CN111315887B - 免疫球蛋白结合性蛋白质 - Google Patents
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Abstract
提供一种化学稳定性、特别是对碱的稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质。通过将来自葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌的蛋白A的结构域C等免疫球蛋白结合结构域中的特定位置的氨基酸残基置换为其它特定的氨基酸残基，从而可以提高对碱的稳定性，由此解决了上述课题。
Description
技术领域
本发明涉及与免疫球蛋白特异性结合的蛋白质。更详细而言，本发明涉及对碱的稳定性优异的免疫球蛋白结合性蛋白质。
背景技术
抗体药物为利用了抗体(免疫球蛋白)的药物，所述抗体为承担生物体内的免疫功能的分子。由于抗体所具有的可变区的多样性，抗体药物得以以高特异性和亲和性与靶分子结合。因此，抗体药物的副作用少，另外，近年来适应症越来越多，市场正在迅速扩张。
抗体药物的制造包含培养工序和纯化工序，在培养工序中，为了提高生产率，希望改良抗体产生细胞、优化培养条件。另外，在纯化工序中，作为粗纯化，采用亲和色谱法，经过这之后的中间纯化、最终纯化及病毒去除而制剂化。
在纯化工序中，使用特异性识别抗体分子的亲和载体，作为该载体中使用的配体蛋白，使用具有与抗体(免疫球蛋白)结合的性质的蛋白A、蛋白G。在制造抗体药物时，为了降低其生产成本而将这些亲和载体使用多次，在使用后进行除去该载体上残留的杂质的工序。在上述除杂质的工序中，通常使用氢氧化钠进行固定洗涤，通过该工序使亲和载体再生。因此，上述配体蛋白需要具有化学稳定性，使得即使进行上述工序也维持对抗体的结合性。
作为具有化学稳定性的、用于亲和载体的配体蛋白的一例，可列举利用了来自葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌的蛋白A(SpA)的结构域C的氨基酸序列的碱稳定色谱配体(专利文献1)；由上述蛋白A的结构域B、结构域C、结构域Z中的任一结构域的缺失了部分氨基酸序列的氨基酸序列构成的亲和色谱配体(专利文献2)。另外，已知结构域Z中第29位的甘氨酸置换为丙氨酸则结构会更稳定(非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2010-504754号公报
专利文献2:日本特开2012-254981号公报
非专利文献
非专利文献1:Bjorn Nilsson等，Protein Engineering，1(2)，107-113，1987
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于，提供对碱的稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质。
用于解决问题的方案
本发明人们为了解决上述课题进行了深入研究，结果确定了来自葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌的蛋白A(SpA)的结构域C中的、与提高稳定性有关的氨基酸残基，发现将该氨基酸残基置换为其它特定的氨基酸残基，从而对碱具有优异的稳定性，从而完成了本发明。
即，本发明包含以下方式。
[1]一种免疫球蛋白结合性蛋白质，其包含蛋白A的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有选自以下的(1)至(8)的至少1种氨基酸置换：
(1)相当于序列号1的第2位的天冬氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸
(2)相当于序列号1的第49位的赖氨酸的氨基酸残基置换为甲硫氨酸
(3)相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸
(4)相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸或天冬氨酸
(5)相当于序列号1的第3位的天冬酰胺的基酸残基置换为异亮氨酸或苏氨酸
(6)相当于序列号1的第11位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为赖氨酸或酪氨酸
(7)相当于序列号1的第15位的谷氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸
(8)相当于序列号1的第40位的缬氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸。
[2]根据上述的免疫球蛋白结合性蛋白质，其为以下的(a)、(b)、(c)或(d)记载的蛋白质：
(a)蛋白质：包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有上述至少1个氨基酸置换；
(b)蛋白质：包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有上述至少1个氨基酸置换，进一步包含除上述至少1个氨基酸置换的位置以外的1或数个位置处的1或数个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加，且具有免疫球蛋白结合活性；
(c)蛋白质：其包含下述氨基酸序列且具有免疫球蛋白结合活性，所述氨基酸序列为相对于在序列号1所记载的氨基酸序列中具有上述至少1个氨基酸置换的氨基酸序列整体具有70％以上的同源性、且残留了上述至少1个氨基酸置换的氨基酸序列；
(d)蛋白质：包含上述(a)、(b)或(c)记载的蛋白质的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中进一步具有选自以下的(9)至(13)中的至少1个氨基酸置换：
(9)相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸
(10)相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸
(11)相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸
(12)相当于序列号1的第6位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为天冬氨酸
(13)相当于序列号1的第42位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸。
[3]根据上述的免疫球蛋白结合性蛋白质，其包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中至少具有以下的(3-1)和/或(4-1)所示的氨基酸置换：
(3-1)序列号1的第21位的天冬酰胺置换为酪氨酸
(4-1)序列号1的第58位的赖氨酸置换为谷氨酸。
[4]根据上述的免疫球蛋白结合性蛋白质，其包含序列号8、9、13、15、17、19、及21中任一者记载的氨基酸序列。
[5]根据上述的免疫球蛋白结合性蛋白质，其包含序列号17记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有选自以下的(I)至(V)中的至少1种氨基酸置换：
(I)序列号17的第3位的天冬酰胺置换为异亮氨酸或苏氨酸
(II)序列号17的第11位的天冬酰胺置换为赖氨酸或酪氨酸
(III)序列号17的第58位的谷氨酸置换为缬氨酸、甘氨酸或天冬氨酸
(IV)序列号17的第15位的谷氨酸置换为丙氨酸
(V)序列号17的第40位的缬氨酸置换为丙氨酸。
[6]根据上述的免疫球蛋白结合性蛋白质，其包含序列号28至32、34、35、及37至40中任一者记载的氨基酸序列。
[7]根据上述的免疫球蛋白结合性蛋白质，其包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中至少具有以下的(2-1)所示的氨基酸置换：
(2-1)序列号1的第49位的赖氨酸置换为甲硫氨酸。
[8]根据上述的免疫球蛋白结合性蛋白质，其包含序列号2记载的氨基酸序列。
[9]一种多核苷酸，其编码上述免疫球蛋白结合性蛋白质。
[10]一种表达载体，其包含上述多核苷酸。
[11]一种转化体，其具有上述多核苷酸或上述表达载体。
[12]根据上述的转化体，其为大肠杆菌(Escherichia coli)。
[13]一种免疫球蛋白结合性蛋白质的制造方法，其包含下述工序：培养上述转化体，从而表达上述免疫球蛋白结合性蛋白质的工序；和、回收表达的上述蛋白质的工序。
[14]一种免疫球蛋白吸附剂，其具备不溶性载体、和固定于该不溶性载体的上述免疫球蛋白结合性蛋白质。
[15]一种免疫球蛋白分离方法，其包含下述工序：向填充有上述吸附剂的柱添加包含免疫球蛋白的溶液，使该免疫球蛋白吸附于上述吸附剂的工序；和、将吸附于上述吸附剂的免疫球蛋白洗脱的工序。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质为特定的免疫球蛋白结合性蛋白质。“免疫球蛋白结合性蛋白质”是指对免疫球蛋白具有结合性的蛋白质。即，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质对免疫球蛋白具有结合性。本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质具体可以为对免疫球蛋白的Fc区具有结合性的蛋白质。将对免疫球蛋白的结合性也称为“免疫球蛋白结合活性”或“抗体结合活性”。免疫球蛋白结合活性可以通过例如ELISA法来测定。ELISA法可以在例如实施例记载的条件下实施。
作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，可列举下述蛋白质：包含蛋白A的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有特定位置处的氨基酸置换。将不具有特定位置处的氨基酸置换的蛋白A的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列也称为“非修饰型氨基酸序列”。将具有特定位置处的氨基酸置换的蛋白A的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列也称为“修饰型氨基酸序列”。即，修饰型氨基酸序列可以为除了具有特定位置处的氨基酸置换以外与非修饰型氨基酸序列相同的氨基酸序列。另外，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以为例如除了具有特定位置处的氨基酸置换以外包含与非修饰型氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白质。另外，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以为例如包含修饰型氨基酸序列的蛋白质。非修饰型氨基酸序列可以为自然界中可见的氨基酸序列，也可以不是这种。非修饰型氨基酸序列可以进行了修饰，例如以使其具有期望的性质。非修饰型氨基酸序列可以具有例如特定位置处的氨基酸置换以外的氨基酸置换。
作为蛋白A，可列举来自葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌的蛋白A(SpA)。作为葡萄球菌属细菌，可列举金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。作为免疫球蛋白结合结构域，可列举结构域C、结构域E、结构域D、结构域A、结构域B。作为免疫球蛋白结合结构域，尤其可列举结构域C。作为来自金黄色葡萄球菌的SpA的结构域C，可列举GenBankNo.AAA26676的第270位至第327位为止的氨基酸残基。将该结构域C的氨基酸序列示于序列号1。另外，作为来自金黄色葡萄球菌的SpA的结构域E，可列举GenBank No.AAA26676的第37位至第92位为止的氨基酸残基。另外，作为来自金黄色葡萄球菌的SpA的结构域D，可列举GenBank No.AAA26676的第93位至第153位的氨基酸残基。另外，作为来自金黄色葡萄球菌的SpA的结构域A，可列举GenBank No.AAA26676的第154位至第211位的氨基酸残基。另外，作为来自金黄色葡萄球菌的SpA的结构域B，可列举GenBank No.AAA26676的第212位至第269位的氨基酸残基。即，作为非修饰型氨基酸序列，具体而言，可列举序列号1记载的氨基酸序列等上述例示的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列。另外，作为修饰型氨基酸序列，具体而言，可列举序列号1记载的氨基酸序列等上述例示的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列中具有特定位置处的氨基酸置换的氨基酸序列。即，作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，具体而言，可列举下述蛋白质：包含序列号1记载的氨基酸序列等上述例示的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有特定位置处的氨基酸置换。换言之，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以为例如下述蛋白质：除了具有特定位置处的氨基酸置换以外，包含与序列号1记载的氨基酸序列等上述例示的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
蛋白质包含氨基酸序列这一表述，也称为“蛋白质包含由氨基酸序列构成的氨基酸残基”。蛋白质或氨基酸序列具有氨基酸置换这一表述，也称为“在蛋白质或氨基酸序列中发生了氨基酸置换”。将构成蛋白质或氨基酸序列的氨基酸也称为“氨基酸残基”。
上述特定位置处的氨基酸置换具体而言为选自Asp2Glu(该表述表示相当于序列号1的第2位的天冬氨酸的氨基酸残基被置换为谷氨酸，以下同样)、Lys49Met、Asn21Tyr、Lys58Glu、Lys58Val、Lys58Gly、Lys58Asp、Asn3Ile、Asn3Thr、Asn11Lys、Asn11Tyr、Glu15Ala、及Val40Ala中的至少一种氨基酸置换。换言之，上述特定位置处的氨基酸置换具体而言为选自(1)Asp2Glu、(2)Lys49Met、(3)Asn21Tyr、(4)Lys58Glu、Lys58Val、Lys58Gly、或Lys58Asp(5)Asn3Ile或Asn3Thr、(6)Asn11Lys或Asn11Tyr、(7)Glu15Ala、及(8)Val40Ala中的至少一种氨基酸置换。本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以具有例如选自这些氨基酸置换中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、或8个氨基酸置换。本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以具有例如至少Asp2Glu和/或Lys49Met的氨基酸置换。另外，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以具有例如至少选自Asp2Glu、Lys49Met、Asn21Tyr、及Lys58Glu中的至少一个氨基酸置换。另外，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以具有例如至少选自Asp2Glu、Lys49Met、Asn21Tyr、Lys58Glu、Lys58Val、Asn3Ile、Asn3Thr、Asn11Lys、及Asn11Tyr中的至少一个氨基酸置换。另外，其中，Asn21Tyr及Lys58Glu为显著提高对碱的稳定性的氨基酸置换。因此，至少具有Asn21Tyr或Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的优选例。另外，至少具有Asn21Tyr及Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的特别优选例。另外，至少具有Lys49Met的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质也为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的优选例。
需要说明的是，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以进一步具有至少1个其它氨基酸置换。作为其它氨基酸置换，可列举已知会增加结构稳定性的Gly29Ala的氨基酸置换(Bjorn Nilsson等，Protein Engineering，1(2)，107-113，1987)。另外，作为其它氨基酸置换，还可列举Lys4Arg、Lys7Glu、Asn6Asp、Lys42Arg的氨基酸置换。即，作为修饰型氨基酸序列，还可列举上述例示的非修饰型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)中具有上述特定位置处的氨基酸置换及Gly29Ala等其它氨基酸置换的氨基酸序列。即，作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，还可列举下述蛋白质：包含上述例示的非修饰型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)，其中，在该氨基酸序列中具有上述特定位置处的氨基酸置换及Gly29Ala等其它氨基酸置换。换言之，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以为例如下述蛋白质：除了具有上述特定位置处的氨基酸置换及Gly29Ala等其它氨基酸置换以外，包含与上述例示的非修饰型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)相同的氨基酸序列。
在本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质具有2个或2个以上氨基酸置换时，这些氨基酸置换的组合没有特别限制。
作为氨基酸置换的组合，具体而言，可列举例如：Lys7Glu、Asn21Tyr及Gly29Ala的氨基酸置换；Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换；Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换；Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala、Lys49Met及Lys58Glu的氨基酸置换；Lys4Arg、Lys7Glu、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换；Asn3Ile、Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换；Asn3Thr、Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换；Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换；Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Tyr、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换；Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Val的氨基酸置换；Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Glu15Ala、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换；Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Gly的氨基酸置换；Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Glu15Ala、Asn21Tyr、Gly29Ala、Val40Ala及Lys58Glu的氨基酸置换；Asn3Ile、Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Glu15Ala、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换；Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Glu15Ala、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Asp的氨基酸置换；Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Glu15Ala、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Val的氨基酸置换。
即，作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，更具体而言，可列举下述的免疫球蛋白结合性蛋白质。这些免疫球蛋白结合性蛋白质在对碱的稳定性提高方面是优选的。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Asn21Tyr的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号8记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号9记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys7Glu、Asn21Tyr及Gly29Ala的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号13记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号15记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号17记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala、Lys49Met及Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号19记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号21记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Asn3Ile、Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号28记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Asn3Thr、Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号29记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号30记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Tyr、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号31记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Val的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号32记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys49Met的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号2记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Glu15Ala、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号34记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Gly的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号35记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Glu15Ala、Asn21Tyr、Gly29Ala、Val40Ala及Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号37记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Asn3Ile、Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Glu15Ala、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号38记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Glu15Ala、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Asp的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号39记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Glu15Ala、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Val的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号40记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。
另外，作为氨基酸置换的组合，具体而言，可列举例如：Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu与选自以下的(I)至(V)中的至少1种氨基酸置换的组合：
(I)Asn3Ile或Asn3Thr
(II)Asn11Lys或Asn11Tyr
(III)Lys58Val、Lys58Gly、或Lys58Asp
(IV)Glu15Ala
(V)Val40Ala。
即，作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，更具体而言，还可列举下述蛋白质：包含序列号17记载的氨基酸序列(序列号1记载的氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换的氨基酸序列)，其中，在该氨基酸序列中具有选自上述(I)至(V)中的至少1种氨基酸置换。作为这种蛋白质，尤其可列举包含上述序列号28至32、34、35、及37至40中任一者记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质。需要说明的是，在此在选择(III)时，序列号17中所含的Lys58Glu的氨基酸置换被Lys58Val等氨基酸置换覆盖，因此本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质不具有Lys58Glu的氨基酸置换。(I)至(V)的氨基酸置换均可以以序列号17为参照序列而适宜替换。即，例如这里的“Lys58Val”可以替换为将序列号17的第58位的谷氨酸置换为缬氨酸的氨基酸置换。在以其它氨基酸序列为参照序列时也同样。
作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，尤其可列举下述蛋白质：包含序列号17记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有选自以下的(A1)至(A3)中的至少1种氨基酸置换：
(A1)Asn3Ile或Asn3Thr
(A2)Asn11Lys或Asn11Tyr
(A3)Lys58Val。
另外，作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，尤其可列举下述蛋白质：包含序列号30记载的氨基酸序列(序列号1记载的氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换的氨基酸序列)，其中，在该氨基酸序列中具有以下的(B1)和/或(B2)的氨基酸置换：
(B1)Glu15Ala
(B2)Lys58Gly。
另外，作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，尤其可列举下述蛋白质：包含序列号34记载的氨基酸序列(序列号1记载的氨基酸序列中具有Lys4Arg、Lys7Glu、Asn11Lys、Glu15Ala、Asn21Tyr、Gly29Ala及Lys58Glu的氨基酸置换的氨基酸序列)，其中，在该氨基酸序列中具有选自以下的(C1)至(C3)中的至少1种氨基酸置换：
(C1)Asn3Ile
(C2)Lys58Val或Lys58Asp
(C3)Val40Ala。
将序列号1记载的氨基酸序列中具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)的氨基酸序列也称为“来自序列号1的置换氨基酸序列”。来自序列号1的置换氨基酸序列换言之为发生了上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)的序列号1记载的氨基酸序列。另外，来自序列号1的置换氨基酸序列换言之为具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)、除此以外与序列号1记载的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
另外，作为修饰型氨基酸序列，还可列举上述例示的修饰型氨基酸序列(例如来自序列号1的置换氨基酸序列)的变体序列。即，作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，还可列举下述蛋白质：包含上述例示的修饰型氨基酸序列(例如来自序列号1的置换氨基酸序列)的变体序列、且具有免疫球蛋白结合活性。以下，列举来自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列的情况进行说明，但该说明也可以沿用于任意的修饰型氨基酸序列的变体序列。
来自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列按照残留上述特定位置处的氨基酸置换(即，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质具有上述特定位置处的氨基酸置换)的方式来设定。另外，来自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列可以按照残留Gly29Ala等其它氨基酸置换(即，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质具有Gly29Ala等其它氨基酸置换)的方式来设定。另外，来自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列可以追加有选自例如上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)中的、来自序列号1的置换氨基酸序列所不具有的1个以上氨基酸置换。例如，来自序列号1的置换氨基酸序列不具有Gly29Ala等其它氨基酸置换时，来自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列可以具有Gly29Ala等其它氨基酸置换。
作为来自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列，可列举在来自序列号1的置换氨基酸序列中包含1或数个位置处的1或数个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列。即，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质只要具有免疫球蛋白结合活性，则可以在上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)的基础上进一步使序列号1记载的氨基酸序列中进一步包含1或数个位置处的1或数个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加。即，作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，还可列举下述蛋白质：包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)，进一步包含1或数个位置处的1或数个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加，且具有免疫球蛋白结合活性。换言之，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以为例如下述蛋白质：具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)，进一步包含1或数个位置处的1或数个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加，除此以外包含与序列号1一致的氨基酸序列且具有免疫球蛋白结合活性。需要说明的是，上述氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加按照残留上述特定位置处的氨基酸置换的方式来选择。即，上述氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加发生在例如上述特定位置以外的位置即可。另外，上述氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加可以按照残留Gly29Ala等其它氨基酸置换的方式来选择。即，上述氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加发生在例如Gly29Ala等其它氨基酸置换以外的位置即可。另外，上述氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加可以包含例如选自上述例示的氨基酸置换中的、来自序列号1的置换氨基酸序列所不具有的1个以上的氨基酸置换。上述“1或数个”也根据氨基酸残基在蛋白质的立体结构中的位置、氨基酸残基的种类而不同，具体是指例如1至30个、1至20个、1至10个、1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1至2个、1个中的任一者。作为上述氨基酸残基置换的一例，可列举在物理性质和/或化学性质相似的氨基酸之间发生置换的保守性置换。本领域技术人员已知：在保守性置换的情况下，通常在发生了置换的蛋白与未发生置换的蛋白之间，蛋白质的功能是得到维持的。作为保守性置换的一例，可列举甘氨酸与丙氨酸间、丝氨酸与脯氨酸间、或谷氨酸与丙氨酸间的置换(蛋白质的结构与功能，MEDICAL SCIENCES INTERNATIONAL公司，9，2005)。另外，上述氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加也包含例如：由于基于蛋白质或编码该蛋白质的基因所来源的微生物的个体差异、种属差异等而天然产生的突变(mutant或variant)，从而产生的置换、缺失、插入和/或添加。
另外，作为来自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列，还可列举相对于来自序列号1的置换氨基酸序列具有高同源性的氨基酸序列。即，作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，还可列举包含下述氨基酸序列且具有免疫球蛋白结合活性的蛋白质，所述氨基酸序列相对于在序列号1记载的氨基酸序列中具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)的氨基酸序列具有高同源性。需要说明的是，上述那样的同源性范围内的氨基酸序列的变化可按照残留上述特定位置处的氨基酸置换的方式来选择。即，上述那样的同源性范围内的氨基酸序列的变化例如发生在上述特定位置以外的位置即可。另外，上述那样的同源性范围内的氨基酸序列的变化可以按照残留Gly29Ala等其它氨基酸置换的方式来选择。即，上述那样的同源性范围内的氨基酸序列的变化例如发生在Gly29Ala等其它氨基酸置换以外的位置即可。另外，上述那样的同源性范围内的氨基酸序列的变化可以包含例如选自上述例示的氨基酸置换中的、来自序列号1的置换氨基酸序列所不具有的1个以上的氨基酸置换。“高同源性”可以是指70％以上、80％以上、90％以上、或95％以上的同源性。“同源性(homology)”可以是指类似性(similarity)或同一性(identity)。“同源性”尤其可以是指同一性(identity)。氨基酸序列的同源性可以利用BLAST等比对程序来确定。例如，氨基酸序列的同一性可以是指使用blastp计算的氨基酸序列间的同一性，具体而言，可以是指以缺省参数使用blastp计算的氨基酸序列间的同一性。
另外，作为修饰型氨基酸序列，还可列举在上述例示的变体序列中进一步具有选自上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)中的1种以上氨基酸置换的氨基酸序列。例如，修饰型氨基酸序列可以为在至少具有上述特定位置处的氨基酸置换的变体序列中进一步具有Gly29Ala等其它氨基酸置换的氨基酸序列。
另外，作为非修饰型氨基酸序列，还可列举上述例示的非修饰型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)的变体序列。即，作为修饰型氨基酸序列，还可列举在上述例示的非修饰型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)的变体序列中具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)的氨基酸序列。即，作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，还可列举下述蛋白质：包含上述例示的非修饰型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)的变体序列，其中，该变体序列中具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)，且具有免疫球蛋白结合活性。换言之，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以为例如下述蛋白质：除了具有上述例示的氨基酸置换以外，包含与上述例示的非修饰型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)的变体序列相同的氨基酸序列。以下，列举序列号1记载的氨基酸序列的变体序列的情况进行说明，但该说明也可以沿用于任意的非修饰型氨基酸序列的变体序列。
作为序列号1记载的氨基酸序列的变体序列，可列举在序列号1记载的氨基酸序列中包含1或数个位置处的1或数个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列。即，作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，还可列举下述蛋白质：包含序列号1记载的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列中包含1或数个位置处的1或数个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加，进一步具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)，且具有免疫球蛋白结合活性。上述氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加发生在例如上述特定位置以外的位置即可。另外，上述氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加发生在例如Gly29Ala等其它氨基酸置换以外的位置即可。
作为序列号1记载的氨基酸序列的变体序列，还可列举相对于序列号1记载的氨基酸序列具有高同源性的氨基酸序列。即，作为本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，还可列举下述蛋白质：包含相对于序列号1记载的氨基酸序列具有高同源性的氨基酸序列，其中，在该氨基酸序列(与序列号1记载的氨基酸序列具有高同源性的氨基酸序列)中具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)，且具有免疫球蛋白结合活性。上述那样的同源性范围内的氨基酸残基的变化发生在例如上述特定位置以外的位置即可。另外，上述那样的同源性范围内的氨基酸残基的变化发生在例如Gly29Ala等其它氨基酸置换以外的位置即可。
此外，序列号1记载的氨基酸序列的变体序列可以沿用关于来自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列的记载。
“序列号1记载的氨基酸序列中的第X位的氨基酸”是指：从序列号1记载的氨基酸序列的N末端数起，存在于第X位的位置的氨基酸。某氨基酸序列中的“相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第X位的氨基酸的氨基酸残基”是指：作为该某氨基酸序列中的氨基酸残基的、在该某氨基酸序列与序列号1的氨基酸序列比对中排列在与序列号1所示的氨基酸序列中的第X位的氨基酸相同的位置的氨基酸残基。例如，在Asp2Glu的氨基酸置换的情况下，某氨基酸序列中的“相当于序列号1的第2位的天冬氨酸的氨基酸残基”是指：作为该某氨基酸序列中的氨基酸残基的、在该某氨基酸序列与序列号1的氨基酸序列比对中排列在与序列号1所示的氨基酸序列中的第2位的天冬氨酸相同的位置的氨基酸残基。需要说明的是，序列号1记载的氨基酸序列中的“相当于序列号1记载的氨基酸序列中的第X位的氨基酸的氨基酸残基”是指：序列号1记载的氨基酸序列中的第X位的氨基酸本身。即，上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)的位置并非一定表示本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质中的绝对位置，而是表示基于序列号1记载的氨基酸序列的相对位置。即，例如本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质在比上述例示的氨基酸置换的位置更靠近N末端侧包含氨基酸残基的插入、缺失或添加的情况下，该氨基酸置换的绝对位置可能会相应地改变。本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质中的上述例示的氨基酸置换的位置可以通过例如本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的氨基酸序列与序列号1记载的氨基酸序列的比对来确定。比对可以利用例如BLAST等比对程序来实施。关于序列号1记载的氨基酸序列的变体序列等任意的氨基酸序列中的、上述例示的氨基酸置换的位置，也同样。另外，上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)的置换前的氨基酸残基表示序列号1记载的氨基酸序列中的置换前的氨基酸残基的种类，在序列号1记载的氨基酸序列以外的非修饰型氨基酸序列中可以保守，也可以不保守。
本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以仅包含1个修饰型氨基酸序列，也可以包含多个修饰型氨基酸序列。本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以包含例如2个以上、3个以上、4个以上、或5个以上修饰型氨基酸序列，可以包含10个以下、7个以下、5个以下、4个以下、3个以下、或2个以下修饰型氨基酸序列，可以包含上述的不矛盾的组合的个数的修饰型氨基酸序列。本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质包含多个修饰型氨基酸序列的情况下，这些多个修饰型氨基酸序列的氨基酸序列可以相同也可以不同。这些多个修饰型氨基酸序列例如可以介由适宜的接头相互连接。
本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以由修饰型氨基酸序列构成，也可以进一步包含其它氨基酸序列(例如寡肽)。即，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质例如可以在其N末端侧或C末端侧进一步包含其它氨基酸序列。换言之，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质中，例如可以在修饰型氨基酸序列的N末端侧或C末端侧添加有其它氨基酸序列。其它氨基酸序列只要不损害本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的免疫球蛋白结合性、稳定性则没有特别限制。例如，其它氨基酸序列的种类、长度只要不损害本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的免疫球蛋白结合性、稳定性则没有特别限制。
本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以在例如所选择的免疫球蛋白结合结构域的基础上包含其它免疫球蛋白结合结构域的一部分。例如，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质包含结构域C的修饰型氨基酸序列的情况下，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以进一步包含蛋白A的结构域C的N末端侧区域(结构域E、结构域D、结构域A、结构域B/Z)的一部分，可以包含蛋白A的结构域C的C末端侧区域的一部分。
另外，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质例如可以在其N末端侧或C末端侧包含对于特异性检测或分离目标物有用的寡肽。作为这种寡肽，可列举聚组氨酸、聚精氨酸。
另外，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质例如可以在其N末端侧或C末端侧包含在将本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质固定于色谱用的支撑体等固相时有用的寡肽。作为这种寡肽，可列举包含赖氨酸、半胱氨酸的寡肽。
本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质包含上述那样的其它氨基酸序列的情况下，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质例如可以以预先包含其它氨基酸序列的形态来制造，也可以附加另外制造的上述那样的其它氨基酸序列。本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质包含上述那样的其它氨基酸序列的情况下，典型情况下，可以由编码包含上述那样的其它氨基酸序列的本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的全长氨基酸序列的多核苷酸表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，从而进行制造。即，例如可以将编码其它氨基酸序列的多核苷酸和编码本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质(例如不含其它氨基酸序列)的多核苷酸以将其它氨基酸序列添加于本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的N末端侧或C末端侧的方式进行连接，来表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质。另外，例如也可以将化学合成的其它氨基酸序列通过化学方式键合到本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质(例如不含其它氨基酸序列)的N末端侧或C末端侧。
例如，由编码本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸进行表达，从而可以制造本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质。将编码本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸也称为“本发明的多核苷酸”。具体而言，本发明的多核苷酸可以为包含编码本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的核苷酸序列的多核苷酸。
本发明的多核苷酸例如可以通过化学合成法或PCR法等DNA扩增法来取得。例如，可以以包含编码本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的核苷酸序列等要扩增的核苷酸序列的多核苷酸为模板，来实施DNA扩增法。就作为模板的多核苷酸而言，可列举表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的生物基因组DNA、本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的cDNA、包含本发明的多核苷酸的载体。本发明的多核苷酸的核苷酸序列例如可以根据本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的氨基酸序列通过转换来进行设计。在根据氨基酸序列转换核苷酸序列时，可以使用标准密码子表，优选考虑本发明的多核苷酸所转化的宿主中的密码子使用频率来进行转换。作为一例，在宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)时，对于精氨酸(Arg)而言AGA/AGG/CGG/CGA的使用频率低，对于异亮氨酸(Ile)而言ATA的使用频率低，对于亮氨酸(Leu)而言CTA的使用频率低，对于甘氨酸(Gly)而言，GGA的使用频率低，对于脯氨酸(Pro)而言，CCC的使用频率低(所谓的稀有密码子)，因此按照避开这些密码子的方式进行转换即可。也可以利用公共数据库(例如，上总DNA研究所的主页中的Codon UsageDatabase等)来分析密码子的使用频率。
另外，本发明的多核苷酸例如还可以如下取得：向编码不具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换及任选的Gly29Ala等其它氨基酸置换)的免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸中，按照使编码的蛋白质具有上述例示的氨基酸置换的方式导入突变，从而取得。作为上述不具有例示的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质，可列举包含上述例示的非修饰型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列或其变体序列)的蛋白质。编码上述不具有例示的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸例如可以通过化学合成法或PCR法等DNA扩增法取得。本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质具有2个以上氨基酸置换的情况下，这些氨基酸置换例如可以同时或依次导入。例如，可以向编码具有选自上述例示的氨基酸置换中的至少1种氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸中，按照使编码的蛋白质具有选自上述例示的氨基酸置换中的另外的至少1个氨基酸置换的方式来导入突变。另外，可以对某位置的氨基酸残基进行2次以上修饰。例如，可以向已具有Lys58Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质中进一步导入Lys58Val的氨基酸置换。
另外，多核苷酸不限于发生上述例示的氨基酸置换，也可以导入用于构建变体序列的突变等任意的突变，利用其作为本发明的多核苷酸或用于取得本发明的多核苷酸的材料。
作为向多核苷酸导入突变的方法，可列举易错PCR法。关于易错PCR法中的反应条件，只要是可以向多核苷酸中导入期望的突变的条件则没有特别限制。例如，使作为底物的4种脱氧核苷酸(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)的浓度不均匀，将MnCl2以0.01至10mM(优选为0.1至1mM)的浓度添加到PCR反应液中进行PCR，从而可以向多核苷酸中导入突变。另外，作为向多核苷酸中导入突变的方法，除了易错PCR法以外，还可列举：使作为诱变剂的药剂作用于多核苷酸或对多核苷酸照射紫外线，从而向多核苷酸中导入突变的方法。就作为诱变剂的药剂而言，可列举羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍、亚硝酸、亚硫酸、肼等本领域技术人员通常使用的诱变性药剂。这种向多核苷酸导入突变的方法不限于导入上述例示的氨基酸置换，也可以用于变体序列的构建(例如氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的导入以及在上述那样的同源性范围内改变氨基酸序列)。
本发明的多核苷酸例如可以一次性取得其全长序列，也可以通过分别取得其部分序列并连接而取得。关于取得上述那样的本发明的多核苷酸的方法的说明，不限于一次性取得其全长序列的情况，也可以沿用于取得其部分序列的情况。
具体而言，本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质例如可以通过使具有本发明的多核苷酸的转化体表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质而制造。将具有本发明的多核苷酸的转化体也称为“本发明的转化体”。本发明的转化体由于具有本发明的多核苷酸而可以表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质。即，本发明的转化体换言之为能够表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
本发明的转化体例如可通过用本发明的多核苷酸转化宿主而得到。即，本发明的转化体例如可以为被本发明的多核苷酸转化的宿主，也可以为具有本发明的多核苷酸的宿主，另外可以为能表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的宿主。宿主只要是通过被本发明的多核苷酸转化而能够表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的物质则没有特别限制。作为宿主，可列举动物细胞、昆虫细胞、微生物。作为动物细胞，可列举COS细胞、CHO细胞、Hela细胞、NIH3T3细胞、HEK293细胞。作为昆虫细胞，可列举Sf9、BTI-TN-5B1-4。作为微生物，可列举酵母、细菌。作为酵母，可列举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母(Saccharomyces)属酵母、巴斯德毕毕赤酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母(Pichia)属酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属酵母。作为细菌，可列举大肠杆菌等埃希氏菌属细菌。作为大肠杆菌，可列举JM109株、BL21(DE3)株。需要说明的是，从生产率方面优选使用酵母、大肠杆菌作为宿主，进一步优选使用大肠杆菌作为宿主。
本发明的多核苷酸可以是以可表达方式保持于本发明的转化体。具体而言，本发明的多核苷酸可以以在宿主有功能的启动子的控制下表达的方式被保持。作为在宿主中有功能的启动子，例如在以大肠杆菌为宿主的情况下，可列举trp启动子、tac启动子、trc启动子、lac启动子、T7启动子、recA启动子、lpp启动子。
在本发明的转化体中，本发明的多核苷酸可以存在于例如在基因组DNA外进行自主复制的载体上。即，本发明的多核苷酸例如可以以包含本发明的多核苷酸的表达载体形式导入宿主。即，一方式中，本发明的转化体可以为具有包含本发明的多核苷酸的表达载体的转化体。将包含本发明的多核苷酸的表达载体也称为“本发明的表达载体”。本发明的表达载体例如通过向表达载体的适宜位置插入本发明的多核苷酸而得到。需要说明的是，表达载体只要是稳定存在于要转化的宿主内且可以复制的载体，则没有特别限制。作为表达载体，例如在以大肠杆菌为宿主时，可以例示pET质粒载体、pUC质粒载体、pTrc质粒载体。表达载体可以具备抗生素抗性基因等选择标记。另外，上述适宜位置是指：不会破坏与表达载体的复制功能、选择标记、传递性有关的区域的位置。在向上述表达载体插入本发明的多核苷酸时，优选以连接于表达所需的启动子等功能性多核苷酸的状态插入。
另外，本发明的转化体中，本发明的多核苷酸可以导入到例如基因组DNA上。本发明的多核苷酸向基因组DNA的导入可以利用例如基于同源重组的基因导入法来实施。作为基于同源重组的基因导入法，可列举Red-driven integration法(Datsenko，K.A，andWanner，B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97：6640-6645(2000))等使用直链状DNA的方法、使用包含温度敏感性复制起点的载体的方法、使用不具有在宿主内起作用的复制起点的载体的方法、使用噬菌体的转导法。
关于使用本发明的表达载体等多核苷酸转化宿主，例如可以通过本领域技术人员通常使用的方法来进行。例如，在选择大肠杆菌作为宿主的情况下，可以利用感受态细胞法、热休克法、电穿孔法等进行转化。通过在转化后用适宜的方法筛选，可以取得本发明的转化体。
关于各种微生物中可使用的表达载体、启动子等基因工程方法相关信息，在例如“微生物学基础讲座8基因工学、共立出版、1987年”中有详细记载，可利用这些。
本发明的转化体具有本发明的表达载体的情况下，可以由本发明的转化体制备本发明的表达载体。例如，可以从培养本发明的转化体而得到的培养物中，使用碱提取法或QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)等市售的提取试剂盒制备本发明的表达载体。
通过培养本发明的转化体，可以表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质。另外，通过培养本发明的转化体来表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质，回收表达的上述蛋白质，从而可以制造本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质。即，本发明提供本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的制造方法，例如包含下述工序：培养本发明的转化体而表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质；和，回收表达的上述蛋白质。培养基组成、培养条件可以根据宿主的种类、本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的特性等诸条件来适宜设定。培养基组成、培养条件例如可以按照宿主可以增殖、且可以表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的方式来设定。作为培养基，可以使用适宜含有例如碳源、氮源、无机盐、其它各种有机成分、无机成分的培养基。例如，在宿主为大肠杆菌时，作为优选的培养基的一例，可列举补充了必要营养源的LB(Luria-Bertani)培养基(胰蛋白胨1％(w/v)、酵母提取物0.5％(w/v)、氯化钠1％(w/v))。需要说明的是，为了通过有无导入本发明的表达载体来选择性地增殖本发明的转化体，优选向培养基中添加对应于该表达载体所含的抗生素抗性基因的抗生素而进行培养。例如，在该表达载体包含卡那霉素抗性基因时，可以向培养基中添加卡那霉素。将本发明的多核苷酸导入到基因组DNA上的情况时，也同样。另外，培养基也含有选自由谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐及二硫苏糖醇组成的组的一种以上还原剂。另外，培养基可以含有甘氨酸等促进蛋白质从上述转化体向培养液分泌的化学试剂。例如，在宿主为大肠杆菌时，优选以2％(w/v)以下向培养基添加甘氨酸。例如，在宿主为大肠杆菌时，培养温度可以通常为10℃至40℃、优选为20℃至37℃、更优选为25℃左右。例如，在宿主为大肠杆菌时，培养基的pH可以为pH6.8至pH7.4、优选为pH7.0左右。另外，在诱导性启动子控制下表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质时，优选加入诱导剂，以可以良好地表达本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质。在表达诱导中，可以使用例如与启动子的种类相应的诱导剂。作为诱导剂，可例示IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。例如，在宿主为大肠杆菌时，在培养液的浊度(600nm下的吸光度)达到约0.5至1.0时，添加合适量的IPTG，继续进行培养，从而可以诱导本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的表达。IPTG的添加浓度可以为例如0.005至1.0mM、优选为0.01至0.5mM。IPTG诱导等表达诱导可以在例如该技术领域中已知的条件下进行。
可以通过与其表达方式相适合的方法，从培养物中分离回收本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质。需要说明的是，“培养物”是指：通过培养而得到的培养液的整体或其一部分。该一部分只要为含有本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的部分，则没有特别限制。作为该一部分，可列举所培养的本发明的转化体的细胞、培养后的培养基(即，培养上清)。例如，当本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质在培养上清中积累时，可以利用离心分离操作分离细胞，从得到的培养上清中回收本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质。另外，当本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质在细胞内(包含周质)中积累时，可以利用离心分离操作回收细胞，然后添加酶处理剂、表面活性剂等而破坏细胞，从破碎物中回收本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质。例如，可以利用用于蛋白质的分离纯化的公知方法，来进行培养上清、细胞破碎物中的本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的回收。作为这种方法，可列举硫酸铵分级、离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、等电点沉淀。
本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以用于例如免疫球蛋白(抗体)的分离或分析。本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质例如可以固定于不溶性载体而使用。即，具体而言，免疫球蛋白(抗体)的分离或分析例如可以使用免疫球蛋白吸附剂来实施，所述免疫球蛋白吸附剂具备不溶性载体和固定于该不溶性载体的本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质。将具备不溶性载体和固定于该不溶性载体的本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质的免疫球蛋白吸附剂也称为“本发明的免疫球蛋白吸附剂”。需要说明的是，“免疫球蛋白的分离”不限于从共存有杂质的溶液中分离免疫球蛋白，还包含基于结构、性质或活性等的免疫球蛋白之间的分离。不溶性载体没有特别限制。作为不溶性载体，可例示以琼脂糖、海藻酸盐(alginate)、角叉菜胶、几丁质、纤维素、糊精、葡聚糖、淀粉之类的多糖为原料的载体；以聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚氨酯等合成高分子为原料的载体；以二氧化硅等的陶瓷为原料的载体。其中，优选以多糖为原料的载体、以合成高分子为原料的载体作为不溶性载体。作为上述优选的载体的一例，可列举：TOYOPEARL(东曹公司制)等导入了羟基的聚甲基丙烯酸酯凝胶、Sepharose(GE Healthcare公司制)等琼脂糖凝胶、Cellu Fine(JNC公司制)等纤维素凝胶。关于不溶性载体的形状，没有特别限定。不溶性载体可以为例如可填充于柱的形状。不溶性载体可以为例如粒状物或非粒状物。另外，不溶性载体可以为例如多孔性或非多孔性。
本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质可以通过例如共价键固定于不溶性载体。具体而言，例如，可以介由不溶性载体所具有的活性基团将本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质和不溶性载体共价结合，从而将本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质固定于不溶性载体。即，不溶性载体可以具有活性基团。不溶性载体例如可以在其表面具有活性基团。作为活性基团，可列举N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化酯基、环氧基、羧基、马来酰亚胺基、卤代乙酰基、三氟代乙烷磺酰基(Tresyl)、甲酰基、卤代乙酰胺。作为具有活性基团的不溶性载体，例如可以直接使用具有活性基团的市售不溶性载体，也可以向不溶性载体中导入活性基团后使用。作为具有活性基团的市售载体，可例示TOYOPEARL AF-Epoxy-650M、TOYOPEARL AF-Tresyl-650M(均为东曹公司制)、HiTrap NHS-activated HP Columns、NHS-activatedSepharose 4Fast Flow、Epoxy-activated Sepharose 6B(均为GE Healthcare公司制)、SulfoLink Coupling Resin(Thermo Fisher Scientific公司制)。
作为向载体表面导入活性基团的方法，可例示使具有2个以上活性部位的化合物中的一个活性部位与存在于载体表面的羟基、环氧基、羧基、氨基等反应的方法。
例如，作为向存在于载体表面的羟基、氨基导入环氧基的化合物，可例示表氯醇、乙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚、己二醇二缩水甘油醚。
另外，例如作为向存在于载体表面的环氧基导入羧基的化合物，可例示2-巯基乙酸、3-巯基丙酸、4-巯基丁酸、6-巯基丁酸、甘氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸。
另外，例如作为向存在于载体表面的羟基、环氧基、羧基、氨基导入马来酰亚胺基的化合物，可例示N-(ε-马来酰亚胺己酸)酰肼、N-(ε-马来酰亚胺丙酸)酰肼、4-(4-N-马来酰亚胺苯基)乙酰肼、2-氨基马来酰亚胺、3-氨基马来酰亚胺、4-氨基马来酰亚胺、6-氨基马来酰亚胺、1-(4-氨基苯基)马来酰亚胺、1-(3-氨基苯基)马来酰亚胺、4-(马来酰亚胺)苯基异氰酸酯、2-马来酰亚胺乙酸、3-马来酰亚胺丙酸、4-马来酰亚胺丁酸、6-马来酰亚胺己酸、N-(α-马来酰亚胺乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯、(间马来酰亚胺苯甲酰基)N-羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羰基-(6-氨基己酸)、琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸、(对马来酰亚胺苯甲酰基)N-羟基琥珀酰亚胺酯、(间马来酰亚胺苯甲酰基)N-羟基琥珀酰亚胺酯。
另外，例如作为向存在于载体表面的羟基、氨基导入卤代乙酰基的化合物，可例示氯代乙酸、溴代乙酸、碘代乙酸、氯代乙酰氯、溴代乙酰氯、溴代乙酰溴、氯代乙酸酐、溴代乙酸酐、碘代乙酸酐、2-(碘代乙酰胺)乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、3-(溴代乙酰胺)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(碘代乙酰基)氨基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
另外，作为向载体表面导入活性基团的方法，可例示使存在于载体表面的羟基、氨基与ω-烯基烷基缩水甘油醚反应之后，用卤化剂将ω-烯基部位卤化而进行活化的方法。作为ω-烯基烷基缩水甘油醚，可例示烯丙基缩水甘油醚、3-丁烯基缩水甘油醚、4-戊烯基缩水甘油醚。作为卤化剂，可例示N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺。
另外，作为向载体表面导入活性基团的方法，还可例示下述方法：对存在于载体表面的羧基使用缩合剂和添加剂而导入活化基团的方法。作为缩合剂，可例示1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(EDC)、二环己基碳二酰亚胺、羰基二咪唑。作为添加剂，可例示出N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4-硝基苯酚、1-羟基苯并三唑。
例如，在缓冲液中实施本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质向不溶性载体的固定。作为缓冲液，可例示乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、MES(2-吗啉乙磺酸)缓冲液、HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液、Tris缓冲液、硼酸缓冲液。关于固定时的反应温度，例如可以根据活性基团的反应性、免疫球蛋白结合性蛋白质的稳定性等诸条件而适宜设定。固定化时的反应温度可以为例如5℃至50℃，优选为10℃至35℃。
本发明的免疫球蛋白吸附剂例如可以填充于柱而用于免疫球蛋白(抗体)的分离。具体而言，例如，向填充有本发明的免疫球蛋白吸附剂的柱中，添加包含免疫球蛋白的溶液而使该免疫球蛋白吸附于上述吸附剂，将吸附于上述吸附剂的免疫球蛋白洗脱，从而可以分离免疫球蛋白。即，本发明提供免疫球蛋白的分离方法，其包含例如下述工序：向填充有本发明的免疫球蛋白吸附剂的柱中添加包含免疫球蛋白的溶液，使该免疫球蛋白吸附于上述吸附剂的工序；和、将吸附于上述吸附剂的免疫球蛋白洗脱的工序。包含免疫球蛋白的溶液可以使用例如泵等液体供应单元添加到柱中。将使液体添加到柱中也称为“将液体通入柱中”。需要说明的是，在添加到柱中之前，可以预先用适宜的缓冲液对包含免疫球蛋白的溶液进行溶剂置换。另外，在将包含免疫球蛋白的溶液添加到柱中之前，可以使用适宜的缓冲液对柱进行平衡。通过柱的平衡，可期待例如以更高纯度对免疫球蛋白进行分离。作为溶剂置换、平衡中使用的缓冲液，可例示磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、MES缓冲液。这样的缓冲液中例如可以进一步添加10mM至100mM的氯化钠等无机盐。用于溶剂置换的缓冲液与用于平衡的缓冲液可以相同也可以不同。另外，在将包含免疫球蛋白的溶液通入柱中之后，在柱中残留有杂质等免疫球蛋白以外的成分时，可以在洗脱吸附于免疫球蛋白吸附剂的免疫球蛋白之前，将这种成分从柱中除去。例如，可以使用适宜的缓冲液从柱中除去免疫球蛋白以外的成分。关于用于除去免疫球蛋白以外的成分的缓冲液，可以沿用例如关于用于溶剂置换、平衡的缓冲液的记载。例如，可以通过减弱免疫球蛋白与配体(本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质)的相互作用，来洗脱吸附于免疫球蛋白吸附剂的免疫球蛋白。作为减弱免疫球蛋白与配体(本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质)的相互作用的手段，可例示利用缓冲液降低pH、添加抗衡肽、升温、改变盐浓度。具体而言，例如可以使用适宜的洗脱液来洗脱吸附于免疫球蛋白吸附剂的免疫球蛋白。作为洗脱液，可列举酸性高于用于溶剂置换、平衡的缓冲液的缓冲液。作为这种缓冲液，可例示柠檬酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、乙酸缓冲液。例如，可以在不损害免疫球蛋白的功能(与抗原的结合性等)的范围内设定洗脱液的pH。
通过如此实施免疫球蛋白(抗体)的分离，可以得到例如分离出的免疫球蛋白。即，一方式中，免疫球蛋白的分离方法可以为免疫球蛋白的制造方法，具体而言，可以为分离出的免疫球蛋白的制造方法。例如，可以以含有免疫球蛋白的洗脱级分形成得到免疫球蛋白。即，可以分取含有洗脱出的免疫球蛋白的级分。级分的分取例如可以按照常规方法进行。作为分取级分的方法，可列举：每隔一定时间、每隔一定的体积更换回收容器的方法；根据洗脱液的色谱图的形状更换回收容器的方法；利用自动采样器等自动级分收集器等分取级分的方法。进一步地，还可以从含有免疫球蛋白的级分中回收免疫球蛋白。例如，可以利用用于蛋白质的分离纯化的公知方法，从含有免疫球蛋白的级分中回收免疫球蛋白。
实施例
以下，使用实施例进一步具体地说明本发明，但本发明不受该实施例限定。
实施例1免疫球蛋白结合性蛋白质表达载体的制作
(1)
使用大肠杆菌型密码子由序列号1记载的免疫球蛋白结合性蛋白质的氨基酸序列进行转换，从而设计序列号3记载的核苷酸序列。
(2)
合成(1)中设计的核苷酸序列后，使用PCR制备包含序列号3记载的核苷酸序列的多核苷酸。PCR如下实施：将上述合成的多核苷酸作为模板DNA，将由序列号4(5’-TAGCCATGGGCGCGGATAACAAGTTC-3’)及序列号5(5’-CTACTCGAGTTTCGGAGCTTGCGCATC-3’)记载的核苷酸序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，制备由表1所示的组成构成的反应液之后，对于该反应液，将以98℃下10秒的第1步骤、55℃下5秒的第2步骤、72℃下60秒的第3步骤为1个循环的反应重复进行30个循环。
[表1]
表1
| 组成 | 体积 |
| 模板DNA | 2.5μL |
| 正向引物(10μM) | 1μL |
| 反向引物(10μM) | 1μL |
| 5×PrimeSTAR缓冲液(宝生物公司制) | 10μL |
| 2.5mM dNTP混合物 | 4μL |
| 2.5U/μL PrimeSTAR HS(宝生物公司制) | 0.5μL |
| H2O | 添加到50μL |
(3)
对得到的多核苷酸进行纯化，用限制性内切酶NcoI和XhoI消化后，连接于预先用限制性内切酶NcoI和XhoI消化的表达载体pET-28a，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(4)
将得到的转化体在含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中培养后，用QIAprepSpin Miniprep kit(QIAGEN公司制)提取表达载体pET-SpA。
(5)
对于得到的提取物中的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸及其周边区域，使用基于链终止子法(chain terminator method)的使用Big Dye Terminator CycleSequencing ready Reaction kit(Life&Science公司制)供于循环测序反应，利用全自动DNA测序仪ABI Prism 3700DNA analyzer(Life&Science公司制)分析核苷酸序列。需要说明的是，在进行该分析时，使用由序列号6(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)或序列号7(5’-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3’)记载的核苷酸序列构成的寡核苷酸作为测序用引物。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-SpA中插入了由序列号3记载的核苷酸序列构成的多核苷酸。
实施例2向免疫球蛋白结合性蛋白质导入突变及文库的制作
通过易错PCR随机地向实施例1中制作的表达载体pET-SpA中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸部分(序列号3)中导入突变。
(1)
使用实施例1中制作的pET-SpA作为模板DNA进行易错PCR。易错PCR如下进行：制备表2所示的组成的反应液之后，将该反应液在95℃下热处理2分钟，进行30个循环的以95℃下30秒的第1步骤、50℃下30秒的第2步骤、72℃下90秒的第3步骤为1个循环的反应，最后在72℃下热处理7分钟。通过上述易错PCR，向编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸(序列号3)中良好地导入了突变，其平均突变导入率为1.15％至1.26％。
[表2]
表2
| 组成 | 体积 |
| 模板DNA(10ng/μL) | 1μL |
| PCR引物(序列号6)(10μM) | 4μL |
| PCR引物(序列号7)(10μM) | 4μL |
| 25mM MgCl2 | 12μL |
| 2.5nM dNTP混合物 | 8μL |
| 10mM MnCl2 | 3μL |
| 10×Ex Taq缓冲液(宝生物公司制) | 10μL |
| GoTaq DNA聚合酶(宝生物公司制) | 1μL |
| H2O | 添加到100μL |
(2)
对得到的PCR产物进行纯化后，用限制性内切酶NcoI和XhoI进行消化，连接于预先用限制性内切酶NcoI和XhoI消化的表达载体pET-28a。
(3)
连接反应结束后，用反应液转化大肠杆菌BL21(DE3)株，用含有50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基培养(37℃、16小时)后，将平板上形成的菌落作为随机突变体文库。
实施例3碱稳定型免疫球蛋白结合性蛋白质的筛选(其1)
(1)
将约1900株实施例2中制作的随机突变体文库(转化体)接种于含有50μg/mL的卡那霉素的2×YT液体培养基(胰蛋白胨1.6％(w/v)、酵母提取物1％(w/v)、氯化钠0.5％(w/v))250μL，用96孔深孔板在37℃下振荡培养过夜。
(2)
培养后，向包含50μg/mL的卡那霉素、0.3％的甘氨酸、0.05mM的IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的2×YT液体培养基500μL中再接种5μL的培养液，用96孔深孔板进一步在20℃下振荡培养过夜。
(3)
培养后，将通过离心操作得到的培养上清用纯水稀释40倍。将稀释后的溶液与2MNaOH等量混合，在25℃下进行16小时碱处理。然后，用4倍量的1M Tris缓冲液(pH7.0)中和。
(4)
用下述所示的ELISA法测定进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，将进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，从而计算残留活性。
(4-1)将使用Tris缓冲生理盐水(TBS)制备成10μg/mL的作为人抗体的γ球蛋白制剂(化学及血清疗法研究所制)分注到96孔微孔板的孔中，固定(4℃、16小时)。固定后，使用以TBS制备为1％(w/v)的牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司制)进行封闭。
(4-2)用洗涤缓冲液(0.05M Tris、0.15M NaCl、0.05％(w/v)Tween 20(商品名))洗涤96孔微孔板的孔之后，添加包含评价抗体结合活性的免疫球蛋白结合性蛋白质的溶液，使免疫球蛋白结合性蛋白质与固定的γ球蛋白反应(30℃、1小时)。
(4-3)反应结束后，用上述洗涤缓冲液洗涤，以100μL/孔添加稀释成100ng/mL的Anti-6-His Antibody(BETHYL LABORATORIES公司制)而进行反应(30℃、1小时)。
(4-4)反应结束后，用上述洗涤缓冲液洗涤，以50μL/孔添加TMB过氧化物酶底物(KPL公司制)。接着，以50μL/孔添加1M磷酸而停止反应，用酶标仪(Tecan公司制)测定450nm的吸光度。
(5)
根据(4)中计算的残留活性，选择表达与天然型(无氨基酸置换)免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号1)相比碱稳定性提高(残留活性提高)的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(6)
培养所选择的转化体，用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(7)
利用实施例1的(5)记载的方法分析所得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的核苷酸序列，确定氨基酸置换位置。
将选择的转化体所表达的免疫球蛋白结合性蛋白质的、相对于天然型(无氨基酸置换的)免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号1)的氨基酸置换位置、及使用0.5M NaOH在25℃下进行15小时碱处理时的残留活性[％]的汇总结果示于表3及表4。可以说，在序列号1记载的氨基酸序列中发生了至少1个Asp2Glu(该表述表示序列号1的第2位的天冬氨酸被置换为谷氨酸，以下同样)、Lys4Arg、Lys49Met、Asn6Asp、Lys7Glu、Asn21Tyr、Lys42Arg、Lys58Glu中的任一氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质与天然型免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号1)相比，碱稳定性提高。
[表3]
表3
| 氨基酸置换 | 残留活性[％] |
| Asp2Glu | 67 |
| Lys4Arg | 69 |
| Lys49Met | 70 |
| 天然型 | 63 |
[表4]
表4
| 氨基酸置换 | 残留活性[％] |
| Lys4Arg | 78 |
| Asn6Asp | 78 |
| Lys7Glu | 80 |
| Asn21Tyr | 82 |
| Lys42Arg | 74 |
| Lys58Glu | 77 |
| 天然型 | 72 |
将发生了表3及表4所示的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质中的最残留活性高的、发生了Asn21Tyr的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质命名为SpA1，将包含编码SpA1的多核苷酸的表达载体命名为pET-SpA1。分别地，将SpA1的氨基酸序列示于序列号8，将编码SpA1的核苷酸序列示于序列号10。
实施例4氨基酸置换免疫球蛋白结合性蛋白质的制作
(1)
制作包含下述多核苷酸的表达载体(命名为pET-SpA’)，所述多核苷酸编码相对于天然型免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号1)导入了有助于稳定结构的Gly29Ala的氨基酸置换(Protein Engineering，1，107-113；非专利文献1)的蛋白质(命名为SpA’)。分别地，将SpA’的氨基酸序列示于序列号11，将编码SpA’的核苷酸序列示于序列号12。
(2)
通过使SpA’(序列号11)中集中通过实施例3而获知的、与提高免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性有关的氨基酸置换，来谋求稳定性的进一步提高。具体而言，设计、制作了以下的(a)至(e)所示的5种免疫球蛋白结合性蛋白质。
(a)相对于SpA’进一步导入了Lys7Glu及Asn21Tyr的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA2)
(b)相对于SpA2进一步导入了Lys58Glu的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA3a)
(c)相对于SpA3a进一步导入了Lys4Arg的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA4a)
(d)相对于SpA4a进一步导入了Lys49Met的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA5a)
(e)相对于SpA’导入了Lys4Arg、Lys7Glu及Lys58Glu的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA3b)
以下对(a)至(e)所示的5种免疫球蛋白结合性蛋白质的制作方法进行说明。
(a)SpA2
(a-1)
设计蛋白质SpA2：从通过实施例3而获知的、与提高碱稳定性有关的氨基酸置换中选择Lys7Glu及Asn21Tyr，使这些氨基酸置换在SpA’(序列号11)中集中。
(a-2)
合成(a-1)中设计的编码SpA2的核苷酸序列后，使用PCR制备包含上述核苷酸序列的多核苷酸。PCR如下实施：将上述合成的多核苷酸作为模板DNA，将由序列号23(5’-TAGCCATGGGCGCGGACAACAAA-3’)及序列号26(5’-CTACTCGAGTTTTGGCGCTTGTGCATC-3’)记载的核苷酸序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，制备由表1所示的组成构成的反应液之后，将该反应液在98℃下热处理30秒，将以98℃下10秒的第1步骤、55℃下5秒的第2步骤、72℃下60秒的第3步骤为1个循环的反应进行30个循环，最后在72℃下热处理2分钟。
(a-3)
对得到的多核苷酸进行纯化，用限制性内切酶NcoI和XhoI消化后，连接于预先用限制性内切酶NcoI和XhoI消化的表达载体pET-28a，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(a-4)
将得到的转化体在含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中培养后，用QIAprepSpin Miniprep kit(QIAGEN公司制)提取表达载体(命名为pET-SpA2)。
(a-5)
用与实施例1的(5)同样的方法进行pET-SpA2的核苷酸序列的分析。序列分析的结果是，确认表达载体pET-SpA2中插入了编码SpA2的多核苷酸。分别地，将SpA2的氨基酸序列示于序列号13，将编码SpA2的核苷酸序列示于序列号14。
(b)SpA3a
(b-1)
设计蛋白质SpA3a：从通过实施例3而获知的、与提高碱稳定性有关的氨基酸置换中选择Lys7Glu、Asn21Tyr及Lys58Glu，使这些氨基酸置换在SpA’(序列号11)中集中。
(b-2)
合成(b-1)中设计的编码SpA3a的多核苷酸后，使用PCR制备包含上述核苷酸序列的多核苷酸。PCR如下实施：将上述合成的多核苷酸作为模板DNA，将由序列号23及序列号27(5’-CTACTCGAGTTCTGGCGCTTGTGCATCGTTCAG-3’)记载的核苷酸序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，通过与(a-2)同样的方法进行PCR。
(b-3)
对得到的多核苷酸进行纯化，用限制性内切酶NcoI和XhoI消化后，连接于预先用限制性内切酶NcoI和XhoI消化的表达载体pET-28a，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(b-4)
将得到的转化体在含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中培养后，用QIAprepSpin Miniprep kit提取表达载体(命名为pET-SpA3a)。
(b-5)
用与实施例1的(5)同样的方法进行pET-SpA3a的核苷酸序列的分析。序列分析的结果是，确认表达载体pET-SpA3a中插入了编码SpA3a的多核苷酸。分别地，将SpA3a的氨基酸序列示于序列号15，将编码SpA3a的核苷酸序列示于序列号16。
(c)SpA4a
(c-1)
设计蛋白质SpA4a：从通过实施例3而获知的、与提高碱稳定性有关的氨基酸置换中选择Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr及Lys58Glu，使这些氨基酸置换在SpA’(序列号11)中集中。
(c-2)
合成(c-1)中设计的编码SpA4a的多核苷酸后，使用PCR制备包含上述核苷酸序列的多核苷酸。PCR如下实施：将上述合成的多核苷酸作为模板DNA，将由序列号24(5’-TAGCCATGGGCGCGGACAATCGATTC-3’)及序列号27记载的核苷酸序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，通过与(a-2)同样的方法进行PCR。
(c-3)
对得到的多核苷酸进行纯化，用限制性内切酶NcoI和XhoI消化后，连接于预先用限制性内切酶NcoI和XhoI消化的表达载体pET-28a，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(c-4)
将得到的转化体在含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中培养后，用QIAprepSpin Miniprep kit提取表达载体(命名为pET-SpA4a)。
(c-5)
用与实施例1的(5)同样的方法进行pET-SpA4a的核苷酸序列的分析。序列分析的结果是，确认表达载体pET-SpA4a中插入了编码SpA4a的多核苷酸。分别地，将SpA4a的氨基酸序列示于序列号17，将编码SpA4a的核苷酸序列示于序列号18。
(d)SpA5a
(d-1)
设计蛋白质SpA5a：从通过实施例3而获知的、与提高碱稳定性有关的氨基酸置换中选择Lys4Arg、Lys7Glu、Asn21Tyr、Lys49Met及Lys58Glu，使这些氨基酸置换在SpA’(序列号11)中集中。
(d-2)
合成(d-1)中设计的编码SpA5a的多核苷酸后，使用PCR制备包含上述核苷酸序列的多核苷酸。PCR如下实施：将上述合成的多核苷酸作为模板DNA，将由序列号25(5’-TAGCCATGGGCGCGGACAACCGCTTCAACGAA-3’)及序列号27记载的核苷酸序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，通过与(a-2)同样的方法进行PCR。
(d-3)
对得到的多核苷酸进行纯化，用限制性内切酶NcoI和XhoI消化后，连接于预先用限制性内切酶NcoI和XhoI消化的表达载体pET-28a，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(d-4)
将得到的转化体在含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中培养后，用QIAprepSpin Miniprep kit提取表达载体(命名为pET-SpA5a)。
(d-5)
用与实施例1的(5)同样的方法进行pET-SpA5a的核苷酸序列的分析。序列分析的结果是，确认表达载体pET-SpA5a中插入了编码SpA5a的多核苷酸。分别地，将SpA5a的氨基酸序列示于序列号19，将编码SpA5a的核苷酸序列示于序列号20。
(e)SpA3b
(e-1)
设计蛋白质SpA3b：从通过实施例3而获知的、与提高碱稳定性有关的氨基酸置换中选择Lys4Arg、Lys7Glu及Lys58Glu，使这些氨基酸置换在SpA’(序列号11)中集中。
(e-2)
合成(e-1)中设计的编码SpA3b的多核苷酸后，使用PCR制备包含上述核苷酸序列的多核苷酸。PCR如下实施：将上述合成的多核苷酸作为模板DNA，将由序列号25及序列号27记载的核苷酸序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，通过与(a-2)同样的方法进行PCR。
(e-3)
对得到的多核苷酸进行纯化，用限制性内切酶NcoI和XhoI消化后，连接于预先用限制性内切酶NcoI和XhoI消化的表达载体pET-28a，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(e-4)
将得到的转化体在含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中培养后，用QIAprepSpin Miniprep kit提取表达载体(命名为pET-SpA3b)。
(e-5)
用与实施例1的(5)同样的方法进行pET-SpA3b的核苷酸序列的分析。序列分析的结果是，确认表达载体pET-SpA3b中插入了编码SpA3b的多核苷酸。分别地，将SpA3b的氨基酸序列示于序列号21，将编码上述SpA3b的核苷酸序列示于序列号22。
实施例5氨基酸置换免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性评价
(1)
将表达实施例1中制作的天然型免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号1)及实施例4中制作的突变型(发生了氨基酸置换的)免疫球蛋白结合性蛋白质(SpA2(序列号13)、SpA3a(序列号15)、SpA4a(序列号17)、SpA5a(序列号19)、SpA3b(序列号21))的转化体分别接种于含有50μg/mL的卡那霉素的2mL的2×YT液体培养基，在37℃下好氧振荡培养一整夜，从而进行预培养。
(2)
向添加了50μg/mL卡那霉素的20mL的2×YT液体培养基中接种预培养液200μL，在37℃下进行好氧振荡培养。
(3)
在培养开始起3小时后，将培养温度变更为20℃，按照终浓度为0.1mM的方式添加IPTG，在20℃下好氧振荡培养一整夜。
(4)
培养结束后，利用离心分离收集菌体，使用BugBuster Protein ExtractionReagent(默克公司制)制备蛋白质提取液。
(5)
用实施例3的(4)记载的ELISA法测定(4)中制备的蛋白质提取液中的天然型免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号1)及突变型免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号13、15、17、19及21)的抗体结合活性。
(6)
按照使各蛋白质的浓度相等的方式用Tris缓冲生理盐水(TBS)进行稀释，将得到的蛋白质溶液中的一方与1M NaOH等量混合，另一者与TBS等量混合，然后在25℃下静置15小时。
(7)
加入4倍量的1M Tris缓冲液(pH7.0)后，利用实施例3的(4)记载的ELISA法测定碱处理(混合1M NaOH)及未进行碱处理(混合TBS)的蛋白质溶液的抗体结合活性。将进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，由此计算残留活性、评价碱稳定性。
将结果示于表5。这里所评价的突变型免疫球蛋白结合性蛋白质(SpA2(序列号13)、SpA3a(序列号15)、SpA4a(序列号17)、SpA5a(序列号19)及SpA3b(序列号21))与天然型免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号1)相比，残留活性均提高，确认这些突变型免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性提高。
[表5]
表5
实施例6向碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质中导入突变及文库的制作
选择实施例5中已评价的突变型免疫球蛋白结合性蛋白质中的SpA4a(实施例4(c))，通过易错PCR向编码SpA4a的多核苷酸部分(序列号18)随机导入突变。
(1)
使用实施例4的(c)中制作的表达载体pET-SpA4a作为模板DNA，进行易错PCR。易错PCR如下进行：制备表2所示的组成的反应液后，将该反应液在95℃下热处理2分钟，进行30个循环的以95℃下30秒的第1步骤、50℃下30秒的第2步骤、72℃下90秒的第3步骤为1个循环的反应，最后在72℃下热处理7分钟。通过上述易错PCR，向编码突变型的免疫球蛋白结合性蛋白质(SpA4a)的多核苷酸(序列号18)中良好地导入了突变，其平均突变导入率为1.09％。
(2)
对得到的PCR产物进行纯化后，用限制性内切酶NcoI和XhoI进行消化，连接于预先用限制性内切酶NcoI和XhoI消化的表达载体pET-28a。
(3)
连接反应结束后，用反应液转化大肠杆菌BL21(DE3)株，用含有50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基培养(37℃、16小时)后，将平板上形成的菌落作为随机突变体文库。
实施例7碱稳定型免疫球蛋白结合性蛋白质的筛选(其2)
(1)
将约1000株实施例6中制作的随机突变体文库(转化体)用实施例3的(1)至(2)记载的方法培养，从而表达免疫球蛋白结合性蛋白质。
(2)
将培养后通过离心操作得到的包含免疫球蛋白结合性蛋白质的培养上清用纯水稀释40倍。将稀释后的溶液与2M NaOH等量混合，在60℃下进行30分钟碱处理。碱处理后，用4倍量的1M Tris缓冲液(pH7.0)进行中和。
(3)
用实施例3的(4)记载的ELISA法分别测定进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性和未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性。
(4)
将进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，从而计算残留活性，选择表达与SpA4a相比碱稳定性提高(残留活性提高)的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(5)
培养所选择的转化体，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(6)
利用实施例1的(5)记载的方法分析得到的表达载体中插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的核苷酸序列，确定氨基酸置换位置。
将(4)中选择的转化体所表达的免疫球蛋白结合性蛋白质相对于SpA4a(序列号17)的氨基酸置换位置、及使用0.5M NaOH在25℃进行15小时碱处理时的残留活性[％]的汇总结果示于表6及表7。可以说，在序列号17记载的氨基酸序列中发生了至少1个Asn3Ile、Asn3Thr、Asn11Lys、Asn11Tyr及Lys(Glu)58Val(该表述表示在制作SpA4a时将序列号1的第58位的赖氨酸暂时置换为谷氨酸，并且进一步置换为缬氨酸)中的任一氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质与SpA4a(序列号17)相比，碱稳定性提高。
分别地，将在序列号17记载的氨基酸序列中发生了Asn317Ile(该表述表示序列号17的第3位的天冬氨酸被置换为异亮氨酸，以下同样)的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA5b)的氨基酸序列示于序列号28，将发生了Asn3 17Thr的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA5c)的氨基酸序列示于序列号29，将发生了Asn11 17Lys的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA5d)的氨基酸序列示于序列号30，将发生了Asn1117Tyr的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA5e)的氨基酸序列示于序列号31，将发生了Lys(Glu)5817Val的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA4b)的氨基酸序列示于序列号32。
[表6]
表6
[表7]
表7
实施例8对碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质导入突变及文库的制作
选择实施例7中已评价的突变型免疫球蛋白结合性蛋白质中的SpA5d(实施例6)，通过易错PCR向编码SpA5d的多核苷酸部分(序列号33)随机导入突变。
(1)
使用实施例6中制作的由随机突变体文库得到的SpA5d的表达载体作为模板DNA，进行易错PCR。易错PCR如下进行：制备表2所示的组成的反应液后，将该反应液在95℃下热处理2分钟，进行30个循环的以95℃下30秒的第1步骤、50℃下30秒的第2步骤、72℃下90秒的第3步骤为1个循环的反应，最后在72℃下热处理7分钟。通过上述易错PCR，在编码突变型的免疫球蛋白结合性蛋白质(SpA5d)的多核苷酸(序列号33)中良好地导入了突变，其平均突变导入率为0.92％。
(2)
对得到的PCR产物进行纯化后，用限制性内切酶NcoI和XhoI进行消化，连接于预先用限制性内切酶NcoI和XhoI消化的表达载体pET-28a。
(3)
连接反应结束后，用反应液转化大肠杆菌BL21(DE3)株，用含有50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基培养(37℃、16小时)后，将平板上形成的菌落作为随机突变体文库。
实施例9碱稳定型免疫球蛋白结合性蛋白质的筛选(其3)
(1)
将约1000株实施例8中制作的随机突变体文库(转化体)用实施例3的(1)至(2)记载的方法培养，从而表达免疫球蛋白结合性蛋白质。
(2)
将培养后通过离心操作得到的包含免疫球蛋白结合性蛋白质的培养上清用纯水稀释40倍。将稀释后的溶液与2M NaOH等量混合，在62℃下进行30分钟碱处理。碱处理后，用4倍量的1M Tris缓冲液(pH7.0)进行中和。
(3)
用实施例3的(4)记载的ELISA法分别测定进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性和未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性。
(4)
将进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，从而计算残留活性，选择表达与SpA5d相比碱稳定性提高(残留活性提高)的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(5)
培养所选择的转化体，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(6)
利用实施例1的(5)记载的方法分析所得到的表达载体中插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的核苷酸序列，确定氨基酸置换位置。
将(4)中选择的转化体所表达的免疫球蛋白结合性蛋白质相对于SpA5d(序列号30)的氨基酸置换位置、及使用0.5M NaOH在25℃进行15小时碱处理时的残留活性[％]的汇总结果示于表8。可以说，在序列号30记载的氨基酸序列中发生了至少1个Glu15Ala及Lys(Glu)58Gly中的任一氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质与SpA5d(序列号30)相比，碱稳定性提高。
将序列号30记载的氨基酸序列中发生了Glu15 30Ala(该表述表示序列号30的第15位的谷氨酸被置换为丙氨酸，以下同样)的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA6a)的氨基酸序列示于序列号34，将发生了Lys(Glu)5830Gly的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA5f)的氨基酸序列示于序列号35。
[表8]
表8
实施例10对碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质导入突变及文库的制作
选择实施例9中已评价的突变型免疫球蛋白结合性蛋白质中的SpA6a(实施例8)，通过易错PCR向编码SpA6a的多核苷酸部分(序列号36)中随机导入突变。
(1)
使用由实施例8中制作的随机突变体文库得到的SpA6a的表达载体作为模板DNA，进行易错PCR。易错PCR如下进行：制备表2、9、或10所示的组成的反应液后，将该反应液在95℃下热处理2分钟，进行30个循环的以95℃下30秒的第1步骤、50℃下30秒的第2步骤、72℃下90秒的第3步骤为1个循环的反应，最后在72℃下热处理7分钟。通过上述易错PCR，向编码突变型的免疫球蛋白结合性蛋白质(SpA6a)的多核苷酸(序列号36)中良好地导入了突变，关于其平均突变导入率，在表2的条件(组成)下进行PCR时为1.03％，在表9的条件(组成)下进行PCR时为1.44％，在表10的条件(组成)下进行PCR时为2.87％。
[表9]
表9
| 组成 | 体积 |
| 模板DNA(10ng/μL) | 1μL |
| PCR引物(序列号6)(10μM) | 4μL |
| PCR引物(序列号7)(10μM) | 4μL |
| 25mM MgCl2 | 12μL |
| 2.5mM dNTP混合物 | 8μL |
| 10mM MnCl2 | 4μL |
| 10×Ex Taq缓冲液(宝生物公司制) | 10μL |
| GoTaq DNA聚合酶(普洛麦格公司制) | 1μL |
| H2O | 添加到100μL |
[表10]
表10
| 组成 | 体积 |
| 模板DNA(10ng/μL) | 1μL |
| PCR引物(序列号6)(10μM) | 4μL |
| PCR引物(序列号7)(10μM) | 4μL |
| 25mM MgCl2 | 12μL |
| 2.5mM dNTP混合物 | 8μL |
| 10mM MnCl2 | 5μL |
| 10×Ex Taq缓冲液(宝生物公司制) | 10μL |
| GoTaq DNA聚合酶(普洛麦格公司制) | 1μL |
| H2O | 添加到100μL |
(2)
对得到的PCR产物进行纯化后，用限制性内切酶NcoI和XhoI进行消化，连接于预先用限制性内切酶NcoI和XhoI消化的表达载体pET-28a。
(3)
连接反应结束后，用反应液转化大肠杆菌BL21(DE3)株，用含有50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基培养(37℃、16小时)后，将平板上形成的菌落作为随机突变体文库。
实施例11碱稳定型免疫球蛋白结合性蛋白质的筛选(其4)
(1)
将实施例10中制作的随机突变体文库(转化体)约2500株(在表2的条件下得到的文库中的约1000株、在表9的条件下得到的文库中的约1000株、及在表10的条件下得到的文库中的约500株)用实施例3的(1)至(2)记载的方法培养，从而表达免疫球蛋白结合性蛋白质。
(2)
将培养后通过离心操作得到的包含免疫球蛋白结合性蛋白质的培养上清用纯水稀释40倍。将稀释后的溶液与2M NaOH等量混合，在65～68℃下进行30分钟碱处理。碱处理后，用4倍量的1M Tris缓冲液(pH7.0)进行中和。
(3)
用实施例3的(4)记载的ELISA法分别测定进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性和未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性。
(4)
将进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，从而计算残留活性，选择表达与SpA6a相比碱稳定性提高(残留活性提高)的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(5)
培养所选择的转化体，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(6)
利用实施例1的(5)记载的方法分析得到的表达载体中插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的核苷酸序列，确定氨基酸置换位置。
将(4)中选择的转化体所表达的免疫球蛋白结合性蛋白质相对于SpA6a(序列号34)的氨基酸置换位置、及使用0.5M NaOH在25℃进行15小时碱处理时的残留活性[％]的汇总结果示于表11、表12、及表13。可以说，在序列号34记载的氨基酸序列中发生了至少1个Val40Ala、Asn3Ile、Lys(Glu)58Asp、及Lys(Glu)58Val中的任一氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质与SpA6a(序列号34)相比，碱稳定性提高。
分别地，将在序列号34记载的氨基酸序列中发生了Val4034Ala(该表述表示序列号34的第40位的缬氨酸被置换为丙氨酸，以下同样)的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA7a)的氨基酸序列示于序列号37，将发生了Asn334Ile的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA7b)的氨基酸序列示于序列号38，将发生了Lys(Glu)5834Asp的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA6b)的氨基酸序列示于序列号39，将发生了Lys(Glu)5834Val的氨基酸置换的蛋白质(命名为SpA6c)的氨基酸序列示于序列号40。
[表11]
表11
[表12]
表12
[表13]
表13
产业上的可利用性
本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质为包含下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列为将来自葡萄球菌属细菌的蛋白A的结构域C等免疫球蛋白结合结构域的特定位置处的氨基酸残基置换为其它特定的氨基酸残基而成的。本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质对碱的稳定性提高，作为用于分离抗体(免疫球蛋白)的吸附剂中的配体蛋白有用。
序列表
<110> 东曹株式会社(TOSOH Corporation)
<120> 免疫球蛋白结合性蛋白质
<130> 2170130-8327
<150> JP2017-216028
<151> 2017-11-09
<150> JP2018-043281
<151> 2018-03-09
<150> JP2018-128287
<151> 2018-07-05
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 1
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Lys49Met
<400> 2
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Met Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 3
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 大肠杆菌密码子
<400> 3
gcggataaca agttcaacaa agaacagcag aatgcctttt atgagattct gcatttaccg 60
aatctgaccg aagaacaacg caatggcttt atccagtcgt tgaaagacga tccaagtgtg 120
agcaaagaga ttctggcaga agccaagaaa ctcaacgatg cgcaagctcc gaaa 174
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 4
tagccatggg cgcggataac aagttc 26
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 5
ctactcgagt ttcggagctt gcgcatc 27
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 6
taatacgact cactataggg 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 7
tatgctagtt attgctcag 19
<210> 8
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SpA1(Asn21Tyr)
<400> 8
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Tyr Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 9
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Lys58Glu
<400> 9
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Glu
50 55
<210> 10
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码SpA1的多核苷酸
<400> 10
gcggataaca agttcaacaa agaacagcag aatgcctttt atgagattct gcatttaccg 60
tatctgaccg aagaacaacg caatggcttt atccagtcgt tgaaagacga tccaagtgtg 120
agcaaagaga ttctggcaga agccaagaaa ctcaacgatg cgcaagctcc gaaa 174
<210> 11
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SpA'(Gly29Ala)
<400> 11
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 12
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码SpA'的多核苷酸
<400> 12
gcggataaca agttcaacaa agaacagcag aatgcctttt atgagattct gcatttaccg 60
aatctgaccg aagaacaacg caatgccttt atccagtcgt tgaaagacga tccaagtgtg 120
agcaaagaga ttctggcaga agccaagaaa ctcaacgatg cgcaagctcc gaaa 174
<210> 13
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SpA2(Lys7Glu,Asn21Tyr,Gly29Ala)
<400> 13
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Glu Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Tyr Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 14
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码SpA2的多核苷酸
<400> 14
gcggacaaca aattcaacga agaacagcag aatgcctttt acgagattct gcatttaccg 60
tatctgaccg aagaacaacg caatgccttt atccagagct tgaaagatga tccgagtgtg 120
tcgaaagaga ttctcgctga agcgaagaaa ctgaacgatg cacaagcgcc aaaa 174
<210> 15
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SpA3a(Lys7Glu,Asn21Tyr,Gly29Ala,Lys58Glu)
<400> 15
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Glu Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Tyr Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Glu
50 55
<210> 16
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码SpA3a的多核苷酸
<400> 16
gcggacaaca aattcaacga agaacagcag aatgcctttt acgagattct gcatttaccg 60
tatctgaccg aagaacaacg caatgccttt atccagagct tgaaagatga tccgagtgtg 120
tcgaaagaga ttctcgctga agcgaagaaa ctgaacgatg cacaagcgcc agaa 174
<210> 17
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SpA4a(Lys4Arg,Lys7Glu,Asn21Tyr,Gly29Ala,Lys58Glu)
<400> 17
Ala Asp Asn Arg Phe Asn Glu Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Tyr Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Glu
50 55
<210> 18
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码SpA4a的多核苷酸
<400> 18
gcggacaatc gattcaacga agaacagcag aatgcctttt acgagattct gcatttaccg 60
tatctgaccg aagaacaacg caatgccttt atccagagct tgaaagatga tccgagtgtg 120
tcgaaagaga ttctcgctga agcgaagaaa ctgaacgatg cacaagcgcc agaa 174
<210> 19
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SpA5a(Lys4Arg,Lys7Glu,Asn21Tyr,Gly29Ala,Lys49Met,Lys58Glu)
<400> 19
Ala Asp Asn Arg Phe Asn Glu Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Tyr Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Met Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Glu
50 55
<210> 20
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码SpA5a的多核苷酸
<400> 20
gcggacaacc gcttcaacga agaacagcag aatgcctttt acgagattct gcatttaccg 60
tatctgaccg aagaacaacg caatgccttt atccagagct tgaaagatga tccgagtgtg 120
tcgaaagaga ttctcgctga agcgatgaaa ctgaacgatg cacaagcgcc agaa 174
<210> 21
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SpA3b(Lys4Arg,Lys7Glu,Gly29Ala,Lys58Glu)
<400> 21
Ala Asp Asn Arg Phe Asn Glu Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Glu
50 55
<210> 22
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码SpA3b的多核苷酸
<400> 22
gcggacaacc gcttcaacga agaacagcag aatgcctttt acgagattct gcatttaccg 60
aatctgaccg aagaacaacg caatgccttt atccagagct tgaaagatga tccgagtgtg 120
tcgaaagaga ttctcgctga agcgaagaaa ctgaacgatg cacaagcgcc agaa 174
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 23
tagccatggg cgcggacaac aaa 23
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 24
tagccatggg cgcggacaat cgattc 26
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 25
tagccatggg cgcggacaac cgcttcaacg aa 32
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 26
ctactcgagt tttggcgctt gtgcatc 27
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 27
ctactcgagt tctggcgctt gtgcatcgtt cag 33
<210> 28
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SpA5b(Asn3Ile,Lys4Arg,Lys7Glu,Asn21Tyr,Gly29Ala,Lys58Glu)
<400> 28
Ala Asp Ile Arg Phe Asn Glu Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Tyr Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Glu
50 55
<210> 29
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SpA5c(Asn3Thr,Lys4Arg,Lys7Glu,Asn21Tyr,Gly29Ala,Lys58Glu)
<400> 29
Ala Asp Thr Arg Phe Asn Glu Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Tyr Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Glu
50 55
<210> 30
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SpA5d(Lys4Arg,Lys7Glu,Asn11Lys,Asn21Tyr,Gly29Ala,Lys58Glu)
<400> 30
Ala Asp Asn Arg Phe Asn Glu Glu Gln Gln Lys Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Tyr Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Glu
50 55
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<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> SpA5e(Lys4Arg,Lys7Glu,Asn11Tyr,Asn21Tyr,Gly29Ala,Lys58Glu)
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Leu His Leu Pro Tyr Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Glu
50 55
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20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Val
50 55
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 编码SpA5d的多核苷酸
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tatctgaccg aagaacaacg caatgccttt atccagagct tgaaagatga tccgagtgtg 120
tcgaaagaga ttctcgctga agcgaagaaa ctgaacgatg cacaagcgcc agaa 174
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Glu
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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
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<223> 编码SpA6a的多核苷酸
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,Lys58Glu)
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p)
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20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Val
50 55
Claims (10)
1.一种免疫球蛋白结合性蛋白质，其包含蛋白A的免疫球蛋白结合结构域，其中，所述免疫球蛋白结合性蛋白质的氨基酸序列为在序列1的基础上，进行选自以下的(3)、(15)至(29)任一项的氨基酸置换：
(3)相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸
(15)相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸及相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸
(16)相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸
(17)相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸、相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸
(18)相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸、相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸、相当于序列号1的第49位的赖氨酸的氨基酸残基置换为甲硫氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸
(19)相当于序列号1的第3位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为异亮氨酸、相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸、相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸
(20)相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸、相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第11位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为赖氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸
(21)相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸、相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第11位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸
(22)相当于序列号1的第3位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为苏氨酸、相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸、相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸
(23)相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸、相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为缬氨酸
(24)相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸、相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第11位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为赖氨酸、相当于序列号1的第15位的谷氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸
(25)相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸、相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第11位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为赖氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为甘氨酸
(26)相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸、相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第11位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为赖氨酸、相当于序列号1的第15位的谷氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸、相当于序列号1的第40位的缬氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸
(27)相当于序列号1的第3位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为异亮氨酸、相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸、相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第11位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为赖氨酸、相当于序列号1的第15位的谷氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸
(28)相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸、相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第11位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为赖氨酸、相当于序列号1的第15位的谷氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为天冬氨酸
(29)相当于序列号1的第4位的赖氨酸的氨基酸残基置换为精氨酸、相当于序列号1的第7位的赖氨酸的氨基酸残基置换为谷氨酸、相当于序列号1的第11位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为赖氨酸、相当于序列号1的第15位的谷氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸、相当于序列号1的第21位的天冬酰胺的氨基酸残基置换为酪氨酸、相当于序列号1的第29位的甘氨酸的氨基酸残基置换为丙氨酸及相当于序列号1的第58位的赖氨酸的氨基酸残基置换为缬氨酸。
2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白结合性蛋白质，其中，所述免疫球蛋白结合性蛋白质的氨基酸序列为序列号8、13、15、17、及19中任一者记载的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的免疫球蛋白结合性蛋白质，其中，所述免疫球蛋白结合性蛋白质的氨基酸序列为序列号28至32、34、35、及37至40中任一者记载的氨基酸序列。
4.一种多核苷酸，其编码权利要求1至3中任一项所述的免疫球蛋白结合性蛋白质。
5.一种表达载体，其包含权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种转化体，其具有权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的转化体，其为大肠杆菌(Escherichia coli)。
8.一种免疫球蛋白结合性蛋白质的制造方法，其包含下述工序：
培养权利要求6或7所述的转化体，从而表达权利要求1至3中任一项所述的免疫球蛋白结合性蛋白质的工序；和
回收表达的上述蛋白质的工序。
9.一种免疫球蛋白吸附剂，其具备不溶性载体、和固定于该不溶性载体的权利要求1至3中任一项所述的免疫球蛋白结合性蛋白质。
10.一种免疫球蛋白的分离方法，其包含下述工序：
向填充有权利要求9所述的吸附剂的柱中添加包含免疫球蛋白的溶液，使该免疫球蛋白吸附于上述吸附剂的工序；和
将吸附于上述吸附剂的免疫球蛋白洗脱的工序。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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