JP2021136967A - 熱に対する安定性が向上したFc結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち24番目のアラニンから297番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち21番目のイソロイシンから119番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、以下の(1)から(7)に示すいずれかの変異を少なくとも1つ以上有する、Fc結合性タンパク質;
(1)配列番号1の50番目のセリンがスレオニンに置換される変異
(2)配列番号1の76番目のトリプトファンが欠失する変異
(3)配列番号1の89番目のスレオニンがバリンに置換される変異
(4)配列番号1の167番目のグルタミンがグルタミン酸に置換される変異
(5)配列番号1の169番目のリジンがアスパラギンに置換される変異
(6)配列番号2の26番目のリジンがイソロイシンに置換される変異
(7)配列番号2の80番目のトリプトファンがセリンに置換される変異
(ii)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち24番目のアラニンから297番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち21番目のイソロイシンから119番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、前記(1)から(7)に示すいずれかの変異を少なくとも1つ以上有し、さらに前記(1)から(7)に示す変異以外に1もしくは数個の位置での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか1つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するFc結合性タンパク質;
(iii)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち24番目のアラニンから297番目のセリンまで、および配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち21番目のイソロイシンから119番目のメチオニンまでのアミノ酸配列において、前記(1)から(7)に示すいずれかの変異を少なくとも1つ以上有するアミノ酸配列全体に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、ただし前記(1)から(7)に示すいずれかの変異が少なくとも1つ残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するFc結合性タンパク質。
(iv)配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち29番目のアラニンから426番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該29番目から426番目までのアミノ酸残基において、以下の(1)から(7)に示すいずれかの変異を少なくとも1つ以上有する、Fc結合性タンパク質;
(1)配列番号3の55番目のセリンがスレオニンに置換される変異
(2)配列番号3の81番目のトリプトファンが欠失する変異
(3)配列番号3の94番目のスレオニンがバリンに置換される変異
(4)配列番号3の172番目のグルタミンがグルタミン酸に置換される変異
(5)配列番号3の174番目のリジンがアスパラギンに置換される変異
(6)配列番号3の333番目のリジンがイソロイシンに置換される変異
(7)配列番号3の387番目のトリプトファンがセリンに置換される変異
(v)配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち29番目のアラニンから426番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該29番目から426番目までのアミノ酸残基において、前記(1)から(7)に示すいずれかの変異を少なくとも1つ以上有し、さらに前記(1)から(7)に示す変異以外に1もしくは数個の位置での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか1つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するFc結合性タンパク質;
(vi)配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち29番目のアラニンから426番目のメチオニンまでのアミノ酸配列において、前記(1)から(7)に示すいずれかの変異を少なくとも1つ以上有するアミノ酸配列全体に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、ただし前記(1)から(7)に示すいずれかの変異が少なくとも1つ残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するFc結合性タンパク質。
(8)配列番号1の71番目または配列番号3の76番目のシステインがアルギニンに置換される変異
(9)配列番号1の78番目または配列番号3の83番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
(10)配列番号1の151番目または配列番号3の156番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異
(11)配列番号1の192番目または配列番号3の197番目のアルギニンがロイシンに置換される変異
(12)配列番号1の196番目または配列番号3の201番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
(13)配列番号1の232番目または配列番号3の237番目のグルタミンがロイシンに置換される変異
(14)配列番号1の295番目または配列番号3の300番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異。
(2)配列番号1の76番目または配列番号3の81番目のトリプトファンが欠失する変異。
(vii)配列番号6、8、10、12、14および16のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、29番目のアラニンから425番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Fc結合性タンパク質;
(viii)配列番号6、8、10、12、14および16のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、29番目のアラニンから425番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該29番目から425番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有する変異以外に1もしくは数個の位置での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか1つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有する、Fc結合性タンパク質;
(ix)配列番号6、8、10、12、14および16のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、29番目のアラニンから425番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該29番目から425番目までのアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有し、かつ前記アミノ酸配列が有する変異が残存し、かつ抗体結合活性を有する、Fc結合性タンパク質。
(I)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるヒトFcRnα鎖の細胞外領域(図1のECの領域)に相当する、24番目のアラニンから297番目のセリンまでのアミノ酸残基
(II)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるヒトFcRnβ鎖のβ2ミクログロブリン領域(図2のB2Mの領域)に相当する、21番目のイソロイシンから119番目のメチオニンまでのアミノ酸残基
したがって、本発明のFc結合性タンパク質は、ヒトFcRnα鎖の細胞外領域(図1のEC領域)やヒトFcRnβ鎖のβ2ミクログロブリン領域(図2のB2Mの領域)のN末端側にあるシグナルペプチド領域(図1および図2のSの領域)の全てまたは一部を含んでもよいし、ヒトFcRnα鎖の細胞外領域(図1のEC領域)のC末端側にある細胞膜貫通領域(図1のTMの領域)および細胞外領域(図1のCの領域)の全てまたは一部を含んでもよい。
(ii)前述した特定位置における変異に加え、1もしくは数個の位置での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか1つ以上をさらに有したFc結合性タンパク質(ただし、前述した特定位置における変異が少なくとも1つ残存していること)
(iii)前述した特定位置における変異に加え、1もしくは数個の位置での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか1つ以上をさらに有し(ただし、前述した特定位置における変異が少なくとも1つ残存していること)、さらにCys76Arg、Asn83Asp、Gly156Asp、Arg197Leu、Asn201Asp、Glu237LeuおよびLys300Gluの変異を全て有したFc結合性タンパク質
(iv)前述した特定位置における変異を有したポリペプチドのアミノ酸配列全体に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するFc結合性タンパク質(ただし、前述した特定位置における変異が少なくとも1つ残存していること)
(v)前述した特定位置における変異を有したポリペプチドのアミノ酸配列全体に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するFc結合性タンパク質であり(ただし、前述した特定位置における変異が少なくとも1つ残存していること)、ただしCys76Arg、Asn83Asp、Gly156Asp、Arg197Leu、Asn201Asp、Glu237LeuおよびLys300Gluの変異を全て有したFc結合性タンパク質
このうち前記(i)、(iii)および(v)に記載のCys76Arg、Asn83Asp、Gly156Asp、Arg197Leu、Asn201Asp、Glu237LeuおよびLys300Gluの変異は、熱安定性および遺伝子組換体による生産性を向上させる変異である(特開2018−183087号公報)。したがって、前述した特定位置における変異を少なくとも1つ以上有した本発明のFc結合性タンパク質に、前記7箇所の変異(Cys76Arg、Asn83Asp、Gly156Asp、Arg197Leu、Asn201Asp、Glu237LeuおよびLys300Glu)をさらに有することで、特開2018−183087号で開示のFc結合性タンパク質よりも熱に対する安定性がさらに向上したタンパク質が得られる。
ちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換をさらに有していてもよい。保守的置
換は、Fc結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていな
いものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守
的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリ
ンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる(タンパク
質の構造と機能、メディカル・サイエンス・インターナショナル社、9、2005)。
配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち、29番目のアラニンから426番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該29番目から426番目のアミノ酸残基において、Cys76Arg、ΔTrp81、Asn83Asp、Gly156Asp、Arg197Leu、Asn201Asp、Gln237LeuおよびLys300Gluの変異を有するポリペプチド。
配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち、29番目のアラニンから426番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該29番目から426番目のアミノ酸残基において、Cys76Arg、ΔTrp81、Asn83Asp、Gly156Asp、Arg197Leu、Asn201Asp、Gln237Leu、Lys300GluおよびLys333Ileの変異を有するポリペプチド。
配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち、29番目のアラニンから426番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該29番目から426番目のアミノ酸残基において、Cys76Arg、ΔTrp81、Asn83Asp、Gly156Asp、Arg197Leu、Asn201Asp、Gln237Leu、Lys300GluおよびTrp387Serの変異を有するポリペプチド。
配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち、29番目のアラニンから426番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該29番目から426番目のアミノ酸残基において、Cys76Arg、ΔTrp81、Asn83Asp、Gly156Asp、Gln172Glu、Arg197Leu、Asn201Asp、Gln237Leu、Lys300Glu、Lys333Ileの変異を有するポリペプチド。
配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち、29番目のアラニンから426番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該29番目から426番目のアミノ酸残基において、Cys76Arg、ΔTrp81、Asn83Asp、Gly156Asp、Gln172Glu、Arg197Leu、Asn201Asp、Gln237Leu、Lys300Glu、Trp387Serの変異を有するポリペプチド。
配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち、29番目のアラニンから426番目のメチオニンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該29番目から426番目のアミノ酸残基において、Cys76Arg、ΔTrp81、Asn83Asp、Gly156Asp、Gln172Glu、Arg197Leu、Asn201Asp、Gln237Leu、Lys300Glu、Lys333Ile、Trp387Serの変異を有するポリペプチド。
(A)本発明のFc結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
(B)Fc結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはFc結合性タンパク質のcDNA等からPCR法といったDNA増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、trpプロモータ、tacプロモータ、trcプロモータ、lacプロモータ、T7プロモータ、recAプロモータ、lppプロモータ、さらにはλファージのλPLプロモータ、λPRプロモータ等があげられる。
せた後、適切な溶出液をカラムに添加することで抗体を溶出すればよい。なお本発明の吸着剤で精製可能な抗体は、Fc結合性タンパク質と親和性を有する抗体のFc領域を少なくとも含んだ抗体であればよい。一例として、抗体医薬に用いる抗体として一般的に用いられているキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体やそれらのアミノ酸置換体があげられる。また二重特異性抗体(バイスペシフィック抗体)、抗体のFc領域と他のタンパク質との融合抗体、抗体のFc領域と薬物との複合体(ADC)などの人工的に構造改変した抗体であっても、本発明の吸着剤で精製できる。また抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に精製できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示でき、緩衝液のpHは、pH3.0から10.0、好ましくはpH5.0から8.0である。
特開2018−183087号に記載の方法で作製した、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるFc結合性タンパク質を発現する発現ベクターpET−FcRn_m7のうち、前記Fc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分(配列番号5)に対し、エラープローンPCRによるランダム変異導入を施した。なお配列番号4に記載の配列からなるFc結合性タンパク質は、配列番号1に記載の配列からなる天然型ヒトFcRnα鎖の細胞外領域および配列番号2に記載の配列からなる同β鎖のβ2ミクログロブリン領域を含む、配列番号3に記載の配列からなるFc結合性タンパク質に以下に示す7箇所のアミノ酸置換(変異)を導入したポリペプチドである。
配列番号3の76番目(配列番号1では71番目)のシステインがアルギニンに置換される変異
配列番号3の83番目(配列番号1では78番目)のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
配列番号3の156番目(配列番号1では151番目)のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異
配列番号3の197番目(配列番号1では192番目)のアルギニンがロイシンに置換される変異
配列番号3の201番目(配列番号1では196番目)のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
配列番号3の237番目(配列番号1では232番目)のグルタミン酸がロイシンに置換される変異
配列番号3の300番目(配列番号1では295番目)のリジンがグルタミン酸に置換される変異
(1)前述したpET−FcRn_m7を鋳型DNAとして用い、エラープローンPCRを行なった。エラープローンPCRは、配列番号18および19に記載のプライマーを用いて、表2に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を95℃で2分間熱処理し、95℃で30秒間の第1ステップ、60℃で30秒間の第2ステップ、72℃で90秒間の第3ステップを1サイクルとする反応を35サイクル行ない、最後に72℃で7分間熱処理することで行なった。
(1)実施例2で作製したランダム変異体ライブラリー(形質転換体)を、50μg/mLのカナマイシンを含む2YT液体培地(ペプトン16g/L、酵母エキス10g/L、塩化ナトリウム5g/L)200μLに接種し、96穴ディープウェルプレートを用いて、30℃で一晩振とう培養した。
(4−1)ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤(化学及血清療法研究所製)を、96穴マイクロプレートのウェルに1μg/wellで固定化し(4℃で18時間)、固定化終了後、2%(w/v)のSKIM MILK(BD社製)および150mMの塩化ナトリウムを含んだ20mMのリン酸緩衝液(pH6.0)によりブロッキングした。
(4−2)洗浄緩衝液(0.05%[w/v]のTween 20、150mMのNaClを含む20mM Tris−HCl緩衝液(pH6.0))で洗浄後、抗体結合活性を評価するFc結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Fc結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた(30℃で1時間)。
(4−3)反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、100ng/mLに希釈したAnti−6His抗体(Bethyl Laboratories社製)を100μL/wellで添加した。
(4−4)30℃で1時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、TMB Peroxidase Substrate(KPL社製)を50μL/wellで添加した。1Mのリン酸を50μL/wellで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー(テカン社製)にて450nmの吸光度を測定した。
実施例2で判明したFc結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換(変異)を、FcRn−m7Δ1に導入することで、さらなる熱安定性向上を図った。変異導入(アミノ酸置換の集積)は主にPCRを用いて行ない、以下の(a)から(e)に示す5種類のFc結合性タンパク質を作製した。
(a)FcRn−m7Δ1に対し、さらにLys333Ileの変異を導入したポリペプチド(FcRn−m8Δ1Aと命名)
(b)FcRn−m7Δ1に対し、さらにTrp387Serのアミノ酸置換を導入したポリペプチド(FcRn−m8Δ1Bと命名)
(c)FcRn−m7Δ1に対し、さらにGln172GluおよびLys333Ileのアミノ酸置換を導入したポリペプチド(FcRn−m9Δ1Aと命名)
(d)FcRn−m7Δ1に対し、さらにGln172GluおよびTrp387Serのアミノ酸置換を導入したポリペプチド(FcRn−m9Δ1Bと命名)
(e)FcRn−m7Δ1に対し、さらにGln172Glu、Lys333IleおよびTrp387Serのアミノ酸置換を導入したポリペプチド(FcRn−m10Δ1と命名)
以下、各Fc結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
実施例2で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からLys333Ileを選択し、当該変異をFcRn−m7Δ1に集積したFcRn−m8Δ1Aを作製した。具体的には、実施例2で得られたFcRn−m7Δ1をコードするポリヌクレオチドに対して、Lys333Ileを生じさせる変異導入を行なうことでFcRn−m8Δ1Aを作製した。
実施例2で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からTrp387Serを選択し、当該変異をFcRn−m7Δ1に集積したFcRn−m8Δ1Bを作製した。具体的には、実施例2で得られたFcRn−m7Δ1をコードするポリヌクレオチドに対して、Trp387Serを生じさせる変異導入を行なうことでFcRn−m8Δ1Bを作製した。
実施例2で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からGln172GluおよびLys333Ileを選択し、これら変異をFcRn−m7Δ1に集積したFcRn−m9Δ1Aを作製した。具体的には、(a)で得られたFcRn−m8Δ1Aをコードするポリヌクレオチドに対して、Gln172Gluを生じさせる変異導入を行なうことでFcRn−m9Δ1Aを作製した。
実施例2で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からGln172GluおよびTrp387Serを選択し、これら変異をFcRn−m7Δ1に集積したFcRn−m9Δ1Bを作製した。具体的には、(b)で得られたFcRn−m8Δ1Bをコードするポリヌクレオチドに対して、Gln172Gluを生じさせる変異導入を行なうことでFcRn−m9Δ1Bを作製した。
実施例2で明らかとなった熱安定性向上に関与する変異の中からGln172Glu、Lys333IleおよびTrp387Serを選択し、FcRn−m7Δ1に集積したFcRn−m10Δ1を作製した。具体的には、(c)で得られたFcRn−m9Δ1Aをコードするポリヌクレオチドに対して、Trp387Serを生じさせる変異導入を行なうことでFcRn−m10Δ1を作製した。
(1)実施例2で作製したFcRn−m7Δ1、ならびに実施例3で作製したFcRn−m8Δ1A、FcRn−m8Δ1B、FcRn−m9Δ1A、FcRn−m9Δ1BおよびFcRn−m10Δ1を発現する形質転換体を、それぞれ50μg/mLのカナマイシンを含む3mLの2YT液体培地(ペプトン16g/L、酵母エキス10g/L、塩化ナトリウム5g/L)に接種し、37℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
Claims (12)
- 以下の(i)から(iii)のいずれかから選択されるFc結合性タンパク質:
(i)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち24番目のアラニンから297番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち21番目のイソロイシンから119番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において、以下の(1)から(7)に示すいずれかの変異を少なくとも1つ以上有する、Fc結合性タンパク質;
(1)配列番号1の50番目のセリンがスレオニンに置換される変異
(2)配列番号1の76番目のトリプトファンが欠失する変異
(3)配列番号1の89番目のスレオニンがバリンに置換される変異
(4)配列番号1の167番目のグルタミンがグルタミン酸に置換される変異
(5)配列番号1の169番目のリジンがアスパラギンに置換される変異
(6)配列番号2の26番目のリジンがイソロイシンに置換される変異
(7)配列番号2の80番目のトリプトファンがセリンに置換される変異
(ii)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち24番目のアラニンから297番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち21番目のイソロイシンから119番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において、前記(1)から(7)に示すいずれかの変異を少なくとも1つ以上有し、さらに前記(1)から(7)に示す変異以外に1もしくは数個の位置での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか1つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するFc結合性タンパク質;
(iii)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち24番目のアラニンから297番目のセリンまで、および配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち21番目のイソロイシンから119番目のメチオニンまでのアミノ酸配列において、前記(1)から(7)に示すいずれかの変異を少なくとも1つ以上有するアミノ酸配列全体に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、ただし前記(1)から(7)に示すいずれかの変異が少なくとも1つ残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するFc結合性タンパク質。 - 以下の(iv)から(vi)のいずれかから選択されるFc結合性タンパク質:
(iv)配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち29番目のアラニンから426番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該29番目から426番目までのアミノ酸残基において、以下の(1)から(7)に示すいずれかの変異を少なくとも1つ以上有する、Fc結合性タンパク質;
(1)配列番号3の55番目のセリンがスレオニンに置換される変異
(2)配列番号3の81番目のトリプトファンが欠失する変異
(3)配列番号3の94番目のスレオニンがバリンに置換される変異
(4)配列番号3の172番目のグルタミンがグルタミン酸に置換される変異
(5)配列番号3の174番目のリジンがアスパラギンに置換される変異
(6)配列番号3の333番目のリジンがイソロイシンに置換される変異
(7)配列番号3の387番目のトリプトファンがセリンに置換される変異
(v)配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち29番目のアラニンから426番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該29番目から426番目までのアミノ酸残基において、前記(1)から(7)に示すいずれかの変異を少なくとも1つ以上有し、さらに前記(1)から(7)に示す変異以外に1もしくは数個の位置での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか1つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するFc結合性タンパク質;
(vi)配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち29番目のアラニンから426番目のメチオニンまでのアミノ酸配列において、前記(1)から(7)に示すいずれかの変異を少なくとも1つ以上有するアミノ酸配列全体に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、ただし前記(1)から(7)に示すいずれかの変異が少なくとも1つ残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するFc結合性タンパク質。 - さらに以下の(8)から(14)に示す全ての変異を有する、請求項1または2に記載のFc結合性タンパク質;
(8)配列番号1の71番目または配列番号3の76番目のシステインがアルギニンに置換される変異
(9)配列番号1の78番目または配列番号3の83番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
(10)配列番号1の151番目または配列番号3の156番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異
(11)配列番号1の192番目または配列番号3の197番目のアルギニンがロイシンに置換される変異
(12)配列番号1の196番目または配列番号3の201番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異
(13)配列番号1の232番目または配列番号3の237番目のグルタミンがロイシンに置換される変異
(14)配列番号1の295番目または配列番号3の300番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異。 - 以下の(2)に示す変異を少なくとも有する、請求項1から3のいずれかに記載のFc結合性タンパク質:
(2)配列番号1の76番目または配列番号3の81番目のトリプトファンが欠失する変異。 - 以下の(vii)から(ix)のいずれかから選択される、請求項4に記載のFc結合性タンパク質:
(vii)配列番号6、8、10、12、14および16のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、29番目のアラニンから425番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Fc結合性タンパク質;
(viii)配列番号6、8、10、12、14および16のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、29番目のアラニンから425番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該29番目から425番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有する変異以外に1もしくは数個の位置での1もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか1つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有する、Fc結合性タンパク質;
(ix)配列番号6、8、10、12、14および16のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、29番目のアラニンから425番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該29番目から425番目までのアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有し、かつ前記アミノ酸配列が有する変異が残存し、かつ抗体結合活性を有する、Fc結合性タンパク質。 - 請求項1から5のいずれかに記載のFc結合性タンパク質をコードするポヌクレオチド。
- 請求項6に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項7に記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる、Fc結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
- 宿主が大腸菌である、請求項8に記載の形質転換体。
- 請求項8または9に記載の形質転換体を培養することによりFc結合性タンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記Fc結合性タンパク質を回収する工程とを含む、Fc結合性タンパク質の製造方法。
- 請求項1から5のいずれかに記載のFc結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、抗体吸着剤。
- 請求項11に記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。
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