JP7009913B2 - アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、免疫グロブリンに親和性のあるＦｃ結合性タンパク質に関する。より詳しくは、本発明はヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、特定位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、遺伝子組換体による生産性が向上したＦｃ結合性タンパク質に関する。

抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質として、細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＰｒｏｔｅｉｎ ＡやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ、ヒト由来のＦｃ受容体、Ｆｃ結合能を有した前記Ｆｃ受容体の部分領域等が知られている。

Ｆｃ受容体は、体内の免疫機構に関与し、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃ受容体上の認識ドメインによって認識している。これによって、免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる。Ｆｃ受容体は、さらにいくつかのサブタイプに分類することができ、ＩｇＧに対する受容体であるＦｃγ受容体、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃε受容体、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃα受容体等がある。また各受容体は更に細かく分類されており、例えばＦｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。

Ｆｃγ受容体の中でも、ヒトＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの細胞表面に存在しており、ヒト免疫機構の中でも重要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に関与している重要な受容体である。また、抗体の糖鎖構造の違いにより、抗体との結合性が異なることが知られている（非特許文献２）。なお、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＧｅｎＢａｎｋ（ＡＡＨ１７８６５．１）等の公的データベースに公表されている。

一方、抗体の糖鎖構造は、抗体医薬品における薬効や安定性に大きく関与するため、抗体医薬品を製造する際に糖鎖構造を制御することは極めて重要である。抗体の糖鎖構造を認識するＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を用いることで、抗体をその糖鎖構造に基づく結合性の違いにより分離できる（特許文献１および２）。このため、前記吸着剤は抗体医薬品製造時の工程分析や分取に有用である。

なおヒトＦｃγＲＩＩＩａには、配列番号１における１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンであるタイプとバリン（配列番号１の態様）であるタイプの遺伝子多型が存在し、バリンのタイプの方が抗体親和性は高く、フェニルアラニンのタイプの方が抗体親和性は低いことが知られている（非特許文献３および４）。

特開２０１５－０８６２１６号公報 特開２０１６－１６９１９７号公報

Ｔａｋａｉ．Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８－３２６，２００５ Ｃ．Ｌ．Ｃｈｅｎ等，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．，１２，１３３５－１３４５，２０１７ Ｈ．Ｒ．Ｋｏｅｎｅ等，Ｂｌｏｏｄ，９０，１１０９－１１１４，１９９７ Ｐ．Ｂｒｕｈｎｓ等，Ｂｌｏｏｄ，１６，３７１６－３７２５，２００９

前述した通りＦｃγＲＩＩＩａは抗体の糖鎖構造を認識することから、ＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤は抗体医薬品製造時の工程分析や分取に有用である。しかしながら、抗体医薬品の工業的製造を前記吸着剤を用いて行なおうとした場合、従来のＦｃγＲＩＩＩａでは遺伝子組換体による生産性が劣っており、コスト面で課題があった。

そこで本発明は、従来のＦｃγＲＩＩＩａと比較し、遺伝子組換体による生産性が向上した、ＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸置換体を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明者らは、配列番号１に示すヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列のうち、１７６番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に網羅的に置換した結果、従来のＦｃγＲＩＩＩａよりも遺伝子組換体による生産性が向上したアミノ酸置換体を見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の［１］から［１２］に記載の態様を包含する。

［１］ 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換された、タンパク質；
（ｂ） 配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換され、さらに１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換されたアミノ酸配列に対して、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質。

［２］ 配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシンにアミノ酸置換された、［１］に記載のＦｃ結合性タンパク質。

［３］ 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換された、タンパク質；
（ｂ）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換され、さらに１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換されたアミノ酸配列に対して、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質。

［４］ 配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、少なくとも１９２番目のバリンがイソロイシンにアミノ酸置換された、［３］に記載のＦｃ結合性タンパク質。

［５］ 配列番号９、１１、および１３から選択されるいずれかに記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列を少なくとも含む、［３］に記載のＦｃ結合性タンパク質。

［６］ ［１］から［５］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

［７］ ［６］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

［８］ ［７］に記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。

［９］ 宿主が大腸菌である、［８］に記載の形質転換体。

［１０］ ［８］または［９］に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記Ｆｃ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。

［１１］ ［１］から［５］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、抗体吸着剤。

［１２］ ［１１］に記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合性を持つヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸置換体である。具体的には、配列番号４に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくともＶａｌ１９２Ｉｌｅ（この表記は、配列番号４の１９２番目のバリンがイソロイシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒのうち、いずれかのアミノ酸置換が生じたタンパク質である。

なお配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列は、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（図１のＥＣの領域）の一部である、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸配列と同一の配列である。したがって本発明のＦｃ結合性タンパク質は、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のバリンをイソロイシン、アラニン、チロシンのいずれかにアミノ酸置換したタンパク質と言い換えることもできる。

また本発明のＦｃ結合性タンパク質は、細胞外領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目から１６番目までの領域、図１のＳ）の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１９３番目から２０８番目までの領域）、細胞膜貫通領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２０９番目から２２９番目までの領域、図１のＴＭ）および細胞内領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２３０番目から２５４番目までの領域、図１のＣ）の全てまたは一部を含んでもよい。

本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体結合活性を有する限り、配列番号４に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、およびＶａｌ１９２Ｔｙｒから選択されるいずれかのアミノ酸に置換するアミノ酸置換以外に、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含んでいてもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には「１若しくは数個」とは、例えば１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個を意味する。上記のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。例えばヒトＦｃγＲＩＩＩａには、Ｌｅｕ８２Ｈｉｓ、Ｌｅｕ８２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１６３Ａｓｐ、Ｔｙｒ１７４Ｈｉｓのうち、いずれか１つ以上のアミノ酸置換が生じたアミノ酸置換体が知られているが、本発明のＦｃ結合性タンパク質はこれらのアミノ酸置換をさらに含んでいてもよい。また、上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加等の例として、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があげられる。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体結合活性を有する限り、上記アミノ酸配列（配列番号４に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、およびＶａｌ１９２Ｔｙｒから選択されるいずれかのアミノ酸に置換するアミノ酸置換を生じたアミノ酸配列）全体に対して、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。

上記１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等についての記載および相同性についての記載は、後述する「配列番号５に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくともＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、およびＶａｌ１９２Ｔｙｒのうち、いずれかのアミノ酸置換が生じたタンパク質」においても準用できる。

本発明のＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から目的の抗体を分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどのペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１－０９７８９８号公報）。

本発明のＦｃ結合性タンパク質の好ましい例として、配列番号５に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくともＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、およびＶａｌ１９２Ｔｙｒのうち、いずれかのアミノ酸置換が生じたタンパク質があげられる。なお配列番号５の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチドは、配列番号４の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなり、但しＶａｌ４３Ｇｌｕ、Ｐｈｅ４５Ｉｌｅ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｇｌｎ６４Ａｒｇ、Ｐｈｅ９１Ｌｅｕ、Ａｓｎ１０８Ｓｅｒ、Ｖａｌ１３３Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１３７ＧｌｙおよびＰｈｅ１８７Ｓｅｒのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。

前述した本発明のＦｃ結合性タンパク質の好ましい例の一態様として、
（Ｉ）配列番号５に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅの置換が生じた配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質や、
（ＩＩ）配列番号５に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、Ｖａｌ１９２Ａｌａの置換が生じた配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質や、
（ＩＩＩ）配列番号５に記載のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒの置換が生じた配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
があげられる。なお配列番号９、１１および１３に記載のＦｃ結合性タンパク質のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジンから３２番目のメチオニンまでがリンカー配列であり、２０９番目から２１０番目までのグリシンがリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジンがタグ配列である。

本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に本発明のポリヌクレオチドとも表記する）の作製方法の一例として、
（ｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ｉｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、または本発明のＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。

前記（ｉ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。

ＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドに変異を導入することで本発明のポリヌクレオチドを作製する際、エラープローンＰＣＲ法を用いることができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ_２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。またエラープローンＰＣＲ法以外の変異導入方法としては、Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射したりして、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法があげられる。当該方法において変異原として使用する薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等、当業者が通常用いる変異原性薬剤を用いればよい。

本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現させる宿主には特に制限はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌があげられる。なお動物細胞や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。

本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターを例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータがあげられ、宿主が動物細胞の場合は、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーターがあげられる。

前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする）を用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すればよい。なお宿主が動物細胞である場合にはエレクトロポレーションやリポフェクションを用いればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体は、適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする）を取得することができる。

本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを調製するには、形質転換に用いた宿主に適した方法で、本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを抽出し調製すればよい。
例えば、本発明の形質転換体の宿主が大腸菌の場合、形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。

本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質を製造することができる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらにグリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。

本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収するには、本発明の形質転換体における本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加したり、超音波やフレンチプレス等を用いて菌体を破砕して本発明のＦｃ結合性タンパク質を抽出した後、精製すればよい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に調製することができる。

得られた本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＦｃ結合性タンパク質の改変型を用いる場合はヒトＩｇＧが好ましい。

本発明のＦｃ結合性タンパク質を用いて抗体の分離・分析を行なう際は、前述した本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化させた、抗体吸着剤を作製する必要がある。なお本明細書における抗体の分離とは、夾雑物質共存下の溶液からの抗体の分離に限らず、構造・性質・活性等に基づく抗体間の分離も含まれる。前記Ｆｃ結合性タンパク質に固定化させる不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。

本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化するには、当該不溶性担体にＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介して本発明のＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）が例示できる。

一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。

担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－［４－Ｎ－マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボニル－（６－アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。

担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。

担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。

本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性やＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。

前述した方法により得られた抗体吸着剤を用いて本発明の分離方法を実施するには、当該抗体吸着剤を充填したカラムに、ポンプ等の送液手段を用いて抗体を含む溶液を添加することで、当該吸着剤に抗体を特異的に吸着させた後、適切な溶出液を当該カラムに添加することで、抗体を溶出すればよい。なお抗体を含む溶液は、カラムに添加する前にあらかじめ適切な緩衝液を用いて溶媒置換させるとよい。また抗体を含む溶液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に分離できるため好ましい。平衡化に用いる緩衝液（平衡化液）としてはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が例示でき、さらに前記緩衝液に、１０ｍＭから１００ｍＭの塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。抗体吸着剤に吸着した抗体を溶出させるには、抗体とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。抗体吸着剤に吸着した抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、抗体吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。その緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能（抗原への結合性等）を損なわない範囲で設定すればよい。

さらに、溶出された抗体が含まれる画分を分取することができ、得られた画分から抗体を得ることができる。分取は常法により行ってよい。具体的には、例えば、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等により画分の分取をすることが挙げられる。

本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、特定位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、遺伝子組換体による生産性を向上させることができる。

なお本発明のＦｃ結合性タンパク質は、従来のＦｃγＩＩＩａと同等の抗体への親和性を有している。そのため、当該タンパク質を不溶性担体に固定して得られる抗体吸着剤は、抗体医薬品の工業的製造における工程分析および分取用途に有用といえる。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａの概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ ＦｃＲ９アミノ酸置換体の作製
特開２０１６－１６９１９７号公報（特許文献２）に記載の方法で作製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号５）に対し、１９２番目（配列番号１では１７６番目に相当）のアミノ酸残基を他のアミノ酸へ置換することの有用性を確認するため、以下に示すアミノ酸置換を行なった。具体的にはＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲ９（特開２０１６－１６９１９７号公報）に対し、ＰＣＲを用いてアミノ酸の置換を行ない、ＦｃＲ９（配列番号５）のうち１９２番目のバリンを他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質を作製した。なおＦｃＲ９（配列番号５）は、配列番号４に示すヒトＦｃγＲＩＩＩ細胞外領域を含むＦｃ結合性タンパク質において、４３番目（配列番号１では２７番目に相当）のバリンをグルタミン酸に、４５番目（配列番号１では２９番目に相当）のフェニルアラニンをイソロイシンに、５１番目（配列番号１では３５番目に相当）のチロシンをアスパラギンに、６４番目（配列番号１では４８番目に相当）のグルタミンをアルギニンに、９１番目（配列番号１では７５番目に相当）のフェニルアラニンをロイシンに、１０８番目（配列番号１では９２番目に相当）のアスパラギンをセリンに、１３３番目（配列番号１では１１７番目に相当）のバリンをグルタミン酸に、１３７番目（配列番号１では１２１番目に相当）のグルタミン酸をグリシンに、および１８７番目（配列番号１では１７１番目に相当）のフェニルアラニンをセリンに、それぞれアミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質である。

（１）鋳型ＤＮＡとして特開２０１６－１６９１９７号公報に記載の方法で作製したＦｃＲ９（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲ９（特開２０１６－１６９１９７号公報）を、フォワードプライマーとして配列番号２（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７（５’－ＣＡＴＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＭＮＮＣＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＡＧＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表１に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することでＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物をＶ１９２ｐ１とした。

（２）フォワードプライマーとして配列番号８（５’－ＣＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＧＮＮＫＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号３（５’－ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は（１）と同様な方法でＰＣＲを行ない、得られたＰＣＲ産物をＶ１９２ｐ２とした。

（３）ＰＣＲ産物として（１）で得られたＶ１９２ｐ１と（２）で得られたＶ１９２ｐ２との混合物を用いて、表２に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、Ｖ１９２ｐ１とＶ１９２ｐ２を連結したＰＣＲ産物Ｖ１９２ｐを得た。

（４）ＰＣＲ産物として（３）で得られたＶ１９２ｐを、フォワードプライマーとして配列番号２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表３に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なうＰＣＲを行ない、ＦｃＲ９（配列番号５）の１９２番目のバリンを任意のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。得られたポリヌクレオチドをＶ１９２ｐ３とした。

（５）（４）で得られたＶ１９２ｐ３を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。

（６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出した。

（７）得られたプラスミドのうちＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２または配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。

配列解析の結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号５）の１９２番目のバリンがアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンのいずれかに置換されたＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を得た。

実施例２ Ｆｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性測定
（１）実施例１で得た形質転換体のうち、ＦｃＲ９（配列番号５）の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のアミノ酸残基をイソロイシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅとも表記）、アラニン（以下、Ｖａｌ１９２Ａｌａとも表記）またはチロシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒとも表記）に置換したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。

（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を０．２ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。

（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。

（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。

（５）Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（５－１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで添加して固定化（４℃で一晩）後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ ＭＩＬＫ（ＢＤ製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）をウェルに添加することでブロッキングした。
（５－２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体結合活性を評価するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Ｆｃ結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃で１時間）。
（５－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（５－４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。

（６）（５）の方法で得られたＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性よりＦｃ結合性タンパク質の発現量を算出した。

結果を表４に示す。Ｖａｌ１９２Ｉｌｅのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号９）、Ｖａｌ１９２Ａｌａのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ａ（配列番号１１）、およびＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｙ（配列番号１３）を発現する形質転換体における培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質発現量はそれぞれ、１３０．６ｍｇ、２１．７ｍｇおよび１４．６ｍｇとなった。

本実施例で検討したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｉのアミノ酸配列を配列番号９に、前記ＦｃＲ９＿Ｉをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１０にそれぞれ示す。なお配列番号９において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９（配列番号５）の３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列においてＶａｌ１９２Ｉｌｅのアミノ酸置換が生じたポリペプチドであり、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅのイソロイシンは配列番号９では１９２番目の位置に存在する。

本実施例で検討したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ａのアミノ酸配列を配列番号１１に、前記ＦｃＲ９＿Ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１２に示す。なお配列番号１１は、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９（配列番号５）の３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列においてＶａｌ１９２Ａｌａのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである他は、配列番号９と同じ配列である。また、Ｖａｌ１９２Ａｌａのアラニンは配列番号１１では１９２番目の位置に存在する。

本実施例で検討したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｙのアミノ酸配列を配列番号１３に、前記ＦｃＲ９＿Ｙをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４に示す。なお配列番号１３は、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９（配列番号５）の３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列においてＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである他は、配列番号９と同じ配列である。また、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒのチロシンは配列番号１３では１９２番目の位置に存在する。

比較例１
形質転換体として、特開２０１６－１６９１９７号公報（特許文献２）で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号５）を発現する形質転換体を用いたこと以外は実施例２と同様に行なった。

結果を表４に示す。培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質の発現量は１．４ｍｇとなった。以上の結果から、ＦｃＲ９にＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒのいずれかのアミノ酸置換を導入したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体は、ＦｃＲ９を発現する形質転換体と比較し、発現量が大幅に向上していることがわかる。

比較例２
形質転換体として、ＦｃＲ９（配列番号５）の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のアミノ酸残基をフェニルアラニン（以下、Ｖａｌ１９２Ｐｈｅとも表記）、アルギニン（以下、Ｖａｌ１９２Ａｒｇとも表記）、ロイシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｌｅｕとも表記）、アスパラギン（以下、Ｖａｌ１９２Ａｓｎとも表記）、アスパラギン酸（以下、Ｖａｌ１９２Ａｓｐとも表記）、システイン（以下、Ｖａｌ１９２Ｃｙｓとも表記）、グルタミン（以下、Ｖａｌ１９２Ｇｌｎとも表記）、グルタミン酸（以下、Ｖａｌ１９２Ｇｌｕとも表記）、グリシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｇｌｙとも表記）、ヒスチジン（以下、Ｖａｌ１９２Ｈｉｓとも表記）、リジン（以下、Ｖａｌ１９２Ｌｙｓとも表記）、メチオニン（以下、Ｖａｌ１９２Ｍｅｔとも表記）、プロリン（以下、Ｖａｌ１９２Ｐｒｏとも表記）、セリン（以下、Ｖａｌ１９２Ｓｅｒとも表記）、スレオニン（以下、Ｖａｌ１９２Ｔｈｒとも表記）またはトリプトファン（以下、Ｖａｌ１９２Ｔｒｐとも表記）に置換したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を用いたこと以外は実施例２と同様に行なった。

結果を表４に示す。いずれも培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質の発現量はゼロまたは１ｍｇ未満であった。

実施例３ Ｆｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合親和性評価
（１）実施例１で得た形質転換体のうち、ＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号９）またはＦｃＲ＿Ａ（配列番号１１）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。

（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１０００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を１０ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。

（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。

（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で懸濁し、超音波破砕した。その後、遠心分離により上清を回収した。

（５）回収した上清は、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌと５００ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で溶出し、当該溶出画分を回収した。

（６）（５）で回収した溶出画分を、ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０））で溶出し、当該溶出画分を回収した。

（７）（６）の溶出画分として回収したＦｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合性評価を表面プラズモン共鳴法を用いて行なった。表面プラズモン共鳴法を用いた結合性の測定において、測定装置としてはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥヘルスケア製）を、センサーチップとしてはＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を、解析ソフトとしてはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア製）を、それぞれ用いた。

（８）Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア製）を用いてＦｃ結合性タンパク質を固定化したセンサーチップに対し、ＩｇＧ１（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ製）をＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥヘルスケア製）で希釈した溶液を流すことでセンサグラムを得た。当該センサグラムを基にカーブフィッティングを行なうことで、ＩｇＧ１に対する結合性を算出した。

ＩｇＧ１に対する親和性を算出した結果を表５に示す。なお表５において、Ｋ_Ｄ値（解離定数）が低いほど、高いアフィニティ（親和性）を有している。ＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号９）およびＦｃＲ９＿Ａ（配列番号１１）のＫ_Ｄ値は、それぞれ６．０×１０^－８Ｍおよび３．６×１０^－８Ｍとなった。

比較例３
形質転換体として、特開２０１６－１６９１９７号公報（特許文献２）で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号５）を発現する形質転換体を用いたこと以外は実施例３と同様に行なった。

ＩｇＧ１に対する親和性を算出した結果を表５に示す。ＦｃＲ９のＫ_Ｄ値は７．７×１０^－８Ｍであり、ＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号９）およびＦｃＲ９＿Ａ（配列番号１１）と同等の親和性であった。このことから本発明のＦｃ結合性タンパク質の一態様である、ＦｃＲ９＿ＩおよびＦｃＲ９＿Ａは、ＦｃＲ９と同様、不溶性担体に固定化することで抗体医薬品製造における工程分析および分取のための抗体吸着剤として使用可能であることが示唆される。

比較例４
形質転換体として、ＦｃＲ９（配列番号５）の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のバリンをフェニルアラニンに置換したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ＿Ｆ）を発現する形質転換体を用いたこと以外は実施例３と同様に行なった。

ＩｇＧ１に対する親和性を算出した結果を表５に示す。ＦｃＲ９＿ＦのＫ_Ｄ値は、３．３×１０^－６Ｍとなり、本発明のＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号９９）およびＦｃＲ＿Ａ（配列番号１１）ならびにＦｃＲ９（配列番号５）と比較し、親和性が低いことを確認した。

Claims (10)

1. 配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、但し当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、１９２番目のバリンがイソロイシン、アラニン、およびチロシンから選択されるいずれかにアミノ酸置換された、Ｆｃ結合性タンパク質。
2. 配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、１９２番目のバリンがイソロイシンにアミノ酸置換された、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質。
3. 配列番号９、１１、および１３から選択されるいずれかに記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列から成る、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質。
4. 請求項１から３のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド 。
5. 請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
6. 請求項５に記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
7. 宿主が大腸菌である、請求項６に記載の形質転換体。
8. 請求項６または７に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記Ｆｃ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
9. 請求項１から３のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、抗体吸着剤。
10. 請求項９に記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。

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