WO2019083048A1 - アルカリ耐性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤および当該抗体吸着剤を用いて抗体を分離する方法 - Google Patents

アルカリ耐性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤および当該抗体吸着剤を用いて抗体を分離する方法

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WO2019083048A1
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amino acid
binding protein
antibody
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遼子 渡邉
諭 遠藤
陽介 寺尾
大江　正剛
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東ソー株式会社
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    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Definitions

  • the present invention relates to Fc binding proteins having affinity to immunoglobulins. More specifically, the present invention relates to an Fc binding protein having improved stability (alkali resistance) to alkali compared to the natural form, a method for producing the protein, an antibody adsorbent obtained by immobilizing the protein on an insoluble carrier, and the antibody The present invention relates to a method of separating an antibody using an adsorbent.
  • the present invention also relates to an Fc binding protein in which productivity by gene recombination is improved by replacing an amino acid residue at a specific position in human Fc ⁇ RIIIa with another specific amino acid residue.
  • Fc receptors are a group of molecules that bind to the Fc region of immunoglobulin molecules. Each molecule recognizes a single or the same group of immunoglobulin isotypes by a recognition domain on an Fc receptor by a recognition domain belonging to the immunoglobulin superfamily. This determines which accessory cells are driven in the immune response. Fc receptors can be further divided into several subtypes, such as Fc ⁇ receptors that are receptors for IgG (immunoglobulin G), Fc ⁇ receptors that bind to the Fc region of IgE, Fc ⁇ receptors that bind to the Fc region of IgA, etc. There is.
  • each receptor is further finely divided, and the presence of Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RIIa, Fc ⁇ RIIb, Fc ⁇ RIIIa, and Fc ⁇ RIIIb has been reported as Fc ⁇ receptors (Non-patent Document 1).
  • Fc ⁇ RIIIa is present on cell surfaces such as natural killer cells (NK cells) and macrophages, and is an important receptor involved in ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) activity which is important among human immune mechanisms. It is. It is reported that the affinity between this Fc ⁇ RIIIa and human IgG is a binding constant (ka) indicating the strength of binding of 10 7 M -1 or less (Non-patent Document 2). In addition, it is known that the binding between Fc ⁇ RIIIa and an antibody differs depending on the difference in the sugar chain structure of the antibody (Non-patent Document 3).
  • FIG. 1 shows a schematic structural view of human Fc ⁇ RIIIa.
  • the numbers in FIG. 1 indicate amino acid numbers, and the numbers correspond to the amino acid numbers described in SEQ ID NO: 1.
  • the sugar chain structure of the antibody is greatly involved in the drug efficacy and stability of the antibody drug, it is extremely important to control the sugar chain structure when producing the antibody drug.
  • Fc ⁇ RIIIa recognizes the sugar chain structure of an antibody
  • an adsorbent obtained by immobilizing Fc ⁇ RIIIa on an insoluble carrier can separate the antibody depending on the difference in the binding property based on the sugar chain structure (Patent Documents 2 and 3). For this reason, the adsorbent is useful for process analysis and fractionation during antibody drug production.
  • Patent Document 1 discloses an Fc-binding protein in which alkaline resistance is improved by substituting an amino acid residue at a specific position with another amino acid residue at an amino acid residue of the extracellular region of natural form Fc ⁇ RIIIa. ing.
  • the alkali resistance is not sufficient, and when it is used for industrial production of antibody drugs, there are problems in terms of production cost.
  • the amino acid at position 176 in SEQ ID NO: 1 is a phenylalanine type (aspect of SEQ ID NO: 1) and a valine type (aspect of SEQ ID NO: 19 published in GenBank (AAH17865.1)) It is known that the gene polymorphism of is present, the type of valine has higher antibody affinity and the type of phenylalanine has lower antibody affinity (Non-patent Documents 4 and 5).
  • An object of the present invention is to provide an Fc binding protein having improved stability (alkali resistance) to alkali, a method for producing the protein, and an antibody adsorbent using the protein.
  • At least one subject of the present invention optionally includes providing an Fc ⁇ RIIIa amino acid substitution product, which has improved productivity by gene recombination as compared to conventional Fc ⁇ RIIIa.
  • the present inventors have identified an amino acid residue involved in the improvement of stability in human Fc ⁇ RIIIa, and a variant in which the amino acid residue is substituted with another amino acid residue is It was found to have excellent stability to alkalis. Furthermore, as a result of exhaustive substitution of the amino acid residue at position 176 in the amino acid sequence of human Fc ⁇ RIIIa shown in SEQ ID NO: 1 with other amino acid residues, the present inventors produced by recombinant gene over conventional Fc ⁇ RIIIa. We found an amino acid substitution with improved sex. Based on these findings, the present inventors have completed the present invention. That is, the present invention includes the embodiments described in the following [1] to [11].
  • Fc comprising an amino acid residue having at least 35 amino acid substitutions shown below at an amino acid residue from glycine 33 to glutamine at amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having an antibody binding activity Binding protein; (1) Substitution of the 37th glutamate in SEQ ID NO: 4 to glycine (2) Substitution of the 39th leucine to methionine of SEQ ID NO: 4 (3) Substitution of the 43rd valine of SEQ ID NO: 4 to glutamate (4) ) Substitution of phenylalanine at position 45 of SEQ ID NO: 4 to isoleucine (5) Substitution of glutamine at position 49 of SEQ ID NO: 4 to proline (6) Substitution of position 51 of SEQ ID NO: 4 to asparagine (7) Sequence Substitution of the 56th lysine to glutamine of No.
  • the Fc binding protein according to any one of [1] to [3], which comprises at least the amino acid residue from glycine 33 to glutamine 208 among the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 7, 9 or 11 .
  • a transformant capable of producing an Fc binding protein which is obtained by transforming a host with the recombinant vector according to [6].
  • An adsorbent for an antibody which is obtained by immobilizing the Fc binding protein according to any one of [1] to [4] on an insoluble carrier.
  • a method of separating antibodies including:
  • the Fc binding protein of the present invention is a protein having a binding property to the Fc region of an antibody, and among the amino acid sequences of Fc binding protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, the extracellular domain of natural human Fc ⁇ RIIIa At least the amino acid residue from glycine 33 to glutamine 208 (from 17th glycine to 192nd glutamine in SEQ ID NO: 1) corresponding to (EC region in FIG. 1), provided that the 33rd to the 208th It is a protein in which an amino acid substitution has occurred at least at a specific position in the amino acid residues up to the first position. Therefore, the Fc binding protein of the present invention may contain all or part of the signal peptide region (S in FIG.
  • the amino acid substitution at the specific position is Glu37Gly (this notation indicates that the 37th glutamic acid in SEQ ID NO: 4 is substituted with glycine, and so forth), Leu39Met, Val43Glu, Phe45Ile, Gln49Pro, Tyr51Asn , Lys56Gln, Gln64Arg, Tyr67His, Glu70Asp, Asn72Asp, Ser81Arg, Ser84Arg, Ser84Pro, Tyr90Phe, Phr91Ile, Ala94Ser, Thr96Ser, Asn108Ser, Val133Glu, Lys135Val, Glu137Gly, Asp138Glu, Lys148Arg, Thr156Met, Thr156Met, Tyrl56Thr Phe187Ser, Ser194Arg
  • the Fc binding protein of the present invention only needs to have at least the amino acid substitution at the specific position described above, and any one of substitution, deletion, insertion and addition of amino acid residues as long as having antibody binding activity. It may further have one or more.
  • Specific examples of the above-mentioned embodiment include Fc-binding proteins having antibody binding activity shown in the following (i) to (v): (I) comprises an amino acid residue from glycine 33 to glutamine 208 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, but having an amino acid substitution at the specific position described above, and at least an amino acid of Val192Ile, Val192Ala or Val192Tyr An Fc binding protein further having a substitution; (Ii) comprises an amino acid residue from glycine 33 to glutamine 208 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, but having an amino acid substitution at the specific position described above, and an amino acid at the specific position described above An Fc binding protein further having any one or more of substitution, deletion, insertion and addition of one or
  • amino acid substitution of Val192Ile, Val192Ala or Val192Tyr described in the above (i), (iii), (v) and (vii) is an amino acid substitution which improves the productivity by gene recombination. Therefore, by further having the above-mentioned amino acid substitution in the Fc binding protein of the present invention having at least the amino acid substitution at the above-mentioned specific position, alkaline resistance is improved more than native Fc ⁇ RIIIa, and productivity by gene recombination is also An improved Fc binding protein is obtained.
  • substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acid residues and “any one or more of substitution, deletion, insertion and / or addition of amino acid residues” are used.
  • it may be, for example, substitution, deletion, insertion or addition of 1 to 50 amino acid residues, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 30, still more preferably 1 to 20 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11) , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20, particularly preferably 1 to 10 (one, two, three, four, Placement of 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acid residues , Deletions, may be inserted or added.
  • substitution are mutations (mutant or variant) that can occur naturally based on individual differences of species from which the gene is derived, differences in species, etc. Is also included.
  • amino acid substitutions having any one or more amino acid substitutions among Leu82His, Leu82Arg, Gly163Asp, and Tyr174His are known for human Fc ⁇ RIIIa, but the Fc-binding protein of the present invention comprises these amino acid substitutions It may further be included.
  • the homology of the amino acid sequences in (iv) and (v) is 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more , 79% or more or 80% or more.
  • the homology of the amino acid sequences in (vi) and (vii) is 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more Or 79% or more, preferably 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more or 84% or more, more preferably 85% or more, 86% or more, 87% or more, It may be 88% or more or 89% or more, more preferably 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more Or it may be 99% or more.
  • identity of amino acid sequences is synonymous with “identity” of amino acid sequences.
  • identity (homology) of amino acid sequences refers to alignment of both amino acid sequences so that the amino acid residues of the two amino acid sequences to be compared match as much as possible, What is divided by the number of amino acid residues is expressed as a percentage. At the time of the alignment, a gap is appropriately inserted in one or both of the two sequences to be compared, as necessary.
  • Such a method for alignment of sequences is not particularly limited, but can be performed using a known sequence comparison program such as BLAST, FASTA, CLUSTAL W, etc.
  • the total number of amino acid residues is the number of residues counting one gap as one amino acid residue.
  • sequence identity corresponds to the total number of amino acid residues of the longer sequence. It is calculated by dividing the number.
  • the Fc binding protein of the present invention may further have conservative substitutions that substitute between the amino acids for which the physical and / or chemical properties of both amino acids are similar. It is known to those skilled in the art that conservative substitution is not limited to Fc binding proteins, but generally, the function of the protein is maintained between those in which substitution occurs and those in which substitution does not occur. Examples of conservative substitution include substitution occurring between glycine and alanine, between aspartic acid and glutamic acid, between serine and proline, or between glutamic acid and alanine (protein structure and function, Medical Science International, 9 , 2005).
  • an oligopeptide useful for separating an antibody of interest from a solution in the presence of a contaminant may be further added to the N-terminal side or C-terminal side of the Fc binding protein of the present invention.
  • the oligopeptide include polyhistidine, polylysine, polyarginine, polyglutamic acid and polyaspartic acid.
  • a cysteine-containing oligopeptide useful for immobilizing the Fc-binding protein of the present invention on a solid phase such as a support for chromatography is an N-terminal or C-terminal side of the Fc-binding protein of the present invention It may be added to The length of the oligopeptide added to the N-terminal side or C-terminal side of the Fc binding protein is not particularly limited.
  • the N-terminal side of the Fc binding protein is genetically engineered using a method well known to those skilled in the art Alternatively, they may be added to the C-terminal side, or the chemically synthesized oligopeptide may be added by chemically binding to the N-terminal side or C-terminal side of the Fc binding protein of the present invention.
  • a signal peptide may be added to promote efficient expression in the host. Examples of the signal peptide when the host is E.
  • coli include secreting a protein in the periplasm such as PelB, DsbA, MalE (region from the 1st to 26th of the amino acid sequences described in UniProt No. P0AEX9), TorT, etc.
  • a signal peptide can be illustrated (Unexamined-Japanese-Patent No. 2011-097898).
  • Fc binding protein of the present invention include an Fc binding protein comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in the following (a), (b) or (c): These Fc binding proteins are preferable in that the stability to alkali (alkali resistance) is improved.
  • (A) FcR 35 d (amino acid residues from the 33rd to the 208th amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7) Among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 4, the amino acid residue from glycine 33 to glutamine 208, provided that the amino acid residue from 33rd to 208th, Glu37Gly, Leu39Met, Val43Glu, Phe45Ile, Gln49Pro, Tyr51Asn, Lys56Gln, Gln64Arg, Tyr67His, Glu70Asp, Asn72Asp, Asr72Asp, Ser81Arg, Ser84Pro, Tyr90Phe, Phe91Ile, Ala94Ser, Thr96Ser, Asn108Ser, Val133Glu, Ly137Gly, Asp138Glu, Asp138Glu, LySlGylThr al, have Lys181Glu, Phe187Ser, Ser194Arg, Asn196Lys, Glu200Gly, Thr
  • (B) FcR36i (amino acid residues from the 33rd to the 208th amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9) Among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 4, the amino acid residue from glycine 33 to glutamine 208, provided that the amino acid residue from 33rd to 208th, Glu37Gly, Leu39Met, Val43Glu, Phe45Ile, Gln49Pro, Tyr51Asn, Lys56Gln, Gln64Arg, Tyr67His, Glu70Asp, Asn72Asp, Asr72Asp, Ser81Arg, Ser84Pro, Tyr90Phe, Phe91Ile, Ala94Ser, Thr96Ser, Asn108Ser, Val133Glu, Ly137Gly, Asp138Glu, Asp138Glu, LySlGylThr al, Lys181Glu, with Phe187Ser, Val192Ile, Ser194Arg, Asn196Lys, Glu200G
  • (C) FcR36a (amino acid residues from the 33rd to the 208th amino acid sequence described in SEQ ID NO: 11) Among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 4, the amino acid residue from glycine 33 to glutamine 208, provided that the amino acid residue from 33rd to 208th, Glu37Gly, Leu39Met, Val43Glu, Phe45Ile, Gln49Pro, Tyr51Asn, Lys56Gln, Gln64Arg, Tyr67His, Glu70Asp, Asn72Asp, Asr72Asp, Ser81Arg, Ser84Pro, Tyr90Phe, Phe91Ile, Ala94Ser, Thr96Ser, Asn108Ser, Val133Glu, Ly137Gly, Asp138Glu, Asp138Glu, LySlGylThr al, Lys181Glu, with Phe187Ser, Val192Ala, Ser194Arg, Asn196Lys, Glu200G
  • the 1st methionine to the 26th alanine are the MalE signal peptide
  • the 27th lysine to the 32nd methionine are the linker sequences.
  • Glycine 33 to glutamine 208 is the amino acid sequence of a polypeptide capable of binding to the Fc region of the antibody (FcR35d (SEQ ID NO: 7), FcR36i (SEQ ID NO: 9) or FcR36a (SEQ ID NO: 11))
  • Glycine at positions 209 to 210 is a linker sequence
  • histidine at positions 211 to 216 is a tag sequence.
  • a method for producing a polynucleotide encoding the Fc binding protein of the present invention (hereinafter, also simply referred to as the polynucleotide of the present invention), (I) A method of artificially synthesizing a polynucleotide comprising the nucleotide sequence by converting the amino acid sequence of the Fc binding protein of the present invention into a nucleotide sequence, (II) A polynucleotide encoding the entire or partial sequence of Fc binding protein is prepared directly or artificially, or from cDNA of Fc binding protein or the like using a DNA amplification method such as PCR, and the polynucleotide is prepared Method of linking in an appropriate manner, Can be illustrated.
  • error-prone PCR When introducing a mutation into the polynucleotide of the present invention, error-prone PCR can be used.
  • the reaction conditions in the error-prone PCR method are not particularly limited as long as they can introduce a desired mutation into a polynucleotide encoding Fc binding protein, and, for example, four types of deoxynucleotides (dATP / dTTP / dCTP as a substrate)
  • the mutation is introduced into the polynucleotide by making the concentration of / dGTP) heterogeneous and adding MnCl 2 at a concentration of 0.01 to 10 mM (preferably 0.1 to 1 mM) to the PCR reaction solution and conducting PCR. be able to.
  • a polynucleotide containing the whole or a partial sequence of the Fc binding protein is contacted with or reacted with an agent serving as a mutagen or irradiated with ultraviolet light
  • an agent serving as a mutagen or irradiated with ultraviolet light There is a method of introducing a mutation into As the drug to be used as a mutagen in the method, hydroxylamine, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfurous acid, hydrazine and the like, mutagenic agents commonly used by those skilled in the art may be used. .
  • animal cells CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, HEK cells, Hela cells, COS cells, etc.
  • yeast Sacharomyces cerevisiae
  • Pichia pastoris Hansenula polymorpha Schizosaccharomyces japonicus, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe etc.
  • insect cells Sf9, Sf21 etc.
  • E. coli JM109 strain, BL21 (DE3) strain, W3110 strain etc.
  • Bacillus subtilis It is preferable to use animal cells and E. coli as a host in terms of productivity, and it is more preferable to use E. coli as a host.
  • the polynucleotide of the present invention When a host is transformed with the polynucleotide of the present invention, the polynucleotide of the present invention may be used, but an expression vector (eg, bacteriophage, cosmid or the like usually used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells) may be used. It is more preferable to use one in which the polynucleotide of the present invention is inserted at an appropriate position of a plasmid etc.).
  • the expression vector is not particularly limited as long as it stably exists in the host to be transformed and can be replicated, and when using E.
  • pET plasmid vector pUC plasmid vector, pTrc plasmid vector, pCDF plasmid vector , PBBR plasmid vectors
  • the appropriate position means a position which does not destroy the replication function of the expression vector, the desired antibiotic marker, and the region involved in transferability.
  • Examples of such a promoter include trp promoter, tac promoter, trc promoter, lac promoter, T7 promoter, recA promoter, lpp promoter, ⁇ PL promoter of ⁇ phage, ⁇ PR promoter and the like when the host is E. coli.
  • examples include SV40 promoter, CMV promoter and CAG promoter.
  • the transformation may be carried out by a method commonly used by those skilled in the art.
  • a microorganism belonging to the genus Escherichia E. coli JM109 strain, E. coli BL21 (DE3) strain, E. coli W3110 strain, etc.
  • known documents eg Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 256, 1992
  • the transformation may be carried out by the method described in 1.).
  • electroporation or lipofection may be used.
  • the transformant obtained by transformation according to the above-mentioned method is screened by an appropriate method to obtain a transformant capable of expressing the Fc binding protein of the present invention (hereinafter referred to as the transformant of the present invention) ) Can be obtained.
  • the expression vector of the present invention may be extracted and prepared from the transformant of the present invention by a method suitable for the host used for transformation.
  • a method suitable for the host used for transformation For example, when the host of the transformant of the present invention is E. coli, the culture obtained by culturing the transformant is prepared using a commercially available extraction kit such as alkaline extraction method or QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by Qiagen). Just do it.
  • the Fc binding protein of the present invention can be produced by culturing the transformant of the present invention and recovering the Fc binding protein of the present invention from the obtained culture.
  • the term "culture” includes not only cultured cells of the transformant of the present invention but also the medium used for culture.
  • the transformant used in the protein production method of the present invention may be cultured in a medium suitable for culturing the target host, and when the host is E. coli, LB (Luria-Bertani) medium supplemented with a necessary nutrient source is preferable An example of the culture medium is given.
  • the medium In order to selectively grow the transformant of the present invention depending on the presence or absence of the introduction of the expression vector of the present invention, it is preferable to culture the medium with a drug corresponding to the drug resistance gene contained in the vector.
  • a drug corresponding to the drug resistance gene contained in the vector for example, when the vector contains a kanamycin resistance gene, kanamycin may be added to the medium.
  • the medium may also contain suitable nutrient sources, optionally selected from the group consisting of glutathione, cysteine, cystamine, thioglycollate and dithiothreitol. May contain one or more reducing agents.
  • a reagent that promotes protein secretion from the transformant to the culture solution such as glycine
  • the concentration of glycine is 2% (w / v) or less of the culture medium. It is preferable to add it.
  • the culture temperature is generally 10 ° C. to 40 ° C., preferably 20 ° C. to 37 ° C., more preferably around 25 ° C. when the host is E. coli, and may be selected according to the characteristics of the protein to be expressed.
  • the pH of the medium is pH 6.8 to pH 7.4, preferably around pH 7.0, when the host is E. coli.
  • induction is preferably performed under conditions that allow the Fc binding protein of the present invention to be expressed well.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the turbidity of the culture solution (absorbance at 600 nm) is measured, and when it reaches about 0.5 to 1.0, an appropriate amount of IPTG is added, followed by culturing to obtain Fc binding. Protein expression can be induced.
  • the addition concentration of IPTG may be appropriately selected from the range of 0.005 to 1.0 mM, preferably in the range of 0.01 to 0.5 mM.
  • Various conditions for IPTG induction may be performed under conditions well known in the art.
  • the Fc-binding protein of the present invention may be recovered by separation / purification from the culture. For example, when expressing in the culture supernatant, the cells may be separated by centrifugation, and the Fc binding protein of the present invention may be purified from the obtained culture supernatant. In addition, when expressing in cells (including periplasm), after collecting the cells by centrifugation, add an enzyme treatment agent, surfactant, etc., or use ultrasonic waves, French press, etc.
  • purification may be performed.
  • methods known in the art may be used, such as separation / purification using liquid chromatography as an example.
  • Liquid chromatography includes ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, etc.
  • the Fc binding ability of the present invention can be achieved by performing a purification operation by combining these chromatographys. Proteins can be prepared to high purity.
  • the binding activity to IgG is determined using Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (hereinafter referred to as ELISA) method, surface plasmon resonance method or the like. It should be measured.
  • the IgG used for measurement of binding activity is preferably human IgG when a modified version of human Fc binding protein is used, and human IgG1 and human IgG3 are particularly preferable.
  • the adsorbent of the present invention can be produced by binding the Fc binding protein of the present invention to an insoluble carrier.
  • the insoluble carrier is not particularly limited, and carriers made of polysaccharides such as agarose, alginate (alginate), carrageenan, chitin, cellulose, dextrin, dextran, starch as a raw material, polyvinyl alcohol, polymethacrylate, poly (2- Examples of such carriers include carriers made of synthetic polymers such as hydroxyethyl methacrylate) and polyurethane, and carriers made of ceramics such as silica. Among them, carriers derived from polysaccharides and carriers derived from synthetic polymers are preferred as insoluble carriers.
  • the preferred carrier examples include polymethacrylate gels into which hydroxyl groups have been introduced such as Toyopearl (manufactured by Tosoh Corporation), agarose gels such as Sepharose (manufactured by GE Healthcare), and cellulose gels such as Celfine (manufactured by JNC).
  • polymethacrylate gels into which hydroxyl groups have been introduced such as Toyopearl (manufactured by Tosoh Corporation), agarose gels such as Sepharose (manufactured by GE Healthcare), and cellulose gels such as Celfine (manufactured by JNC).
  • Toyopearl manufactured by Tosoh Corporation
  • agarose gels such as Sepharose
  • Celfine manufactured by JNC
  • an N-hydroxysuccinimide (NHS) activated ester group an epoxy group, a carboxyl group, a maleimide group, a haloacetyl group, a tresyl group, a formyl group, a halo is used as the insoluble carrier. It may be immobilized by providing an active group such as acetamide, and covalently bonding a human Fc binding protein and an insoluble carrier via the active group.
  • the carrier to which the active group is attached may be a commercially available carrier as it is, or may be prepared by introducing an active group onto the surface of the carrier under appropriate reaction conditions.
  • TOYOPEARL AF-Epoxy-650M TOYOPEARL AF-Tresyl-650M (all from Tosoh)
  • HiTrap NHS-activated HP Columns NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow
  • Epoxy-activated Sepharose 6B All manufactured by GE Healthcare
  • SulfoLink Coupling Resin manufactured by Thermo Scientific
  • a method of introducing an active group on the surface of a carrier a method of reacting one of a compound having two or more active sites with a hydroxyl group, an epoxy group, a carboxyl group, an amino group, etc. present on the carrier surface is exemplified. it can.
  • the compound epichlorohydrin, ethanediol diglycidyl ether, butanediol diglycidyl ether, and hexanediol diglycidyl ether can be exemplified as a compound for introducing an epoxy group to a hydroxyl group or amino group on the carrier surface.
  • 2-mercaptoacetic acid, 3-mercaptopropionic acid, 4-mercaptobutyric acid, 6-mercaptobutyric acid, glycine, 3- 3- Aminopropionic acid, 4-aminobutyric acid, 6-aminohexanoic acid can be exemplified.
  • N- ( ⁇ -maleimidocaproic acid) hydrazide N- ( ⁇ -maleimidopropionic acid) hydrazide
  • 4- [4 4-N-maleimidophenyl] acetic acid hydrazide 2-aminomaleimide, 3-aminomaleimide, 4-aminomaleimide, 6-aminomaleimide, 1- (4-aminophenyl) maleimide, 1- (3-aminophenyl) maleimide, 4- (Maleimido) phenyl isocyanate, 2-maleimidoacetic acid, 3-maleimidopropionic acid, 4-maleimidobutyric acid, 6-maleimidohexanoic acid, (N- [ ⁇ -maleimidoacetoxy] succinimide ester), (m-maleimidobenzoyl)
  • Examples of compounds for introducing a haloacetyl group to a hydroxyl group or amino group present on the surface of a carrier include chloroacetic acid, bromoacetic acid, iodoacetic acid, chloroacetic acid chloride, bromoacetic acid chloride, bromoacetic acid bromide, chloroacetic acid anhydride, bromoacetic acid anhydride, Iodoacetic anhydride, 2- (iodoacetamido) acetic acid-N-hydroxysuccinimide ester, 3- (bromoacetamido) propionic acid-N-hydroxysuccinimide ester, 4- (iodoacetyl) aminobenzoic acid-N-hydroxysuccinimide ester It can be illustrated.
  • Examples of ⁇ -alkenyl alkane glycidyl ether include allyl glycidyl ether, 3-butenyl glycidyl ether and 4-pentenyl glycidyl ether, and examples of a halogenating agent include N-chlorosuccinimide, N-bromosuccinimide and N-iodosuccinimide. it can.
  • the method of introducing an active group to the surface of a carrier there is a method of introducing an activating group to a carboxyl group present on the surface of a carrier using a condensing agent and an additive.
  • the condensing agent include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), dicyclohexyl carbodiimide, and carbonyl diimidazole.
  • the additive include N-hydroxysuccinimide (NHS), 4-nitrophenol and 1-hydroxybenztriazole.
  • a buffer used when immobilizing the Fc binding protein of the present invention on an insoluble carrier acetate buffer, phosphate buffer, MES (2-MorpholinoEthane Sulfonic acid) buffer, HEPES (4- (2-HydroxyEthyl)- 1-PiperazineEthaneSulfonic acid) buffer, Tris buffer, borate buffer can be exemplified.
  • the reaction temperature for immobilization may be appropriately set in consideration of the reactivity of the active group and the stability of the Fc binding protein of the present invention from the temperature range of 5 ° C. to 50 ° C., preferably It is in the range of 10 ° C to 35 ° C.
  • a buffer containing the antibody in a column packed with the adsorbent of the present invention The antibody may be eluted by specifically adding the antibody to the adsorbent of the present invention by adding it using a liquid delivery means such as a pump, and then adding an appropriate elution solution to the column. It is preferable to equilibrate the column with an appropriate buffer before adding the buffer containing the antibody to the column, since the antibody can be separated with higher purity.
  • the buffer solution include phosphate buffer solutions, and buffers containing inorganic salts as components.
  • the pH of the buffer is pH 3 to 10, preferably pH 4 to 8.
  • it is sufficient to weaken the interaction between the antibody and the ligand (the Fc binding protein of the present invention).
  • pH change by the buffer counter Examples include peptides, temperature changes, and salt concentration changes.
  • a buffer on the acid side of the solution used when adsorbing the antibody to the adsorbent of the present invention can be mentioned.
  • a citrate buffer having a buffer capacity on the acid side As a type of buffer, a citrate buffer having a buffer capacity on the acid side, a glycine hydrochloride buffer, and an acetate buffer can be exemplified.
  • the pH of the buffer solution may be set within the range that does not impair the function of the antibody, preferably 2.5 to 6.0, more preferably 3.0 to 5.0, and still more preferably 3.0 to 4. It is 0.
  • the antibody When the antibody is eluted by a change in salt concentration, it may be eluted in a single step with a buffer (eluent) containing a high concentration of salt, or the salt concentration may be optionally raised stepwise (step gradient)
  • the salt concentration may be increased with a linear concentration gradient (linear gradient), but it is preferable to elute with a linear gradient.
  • sodium chloride when sodium chloride is used as a water-soluble salt, it may be eluted with a linear gradient of sodium chloride concentration from 0 M to 1 M.
  • the antibody when it is eluted by pH change, it may be eluted in one step with an acidic buffer (eluted solution) whose pH is lower than that of the equilibration buffer, and the pH of the buffer is optionally lowered stepwise. It is also preferable (step gradient) to lower the pH of the buffer with a linear gradient (linear gradient) but to elute with a linear gradient. For example, it may be eluted with a linear gradient from a neutral to weakly acidic buffer to which the antibody is adsorbed to an acidic buffer to which the antibody is eluted.
  • the antibody can be obtained by separating the fraction containing the antibody, which has been eluted by the method described above.
  • the sorting may be performed according to a conventional method. Specifically, for example, a method of replacing the collection container at fixed time intervals or a fixed volume, a method of changing the collection container according to the shape of the chromatogram of the eluate, a fraction by an automatic fraction collector, etc. It can be mentioned that the
  • the Fc binding protein of the present invention recognizes the difference in the sugar chain structure bound to the antibody, so that the antibody It is preferable to elute the antibody sequentially due to the difference in the sugar chain structure, and as a result, it is preferable to use an elution solution in which the elution position (elution fraction) of the antibody is different. Therefore, by separating the antibody using the adsorbent of the present invention, it is possible to identify the difference in sugar chain structure possessed by the antibody.
  • a sugar chain added when an antibody is expressed using as a host a cell derived from an animal such as CHO cells or a yeast such as Pichia yeast or Saccharomyces yeast examples include sugar chains possessed by antibodies, and sugar chains added to antibodies by chemical synthesis.
  • the adsorbent of the present invention can separate the antibody based on the difference in the sugar chain structure of the antibody.
  • the Fc binding protein of the present invention has excellent stability (alkali resistance) to alkali as compared to a native Fc binding protein.
  • an adsorbent having high stability (resistance) to alkaline washing can be obtained. Therefore, it can contribute to cost reduction in the industrial production of antibody pharmaceuticals.
  • the productivity by gene recombination can be improved by replacing the amino acid residue at a specific position with another specific amino acid residue.
  • FIG. 1 is a schematic view of human Fc ⁇ RIIIa.
  • the numbers in the figure indicate the numbers of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1.
  • S indicates a signal sequence
  • EC indicates an extracellular region
  • TM indicates a cell transmembrane region
  • C indicates an intracellular region. It is a chromatogram at the time of isolate
  • Avastin was eluted by step gradient elution with 20 mM acetate buffer (pH 5.2), 20 mM acetate buffer (pH 4.8) and 10 mM glycine hydrochloride buffer (pH 3.0).
  • FcR35c amino acid residues from the 33rd to the 208th amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5 corresponds to the extracellular region (EC region in FIG.
  • An expression vector pET-FcR35c (a sequence of a polynucleotide encoding an Fc binding protein described in SEQ ID NO: 5 among the expression vectors, prepared as a template by the method described in JP-A-2017-118871 (SEQ ID NO: 5)
  • the error prone PCR was performed using 6).
  • the error-prone PCR heat-processes the reaction solution at 95 ° C. for 2 minutes, and performs the first step at 95 ° C. for 30 seconds, the second step at 60 ° C. for 30 seconds, 72
  • the reaction was carried out for 35 cycles with one cycle of the third step of 90 ° C. for 90 seconds, and finally the heat treatment was carried out at 72 ° C. for 7 minutes.
  • This reaction successfully introduced a mutation into the polynucleotide encoding the Fc binding protein.
  • reaction solution is introduced into E. coli BL21 (DE3) strain by electroporation, and after culturing in LB plate medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin, colonies formed on the plate are subjected to random mutation live It was a rally.
  • Example 2 Screening of Fc Binding Protein Having Alkaline Resistance
  • 2YT liquid medium Peptone 16 g / L, containing 50 ⁇ g / mL kanamycin
  • the random mutation library prepared in Example 1 200 ⁇ L of yeast extract 10 g / L, sodium chloride 5 g / L
  • shake culture was carried out overnight at 30 ° C. using a 96-well deep well plate.
  • the culture supernatant containing the Fc binding protein obtained by centrifugation is diluted 25 times with pure water and mixed with an equal volume of 500 mM sodium hydroxide solution, and then at 30 ° C.
  • the alkali treatment was performed by leaving still for 3 hours. After alkali treatment, the pH was returned to near neutrality with 4 volumes of 1 M Tris buffer (pH 7.0).
  • TMB Peroxidase Substrate manufactured by KPL
  • Color development was stopped by adding 1 M phosphoric acid at 50 ⁇ L / well, and absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader (manufactured by TEKAN).
  • the transformant of about 2700 strains was evaluated by the method of (4), and among them, a transformant expressing an Fc binding protein with improved stability as compared to FcR35c was selected.
  • the selected transformant was cultured in 2YT liquid medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin, and an expression vector was prepared using QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by Qiagen).
  • an oligonucleotide consisting of the sequence described in SEQ ID NO: 2 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') or SEQ ID NO: 3 (5'-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3') was used as a primer for sequencing.
  • the transformant was evaluated by the method of (4), and the results of comparison with FcR35c are shown in Table 2.
  • the polypeptides with improved alkaline stability compared to FcR35c were designated FcR35d, FcR36i and FcR36a.
  • the polypeptides with reduced alkaline stability compared to FcR35c are listed in Table 2 as A, B, C and D, respectively (Sequence not confirmed).
  • the amino acid sequence of the Fc binding protein containing FcR35d is shown in SEQ ID NO: 7, and the sequence of the polynucleotide encoding the protein is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the amino acid sequence of the Fc binding protein containing FcR36i is shown in SEQ ID NO: 9 and the sequence of the polynucleotide encoding the protein is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid sequence of the Fc binding protein containing FcR36a is shown in SEQ ID NO: 11, and the sequence of the polynucleotide encoding the protein is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the 1st methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) is a MalE signal peptide
  • the 27th lysine (Lys) to the 32nd methionine (Met) Is the linker sequence
  • the amino acid sequence of FcR35d (SEQ ID NO: 7), FcR36i (SEQ ID NO: 9) or FcR36a (SEQ ID NO: 11) from glycine (Gly) at position 33 to glutamine (Gln) at position 208;
  • Glycine (Gly) up to the 210th is a linker sequence, and histidine (His) from the 211st to 216th is a tag sequence.
  • FcR35d As a result of analyzing the sequences of polynucleotides encoding FcR35d, FcR36i and FcR36a by the method of (6), FcR35d (SEQ ID NO: 7) resulted in new amino acid substitutions Ser81Arg, Asn196Lys, Glu200Gly and Glu203Asp relative to FcR35c
  • the 98th, 114th, 117th and 208th amino acid residues were returned to amino acid residues of the natural type (SEQ ID NO: 4).
  • FcR36i (SEQ ID NO: 9) has new amino acid substitutions such as Ser81Arg, Val192Ile, Asn196Lys, Glu200Gly and Glu203Asp for FcR35c, while the 98th, 114th, 117th and 208th amino acid residues were FcR35d and Similarly, the amino acid residue of the natural type (SEQ ID NO: 4) was restored.
  • FcR36a (SEQ ID NO: 11) has new amino acid substitutions of Ser81Arg, Val192Ala, Asn196Lys, Glu200Gly and Glu203Asp against FcR35c, whereas the 98th, 114th, 117th and 208th amino acid residues are FcR35d and FcR36i Similarly, the amino acid residue of the natural type (SEQ ID NO: 4) was restored.
  • Example 3 Evaluation of alkaline stability of Fc binding protein (1) Fc binding protein including FcR35c (SEQ ID NO: 5), and Fc binding protein including FcR35d (SEQ ID NO: 7) obtained in Example 2; FcR36i
  • the transformant expressing the Fc binding protein (SEQ ID NO: 9) containing Fc and the Fc binding protein (SEQ ID NO: 11) containing FcR36a was inoculated into 100 mL of 2YT liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of kanamycin and Preculture was performed by aerobic shaking culture overnight at ° C.
  • the collected supernatant is passed through a column packed with Ni Sepharose 6 Fast Flow (manufactured by GE Healthcare), and a washing buffer (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM NaCl) After sufficient washing was carried out, elution was performed with elution buffer (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM NaCl and 500 mM imidazole), and the eluted fraction was collected.
  • the eluted fraction collected in (5) is passed through a column packed with IgG Sepharose 6 Fast Flow (manufactured by GE Healthcare), and the washing buffer (20 mM Tris-HCl buffer (150 mM NaCl) After sufficient washing with pH 7.4)), elution is carried out with elution buffer (100 mM glycine buffer (pH 3.0)), and the eluted fraction is recovered, followed by 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0). Each purified Fc binding protein was prepared by adding 1 ⁇ 4 volume of N) to neutralize.
  • Fc-binding protein containing FcR35d SEQ ID NO: 7
  • Fc-binding protein containing FcR36i SEQ ID NO: 9
  • Fc-binding containing FcR36a A transformant expressing a protein (SEQ ID NO: 11) or an Fc binding protein (SEQ ID NO: 5) containing FcR35c was measured by the following method.
  • the antibody binding activity of Fc binding protein was measured by the ELISA method shown in Example 2 (4).
  • the amount of expression of Fc binding protein was calculated from the binding activity of the obtained Fc binding protein to IgG.
  • the Fc binding protein (SEQ ID NO: 7) containing the above FcR35d, the Fc binding protein containing FcR36i (SEQ ID NO: 9), the Fc binding protein containing FcR36a (SEQ ID NO: 11) or the Fc binding protein containing FcR35c A transformant expressing (SEQ ID NO: 5) was inoculated into 2 mL of 2YT liquid medium each containing 50 ⁇ g / mL kanamycin, and preculture was carried out by aerobically culturing overnight at 37 ° C. .
  • Example 5 Evaluation of Binding Affinity of Fc-Binding Protein and IgG1 (1) Culture and purification were carried out in the same manner as in Example 3 (1) to (6) to prepare each Fc-binding protein.
  • FcR35d, FcR36i and FcR36a obtained in Example 2 have binding affinity to an antibody equivalent to a known polypeptide (FcR35c, JP-A-2017-11887) capable of binding to the Fc region of the antibody. It is understood that the alkali resistance is improved while having it.
  • Example 6 Preparation of FcR36i to which a Cysteine Tag is Added
  • PCR was carried out using the polynucleotide (SEQ ID NO: 10) encoding FcR36i prepared in Example 2 as a template.
  • the primers in the PCR used were oligonucleotides consisting of the sequences described in SEQ ID NO: 13 (5′-CATATGAAAATAAAAAACAGGTGCAC GCC ATCC GCTC ATCC GCATT AACGAC-3 ′) and SEQ ID NO: 14 (5′-CCCAAGCTTATCGCGAGGATCGTTTGCGGCACCCTTGGGAACGGTAATGTCCACGGCCCCGCTG-3 ′).
  • the PCR is heat-treated at 98 ° C for 5 minutes, and the first step at 98 ° C for 10 seconds, the second step at 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C.
  • the reaction was carried out by repeating 30 cycles of the 1-minute third step as one cycle.
  • the polynucleotide obtained in (1) is purified, digested with the restriction enzymes NcoI and HindIII, and then the expression vector pTrc-PelB prepared by the method described in WO2015 / 199154 previously digested with the restriction enzymes NcoI and HindIII The ligation product was used to transform E. coli W3110 strain.
  • nucleotide sequence of pTrc-FcR36i_Cys was analyzed using an oligonucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 15 (5′-TGTGGGTATGGCTGTGCACAGG-3 ′) or SEQ ID NO: 16 (5′-TCGGCATGGGGTCAGGTG-3 ′)
  • SEQ ID NO: 15 5′-TGTGGGTATGGCTGTGCACAGG-3 ′
  • SEQ ID NO: 16 5′-TCGGCATGGGGTCAGGTG-3 ′
  • amino acid sequence of the polypeptide expressed by the expression vector pTrc-FcR36i_Cys is shown in SEQ ID NO: 17, and the sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the 1st methionine (Met) to the 22nd alanine (Ala) is an improved PelB signal peptide (an oligopeptide consisting of the 1st to 22nd amino acid residues of UniProt No. P0C1C1) However, it is an oligopeptide containing one amino acid substitution), and from the 24th glycine (Gly) to the 199th glutamine (Gln) is the amino acid sequence of the Fc binding protein FcR36i (33th to 208th of SEQ Region), from the 200th glycine (Gly) to the 207th glycine (Gly) is a cysteine tag sequence.
  • Example 7 Preparation of FcR36i_Cys (1) 400 mL of 2YT liquid medium containing 100 ⁇ g / mL carbenicillin (Peptone 16 g / L, yeast extract containing 100 ⁇ g / mL carbenicillin contained in the 2 L baffle flask, the transformant expressing FcR36i_Cys prepared in Example 6 The preculture was performed by inoculating 10 g / L, 5 g / L sodium chloride, and aerobically culturing at 37 ° C. overnight.
  • the culture was stopped about 48 hours after the start of the culture, and the culture was centrifuged at 8000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. to recover the cells.
  • the collected cells are suspended in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) so as to be 5 mL / 1 g (cells), and an ultrasonic generator (Insonator 201M (trade name), manufactured by Kubota Shoji Co., Ltd.)
  • the cells were disrupted at an output of about 150 W for about 10 minutes at 4 ° C. using The disrupted cell suspension was centrifuged twice at 8000 rpm for 20 minutes at 4 ° C., and the supernatant was recovered.
  • Example 8 Preparation of FcR36i-immobilized gel and antibody separation by linear gradient elution (1) FcR36i_Cys prepared in Example 7 after activating the hydroxyl group on the surface of hydrophilic vinyl polymer (made by Tosoh Corporation) for separating agent with iodoacetyl group The reaction was carried out to obtain FcR36i immobilized gel.
  • the results are shown in FIG.
  • the monoclonal antibody interacted with FcR36i to separate into two peaks instead of a single peak as in gel filtration chromatography. That is, the antibody showing weak binding to FcR36i was separated into two peaks by the elution time being fast, and the antibody showing strong binding being delayed by the elution time.
  • Example 9 ADCC (antibody dependent cytotoxicity) activity measurement of antibody separated by linear gradient elution using FcR36i immobilized gel
  • Raji cells were adjusted to approximately 5 ⁇ 10 5 cells / mL with ADCC Assay Buffer, and added to a 96-well plate (3917: Corning) at 25 ⁇ L / well.
  • Effector cells (manufactured by Promega) were prepared to about 3.0 ⁇ 10 5 cells / mL with ADCC Assay Buffer, and added at 25 ⁇ L / well to wells to which Raji cells and antibody were added. Then, it was left still for 6 hours in a CO 2 incubator (5% CO 2 , 37 ° C.).
  • the antibody contained in FrA having an earlier elution time fractionated on the FcR36i-immobilized gel has almost the same luminescence intensity as that of the monoclonal antibody before separation, and the ADCC activity can be said to be almost equal.
  • the antibody contained in FrB which has a slower elution time, had an ADCC activity about 1.4 times higher than that of the monoclonal antibody before separation, and about 1.5 times higher than that of the antibody contained in FrA. That is, it can be seen that the antibody contained in FrB has higher ADCC activity than the monoclonal antibody before separation and the antibody contained in FrA.
  • Example 10 Sugar chain structural analysis of antibody separated by linear gradient elution using FcR36i immobilized gel (1) Antibody contained in FrA and FrB separated in Example 9 (1) at 100 ° C., 10 minutes After denaturation by heat treatment, they were sequentially treated with glycoamidase A / pepsin and pronase, and purified by gel filtration to obtain a sugar chain fraction.
  • the results of the assigned sugar chain structure are shown in FIG. 4 and Table 8, and a schematic view of the sugar chain structure is shown in Table 9.
  • the antibody contained in FrB has a high proportion of antibodies having a galactose-containing sugar chain structure (G1Fa and G2F) at the end, and a galactose-free sugar chain structure (G0F) The proportion of antibodies possessed was low.
  • an antibody having a sugar chain structure containing galactose at the end binds strongly to FcR36i and is eluted at a slow elution time (ie, eluted at low pH) when separated on an Fc36i-immobilized gel
  • An antibody having a galactose-free sugar chain structure at the end is found to be weakly bound to FcR36i and to be eluted quickly (ie, eluted at high pH) when separated on an Fc36i-immobilized gel .
  • Example 11 Preparation of FcR36i-immobilized gel and antibody separation by step gradient elution (1) An FcR36i-immobilized gel was obtained by the same method as in Example 8 (1).
  • the adsorbed monoclonal antibody was eluted by feeding 10 mM glycine hydrochloride buffer (pH 3.0) for 50 minutes at a flow rate of 0.2 mL / min.
  • an antibody having a sugar chain structure containing galactose at the end was strongly bound to FcR36i, eluted at a low pH when separated on an Fc 36i-immobilized gel, and had a sugar chain structure not containing galactose at the end
  • the antibody is found to weakly bind to FcR36i and to be eluted at high pH when separated on an Fc36i immobilized gel.
  • Example 13 Antibody separation by step gradient elution using FcR36i immobilized gel (Part 2) (1) An FcR36i-immobilized gel was obtained by the same method as in Example 8 (1).
  • the adsorbed monoclonal antibody was eluted by supplying 10 mM glycine hydrochloride buffer (pH 3.0) for 100 minutes while maintaining the flow rate of 0.04 mL / min.
  • the results (chromatogram of elution pattern) are shown in FIG.
  • the monoclonal antibody was separated into three peaks, but is a different type of antibody from Example 11, so it can be seen that different elution patterns can be obtained.
  • the FcR9 (SEQ ID NO: 20) is the 43rd (corresponding to the 27th in SEQ ID NO: 1) valine at glutamic acid in the Fc binding protein containing the extracellular domain of human Fc ⁇ RIII shown in SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 20)
  • phenylalanine is equivalent to isoleucine
  • 51st corresponding to 35th in SEQ ID NO: 1
  • tyrosine is asparagine
  • 64th corresponding to 48th in SEQ ID NO: 1
  • glutamine is arginine
  • 91 The phenylalanine is leucine
  • the 108th (corresponding to 92nd in SEQ ID NO: 1) is serine
  • the valine is 133th (corresponding to 117th in SEQ ID NO: 1).
  • Glutamic acid is a glutamic acid at position 137 (corresponding to position 121 in SEQ ID NO: 1).
  • the Fc binding proteins respectively amino acid substitutions.
  • a plasmid pET-FcR9 Japanese Patent Laid-Open No. 2016-169197 containing a polynucleotide (SEQ ID No. 21) encoding FcR9 (SEQ ID No. 20) prepared by the method described in Japanese Patent Laid-Open No.
  • PCR was carried out by performing 30 cycles of reaction with 1 cycle of the third step as one cycle to obtain a polynucleotide encoding an Fc binding protein in which valine at position 192 of FcR9 (SEQ ID NO: 20) was substituted with any amino acid .
  • the obtained polynucleotide was designated V192p3.
  • V192p3 obtained in (4) After purification of V192p3 obtained in (4), it is digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, and ligated in expression vector pETMalE (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046) previously digested with restriction enzymes NcoI and HindIII. Was used to transform E. coli BL21 (DE3) strain.
  • pETMalE Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046
  • the resulting transformant was cultured in LB medium supplemented with 50 ⁇ g / mL kanamycin.
  • the plasmid was extracted from the collected cells (transformants).
  • the polynucleotide encoding the Fc binding protein and the surrounding region are subjected to a cycle sequencing reaction using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies) based on the chain terminator method.
  • the nucleotide sequence was analyzed using a fully automated DNA sequencer Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (manufactured by Life Technologies).
  • the oligonucleotide which consists of a sequence of sequence number 2 or sequence number 3 was used as a primer for a sequence.
  • valine at position 192 of Fc binding protein FcR9 is alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine,
  • a transformant expressing an Fc binding protein substituted with any of proline, serine, threonine, tryptophan and tyrosine was obtained.
  • Reference Example 2 Measurement of Binding Activity of Fc-Binding Protein to IgG
  • the 192nd amino acid residue (176th in SEQ ID NO: 1) of FcR 9 (SEQ ID NO: 20)
  • the antibody binding activity of the Fc binding protein was measured by the ELISA method described below.
  • TMB Peroxidase Substrate manufactured by KPL
  • Color development was stopped by adding 1 M phosphoric acid at 50 ⁇ L / well, and absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader (manufactured by TEKAN).
  • the expression level of Fc binding protein was calculated from the binding activity of the Fc binding protein obtained by the method of (5) to IgG.
  • FcR9_I (SEQ ID NO: 24) which is an Fc binding protein containing an amino acid substitution of Val192Ile
  • FcR9_A (SEQ ID NO: 26) which is an Fc binding protein containing an amino acid substitution of Val192Ala
  • Fc binding protein containing an amino acid substitution of Val192Tyr The amount of Fc binding protein expressed per liter of culture solution in the transformant expressing a certain FcR9_Y (SEQ ID NO: 28) was 130.6 mg, 21.7 mg and 14.6 mg, respectively.
  • FcR9_I The amino acid sequence of FcR9_I, which is the Fc binding protein examined in this reference example, is shown in SEQ ID NO: 24, and the sequence of the polynucleotide encoding FcR9_I is shown in SEQ ID NO: 25.
  • the 1st methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) is a MalE signal peptide
  • the 27th lysine (Lys) to the 32nd methionine (Met) is a linker sequence
  • glycine (Gly) from 209 to 210 is a linker sequence
  • histidine (His) from 211 to 216 is a tag sequence.
  • isoleucine of Val192Ile is present at the 192nd position in SEQ ID NO: 24.
  • SEQ ID NO: 26 corresponds to the amino acid sequence of glycine (Gly) at position 33 to glutamine (Gln) at position 208 in the amino acid sequence from glycine 33 (Gly) to glutamine at position 208 (Gln) of FcR9 (SEQ ID NO: 20).
  • SEQ ID NO: 24 corresponds to the amino acid substitution of Val192Ala has occurred.
  • the alanine of Val192Ala is present at the 192nd position in SEQ ID NO: 26.
  • SEQ ID NO: 28 corresponds to the amino acid sequence of glycine (Gly) at position 33 to glutamine (Gln) at position 208 in the amino acid sequence from glycine 33 (Gly) to glutamine at position 208 (Gln) of FcR9 (SEQ ID NO: 20). It is the same sequence as SEQ ID NO: 24 except that the polypeptide has an amino acid substitution of Val192Tyr. In addition, tyrosine of Val192Tyr is present at the 192nd position in SEQ ID NO: 28.
  • Reference Example 3 The same procedure as in Reference Example 2 was carried out except that a transformant expressing the Fc binding protein FcR9 (SEQ ID NO: 20) disclosed in JP-A-2016-169197 (patent document 3) was used as a transformant. .
  • the 192nd (176th in SEQ ID NO: 1) amino acid residue of FcR9 (SEQ ID NO: 20) is phenylalanine (hereinafter also referred to as Val192Phe), arginine (hereinafter also referred to as Val192Arg), leucine (hereinafter, Val192Leu) Asparagine (hereinafter also referred to as Val192Asn), aspartic acid (hereinafter also referred to as Val192Asp), cysteine (hereinafter also referred to as Val192Cys), glutamine (hereinafter also referred to as Val192Gln), glutamic acid (hereinafter also referred to as Val192Glu), Glycine (hereinafter also referred to as Val192Gly), histidine (hereinafter referred to as Val192His), lysine (hereinafter also referred to as Val192Lys), methionine (hereinafter referred to as Val192Me
  • Proline hereinafter also referred to as Val192P
  • the collected supernatant is passed through a column packed with Ni Sepharose 6 Fast Flow (manufactured by GE Healthcare), and a washing buffer (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM NaCl) After sufficient washing was carried out, elution was performed with elution buffer (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM NaCl and 500 mM imidazole), and the eluted fraction was collected.
  • the eluted fraction collected in (5) is passed through a column packed with IgG Sepharose 6 Fast Flow (manufactured by GE Healthcare), and the washing buffer (20 mM Tris-HCl buffer (150 mM NaCl) After sufficient washing with pH 7.4)), elution was performed with elution buffer (100 mM glycine buffer (pH 3.0)), and the eluted fraction was collected.
  • Reference Example 6 The same procedure as in Reference Example 5 was carried out except that a transformant expressing the Fc binding protein FcR9 (SEQ ID NO: 20) disclosed in JP-A-2016-169197 (Patent Document 3) was used as a transformant. .
  • FcR9_I and FcR9_A which is one aspect of the Fc binding protein of the present invention, is used as an antibody adsorbent for step analysis and separation in antibody drug manufacture by immobilizing it on an insoluble carrier like FcR9. It is suggested that it is possible.
  • Reference Example 7 Reference Example except that a transformant expressing Fc binding protein (FcR_F) in which valine at position 192 (position 176 in SEQ ID NO: 1) of FcR9 (SEQ ID NO: 20) is substituted with phenylalanine is used as a transformant. It carried out similarly to 5.
  • FcR_F Fc binding protein

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Abstract

本発明は、アルカリ耐性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を担体に固定化して得られる、抗体の吸着剤、および当該吸着剤を用いて抗体を分離する方法に関する。

Description

アルカリ耐性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤および当該抗体吸着剤を用いて抗体を分離する方法
　本発明は、免疫グロブリンに親和性を有するＦｃ結合性タンパク質に関する。より詳しくは本発明は、アルカリに対する安定性（アルカリ耐性）が天然型より向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤、および当該抗体吸着剤を用いて抗体を分離する方法に関する。
　また本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、特定位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、遺伝子組換体による生産性が向上したＦｃ結合性タンパク質に関する。
　Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の認識ドメインによって認識している。これによって、免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる。Ｆｃレセプターは、さらにいくつかのサブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであるＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある。また各レセプターは更に細かく分類されており、Ｆｃγレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。
　Ｆｃγレセプターの中でも、ＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの細胞表面に存在しており、ヒト免疫機構の中でも重要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に関与している重要なレセプターである。このＦｃγＲＩＩＩａとヒトＩｇＧとの親和性は結合の強さを示す結合定数（ｋａ）が１０7Ｍ-1以下であることが報告されている（非特許文献２）。また、抗体の糖鎖構造の違いにより、ＦｃγＲＩＩＩａと抗体との結合性が異なることが知られている（非特許文献３）。天然型のヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０８６３７）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中の番号はアミノ酸番号を示しており、その番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２０９番目のバリン（Ｖａｌ）から２２９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２３０番目のリジン（Ｌｙｓ）から２５４番目のリジン（Ｌｙｓ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なおＦｃγＲＩＩＩａはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるヒトＩｇＧサブクラスのうち、特にＩｇＧ１とＩｇＧ３に対し強く結合する一方、ＩｇＧ２とＩｇＧ４に対する結合は弱いことが知られている。
　抗体の糖鎖構造は、抗体医薬品における薬効や安定性に大きく関与するため、抗体医薬品を製造する際に糖鎖構造を制御することは極めて重要である。ＦｃγＲＩＩＩａは抗体の糖鎖構造を認識することから、ＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤は、抗体をその糖鎖構造に基づく結合性の違いにより分離できる（特許文献２および３）。このため、前記吸着剤は抗体医薬品製造時の工程分析や分取に有用である。しかしながら、抗体医薬品の工業的製造を前記吸着剤を用いて行なおうとした場合、天然型のＦｃγＲＩＩＩａではアルカリ耐性がなく、アルカリ洗浄による前記吸着剤の再利用が困難なため、前記工業的製造用途には不向きであった。
　特許文献１には、天然型のＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域のアミノ酸残基において、特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで、アルカリ耐性が向上したＦｃ結合性タンパク質を開示している。しかしながら特許文献１に開示のＦｃ結合性タンパク質であってもアルカリ耐性は十分とはいえず、抗体医薬品の工業的製造用途に用いる場合、製造コスト面で課題があった。
　なおヒトＦｃγＲＩＩＩａには、配列番号１における１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンであるタイプ（配列番号１の態様）とバリンであるタイプ（ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＡＨ１７８６５．１）において公表されている、配列番号１９の態様）の遺伝子多型が存在し、バリンのタイプの方が抗体親和性は高く、フェニルアラニンのタイプの方が抗体親和性は低いことが知られている（非特許文献４および５）。
特開２０１７－１１８８７１号公報 特開２０１５－０８６２１６号公報 特開２０１６－１６９１９７号公報
Ｔａｋａｉ．Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８－３２６，２００５ Ｊ．Ｇａｌｏｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８－１９３２，１９９７ Ｃ．Ｌ．Ｃｈｅｎ等，ＡＣＳ　Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．，１２，１３３５－１３４５，２０１７ Ｈ．Ｒ．Ｋｏｅｎｅ等，Ｂｌｏｏｄ，９０，１１０９－１１１４，１９９７ Ｐ．Ｂｒｕｈｎｓ等，Ｂｌｏｏｄ，１６，３７１６－３７２５，２００９
　本発明の課題は、アルカリに対する安定性（アルカリ耐性）が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤を提供することを含む。
　また前述した通り、ＦｃγＲＩＩＩａは抗体の糖鎖構造を認識することから、ＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤は抗体医薬品製造時の工程分析や分取に有用である。しかしながら、抗体医薬品の工業的製造を前記吸着剤を用いて行なおうとした場合、従来のＦｃγＲＩＩＩａでは遺伝子組換体による生産性が劣っており、コスト面で課題があった。そこで少なくとも１つの本発明の課題は、従来のＦｃγＲＩＩＩａと比較し、遺伝子組換体による生産性が向上した、ＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸置換体を提供することを場合により含む。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトＦｃγＲＩＩＩａにおける安定性向上に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異体が、アルカリに対して優れた安定性を有することを見出した。また本発明者らは、配列番号１に示すヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列のうち、１７６番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に網羅的に置換した結果、従来のＦｃγＲＩＩＩａよりも遺伝子組換体による生産性が向上したアミノ酸置換体を見出した。これらの知見に基づいて、本発明者らは本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の［１］から［１１］に記載の態様を包含する。
　［１］
配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、少なくとも以下に示す３５箇所のアミノ酸置換を有するアミノ酸残基を含み、かつ、抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質；
（１）配列番号４の３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
（２）配列番号４の３９番目のロイシンのメチオニンへの置換
（３）配列番号４の４３番目のバリンのグルタミン酸への置換
（４）配列番号４の４５番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換
（５）配列番号４の４９番目のグルタミンのプロリンへの置換
（６）配列番号４の５１番目のチロシンのアスパラギンへの置換
（７）配列番号４の５６番目のリジンのグルタミンへの置換
（８）配列番号４の６４番目のグルタミンのアルギニンへの置換
（９）配列番号４の６７番目のチロシンのヒスチジンへの置換
（１０）配列番号４の７０番目のグルタミン酸のアスパラギン酸への置換
（１１）配列番号４の７２番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換
（１２）配列番号４の８１番目のセリンのアルギニンへの置換
（１３）配列番号４の８４番目のセリンのプロリンへの置換
（１４）配列番号４の９０番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換
（１５）配列番号４の９１番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換
（１６）配列番号４の９４番目のアラニンのセリンへの置換
（１７）配列番号４の９６番目のスレオニンのセリンへの置換
（１８）配列番号４の１０８番目のアスパラギンのセリンへの置換
（１９）配列番号４の１３３番目のバリンのグルタミン酸への置換
（２０）配列番号４の１３５番目のリジンのバリンへの置換
（２１）配列番号４の１３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
（２２）配列番号４の１３８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換
（２３）配列番号４の１４８番目のリジンのアルギニンへの置換
（２４）配列番号４の１５６番目のスレオニンのメチオニンへの置換
（２５）配列番号４の１５７番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換
（２６）配列番号４の１６３番目のグリシンのバリンへの置換
（２７）配列番号４の１７４番目のチロシンのバリンへの置換
（２８）配列番号４の１８１番目のリジンのグルタミン酸への置換
（２９）配列番号４の１８７番目のフェニルアラニンのセリンへの置換
（３０）配列番号４の１９４番目のセリンのアルギニンへの置換
（３１）配列番号４の１９６番目のアスパラギンのリジンへの置換
（３２）配列番号４の２００番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
（３３）配列番号４の２０１番目のスレオニンのアラニンへの置換
（３４）配列番号４の２０３番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換
（３５）配列番号４の２０６番目のイソロイシンのバリンへの置換
　［２］
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）である、［１］に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、
（ｉ）前記（１）～（３５）のアミノ酸置換、および
（ｉｉ）（ｉ）以外の１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加の１以上を有するアミノ酸残基を含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｂ）前記（１）～（３５）のアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であって、配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列において、前記（１）～（３５）のアミノ酸置換がなされたアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
　［３］
　さらに以下に示すアミノ酸置換のいずれかを少なくとも有する、［１］または［２］に記載のＦｃ結合性タンパク質。
（３６）配列番号４の１９２番目のバリンのイソロイシンへの置換
（３７）配列番号４の１９２番目のバリンのアラニンへの置換
（３８）配列番号４の１９２番目のバリンのチロシンへの置換
　［４］
　配列番号７、９または１１に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、［１］～［３］の何れかに記載のＦｃ結合性タンパク質。
　［５］
　［１］～［４］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　［６］
　［５］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
　［７］
　［６］に記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
　［８］
　宿主が大腸菌である、［７］に記載の形質転換体。
　［９］
　［７］または［８］に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記Ｆｃ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
　［１０］
　［１］から［４］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、抗体の吸着剤。
　［１１］
　［１０］に記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。
　［１２］
　Ｆｃ結合性タンパク質との結合性の違いに基づいて、異なる糖鎖構造を有する抗体が分離される、［１１］に記載の分離方法。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域に結合性を持つタンパク質であり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（図１のＥＣ領域）に相当する３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまで（配列番号１では１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまで）のアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも特定位置におけるアミノ酸置換が生じたタンパク質である。したがって、本発明のＦｃ結合性タンパク質は、細胞外領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳ）の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭ）および細胞内領域（図１のＣ）の全てまたは一部を含んでもよい。前記特定位置におけるアミノ酸置換は具体的には、Ｇｌｕ３７Ｇｌｙ（この表記は、配列番号４の３７番目のグルタミン酸がグリシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｌｅｕ３９Ｍｅｔ、Ｖａｌ４３Ｇｌｕ、Ｐｈｅ４５Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４９Ｐｒｏ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｌｙｓ５６Ｇｌｎ、Ｇｌｎ６４Ａｒｇ、Ｔｙｒ６７Ｈｉｓ、Ｇｌｕ７０Ａｓｐ、Ａｓｎ７２Ａｓｐ、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｓｅｒ８４Ｐｒｏ、Ｔｙｒ９０Ｐｈｅ、Ｐｈｅ９１Ｉｌｅ、Ａｌａ９４Ｓｅｒ、Ｔｈｒ９６Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０８Ｓｅｒ、Ｖａｌ１３３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３５Ｖａｌ、Ｇｌｕ１３７Ｇｌｙ、Ａｓｐ１３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１４８Ａｒｇ、Ｔｈｒ１５６Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１５７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１６３Ｖａｌ、Ｔｙｒ１７４Ｖａｌ、Ｌｙｓ１８１Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１８７Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１９４Ａｒｇ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００Ｇｌｙ、Ｔｈｒ２０１Ａｌａ、Ａｓｎ２０３ＡｓｐおよびＩｌｅ２０６Ｖａｌである。
　なお本発明のＦｃ結合性タンパク質は、前述した特定位置におけるアミノ酸置換を少なくとも有していればよく、抗体結合活性を有する限り、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上、さらに有してもよい。前記態様の具体例として、以下の（ｉ）から（ｖ）に示す、抗体結合活性を有したＦｃ結合性タンパク質があげられる:
（ｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、但し前述した特定位置におけるアミノ酸置換を有し、かつ少なくともＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２ＡｌａまたはＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換をさらに有したＦｃ結合性タンパク質；
（ｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、但し前述した特定位置におけるアミノ酸置換を有しており、かつ前述した特定位置におけるアミノ酸置換以外の１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有したＦｃ結合性タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、但し前述した特定位置におけるアミノ酸置換を有しており、かつ前述した特定位置におけるアミノ酸置換以外の１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２ＡｌａまたはＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換をさらに有したＦｃ結合性タンパク質；
（ｉｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して、７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＦｃ結合性タンパク質であって、前述した特定位置におけるアミノ酸置換を有したＦｃ結合性タンパク質；
（ｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して、７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＦｃ結合性タンパク質であって、前述した特定位置におけるアミノ酸置換およびＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２ＡｌａまたはＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換を有したＦｃ結合性タンパク質；
（ｖｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して、７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、前述した特定位置におけるアミノ酸置換を有したＦｃ結合性タンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して、７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、前述した特定位置におけるアミノ酸置換およびＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２ＡｌａまたはＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換を有したＦｃ結合性タンパク質。
　前記（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）に記載のＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２ＡｌａまたはＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換は、遺伝子組換体による生産性を向上させるアミノ酸置換である。したがって、前述した特定位置におけるアミノ酸置換を少なくとも有した本発明のＦｃ結合性タンパク質に、前記アミノ酸置換をさらに有することで、天然型ＦｃγＲＩＩＩａよりもアルカリ耐性が向上し、かつ遺伝子組換体による生産性も向上したＦｃ結合性タンパク質が得られる。
　本明細書において、「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加」、ならびに「アミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１から５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加であってよく、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から３０個、更に好ましくは１から２０個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個）、特に好ましくは１から１０個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個）のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加であってよい。また本明細書における「置換」、「欠失」、「挿入」および「付加」には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いなどに基づく、天然にも生じ得る変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。例えばヒトＦｃγＲＩＩＩａには、Ｌｅｕ８２Ｈｉｓ、Ｌｅｕ８２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１６３Ａｓｐ、Ｔｙｒ１７４Ｈｉｓのうち、いずれか１つ以上のアミノ酸置換を有したアミノ酸置換体が知られているが、本発明のＦｃ結合性タンパク質はこれらのアミノ酸置換をさらに含んでいてもよい。
　前記（ｉｖ）および（ｖ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上または８０％以上であってよい。
　前記（ｖｉ）および（ｖｉｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上または７９％以上であってよく、好ましくは８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上または８４％以上であってよく、より好ましくは８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上または８９％以上であってよく、更に好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってよい。
　本明細書において、アミノ酸配列の「相同性」は、アミノ酸配列の「同一性」と同義である。ここで、アミノ酸配列の「同一性（相同性）」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化方法は、特に限定されないが、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ等の周知の配列比較プログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、配列同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質は、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換をさらに有してもよい。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。
　また本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から目的の抗体を分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどのペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１－０９７８９８号公報）。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質の好ましい態様として、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むＦｃ結合性タンパク質があげられる。これらのＦｃ結合性タンパク質はアルカリに対する安定性（アルカリ耐性）が向上する点で好ましい。
　（ａ）ＦｃＲ３５ｄ（配列番号７に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基）
　配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ３７Ｇｌｙ、Ｌｅｕ３９Ｍｅｔ、Ｖａｌ４３Ｇｌｕ、Ｐｈｅ４５Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４９Ｐｒｏ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｌｙｓ５６Ｇｌｎ、Ｇｌｎ６４Ａｒｇ、Ｔｙｒ６７Ｈｉｓ、Ｇｌｕ７０Ａｓｐ、Ａｓｎ７２Ａｓｐ、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｓｅｒ８４Ｐｒｏ、Ｔｙｒ９０Ｐｈｅ、Ｐｈｅ９１Ｉｌｅ、Ａｌａ９４Ｓｅｒ、Ｔｈｒ９６Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０８Ｓｅｒ、Ｖａｌ１３３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３５Ｖａｌ、Ｇｌｕ１３７Ｇｌｙ、Ａｓｐ１３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１４８Ａｒｇ、Ｔｈｒ１５６Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１５７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１６３Ｖａｌ、Ｔｙｒ１７４Ｖａｌ、Ｌｙｓ１８１Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１８７Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１９４Ａｒｇ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００Ｇｌｙ、Ｔｈｒ２０１Ａｌａ、Ａｓｎ２０３ＡｓｐおよびＩｌｅ２０６Ｖａｌのアミノ酸置換を有する、ポリペプチド。
　（ｂ）ＦｃＲ３６ｉ（配列番号９に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基）
　配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ３７Ｇｌｙ、Ｌｅｕ３９Ｍｅｔ、Ｖａｌ４３Ｇｌｕ、Ｐｈｅ４５Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４９Ｐｒｏ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｌｙｓ５６Ｇｌｎ、Ｇｌｎ６４Ａｒｇ、Ｔｙｒ６７Ｈｉｓ、Ｇｌｕ７０Ａｓｐ、Ａｓｎ７２Ａｓｐ、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｓｅｒ８４Ｐｒｏ、Ｔｙｒ９０Ｐｈｅ、Ｐｈｅ９１Ｉｌｅ、Ａｌａ９４Ｓｅｒ、Ｔｈｒ９６Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０８Ｓｅｒ、Ｖａｌ１３３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３５Ｖａｌ、Ｇｌｕ１３７Ｇｌｙ、Ａｓｐ１３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１４８Ａｒｇ、Ｔｈｒ１５６Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１５７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１６３Ｖａｌ、Ｔｙｒ１７４Ｖａｌ、Ｌｙｓ１８１Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１８７Ｓｅｒ、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１９４Ａｒｇ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００Ｇｌｙ、Ｔｈｒ２０１Ａｌａ、Ａｓｎ２０３ＡｓｐおよびＩｌｅ２０６Ｖａｌのアミノ酸置換を有する、ポリペプチド。
　（ｃ）ＦｃＲ３６ａ（配列番号１１に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基）
　配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ３７Ｇｌｙ、Ｌｅｕ３９Ｍｅｔ、Ｖａｌ４３Ｇｌｕ、Ｐｈｅ４５Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４９Ｐｒｏ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｌｙｓ５６Ｇｌｎ、Ｇｌｎ６４Ａｒｇ、Ｔｙｒ６７Ｈｉｓ、Ｇｌｕ７０Ａｓｐ、Ａｓｎ７２Ａｓｐ、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｓｅｒ８４Ｐｒｏ、Ｔｙｒ９０Ｐｈｅ、Ｐｈｅ９１Ｉｌｅ、Ａｌａ９４Ｓｅｒ、Ｔｈｒ９６Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０８Ｓｅｒ、Ｖａｌ１３３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３５Ｖａｌ、Ｇｌｕ１３７Ｇｌｙ、Ａｓｐ１３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１４８Ａｒｇ、Ｔｈｒ１５６Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１５７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１６３Ｖａｌ、Ｔｙｒ１７４Ｖａｌ、Ｌｙｓ１８１Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１８７Ｓｅｒ、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、Ｓｅｒ１９４Ａｒｇ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００Ｇｌｙ、Ｔｈｒ２０１Ａｌａ、Ａｓｎ２０３ＡｓｐおよびＩｌｅ２０６Ｖａｌのアミノ酸置換を有する、ポリペプチド。
　なお、配列番号７、９および１１に記載のＦｃ結合タンパク質のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジンから３２番目のメチオニンまでがリンカー配列であり、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでが抗体のＦｃ領域に結合可能なポリペプチド（ＦｃＲ３５ｄ（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉ（配列番号９）またはＦｃＲ３６ａ（配列番号１１））のアミノ酸配列であり、２０９番目から２１０番目までのグリシンがリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジンがタグ配列である。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に本発明のポリヌクレオチドとも表記する）の作製方法の一例として、
（Ｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列をコードするポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、
が例示できる。
　前記（Ｉ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ　Ｕｓａｇｅ　Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
　本発明のポリヌクレオチドへ変異を導入する場合、エラープローンＰＣＲ法を用いることができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ2を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。またエラープローンＰＣＲ法以外の変異導入方法としては、Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射したりして、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法があげられる。当該方法において変異原として使用する薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等、当業者が通常用いる変異原性薬剤を用いればよい。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現させる宿主には特に制限はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌があげられる。なお動物細胞や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。
　本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターを例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモーターといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモーターの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、さらにはλファージのλＰＬプロモーター、λＰＲプロモーターがあげられ、宿主が動物細胞の場合は、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーターがあげられる。
　前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする）を用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すればよい。なお宿主が動物細胞である場合にはエレクトロポレーションやリポフェクションを用いればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体は、適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする）を取得することができる。
　本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを調製するには、形質転換に用いた宿主に適した方法で、本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを抽出し調製すればよい。例えば、本発明の形質転換体の宿主が大腸菌の場合、形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（キアゲン製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。
　本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質を製造することができる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。
　さらにグリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモーターが含まれている場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
　本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収するには、本発明の形質転換体における本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加したり、超音波やフレンチプレス等を用いて菌体を破砕して本発明のＦｃ結合性タンパク質を抽出した後、精製すればよい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に調製することができる。
　得られた本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ（以下、ＥＬＩＳＡと表記）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＦｃ結合性タンパク質の改変型を用いる場合は、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１やヒトＩｇＧ３が特に好ましい。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に結合させることで、本発明の吸着剤を製造することができる。前記不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
　Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化するには、不溶性担体にＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介してヒトＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー製）、ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ　Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｒｅｓｉｎ（サーモサイエンティフィック製）が例示できる。
　一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。
　担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－［４－Ｎ－マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、（Ｎ－［α―マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル）、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（スクシンイミジル－４－［マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボニル－［６－アミノヘキサン酸］）、（スクシンイミジル－４－［マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボン酸）、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
　担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。
　担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－ＭｏｒｐｈｏｌｉｎｏＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ＨｙｄｒｏｘｙＥｔｈｙｌ）－１－ＰｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性や本発明のＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる本発明の吸着剤を用いて、抗体を分離するには、例えば、本発明の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む緩衝液をポンプ等の送液手段を用いて添加することで、抗体を本発明の吸着剤に特異的に吸着させた後、適切な溶出液をカラムに添加することで、抗体を溶出すればよい。なお、抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に分離できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示することができる。なお緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ４から８である。本発明の吸着剤に吸着した、抗体を溶出させるには、抗体とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨ変化、カウンターペプチド、温度変化、塩濃度変化が例示できる。本発明の吸着剤に吸着した、抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、本発明の吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から５．０、さらに好ましくはｐＨ３．０から４．０である。
　塩濃度の変化で抗体を溶出させる場合、高濃度の塩を含む緩衝液（溶出液）で一段階に溶出してもよく、任意に塩濃度を段階的に上昇させてもよく（ステップグラジエント）、直線的濃度勾配で塩濃度を上昇させてもよい（リニアグラジエント）が、リニアグラジエントで溶出させると好ましい。例えば水溶性の塩として塩化ナトリウムを用いる場合、塩化ナトリウム濃度０Ｍから１Ｍまでのリニアグラジエントで溶出させればよい。また、ｐＨ変化で抗体を溶出させる場合、平衡化緩衝液よりｐＨが低下した酸性緩衝液（溶出液）で一段階に溶出してもよく、任意に緩衝液のｐＨを段階的に低下させてもよく（ステップグラジエント）、直線的濃度勾配で緩衝液のｐＨを低下させてもよい（リニアグラジエント）が、リニアグラジエントで溶出させると好ましい。例えば抗体が吸着する中性から弱酸性の緩衝液から抗体が溶離する酸性の緩衝液へと、リニアグラジエントで溶出させればよい。
　前述した方法で溶出された、抗体が含まれる画分を分取することで当該抗体を得ることができる。分取は常法により行なってよい。具体的には、例えば、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、自動フラクションコレクター等により画分の分取をすることが挙げられる。
　なお抗体を含む溶液から、本発明の吸着剤を用いて前記抗体を分離する際、本発明のＦｃ結合性タンパク質は抗体に結合している糖鎖構造の違いを認識することから、前記抗体が有する糖鎖構造の違いにより、抗体を順次溶出させ、その結果、抗体の溶出位置（溶出フラクション）が異なる溶出離液を用いることが好ましい。従って、本発明の吸着剤を用いて抗体を分離することで、抗体が有する糖鎖構造の違いを識別することができる。識別可能な糖鎖の構造に特に限定はなく、一例として、ＣＨＯ細胞といった動物由来の細胞や、ピキア酵母やサッカロミセス酵母といった酵母を宿主として抗体を発現させたときに付加される糖鎖や、ヒト抗体が有する糖鎖や、化学合成法で抗体に付加した糖鎖があげられる。また本発明の吸着剤は、抗体が有する糖鎖構造の違いに基づき抗体を分離できる。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質は、天然型のＦｃ結合性タンパク質と比べて、アルカリに対して優れた安定性（アルカリ耐性）を有する。本発明のＦｃ結合性タンパク質を抗体の吸着剤におけるアフィニティリガンドとして用いることで、アルカリ洗浄に対する安定性（耐性）が高い吸着剤が得られる。したがって、抗体医薬品の工業的製造におけるコスト低減に寄与できる。
　また、本発明のＦｃ結合性タンパク質において、特定位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、遺伝子組換体による生産性を向上させることができる。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａの概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。 ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルにより、モノクローナル抗体（リツキサン）を分離した際のクロマトグラムである。２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）および１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を用い、１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）が０％から１００％になるようにリニアグラジエント溶出することで、リツキサンを溶出した。 ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いて、リニアグラジエント溶出により分取したモノクローナル抗体（リツキサン）のＡＤＣＣ活性を測定した結果を示している。 ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いて、リニアグラジエント溶出により分取したモノクローナル抗体（リツキサン）の糖鎖構造を解析した結果を示している。 ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルにより、モノクローナル抗体（リツキサン）を分離した際のクロマトグラムである。２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）および１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）により、ステップグラジエント溶出することで、リツキサンを溶出した。 ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いて、ステップグラジエント溶出により分取したモノクローナル抗体（リツキサン）の糖鎖構造を解析した結果を示している。 ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルにより、モノクローナル抗体（アバスチン）を分離した際のクロマトグラムである。２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）および１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）により、ステップグラジエント溶出することで、アバスチンを溶出した。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
　実施例１　Ｆｃ結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
　特開２０１７－１１８８７１号公報に記載の方法で作製した、ＦｃＲ３５ｃを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号５）をコードするポリヌクレオチドに対し、エラープローンＰＣＲによるランダム変異導入を施した。なおＦｃＲ３５ｃ（配列番号５に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基）は、天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（図１のＥＣ領域）に相当する、配列番号４の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまで（配列番号１では１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまで）のアミノ酸残基であり、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ３７Ｇｌｙ（この表記は、配列番号４の３７番目のグルタミン酸がグリシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｌｅｕ３９Ｍｅｔ、Ｖａｌ４３Ｇｌｕ、Ｐｈｅ４５Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４９Ｐｒｏ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｌｙｓ５６Ｇｌｎ、Ｇｌｎ６４Ａｒｇ、Ｔｙｒ６７Ｈｉｓ、Ｇｌｕ７０Ａｓｐ、Ａｓｎ７２Ａｓｐ、Ｓｅｒ８４Ｐｒｏ、Ｔｙｒ９０Ｐｈｅ、Ｐｈｅ９１Ｉｌｅ、Ａｌａ９４Ｓｅｒ、Ｔｈｒ９６Ｓｅｒ、Ａｓｐ９８Ｇｌｕ、Ａｓｎ１０８Ｓｅｒ、Ａｓｐ１１４Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１１７Ｌｅｕ、Ｖａｌ１３３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３５Ｖａｌ、Ｇｌｕ１３７Ｇｌｙ、Ａｓｐ１３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１４８Ａｒｇ、Ｔｈｒ１５６Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１５７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１６３Ｖａｌ、Ｔｙｒ１７４Ｖａｌ、Ｌｙｓ１８１Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１８７Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１９４Ａｒｇ、Ｔｈｒ２０１Ａｌａ、Ａｓｎ２０３Ｇｌｕ、Ｉｌｅ２０６ＶａｌおよびＧｌｎ２０８Ｐｒｏのアミノ酸置換を有したポリペプチドである。
　（１）鋳型として特開２０１７－１１８８７１号公報に記載の方法で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲ３５ｃ（当該発現ベクターのうち配列番号５に記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６に示す）を用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。この反応によりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションした。
　（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異ライブラリーとした。
　実施例２　アルカリ耐性を有したＦｃ結合性タンパク質のスクリーニング
　（１）実施例１で作製したランダム変異ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３０℃で一晩振とう培養した。
　（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの０．０５ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
　（３）培養後、遠心操作によって得られた、Ｆｃ結合性タンパク質を含む培養上清を純水にて２５倍に希釈し、等量の５００ｍＭの水酸化ナトリウム溶液と混合した後、３０℃で３時間静置することでアルカリ処理した。アルカリ処理後は、４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）でｐＨを中性付近に戻した。
　（４）（３）に記載のアルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（３）に記載のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、それぞれ下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、アルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
　（４－１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化し（４℃で１８時間）、固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ　ＭＩＬＫ（ＢＤ製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
　（４－２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ　２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体結合活性を評価するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Ｆｃ結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃で１時間）。
　（４－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
　（４－４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　（５）（４）の方法で約２７００株の形質転換体を評価し、その中からＦｃＲ３５ｃと比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。選択した形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地にて培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて発現ベクターを調製した。
　（６）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　ｒｅａｄ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７００　ＤＮＡ　ａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）または配列番号３（５’－ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
　（４）の方法で形質転換体を評価し、ＦｃＲ３５ｃと比較した結果を表２に示す。ＦｃＲ３５ｃと比較してアルカリ安定性が向上したポリペプチドを、ＦｃＲ３５ｄ、ＦｃＲ３６ｉおよびＦｃＲ３６ａと命名した。ＦｃＲ３５ｃと比較してアルカリ安定性が低下したポリペプチドを、それぞれＡ，Ｂ，ＣおよびＤとして表２に記載した（配列未確認）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号８に示す。また、ＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列を配列番号９に、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１０に示す。さらに、ＦｃＲ３６ａを含むＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１１に、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１２に示す。なお、配列番号７、９および１１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ３５ｄ（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉ（配列番号９）またはＦｃＲ３６ａ（配列番号１１）のアミノ酸配列、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
　（６）の方法でＦｃＲ３５ｄ、ＦｃＲ３６ｉおよびＦｃＲ３６ａをコードするポリヌクレオチドの配列を解析した結果、ＦｃＲ３５ｄ（配列番号７）はＦｃＲ３５ｃに対して、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００ＧｌｙおよびＧｌｕ２０３Ａｓｐという新たなアミノ酸置換が生じた一方、９８番目、１１４番目、１１７番目および２０８番目のアミノ酸残基は天然型（配列番号４）のアミノ酸残基に戻っていた。またＦｃＲ３６ｉ（配列番号９）はＦｃＲ３５ｃに対して、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００ＧｌｙおよびＧｌｕ２０３Ａｓｐという新たなアミノ酸置換が生じた一方、９８番目、１１４番目、１１７番目および２０８番目のアミノ酸残基はＦｃＲ３５ｄと同様、天然型（配列番号４）のアミノ酸残基に戻っていた。ＦｃＲ３６ａ（配列番号１１）はＦｃＲ３５ｃに対して、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００ＧｌｙおよびＧｌｕ２０３Ａｓｐという新たなアミノ酸置換が生じた一方、９８番目、１１４番目、１１７番目および２０８番目のアミノ酸残基はＦｃＲ３５ｄおよびＦｃＲ３６ｉと同様、天然型（配列番号４）のアミノ酸残基に戻っていた。
　実施例３　Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性評価
　（１）ＦｃＲ３５ｃを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号５）、ならびに実施例２で取得した、ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号９）およびＦｃＲ３６ａを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号１１）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
　（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１０００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を１０ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
　（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
　（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で懸濁し、超音波破砕した。その後、遠心分離により上清を回収した。
　（５）回収した上清は、Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌと５００ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で溶出し、当該溶出画分を回収した。
　（６）（５）で回収した溶出画分を、ＩｇＧ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０））で溶出し、当該溶出画分を回収後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１／４倍量加えて中和することで、精製した各Ｆｃ結合性タンパク質を調製した。
　（７）各Ｆｃ結合性タンパク質の濃度が１０μｇ／ｍＬになるよう純水で希釈後、前記希釈した溶液５０μＬと２００ｍＭの水酸化ナトリウム溶液５０μＬとを混合し、２５℃で９６時間静置することでアルカリ処理した。その後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えることで中和した。
　（８）（７）に記載のアルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（７）に記載のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。その後、アルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
　結果を表３に示す。ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号９）およびＦｃＲ３６ａを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号１１）は、ＦｃＲ３５ｃを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号５）と比較し残存活性が高いことから、実施例２で取得したＦｃＲ３５ｄ、ＦｃＲ３６ｉおよびＦｃＲ３６ａは、ＦｃＲ３５ｃに比べてアルカリ安定性（アルカリ耐性）が向上していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例４　Ｆｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性測定
　形質転換体として、ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号９）、ＦｃＲ３６ａを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号１１）またはＦｃＲ３５ｃを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号５）を発現する形質転換体を用いて、下記の方法で測定した。
　（１）前記ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号７）またはＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号９）を発現する形質転換体をそれぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
　（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を０．２ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
　（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
　（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（メルクミリポア製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
　（５）Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例２（４）に示すＥＬＩＳＡ法にて測定した。得られたＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性よりＦｃ結合性タンパク質の発現量を算出した。
　結果を表４に示す。培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ３５ｄおよびＦｃＲ３６ｉの発現量はそれぞれ４４３．５ｍｇおよび４９５．６ｍｇとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（６）前記ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号９）、ＦｃＲ３６ａを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号１１）またはＦｃＲ３５ｃを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号５）を発現する形質転換体をそれぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
　（７）（２）と同様に振とう培養を行った。
　（８）（３）に記載の方法のうち培養時間を１２時間とした以外は同様の方法で振とう培養した。
　（９）（４）と同様にタンパク質抽出液を調製した。
　（１０）（５）と同様に発現量を算出した。
　結果を表５に示す。培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ３５ｄ、ＦｃＲ３６ｉ、ＦｃＲ３６ａおよびＦｃＲ３５ｃの発現量はそれぞれ２２６ｍｇ、２４８ｍｇ、３０７ｍｇおよび２１１ｍｇとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　実施例５　Ｆｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合親和性評価
　（１）実施例３（１）から（６）と同様の方法で培養および精製を実施し、各Ｆｃ結合性タンパク質を調製した。
　（２）（１）の溶出画分として回収したＦｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合親和性評価を表面プラズモン共鳴法により行なった。表面プラズモン共鳴法を用いた結合親和性の測定において、測定装置としてはＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００（ＧＥヘルスケア製）を、センサーチップとしてはＳｅｎｓｏｒ　Ｃｈｉｐ　ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を、解析ソフトとしてはＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア製）を、それぞれ用いた。
　（３）Ａｍｉｎｅ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア製）を用いてＦｃ結合性タンパク質を固定化したセンサーチップに対し、ＩｇＧ１（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ製）をＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥヘルスケア製）で希釈した溶液を流すことでセンサーグラムを得た。当該センサーグラムを基にカーブフィッティングを行なうことで、ＩｇＧ１に対する結合親和性を算出した。
　ＩｇＧ１に対する結合親和性を算出した結果を表６に示す。なお表５において、ＫD値（解離定数）が低いほど、高いアフィニティ（結合親和性）を有している。ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号９）およびＦｃＲ３６ａを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号１１）のＫD値は、それぞれ３．９×１０-8Ｍ、４．３×１０-8Ｍおよび９．５×１０-8Ｍとなり、ＦｃＲ３５ｃを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号５）のＫD値（４．０×１０-8Ｍ）と同等の結合親和性であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　以上の結果から、実施例２で取得したＦｃＲ３５ｄ、ＦｃＲ３６ｉおよびＦｃＲ３６ａは、抗体のＦｃ領域と結合可能な既知のポリペプチド（ＦｃＲ３５ｃ、特開２０１７－１１８８７号公報）と同等の抗体に対する結合親和性を有しながら、アルカリ耐性は向上していることがわかる。
　実施例６　システインタグを付加したＦｃＲ３６ｉの作製
（１）実施例２で作製したＦｃＲ３６ｉをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０）を鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号１３（５’－ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣＴＣＧＣＡＴＴＡＴＣＣＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣ－３’）および配列番号１４（５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＴＡＡＴＧＴＣＣＡＣＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製の発現ベクターｐＴｒｃ－ＰｅｌＢにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
　（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを抽出した。
　（４）ｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を、配列番号１５（５’－ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ－３’）または配列番号１６（５’－ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて行なった。
　発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１７に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１８にそれぞれ示す。
　なお配列番号１７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までが改良ＰｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチドであって、ただし１つのアミノ酸置換を含むオリゴペプチド）であり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ３６ｉのアミノ酸配列（配列番号９の３３番目から２０８番目までの領域）、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。
　実施例７　ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの調製
　（１）実施例６で作製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを発現する形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
　（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよびカルベニシリン１００ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽（バイオット製）を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。
　（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
　（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。
　（５）回収した菌体を２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
　（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１４０ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＣＭ－６５０Ｍ（東ソー製）を充填したＶＬ３２×２５０カラム（メルクミリポア製）に流速１０ｍＬ／分でアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。
　前記精製により、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを得た。
実施例８　ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルの作製とリニアグラジエント溶出による抗体分離
　（１）分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、実施例７で調製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを反応させることにより、ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを得た。
　（２）（１）で調製したＦｃＲ３６ｉ固定化ゲル１．０ｍＬをＴｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥヘルスケア製、内径５ｍｍ）に充填した。
　（３）ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを充填したカラムをＡＫＴＡ　Ａｖａｎｔ（ＧＥヘルスケア製）に接続し、ｐＨ４．８の２０ｍＭの酢酸緩衝液（緩衝液Ａ）で平衡化した。
　（４）ｐＨ４．８の２０ｍＭの酢酸緩衝液（緩衝液Ａ）で１０ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業製）を流速０．２ｍＬ／ｍｉｎにて０．５ｍＬアプライした。
　（５）流速０．２ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で６６分洗浄後、ｐＨ３．０の１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（緩衝液Ｂ）によるリニアグラジエント（７５分でｐＨ３．０の１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（緩衝液Ｂ）が１００％となるリニアグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
　結果（溶出パターンのクロマトグラム）を図２に示す。モノクローナル抗体はＦｃＲ３６ｉと相互作用することで、ゲルろ過クロマトグラフィーのような単一のピークではなく、２つのピークに分離された。つまり、ＦｃＲ３６ｉと弱い結合を示す抗体は溶出時間が早く、強い結合を示す抗体は溶出時間が遅くなることにより、２つのピークに分離した。
実施例９　ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いてリニアグラジエント溶出により分離した抗体のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害作用）活性測定
　（１）実施例８に記載の溶出条件でモノクローナル抗体を分離し、図２に記載の溶出パターンのクロマトグラムにおけるフラクションＡ（ＦｒＡ）およびフラクションＢ（ＦｒＢ）の画分を分取した。
　（２）ＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体、ならびに分離前のモノクローナル抗体の濃度を２８０ｎｍの吸光度で測定した。
　（３）以下に示す方法で、ＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体、ならびに分離前のモノクローナル抗体が有するＡＤＣＣ活性を測定した。
　（３－１）１．４ｍＬのＬｏｗ　ＩｇＧ　Ｓｅｒｕｍと３３．６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地とを混合して調製したＡＤＣＣ　Ａｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒを用いて、ＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体ならびに分離前のモノクローナル抗体を１ｎｇ／ｍＬから１／３希釈で９段階の希釈系列を調製した。
　（３－２）Ｒａｊｉ細胞をＡＤＣＣ　Ａｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒにて約５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６ｗｅｌｌプレート（３９１７：コーニング社）に２５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。
　（３－３）Ｒａｊｉ細胞を加えたｗｅｌｌに（３－１）で調製したＦｒＡ、ＦｒＢ、分離前のモノクローナル抗体、ブランク（ＡＤＣＣ　Ａｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒのみ）を２５μＬ／ｗｅｌｌ加えた。
　（３－４）Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞（プロメガ製）をＡＤＣＣ　Ａｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒにて約３．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、Ｒａｊｉ細胞および抗体を加えたｗｅｌｌに２５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。その後、ＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2、３７℃）にて６時間静置した。
　（３－５）９６ｗｅｌｌプレートを室温で５分から３０分静置した後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ製）を７５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。室温で３０分反応させたのち、ＧｌｏＭａｘ　Ｍｕｌｔｉ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で発光を測定した。
　実施例８に記載の溶出条件で分取したＦｒＡおよびＦｒＢにそれぞれ含まれる抗体ならびに分離前のモノクローナル抗体の発光強度を比較した結果を図３に示す。なお図３の結果は、測定した発光強度からブランクの発光強度を引いた値を示しており、発光強度が高いほど、ＡＤＣＣ活性が高いことを意味している。
　ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルで分取した溶出時間の早いＦｒＡに含まれる抗体は、分離前のモノクローナル抗体とほぼ同程度の発光強度であることからＡＤＣＣ活性はほぼ同等といえる。一方、溶出時間の遅いＦｒＢに含まれる抗体は、分離前のモノクローナル抗体と比べてＡＤＣＣ活性が約１．４倍、ＦｒＡに含まれる抗体と比べても約１．５倍に向上していた。つまり、ＦｒＢに含まれる抗体は分離前のモノクローナル抗体およびＦｒＡに含まれる抗体と比べてＡＤＣＣ活性が高いことが分かる。
実施例１０　ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いてリニアグラジエント溶出により分離した抗体の糖鎖構造解析
　（１）実施例９（１）で分取したＦｒＡおよびＦｒＢにそれぞれ含まれる抗体を１００℃、１０分の熱処理により変性後、グリコアミダーゼＡ／ペプシンおよびプロナーゼで順次処理し、ゲルろ過法による精製操作を経て糖鎖画分を取得した。
　（２）（１）で得られた糖鎖をエバポレーターにて濃縮・乾燥後、酢酸溶媒下、２－アミノピリジン、次いでジメチルアミンボランを順次作用させて蛍光ラベル化糖鎖とし、ゲルろ過法により精製した。
　（３）（２）で得られた蛍光ラベル化糖鎖を陰イオン交換カラム（ＴＳＫｇｅｌ　ＤＥＡＥ－５ＰＷ、φ７．５ｍｍ×７．５ｃｍ：東ソー製）にて、中性糖鎖画分とモノシアリル化糖鎖画分に分離した。
　（４）（３）で得られた中性糖鎖画分とモノシアリル化糖鎖画分をＯＤＳカラムを用いて、個々の糖鎖に単離した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析により単離した糖鎖の分子量情報を取得後、ＯＤＳカラムクロマトグラフのリテンションタイムと照らし合わせて糖鎖構造を帰属した。
　帰属した糖鎖構造の結果を図４および表８、糖鎖構造の概略図を表９に示す。ＦｒＡに含まれる抗体と比較してＦｒＢに含まれる抗体では末端にガラクトースを含む糖鎖構造（Ｇ１ＦａおよびＧ２Ｆ）を有した抗体の割合が高く、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造（Ｇ０Ｆ）を有した抗体の割合が低かった。このことより、末端にガラクトースを含む糖鎖構造を有した抗体はＦｃＲ３６ｉと強く結合し、Ｆｃ３６ｉ固定化ゲルで分離した際に遅い溶出時間で溶出され（すなわち、低いｐＨにて溶出される）、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造を有した抗体はＦｃＲ３６ｉとの結合が弱いこと、およびＦｃ３６ｉ固定化ゲルで分離する際に早く溶出される（すなわち、高いｐＨにて溶出される）ことが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
実施例１１　ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルの作製とステップグラジエント溶出による抗体分離
　（１）実施例８（１）と同様の方法により、ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを得た。
　（２）実施例８（２）と同様の方法により、ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルをカラムに充填した。
　（３）ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを充填したカラムをＡＫＴＡ　Ａｖａｎｔ（ＧＥヘルスケア製）に接続し、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化した。
　（４）２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で１０ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業製）を流速０．２ｍＬ／ｍｉｎにて１．５ｍＬアプライした。
　（５）流速０．２ｍＬ／ｍｉｎのまま２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を１２０分間送液後、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）を１００分間送液し、モノクローナル抗体を溶出した。
　（６）流速０．２ｍＬ／ｍｉｎのまま１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を５０分間送液することで、吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
　結果（溶出パターンのクロマトグラム）を図５に示す。ｐＨの異なる緩衝液をカラムに送液したことで、それぞれの緩衝液にて抗体が溶出され、モノクローナル抗体は３つのピークに分離された。モノクローナル抗体はＦｃＲ３６ｉと相互作用することから、高いｐＨで早く溶出された抗体はＦｃＲ３６ｉと弱い親和性を示す抗体であり、低いｐＨで遅く溶出された抗体はＦｃＲ３６ｉと強い親和性を示す抗体であることがわかる。
実施例１２　ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルで分離した抗体の糖鎖解析
　（１）実施例１１に記載の溶出条件でモノクローナル抗体を分離し、図５に記載の溶出パターンのクロマトグラムにおけるフラクションＣ（ＦｒＣ）、フラクションＤ（ＦｒＤ）およびフラクションＥ（ＦｒＥ）の画分を分取した。
　（２）上記で分取したＦｒＣ、ＦｒＤおよびＦｒＥにそれぞれ含まれる抗体を用いたこと以外は、実施例１０と同様の方法で、糖鎖構造を帰属した。
　帰属した糖鎖構造の結果を図６および表１０、糖鎖構造の概略図を表９に示す。
ＦｒＣ（２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で溶出）、ＦｒＤ（２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）で溶出）およびＦｒＥ（１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出）に含まれるそれぞれの抗体の糖鎖構造を比較すると、高いｐＨで溶出されたフラクションに含まれる抗体では末端にガラクトースを含まない糖鎖構造（Ｇ０Ｆ）を有した抗体の割合が高く、低いｐＨで溶出されたフラクションに含まれる抗体では末端にガラクトースを含む糖鎖構造（Ｇ１ＦａおよびＧ２Ｆ）を有した抗体の割合が高かった。このことより、末端にガラクトースを含む糖鎖構造を有した抗体はＦｃＲ３６ｉと強く結合し、Ｆｃ３６ｉ固定化ゲルで分離した際に低いｐＨで溶出され、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造を有した抗体はＦｃＲ３６ｉとの結合が弱いこと、およびＦｃ３６ｉ固定化ゲルで分離した際に高いｐＨで溶出されることが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
実施例１３　ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いたステップグラジエント溶出による抗体分離（その２）
　（１）実施例８（１）と同様の方法により、ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを得た。
　（２）ゲル量を０．２ｍLとした以外は、実施例８（２）と同様の方法により、ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルをカラムに充填した。
　（３）ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを充填したカラムをＡＫＴＡ　Ａｖａｎｔ（ＧＥヘルスケア製）に接続し、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化した。
　（４）２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で１０ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体（アバスチン、Ｒｏｃｈｅ製）を流速０．０４ｍＬ／ｍｉｎにて０．３ｍＬアプライした。
　（５）流速０．０４ｍＬ／ｍｉｎのまま２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を１８０分間送液後、流速０．０４ｍＬ／ｍｉｎで２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）を１５０分間送液し、モノクローナル抗体を溶出した。
　（６）流速０．０４ｍＬ／ｍｉｎのまま１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を１００分間送液することで、吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
結果（溶出パターンのクロマトグラム）を図７に示す。モノクローナル抗体は３つのピークに分離されたが実施例１１と異なる種類の抗体であることから、異なる溶出パターンが得られることが分かる。
　参考例１　ＦｃＲ９アミノ酸置換体の作製
　特開２０１６－１６９１９７号公報（特許文献３）に記載の方法で作製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号２０）に対し、１９２番目（配列番号１では１７６番目に相当）のアミノ酸残基を他のアミノ酸へ置換することの有用性を確認するため、以下に示すアミノ酸置換を行なった。具体的にはＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１）を含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲ９（特開２０１６－１６９１９７号公報）に対し、ＰＣＲを用いてアミノ酸の置換を行ない、ＦｃＲ９（配列番号２０）のうち１９２番目のバリンを他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質を作製した。なおＦｃＲ９（配列番号２０）は、配列番号４に示すヒトＦｃγＲＩＩＩ細胞外領域を含むＦｃ結合性タンパク質において、４３番目（配列番号１では２７番目に相当）のバリンをグルタミン酸に、４５番目（配列番号１では２９番目に相当）のフェニルアラニンをイソロイシンに、５１番目（配列番号１では３５番目に相当）のチロシンをアスパラギンに、６４番目（配列番号１では４８番目に相当）のグルタミンをアルギニンに、９１番目（配列番号１では７５番目に相当）のフェニルアラニンをロイシンに、１０８番目（配列番号１では９２番目に相当）のアスパラギンをセリンに、１３３番目（配列番号１では１１７番目に相当）のバリンをグルタミン酸に、１３７番目（配列番号１では１２１番目に相当）のグルタミン酸をグリシンに、および１８７番目（配列番号１では１７１番目に相当）のフェニルアラニンをセリンに、それぞれアミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質である。
　（１）鋳型ＤＮＡとして特開２０１６－１６９１９７号公報に記載の方法で作製したＦｃＲ９（配列番号２０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１）を含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲ９（特開２０１６－１６９１９７号公報）を、フォワードプライマーとして配列番号２（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号２２（５’－ＣＡＴＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＭＮＮＣＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＡＧＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表１１に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することでＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物をＶ１９２ｐ１とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　（２）フォワードプライマーとして配列番号２３（５’－ＣＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＧＮＮＫＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号３（５’－ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は（１）と同様な方法でＰＣＲを行ない、得られたＰＣＲ産物をＶ１９２ｐ２とした。
　（３）ＰＣＲ産物として（１）で得られたＶ１９２ｐ１と（２）で得られたＶ１９２ｐ２との混合物を用いて、表１２に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、Ｖ１９２ｐ１とＶ１９２ｐ２を連結したＰＣＲ産物Ｖ１９２ｐを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　（４）ＰＣＲ産物として（３）で得られたＶ１９２ｐを、フォワードプライマーとして配列番号２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表１３に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なうＰＣＲを行ない、ＦｃＲ９（配列番号２０）の１９２番目のバリンを任意のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。得られたポリヌクレオチドをＶ１９２ｐ３とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　（５）（４）で得られたＶ１９２ｐ３を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
　（６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出した。
　（７）得られたプラスミドのうちＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２または配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
　配列解析の結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号２０）の１９２番目のバリンがアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンのいずれかに置換されたＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を得た。
　参考例２　Ｆｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性測定
　（１）参考例１で得た形質転換体のうち、ＦｃＲ９（配列番号２０）の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のアミノ酸残基をイソロイシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅとも表記）、アラニン（以下、Ｖａｌ１９２Ａｌａとも表記）またはチロシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒとも表記）に置換したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
　（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を０．２ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
　（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
　（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
　（５）Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定した。
　（５－１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで添加して固定化（４℃で一晩）後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ　ＭＩＬＫ（ＢＤ製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）をウェルに添加することでブロッキングした。
　（５－２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体結合活性を評価するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Ｆｃ結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃で１時間）。
　（５－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
　（５－４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　（６）（５）の方法で得られたＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性よりＦｃ結合性タンパク質の発現量を算出した。
　結果を表１４に示す。Ｖａｌ１９２Ｉｌｅのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号２４）、Ｖａｌ１９２Ａｌａのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ａ（配列番号２６）、およびＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｙ（配列番号２８）を発現する形質転換体における培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質発現量はそれぞれ、１３０．６ｍｇ、２１．７ｍｇおよび１４．６ｍｇとなった。
　本参考例で検討したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｉのアミノ酸配列を配列番号２４に、前記ＦｃＲ９＿Ｉをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２５にそれぞれ示す。なお配列番号２４において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９（配列番号２０）の３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列においてＶａｌ１９２Ｉｌｅのアミノ酸置換が生じたポリペプチドであり、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅのイソロイシンは配列番号２４では１９２番目の位置に存在する。
　本参考例で検討したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ａのアミノ酸配列を配列番号２６に、前記ＦｃＲ９＿Ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２７に示す。なお配列番号２６は、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９（配列番号２０）の３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列においてＶａｌ１９２Ａｌａのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである他は、配列番号２４と同じ配列である。また、Ｖａｌ１９２Ａｌａのアラニンは配列番号２６では１９２番目の位置に存在する。
　本参考例で検討したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｙのアミノ酸配列を配列番号２８に、前記ＦｃＲ９＿Ｙをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２９に示す。なお配列番号２８は、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９（配列番号２０）の３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列においてＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである他は、配列番号２４と同じ配列である。また、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒのチロシンは配列番号２８では１９２番目の位置に存在する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　参考例３
　形質転換体として、特開２０１６－１６９１９７号公報（特許文献３）で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号２０）を発現する形質転換体を用いたこと以外は参考例２と同様に行なった。
　結果を表１４に示す。培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質の発現量は１．４ｍｇとなった。以上の結果から、ＦｃＲ９にＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒのいずれかのアミノ酸置換を導入したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体は、ＦｃＲ９を発現する形質転換体と比較し、発現量が大幅に向上していることがわかる。
　参考例４
　形質転換体として、ＦｃＲ９（配列番号２０）の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のアミノ酸残基をフェニルアラニン（以下、Ｖａｌ１９２Ｐｈｅとも表記）、アルギニン（以下、Ｖａｌ１９２Ａｒｇとも表記）、ロイシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｌｅｕとも表記）、アスパラギン（以下、Ｖａｌ１９２Ａｓｎとも表記）、アスパラギン酸（以下、Ｖａｌ１９２Ａｓｐとも表記）、システイン（以下、Ｖａｌ１９２Ｃｙｓとも表記）、グルタミン（以下、Ｖａｌ１９２Ｇｌｎとも表記）、グルタミン酸（以下、Ｖａｌ１９２Ｇｌｕとも表記）、グリシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｇｌｙとも表記）、ヒスチジン（以下、Ｖａｌ１９２Ｈｉｓとも表記）、リジン（以下、Ｖａｌ１９２Ｌｙｓとも表記）、メチオニン（以下、Ｖａｌ１９２Ｍｅｔとも表記）、プロリン（以下、Ｖａｌ１９２Ｐｒｏとも表記）、セリン（以下、Ｖａｌ１９２Ｓｅｒとも表記）、スレオニン（以下、Ｖａｌ１９２Ｔｈｒとも表記）またはトリプトファン（以下、Ｖａｌ１９２Ｔｒｐとも表記）に置換したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を用いたこと以外は参考例２と同様に行なった。
　結果を表１４に示す。いずれも培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質の発現量はゼロまたは１ｍｇ未満であった。
　参考例５　Ｆｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合親和性評価
　（１）参考例１で得た形質転換体のうち、ＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号２４）またはＦｃＲ＿Ａ（配列番号２６）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
　（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１０００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を１０ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
　（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
　（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で懸濁し、超音波破砕した。その後、遠心分離により上清を回収した。
　（５）回収した上清は、Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌと５００ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で溶出し、当該溶出画分を回収した。
　（６）（５）で回収した溶出画分を、ＩｇＧ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０））で溶出し、当該溶出画分を回収した。
　（７）（６）の溶出画分として回収したＦｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合性評価を表面プラズモン共鳴法を用いて行なった。表面プラズモン共鳴法を用いた結合性の測定において、測定装置としてはＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００（ＧＥヘルスケア製）を、センサーチップとしてはＳｅｎｓｏｒ　Ｃｈｉｐ　ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を、解析ソフトとしてはＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア製）を、それぞれ用いた。
　（８）Ａｍｉｎｅ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア製）を用いてＦｃ結合性タンパク質を固定化したセンサーチップに対し、ＩｇＧ１（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ製）をＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥヘルスケア製）で希釈した溶液を流すことでセンサグラムを得た。当該センサグラムを基にカーブフィッティングを行なうことで、ＩｇＧ１に対する結合性を算出した。
　ＩｇＧ１に対する親和性を算出した結果を表１５に示す。なお表５において、ＫD値（解離定数）が低いほど、高いアフィニティ（親和性）を有している。ＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号２４）およびＦｃＲ９＿Ａ（配列番号２６）のＫD値は、それぞれ６．０×１０-8Ｍおよび３．６×１０-8Ｍとなった。
　参考例６
　形質転換体として、特開２０１６－１６９１９７号公報（特許文献３）で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号２０）を発現する形質転換体を用いたこと以外は参考例５と同様に行なった。
　ＩｇＧ１に対する親和性を算出した結果を表１５に示す。ＦｃＲ９のＫD値は７．７×１０-8Ｍであり、ＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号２４）およびＦｃＲ９＿Ａ（配列番号２６）と同等の親和性であった。このことから本発明のＦｃ結合性タンパク質の一態様である、ＦｃＲ９＿ＩおよびＦｃＲ９＿Ａは、ＦｃＲ９と同様、不溶性担体に固定化することで抗体医薬品製造における工程分析および分取のための抗体吸着剤として使用可能であることが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　参考例７
　形質転換体として、ＦｃＲ９（配列番号２０）の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のバリンをフェニルアラニンに置換したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ＿Ｆ）を発現する形質転換体を用いたこと以外は参考例５と同様に行なった。
　ＩｇＧ１に対する親和性を算出した結果を表１５に示す。ＦｃＲ９＿ＦのＫD値は、３．３×１０-6Ｍとなり、本発明のＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号２４）およびＦｃＲ＿Ａ（配列番号２６）ならびにＦｃＲ９（配列番号２０）と比較し、親和性が低いことを確認した。

Claims (12)

  1. 　配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、少なくとも以下に示す３５箇所のアミノ酸置換を有するアミノ酸残基を含み、かつ、抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質；
    （１）配列番号４の３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
    （２）配列番号４の３９番目のロイシンのメチオニンへの置換
    （３）配列番号４の４３番目のバリンのグルタミン酸への置換
    （４）配列番号４の４５番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換
    （５）配列番号４の４９番目のグルタミンのプロリンへの置換
    （６）配列番号４の５１番目のチロシンのアスパラギンへの置換
    （７）配列番号４の５６番目のリジンのグルタミンへの置換
    （８）配列番号４の６４番目のグルタミンのアルギニンへの置換
    （９）配列番号４の６７番目のチロシンのヒスチジンへの置換
    （１０）配列番号４の７０番目のグルタミン酸のアスパラギン酸への置換
    （１１）配列番号４の７２番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換
    （１２）配列番号４の８１番目のセリンのアルギニンへの置換
    （１３）配列番号４の８４番目のセリンのプロリンへの置換
    （１４）配列番号４の９０番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換
    （１５）配列番号４の９１番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換
    （１６）配列番号４の９４番目のアラニンのセリンへの置換
    （１７）配列番号４の９６番目のスレオニンのセリンへの置換
    （１８）配列番号４の１０８番目のアスパラギンのセリンへの置換
    （１９）配列番号４の１３３番目のバリンのグルタミン酸への置換
    （２０）配列番号４の１３５番目のリジンのバリンへの置換
    （２１）配列番号４の１３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
    （２２）配列番号４の１３８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換
    （２３）配列番号４の１４８番目のリジンのアルギニンへの置換
    （２４）配列番号４の１５６番目のスレオニンのメチオニンへの置換
    （２５）配列番号４の１５７番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換
    （２６）配列番号４の１６３番目のグリシンのバリンへの置換
    （２７）配列番号４の１７４番目のチロシンのバリンへの置換
    （２８）配列番号４の１８１番目のリジンのグルタミン酸への置換
    （２９）配列番号４の１８７番目のフェニルアラニンのセリンへの置換
    （３０）配列番号４の１９４番目のセリンのアルギニンへの置換
    （３１）配列番号４の１９６番目のアスパラギンのリジンへの置換
    （３２）配列番号４の２００番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
    （３３）配列番号４の２０１番目のスレオニンのアラニンへの置換
    （３４）配列番号４の２０３番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換
    （３５）配列番号４の２０６番目のイソロイシンのバリンへの置換
  2. 　以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）である、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質：
    （ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、
    （ｉ）前記（１）～（３５）のアミノ酸置換、および
    （ｉｉ）（ｉ）以外の１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加の１以上を有するアミノ酸残基を含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
    （ｂ）前記（１）～（３５）のアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であって、配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
    （ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列において、前記（１）～（３５）のアミノ酸置換がなされたアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
  3. 　さらに以下に示すアミノ酸置換のいずれかを少なくとも有する、請求項１または２に記載のＦｃ結合性タンパク質。
    （３６）配列番号４の１９２番目のバリンのイソロイシンへの置換
    （３７）配列番号４の１９２番目のバリンのアラニンへの置換
    （３８）配列番号４の１９２番目のバリンのチロシンへの置換
  4. 　配列番号７、９または１１に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、請求項１～３の何れかに記載のＦｃ結合性タンパク質。
  5. 　請求項１～４のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  6. 　請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  7. 　請求項６に記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
  8. 　宿主が大腸菌である、請求項７に記載の形質転換体。
  9. 　請求項７または８に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記Ｆｃ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
  10. 　請求項１から４のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、抗体の吸着剤。
  11. 　請求項１０に記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。
  12. 　Ｆｃ結合性タンパク質との結合性の違いに基づいて、異なる糖鎖構造を有する抗体が分離される、請求項１１に記載の分離方法。
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