WO2023095665A1 - 抗体の分離方法 - Google Patents

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WO2023095665A1
WO2023095665A1 PCT/JP2022/042273 JP2022042273W WO2023095665A1 WO 2023095665 A1 WO2023095665 A1 WO 2023095665A1 JP 2022042273 W JP2022042273 W JP 2022042273W WO 2023095665 A1 WO2023095665 A1 WO 2023095665A1
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citrate buffer
antibody
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column
adsorbent
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勇太 早川
直優 谷口
陽介 寺尾
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東ソー株式会社
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    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Definitions

  • the present invention relates to an antibody separation method using an antibody adsorbent. More specifically, the present invention relates to an antibody separation method in which the step of eluting antibodies adsorbed on the antibody adsorbent is optimized.
  • Antibody drugs are drugs that use antibodies (immunoglobulins), which are molecules responsible for immune functions in the body. Antibody drugs bind to target molecules with high specificity and affinity due to the diversity of antibody variable regions. For this reason, antibody drugs have few side effects, and in recent years, the number of diseases to which antibody drugs can be applied has expanded, and the market is expanding rapidly.
  • antibodies immunoglobulins
  • Antibodies used in antibody drugs are manufactured by culturing cells capable of expressing the antibody obtained by genetic engineering (e.g., Chinese hamster ovary cells) and purifying them to a high degree of purity using column chromatography, etc. do.
  • genetic engineering e.g., Chinese hamster ovary cells
  • Non-Patent Document 1 Fractionation is required for each adsorption activity to the graphic carrier.
  • fractionation using affinity chromatography is based on the affinity between the affinity ligand and the antibody.
  • Preparative fractionation may be possible.
  • the affinity chromatography method using an antibody adsorbent containing an insoluble porous carrier and an Fc-binding protein immobilized on the carrier differences in sugar chain structures (e.g., differences in ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) activity ), separation and fractionation of antibodies are possible (Patent Document 1).
  • the antibody adsorbed on the antibody adsorbent is eluted with a linear gradient that continuously lowers the pH.
  • linear gradient elution is applied, the separability of elution peaks decreases, and it takes a long time to fractionate antibodies, making it difficult to process a large amount of antibodies.
  • An object of the present invention is to solve the problem of antibody-dependent cytotoxic activity due to differences in sugar chain structure in an affinity chromatography method using an antibody adsorbent containing an insoluble porous carrier and an Fc-binding protein immobilized on the carrier.
  • the object is to provide a method capable of large-scale fractionation of antibodies based on differences.
  • the antibody adsorbed on the antibody adsorbent is eluted with a step gradient that gradually decreases the pH, and the range of decrease is optimized. , have completed the present invention.
  • the method is a step gradient that decreases stepwise, and the range of decrease in pH is 0.1 or more and less than 1.
  • [2] The method according to [1], wherein the insoluble porous carrier has a volume average particle size of 30 to 150 ⁇ m.
  • the buffer solution has a buffering capacity in the range of pH 3.0 or more and 6.0 or less and contains a buffer substance having multiple pKas within the above range. described method.
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the ratio of the mass of the antibody to the volume of the antibody adsorbent is 1 mg/1.0 mL to 50 mg/0.1 mL.
  • [5] The method of any one of [1] to [4], wherein the Fc-binding protein is human Fc ⁇ RIIIa.
  • antibody composition having binding activity to the above antibody, wherein the following citrate buffer having a pH of 4.0 or less when the monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions: An antibody composition containing 15% by mass or more of an antibody eluted in a liquid, based on the total mass of the antibody composition. [8] An antibody composition containing 15% by mass or more of an antibody detected at a retention time of 750 minutes or more when a monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions, based on the total mass of the antibody composition. , antibody composition.
  • An antibody composition the antibody eluted with the following citrate buffer having a pH of 4.2 or higher when the monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions, the total mass of the antibody composition An antibody composition containing 15% by mass or more of.
  • a concentrate of an antibody solution wherein the antibody solution and the concentrate are eluted with the following citrate buffer having a pH of 4.0 or less when the monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions.
  • a concentrate comprising an antibody, wherein the content of said antibody relative to the total amount of said concentrate is at least twice the content of said antibody relative to the total amount of said antibody solution.
  • An antibody solution concentrate wherein the antibody solution and the concentrate contain an antibody detected at a retention time of 750 minutes or more when the monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions, and the concentration is A concentrate, wherein the content of said antibody relative to the total mass of the product is at least twice the content of said antibody relative to the total volume of said antibody solution.
  • a concentrate of an antibody solution wherein the antibody solution and the concentrate are eluted with the following citrate buffer having a pH of 4.2 or higher when the monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions.
  • a concentrate comprising an antibody, wherein the content of said antibody relative to the total amount of said concentrate is at least twice the content of said antibody relative to the total amount of said antibody solution.
  • An antibody solution concentrate wherein the antibody solution and the concentrate contain an antibody detected at a retention time of less than 750 minutes when the monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions, and the concentration A concentrate, wherein the content of said antibody relative to the total mass of the product is at least twice the content of said antibody relative to the total volume of said antibody solution.
  • An antibody composition wherein the antibody eluted with the following citrate buffer solution having a pH of 4.2 or higher when the monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions, the total mass of the antibody composition An antibody composition containing 15% by mass or more of.
  • a concentrate of an antibody solution wherein the antibody solution and the concentrate are eluted with the following citrate buffer having a pH of 4.0 or less when the monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions.
  • a concentrate comprising an antibody, wherein the content of said antibody relative to the total amount of said concentrate is at least twice the content of said antibody relative to the total amount of said antibody solution.
  • An antibody solution concentrate wherein the antibody solution and the concentrate contain an antibody detected at a retention time of 800 minutes or more when the monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions, and the concentration is A concentrate, wherein the content of said antibody relative to the total mass of the product is at least twice the content of said antibody relative to the total volume of said antibody solution.
  • a concentrate of an antibody solution wherein the antibody solution and the concentrate are eluted with the following citrate buffer having a pH of 4.2 or higher when the monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions.
  • a concentrate comprising an antibody, wherein the content of said antibody relative to the total amount of said concentrate is at least twice the content of said antibody relative to the total amount of said antibody solution.
  • An antibody solution concentrate wherein the antibody solution and the concentrate contain an antibody detected at a retention time of less than 800 minutes when the monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions, and the concentration A concentrate, wherein the content of said antibody relative to the total mass of the product is at least twice the content of said antibody relative to the total volume of said antibody solution.
  • the antibody adsorbed on the adsorbent is is eluted with a step gradient that decreases stepwise with a decrease width of 0.1 or more and less than 1.
  • the desired structure e.g. sugar chain structure
  • activity e.g. ADCC activity or CDC (complement-dependent Antibodies having sexual cytotoxicity) activity
  • ADCC activity or CDC complement-dependent Antibodies having sexual cytotoxicity
  • the insoluble porous carrier of the present invention has a large particle size and is porous, it is possible to further improve dynamic binding capacity (DBC) and reduce pressure loss. can.
  • DBC dynamic binding capacity
  • the present invention is useful as a preparative method for large-scale production of antibodies used in industrial production of antibody drugs.
  • FIG. 1 is a diagram showing a pH approximation curve of a citrate buffer.
  • FIG. 2 is a diagram showing step gradients performed in Examples 1 to 6 and Comparative Example 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Example 1 (Rituxan, pH drop width 0.5).
  • FIG. 4 is a diagram showing the result (separation pattern) of applying the F1 fraction and F2 fraction of FIG. 3 to an FcRIIIA column.
  • FIG. 5 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Example 2 (Rituxan, pH drop width 0.2).
  • FIG. 6 is a diagram showing the results (separation pattern) of applying the F1 to F4 fractions of FIG. 5 to an FcRIIIA column.
  • FIG. 7 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Comparative Example 1 (Rituxan, pH decrease width 1.0).
  • FIG. 8 is a diagram showing the result (separation pattern) of subjecting the F1 fraction in FIG. 7 to an FcRIIIA column.
  • FIG. 9 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Example 3 (Actemra, pH drop width 0.5).
  • FIG. 10 is a diagram showing the results (separation pattern) of applying the F1 to F3 fractions of FIG.
  • FIG. 11 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Example 4 (Actemra, pH drop width 0.2).
  • FIG. 12 is a diagram showing the results (separation pattern) of applying the F1 to F6 fractions of FIG. 11 to an FcRIIIA column.
  • FIG. 13 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Example 5 (Erbitux, pH drop width 0.5).
  • FIG. 14 is a diagram showing the results (separation pattern) of applying the F1 fraction and F2 fraction of FIG. 13 to an FcRIIIA column.
  • FIG. 11 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Example 4 (Actemra, pH drop width 0.2).
  • FIG. 12 is a diagram showing the results (separation pattern) of applying the F1 to F6 fractions of FIG. 11 to an FcRIIIA column.
  • FIG. 13 is a diagram
  • FIG. 15 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Example 6 (Erbitux, pH drop width 0.2).
  • FIG. 16 is a diagram showing the results (separation pattern) of applying the F1 to F4 fractions of FIG. 15 to an FcRIIIA column.
  • FIG. 17 shows the step gradients performed in Examples 7-11.
  • FIG. 18 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Example 7 (Rituxan, pH decrease width 0.2).
  • FIG. 19 is a diagram showing the results (separation pattern) of applying the F1 to F3 fractions of FIG. 18 to an FcRIIIA column.
  • FIG. 20 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Example 8 (Rituxan, pH decrease width 0.2).
  • FIG. 21 is a diagram showing the results (separation pattern) of applying the F1 to F4 fractions of FIG. 20 to an FcRIIIA column.
  • FIG. 22 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Example 9 (Rituxan, pH decrease width 0.2).
  • FIG. 23 is a diagram showing the results (separation pattern) of applying the F1 to F4 fractions of FIG. 22 to an FcRIIIA column.
  • FIG. 24 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Example 10 (Rituxan, pH decrease width 0.2).
  • FIG. 25 is a diagram showing the results (separation patterns) of applying the F1 to F6 fractions of FIG. 24 to an FcRIIIA column.
  • FIG. 26 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Example 11 (Rituxan, pH drop width 0.2).
  • FIG. 27 is a diagram showing the results (separation pattern) of applying the F1 to F6 fractions of FIG. 26 to an FcRIIIA column.
  • 28 is a diagram showing the proportion of sugar chain structures possessed by antibodies contained in the F2 fraction of FIG. 18 and the F1, F2 and F4 fractions of FIG. 20.
  • FIG. 26 is a diagram showing the separation pattern of the FcR36i_Cys column in Example 11 (Rituxan, pH drop width 0.2).
  • FIG. 27 is a diagram showing the results (separation pattern) of applying the F1 to F6 fractions of FIG. 26 to an FcRIIIA column.
  • 28 is a
  • the present embodiment a mode for carrying out the present invention (hereinafter simply referred to as "the present embodiment”).
  • the following embodiments are examples for explaining the present invention, and are not intended to limit the present invention to the following contents.
  • the present invention can be appropriately modified and implemented within the scope of its gist.
  • the antibody separation method comprises adding a solution containing an antibody to a column filled with an antibody adsorbent containing an insoluble porous carrier and an Fc-binding protein immobilized on the carrier, and removing the antibody.
  • the pH gradient is the pH of the buffer solution.
  • the insoluble porous carrier in the present invention may be a substance capable of immobilizing an Fc-binding protein and insoluble in the solution or solvent used for antibody adsorption/elution. It may be a carrier derived from an inorganic substance, or a carrier derived from a natural organic polymer substance such as cellulose, agarose, dextran, or polyacrylic acid, polystyrene, polyacrylamide, polymethacrylamide, Carriers derived from synthetic organic polymeric substances such as polymethacrylates and vinyl polymers may also be used.
  • the insoluble porous carrier is a porous carrier.
  • porous carrier means a sponge-like carrier having pores on its surface and a cavity inside. More specifically, the porous carrier of the present invention may have a porosity of 30% or more and 95% or less (preferably 50% or more and 95% or less).
  • the porosity can be calculated, for example, by the steps shown in (a) to (e) below, which are common methods in the field of liquid chromatography (International Publication No. 2017/141910).
  • the volume average particle size of the insoluble porous carrier may be 30-150 ⁇ m. When the volume average particle size is within this range, the dynamic adsorption amount can be further improved and the pressure loss can be reduced.
  • the volume average particle size of the insoluble porous carrier can be obtained by measuring the particle size distribution using a laser diffraction method.
  • the Fc-binding protein to be immobilized on the insoluble porous carrier refers to a protein that has binding properties to the Fc region of an antibody (immunoglobulin). , and Protein G derived from group G streptococcus. Further, when the Fc-binding protein is a human Fc receptor, specific examples thereof include human Fc ⁇ RI, human Fc ⁇ RIIa, human Fc ⁇ RIIb, human Fc ⁇ RIIIa, and human FcRn.
  • human Fc ⁇ RIIIa is a human Fc receptor capable of recognizing differences in sugar chain structures possessed by antibodies (for example, structures contributing to ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) activity), immobilized on an insoluble porous carrier and the carrier.
  • the antibody adsorbent containing the human Fc ⁇ RIIIa can be separated based on the difference in the sugar chain structure of the antibody (for example, the difference in ADCC activity) (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2018-197224), so the Fc binding protein in the present invention It can be said that this is a preferred embodiment.
  • differences in the sugar chain structure include the presence or absence of galactose residues at non-reducing terminals and the difference in the number of galactose residues.
  • the Fc-binding protein in the present invention (1) At least the extracellular region of native human Fc ⁇ RIIIa (amino acid residues from the 17th glycine residue (Gly) to the 192nd glutamine residue (Gln) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1) polypeptide, (2) including at least the extracellular region of native human Fc ⁇ RIIIa, but having one or more amino acid residue substitutions, deletions, insertions or additions in the amino acid residues constituting the extracellular region, and antibody binding (3) a polypeptide having activity, and (3) containing at least the extracellular region of native human Fc ⁇ RIIIa, having 70% or more homology with the amino acid sequence from 17th to 192nd amino acids, and binding activity to an antibody and a polypeptide having
  • one or several is, for example, 1 or more and 40 or less, 1 or more and 30 or less, 1 or more and 20 or less, or 1 or more and 10 or less (10, 9, 8 , any of 7, 6, 5, 4, 3, 2 and 1).
  • the homology of the amino acid sequences in (3) above may be 70% or higher, and may be higher (eg, 80% or higher, 85% or higher, 90% or higher, or 95% or higher). Alkali resistance is improved when the Fc-binding protein is the protein shown in (3).
  • N-hydroxysuccinimide (NHS) activated ester is added to the surface of the insoluble porous carrier.
  • group epoxy group, carboxyl group, maleimide group, haloacetyl group, tresyl group, formyl group, haloacetamide (iodoacetamide, bromoacetamide, etc.) under appropriate reaction conditions. It may be produced by covalently bonding an Fc-binding protein and an insoluble porous carrier via a group.
  • a commercially available carrier for chromatography preliminarily provided with an activated functional group may be covalently bonded to the Fc-binding protein.
  • Commercially available carriers with activated functional groups include TOYOPEARL AF-Epoxy-650M, TOYOPEARL AF-Tresyl-650M (both manufactured by Tosoh Corporation), HiTrap NHS-activated HP Columns, NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow, Epo xy -activated Sepharose 6B (both manufactured by Cytiva) and SulfoLink Coupling Resin (manufactured by Thermo Fisher Scientific) can be exemplified.
  • the functional group When the insoluble porous carrier has a functional group such as a hydroxyl group, an epoxy group, a carboxyl group, or an amino group on its surface, the functional group is activated by introducing a compound having an activating functional group. After preparing an insoluble porous carrier to which a functional group has been added, the activated functional group and an Fc-binding protein may be covalently bonded to prepare an antibody adsorbent.
  • a functional group such as a hydroxyl group, an epoxy group, a carboxyl group, or an amino group
  • epichlorohydrin forms an epoxy group as an activating group
  • 1,4-butanediol diglycidyl ether forms an epoxy group as an activating group
  • An activating agent such as silk chloride (forming a tresyl group as an activating group) or vinyl bromide (forming a vinyl group as an activating group) may be used to impart an activated functional group.
  • N-succinimidyl 3-maleimidopropionate forming a maleimide group as an activating group
  • 1,1'-carbonyldiimidazole a carbonylimidazole group as an activating group
  • an activating agent such as halogenated acetic acid (forming a halogenated acetyl group as an activating group) may be used to provide an activated functional group.
  • the column packed with the antibody adsorbent may be one commonly used for affinity chromatography.
  • the diameter (inner diameter) of the column can be 3 mm to 100 cm, preferably 3 mm to 100 mm, more preferably 3 mm to 30 mm.
  • the length of the column can be 10 to 500 mm.
  • a Cytiva Tricorn column Tricorn 5/50 of ⁇ 5.0 mm ⁇ 50 mm can be used.
  • an antibody means a molecule containing an immunoglobulin Fc region.
  • An antibody may consist of an Fc region or may contain other regions in addition to the Fc region.
  • the antibody of the present invention may have a sugar chain added (has a sugar chain).
  • Antibodies may be monoclonal antibodies or polyclonal antibodies.
  • the antibody may be an antibody drug.
  • Antibody drugs include Herceptin (trastuzumab), Rituxan (rituximab), Avastin (bevacizumab), Erbitux (cetuximab), Actemra (tocilizumab), Remicade (infliximab) and the like.
  • Antibodies may be commercially available, or may be produced using CHO cells (Chinese hamster ovary cells), Sp2/0 cells, NS0 cells, hybridoma cells, and the like.
  • the antibody-containing solution may be a solution in which the antibody is dissolved in phosphate-buffered saline.
  • the column may be equilibrated by adding an equilibration liquid to the column packed with the antibody adsorbent using liquid transfer means such as a pump.
  • the antibody is specifically adsorbed on the antibody adsorbent by adding a solution containing the antibody by the above-mentioned liquid feeding means.
  • the adsorbed antibody may be eluted by adding a buffer solution and changing the pH in a stepwise manner by the liquid feeding means.
  • separation of antibodies is not limited to separation based on structure, properties, activity, etc., but also includes separation of antibodies from solutions containing contaminants (removal of contaminants).
  • equilibration solutions examples include phosphate buffer, acetate buffer, MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) buffer, and citrate buffer.
  • An inorganic salt such as sodium chloride at 10 mM or more and 200 mM or less may be added to these buffer solutions.
  • the pH of the equilibration solution may be appropriately determined from the pH range of 4.0 to 8.0, taking into consideration the buffer solution components, column shape, packing pressure of the adsorbent into the column, and the like.
  • the antibody adsorbed on the antibody adsorbent is eluted with a pH gradient.
  • the pH gradient is a step gradient in which the pH of the buffer solution is lowered stepwise, and the range of pH decrease is 0.1 or more and less than 1.
  • a linear gradient is generally used as a pH gradient, but when eluting with a linear gradient, if the slope of the pH decrease is too steep, all antibodies will be eluted at once regardless of differences in structure or activity. There are risks. In order to avoid this risk, if the slope of the pH decrease is moderated, it takes a lot of time and the obtained chromatogram (separation pattern) has gentle peaks, which makes fractionation based on peaks difficult. In other words, it becomes difficult to determine when to aliquot the desired antibody. Therefore, in the present invention, the pH gradient elution of the antibody adsorbed on the antibody adsorbent is carried out with a step gradient.
  • Elution by a step gradient in the present invention specifically, the pH of the buffer solution added to the column filled with the antibody adsorbent, the antibody adsorbed to the adsorbent is stepwise with a decrease range of 0.1 or more and less than 1. and let it elute.
  • a pH drop within this range facilitates peak-based fractionation without eluting all of the antibody at once.
  • antibodies can be sorted based on differences in structure and activity.
  • the decrease in pH is 0.1 or more, and may be 0.15 or more.
  • the decrease in pH is less than 1 and is 0.9 or less, 0.8 or less, 0.7 or less, 0.6 or less, 0.5 or less, 0.4 or less, 0.3 or less, or 0.25 or less.
  • the range of decrease in pH may be 0.1 or more and 0.6 or less, or may be 0.1 or more and 0.3 or less.
  • the pH at the start of the step gradient may be a value obtained by adding a safety factor to the pH at which the antibody adsorbed to the antibody adsorbent begins to elute.
  • the safety factor may be set as appropriate as long as it satisfies the purpose of preventing the risk of elution immediately after the start of liquid flow. A value obtained by adding three times may be used.
  • the buffer used for the step gradient can be added to the column after adjusting the pH by the following method.
  • the above two kinds of solutions may be mixed so as to obtain a desired pH and added to the column.
  • the buffer substance contained in the buffer solution may be a substance that has a buffering capacity within the pH range where the antibody elutes (e.g., pH 3.0 or more and 6.0 or less) and has multiple pKas within that range, Examples include citrate buffers, acetate buffers, phosphate buffers, succinate buffers, phthalate buffers, and glycine hydrochloride buffers.
  • the flow rate of the buffer during the step gradient or the time to maintain the pH can be set as appropriate, taking into account the size of the column filled with the antibody adsorbent.
  • the conditions for changing the pH before starting the step gradient may be set as appropriate.
  • the pH may be decreased in one step to the pH at the start of the step gradient, may be decreased continuously (linear gradient), or may be decreased stepwise.
  • the extent of the decrease is not particularly limited.
  • Antibodies with the desired structure and activity can be obtained by fractionating antibody-containing fractions (peaks) eluted with each pH buffer solution by the method described above. Fractionation may be performed by a conventional method. Specifically, for example, the collection container may be replaced at the timing when the pH of the buffer solution changes.
  • the amount of antibody adsorbent packed in the column can be 0.1 mL or more, 0.3 mL or more, 0.5 mL or more, 0.7 mL or more, or 0.9 mL or more.
  • the amount of antibody adsorbent packed in the column can be 1.4 mL or less, 1.2 mL or less, or 1.0 mL or less.
  • the method of the invention can separate 1 mg or more and 50 mg or less of antibody. That is, the antibody-containing solution of the present invention may contain 1 mg or more and 50 mg or less of the antibody. The antibody-containing solution of the present invention may contain 5 mg or more and 40 mg or less of the antibody.
  • the ratio of the mass of the antibody in the solution containing the antibody to the volume of the antibody adsorbent packed in the column may be from 1 mg/1.0 mL to 50 mg/0.1 mL, and from 5 mg/1.0 mL to 40 mg/0.1 mL. It may be 9 mL.
  • a column filled with 0.1 mL or more and 1.0 mL or less of antibody adsorbent may be added with a solution containing 1 mg or more and 50 mg or less of antibody, and 0.9 mL or more and 1.0 mL or less of antibody adsorbent is filled.
  • a solution containing 5 mg or more and 40 mg or less of antibody may be added to the column.
  • the antibody composition according to one aspect of the present invention contains antibodies detected at a retention time of 750 minutes or more when the monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions, and 15% by mass based on the total mass of the antibody composition. Including above.
  • the antibody composition when the monoclonal antibody solution is fractionated under the following measurement conditions, the antibody eluted with the following citrate buffer solution having a pH of 4.0 or less is obtained based on the total mass of the antibody composition. Contains 15% by mass or more.
  • This antibody composition exhibits high activity (for example, ADCC activity or CDC activity), and is effective in treating cancer and the like.
  • the retention time may be 900 minutes or less, 850 minutes or less, or 800 minutes or less.
  • the holding time may be 750 to 900 minutes, 750 to 850 minutes, or 750 to 800 minutes.
  • the pH of the citrate buffer may be 3.6-4.0, 3.8-4.0, and may be 3.4, 3.6, 3.8 or 4.0.
  • the content of antibodies detected at a retention time of 750 minutes or longer when the monoclonal antibody solution is fractionated under the above measurement conditions is based on the total mass of the antibody composition. , 20% by mass or more, 30% by mass or more, 40% by mass or more, 50% by mass or more, 60% by mass or more, 70% by mass or more, 80% by mass or more, or 90% by mass or more.
  • the activity exhibited by the antibody composition for example, ADCC activity or CDC activity
  • the antibody detected with a retention time of less than 750 minutes when the monoclonal antibody solution is fractionated under the measurement conditions is 15% based on the total mass of the antibody composition. Contains more than mass %.
  • the antibody eluted with the above citrate buffer having a pH of 4.2 or higher is extracted based on the total mass of the antibody composition. Contains 15% by mass or more.
  • the activity (eg, ADCC activity or CDC activity) exhibited by this antibody composition is low, and it is effective, for example, in the treatment of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis.
  • the retention time is 450 to 550 minutes, 550 to 650 minutes, 650 to 750 minutes, 300 to 400 minutes, 400 to 480 minutes. minutes or less, 480 to 580 minutes, 580 to 650 minutes, 650 to 750 minutes, 500 to 600 minutes, 600 to 650 minutes, or 650 to 750 minutes.
  • the pH of the citrate buffer may be 4.2-5.0 or 4.4-4.8, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8 or 5.0 good too. The shorter the retention time and the higher the pH of the citrate buffer, the lower the activity exhibited by the antibody composition (e.g., ADCC activity or CDC activity). It is valid.
  • the content of antibodies detected at a retention time of less than 750 minutes when the monoclonal antibody solution is fractionated under the measurement conditions is the total mass of the antibody composition It may be 20% by mass or more, 30% by mass or more, 40% by mass or more, 50% by mass or more, 60% by mass or more, 70% by mass or more, 80% by mass or more, or 90% by mass or more.
  • the activity eg, ADCC activity or CDC activity
  • the antibody composition is further reduced, and, for example, it is more effective in treating autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis.
  • the antibody composition of the present invention may be an antibody composition in which antibodies having sugar chains containing galactose account for 80% by mass or more of the total amount of the antibody composition.
  • This antibody composition exhibits high activity (for example, ADCC activity or CDC activity), and is effective in treating cancer and the like.
  • the content of the antibody having sugar chains containing galactose may be 85% by mass or more, 90% by mass or more, or 95% by mass or more based on the total amount of the antibody composition. When the content is within these ranges, the activity exhibited by the antibody composition (for example, ADCC activity or CDC activity) is enhanced, making it more effective in treating cancer and the like.
  • Another antibody composition of the present invention may be an antibody composition in which antibodies having sugar chains that do not contain galactose account for 60% by mass or more of the total amount of the antibody composition.
  • the activity (eg, ADCC activity or CDC activity) exhibited by this antibody composition is low, and it is believed to be effective, for example, in the treatment of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis.
  • the content of the antibody having sugar chains without galactose may be 70% by mass or more, 80% by mass or more, or 90% by mass or more based on the total amount of the antibody composition. When the content is within these ranges, the activity (eg, ADCC activity or CDC activity) exhibited by the antibody composition is further reduced, and, for example, it is more effective in treating autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis.
  • the concentrate according to one aspect of the present invention is an antibody solution concentrate, and the antibody solution and the concentrate are detected at a retention time of 750 minutes or more when the monoclonal antibody solution is fractionated under the measurement conditions.
  • the content of said antibody relative to the total volume of said concentrate is at least twice the content of said antibody relative to the total volume of said antibody solution.
  • this concentrate contains an antibody that is eluted with the citrate buffer solution having a pH of 4.0 or less when the monoclonal antibody solution is fractionated under the measurement conditions, and the amount of the antibody with respect to the total amount of the concentrate is The content is at least twice the content of the antibody with respect to the total amount of the antibody solution.
  • the activity for example, ADCC activity or CDC activity
  • exhibited by this concentrate is high and effective for treatment of cancer and the like.
  • the retention time may be 900 minutes or less, 850 minutes or less, or 800 minutes or less.
  • the holding time may be 750 to 900 minutes, 750 to 850 minutes, or 750 to 800 minutes.
  • the pH of the citrate buffer may be 3.6-4.0, 3.8-4.0, and may be 3.4, 3.6, 3.8 or 4.0.
  • the content of the antibody with respect to the total amount of the concentrate is 2.5 times or more, 3 times or more, 3.5 times the content of the antibody with respect to the total amount of the antibody solution. or more.
  • the activity for example, ADCC activity or CDC activity
  • the concentrate is enhanced, making it more effective in treating cancer and the like.
  • a concentrate according to another aspect of the present invention is an antibody solution concentrate, wherein the antibody solution and the concentrate have a retention time of less than 750 minutes when the monoclonal antibody solution is fractionated under the measurement conditions. wherein the content of said antibody relative to the total volume of said concentrate is at least twice the content of said antibody relative to the total volume of said antibody solution.
  • this concentrate contains an antibody that is eluted with the above citrate buffer solution having a pH of 4.2 or higher when the monoclonal antibody solution is fractionated under the above measurement conditions, and the amount of the antibody relative to the total amount of the concentrate is The content is at least twice the content of the antibody with respect to the total amount of the antibody solution.
  • the activity eg, ADCC activity or CDC activity
  • exhibited by this concentrate is low, and it is effective, for example, in the treatment of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis.
  • the retention time is 450 to 550 minutes, 550 to 650 minutes, 650 to 750 minutes, 300 to 400 minutes, 400 to 480 minutes. 480 minutes to 580 minutes, 580 minutes to 650 minutes, 650 minutes to less than 750 minutes, 500 minutes to 600 minutes, 600 minutes to 650 minutes, or 650 minutes to less than 750 minutes.
  • the pH of the citrate buffer may be 4.2-5.0 or 4.4-4.8, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8 or 5.0 good too. The shorter the retention time and the higher the pH of the citrate buffer, the lower the activity (e.g. ADCC activity or CDC activity) exhibited by the concentrate, making it more effective in treating autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis. is.
  • the content of the antibody with respect to the total amount of the concentrate is 2.5 times or more, 3 times or more, the content of the antibody with respect to the total amount of the antibody solution. It may be 5 times or more.
  • the concentrate exerts less activity (eg, ADCC activity or CDC activity) and is more effective in treating, for example, autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis.
  • FcR36i_Cys SEQ ID NO: 2
  • the first methionine (Met) to the 22nd alanine (Ala) is the PelB signal peptide
  • the 24th glycine (Gly) to the 199th glutamine (Gln) is Fc
  • the amino acid sequence of the binding protein FcR36i, from 200th glycine (Gly) to 207th glycine (Gly) is the cysteine tag sequence.
  • FcR36i is the extracellular region of native human Fc ⁇ RIIIa (amino acid sequence from 17th glycine (Gly) to 192nd glutamine (Gln) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1), provided that In amino acid residues, Glu21Gly (this notation indicates that glutamic acid at position 21 in SEQ ID NO: 1 (corresponding to position 28 in SEQ ID NO: 2) is substituted with glycine, the same shall apply hereinafter), Leu23Met, Val27Glu, Phe29Ile, Gln33Pro, Tyr35Asn, Lys40Gln, Gln48Arg, Tyr51His, Glu54Asp, Asn56Asp, Ser65Arg, Ser68Pro, Tyr74Phe, Phe75Ile, Ala78Ser, Thr80Ser, Asn92Ser, Val117 Glu, Lys119Val, Glu121Gly, Asp122Glu, Lys132Arg, Thr140Met, Tyr141P
  • the antibody adsorbent obtained in Reference Example 1 had good alkali resistance. More specifically, even after 200 washings in place (CIP) of the antibody adsorbent with a 0.1 M NaOH solution, 90% of the antibody adsorption amount was maintained compared to before washing. Moreover, the antibody adsorbent obtained in Reference Example 1 had a dynamic adsorption capacity (DBC) of 40 g/L or more.
  • DBC dynamic adsorption capacity
  • 1 is the ratio of 50 mM trisodium citrate (Citrate-3Na) aqueous solution based on the total mass of 50 mM citric acid aqueous solution and 50 mM trisodium citrate aqueous solution, and the vertical axis. indicates pH.
  • Table 1 shows the relationship between the mixing ratio of 50 mM citric acid aqueous solution (50 mM citric acid) and 50 mM trisodium citrate aqueous solution (50 mM Citrate-3Na) and pH obtained from the approximate curve (Fig. 1). show.
  • Example 1 Separation of antibodies using an antibody adsorbent packed column
  • the antibody adsorbent (FcR36i_Cys immobilized gel) prepared in Reference Example 1 was applied to a Cytiva Tricorn column (Tricorn 5 /50) to prepare an FcR36i_Cys column with a gel volume of 0.373 mL.
  • phosphate buffered saline (pH 7.4) (hereinafter also referred to as PBS) was added to the column at a flow rate of 0.07 mL.
  • a step gradient in which the pH is gradually decreased by 0.5 from 5.0 is indicated by a broken line in FIG. (7)
  • the fractions collected in (5) and (6) were dialyzed against PBS for 16 hours to replace the solvent.
  • a TSKgel FcR-IIIA-NPR column manufactured by Tosoh Corporation; hereinafter simply referred to as FcRIIIA column
  • FcRIIIA column was connected to a high-performance liquid chromatography device (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the separation pattern of the FcR36i_Cys column is shown in FIG. 3, and the separation pattern of the FcRIIIA column is shown in FIG.
  • the vertical axis (left) indicates absorbance at 280 nm
  • the vertical axis (right) indicates the set pH (pH of citrate buffer)
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • the vertical axis in FIG. 4 indicates absorbance at 280 nm
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • the antibody adsorbed on the antibody adsorbent was eluted with a step gradient in which the pH was decreased stepwise by a decrease width of 0.5, thereby separating into two peaks (F1 and F2) (Fig. 3).
  • the F1 and F2 fractions in FIG. 3 were fractionated and analyzed with an FcRIIIA column.
  • the F1 fraction was mainly eluted at the first peak (1st), and the ADCC (antibody It was found that many antibodies with sugar chain structures with low activity (dependent cytotoxicity) were contained (Fig. 4). From this, it was found that according to the method of the present invention, 5 mg of antibody can be fractionated based on the difference in ADCC activity.
  • the first peak (1st) in FIG. 4 shows an antibody having a sugar chain structure with low ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) activity.
  • the third peak (3rd) separates an antibody having a sugar chain structure with high ADCC activity
  • the second peak (2nd) separates an antibody having a sugar chain structure exhibiting intermediate ADCC activity.
  • Example 2 Separation of antibodies using an antibody-adsorbent-filled column 6
  • 50 mM citrate buffer (pH 4.4) 50 mM citrate buffer (pH 4.2), 50 mM citrate buffer (pH 4.0), 50 mM citrate buffer (pH 3.8) , 50 mM citrate buffer (pH 3.6) and 50 mM citrate buffer (pH 3.4) are added in 10 CV steps in this order to create a step gradient that decreases the pH stepwise with a decrease width of 0.2.
  • Separation patterns of the FcR36i_Cys column and the FcRIIIA column were obtained in the same manner as in Example 1 except for the implementation.
  • the step gradient performed in this example is indicated by a dotted line in FIG.
  • the separation pattern of the FcR36i_Cys column is shown in FIG. 5, and the separation pattern of the FcRIIIA column is shown in FIG.
  • the vertical axis (left) indicates absorbance at 280 nm
  • the vertical axis (right) indicates the set pH (pH of citrate buffer)
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • the vertical axis in FIG. 6 indicates absorbance at 280 nm
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • the F1 fraction mainly had the first peak (1st), that is, an antibody having a sugar chain structure with low ADCC activity.
  • the F3 fraction mainly contained the second peak (2nd), ie, an antibody having a sugar chain structure exhibiting intermediate ADCC activity
  • the F4 fraction mainly contained the third peak (3rd), ie, an ADCC activity. It was found that antibodies with high sugar chain structures were contained in each (Fig. 6). From the above results, it was found that 5 mg of antibody can be more easily fractionated based on the difference in sugar chain structure (here, the difference in ADCC activity) by reducing the range of pH decrease from 0.5 to 0.2. have understood.
  • the separation pattern of the FcR36i_Cys column is shown in FIG. 7, and the separation pattern of the FcRIIIA column is shown in FIG.
  • the vertical axis (left) in FIG. 7 indicates the absorbance at 280 nm
  • the vertical axis (right) indicates the set pH (pH of citrate buffer)
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • the vertical axis in FIG. 8 indicates absorbance at 280 nm
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • Example 1 decrease width 0.5
  • Example 2 decrease width 0.2
  • the desired sugar chain structure was obtained using an antibody adsorbent (FcR36i_Cys column) containing a porous carrier and an Fc-binding protein immobilized on the carrier.
  • an antibody having here, desired ADCC activity
  • the antibody adsorbed on the antibody adsorbent is eluted with a step gradient that decreases the pH stepwise in a range of decrease of 0.1 or more and less than 1. I found it necessary.
  • an antibody having a desired sugar chain structure here, a desired ADCC activity
  • Example 3 Separation of antibodies using an antibody adsorbent packed column
  • the monoclonal antibody solution to be added to the FcR36i_Cys column was Actemra (manufactured by Roche; anti-interleukin 6 monoclonal antibody; addition amount 5 mg) solution
  • the separation patterns of the FcR36i_Cys column and the FcRIIIA column were obtained in the same manner as in Example 1.
  • the step gradient performed in this example is indicated by a dashed line in FIG.
  • Example 4 Separation of antibodies using an antibody adsorbent packed column
  • the monoclonal antibody solution to be added to the FcR36i_Cys column was Actemra (manufactured by Roche; anti-interleukin 6 monoclonal antibody; addition amount 5 mg) solution, and the separation pattern of the FcR36i_Cys column and the FcRIIIA column was obtained in the same manner as in Example 1 except that the step gradient performed in (6) of Example 1 was performed by the method described in Example 2. rice field. The step gradient performed in this example is indicated by a dotted line in FIG.
  • FIGS. 11 and 12 The separation patterns of the FcR36i_Cys column and the FcRIIIA column in Example 3 (decrease in pH: 0.5) are shown in Figures 9 and 10, respectively.
  • the vertical axis (left) in FIG. 9 indicates the absorbance at 280 nm
  • the vertical axis (right) indicates the set pH (pH of citrate buffer)
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • the vertical axis in FIG. 10 indicates absorbance at 280 nm
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • FIGS. 11 and 12 are shown in FIGS. 11 and 12, respectively. In FIG.
  • the vertical axis (left) indicates absorbance at 280 nm
  • the vertical axis (right) indicates the set pH (pH of citrate buffer)
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • the vertical axis in FIG. 12 indicates absorbance at 280 nm
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • Fractions F1 to F6 in FIG. 11 were fractionated and analyzed with an FcRIIIA column.
  • Fractions F1 to F4 mainly had the first peak (1st), that is, a sugar chain structure with low ADCC activity.
  • Antibodies mainly show the second peak (2nd) in the F5 fraction, that is, antibodies having a sugar chain structure exhibiting intermediate ADCC activity, and mainly the third peak (3rd), that is, the ADCC activity in the F6 fraction. (Fig. 12).
  • the antibody adsorbed to the antibody adsorbent is eluted with a step gradient in which the pH is lowered in steps of 0.1 or more and less than 1.
  • a large amount of antibody can be fractionated based on the difference in sugar chain structure (here, the difference in ADCC activity), and fractionation can be more easily achieved with a reduction range of 0.1 or more and 0.3 or less.
  • Example 5 Separation of antibodies using an antibody adsorbent packed column
  • the monoclonal antibody solution to be added to the FcR36i_Cys column was Erbitux (Merck Serono; A separation pattern of the FcR36i_Cys column and the FcRIIIA column was obtained in the same manner as in Example 1, except that the amount of the solution was 5 mg).
  • the step gradient performed in this example is indicated by a dashed line in FIG.
  • Example 6 Separation of antibodies using an antibody adsorbent packed column
  • the monoclonal antibody solution to be added to the FcR36i_Cys column was Erbitux (manufactured by Merck Serono;
  • a separation pattern of the FcR36i_Cys column and the FcRIIIA column was obtained in the same manner as in Example 1 except that the step gradient performed in Example 1 (6) was performed by the method described in Example 2. rice field.
  • the step gradient performed in this example is indicated by a dotted line in FIG.
  • FIGS. 13 and 14 The separation patterns of the FcR36i_Cys column and the FcRIIIA column in Example 5 (pH reduction width of 0.5) are shown in FIGS. 13 and 14, respectively.
  • the vertical axis (left) indicates absorbance at 280 nm
  • the vertical axis (right) indicates the set pH (pH of citrate buffer)
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • the vertical axis in FIG. 14 indicates absorbance at 280 nm
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • FIGS. 15 and 16 The separation patterns of the FcR36i_Cys column and the FcRIIIA column in Example 6 (pH reduction width of 0.2) are shown in FIGS. 15 and 16, respectively.
  • the antibody adsorbed to the antibody adsorbent is eluted with a step gradient in which the pH is lowered stepwise in a range of decrease of 0.1 or more and less than 1.
  • a large amount of antibody can be fractionated based on the difference in sugar chain structure (here, the difference in ADCC activity), and fractionation can be more easily achieved with a reduction range of 0.1 or more and 0.3 or less.
  • Example 7 Separation of antibodies using an antibody adsorbent packed column ⁇ 1>
  • the antibody adsorbent (FcR36i_Cys immobilized gel) prepared in Reference Example 1 was applied to a Cytiva Tricorn column (Tricorn 5 /50) to prepare an FcR36i_Cys column with a gel volume of 0.982 mL.
  • ⁇ 2> After connecting the FcR36i_Cys column prepared in ⁇ 1> to AKTA york 150 manufactured by Cytiva, PBS (pH 7.4) was added to the column at a flow rate of 0.20 mL/min for 5 CV to equilibrate the column.
  • a monoclonal antibody (Rituxan, human/mouse chimeric monoclonal antibody manufactured by Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) diluted with PBS to 5.0 mg/mL was added to the FcR36i_Cys column at a flow rate of 0.20 mL/min as an antibody at a flow rate of 0.20 mL/min.
  • the column was washed by adding 20 CV of PBS to the FcR36i_Cys column at a flow rate of 0.20 mL/min.
  • fractions containing the monoclonal antibody eluted from the antibody adsorbent were collected for each pH buffer added.
  • the step gradient performed in this example is indicated by a solid line in FIG. ⁇ 7>
  • the fractions collected in ⁇ 5> and ⁇ 6> were dialyzed against PBS for 16 hours to replace the solvent.
  • the FcRIIIA column was connected to a high performance liquid chromatography device (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the FcRIIIA column was equilibrated by adding 30 CV of 20 mM acetic acid-sodium acetate buffer (pH 5.0) containing 50 mM sodium chloride to the FcRIIIA column at a flow rate of 0.6 mL/min. 5 ⁇ g of the monoclonal antibody solution (fractions collected in ⁇ 5> and ⁇ 6>) after solvent replacement in ⁇ 9> ⁇ 7> was added to the FcRIIIA column at a flow rate of 0.6 mL/min.
  • the separation pattern of the FcR36i_Cys column is shown in FIG. 18, and the separation pattern of the FcRIIIA column is shown in FIG. 19, respectively.
  • the vertical axis (left) in FIG. 18 indicates the absorbance at 280 nm
  • the vertical axis (right) indicates the set pH (pH of citrate buffer)
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • the antibody adsorbed on the antibody adsorbent was eluted with a step gradient in which the pH was decreased stepwise by a decrease width of 0.2, thereby separating into three peaks (F1, F2 and F3) (Fig. 18).
  • F1 fraction, F2 fraction and F3 fraction in FIG. 18 were fractionated and analyzed with an FcRIIIA column.
  • the F1 fraction mainly contained the first peak (1st), that is, a sugar chain structure with low ADCC activity.
  • Example 8 Separation of antibodies using an antibody adsorbent packed column
  • the amount of monoclonal antibody (Rituxan manufactured by Zenyaku Kogyo Co., Ltd., human-mouse chimeric monoclonal antibody) added to the FcR36i_Cys column was Separation patterns of the FcR36i_Cys column and the FcRIIIA column were obtained in the same manner as in Example 7, except that the amount was 10 mg.
  • FIG. 17 shows the step gradient performed in this example.
  • the separation pattern of the FcR36i_Cys column is shown in FIG. 20, and the separation pattern of the FcRIIIA column is shown in FIG.
  • the vertical axis (left) in FIG. 20 indicates the absorbance at 280 nm
  • the vertical axis (right) indicates the set pH (pH of citrate buffer)
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • the antibody adsorbed on the antibody adsorbent was eluted with a step gradient in which the pH was decreased stepwise by a decrease width of 0.2, thereby separating into four peaks (F1 to F4) (Fig. 20). Fractions F1 to F4 in FIG.
  • the F1 and F2 fractions mainly had the first peak (1st), that is, sugar chain structures with low ADCC activity.
  • Antibodies have mainly the second peak (2nd) and the third peak (3rd) in the F3 fraction, that is, antibodies having a sugar chain structure exhibiting an intermediate or higher ADCC activity, It was found that the peak (3rd), that is, antibodies having a sugar chain structure with high ADCC activity were included (Fig. 21).
  • Example 9 Antibody separation using an antibody adsorbent packed column
  • the amount of monoclonal antibody (Rituxan manufactured by Zenyaku Kogyo Co., Ltd., human-mouse chimeric monoclonal antibody) added to the FcR36i_Cys column was Separation patterns of the FcR36i_Cys column and the FcRIIIA column were obtained in the same manner as in Example 7, except that the amount was 20 mg.
  • FIG. 17 shows the step gradient performed in this example.
  • the separation pattern of the FcR36i_Cys column is shown in FIG. 22, and the separation pattern of the FcRIIIA column is shown in FIG.
  • the vertical axis (left) in FIG. 22 indicates the absorbance at 280 nm
  • the vertical axis (right) indicates the set pH (pH of citrate buffer)
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • the antibody adsorbed on the antibody adsorbent was eluted with a step gradient in which the pH was decreased stepwise by a decrease width of 0.2, thereby separating into four peaks (F1 to F4) (Fig. 22). Fractions F1 to F4 in FIG.
  • the F1 and F2 fractions mainly had the first peak (1st), that is, a sugar chain structure with low ADCC activity.
  • Antibodies have mainly the second peak (2nd) and the third peak (3rd) in the F3 fraction, that is, antibodies having a sugar chain structure exhibiting an intermediate or higher ADCC activity, It was found that the peak (3rd), that is, antibodies having a sugar chain structure with high ADCC activity were included (Fig. 23).
  • Example 10 Antibody separation using an antibody adsorbent packed column
  • the amount of monoclonal antibody (Rituxan manufactured by Zenyaku Kogyo Co., Ltd., human-mouse chimeric monoclonal antibody) added to the FcR36i_Cys column was Separation patterns of the FcR36i_Cys column and the FcRIIIA column were obtained in the same manner as in Example 7, except that the amount was 30 mg.
  • FIG. 17 shows the step gradient performed in this example.
  • the separation pattern of the FcR36i_Cys column is shown in FIG. 24, and the separation pattern of the FcRIIIA column is shown in FIG.
  • the vertical axis (left) in FIG. 24 indicates the absorbance at 280 nm
  • the vertical axis (right) indicates the set pH (pH of citrate buffer)
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • the antibody adsorbed on the antibody adsorbent was eluted with a step gradient in which the pH was decreased stepwise by a decrease width of 0.2, thereby separating into 6 peaks (F1 to F6) (Fig. 24). Fractions F1 to F6 in FIG.
  • the F1 to F3 fractions mainly had the first peak (1st), that is, sugar chain structures with low ADCC activity.
  • Antibodies mainly show the first peak (1st) and the second peak (2nd) in the F4 fraction, that is, antibodies with sugar chain structures exhibiting intermediate or lower ADCC activity, and antibodies with sugar chain structures showing intermediate or lower ADCC activity mainly in the second peak in the F5 fraction.
  • the peak (2nd), that is, an antibody having a sugar chain structure exhibiting intermediate ADCC activity, and the third peak (3rd), that is, an antibody having a sugar chain structure exhibiting high ADCC activity, were mainly present in the F6 fraction. It was found to contain (Fig. 25).
  • Example 11 Antibody separation using an antibody adsorbent-filled column
  • the amount of monoclonal antibody (Rituxan manufactured by Zenyaku Kogyo Co., Ltd., human-mouse chimeric monoclonal antibody) added to the FcR36i_Cys column was Separation patterns of the FcR36i_Cys column and the FcRIIIA column were obtained in the same manner as in Example 7, except that the amount was 40 mg.
  • FIG. 17 shows the step gradient performed in this example.
  • the separation pattern of the FcR36i_Cys column is shown in FIG. 26, and the separation pattern of the FcRIIIA column is shown in FIG.
  • the vertical axis (left) in FIG. 26 indicates the absorbance at 280 nm
  • the vertical axis (right) indicates the set pH (pH of citrate buffer)
  • the horizontal axis indicates time (minutes).
  • the antibody adsorbed on the antibody adsorbent was eluted with a step gradient in which the pH was decreased stepwise by a decrease width of 0.2, whereby it was separated into a plurality of peaks (Fig. 26).
  • the F1 and F2 fractions mainly had the first peak (1st), that is, sugar chain structures with low ADCC activity.
  • Antibodies mainly show the second peak (2nd) in the F3 and F4 fractions, that is, antibodies with sugar chain structures exhibiting intermediate ADCC activity, and the F5 fractions mainly show the second peak (2nd) and the second peak (2nd).
  • the antibody adsorbed to the antibody adsorbent can be eluted with a step gradient in which the pH is decreased stepwise by a decrease of 0.2.
  • antibodies can be sorted based on differences in sugar chain structure (eg, ADCC activity).
  • Labeled sugar chains were purified on a hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) column.
  • HILIC hydrophilic interaction liquid chromatography
  • the analysis results of the obtained sugar chain structure are shown in FIG. 28 and Table 2, and the schematic diagram of the sugar chain structure is shown in Table 3, respectively.
  • the vertical axis of the graph shown in FIG. 28 is the ratio of sugar chain structures (peak area ratio of each sugar chain structure).
  • the sugar names (abbreviations) listed along the horizontal axis are the same as the abbreviations used in Table 3.
  • the antibodies contained in the F4 fraction (eluted with pH 4.0 citrate buffer) in FIG. The content ratio of antibodies having a non-reducing end was high, and the content ratio of antibodies having a sugar chain structure (eg, G0F) not containing galactose at the non-reducing end was low.
  • the antibody contained in the F1 fraction of FIG. 20 eluted with a citrate buffer of pH 4.6
  • the antibody contained in the F2 fraction of FIG. 20 eluted with a citrate buffer of pH 4.4
  • the antibody contained in the F2 fraction is the content ratio of antibodies having a sugar chain structure containing galactose at the non-reducing end, and the sugar chain containing no galactose at the non-reducing end.
  • the content ratio of antibodies with structures did not differ greatly. From this, it is possible to obtain an antibody containing many antibodies having a sugar chain structure containing galactose at the non-reducing end by recovering the antibody eluted with a citrate buffer solution having a pH of 4.0 or less. shown. That is, it was found that the separation method of the present invention can separate antibodies contained in a solution based on differences in sugar chain structures, specifically based on the presence or absence of non-reducing terminal galactose residues.
  • the antibody contained in the F2 fraction of FIG. 18 has a higher content of G2F containing two galactoses at the non-reducing end than the antibodies contained in the F1 and F2 fractions of FIG. shown. That is, it was found that the separation method of the present invention can separate antibodies contained in a solution based on differences in sugar chain structures, specifically, differences in the number of non-reducing terminal galactose residues.
  • the separation method of the present invention can separate antibodies contained in a solution based on the content ratio of antibodies having a sugar chain structure that does not contain galactose at the non-reducing end.
  • the F1 and F2 fractions in FIG. 20 and the F2 fraction in FIG. considered suitable for treatment.
  • Antibodies having a sugar chain structure containing galactose at the non-reducing end have high ADCC activity and CDC activity, so the F4 fraction in FIG. 20 is considered suitable for treatment of cancer and the like.
  • the present invention facilitates large-scale fractionation of antibodies based on differences in structure and activity of antibody drugs or antibody-related drugs, which has been difficult in the past.
  • the present invention can improve quality, which has been a problem in the production of antibody drugs, that is, reduce variation in activity between lots due to differences in structure.

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Abstract

不溶性多孔質担体と上記担体に固定化されたＦｃ結合性タンパク質とを含む抗体吸着材を充填したカラムに、抗体を含む溶液を添加し、上記抗体を上記抗体吸着材に吸着させる工程と、上記カラムに緩衝液を添加し、上記抗体吸着材に吸着した上記抗体をｐＨグラジエントで溶出させる工程と、を備える抗体の分離方法であって、上記ｐＨグラジエントが、上記緩衝液のｐＨを段階的に低下させるステップグラジエントであり、上記ｐＨの低下幅が０．１以上１未満である、方法。

Description

抗体の分離方法
　本発明は、抗体吸着材を用いた抗体の分離方法に関する。より詳しくは、本発明は、上記抗体吸着材に吸着した抗体を溶出させる工程を最適化した、抗体の分離方法に関する。
　抗体医薬品は生体内の免疫機能を担う分子である抗体（免疫グロブリン）を利用した医薬品である。抗体医薬品は、抗体が有する可変領域の多様性により標的分子に対し高い特異性と親和性をもって結合する。そのため、抗体医薬品は副作用が少なく、また、近年では抗体医薬品を適応できる疾患が広がってきていることもあり、市場が急速に拡大している。
　抗体医薬に用いる抗体は、遺伝子工学的手法により得られた、当該抗体を発現可能な細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞等）を培養後、カラムクロマトグラフィー等を用いて高純度に精製し、製造する。
　近年、抗体医薬が酸化、還元、異性化または糖鎖付加などの修飾を受けることで、多様な分子の集合体となっていることが判明しており、薬効および安全性への影響が懸念されている。特に、抗体に結合している糖鎖構造の違いは、抗体医薬品の活性、動態および安全性に大きな影響を与えることが報告されており（非特許文献１）、製造時にも糖鎖構造すなわちクロマトグラフィー担体への吸着活性毎に分取することが求められる。
　クロマトグラフィーを用いた分取の中でも、アフィニティークロマトグラフィーを用いた分取はアフィニティーリガンドと抗体との親和性に基づき分取するため、クロマトグラフィー担体への吸着活性に依存する微小な構造変化に基づいた分取が可能な場合がある。例えば、不溶性多孔質担体と当該担体に固定化したＦｃ結合性タンパク質とを含む抗体吸着材を用いたアフィニティークロマトグラフィー法は、糖鎖構造の違い（例えばＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性の違い）に基づいた抗体の分離および分取が可能である（特許文献１）。
　特許文献１で開示のアフィニティークロマトグラフィー法は、抗体吸着材に吸着した抗体を、ｐＨを連続的に低下させるリニアグラジエントで溶出させている。しかしながら、リニアグラジエントによる溶出を適用させると溶出ピークの分離性が低下し、抗体分取に多大な時間を要するため、大量の抗体を処理することは困難であった。
特開第２０１８－１９７２２４号公報
Ｙ．Ｙａｇｉ　ａｎｄ　Ｓ．Ｓｕｚｕｋｉ，　"Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｉｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ"，　ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ，３４（２），８３－８８（２０１３）
　本発明の課題は、不溶性多孔質担体と当該担体に固定化されたＦｃ結合性タンパク質とを含む抗体吸着材を用いたアフィニティークロマトグラフィー法において、糖鎖構造の違いによる抗体依存性細胞傷害活性の違いに基づいた抗体の大量分取が可能な方法を提供することにある。
　上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、抗体吸着材に吸着した抗体を、ｐＨを段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させ、かつその低下幅を最適化することで、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の［１］から［２４］に記載の態様を包含する。
［１］不溶性多孔質担体と上記担体に固定化されたＦｃ結合性タンパク質とを含む抗体吸着材を充填したカラムに、抗体を含む溶液を添加し、上記抗体を上記抗体吸着材に吸着させる工程と、上記カラムに緩衝液を添加し、上記抗体吸着材に吸着した上記抗体をｐＨグラジエントで溶出させる工程と、を備える抗体の分離方法であって、上記ｐＨグラジエントが、上記緩衝液のｐＨを段階的に低下させるステップグラジエントであり、上記ｐＨの低下幅が０．１以上１未満である、方法。
［２］上記不溶性多孔質担体の体積平均粒子径が３０～１５０μｍである、［１］に記載の方法。
［３］上記緩衝液が、ｐＨ３．０以上６．０以下の範囲で緩衝能を有し、かつ上記範囲内にｐＫａを複数有する緩衝物質を含む溶液である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］上記抗体吸着材の体積に対する上記抗体の質量の比が、１ｍｇ／１．０ｍＬ～５０ｍｇ／０．１ｍＬである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］上記Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］上記ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、下記（１）、下記（２）または下記（３）に記載のポリペプチドである、［５］に記載の方法。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシン残基（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン残基（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列を含むポリペプチド
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシン残基（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン残基（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有し、かつ上記抗体への結合活性を有するポリペプチド
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシン残基（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン残基（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ上記抗体への結合活性を有するポリペプチド
［７］抗体組成物であって、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．０以下の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を、上記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む、抗体組成物。
［８］抗体組成物であって、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合に７５０分以上の保持時間で検出される抗体を、上記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む、抗体組成物。
［９］抗体組成物であって、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．２以上の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を、上記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む、抗体組成物。
［１０］抗体組成物であって、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合に７５０分未満の保持時間で検出される抗体を、上記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む、抗体組成物。
［１１］抗体溶液の濃縮物であって、上記抗体溶液および上記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．０以下の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を含み、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量が、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２倍以上である、濃縮物。
［１２］抗体溶液の濃縮物であって、上記抗体溶液および上記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合に７５０分以上の保持時間で検出される抗体を含み、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量が、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２倍以上である、濃縮物。
［１３］抗体溶液の濃縮物であって、上記抗体溶液および上記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．２以上の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を含み、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量が、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２倍以上である、濃縮物。
［１４］抗体溶液の濃縮物であって、上記抗体溶液および上記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合に７５０分未満の保持時間で検出される抗体を含み、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量が、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２倍以上である、濃縮物。
［７］～［１４］における（測定条件）：
　カラム：Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０（φ５．０ｍｍ×５０ｍｍ、Ｃｙｔｉｖａ社製）
　吸着材：吸着材用多孔質親水性ビニルポリマー（東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（液体クロマトグラフィー用充填剤）、体積平均粒子径：４５μｍ）１ｇに対し、Ｆｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を３０ｍｇ反応させて得たＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル
　流速：０．０７ｍＬ／分
　溶媒：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
　ステップグラジエント：５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）をこの順に３．７３ｍＬずつ添加
　５０ｍＭのクエン酸緩衝液：５０ｍＭのクエン酸水溶液および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液の混合液
　カラム温度：２５℃
　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
　注入量：２０００μＬ（抗体量：５ｍｇ）
［１５］抗体組成物であって、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．０以下の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を、上記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む、抗体組成物。
［１６］抗体組成物であって、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合に８００分以上の保持時間で検出される抗体を、上記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む、抗体組成物。
［１７］抗体組成物であって、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．２以上の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を、上記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む、抗体組成物。
［１８］抗体組成物であって、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合に８００分未満の保持時間で検出される抗体を、上記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む、抗体組成物。
［１９］抗体溶液の濃縮物であって、上記抗体溶液および上記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．０以下の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を含み、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量が、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２倍以上である、濃縮物。
［２０］抗体溶液の濃縮物であって、上記抗体溶液および上記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合に８００分以上の保持時間で検出される抗体を含み、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量が、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２倍以上である、濃縮物。
［２１］抗体溶液の濃縮物であって、上記抗体溶液および上記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．２以上の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を含み、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量が、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２倍以上である、濃縮物。
［２２］抗体溶液の濃縮物であって、上記抗体溶液および上記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合に８００分未満の保持時間で検出される抗体を含み、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量が、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２倍以上である、濃縮物。
［１５］～［２２］における（測定条件）：
　カラム：Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０（φ５．０ｍｍ×５０ｍｍ、Ｃｙｔｉｖａ社製）
　吸着材：吸着材用多孔質親水性ビニルポリマー（東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（液体クロマトグラフィー用充填剤）、体積平均粒子径：４５μｍ）１ｇに対し、Ｆｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を３０ｍｇ反応させて得たＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル
　流速：０．２０ｍＬ／分
　溶媒：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
　ステップグラジエント：５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）をこの順に９．８２ｍＬずつ添加、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）をこの順に２９．４６ｍＬずつ添加、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）をこの順に９．８２ｍＬずつ添加
　５０ｍＭのクエン酸緩衝液：５０ｍＭのクエン酸水溶液および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液の混合液
　カラム温度：２５℃
　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
　注入量：１０００－８０００μＬ（抗体量：５－４０ｍｇ）
［２３］抗体の分離方法が、当該抗体が有する糖鎖構造の違いに基づく抗体の分離方法である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［２４］上記糖鎖構造の違いが、当該糖鎖構造中の非還元末端のガラクトース残基数の違いである、［２３］に記載の方法。
　本発明は、溶液中に含まれる抗体を、不溶性多孔質担体と当該担体に固定化したＦｃ結合性タンパク質とを含む抗体吸着材を用いて分離する際、上記吸着材に吸着した抗体を、ｐＨを０．１以上１未満の低下幅で段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させることを特徴としている。本発明により、従来から行なわれてきた、ｐＨを連続的に低下させるリニアグラジエントで溶出させたときよりも、所望の構造（例えば糖鎖構造）および活性（例えば、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）活性）を有した抗体の分取が容易となり、分取した抗体のロット間差を低減できる。また、本発明の不溶性多孔質担体は、大きな粒子径を有し、かつ多孔質であるので、動的吸着量（ＤＢＣ；Ｄｉｎａｍｉｃ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｃａｐａｃｉｔｙ）がより向上し、かつ、圧力損失を低下させることができる。以上より、本発明は、抗体医薬品の工業的な製造で用いる、大量の抗体製造の分取方法として有用である。
図１は、クエン酸緩衝液のｐＨ近似曲線を表した図である。 図２は、実施例１～６および比較例１で実施したステップグラジエントを表した図である。 図３は、実施例１（リツキサン、ｐＨ低下幅０．５）におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを表す図である。 図４は、図３のＦ１画分およびＦ２画分をＦｃＲＩＩＩＡカラムに供した結果（分離パターン）を表す図である。 図５は、実施例２（リツキサン、ｐＨ低下幅０．２）におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを表す図である。 図６は、図５のＦ１画分からＦ４画分をＦｃＲＩＩＩＡカラムに供した結果（分離パターン）を表す図である。 図７は、比較例１（リツキサン、ｐＨ低下幅１．０）におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを表す図である。 図８は、図７のＦ１画分をＦｃＲＩＩＩＡカラムに供した結果（分離パターン）を表す図である。 図９は、実施例３（アクテムラ、ｐＨ低下幅０．５）におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを表す図である。 図１０は、図９のＦ１画分からＦ３画分をＦｃＲＩＩＩＡカラムに供した結果（分離パターン）を表す図である。 図１１は、実施例４（アクテムラ、ｐＨ低下幅０．２）におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを表す図である。 図１２は、図１１のＦ１画分からＦ６画分をＦｃＲＩＩＩＡカラムに供した結果（分離パターン）を表す図である。 図１３は、実施例５（アービタックス、ｐＨ低下幅０．５）におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを表す図である。 図１４は、図１３のＦ１画分およびＦ２画分をＦｃＲＩＩＩＡカラムに供した結果（分離パターン）を表す図である。 図１５は、実施例６（アービタックス、ｐＨ低下幅０．２）におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを表す図である。 図１６は、図１５のＦ１画分からＦ４画分をＦｃＲＩＩＩＡカラムに供した結果（分離パターン）を表す図である。 図１７は、実施例７～１１で実施したステップグラジエントを表した図である。 図１８は、実施例７（リツキサン、ｐＨ低下幅０．２）におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを表す図である。 図１９は、図１８のＦ１画分からＦ３画分をＦｃＲＩＩＩＡカラムに供した結果（分離パターン）を表す図である。 図２０は、実施例８（リツキサン、ｐＨ低下幅０．２）におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを表す図である。 図２１は、図２０のＦ１画分からＦ４画分をＦｃＲＩＩＩＡカラムに供した結果（分離パターン）を表す図である。 図２２は、実施例９（リツキサン、ｐＨ低下幅０．２）におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを表す図である。 図２３は、図２２のＦ１画分からＦ４画分をＦｃＲＩＩＩＡカラムに供した結果（分離パターン）を表す図である。 図２４は、実施例１０（リツキサン、ｐＨ低下幅０．２）におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを表す図である。 図２５は、図２４のＦ１画分からＦ６画分をＦｃＲＩＩＩＡカラムに供した結果（分離パターン）を表す図である。 図２６は、実施例１１（リツキサン、ｐＨ低下幅０．２）におけるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを表す図である。 図２７は、図２６のＦ１画分からＦ６画分をＦｃＲＩＩＩＡカラムに供した結果（分離パターン）を表す図である。 図２８は、図１８のＦ２画分並びに図２０のＦ１、Ｆ２及びＦ４画分に含まれる抗体が有する糖鎖構造の割合を示す図である。
　以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
　本発明に係る、抗体の分離方法は、不溶性多孔質担体と上記担体に固定化されたＦｃ結合性タンパク質とを含む抗体吸着材を充填したカラムに、抗体を含む溶液を添加し、上記抗体を上記抗体吸着材に吸着させる工程と、上記カラムに緩衝液を添加し、上記抗体吸着材に吸着した上記抗体をｐＨグラジエントで溶出させる工程と、を備え、上記ｐＨグラジエントが、上記緩衝液のｐＨを段階的に低下させるステップグラジエントであり、上記ｐＨの低下幅が０．１以上１未満である。
　本発明における不溶性多孔質担体は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化可能、かつ抗体の吸着／溶出に用いる溶液または溶剤に対して不溶性の物質であればよく、ジルコニア、ゼオライト、シリカ、皮膜シリカ等の無機系物質に由来した担体であってもよいし、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然有機高分子物質に由来した担体であってもよいし、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート、ビニルポリマー等の合成有機高分子物質に由来した担体であってもよい。またＳｈｏｄｅｘ（昭和電工社製）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｃｙｔｉｖａ社製）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（デュポン社製）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（ＪＮＣ社製）、ＰＯＲＯＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、トヨパール（東ソー社製）といった市販のクロマトグラフィー用担体を不溶性多孔質担体として用いてもよい。
　本発明において、不溶性多孔質担体は多孔質担体である。本明細書において多孔質担体とは、表面に孔があり、かつ中も空洞になっているスポンジ状の担体を意味する。より具体的には、本発明の多孔質担体は、空孔率３０％以上９５％以下（好ましくは５０％以上９５％以下）の担体であってよい。
　空孔率は、例えば、液体クロマトグラフィーの分野で一般的な方法である、以下の（ａ）から（ｅ）に示す工程により算出できる（国際公開第２０１７／１４１９１０号公報）。
（ａ）測定対象の不溶性多孔質担体をクロマトグラフィー用カラムに充填する工程。
（ｂ）上記カラムに水を添加し、水を溶出液として、上記カラムからのブルーデキストラン（分子量２００万）および塩化ナトリウムの溶出容積を測定する工程。
（ｃ）上記カラムのカラム容積と、上記（ｂ）で測定したブルーデキストランの溶出容積との差から、ゲル容積を算出する工程。
（ｄ）操作（ｂ）で測定した塩化ナトリウムの溶出容積と、操作（ｂ）で測定した分子ブルーデキストランの溶出容積との差から、細孔容積を算出する工程。
（ｅ）操作（ｄ）で算出した細孔容積を、操作（ｃ）で算出したゲル容積で除することで、空孔率を算出する工程。
　以上をまとめると、塩化ナトリウムの溶出容積（Ｖｎ）、ブルーデキストラン（分子量２００万）の溶出容積（Ｖｏ）およびカラム容積（Ｖｃ）から、以下に示した計算式により空孔率を算出できる。
　　空孔率［％］＝（（Ｖｎ－Ｖｏ）／（Ｖｃ－Ｖｏ））×１００
　不溶性多孔質担体の体積平均粒子径は、３０～１５０μｍであってよい。体積平均粒子径がこの範囲にあることで、動的吸着量がより向上し、かつ、圧力損失を低下させることができる。不溶性多孔質担体の体積平均粒子径は、レーザー回折法を用いて粒度分布を測定することにより求めることができる。
　本発明において不溶性多孔質担体に固定化させるＦｃ結合性タンパク質は、抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合性を有するタンパク質のことをいい、Ｆｃ受容体、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）由来Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ、Ｇ群溶血性レンサ球菌（ｇｒｏｕｐ　Ｇ　ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇを例示できる。またＦｃ結合性タンパク質がヒトＦｃ受容体である場合の具体例としては、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ヒトＦｃＲｎがあげられる。特にヒトＦｃγＲＩＩＩａは、抗体が有する糖鎖構造（例えばＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に寄与する構造）の違いを認識可能なヒトＦｃ受容体であり、不溶性多孔質担体と当該担体に固定化したヒトＦｃγＲＩＩＩａとを含む抗体吸着材は、抗体が有する糖鎖構造の違い（例えばＡＤＣＣ活性の違い）に基づき分離できる（特開第２０１８－１９７２２４号公報）ことから、本発明におけるＦｃ結合性タンパク質の好ましい態様といえる。前記糖鎖構造の違いの一例として、非還元末端のガラクトース残基の有無や当該ガラクトース残基数の違いが挙げられる。
　本発明におけるＦｃ結合性タンパク質の好ましい態様の一例として、
（１）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシン残基（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン残基（Ｇｌｎ）までのアミノ酸残基）を少なくとも含むポリペプチド、
（２）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域を少なくとも含み、ただし当該細胞外領域を構成するアミノ酸残基において、１以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド、および
（３）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ抗体への結合活性を有するポリペプチド、があげられる。
　上記（２）における、「１もしくは数個」とは、例えば、１以上４０個以下、１以上３０個以下、１以上２０個以下、または１以上１０個以下（１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個および１個のいずれか）を意味してよい。上記（２）の好ましい態様として、特開第２０１５－０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、特開第２０１６－１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、特開第２０１７－１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、特開第２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、および国際公開第２０１９／０８３０４８号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、があげられる。Ｆｃ結合性タンパク質が（２）に示されるタンパク質であることで、耐アルカリ性が向上する。
　上記（３）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上であればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）であってもよい。Ｆｃ結合性タンパク質が（３）に示されるタンパク質であることで、耐アルカリ性が向上する。
　Ｆｃ結合性タンパク質を、前述した不溶性多孔質担体に固定化して本発明で用いる抗体吸着材を作製するには、例えば、不溶性多孔質担体表面に、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシ基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド（ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド等）等の活性化官能基を適切な反応条件で付与した後、当該活性化官能基を介してＦｃ結合性タンパク質と不溶性多孔質担体とを共有結合させて作製すればよい。また、あらかじめ活性化官能基が付与された市販のクロマトグラフィー用担体を、Ｆｃ結合性タンパク質と共有結合させて作製してもよい。活性化官能基が付与された市販の担体として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ　Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ（いずれもＣｙｔｉｖａ社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｒｅｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）が例示できる。
　なお不溶性多孔質担体がその表面にヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基等の官能基を有している場合、当該官能基に対して活性化官能基を有する化合物を導入して活性化官能基が付与された不溶性多孔質担体を作製後、当該活性化官能基とＦｃ結合性タンパク質とを共有結合させて抗体吸着材を作製してもよい。例えば、担体表面にヒドロキシ基を有している場合、エピクロロヒドリン（活性化基としてエポキシ基を形成）、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（活性化基としてエポキシ基を形成）、トレシルクロリド（活性化基としてトレシル基を形成）、ビニルブロミド（活性化基としてビニル基を形成）等の活性化剤を用いて、活性化官能基を付与すればよい。またヒドロキシ基をアミノ基またはカルボキシ基などに変換した後、３－マレイミドプロピオン酸Ｎ－スクシンイミジル（活性化基としてマレイミド基を形成）、１，１’－カルボニルジイミダゾール（活性化基としてカルボニルイミダゾール基を形成）、ハロゲン化酢酸（活性化基としてハロゲン化アセチル基を形成）等の活性化剤を用いて、活性化官能基を付与してもよい。
　抗体吸着材を充填するカラムは、アフィニティークロマトグラフィーに通常用いられるものであってよい。カラムの直径（内径）は、３ｍｍ～１００ｃｍとすることができ、好ましくは３ｍｍ～１００ｍｍ、より好ましくは３ｍｍ～３０ｍｍである。カラムの長さは、１０～５００ｍｍとすることができる、カラムとしては、例えば、φ５．０ｍｍ×５０ｍｍのＣｙｔｉｖａ社製Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０）を使用することができる。
　本発明において、抗体とは、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む分子を意味する。抗体は、Ｆｃ領域からなるものであってもよく、Ｆｃ領域に加えて他の領域を含むものであってもよい。本発明の抗体には、糖鎖が付加されて（糖鎖を有して）いてよい。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、抗体医薬品であってもよい。抗体医薬品としては、ハーセプチン（トラスツズマブ）、リツキサン（リツキシマブ）、アバスチン（ベバシズマブ）、アービタックス（セツキシマブ）、アクテムラ（トシリズマブ）、レミケード（インフリキシマブ）等が挙げられる。抗体は、市販のものを用意してもよく、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ハイブリドーマ細胞等により製造してもよい。
　本発明において、抗体を含む溶液とは、抗体をリン酸緩衝生理食塩水に溶解させたものであってよい。
　前述した抗体吸着材を用いて抗体を分離するには、まず、当該抗体吸着材を充填したカラムにポンプ等の送液手段で平衡化液を添加することでカラムを平衡化してよい。次に、上記送液手段で抗体を含む溶液を添加することで抗体吸着材に抗体を特異的に吸着させる。その後、上記送液手段で緩衝液を添加し、ｐＨをステップワイズで変化させることで吸着した抗体を溶出させればよい。本発明において抗体の分離とは、構造、性質、活性等に基づく分離に限らず、夾雑物を含む溶液からの抗体分離（夾雑物除去）も含まれる。
　平衡化液としてはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ（２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）緩衝液、クエン酸緩衝液が例示できる。これらの緩衝液に、１０ｍＭ以上２００ｍＭ以下の塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。平衡化液のｐＨは、ｐＨ４．０以上８．０以下の範囲から、緩衝液成分、カラム形状、吸着材のカラムへの充填圧力などを考慮し、適宜最適値を決定すればよい。
　本発明では前述した通り、抗体吸着材に吸着した抗体を、ｐＨグラジエントで溶出させる。本発明においては、ｐＨグラジエントは、緩衝液のｐＨを段階的に低下させるステップグラジエントであり、ｐＨの低下幅は０．１以上１未満である。
　ｐＨグラジエントとしては、一般的にはリニアグラジエントも挙げられるが、リニアグラジエントで溶出させる場合、ｐＨ低下の傾きが急すぎると、構造または活性の違いによらず全ての抗体が一度に溶出してしまうリスクがある。またこのリスクを回避すべく、ｐＨ低下の傾きを緩やかにすると多大な時間を要し、かつ得られるクロマトグラム（分離パターン）もなだらかなピークとなるため、ピークに基づく分取が困難になる。つまり、所望の抗体をどのタイミングで分取するかの判断が困難になる。したがって本発明では、抗体吸着材に吸着した抗体のｐＨグラジエントによる溶出を、ステップグラジエントで実施する。
　本発明におけるステップグラジエントによる溶出は、具体的には、抗体吸着材に吸着した抗体を、当該吸着材を充填したカラムに添加する緩衝液のｐＨを０．１以上１未満の低下幅で段階的に低下させて、溶出させる。ｐＨの低下幅がこの範囲にあることで、全ての抗体が一度に溶出することなく、ピークに基づく分取が容易になる。その結果、構造および活性の違いに基づいて抗体を分取することができる。ｐＨの低下幅は、０．１以上であり、０．１５以上であってよい。ｐＨの低下幅は、１未満であり、０．９以下、０．８以下、０．７以下、０．６以下、０．５以下、０．４以下、０．３以下または０．２５以下であってよい。ｐＨの低下幅は、０．１以上０．６以下であってよく、０．１以上０．３以下であってよい。ｐＨの低下幅がこれらの範囲にあると、構造および活性の違いに基づく抗体の分取がより容易になる。
　本発明において、ステップグラジエント開始時のｐＨは、抗体吸着材に吸着した抗体が溶出し始めるｐＨに安全係数を加算した値とすればよい。安全係数は通液開始直後から溶出してしまうリスクを防ぐ目的を満たしていれば適宜設定してよく、例えば、定数を用いても良く、事前測定した結果の平均値に標準偏差の１倍から３倍加算した値を用いてもよい。
　ステップグラジエントに用いる緩衝液は、次の方法でｐＨを調整し、カラムに添加することができる。まず、ｐＨの異なる二種類の溶液を用意し、これらの溶液の混合比率に対するｐＨの近似式を算出する。次に、当該近似式に基づき、所望のｐＨとなるよう、上記二種類の溶液を混合し、カラムに添加すればよい。緩衝液に含まれる緩衝物質は、抗体が溶出するｐＨ（例えば、ｐＨ３．０以上６．０以下）の範囲に緩衝能を有し、かつ当該範囲内にｐＫａを複数有する物質であってよく、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液が例示される。中でも、クエン酸（ｐＫａ１＝３．０９、ｐＫａ２＝４．７５）緩衝液、コハク酸（ｐＫａ１＝４．２、ｐＫａ２＝５．６）緩衝液など、抗体が溶出するｐＨの範囲内にｐＫａを複数有する緩衝物質を含む溶液を、抗体溶出の際、カラムに添加する緩衝液として用いると、混合比率の違いによるｐＨの変化が緩やかになり、扱いやすい。
　ステップグラジエント時の緩衝液の流速、またはｐＨを維持する時間は抗体吸着材を充填したカラムのサイズ等も考慮し、適宜設定すればよい。
　なお、ステップグラジエント開始前（すなわち、抗体を溶出させる前）におけるｐＨを変化させる条件は適宜設定してよい。例えば、ステップグラジエント開始時のｐＨまで一段階に低下させてもよく、連続的に低下させてもよく（リニアグラジエント）、段階的に低下させてもよい。抗体を溶出させる前において、ｐＨを段階的に低下させる場合、その低下幅は特に限定されない。
　前述した方法で各ｐＨの緩衝液で溶出された、抗体を含む画分（ピーク）を分取することで所望の構造および活性を有した抗体が得られる。分取は常法により行なってよい。具体的には、例えば、緩衝液のｐＨが変わるタイミングで回収容器を交換すればよい。
　カラムに充填する抗体吸着材の量は、０．１ｍＬ以上、０．３ｍＬ以上、０．５ｍＬ以上、０．７ｍＬ以上又は０．９ｍＬ以上とすることができる。カラムに充填する抗体吸着材の量は、１．４ｍＬ以下、１．２ｍＬ以下又は１．０ｍＬ以下とすることができる。
　本発明の方法によれば、大量の抗体を分離することが可能である。例えば、本発明の方法は、１ｍｇ以上５０ｍｇ以下の抗体を分離することができる。すなわち、本発明における抗体を含む溶液は、抗体を１ｍｇ以上５０ｍｇ以下含んでいてよい。本発明における抗体を含む溶液は、抗体を５ｍｇ以上４０ｍｇ以下含んでいてもよい。
　カラムに充填する抗体吸着材の体積に対する、抗体を含む溶液中の抗体の質量の比は、１ｍｇ／１．０ｍＬ～５０ｍｇ／０．１ｍＬであってよく、５ｍｇ／１．０ｍＬ～４０ｍｇ／０．９ｍＬであってもよい。例えば、０．１ｍＬ以上１．０ｍＬ以下の抗体吸着材を充填したカラムに、１ｍｇ以上５０ｍｇ以下の抗体を含む溶液を添加してよく、０．９ｍＬ以上１．０ｍＬ以下の抗体吸着材を充填したカラムに、５ｍｇ以上４０ｍｇ以下の抗体を含む溶液を添加してもよい。
　本発明の一側面に係る抗体組成物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合に７５０分以上の保持時間で検出される抗体を、上記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む。言い換えれば、この抗体組成物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．０以下の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を、上記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む。この抗体組成物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）は高く、癌等の治療に有効である。
（測定条件）
　カラム：Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０（φ５．０ｍｍ×５０ｍｍ、Ｃｙｔｉｖａ社製）
　吸着材：吸着材用多孔質親水性ビニルポリマー（東ソー社製、液体クロマトグラフィー用充填剤）１ｇに対し、Ｆｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を３０ｍｇ反応させて得たＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル
　流速：０．０７ｍＬ／分
　溶媒：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
　ステップグラジエント：５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）をこの順に３．７３ｍＬずつ添加
　５０ｍＭのクエン酸緩衝液：５０ｍＭのクエン酸水溶液および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液の混合液
　カラム温度：２５℃
　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
　注入量：２０００μＬ（抗体量：５ｍｇ）
　本発明の一側面に係る抗体組成物において、保持時間は、９００分以下、８５０分以下または８００分以下であってよい。保持時間は、７５０分以上９００分以下、７５０分以上８５０分以下または７５０分以上８００分以下であってよい。クエン酸緩衝液のｐＨは、３．６～４．０、３．８～４．０であってよく、３．４、３．６、３．８または４．０であってもよい。
　本発明の一側面に係る抗体組成物において、モノクローナル抗体溶液を上記測定条件で分画した場合に７５０分以上の保持時間で検出される抗体の含有量は、上記抗体組成物の全質量基準で、２０質量％以上、３０質量％以上、４０質量％以上、５０質量％、６０質量％以上、７０質量％以上、８０質量％以上または９０質量％以上であってよい。含有量がこれらの範囲にあると、抗体組成物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）がより高まり、癌等の治療により有効である。
　本発明の別の一側面に係る抗体組成物は、モノクローナル抗体溶液を上記測定条件で分画した場合に７５０分未満の保持時間で検出される抗体を、上記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む。言い換えれば、この抗体組成物は、モノクローナル抗体溶液を上記測定条件で分画した場合にｐＨが４．２以上の上記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を、上記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む。この抗体組成物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）は低く、例えば、リウマチ等の自己免疫疾患等の治療に有効である。
　本発明の別の一側面に係る抗体組成物において、保持時間は、４５０分以上５５０分以下、５５０分以上６５０分以下、６５０分以上７５０分未満、３００分以上４００分以下、４００分以上４８０分以下、４８０分以上５８０分以下、５８０分以上６５０分以下、６５０分以上７５０分未満、５００分以上６００分以下、６００分以上６５０分以下または６５０分以上７５０分未満であってよい。クエン酸緩衝液のｐＨは、４．２～５．０または４．４～４．８であってよく、４．２、４．４、４．６、４．８または５．０であってもよい。保持時間が短い程、また、クエン酸緩衝液のｐＨが高い程、抗体組成物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）がより低下し、例えば、リウマチ等の自己免疫疾患等の治療により有効である。
　本発明の別の一側面に係る抗体組成物において、モノクローナル抗体溶液を上記測定条件で分画した場合に７５０分未満の保持時間で検出される抗体の含有量は、上記抗体組成物の全質量基準で、２０質量％以上、３０質量％以上、４０質量％以上、５０質量％、６０質量％以上、７０質量％以上、８０質量％以上または９０質量％以上であってよい。含有量がこれらの範囲にあると、抗体組成物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）がより低下し、例えば、リウマチ等の自己免疫疾患等の治療により有効である。
　また、本発明の抗体組成物は、ガラクトースを含む糖鎖を有する抗体が抗体組成物の全量基準で８０質量％以上である抗体組成物であってもよい。この抗体組成物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）は高く、癌等の治療に有効である。ガラクトースを含む糖鎖を有する抗体の含有量は、抗体組成物の全量基準で８５質量％以上、９０質量％以上または９５質量％以上であってよい。含有量がこれらの範囲にあると、抗体組成物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）がより高まり、癌等の治療により有効である。
　本発明の別の抗体組成物は、ガラクトースを含まない糖鎖を有する抗体が、抗体組成物の全量基準で６０質量％以上である抗体組成物であってもよい。この抗体組成物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）は低く、例えば、リウマチ等の自己免疫疾患等の治療に有効であると考えられる。ガラクトースを含まない糖鎖を有する抗体の含有量は、抗体組成物の全量基準で、７０質量％以上、８０質量％以上または９０質量％以上であってよい。含有量がこれらの範囲にあると、抗体組成物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）がより低下し、例えば、リウマチ等の自己免疫疾患等の治療により有効である。
　本発明の一側面に係る濃縮物は、抗体溶液の濃縮物であって、上記抗体溶液および上記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を上記測定条件で分画した場合に７５０分以上の保持時間で検出される抗体を含み、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量が、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２倍以上である。言い換えれば、この濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を上記測定条件で分画した場合にｐＨが４．０以下の上記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を含み、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量が、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２倍以上である。この濃縮物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）は高く、癌等の治療に有効である。
　本発明の一側面に係る濃縮物において、保持時間は、９００分以下、８５０分以下または８００分以下であってよい。保持時間は、７５０分以上９００分以下、７５０分以上８５０分以下または７５０分以上８００分以下であってよい。クエン酸緩衝液のｐＨは、３．６～４．０、３．８～４．０であってよく、３．４、３．６、３．８または４．０であってもよい。
　本発明の一側面に係る濃縮物において、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量は、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上であってよい。この場合、濃縮物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）がより高まり、癌等の治療により有効である。
　本発明の別の一側面に係る濃縮物は、抗体溶液の濃縮物であって、上記抗体溶液および上記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を上記測定条件で分画した場合に７５０分未満の保持時間で検出される抗体を含み、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量が、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２倍以上である。言い換えれば、この濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を上記測定条件で分画した場合にｐＨが４．２以上の上記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を含み、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量が、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２倍以上である。この濃縮物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）は低く、例えば、リウマチ等の自己免疫疾患等の治療に有効である。
　本発明の別の一側面に係る濃縮物において、保持時間は、４５０分以上５５０分以下、５５０分以上６５０分以下、６５０分以上７５０分未満、３００分以上４００分以下、４００分以上４８０分以下、４８０分以上５８０分以下、５８０分以上６５０分以下、６５０分以上７５０分未満、５００分以上６００分以下、６００分以上６５０分以下または６５０分以上７５０分未満であってよい。クエン酸緩衝液のｐＨは、４．２～５．０または４．４～４．８であってよく、４．２、４．４、４．６、４．８または５．０であってもよい。保持時間が短い程、また、クエン酸緩衝液のｐＨが高い程、濃縮物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）がより低下し、例えば、リウマチ等の自己免疫疾患等の治療により有効である。
　本発明の別の一側面に係る濃縮物において、上記濃縮物の全量に対する上記抗体の含有量は、上記抗体溶液の全量に対する上記抗体の含有量の２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上であってよい。この場合、濃縮物が発揮する活性（例えばＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性）がより低くなり、例えば、リウマチ等の自己免疫疾患等の治療により有効である。
　これらの全ての抗体組成物および濃縮物は、本発明の分離方法で得ることができる。抗体が有する糖鎖の構造は、液体クロマトグラフ質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）など公知の方法で解析することができる。
　本発明の各実施形態について、実施例および比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら例により何ら限定されるものではない。
（参考例１）抗体吸着材の調製
　吸着材用多孔質親水性ビニルポリマー（東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（液体クロマトグラフィー用充填剤）、体積平均粒子径：４５μｍ）をサクションドライゲルとして１ｇ採取し、当該ゲル表面に有するヒドロキシ基をヨードアセチル基で活性化後、国際公開第２０１９／０８３０４８号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を３０ｍｇ反応させることにより、抗体吸着材ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲルを得た。
　ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）のうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ３６ｉのアミノ酸配列、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。ＦｃＲ３６ｉは、天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列）であり、ただし当該領域のアミノ酸残基において、Ｇｌｕ２１Ｇｌｙ（この表記は、配列番号１の２１番目（配列番号２では２８番目に相当）のグルタミン酸がグリシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｎ３３Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｌｙｓ４０Ｇｌｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ａｓｎ５６Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏ、Ｔｙｒ７４Ｐｈｅ、Ｐｈｅ７５Ｉｌｅ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ｔｈｒ８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１１９Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ａｓｐ１２２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３２Ａｒｇ、Ｔｈｒ１４０Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１４１Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１４７Ｖａｌ、Ｔｙｒ１５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ１６５Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｖａｌ１７６Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１７８Ａｒｇ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１８４Ｇｌｙ、Ｔｈｒ１８５Ａｌａ、Ａｓｎ１８７ＡｓｐおよびＩｌｅ１９０Ｖａｌのアミノ酸置換を有する、ポリペプチドである。
　参考例１で得られた抗体吸着材は、耐アルカリ性が良好であった。より具体的には、０．１ＭのＮａＯＨ溶液で上記抗体吸着材の定置洗浄（ＣＩＰ）を２００回行った後でも、洗浄前に対して９０％の抗体吸着量が維持された。また、参考例１で得られた抗体吸着材は、４０ｇ／Ｌ以上の動的吸着量（ＤＢＣ）を有していた。
（参考例２）抗体分離用緩衝液の調製
　抗体の分離に使用するクエン酸緩衝液の原液となる、５０ｍＭのクエン酸水溶液および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液を作製した。作製した二種類の水溶液を任意の割合で混合し、得られた混合液（クエン酸緩衝液）のｐＨを測定した。測定した結果から近似曲線を作成し（図１）、特定ｐＨにおける二種類の水溶液の混合比率を算出した。図１に示されるグラフの横軸は、５０ｍＭのクエン酸水溶液および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液の全質量を基準とした、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム（Ｃｉｔｒａｔｅ－３Ｎａ）水溶液の割合であり、縦軸はｐＨを示す。
　近似曲線（図１）から得られた、５０ｍＭのクエン酸水溶液（５０　ｍＭ　Ｃｉｔｒｉｃ　ａｃｉｄ）および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液（５０　ｍＭ　Ｃｉｔｒａｔｅ－３Ｎａ）の混合比率とｐＨとの関係を、表１に示す。
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（実施例１）抗体吸着材充填カラムを用いた抗体の分離
（１）参考例１で作製した抗体吸着材（ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル）を、φ５．０ｍｍ×５０ｍｍのＣｙｔｉｖａ社製Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０）に充填し、ゲル容量０．３７３ｍＬのＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムを作製した。
（２）（１）で作製したＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムをＣｙｔｉｖａ社製ＡＫＴＡ　ａｖａｎｔ　１５０に接続後、上記カラムに、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（以下、ＰＢＳとも表記）を、流速０．０７ｍＬ／ｍｉｎで、５カラムボリューム（以下、「ＣＶ」と表記；１ＣＶ＝０．３７３ｍＬ）添加することによりカラムを平衡化した。
（３）ＰＢＳで２．５ｍｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体（全薬工業社製リツキサン、ヒト・マウスキメラモノクローナル抗体）を、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムに、流速０．０７ｍＬ／ｍｉｎで、抗体として５ｍｇ添加した。
（４）流速０．０７ｍＬ／ｍｉｎのまま、ＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムにＰＢＳを２０ＣＶ添加することで上記カラムを洗浄した。
（５）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムへ、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）の順に１０ＣＶずつ添加し、ｐＨを段階的に低下させた（ステップグラジエント）。各ｐＨのクエン酸緩衝液は、参考例２で決定した混合比率に基づき、５０ｍＭのクエン酸水溶液と５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液とを混合し調製した（（６）以降で用いる、他のｐＨのクエン酸緩衝液も同じ）。なお、ｐＨ６．０～ｐＨ５．０までのステップグラジエントを、図２では実線で示した。
（６）ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムへ、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）をこの順に１０ＣＶずつ添加した。このようにｐＨを低下幅０．５で段階的に低下させるステップグラジエントを実施し、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを得た。また、（５）および（６）において、抗体吸着材（ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル）から溶出したモノクローナル抗体を含む画分を、添加した各ｐＨの緩衝液毎に分取した。なお、ｐＨ５．０から０．５ずつ段階的に低下させるステップグラジエントを、図２では破線で示した。
（７）（５）および（６）で分取した画分をＰＢＳで１６時間透析し、溶媒置換をした。
（８）ＴＳＫｇｅｌ　ＦｃＲ－ＩＩＩＡ－ＮＰＲカラム（東ソー社製；以下、単にＦｃＲＩＩＩＡカラムとも表記）を高速液体クロマトグラフィー装置（島津製作所社製）に接続した。その後、ＦｃＲＩＩＩＡカラムに５０ｍＭの塩化ナトリウム含有２０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）（以下、単に酢酸緩衝液とも表記）を流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで３０ＣＶ添加することで、ＦｃＲＩＩＩＡカラムを平衡化した。
（９）（７）で溶媒置換した、モノクローナル抗体溶液（（５）および（６）で分取した画分）を、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで、５μｇ分、ＦｃＲＩＩＩＡカラムに添加した。
（１０）流速０．６ｍＬ／ｍｉｎのまま酢酸緩衝液で２分洗浄後、１０ｍＭのグリシン－塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエント（２８分で１０ｍＭのグリシン－塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）が１００％となるリニアグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出し、ＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを得た。
　ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを図３に、ＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを図４に、それぞれ示す。図３の縦軸（左）は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、縦軸（右）は設定ｐＨ（クエン酸緩衝液のｐＨ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図４の縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は時間（分）を示す。抗体吸着材に吸着した抗体を、ｐＨを低下幅０．５で段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させることで、２本のピーク（Ｆ１およびＦ２）に分かれた（図３）。図３中のＦ１画分およびＦ２画分を分取し、ＦｃＲＩＩＩＡカラムで分析したところ、Ｆ１画分には主に第１ピーク（１ｓｔ）で溶出されており、当該画分にはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性の低い糖鎖構造を有した抗体が多く含まれていることがわかった（図４）。このことから、本発明の方法によれば、５ｍｇの抗体を、ＡＤＣＣ活性の違いに基づいて分画することができることが分かった。なお、図４（および、後述する図６，８，１０，１２，１４，１６）中の第１ピーク（１ｓｔ）ではＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性の低い糖鎖構造を有した抗体が、第３ピーク（３ｒｄ）ではＡＤＣＣ活性の高い糖鎖構造を有した抗体が、第２ピーク（２ｎｄ）では中間のＡＤＣＣ活性を示す糖鎖構造を有した抗体が、それぞれ分離されている。
（実施例２）抗体吸着材充填カラムを用いた抗体の分離
　実施例１の（６）で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムへ、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）をこの順に１０ＣＶずつ添加することで、ｐＨを低下幅０．２で段階的に低下させるステップグラジエントを実施した他は、実施例１と同様の方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを得た。本実施例で実施したステップグラジエントを、図２では点線で示した。
　ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを図５に、ＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを図６に、それぞれ示す。図５の縦軸（左）は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、縦軸（右）は設定ｐＨ（クエン酸緩衝液のｐＨ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図６の縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は時間（分）を示す。抗体吸着材に吸着した抗体を、ｐＨを低下幅０．２で段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させると、実施例１（低下幅０．５）よりも多くのピークに分かれた（図５）。また図５中のＦ１画分～Ｆ４画分を分取し、ＦｃＲＩＩＩＡカラムで分析したところ、Ｆ１画分には主に第１ピーク（１ｓｔ）、すなわちＡＤＣＣ活性の低い糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ３画分には主に第２ピーク（２ｎｄ）、すなわち中間のＡＤＣＣ活性を示す糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ４画分には主に第３ピーク（３ｒｄ）、すなわちＡＤＣＣ活性の高い糖鎖構造を有した抗体が、それぞれ含まれていることがわかった（図６）。以上の結果から、ｐＨの低下幅を０．５から０．２にすることで、５ｍｇの抗体を、糖鎖構造の違い（ここではＡＤＣＣ活性の違い）に基づいてより容易に分画できることがわかった。
（比較例１）
　実施例１の（６）で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムへ、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）をこの順に１０ＣＶずつ添加することで、ｐＨを低下幅１．０で段階的に低下させるステップグラジエントを実施した他は、実施例１と同様の方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを得た。本比較例で実施したステップグラジエントを、図２では実線で示した。
　ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを図７に、ＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを図８に、それぞれ示す。図７の縦軸（左）は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、縦軸（右）は設定ｐＨ（クエン酸緩衝液のｐＨ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図８の縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は時間（分）を示す。抗体吸着材に吸着した抗体を、ｐＨを低下幅１．０で段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させると、実施例１（低下幅０．５）および実施例２（低下幅０．２）とは異なり、ピークは１本となった（図７）。したがって、低下幅１．０では、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムを用いた、糖鎖構造の違い（ここではＡＤＣＣ活性の違い）に基づく抗体分取は実施できないことがわかった。
　実施例１、実施例２および比較例１の結果をまとめると、多孔質担体と当該担体に固定化したＦｃ結合性タンパク質とを含む抗体吸着材（ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラム）を用いて、所望の糖鎖構造（ここでは、所望のＡＤＣＣ活性）を有した抗体を分取する場合、抗体吸着材に吸着した抗体を、ｐＨを０．１以上１未満の低下幅で段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させる必要があることがわかった。また実施例１と実施例２との比較から、上記低下幅を０．１以上０．３以下とすると、所望の糖鎖構造（ここでは所望のＡＤＣＣ活性）を有した抗体をより容易に分取できることがわかった。
（実施例３）抗体吸着材充填カラムを用いた抗体の分離
　実施例１の（３）で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムに添加するモノクローナル抗体溶液を、アクテムラ（ロシュ社製；抗インターロイキン６モノクローナル抗体；添加量５ｍｇ）溶液とした他は、実施例１と同様の方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを得た。本実施例で実施したステップグラジエントを、図２では破線で示した。
（実施例４）抗体吸着材充填カラムを用いた抗体の分離
　実施例１の（３）で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムに添加するモノクローナル抗体溶液を、アクテムラ（ロシュ社製；抗インターロイキン６モノクローナル抗体；添加量５ｍｇ）溶液とし、実施例１の（６）で実施するステップグラジエントを実施例２に記載の方法で行なった他は、実施例１と同様の方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを得た。本実施例で実施したステップグラジエントを、図２では点線で示した。
　実施例３（ｐＨの低下幅：０．５）におけるＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを図９および図１０にそれぞれ示す。図９の縦軸（左）は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、縦軸（右）は設定ｐＨ（クエン酸緩衝液のｐＨ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図１０の縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は時間（分）を示す。実施例４（ｐＨの低下幅：０．２）におけるＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを図１１および図１２にそれぞれ示す。図１１の縦軸（左）は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、縦軸（右）は設定ｐＨ（クエン酸緩衝液のｐＨ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図１２の縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は時間（分）を示す。ｐＨの低下幅が０．５のとき（実施例３）は３本のピーク（Ｆ１～Ｆ３）に分かれた（図９）。また上記３本のピーク画分を分取し、ＦｃＲＩＩＩＡカラムで分析したところ、Ｆ１画分およびＦ２画分には主に第１ピーク（１ｓｔ）、すなわちＡＤＣＣ活性の低い糖鎖構造を有した抗体が含まれていることがわかった（図１０）。ｐＨの低下幅が０．２のとき（実施例４）は多数のピークに分かれた（図１１）。図１１中のＦ１画分～Ｆ６画分を分取し、ＦｃＲＩＩＩＡカラムで分析したところ、Ｆ１からＦ４画分には主に第１ピーク（１ｓｔ）、すなわちＡＤＣＣ活性の低い糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ５画分には主に第２ピーク（２ｎｄ）、すなわち中間のＡＤＣＣ活性を示す糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ６画分には主に第３ピーク（３ｒｄ）、すなわちＡＤＣＣ活性の高い糖鎖構造を有した抗体が、それぞれ含まれていることがわかった（図１２）。
　本発明によれば、モノクローナル抗体をリツキサンからアクテムラに替えても、抗体吸着材に吸着した抗体を、０．１以上１未満の低下幅でｐＨを段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させることで、大量の抗体を糖鎖構造の違い（ここではＡＤＣＣ活性の違い）に基づいて分画でき、０．１以上０．３以下の低下幅にするとより容易に分画できることがわかった。
（実施例５）抗体吸着材充填カラムを用いた抗体の分離
　実施例１の（３）で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムに添加するモノクローナル抗体溶液をアービタックス（メルクセローノ社製；ヒト・マウスキメラ化モノクローナル抗体；添加量５ｍｇ）溶液とした他は、実施例１と同様の方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを得た。本実施例で実施したステップグラジエントを、図２では破線で示した。
（実施例６）抗体吸着材充填カラムを用いた抗体の分離
　実施例１の（３）で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムに添加するモノクローナル抗体溶液をアービタックス（メルクセローノ社製；ヒト・マウスキメラ化モノクローナル抗体；添加量５ｍｇ）溶液とし、実施例１（６）で実施するステップグラジエントを実施例２に記載の方法で行なった他は、実施例１と同様の方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを得た。本実施例で実施したステップグラジエントを、図２では点線で示した。
　実施例５（ｐＨの低下幅０．５）におけるＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを図１３および図１４にそれぞれ示す。図１３の縦軸（左）は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、縦軸（右）は設定ｐＨ（クエン酸緩衝液のｐＨ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図１４の縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は時間（分）を示す。実施例６（ｐＨの低下幅０．２）におけるＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを図１５および図１６にそれぞれ示す。図１５の縦軸（左）は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、縦軸（右）は設定ｐＨ（クエン酸緩衝液のｐＨ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図１６の縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は時間（分）を示す。ｐＨの低下幅が０．５のとき（実施例５）は２本のピーク（Ｆ１およびＦ２）に分かれた（図１３）。図１３のＦ１画分およびＦ２画分を分取し、ＦｃＲＩＩＩＡカラムで分析したところ、Ｆ１画分には第１ピーク（１ｓｔ）、すなわちＡＤＣＣ活性の低い糖鎖構造を有した抗体が多く含まれていることがわかった（図１４）。ｐＨの低下幅が０．２のとき（実施例６）は４本のピーク（Ｆ１～Ｆ４）に分かれた（図１５）。これら４本のピーク画分を分取し、ＦｃＲＩＩＩＡカラムで分析したところ、Ｆ２画分には主に第１ピーク（１ｓｔ）、すなわちＡＤＣＣ活性の低い糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ３画分には主に第１ピークおよび第２ピーク（２ｎｄ）、すなわちＡＤＣＣ活性が中間以下の糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ４画分には主に第２ピークおよび第３ピーク（３ｒｄ）、すなわちＡＤＣＣ活性が中間以上の糖鎖構造を有した抗体が、それぞれ含まれていることがわかった（図１６）。
　本発明によれば、モノクローナル抗体をリツキサンからアービタックスに替えても、抗体吸着材に吸着した抗体を、０．１以上１未満の低下幅でｐＨを段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させることで、大量の抗体を糖鎖構造の違い（ここではＡＤＣＣ活性の違い）に基づいて分画でき、０．１以上０．３以下の低下幅にするとより容易に分画できることがわかった。
（実施例７）抗体吸着材充填カラムを用いた抗体の分離
＜１＞参考例１で作製した抗体吸着材（ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル）を、φ５．０ｍｍ×５０ｍｍのＣｙｔｉｖａ社製Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０）に充填し、ゲル容量０．９８２ｍＬのＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムを作製した。
＜２＞＜１＞で作製したＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムをＣｙｔｉｖａ社製ＡＫＴＡ　ａｖａｎｔ　１５０に接続後、上記カラムに、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を、流速０．２０ｍＬ／ｍｉｎで、５ＣＶ添加することによりカラムを平衡化した。
＜３＞ＰＢＳで５．０ｍｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体（全薬工業社製リツキサン、ヒト・マウスキメラモノクローナル抗体）を、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムに、流速０．２０ｍＬ／ｍｉｎで、抗体として５ｍｇ添加した。
＜４＞流速０．２０ｍＬ／ｍｉｎのまま、ＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムにＰＢＳを２０ＣＶ添加することで上記カラムを洗浄した。
＜５＞ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムへ、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）をこの順に１０ＣＶずつ添加し、ｐＨを段階的に低下させた（ステップグラジエント）。
＜６＞ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムへ、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）をこの順に３０ＣＶずつ添加した後、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）をこの順に１０ＣＶずつ添加した。このようにｐＨを低下幅０．２で段階的に低下させるステップグラジエントを実施し、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを得た。また、＜５＞および＜６＞において、抗体吸着材（ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル）から溶出したモノクローナル抗体を含む画分を、添加した各ｐＨの緩衝液毎に分取した。本例で実施したステップグラジエントを、図１７において実線で示した。
＜７＞＜５＞および＜６＞で分取した画分をＰＢＳで１６時間透析し、溶媒置換をした。
＜８＞ＦｃＲＩＩＩＡカラムを高速液体クロマトグラフィー装置（島津製作所社製）に接続した。その後、ＦｃＲＩＩＩＡカラムに５０ｍＭの塩化ナトリウム含有２０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで３０ＣＶ添加することで、ＦｃＲＩＩＩＡカラムを平衡化した。
＜９＞＜７＞で溶媒置換した、モノクローナル抗体溶液（＜５＞および＜６＞で分取した画分）を、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで、５μｇ分、ＦｃＲＩＩＩＡカラムに添加した。
＜１０＞流速０．６ｍＬ／ｍｉｎのまま酢酸緩衝液で２分洗浄後、１０ｍＭのグリシン－塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエント（２８分で１０ｍＭのグリシン－塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）が１００％となるリニアグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出し、ＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを得た。
　ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを図１８に、ＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを図１９に、それぞれ示す。図１８の縦軸（左）は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、縦軸（右）は設定ｐＨ（クエン酸緩衝液のｐＨ）を示し、横軸は時間（分）を示す。抗体吸着材に吸着した抗体を、ｐＨを低下幅０．２で段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させることで、３本のピーク（Ｆ１、Ｆ２およびＦ３）に分かれた（図１８）。図１８中のＦ１画分、Ｆ２画分およびＦ３画分を分取し、ＦｃＲＩＩＩＡカラムで分析したところ、Ｆ１画分には主に第１ピーク（１ｓｔ）、すなわちＡＤＣＣ活性の低い糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ２画分には主に第２ピーク（２ｎｄ）、すなわち中間のＡＤＣＣ活性を示す糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ３画分には主に第３ピーク（３ｒｄ）、すなわちＡＤＣＣ活性の高い糖鎖構造を有した抗体が、それぞれ含まれていることがわかった（図１９）。
（実施例８）抗体吸着材充填カラムを用いた抗体の分離
　実施例７の＜３＞で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムに添加するモノクローナル抗体（全薬工業社製リツキサン、ヒト・マウスキメラモノクローナル抗体）の量を１０ｍｇとした他は、実施例７と同様の方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを得た。本例で実施したステップグラジエントを図１７に示した。
　ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを図２０に、ＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを図２１に、それぞれ示す。図２０の縦軸（左）は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、縦軸（右）は設定ｐＨ（クエン酸緩衝液のｐＨ）を示し、横軸は時間（分）を示す。抗体吸着材に吸着した抗体を、ｐＨを低下幅０．２で段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させることで、４本のピーク（Ｆ１～Ｆ４）に分かれた（図２０）。図２０中のＦ１画分～Ｆ４画分を分取し、ＦｃＲＩＩＩＡカラムで分析したところ、Ｆ１およびＦ２画分には主に第１ピーク（１ｓｔ）、すなわちＡＤＣＣ活性の低い糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ３画分には主に第２ピーク（２ｎｄ）および第３ピーク（３ｒｄ）、すなわち中間以上のＡＤＣＣ活性を示す糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ４画分には主に第３ピーク（３ｒｄ）、すなわちＡＤＣＣ活性の高い糖鎖構造を有した抗体が、それぞれ含まれていることがわかった（図２１）。
（実施例９）抗体吸着材充填カラムを用いた抗体の分離
実施例７の＜３＞で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムに添加するモノクローナル抗体（全薬工業社製リツキサン、ヒト・マウスキメラモノクローナル抗体）の量を２０ｍｇとした他は、実施例７と同様の方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを得た。本例で実施したステップグラジエントを図１７に示した。
　ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを図２２に、ＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを図２３に、それぞれ示す。図２２の縦軸（左）は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、縦軸（右）は設定ｐＨ（クエン酸緩衝液のｐＨ）を示し、横軸は時間（分）を示す。抗体吸着材に吸着した抗体を、ｐＨを低下幅０．２で段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させることで、４本のピーク（Ｆ１～Ｆ４）に分かれた（図２２）。図２２中のＦ１画分～Ｆ４画分を分取し、ＦｃＲＩＩＩＡカラムで分析したところ、Ｆ１およびＦ２画分には主に第１ピーク（１ｓｔ）、すなわちＡＤＣＣ活性の低い糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ３画分には主に第２ピーク（２ｎｄ）および第３ピーク（３ｒｄ）、すなわち中間以上のＡＤＣＣ活性を示す糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ４画分には主に第３ピーク（３ｒｄ）、すなわちＡＤＣＣ活性の高い糖鎖構造を有した抗体が、それぞれ含まれていることがわかった（図２３）。
（実施例１０）抗体吸着材充填カラムを用いた抗体の分離
実施例７の＜３＞で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムに添加するモノクローナル抗体（全薬工業社製リツキサン、ヒト・マウスキメラモノクローナル抗体）の量を３０ｍｇとした他は、実施例７と同様の方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを得た。本例で実施したステップグラジエントを図１７に示した。
　ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを図２４に、ＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを図２５に、それぞれ示す。図２４の縦軸（左）は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、縦軸（右）は設定ｐＨ（クエン酸緩衝液のｐＨ）を示し、横軸は時間（分）を示す。抗体吸着材に吸着した抗体を、ｐＨを低下幅０．２で段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させることで、６本のピーク（Ｆ１～Ｆ６）に分かれた（図２４）。図２４中のＦ１画分～Ｆ６画分を分取し、ＦｃＲＩＩＩＡカラムで分析したところ、Ｆ１～Ｆ３画分には主に第１ピーク（１ｓｔ）、すなわちＡＤＣＣ活性の低い糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ４画分には主に第１ピーク（１ｓｔ）および第２ピーク（２ｎｄ）、すなわち中間以下のＡＤＣＣ活性を示す糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ５画分には主に第２ピーク（２ｎｄ）、すなわち中間のＡＤＣＣ活性を示す糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ６画分には主に第３ピーク（３ｒｄ）、すなわちＡＤＣＣ活性の高い糖鎖構造を有した抗体が、それぞれ含まれていることがわかった（図２５）。
（実施例１１）抗体吸着材充填カラムを用いた抗体の分離
実施例７の＜３＞で、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムに添加するモノクローナル抗体（全薬工業社製リツキサン、ヒト・マウスキメラモノクローナル抗体）の量を４０ｍｇとした他は、実施例７と同様の方法で、ＦｃＲ３６ｉ＿ＣｙｓカラムおよびＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを得た。本例で実施したステップグラジエントを図１７に示した。
　ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓカラムの分離パターンを図２６に、ＦｃＲＩＩＩＡカラムの分離パターンを図２７に、それぞれ示す。図２６の縦軸（左）は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、縦軸（右）は設定ｐＨ（クエン酸緩衝液のｐＨ）を示し、横軸は時間（分）を示す。抗体吸着材に吸着した抗体を、ｐＨを低下幅０．２で段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させることで、複数のピークに分かれた（図２６）。図２６中のＦ１画分～Ｆ６画分を分取し、ＦｃＲＩＩＩＡカラムで分析したところ、Ｆ１およびＦ２画分には主に第１ピーク（１ｓｔ）、すなわちＡＤＣＣ活性の低い糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ３およびＦ４画分には主に第２ピーク（２ｎｄ）、すなわち中間のＡＤＣＣ活性を示す糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ５画分には主に第２ピーク（２ｎｄ）および第３ピーク（３ｒｄ）、すなわち中間以上のＡＤＣＣ活性を示す糖鎖構造を有した抗体が、Ｆ６画分には主に第３ピーク（３ｒｄ）、すなわちＡＤＣＣ活性の高い糖鎖構造を有した抗体が、それぞれ含まれていることがわかった（図２７）。
　以上をまとめると、モノクローナル抗体添加量を５ｍｇから４０ｍｇの範囲で替えても、抗体吸着剤に吸着した抗体を、０．２の低下幅でｐＨを段階的に低下させるステップグラジエントで溶出させることで、糖鎖構造（例えばＡＤＣＣ活性）の違いに基づいた抗体の分取ができることがわかる。
（実施例１２）本発明の方法で分離した抗体の糖鎖構造解析
＜１＞実施例７で分取した図１８のＦ２画分、並びに実施例８で分取した図２０のＦ１、Ｆ２及びＦ４画分のそれぞれに、ＲａｐｉＧｅｓｔ　ＳＦ溶液（ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ　ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳ　Ｎ－Ｇｌｙｃａｎキット［Ｗａｔｅｒｓ社製］に添付）を添加後、９０℃で３分間熱処理することで、これらの画分中に含まれる抗体を変性させた。熱処理後の抗体を、Ｒａｐｉｄ　ＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、当該抗体が有していた糖鎖を切り出した。
＜２＞＜１＞で切り出した糖鎖に対し、ＲａｐｉＦｌｏｕｒ－ＭＳ試薬溶液（上記Ｗａｔｅｒｓ社製キットに添付）を添加することで蛍光標識した。標識した糖鎖は、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラムで精製した。
＜３＞＜２＞で得られた蛍光標識糖鎖をＧｌｙｃａｎ　ＢＥＨ　Ａｍｉｄｅカラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）で分離後、質量分析器に供して当該糖鎖の分子量情報を取得した。Ｇｌｙｃａｎ　ＢＥＨ　Ａｍｉｄｅカラムで得られたクロマトグラムのリテンションタイムと照合し、糖鎖構造を分析した。
　得られた糖鎖構造の分析結果を図２８および表２に、糖鎖構造の概略図を表３に、それぞれ示す。図２８に示されたグラフの縦軸は糖鎖構造の割合（各糖鎖構造のピーク面積比率）である。横軸に沿って記載された糖の名称（略称）は、表３で用いられる略称と同一である。
　図２８および表２によれば、図２０のＦ４画分（ｐＨ４．０のクエン酸緩衝液で溶出）に含まれる抗体は、非還元末端にガラクトースを含む糖鎖構造（例えばＧ１ＦａおよびＧ２Ｆ）を有する抗体の含有割合が高く、非還元末端にガラクトースを含まない糖鎖構造（例えばＧ０Ｆ）を有する抗体の含有割合が低かった。一方、図２０のＦ１画分（ｐＨ４．６のクエン酸緩衝液で溶出）に含まれる抗体、図２０のＦ２画分（ｐＨ４．４のクエン酸緩衝液で溶出）に含まれる抗体および図１８のＦ２画分（ｐＨ４．２のクエン酸緩衝液で溶出）に含まれる抗体は、非還元末端にガラクトースを含む糖鎖構造を有する抗体の含有割合と、非還元末端にガラクトースを含まない糖鎖構造を有する抗体の含有割合とが大きくは変わらなかった。このことから、ｐＨが４．０以下のクエン酸緩衝液で溶出される抗体を回収することで、非還元末端にガラクトースを含む糖鎖構造を有する抗体が多く含まれる抗体を得ることができることが示された。すなわち、本発明の分離方法により、糖鎖構造の違いに基づき、具体的には非還元末端のガラクトース残基の有無に基づき、溶液中に含まれる抗体を分離できることがわかった。
　加えて、図１８のＦ２画分に含まれる抗体は、図２０のＦ１画分およびＦ２画分に含まれる抗体に比べて、非還元末端にガラクトースを２つ含むＧ２Ｆの含有割合が高いことが示された。すなわち、本発明の分離方法により、糖鎖構造の違いに基づき、具体的には非還元末端のガラクトース残基数の違いに基づき、溶液中に含まれる抗体を分離できることがわかった。
　さらに、図２０のＦ１画分およびＦ２画分にそれぞれ含まれる抗体の組成を比べると、Ｆ１画分のほうが非還元末端にガラクトースを含まない糖鎖構造を有する抗体の含有割合が高いことが示された。すなわち、本発明の分離方法により、非還元末端にガラクトースを含まない糖鎖構造を有する抗体の含有割合に基づいて、溶液中に含まれる抗体を分離できることがわかった。
　非還元末端にガラクトースを含まない糖鎖構造を有する抗体は、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性が低いことから、図２０のＦ１画分およびＦ２画分ならびに図１８のＦ２画分は、自己免疫疾患等の治療に適していると考えられる。非還元末端にガラクトースを含む糖鎖構造を有する抗体は、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性が高いことから、図２０のＦ４画分は、癌等の治療に適していると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３で用いられた略称は以下のとおりである。
ＮｅｕＡｃ：Ｎ－アセチルノイラミン酸
Ｇａｌ：ガラクトース
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ－アセチルグルコサミン
Ｍａｎ：マンノース
Ｆｕｃ：フコース
ＲＦ：ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳ　蛍光標識
　本発明により、従来困難であった、抗体医薬品または抗体類縁医薬品の構造および活性の違いに基づく抗体の大量分取が容易となる。また本発明により、抗体医薬品を製造する際の課題とされていた品質の向上、すなわち構造の違いによるロット間における活性のバラつきが低減できる。

Claims (16)

  1. 　不溶性多孔質担体と当該担体に固定化されたＦｃ結合性タンパク質とを含む抗体吸着材を充填したカラムに、抗体を含む溶液を添加し、当該抗体を前記抗体吸着材に吸着させる工程と、
    　前記カラムに緩衝液を添加し、前記抗体吸着材に吸着した前記抗体をｐＨグラジエントで溶出させる工程と、
    を備える抗体の分離方法であって、
    　前記ｐＨグラジエントが、前記緩衝液のｐＨを段階的に低下させるステップグラジエントであり、
    　当該ｐＨの低下幅が０．１以上１未満である、方法。
  2. 　前記不溶性多孔質担体の体積平均粒子径が３０～１５０μｍである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記緩衝液が、ｐＨ３．０以上６．０以下の範囲で緩衝能を有し、かつ当該範囲内にｐＫａを複数有する緩衝物質を含む溶液である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記抗体吸着材の体積に対する前記抗体の質量の比が、１ｍｇ／１．０ｍＬ～５０ｍｇ／０．１ｍＬである、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　抗体の分離方法が、当該抗体が有する糖鎖構造の違いに基づく抗体の分離方法である、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記糖鎖構造の違いが、当該糖鎖構造中の非還元末端のガラクトース残基数の違いである、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、下記（１）、下記（２）または下記（３）に記載のポリペプチドである、請求項５に記載の方法。
    （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシン残基（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン残基（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシン残基（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン残基（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を有し、かつ前記抗体への結合活性を有するポリペプチド
    （３）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシン残基（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン残基（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ前記抗体への結合活性を有するポリペプチド
  9. 　抗体組成物であって、
    　モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．０以下の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を、前記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む、抗体組成物。
    （測定条件）
    　カラム：Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０（φ５．０ｍｍ×５０ｍｍ、Ｃｙｔｉｖａ社製）
    　吸着材：吸着材用多孔質親水性ビニルポリマー（東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（液体クロマトグラフィー用充填剤）、体積平均粒子径：４５μｍ）１ｇに対し、Ｆｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を３０ｍｇ反応させて得たＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル
    　流速：０．０７ｍＬ／分
    　溶媒：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
    　ステップグラジエント：５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）をこの順に３．７３ｍＬずつ添加
    　５０ｍＭのクエン酸緩衝液：５０ｍＭのクエン酸水溶液および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液の混合液
    　カラム温度：２５℃
    　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
    　注入量：２０００μＬ（抗体量：５ｍｇ）
  10. 　抗体組成物であって、
    　モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．２以上の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を、前記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む、抗体組成物。
    （測定条件）
    　カラム：Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０（φ５．０ｍｍ×５０ｍｍ、Ｃｙｔｉｖａ社製）
    　吸着材：吸着材用多孔質親水性ビニルポリマー（東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（液体クロマトグラフィー用充填剤）、体積平均粒子径：４５μｍ）１ｇに対し、Ｆｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を３０ｍｇ反応させて得たＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル
    　流速：０．０７ｍＬ／分
    　溶媒：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
    　ステップグラジエント：５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）をこの順に３．７３ｍＬずつ添加
    　５０ｍＭのクエン酸緩衝液：５０ｍＭのクエン酸水溶液および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液の混合液
    　カラム温度：２５℃
    　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
    　注入量：２０００μＬ（抗体量：５ｍｇ）
  11. 　抗体溶液の濃縮物であって、
    　前記抗体溶液および前記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．０以下の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を含み、
    　前記濃縮物の全量に対する前記抗体の含有量が、前記抗体溶液の全量に対する前記抗体の含有量の２倍以上である、濃縮物。
    （測定条件）
    　カラム：Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０（φ５．０ｍｍ×５０ｍｍ、Ｃｙｔｉｖａ社製）
    　吸着材：吸着材用多孔質親水性ビニルポリマー（東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（液体クロマトグラフィー用充填剤）、体積平均粒子径：４５μｍ）１ｇに対し、Ｆｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を３０ｍｇ反応させて得たＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル
    　流速：０．０７ｍＬ／分
    　溶媒：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
    　ステップグラジエント：５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）をこの順に３．７３ｍＬずつ添加
    　５０ｍＭのクエン酸緩衝液：５０ｍＭのクエン酸水溶液および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液の混合液
    　カラム温度：２５℃
    　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
    　注入量：２０００μＬ（抗体量：５ｍｇ）
  12. 　抗体溶液の濃縮物であって、
    　前記抗体溶液および前記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．２以上の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を含み、
    　前記濃縮物の全量に対する前記抗体の含有量が、前記抗体溶液の全量に対する前記抗体の含有量の２倍以上である、濃縮物。
    （測定条件）
    　カラム：Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０（φ５．０ｍｍ×５０ｍｍ、Ｃｙｔｉｖａ社製）
    　吸着材：吸着材用多孔質親水性ビニルポリマー（東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（液体クロマトグラフィー用充填剤）、体積平均粒子径：４５μｍ）１ｇに対し、Ｆｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を３０ｍｇ反応させて得たＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル
    　流速：０．０７ｍＬ／分
    　溶媒：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
    　ステップグラジエント：５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）をこの順に３．７３ｍＬずつ添加
    　５０ｍＭのクエン酸緩衝液：５０ｍＭのクエン酸水溶液および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液の混合液
    　カラム温度：２５℃
    　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
    　注入量：２０００μＬ（抗体量：５ｍｇ）
  13. 　抗体組成物であって、
    　モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．０以下の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を、前記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む、抗体組成物。
    （測定条件）
    　カラム：Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０（φ５．０ｍｍ×５０ｍｍ、Ｃｙｔｉｖａ社製）
    　吸着材：吸着材用多孔質親水性ビニルポリマー（東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（液体クロマトグラフィー用充填剤）、体積平均粒子径：４５μｍ）１ｇに対し、Ｆｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を３０ｍｇ反応させて得たＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル
    　流速：０．２０ｍＬ／分
    　溶媒：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
    　ステップグラジエント：５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）をこの順に９．８２ｍＬずつ添加、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）をこの順に２９．４６ｍＬずつ添加、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）をこの順に９．８２ｍＬずつ添加
    　５０ｍＭのクエン酸緩衝液：５０ｍＭのクエン酸水溶液および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液の混合液
    　カラム温度：２５℃
    　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
    　注入量：１０００－８０００μＬ（抗体量：５－４０ｍｇ）
  14. 　抗体組成物であって、
    　モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．２以上の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を、前記抗体組成物の全質量基準で１５質量％以上含む、抗体組成物。
    （測定条件）
    　カラム：Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０（φ５．０ｍｍ×５０ｍｍ、Ｃｙｔｉｖａ社製）
    　吸着材：吸着材用多孔質親水性ビニルポリマー（東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（液体クロマトグラフィー用充填剤）、体積平均粒子径：４５μｍ）１ｇに対し、Ｆｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を３０ｍｇ反応させて得たＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル
    　流速：０．２０ｍＬ／分
    　溶媒：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
    　ステップグラジエント：５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）をこの順に９．８２ｍＬずつ添加、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）をこの順に２９．４６ｍＬずつ添加、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）をこの順に９．８２ｍＬずつ添加
    　５０ｍＭのクエン酸緩衝液：５０ｍＭのクエン酸水溶液および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液の混合液
    　カラム温度：２５℃
    　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
    　注入量：１０００－８０００μＬ（抗体量：５－４０ｍｇ）
  15. 　抗体溶液の濃縮物であって、
    　前記抗体溶液および前記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．０以下の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を含み、
    　前記濃縮物の全量に対する前記抗体の含有量が、前記抗体溶液の全量に対する前記抗体の含有量の２倍以上である、濃縮物。
    （測定条件）
    　カラム：Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０（φ５．０ｍｍ×５０ｍｍ、Ｃｙｔｉｖａ社製）
    　吸着材：吸着材用多孔質親水性ビニルポリマー（東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（液体クロマトグラフィー用充填剤）、体積平均粒子径：４５μｍ）１ｇに対し、Ｆｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を３０ｍｇ反応させて得たＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル
    　流速：０．２０ｍＬ／分
    　溶媒：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
    　ステップグラジエント：５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）をこの順に９．８２ｍＬずつ添加、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）をこの順に２９．４６ｍＬずつ添加、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）をこの順に９．８２ｍＬずつ添加
    　５０ｍＭのクエン酸緩衝液：５０ｍＭのクエン酸水溶液および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液の混合液
    　カラム温度：２５℃
    　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
    　注入量：１０００－８０００μＬ（抗体量：５－４０ｍｇ）
  16. 　抗体溶液の濃縮物であって、
    　前記抗体溶液および前記濃縮物は、モノクローナル抗体溶液を下記測定条件で分画した場合にｐＨが４．２以上の下記クエン酸緩衝液で溶出される抗体を含み、
    　前記濃縮物の全量に対する前記抗体の含有量が、前記抗体溶液の全量に対する前記抗体の含有量の２倍以上である、濃縮物。
    （測定条件）
    　カラム：Ｔｒｉｃｏｒｎ　５／５０（φ５．０ｍｍ×５０ｍｍ、Ｃｙｔｉｖａ社製）
    　吸着材：吸着材用多孔質親水性ビニルポリマー（東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（液体クロマトグラフィー用充填剤）、体積平均粒子径：４５μｍ）１ｇに対し、Ｆｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を３０ｍｇ反応させて得たＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓ固定化ゲル
    　流速：０．２０ｍＬ／分
    　溶媒：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
    　ステップグラジエント：５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）をこの順に９．８２ｍＬずつ添加、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）をこの順に２９．４６ｍＬずつ添加、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）および５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４）をこの順に９．８２ｍＬずつ添加
    　５０ｍＭのクエン酸緩衝液：５０ｍＭのクエン酸水溶液および５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム水溶液の混合液
    　カラム温度：２５℃
    　検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
    　注入量：１０００－８０００μＬ（抗体量：５－４０ｍｇ）

     
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