KR101700580B1 - 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 항체의 아형 분리 방법 - Google Patents

양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 항체의 아형 분리 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 항체의 아형 분리 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항체의 생산 과정에서 생긴 여러 가지 아형을 양이온 교환 크로마토그래피의 세척 용액을 사용하여 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 항체의 아형 분리 방법{Method for separating antibody isoform by using cation exchange chromatography}
본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 항체의 아형(isoform) 분리 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항체의 생산 과정에서 생긴 여러 가지 아형을 양이온 교환 크로마토그래피의 완충 용액을 사용하여 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
단백질은 박테리아나 세포 내에서 유전자를 통해 발현이 된다. 그 과정에서 당체화, 당화 또는 효소나 다른 단백질에 의한 변형으로 인하여 본래의 목적한 단백질의 아형(isoform)이 생성될 수 있으며, 외부 환경에 의한 스트레스로 인해 탈아미드화, 산화, 아미노산의 치환/결손으로 인한 아형이 생성될 수 있다. 전자의 경우는 세포 배양 과정 중 해독 후의 변형에 의해 많이 생성되며, 후자의 경우는 정제 공정 중 또는 보관 중에 많이 생성된다.
이렇게 생성된 아형은 본래 목적한 단백질과 비교하여 약효를 얼마나 유지하고 있는지에 따라 제품 관련 물질과 제품 관련 불순물로 분류가 된다.
단백질 치료제의 대표적인 물질인 단일 클론 항체는 표적에 특이적으로 결합하는 능력과 관련된 모든 부분에서 체내에 사용이 가능하기 때문에 치료제 개발에 굉장히 매력적인 도구가 되고 있다.
단일 클론 항체 또한 세포 내 발현 과정 중 여러 유형의 아형이 생성되는데, 이러한 아형 중에서도 제품 관련 불순물이 생성되지 않고 약효를 최대한으로 갖도록 하기 위해서는 클론선택과 배양 공정 개발을 통해 이를 해결해야 한다. 하지만 이후에도 제품 관련 불순물의 아형이 남아 있는 경우 정제 공정 중 또는 보관 중 더 이상 증가하지 않도록 노력해야 한다.
제품 관련 불순물은 제품과 매우 유사한 속성을 가지고 있어 정제 공정에서 사용되는 크로마토그래피를 통한 분리가 매우 어렵지만, 최근에 기술이 발달함에 따라 정제 공정 개발을 통해서도 이러한 제품 관련 불순물을 제거하려는 시도를 하고 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 항체의 아형(isoform)을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 방법을 이용한 정제 공정을 포함하는 항체 제제의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명의 일 구체예는 하기 단계를 포함하는 항체의 아형(isoform)을 분리하는 방법을 제공한다:
a) 항체 함유 시료를 평형 용액(equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography) 컬럼에 적재하는 단계;
b) pH가 상기 항체의 pI 보다 1.0 이상 낮은 pH이고, 염 농도가 10 내지 300 mM인 세척 용액(washing buffer)으로 상기 컬럼을 세척하는 단계; 및
c) 용출 용액(elution buffer)으로 상기 컬럼으로부터 목적 항체를 회수하는 단계.
본 발명의 다른 일 구체예는 하기 단계를 포함하는 항체의 아형(isoform)을 분리하는 방법을 제공한다:
a) 항체 함유 시료를 pH가 상기 항체의 pI 보다 1.0 이상 낮은 pH이고, 염 농도가 10 내지 300 mM인 평형 용액(equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography) 컬럼에 적재하는 단계; 및
b) 용출 용액(elution buffer)으로 상기 컬럼으로부터 목적 항체를 회수하는 단계.
본 발명의 다른 일 구체예는 상기 방법을 이용한 정제 공정을 포함하는 항체 제제의 제조 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 일 구체예는 항체의 아형을 분리하고자 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)를 이용한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이온 교환 크로마토그래피"는 "이온 교환 크로마토그래피 물질"을 사용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 크로마토그래피 작용기로서 공유 결합된 하전 기를 갖는 고정 고분자량 고체상을 의미한다. 전체 전하 중립성을 위해, 공유 결합되지 않은 상대 이온이 그와 결합한다. "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 주위 용액의 유사하게 하전된 이온을 그의 공유 결합되지 않은 상대 이온과 교환시키는 능력을 갖는다. 그의 교환가능한 상대 이온의 전하에 따라서, "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 "양이온 교환 크로마토그래피 물질" 또는 "음이온 교환 크로마토그래피 물질"로 지칭된다.
또한 하전된 기의 성질에 따라서, "이온 교환 크로마토그래피 물질"은, 예를 들면, 설폰산기(S) 또는 카복시메틸기(CM)를 갖는 경우에 양이온 교환 크로마토그래피 물질로 지칭된다. 하전된 기의 화학적 성질에 따라서, "이온 교환 크로마토그래피 물질"은, 공유 결합된 하전된 치환체의 강도에 따라 강 또는 약 이온 교환 크로마토그래피 물질로 추가로 분류될 수 있다. 예를 들면, 강 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 설폰산기를 가지고, 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 카복실산기를 갖는다.
예를 들어, "양이온 교환 크로마토그래피 물질"은 다음과 같은 다수의 회사로부터 다양한 명칭 하에 시판된다: Bio-Rex, Macro-Prep CM(BioRad Laboratories에서 시판, 미국 캘리포니아주 허큘레스), 약 양이온 교환기 WCX2(Ciphergen에서 시판, 미국 캘리포니아주 프레몬트), Dowex MAC-3(Dow Chemical Company에서 시판, 미국 미들랜드주 미들랜드), Mustang C(Pall Corp.에서 시판, 미국 뉴욕주 이스트 힐즈), 셀룰로스 CM-23, CD-32, CM-52, 하이퍼-D 및 파티스피어(Partisphere)(Whatman plc에서 시판, 영국 브렌트포드), Amberlite IRC 76, IRC 747, IRC 748, GT73(Tosoh Bioscience GmbH에서 시판, 독일 스터트가르트), CM 1500, CM 3000(BioChrom Labs에서 시판, 미국 인디애나주 테러호트), 및 CM-Sepharose Fast Flow (GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈에서 시판, 독일). 또한, 상업적으로 시판하는 양이온 교환 수지로는 카복시메틸-셀룰로스, 베이커본드(Bakerbond) ABX, 아가로스상에 고정화된 설포프로필(SP)(예를 들면, GE 헬쓰케어 - Amersham Biosciences Europe GmbH, 독일 브라이버그)에서 시판하는 SP-Sepharose Fast Flow 또는 SP-Sepharose High Performance), 및 아가로스상에 고정화된 설포닐(예를 들면, 독일 GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈에서 시판하는 S- Sepharose Fast Flow)이 포함된다. 상기 "양이온 교환 크로마토그래피 물질"은 이온 교환 기능과 소수성 상호작용 기능의 혼합 방식 크로마토그래피 물질(예; Capto adhere, Capto MMC, MEP HyperCell, Eshmuno HCX 등), 음이온 교환기능과 양이온 교환 기능의 혼합 방식 크로마토그래피 물질(예; hydroxyapatite, Ceramic hydroxyapatite 등) 등을 포함한다.
본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피에 사용 가능한 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 상기 시판되는 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 모두 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 양이온 교환 크로마토그래피 물질로 CM-Sepharose Fast Flow와 Capto S를 사용하였다.
일반적인 크로마토그래피 방법 및 그의 사용법은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 항체의 아형(isoform)을 분리하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 항체 함유 시료를 평형 용액(equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography) 컬럼에 적재하는 단계;
b) pH가 상기 항체의 pI 보다 1.0 이상 낮은 pH이고, 염 농도가 10 내지 300 mM인 세척 용액(washing buffer)으로 상기 컬럼을 세척하는 단계; 및
c) 용출 용액(elution buffer)으로 상기 컬럼으로부터 목적 항체를 회수하는 단계.
상기 단계 b)에서, 세척 용액의 pH는 5.0 내지 8.0일 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 b)에서, 세척 용액의 전도도는 0.5 내지 50 mS/cm일 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
상기 항체 아형은 산성(acidic) 아형일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 세척 방법에 의해 항체의 산성 아형이 분리됨을 CEX-HPLC 분석을 통하여 유추할 수 있었다.
상기 단계 a)의 항체 함유 시료는 적재 전에 10 mS/cm 이하의 전도도로 조절될 수 있다. 상기 전도도는, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 트리스(Tris), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염으로 조절될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 단계 a) 이전 또는 상기 단계 c) 이후에 항체 함유 시료를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(protein A affinity chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography) 및 혼합 모드 크로마토그래피(mixed mode chromatography)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 크로마토그래피에 적재하여 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 단계 a) 이전에 항-EGFR 항체 또는 항-CD20 항체 함유 시료를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(protein A affinity chromatography)로 정제하는 단계를 추가로 수행하였다.
상기 단계 b)에서, 상기 세척 용액은 시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 트리스(Tris), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 a)에서, 상기 평형 용액은 시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 트리스(Tris), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 a)에서 평형 용액의 pH는 8.5 이하일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 a)에서 평형 용액의 농도는 100 mM 이하일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 a)의 평형 용액의 전기전도도(conductivity)는 15 mS/cm 이하일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 c)에서, 상기 용출 용액은 시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 트리스(Tris), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 c)에서 용출 용액의 pH는 4.0 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 c)에서 용출 용액의 농도는 20 mM 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 c)의 세척 용액의 전기전도도(conductivity)는 5 mS/cm 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예로, 상기 항체는 항-EGFR(epidermal growth factor receptor) 항체, 항-CD20 항체, 항-HER2 항체, 항-TNFα 항체, 항-VEGF(vascular endothelial growth factor), 항-인플루엔자 A 바이러스 항체, 항-RSV(Respiratory Sncytial Virus) 항체, 항-HBV(Hepatitis B virus) 항체, 항-광견병 바이러스 항체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 본 발명은 일반적으로 면역글로불린을 사용하여 실행될 수 있다. 상기 항체들은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 포유류 세포에 도입하여 발현시킴으로써 수득할 수 있으며, 항체 제조방법은 당업계에 잘 알려져 있으므로, 본 명세서에서는 생략한다.
본 발명의 다른 일 구체예는 하기 단계를 포함하는 항체의 아형(isoform)을 분리하는 방법을 제공한다:
a) 항체 함유 시료를 pH가 상기 항체의 pI 보다 1.0 이상 낮은 pH이고, 염 농도가 10 내지 300 mM인 평형 용액(equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography) 컬럼에 적재하는 단계; 및
b) 용출 용액(elution buffer)으로 상기 컬럼으로부터 목적 항체를 회수하는 단계.
즉, 앞서 기술한 세척 용액의 pH와 염 농도 조건을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 적재 조건에 적용해도 동일 유사하게 항체 아형을 분리할 수 있다.
본 발명의 다른 일 구체예는 하기 단계를 포함하는 항체의 아형(isoform)을 분리하는 방법을 제공한다:
a) 항체 함유 시료를 평형 용액(equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography) 컬럼에 적재하는 단계; 및
b) pH가 상기 항체의 pI 보다 1.0 이상 낮은 pH이거나, 염 농도가 10 내지 300 mM인 용출 용액(elution buffer)으로 선형 농도 구배에 의해 pH 농도 또는 염 농도를 저 농도에서 고 농도로 증가시켜 상기 컬럼으로부터 목적 항체를 회수하는 단계.
상기 단계 b)에서 용출 용액의 pH에 대한 선형 농도 구배 범위는 pH 5.0 내지 8.0, pH 6.0 내지 8.0, 또는 pH 7.0 내지 8.0일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는, pH 6.0 내지 8.0의 선형 농도 구배에 의해 목적 항체를 용출하였다.
상기 단계 b)에서 용출 용액의 염 농도에 대한 선형 농도 구배 범위는 10 내지 300mM, 20 내지 300mM, 30 내지 300mM, 40 내지 300mM, 50 내지 300mM, 60 내지 300mM, 70 내지 300mM, 80 내지 300mM, 90 내지 300mM, 100 내지 300mM, 150 내지 300mM, 또는 200 내지 300mM일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 단계 b)에서 용출 용액의 염 농도에 대한 선형 농도 구배 범위는 10 내지 200mM, 20 내지 200mM, 30 내지 200mM, 40 내지 200mM, 50 내지 200mM, 60 내지 200mM, 70 내지 200mM, 80 내지 200mM, 90 내지 200mM, 100 내지 200mM, 또는 150 내지 200mM일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는, 50 내지 200mM의 염 농도 선형 농도 구배에 의해 목적 항체를 용출하였다.
또한, 상기 단계 b)에서 용출 용액의 pH와 염 농도에 선형 농도 구배를 동시에 주는 방식으로 목적 항체를 용출할 수 있다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 2개 이상의 경쇄 폴리펩타이드 및 2개의 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는 각각 항원과의 상호작용을 위한 결합 영역을 함유하는 가변 영역(일반적으로 폴리펩타이드 쇄의 아미노 말단 부분)을 함유한다. 또한, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는 각각 숙주 조직, 또는 면역 시스템의 다양한 세포, 일부 식세포 및 전통적인 보체계의 제 1 성분(C1q)을 포함한 인자들에 대한 항체의 결합을 매개할 수 있는 불변 영역(일반적으로 카복시 말단 부분)을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 실질적으로 항체 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 폴리펩타이드로 이루어진 단백질을 말한다. 인지된 항체 유전자는 다양한 불변 영역 유전자, 및 다양한 항체 가변 영역 유전자를 포함한다. 예를 들면, 항체는 Fv, Fab 및 F(ab)2 및 단일쇄를 포함하여 다양한 형태로 존재할 수 있다. 일 예로, 본 발명의 일 구체예에 따른 항체는 단클론성 항체 및 그의 단편, 예를 들면, 분리된 중쇄 또는 경쇄, 또는 불변 영역으로만 이루어진 중쇄 또는 경쇄, 및 그의 단편을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “아형(isoform)”은 같은 유전자에서 발현된 같은 형태의 단백질 중 전사 후 변형(post-transcriptional modification), 번역 후 변형(post-translational modification) 및 세포의 차이에 의해 목적했던 형태와는 약간의 다른 형태를 가진 단백질을 의미한다. 이러한 아형의 형태는 본래 단백질의 기능과 목적에 따라 제품 관련 물질(product-related substance) 또는 제품 관련 불순물 (product-related impurity)로 분류될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “항체 아형(isoform)”은 상기 “아형”에 관해 설명된 단백질 중 항체로 제한한 것을 의미한다.
현재까지 알려진 항체의 번역 후 변형(post-translational modification)의 원인은 아래와 같다.
항체의 번역 후 변형의 원인
응집(aggregation) 분절(fragmentation)
구조 변화(conformation variant) 당화반응(glycation)
C-말단 라이신 변화
(C-terminal lysine variant)		 당화(glycosylation)
탈아민화(deamidation) 산화(oxidation)
이황화물 결합(disulfide bond) 황화에테르 연결(thioether link)
본 명세서에서 사용되는 용어 "불순물"은 목적하는 단백질 이외의 물질이면 어떠한 물질이어도 포함되며, 불순물의 예로서는 약효가 없는 단백질 아형(isoform), 단백질 다량체(aggregate), 단백질 분절체(fragment), DNA 오염물, 바이러스, 단백질 A (칼럼으로부터 용출됨), 숙주세포 유래 단백질(Host cell protein), 내독소, 배지 성분인 Hy-Fish (FL), IGF 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 본 발명에 따른 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 항체 아형을 효과적으로 분리할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 동물세포 배양으로부터 유전자 재조합 기술로 생산된 항체를 고순도로 분리하여 제조하는데 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 약한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 항체의 정제 단계를 도시한 것이다.
도 2a 내지 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 A 완충액(20mM NaPhosphate, pH 6.0)과 B 완충액(20mM NaPhosphate, pH 8.0)의 비율을 달리하여 단일 단계 구배 세척에 의한 크로마토그램을 도시한 것이다. 도 2a는 70:30, 도 2b는 65:35, 도 2c는 60:40의 단일 단계 구배 세척에 의해 각각 생성되었다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 강한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 항체의 정제 단계를 도시한 것이다.
도 4a 내지 4f는 본 발명의 일 실시예에 따른 표 4의 세척 완충액 조건을 각각 적용한 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 약한 양이온 교환 크로마토그래피에서 선형 농도 구배를 이용한 항체의 정제 단계를 도시한 것이다.
도 6a 및 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 pH에 대한 선형 농도 구배, 염 농도에 대한 선형 농도 구배를 각각 적용한 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 약한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 항체의 정제 단계를 도시한 것이다.
도 8a 및 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 50mM NaAcetate, 43mM NaCl, pH 6.0과 pH 6.1 세척 완충액을 각각 적용한 크로마토그램을 도시한 것이다.
이하, 실시 예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용한 항- EGFR 단일클론항체의 정제
첫 번째 단계에서 항-EGFR 단일 클론 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질 A 컬럼으로부터 용출은 산성 조건에서 (50mM 아세트산 나트륨, 60mM 염화 나트륨 완충제, pH 3.5 ± 0.05) 하에서 수행하였다. 여과 전에 1M 트리스 완충액을 사용하여 pH를 5.0으로 적정하였고 물로 희석하여 전도도를 2 mS/cm 이하로 희석하였다. 단백질 A 용출액은 0.3 - 10 mg/ml의 단백질 농도를 갖고 있으며 아세트산 나트륨과 트리스로 완충시키고 물로 희석된 용액이다. 이하, 상기 물질은 양이온 교환 크로마토그래피에 적재하기 위해 제조된, 조절된 단백질 A 용출액으로 지칭된다.
실시예 2: 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 항- EGFR 단일클론항체 아형( isoform )의 분리
2-1. 약한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 항- EGFR 단일클론항체 아형의 분리
실시예 1과 같은 방법으로 조절된 단백질 A 용출액을 약한 양이온 교환 크로마토그래피 수지(CM Sepharose Fast Flow, GE Healthcare)에 적재하여 항-EGFR 단일클론항체(pI: 7.9-8.8)의 여러 아형을 분리하였다.
* 크로마토그래피 조건:
- 수지: CM Sepharose Fast Flow
- 유속: 200cm/h
- 평형: 20mM NaAcetate, pH 5.0 완충액
- 적재: 최대 20g 단백질/L 수지 부피
- 멸균: 1M NaOH 용액
- 재생: 20mM NaPhosphate, 1000mM NaCl, pH 7.0 완충액
- 세척: 단일 단계 구배
- 용출: 50mM NaAcetate, 100mM NaCl, pH 5.5
도 1의 절차에 따라 실험이 진행되었다. 조절된 단백질 A 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재하였고, 컬럼에 결합된 단일 클론 항체는 세 가지 단일 단계 구배 방법으로 12 컬럼 부피만큼 세척하였다. 용출은 자외선이 100mAU로 올라갔을 때 제품을 수집하기 시작하여 50mAU만큼 떨어졌을 때 수집을 완료하였다.
세척은 A 완충액(20mM NaPhosphate, pH 6.0)과 B 완충액(20mM NaPhosphate, pH 8.0)의 비율을 달리하여 단일 단계로 구배를 주어 세척하는 방식을 도입하였다. A 완충액: B 완충액의 비율은 각각 70:30, 65:35와 60:40으로 주어 세척하였다.
70:30의 단일 단계 구배 세척에 의해 도 2a의 크로마토그램이, 65:35와 60:40에 의해 도 2b와 도 2c가 각각 생성되었다. 크로마토그램을 보면 세척 단계에서 자외선이 올라가는 현상을 볼 수 있는데, 양이온 교환 수지에 약하게 붙어 있던 아형(isoform)들이 떨어져 나가는 현상으로 유추할 수 있다.
70:30, 65:35와 60:40의 단일 단계 구배 세척 후, 용출에 의해 분리된 단일 클론 항체는 CEX-HPLC에 의해 분석되었으며, 이 중 Fab 부분의 당체는 LC/MS를 이용한 intact mass 분석이 이루어졌다. 그 결과는 아래 표 2 및 3과 같다.
단일 단계 구배 세척에 의한 수율과 CEX-HPLC 분석 결과
분석 샘플 수율 (%) Acidic peak %
(peak 1+2+3)
조절된 단백질 A 용출액 N/A 39.48%
단일 단계 구배
(A 완충액:
B 완충액)		 70:30 70.49% 29.18%
65:35 50.37% 14.82%
60:40 33.90% 4.06%
Figure 112014101795192-pat00001
표 2에서 CEX-HPLC 분석 결과를 보면 양이온 교환 크로마토그래피의 적재 전 물질의 아형 중 산성을 띄고 있는 부분이 세척 완충액의 pH에 의해 분리되는 현상을 볼 수 있다. 이러한 아형이 유래된 원인을 파악하기 위해 LC/MS로 Fab 부분을 intact mass로 분석해 본 결과(표 3), Fab가 가지고 있는 당체에서 NGNA(N-Glycolylneuraminic acid)가 포함된 부분이 세척에 의해 제거된 후 용출된 결과를 볼 수 있다. NGNA는 구조적으로 음전하를 가지고 있기 때문에 CEX-HPLC에 의해 분석된 산성 부분이 이러한 NGNA를 포함하는 아형을 포함하고 있다는 것을 유추할 수 있다.
2-2. 강한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 항- EGFR 단일클론항체 아형의 분리
실시예 1과 같은 절차로 제조된 조절된 단백질 A 용출액을 강한 양이온 교환 크로마토그래피 수지(Capto S, GE Healthcare)에 적재하여 항-EGFR 단일클론항체(pI: 7.9-8.8)의 여러 아형을 분리하였다.
* 크로마토그래피 조건:
- 수지: Capto S
- 유속: 300cm/h
- 평형: 50mM NaAcetate, pH 5.5 완충액
- 적재: 최대 10g 단백질/L 수지 부피
- 멸균: 1M NaOH 용액
- 재생: 20mM NaPhosphate, 1000mM NaCl, pH 7.0 완충액
- 세척: 표4 참조
- 용출: 50mM NaAcetate, 100mM NaCl, pH 5.5
도 3의 절차에 따라 실험이 진행되었다. 조절된 단백질 A 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재하였고, 컬럼에 결합된 단일 클론 항체는 세 가지 세척 조건으로 5와 12 컬럼 부피만큼 각각 세척하였다. 용출은 자외선이 50mAU로 올라갔을 때 제품을 수집하기 시작하여 100mAU만큼 떨어졌을 때 수집을 완료하였다.
세척 완충액 조건과 세척 부피
실험 번호 세척 조건 세척 부피 (컬럼 부피)
CS1E 20mM NaPi, pH 7.14 5
CS2E 10
CS3E 25mM NaPi, pH 6.9 5
CS4E 10
CS5E 25mM NaPi, pH 7.0 5
CS6E 10
CS1E부터 CS6E의 6가지 실험 조건에 의해 도 4a부터 도 4f까지의 크로마토그램이 각각 생성되었다. 크로마토그램을 보면 실시예1처럼 세척 단계에서 자외선이 올라가는 현상을 볼 수 있는데, 마찬가지로 양이온 교환 수지에 약하게 붙어 있던 아형(isoform)들이 떨어져 나가는 현상으로 유추할 수 있다.
각각의 실험 단계에서 세척 후, 용출에 의해 분리된 단일 클론 항체는 CEX-HPLC에 의해 아형의 분리에 대해 분석되었다.
단일 단계 구배 세척에 의한 수율과 CEX-HPLC 분석 결과
분석 샘플 수율 (%) Acidic peak %
(peak 1+2+3)
조절된 단백질 A 용출액 N/A 25.20%
세척 조건
(세척 부피)		 20mM NaPi, pH 7.14 (5CV) 69.68% 14.48%
20mM NaPi, pH 7.14 (10CV) 40.76% 5.32%
25mM NaPi, pH 6.9 (5CV) 65.66% 12.66%
25mM NaPi, pH 6.9 (10CV) 42.83% 6.54%
25mM NaPi, pH 7.0 (5CV) 45.43% 11.44%
25mM NaPi, pH 7.0 (10CV) 19.19% 5.37%
표 5에서 CEX-HPLC 분석 결과를 보면 양이온 교환 크로마토그래피의 적재 전 물질의 아형 중 산성을 띄고 있는 부분이 세척 완충액의 조건과 흘려준 세척 부피에 따라 분리되는 현상을 볼 수 있으며 그에 따라 낮아진 수율을 알 수 있다. 따라서, 실시예 2-1과 2-2에 의해 양이온의 세기와 관계없이 항체의 아형이 세척 조건에 따라 조절되어 분리될 수 있음을 알 수 있다.
2-3. 약한 양이온 교환 크로마토그래피에서 선형 농도 구배를 이용한 항-EGFR 단일클론항체 아형의 분리
실시예 1과 같은 방법으로 조절된 단백질 A 용출액을 약한 양이온 교환 크로마토그래피 수지(CM Sepharose Fast Flow, GE Healthcare)에 적재하여 항-EGFR 단일클론항체(pI: 7.9-8.8)의 여러 아형을 분리하였다.
* 크로마토그래피 조건:
- 수지: CM Sepharose Fast Flow
- 유속: 200cm/h
- 평형: 20mM NaAcetate, pH 5.0 완충액
- 적재: 20g 단백질/L 수지 부피
- 멸균: 1M NaOH 용액
- 재생: 20mM NaPhosphate, 1000mM NaCl, pH 7.0 완충액
- 용출 1: 선형 농도 구배 (표 6 참고)
- 용출 2: 50mM NaAcetate, 100mM NaCl, pH 5.5
도 5의 절차에 따라 실험이 진행되었다. 조절된 단백질 A 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재하였고, 컬럼에 결합된 단일 클론 항체는 두 가지 선형 농도 구배 방법으로 20 컬럼 부피만큼 첫 번째 용출을 하였다. 그리고 첫 번째 용출 후 남아있는 단일 클론 항체를 수집하기 위해 평형 후 두 번째 용출을 진행하였다. 두 번째 용출은 첫 번째 용출 정도에 따라 선택적으로 진행할 수 있다.
첫 번째 용출은 A 완충액의 비중은 점점 낮추고 B 완충액의 비중은 점점 높이는 선형 농도 구배를 주는 방식을 도입하였다. 여기서 선형 농도 구배는 pH에 대한 선형 농도 구배와 염농도에 대한 선형 농도 구배를 주는 두 가지 방식으로 실험이 진행되었다. 사용된 용출액은 아래 표 6과 같다.
선형 농도 구배에 이용된 완충액
선형 농도 구배 방식 A 완충액 B 완충액
pH 선형 농도 구배
(pH 6.0 - 8.0)		 20mM NaPi, pH 6.0 20mM NaPi, pH 8.0
염농도 선형 농도 구배
(NaCl 50 - 200mM)		 20mM NaAcetate,
50mM NaCl, pH 5.0		 20mM NaAcetate,
200mM NaCl, pH 5.0
pH에 대한 선형 농도 구배에 의해 도 6a의 크로마토그램이, 염농도에 대한 선형 농도 구배에 의해 도 6b가 각각 생성되었다. 크로마토그램을 보면 첫 번째 용출 단계에서 pH 또는 염농도가 조금씩 올라가면서 자외선이 올라가는 현상을 볼 수 있는데, 시간상 먼저 용출되는 단백질의 경우 양이온 교환 수지에 약하게 붙어 있던 아형(isoform)들이 떨어져 나가는 현상으로 유추할 수 있다.
pH와 염 농도 선형 농도 구배 용출 후, 용출액은 각각 5mL씩 나누어 수집하였고 pH에 대한 선형 농도 구배 용출액은 A8번부터 B10번까지 8개의 용출 부분액으로 염농도에 대한 선형 농도 구배 용출액은 C4번부터 C9번까지 6개의 용출 부분액으로 각각 나누어 받았다. 각각의 용출 부분액에 포함된 항체의 Fab 부분의 당체는 LC/MS를 이용한 intact mass 분석이 이루어졌다. 그 결과는 아래 표 7 및 8과 같다.
Figure 112014101795192-pat00002
Figure 112014101795192-pat00003
실시예 2-1과 같이 전하가 다른 아형이 유래된 원인은 항체의 Fab 가 가지고 있는 당체에서 NGNA(N-Glycolylneuraminic acid)가 포함된 부분인 것을 알 수 있으며, 표 7 및 8에서 선형 농도 구배 용출 부분액 중 먼저 용출된 용출 부분액의 NGNA 비율이 더 높은 것을 알 수 있다. 이는 pH와 염 농도 선형 구배가 비슷한 경향성을 가지고 있으며 이러한 방법으로 우리가 원하는 만큼의 항체 아형을 분리할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 항- CD20 단일클론항체 아형( isoform )의 분리
항-CD20 단일클론 항체(pI: 9.4-9.6)를 실시예 1과 같은 방법으로 조절된 단백질 A 용출액을 제조하여 양이온 교환 크로마토그래피 수지(CM Sepharose Fast Flow, GE Healthcare)에 적재하여 항-CD20 단일클론 항체의 아형을 분리하였다.
* 크로마토그래피 조건:
- 수지: CM Sepharose Fast Flow
- 유속: 300cm/h
- 평형: 50mM NaAcetate, pH 5.0 완충액
- 적재: 7.5g 단백질/L 수지 부피
- 멸균: 1M NaOH 용액
- 재생: 20mM NaPhosphate, 1000mM NaCl, pH 5.5 완충액
- 세척: 50mM NaAcetate, 43mM NaCl, pH 6.0과 pH 6.1 완충액
- 용출: 50mM NaPi, 50mM NaCl, pH 7.4
도 7의 절차로 실험이 진행되었다. 조절된 단백질 A 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재하였고, 컬럼에 결합된 단일 클론 항체는 평형 완충액으로 6 컬럼 부피만큼 흘려준 후, 10 컬럼 부피만큼 세척 완충액으로 세척, 다시 평형 완충액으로 6 컬럼 부피만큼 흘려주었다. 용출은 자외선이 40mAU로 올라갔을 때 제품을 수집하기 시작하여 40mAU만큼 떨어졌을 때 수집을 완료하였다. 여기서, 세척 완충액은 조성은 같지만 pH가 각각 다른 6.0과 6.1의 두 종류를 사용하여 결과를 비교해 보았다. 결과는 해당 용출액을 CEX-HPLC를 이용하여 각각의 아형을 분석하였다.
세척에 의한 수율과 CEX-HPLC 결과 분석
샘플 수율
(%)		 Area of peak (%)
PEAK
1		 PEAK
2		 PEAK
3		 PEAK
4		 PEAK
5		 PEAK
6		 PEAK
7		 PEAK
8		 Acidic
peaks		 Main
peaks		 Basic
peaks
적재
용액		 N/A 8.38 5.76 68.58 8.08 5.58 1.78 1.45 0.41 14.14 68.58 17.3
용출액
1		 83.22 5.86 5.86 71.56 9.29 4.33 1.74 0.99 0.37 11.72 71.56 16.72
용출액
2		 67.10 3.84 4.76 72.12 9.65 5.95 2.11 1.17 0.41 8.6 72.12 19.29
Acidic peaks = Peak 1 + 2, Basic peaks = Peak 4 + 5 + 6 + 7 + 8
각각의 용출액을 분석해 본 결과 (표 9), 같은 조성에서 pH 6.1으로 세척 후 용출한 용출액 2는 pH 6.0으로 세척 후 용출한 용출액 1보다 더 적은 산성 아형을 가진 것으로 나타났으며, 마찬가지로 용출액 1 또한 적재된 단백질 용액보다 더 적은 산성 아형을 가진 것으로 나타났다.
도 8a와 8b를 보면 세척 과정에서 자외선 수치가 올라가는 것을 볼 수 있는데, 이 과정에서 산성(acidic) 아형이 컬럼에서 분리되어 떨어져 나온 것으로 유추할 수 있으며 그만큼 수율 또한 낮아진 것을 알 수 있다.

Claims (10)

  1. 하기 단계를 포함하는 항체의 산성 아형(acidic isoform)을 분리하는 방법:
    a) 항체 및 항체의 산성 아형을 함유하는 시료를 pH 8.5 이하 및 농도 20 내지 100 mM인 평형 용액(equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography) 컬럼에 7.5 내지 20.0 g 단백질/L 수지 부피로 적재하는 단계;
    b) pH가 상기 항체의 pI 보다 1.0 이상 낮고 상기 평형 용액 pH 보다 높고, 염 농도가 10 내지 300 mM인 세척 용액(washing buffer)을 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재하고 단일 단계 구배 방식으로 세척하여, 항체의 산성 아형이 상기 컬럼으로부터 분리되게 하는 단계; 및
    c) pH가 상기 평형 용액 pH 이상이고 상기 세척 용액 pH 미만이고, 농도가 20 내지 150 mM인 용출 용액(elution buffer)을 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재하여 그 컬럼으로부터 목적 항체를 회수하는 단계.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 b)에서 세척 용액의 전도도는 0.5 내지 50 mS/cm임을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 a)의 항체 함유 시료는 적재 전에 0.1 mS/cm 내지 10 mS/cm의 전도도로 조절됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단계 a) 이전 또는 상기 단계 c) 이후에 항체 함유 시료를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(protein A affinity chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography) 및 혼합 모드 크로마토그래피(mixed mode chromatography)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 크로마토그래피에 적재하여 정제하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 세척 용액은 시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 트리스(Tris), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항, 제3항, 제5항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항의 방법을 이용한 정제 공정을 포함하는 항체 제제의 제조 방법.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR111465A1 (es) * 2017-04-14 2019-07-17 Cj Healthcare Corp Método para la purificación de anticuerpos análogos por el uso de cromatografía de intercambio de cationes
CN110128538B (zh) * 2018-02-09 2022-08-26 鲁南制药集团股份有限公司 一种纯化抗cd20人鼠嵌合单克隆抗体的方法
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CN111072766B (zh) * 2019-12-30 2022-02-22 北京博康健基因科技有限公司 rhPTH(1-34)脱酰胺杂质、其制备方法及应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ507557A (en) * 1998-05-06 2003-10-31 Genentech Inc Protein purification by ion exchange chromatography
TWI320788B (en) 2005-05-25 2010-02-21 Hoffmann La Roche Method for the purification of antibodies
CA2673771A1 (en) * 2007-01-17 2008-07-24 Merck Serono S.A. Process for the purification of fc-containing proteins
ES2666170T3 (es) 2007-10-30 2018-05-03 Genentech, Inc. Purificación de anticuerpos mediante cromatografía de intercambio catiónico
EP2480561B1 (en) 2009-09-23 2016-07-13 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Cation exchange chromatography
CA2820095C (en) * 2010-12-21 2019-02-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Isoform enriched antibody preparation and method for obtaining it
KR101498771B1 (ko) 2011-12-15 2015-03-09 한화케미칼 주식회사 항체의 정제 방법

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