WO2021210662A1 - タンパク質製剤原薬の着色除去方法 - Google Patents

タンパク質製剤原薬の着色除去方法 Download PDF

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野崎　晋也
尚紀 有馬
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小野薬品工業株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for removing coloration of a drug substance solution of a protein preparation and the solution produced in a manufacturing process including the method.
  • the prescription form adopted for antibody drugs the prescription form by subcutaneous injection is often selected because of the burden on the patient and its convenience.
  • subcutaneous administration it is naturally required to increase the concentration of the drug due to the limit of the dose, and in particular, in the case of antibody drugs, there are some problems caused by it.
  • One of them is the coloring of the drug substance solution
  • the European Pharmacopoeia requires that the color of the drug substance solution be colorless or slightly colored.
  • the coloring of the drug substance solution may indicate the presence of impurities and the non-uniformity of the drug substance associated therewith, and it cannot be denied that the performance of the drug substance may deteriorate or the efficacy or safety may be affected ().
  • One of the causes of such coloring is the culture environment of the producing cells.
  • CHO cells which are widely used for antibody production, are cultured under high oxygen and high glucose culture conditions, the proteins produced are exposed to a significant oxidation and glycation environment, and advanced glycation end products (AGEs: A) are exposed.
  • AGEs: A advanced glycation end products
  • dvanced G lycation E nd products is formed, a portion of which is reported to be the cause of coloring (non-Patent documents 3, 4 and 5).
  • it has also been reported that such advanced glycation end products can cause a decrease in the effectiveness of protein drugs, and removal of the causative substance from the colored drug substance solution maintains the quality and performance of the drug. Is important to.
  • An object of the present invention is to provide a method for removing coloration of a drug substance solution of a protein preparation and the solution produced in a manufacturing process including the method.
  • the present inventors have found a method for removing a substance causing coloring of the drug substance solution by ion exchange chromatography, and completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • [1] A method for separating a protein non-colored product from a solution containing the protein non-colored product and the protein colored product.
  • (I) A step of charging the solution onto an ion exchange carrier column and binding the protein non-colored product and the protein colored product to the ion exchange carrier using an equilibration buffer having a predetermined initial pH.
  • (Ii) An elution buffer that forms a pH gradient that fluctuates from the initial pH to the final pH under predetermined conditions for separating the non-colored protein and the colored protein, and the elution buffer at a predetermined flow rate.
  • the separation method comprising a step of flowing into an exchange carrier column and (iii) a step of separating a predetermined fraction containing a protein non-colored substance eluted by the step (iii); [2] A method for separating a protein non-colored product from a solution containing the protein non-colored product and the protein colored product.
  • the separation method comprising the step of recovering the fraction containing the protein non-colored substance that flows through as it is in the step (ii);
  • the color concentration of the solution containing the non-colored protein and the colored protein or the concentrated solution thereof is (1) the comparative standard in item 2.65 "comparative test method of color" in the general test method of the 17th revised Japanese Pharmacy.
  • UV absorption detection peak area of 280 nm wavelength calculated based on UV absorption measurement and fluorescence spectrum measurement of the solution or its concentrate (hereinafter referred to as , "UV 280 " may be abbreviated) for the fluorescence intensity detection peak area (however, the excitation wavelength is 380 nm and the detection wavelength is 560 nm. Hereinafter, this is abbreviated as "Em560 (ex380)”.
  • the value obtained by multiplying the ratio of Separation method [4] The separation method according to any one of the above items [1] to [3], wherein the ion exchange carrier is an anion exchange carrier; [5] The separation method according to any one of the above items [1] to [4], wherein the ion exchange carrier or the anion exchange carrier is in the form of small particles, a membrane or a monolith; [6] The separation method according to the preceding item [4] or [5], wherein the anion exchange carrier is a strong anion exchange carrier, a weak anion exchange carrier, or a multimode / anion exchange carrier; [7] The separation method according to the preceding item [4] or [5], wherein the anion exchange carrier is a weak anion exchange carrier or a multimode anion exchange carrier; [8] The weak anion exchange carrier is Fractogel (registered trademark) EMD DEAE, Fractogel (registered trademark) EMD DMAE, Capto (registered trademark) DEAE, DEAE
  • the strong anion exchange carrier is Fractogel (registered trademark) EMD TMAE (M), Fractogel (registered trademark) EMD TMAE Medcap (M), Fractogel (registered trademark) EMD TMAE Hicap (M), Eshmuno (registered trademark).
  • the total concentration of the protein non-colored product and the protein colored product charged into the ion exchange carrier column is about 2 to about 50 mg / mL (preferably about 10 to about 30 mg / mL).
  • the total loadings of the protein non-colored product and the protein colored product charged into the ion exchange carrier column are about 10 mg / mL, about 20 mg / mL, about 30 mg / mL, and about 40 mg / mL.
  • the separation method is any pH in the range of about 4.0 to about 8.2 (specifically, about 4.0, about 4.2, about 4.4, about 4.6, about 4.8, about 5.0, about 5.2, about 5.4, about.
  • any one selected from the group consisting of 5.6, about 5.8, about 6.0, about 6.2, about 6.4, about 6.6, about 6.8, about 7.0, about 7.2, about 7.4, about 7.6, about 7.8, about 8.0 and about 8.2. pH (However, the initial pH is 1.0 or more higher than the final pH.)
  • the separation method according to any one of the above is a buffer having the initial pH (hereinafter, may be abbreviated as "buffer A”) and a buffer having the final pH (hereinafter, abbreviated as "buffer B").
  • buffer A a buffer having the initial pH
  • buffer B a buffer having the final pH
  • the buffer A and / or buffer B is MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, TAPSO, POPSO, HEPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS, CHES.
  • the buffer A is Thermo Scientific® CX-1 pH Gradient Buffer B (pH 10.2)
  • the buffer B is Thermo Scientific® CX-1 pH Gradient Buffer A (pH 5.6).
  • the ratio (%) of B can be any ratio in the range of about 0.5% to about 5% (specifically, about 0.5%, about 1%, about 1.5%, about 2%, about 2.5%, about 3%). , About 3.5%, about 4%, about 4.5%, and any ratio selected from the group consisting of about 5%). Separation method according to any one item; [30] Arbitrary column capacitance in the range of about 1 to about 20 CV (specifically, about 1 CV, about 2 CV, about 3 CV, about 4 CV, about 5 CV, about 6 CV).
  • Arbitrary values in the range of about 0.1 to about 1.0 (specifically, a group consisting of about 0.1, about 0.2, about 0.3, about 0.4, about 0.5, about 0.6, about 0.7, about 0.8, about 0.9 and about 1.0.
  • Arbitrary column capacity in the range of about 20 to about 50 CV specifically, about 20 CV, about 25 CV, about 30 CV, about 35 CV, about 40 CV, about 45 CV).
  • a stepwise gradient performed by decreasing by a step any value selected from the group consisting of about 0.2, about 0.3, about 0.4, about 0.5, about 0.6, about 0.7, about 0.8, about 0.9 and about 1.0).
  • Any column capacity specifically, about 20 CV, about 25 CV, about 30 CV, about 35 CV, about 40 CV, about 45 CV with the pH gradient in the range of about 20 to about 50 CV.
  • any column volume selected from the group consisting of about 50 CV which is a linear gradient performed by continuously lowering the pH of the elution buffer, according to the preceding paragraphs [23] to [28].
  • the ratio (%) of the buffer B is set to at least an arbitrary ratio in the range of about 10 to about 100% (specifically, about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about). Any percentage from about 30% to about 100% (preferably any percentage selected from the group consisting of 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90% and about 100%).
  • the separation method according to any one of the preceding paragraphs [29], [31] and [33], which is continuously increased; [36]
  • the percentage (%) of buffer B in the elution buffer is at least about 50-100% at intervals corresponding to any column volume where the pH gradient is (a) in the range of about 4 to about 6 CV. It is carried out by stepwise increasing in arbitrary proportions in the range of about 1 to about 2% over the range of, or (b) in the range corresponding to the column capacity of about 30 to about 40 CV.
  • the linear flow velocity of the elution buffer and the equilibrium buffer according to the previous item [2] is any linear flow velocity in the range of about 100 to about 800 cm / h (specifically, about 100 cm / h, respectively.
  • the electrical conductivity of the equilibrium buffer and / or elution buffer according to the previous item [1] is any electrical conductivity (preferably about 2 to about 15 mS / cm) in the range of about 1 to about 20 mS / cm. Any electrical conductivity in the cm range, specifically about 2 mS / cm, about 3 mS / cm, about 4 mS / cm, about 5 mS / cm, about 6 mS / cm, about 7 mS.
  • the electrical conductivity of the equilibrium buffer according to the previous item [2] is arbitrary in the range of about 1 to about 20 mS / cm (preferably in the range of about 2 to about 15 mS / cm).
  • it is about 2 mS / cm, about 3 mS / cm, about 4 mS / cm, about 5 mS / cm, about 6 mS / cm, about 7 mS / cm, about 8 mS. Selected from the group consisting of / cm, about 9 mS / cm, about 10 mS / cm, about 11 mS / cm, about 12 mS / cm, about 13 mS / cm, about 14 mS / cm and about 15 mS / cm.
  • the pH of the equilibration buffer according to the previous item [2] is any pH in the range of about 9.2 to about 7.4 (specifically, about 9.2, about 9.0, about 8.8, about 8.6, about 8.4, about 8.2). , About 8.0, about 7.8, about 7.6 and about 7.4, preferably any pH in the range of about 8.2 to about 7.8), according to the preceding paragraphs [2] to [16] and [39].
  • the protein concentration of the concentrate is above an arbitrary concentration in the range of about 50 to about 100 mg / mL (specifically, about 50 mg / mL, about 60 mg / mL, about 70 mg / mL, Any one of the preceding paragraphs [3] and [43] to [47], which is at least one concentration selected from the group consisting of about 80 mg / mL, about 90 mg / mL and about 100 mg / mL).
  • the described separation method [49] Any one of the above items [1] to [48], wherein the protein concentration in the fractionated or recovered protein uncolored fraction is an arbitrary concentration in the range of about 20 to about 300 mg / mL.
  • the bispecific antibody is abbreviated as "anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody", which can specifically bind to PD-1 and CD3, respectively.
  • the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody is the PD-1 / CD3 bispecific antibody disclosed in the patent application specification specified by WO2019 / 156199, supra [54]. Described separation method;
  • the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody constitutes a heavy chain and a light chain constituting an antigen-binding site that specifically binds to PD-1, and an antigen-binding site that specifically binds to CD3.
  • the heavy chain in the heavy chain and the light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to PD-1 is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,
  • the heavy and light chains consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 and constituting the antigen-binding site that specifically binds to (b) CD3 are the heavy chains of SEQ ID NO: 6.
  • C Heavy chains and light chains that make up an antigen-binding site that specifically binds to PD-1 and heavy chains that make up an antigen-binding site that specifically binds to the light chain and CD3.
  • the light chain in the light chain are both the bispecific antibody consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (hereinafter, one or more of these bispecific antibodies are collectively referred to as "anti-PD-1 / CD3".
  • anti-PD-1 / CD3 the bispecific antibody consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • anti-PD-1 / CD3 the bispecific antibody consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • the heavy chain constant region of each heavy chain and light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to PD-1 according to the preceding item [56] or [57] is SEQ ID NO: 8, respectively. , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, which are replaced with a heavy chain constant region consisting of any one of the amino acid sequences, according to the above item [56] or [57].
  • the heavy chain constant regions of the heavy chain and the light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to CD3 are SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 17, respectively.
  • the separation method according to the preceding item [56] or [57], which is substituted with a heavy chain constant region consisting of any one of the amino acid sequences selected from 18 and SEQ ID NO: 19 (hereinafter, the above item [56] or [57].
  • the two heavy chain constant regions of the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A of the above are collectively referred to as one or more of the bispecific antibodies in which the heavy chain constant regions of this section are substituted, respectively. It may be abbreviated as "anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody B”.);
  • [59] A method for separating a protein non-colored product from a solution containing the protein non-colored product and the protein colored product.
  • the separation method is (I) A step of charging the solution into an anion exchange carrier column and binding the protein non-colored product and the protein colored product to the anion exchange carrier using an equilibrium buffer having a predetermined initial pH. (Ii) An elution buffer that forms a pH gradient that drops from the initial pH to the final pH under predetermined conditions for separating the non-colored protein and the colored protein is applied to the yin at a predetermined flow rate. It comprises a step of flowing it through an ion exchange carrier column and (iii) a step of separating a predetermined fraction containing a protein non-colored substance eluted by the step (iii).
  • the protein consists of a heavy chain and a light chain constituting an antigen-binding site that specifically binds to PD-1, and a heavy chain and a light chain constituting an antigen-binding site that specifically binds to CD3.
  • the heavy chain and the light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to PD-1 are selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
  • the heavy chain in the heavy chain and light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to CD3 is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and (c).
  • the light chain in the heavy chain and the light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to PD-1 and the light chain in the heavy chain and the light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to CD3 A bispecific antibody consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, which specifically binds to PD-1 and CD3, respectively.
  • the anion exchange carrier is Toyopearl (registered trademark) NH2-750F.
  • the initial pH of the equilibration buffer and the elution buffer is an arbitrary pH in the range of about 10.6 to about 8.4, and the final pH of the elution buffer is an arbitrary pH in the range of about 7.0 to about 4.0 (however, the said).
  • the initial pH is 2.0 or more higher than the final pH.
  • the percentage (%) of buffer B in the elution buffer is at least about 50-100% at intervals corresponding to any column volume where the pH gradient is (a) in the range of about 4 to about 6 CV.
  • the pH in the elution buffer is either carried out by stepwise increasing by about 1 to about 2% over the range of (b) or in the range corresponding to a column volume of about 30 to about 40 CV. By stepping down any pH in the range of about 0.6 to about 1.0, (6)
  • the linear flow velocity of the elution buffer is an arbitrary linear flow velocity of about 100 to about 800 cm / h, and (7) the color concentration of the solution containing the fractionated protein non-colored material is (i).
  • the separation method which is about 6.3 or less; [60] A method for separating a non-protein color from a solution containing the non-protein color and the non-protein color.
  • the separation method is (I) The step of charging the solution into the anion exchange carrier column, (Ii) A step in which the protein colorant in the solution binds to the anion exchange carrier and an equilibrium buffer prepared so as not to bind the protein non-colorant is allowed to flow through the anion exchange carrier column at a predetermined flow rate.
  • the protein consists of a heavy chain and a light chain constituting an antigen-binding site that specifically binds to PD-1, and a heavy chain and a light chain constituting an antigen-binding site that specifically binds to CD3.
  • the heavy chain and the light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to PD-1 are selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
  • the heavy chain in the heavy chain and light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to CD3 is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and (c).
  • the light chain in the heavy chain and the light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to PD-1 and the light chain in the heavy chain and the light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to CD3 A bispecific antibody consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, which specifically binds to PD-1 and CD3, respectively.
  • the anion exchange carrier is Toyopearl (registered trademark) NH2-750F.
  • the pH of the equilibration buffer is any pH in the range of about 8.2 to about 7.8, and the electric conductivity is any electric conductivity of about 5 to about 7 mS / cm.
  • the linear velocity of the equilibration buffer is any linear velocity in the range of about 100 to about 400 cm / h, and (6) the color concentration of the solution containing the fractionated protein non-colored material is (I) In a visual comparison test with the comparative standard solution BY5, Em / UV * of a solution containing a protein non-colored product that is substantially the same as or thinner than the BY5, or (ii) fractionated protein non-colored product.
  • the separation method where the 100 value is about 6.3 or less;
  • [3-1] A pharmaceutical composition containing the solution according to any one of the preceding paragraphs [2-1] to [2-13]; and [4-1] autoimmune disease or graft-versus-host disease (GVHD) or Use of the pharmaceutical composition according to the preceding paragraph [3-1] in the prevention, suppression of symptom progression, suppression of recurrence and / or treatment of blood cancer.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody is fractionated by strong cation exchange chromatography, the fractionated fraction is concentrated to 100 mg / mL, and the high-colored fraction and the low-colored fraction are mixed and compared.
  • the X-axis is the flow rate (mL)
  • the Y-axis is the UV absorption detection peak area (UV 280 ) and fluorescence intensity detection peak area (Em560 (ex380)) multiplied by 10 (UV 280 x 10, Em560 (UV 280 x 10, Em560). Ex 380) ⁇ 10) are represented respectively.
  • the solid line represents the UV detection chromatogram (UV280_BY3.5), and the broken line represents the fluorescence detection chromatogram (Fluorescene_BY3.5).
  • the arrow indicates the peak of the target object.
  • the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody is fractionated by strong cation exchange chromatography, the fractionated fraction is concentrated to 100 mg / mL, and the high-colored fraction and the low-colored fraction are mixed and compared. Represents a chromatogram of reverse phase HPLC analysis of samples prepared to correspond to standard solution BY6.0.
  • the X-axis is the flow rate (mL), and the Y-axis is the UV absorption detection peak area (UV 280 ) and fluorescence intensity detection peak area (Em560 (ex380)) multiplied by 10 (UV 280 x 10, Em560 (UV 280 x 10, Em560). Ex 380) ⁇ 10) are represented respectively.
  • the solid line represents the UV detection chromatogram (UV280_BY6.0), and the broken line represents the fluorescence detection chromatogram (Fluorescene_BY6.0).
  • the arrow indicates the peak of the target object.
  • Comparative standard solutions BY3.5, BY4, BY4.5, BY5, BY6 prepared by mixing high-colored fractions and low-colored fractions of anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody concentrated to 100 mg / mL.
  • the results of HPLC analysis of each control sample are shown.
  • the horizontal axis represents the number of the comparative standard solution
  • the vertical axis represents the Em / UV * 100 value
  • the numerical value at the top of each vertical bar graph represents the Em / UV * 100 value of each comparative standard solution.
  • the sample used for the separation operation is an antibody.
  • the X-axis represents the amount of liquid flowing (mL)
  • the Y-axis on the left represents the UV absorption detection peak area (UV 280 )
  • the Y-axis on the right represents the value obtained by multiplying the electrical conductivity (mS / cm) by 10.
  • the Y-axis on the right side also serves as the notation of the ratio (% B) of the liquid feed amount at B among the two mobile phase liquid feed pumps A and B.
  • the black solid line represents the UV detection chromatogram (UV280)
  • the broken line represents the electrical conductivity (Conductivity)
  • the gray solid line represents the liquid feeding ratio (% B) by the B pump.
  • the arrows Nos. 1 to 4 indicate the positions of the purified fractions subjected to the coloring analysis.
  • the sample used for the separation operation is an antibody.
  • the X-axis and Y-axis and the solid black line, broken line, and gray line in the figure have the same meanings as in FIG. 4, respectively.
  • the inverted U shape represents the range of recovered fractions that were subjected to analysis after purification.
  • the sample used for the separation operation is an antibody.
  • the X-axis and Y-axis and the solid black line, broken line, and gray line in the figure have the same meanings as in FIG. 4, respectively.
  • the arrows numbered 1 to 5 indicate the positions of the purified fractions subjected to the coloring analysis.
  • Cellufine® MAX IB Represents a pH linear gradient elution chromatogram in Bind-elute mode for anion exchange using a packed column.
  • the sample used for the separation operation is an antibody.
  • the X-axis and Y-axis and the solid black line, broken line, and gray line in the figure have the same meanings as in FIG. 4, respectively.
  • the arrows numbered 1 to 5 indicate the positions of the purified fractions subjected to the coloring analysis.
  • the sample used for the separation operation is albumin (BSA) derived from bovine serum.
  • BSA albumin
  • the X-axis and Y-axis and the solid black line, broken line, and gray line in the figure have the same meanings as in FIG. 4, respectively.
  • the arrows of numbers 1 to 3 indicate the positions of the purified fractions subjected to the coloring analysis.
  • the amino acid sequences of the heavy chain and the light chain are shown.
  • Each amino acid in the heavy chain constant region (the heavy chain constant region in the heavy chain and light chain that constitutes the antigen binding site that specifically binds to PD-1) constituting the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody B. Shows the sequence.
  • Each amino acid sequence of the heavy chain constant region (heavy chain constant region in the heavy chain and light chain constituting the antigen binding site that specifically binds to CD3) constituting the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody B is set. show.
  • the present invention is a method for separating a protein non-colored product from a solution containing the protein non-colored product and the protein colored product.
  • the present invention relates to a separation method (hereinafter referred to as “Bind-Elute method”), which comprises a step of separating a predetermined fraction containing a protein non-colored substance eluted by the step (2).
  • the present invention is a method for separating a protein non-colored product from a solution containing a protein non-colored product and a protein colored product.
  • (3a) also includes a separation method (hereinafter, referred to as “Flow-Through method”) comprising a step of recovering a fraction containing a protein non-colored substance that flows through as it is in the step (2a).
  • the “protein colorant” in the present invention is a modified form of a protein that causes coloring, which is a subject of the present invention, and the protein modification that causes the coloring includes a plurality of types of advanced glycation end products (hereinafter, "" AGEs ”) are mentioned, and the solution containing them exhibits a slight yellow to yellow color depending on the amount of the protein produced.
  • the advanced glycation end product is an irreversible dehydration, condensation, oxidation and / or reduction after the free amino group in the lysine residue of the protein reacts non-enzymatically with a reducing sugar such as glucose or fructose. It is a general term for multiple types of protein modifiers produced by repeating the above reactions.
  • Glucose-derived AGEs glyceraldehyde-derived AGEs, glycolaldehyde-derived AGEs, methylglyoxal-derived AGEs, glyoxal-derived AGEs, and 3-deoxyglucoson-derived AGEs.
  • the formation of various AGEs has been confirmed, and it has been reported that some of them contain modified substances that exhibit yellowish brown fluorescence.
  • the isoelectric point of the protein colorant is in the range of about 5 to about 9.1, and is generally in the range of about 6 to about 7.
  • the "protein non-colored substance” is a protein of interest that is so slight that the protein modification is substantially not generated or the solution thereof is visually recognized as not coloring.
  • the isoelectric point of the non-colored protein is in the range of about 7 to about 9.5, specifically, about 7.0 or more and less than 7.5, about 7.5 or more and less than about 8.0, about 8.0 or more and less than about 8.5. , About 8.5 or more and less than about 9.0 and about 9.0 or more and less than about 9.5.
  • the color concentration of itself or its concentrated solution is described in item 2.65 “Color comparison test method” in the 17th revised Japanese Pharmacopoeia general test method. In a visual comparison test with the comparative standard solution BY5, those that are darker than the BY5 or have an Em / UV * 100 value of more than about 6.3 are targeted.
  • the "equilibrium buffer having a predetermined initial pH” in the present invention is a buffer having substantially the same pH value as a pH value predetermined as the upper limit of the pH gradient formed by the elution buffer used in the present invention. It was prepared in advance so that both the non-colored protein and the colored protein in the solution charged into the ion exchange carrier column had a predetermined electric conductivity and pH value capable of binding to the ion exchange carrier. It is a thing.
  • the electrical conductivity of the equilibrium buffer and / or elution buffer used in the separation method (Bind-Elute method) of the present invention depends on the properties of the applied protein and the type of the anion exchange carrier.
  • the conductivity can be determined in advance, but for example, any electrical conductivity in the range of about 1 to about 20 mS / cm can be selected, preferably in the range of about 2 to about 15 mS / cm. Any electrical conductivity, specifically, for example, about 2 mS / cm, about 3 mS / cm, about 4 mS / cm, about 5 mS / cm, about 6 mS / cm, about 7 mS / cm.
  • the electrical conductivity of the equilibration buffer and the elution buffer are generally substantially the same.
  • the pH and electrical conductivity of the equilibration buffer used in the separation method (Flow-Through method) of the present invention are such that the protein colorant in solution binds to the ion exchange carrier and the protein non-colored material does not bind.
  • the pH is any pH value between about 9.2 and about 7.4, specifically, for example, about 9.2, about 9.0, about 8.8, about 8.6, about 8.4, about 8.2, about 8.0. , About 7.8, about 7.6 and about 7.4, preferably any pH value in the range of about 8.6 to about 7.4, more preferably any pH value in the range of about 8.2 to about 7.4. More preferably, it is an arbitrary pH value in the range of about 8.2 to about 7.8.
  • any electrical conductivity in the range of about 1 to about 20 mS / cm can be selected, preferably any electrical conductivity in the range of about 2 to 15 mS / cm.
  • Any electrical conductivity in the range / cm As the equilibration buffer used in the Flow-Through method, for example, a HEPES buffer (pH 8.0) is preferable.
  • the wash buffer used in the separation method of the present invention is mainly used to wash the anion exchange carrier before elution of the protein non-colored product.
  • the washing buffer include those having a composition capable of removing impurities other than the target protein non-colored substance and the colored body from the ion exchange carrier, and those having a high pH sufficiently outside the elution range of the target protein non-colored substance. Those having low electrical conductivity can be used.
  • the ion exchange carrier in the present invention is preferably an anion exchange carrier. Further, as the form thereof, for example, the form of small particles, a film or a monolith can be mentioned, but the form of small particles is preferable.
  • the ion exchange carrier column in the present invention means a column packed with an ion exchange carrier.
  • the anion exchange carrier is not limited as long as it exhibits an anion exchange action, and includes, for example, a strong anion exchange carrier, a weak anion exchange carrier, and a multimode / anion exchange carrier.
  • strong anion exchange carrier examples include Fractogel (registered trademark) EMDTMAE (M), Fractogel (registered trademark) EMDTMAE Medcap (M), Fractogel (registered trademark) EMDTMAE Hicap (M), and Eshmuno (registered trademark).
  • Examples of the weak anion exchange carrier include Fractogel (registered trademark) EMD DEAE, Fractogel (registered trademark) EMD DMAE, Capto (registered trademark) DEAE, DEAE Ceramic HyperD (registered trademark) F, and Toyopearl (registered trademark) NH2. -750F, TOYOPEARL® DEAE-650C, TOYOPEARL® DEAE-650M, TOYOPEARL® DEAE-650S, Cellufine® A-200, Cellufine® A-500, Cellufine ( Examples include A-800 (registered trademark) and Cellufine (registered trademark) MAX DEAE.
  • examples of the multimode anion exchange carrier include Toyopearl (registered trademark) NH2-750F, Capto (registered trademark) Adhere, Capto (registered trademark) Adhere ImpRes, Capto (registered trademark) MMC, and Capto (registered trademark).
  • Examples include core 700 and Cellufine® IB.
  • the anion exchange carrier that can be used in the separation method of the present invention is preferably a multimode anion exchange carrier, and more preferably Toyopearl® NH2-750F.
  • the "elution buffer forming a pH gradient that fluctuates from the initial pH to the final pH” in the present invention fluctuates with a linear gradient or a stepwise gradient at least in the pH range that sandwiches the isoelectric point of the protein to be eluted.
  • An eluent consisting of a combination of two or more buffers prepared to form a pH gradient.
  • the pH range is determined in advance according to the isoelectric point of the target protein and its distribution, and the buffer has an initial pH which is the upper limit of the pH range (hereinafter referred to as "buffer A").
  • buffer B a buffer having a final pH that is the lower limit of the pH range
  • buffer B a buffer having a final pH that is the lower limit of the pH range
  • the pH gradient applied in the separation method of the present invention is a pH gradient that decreases from the initial pH to the final pH.
  • the initial pH is, for example, an arbitrary pH value in the range of about 11.0 to about 7.0, specifically, about 11.0, about 10.8, about 10.6, about 10.4, about 10.2, about 10.0, about 9.8, One selected from the group consisting of about 9.6, about 9.4, about 9.2, about 9.0, about 8.8, about 8.6, about 8.4, about 8.2, about 8.0, about 7.8, about 7.6, about 7.4, about 7.2 and about 7.0.
  • the pH value is preferably about 10.8 to about 7.2, about 10.8 to about 7.4, about 10.8 to about 7.6, about 10.8 to about 7.8, about 10.8 to about 8.0, about 10.8 to about 8.2, about 10.8 to about 8.4.
  • It is a value, more preferably an arbitrary pH value in the range of about 10.6 to about 8.4.
  • the final pH is, for example, an arbitrary pH value in the range of about 4.0 to about 8.2, specifically, about 4.0, about 4.2, about 4.4, about 4.6, about 4.8, about 5.0, about 5.2, about.
  • Any pH value preferably in the range of about 4.0 to about 8.0, about 4.0 to about 7.8, about 4.0 to about 7.6, about 4.0 to about 7.4, about 4.0 to about 7.2 or about 4.0 to about 7.0.
  • any pH value preferably in the range of about 4.0 to about 8.0, about 4.0 to about 7.8, about 4.0 to about 7.6, about 4.0 to about 7.4, about 4.0 to about 7.2 or about 4.0 to about 7.0.
  • the initial pH is about 1.0 or more higher than the final pH.
  • the range of the pH gradient is, for example, about 11.0, about 10.8, about 10.6, about 10.4, about 10.2, about 10.0, about 9.8, about 9.6, about 9.4, about 9.2, about 9.0, about 8.8, about 8.6. , About 4.0, about 4.2, about 4.4, about 4.6 from any one initial pH selected from the group consisting of about 8.4, about 8.2, about 8.0, about 7.8, about 7.6, about 7.4, about 7.2 and about 7.0.
  • the range of the pH gradient is about 11.0 to about 4.0, about 11.0 to about 4.2, about 11.0 to about 4.4, about 11.0 to about 4.6, about 11.0 to about 4.8, about 11.0 to about 5.0, and about 11.0 to.
  • buffer A and / or buffer B may be, for example, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, TAPSO, POPSO, HEPSO, depending on individual separation conditions.
  • Each can be prepared from a combination of multiple good buffers selected from the group consisting of EPPS, Tricine, Bicine, TAPS, CHES, CAPSO and CAPS.
  • both buffers are selected from the group consisting of, for example, MES, MOPS, TAPS and CAPSO.
  • It is preferably prepared from a combination of buffers, and in particular, Thermo Scientific (registered trademark) CX-1 pH Gradient Buffer A (pH 5.6) and CX-1 pH Gradient Buffer B (pH 10.2) manufactured by Thermo Fisher.
  • Thermo Scientific registered trademark
  • CX-1 pH Gradient Buffer A pH 5.6
  • CX-1 pH Gradient Buffer B pH 10.2
  • both buffers can be prepared from a combination of a plurality of buffers selected from the group consisting of, for example, Tris-acetate, Tris-phosphate and Tris-citrate.
  • the conditions of the pH gradient can be determined in advance so that the non-colored body and the colored body are separated according to the properties of the protein attached to the separation method.
  • separation of non-protein colorant and protein colorant means that the fraction containing the non-colored protein recovered by the separation method or a concentrate thereof is "colorless or slightly colored”. Both proteins are separated under predetermined conditions so as to have a color density, or the fraction containing the recovered protein non-colored product does not substantially contain the colored product, or the colored product is colored. It means that the residual ratio of the body is reduced so as to form a color density of "colorless or slightly colored” as compared with the non-colored body.
  • the color density of "colorless or slightly colored" used as a definition indicating the degree of coloring can be evaluated by qualitative or quantitative analysis.
  • the United States Pharmacopeia 2012 (USP) Monograph 631, Color and Achromicity), European Pharmacopoeia 5.0 (EP Method 2.2.2, Degree of Coloration of Liquids) or Item 2.65 “Color Comparison Test Method” in the 17th revised Japanese Pharmacopoeia General Test Method It can be carried out by a visual comparison test with the comparative standard solution.
  • the coloring of the protein in the present invention if it is substantially the same as or lighter than BY7 in the brown-yellow comparative standard solutions BY1 to BY7, it can be evaluated as "colorless", and although it is darker than BY7, it is substantially the same as BY5. If it is the same or lighter than that, it can be evaluated as "slightly colored” or “slightly yellow”.
  • Clarity, Opalescence and Coloration (COC) assay that is, a test tube made of colorless and transparent neutral glass with an inner diameter of 15 to 25 mm on a flat bottom, was compared so that the layer depth was 40 mm. It can be carried out by pouring each of the standard solution and the solution to be tested and comparing the two.
  • the evaluation method for calculating the Em / UV * 100 value described above can be mentioned, and it can be carried out by the ultraviolet absorption measurement by the spectrophotometer and the fluorescence spectrum measurement by the spectrophotometric radiometer.
  • the brown-yellow comparative standard solution BY6 in the "color comparison test method" corresponds to about 4.1 as the Em / UV * 100 value
  • BY5 corresponds to about 6.3.
  • the color concentration of the non-colored protein fraction or its concentrate separated or fractionated according to the present invention is substantially the same as or less than that of BY5 in a visual comparison test with the comparative standard solution BY5. It is more preferable that it is evaluated as substantially the same as or thinner than the BY6, and it is most preferable that it is evaluated as substantially the same as the BY7. ..
  • the concentrated solution of the protein non-colored fraction (the protein concentration is at least an arbitrary concentration in the range of about 50 to about 100 mg / mL, preferably about 50 mg / mL and about 60 mg / mL).
  • the concentration selected from the group consisting of mL, about 70 mg / mL, about 80 mg / mL, about 90 mg / mL and about 100 mg / mL) is substantially the same as or thinner than the BY5. It is more preferable that it is evaluated as substantially the same as or thinner than the BY6, or substantially the same as the BY7.
  • the protein non-colored fraction can be concentrated by known methods such as ultrafiltration method, precipitation-resolution method and lyophilization-resolution method.
  • the mode of the stepwise gradient is, for example, an arbitrary column volume (CV (Column Volume)) in the range of about 1 to 20 CV, for example, about 1 CV, about 2 CV. , Approximately 3 CV, Approximately 4 CV, Approximately 5 CV, Approximately 6 CV, Approximately 7 CV, Approximately 8 CV, Approximately 9 CV, Approximately 10 CV, Approximately 15 CV and Approximately 20 CV
  • the percentage of buffer B in the elution buffer can be any percentage in the range of about 0.5 to about 5%, eg, about 0.5%, about 1%, about 1.5%,
  • the initial pH to the final pH A gradual pH gradient can be applied up to.
  • the ratio (%) of the buffer B is set to at least an arbitrary ratio in the range of about 10 to about 100%, for example, about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, and so on. Any percentage in the range of about 30 to about 100%, eg, about 30%, from any percentage selected from the group consisting of about 60%, about 70%, about 70%, about 90% and about 100%. , Approximately 40%, Approximately 50%, Approximately 60%, Approximately 70%, Approximately 80%, Approximately 90% and Approximately 100%. It can be carried out. Specifically, the range for increasing the ratio (%) of the buffer B is about 10 to about 30%, about 10 to about 40%, about 10 to about 50%, about 10 to about 60%, and about 10 to about 10 to about.
  • any column capacity in the range of about 1 to about 20 CV for example, about 1 CV, about 2 CV, about 3 CV, Corresponds to any column capacity selected from the group consisting of about 4 CV, about 5 CV, about 6 CV, about 7 CV, about 8 CV, about 9 CV, about 10 CV, about 15 CV and about 20 CV.
  • the pH of the elution buffer was set to any value in the range of about 0.1 to about 1.0, for example about 0.1, about 0.2, about 0.3, about 0.4, about 0.5, about 0.6, about 0.7, about 0.8, about.
  • a stepwise pH gradient can also be applied from the initial pH to the final pH by lowering the pH by any value selected from the group consisting of 0.9 and about 1.0.
  • any column capacity in the range of about 20 to about 50 CV for example, about 20 CV, 25 CV, about.
  • the ratio (%) of buffer B in the elution buffer is set in the range corresponding to any column capacity selected from the group consisting of 30 CV, about 35 CV, about 40 CV, about 45 CV and about 50 CV. Any percentage in the range of about 0.5 to about 5%, for example about 0.5%, about 1%, about 1.5%, about 2%, about 2.5%, about 3%, about 3.5%, about 4%, about 4.5%
  • a gradual pH gradient can be applied from the initial pH to the final pH.
  • the ratio (%) of the buffer B is set to at least an arbitrary ratio in the range of about 10 to about 100%, for example, about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, and so on. Any percentage in the range of about 30 to about 100%, eg, about 30%, from any percentage selected from the group consisting of about 60%, about 70%, about 80%, about 90% and about 100%. , Approximately 40%, Approximately 50%, Approximately 60%, Approximately 70%, Approximately 80%, Approximately 90% and Approximately 100%. It can be carried out.
  • the pH of the elution buffer is set to about 0.1 to about 1.0 in the range corresponding to any column volume selected from the group consisting of about 30 CV, about 35 CV, about 40 CV, about 45 CV and about 50 CV. Any value in the range of, eg, any value selected from the group consisting of about 0.1, about 0.2, about 0.3, about 0.4, about 0.5, about 0.6, about 0.7, about 0.8, about 0.9 and about 1.0.
  • a stepwise pH gradient can be applied from the initial pH to the final pH.
  • any column capacity in the range of about 20 to about 50 CV for example, about 20 CV, 25 CV, 30 CV, about 35 CV, about.
  • the percentage of buffer B in the elution buffer in a range corresponding to any column volume selected from the group consisting of 40 CV, about 45 CV and about 50 CV.
  • a continuous pH gradient can also be applied from the initial pH to the final pH.
  • the ratio (%) of the buffer B is set to at least an arbitrary ratio in the range of about 10 to about 100%, for example, about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, and so on.
  • any column capacity in the range of about 20 to about 50 CV for example, about 20 CV, 25 CV, 30 CV, about 35 CV.
  • the pH of the elution buffer in a range corresponding to any column volume selected from the group consisting of about 40 CV, about 45 CV and about 50 CV, the initial pH to the final pH It is also possible to apply a continuous pH gradient up to.
  • the pH gradient in the separation method of the present invention is, for example, (a) at least about the proportion (%) of buffer B in the elution buffer at intervals corresponding to any column volume in the range of about 4 to about 6 CV. It is carried out by stepwise increasing by any percentage in the range of about 1 to about 2% over the range of 50-100%, or (b) any in the range of about 30 to about 40 CV. It is preferably carried out by gradually lowering the pH in the elution buffer in an arbitrary pH range of about 0.6 to about 1.0 in a range corresponding to the column volume.
  • the elution buffer in the separation method of the present invention can be flowed at an optimum linear flow velocity determined in advance according to the type of ion exchange carrier used and the degree of separation between the colored body and the non-colored product.
  • Any linear velocity in the range of about 100-about 800 cm / h for example about 100 cm / h, about 150 cm / h, about 200 cm / h, about 250 cm / h, about 300 cm / h, about 350 cm / h, about 400 cm / h, about 450 cm / h, about 500 cm / h, about 550 cm / h, about 600 cm / h, about 650 cm / h, about 700 cm / h, about 750 cm It can be selected from the group consisting of / h and about 800 cm / h.
  • the total loading amount (mg / mL) of the protein non-colored product and the protein colored product charged into the ion exchange carrier column is about 2 to about 200 mg / mL, for example, about 10 mg / mL, about 20 mg / mL, about 30 mg / mL, about 40 mg / mL, about 50 mg / mL, about 60 mg / mL, about 70 mg / mL, about 80 mg / mL, about 90 mg / mL mL, about 100 mg / mL, about 110 mg / mL, about 120 mg / mL, about 130 mg / mL, about 140 mg / mL, about 150 mg / mL, about 160 mg / mL, about 170 mg / mL, Approximately 180 mg / mL, 190 mg / mL and 200 mg / mL are mentioned.
  • the loading amount (mg / / / mL)
  • the total concentration of the protein non-colored product and the protein colored product that can be charged into the ion exchange carrier column also depends on the above-mentioned conditions, but is usually about 2 to about 50 mg / mL, specifically, about 2 to about 50 mg / mL. , About 5 mg / mL, about 10 mg / mL, about 15 mg / mL, about 20 mg / mL, about 25 mg / mL, about 30 mg / mL, about 35 mg / mL, about 40 mg / mL, about 45 mg / mL and about 50 mg / mL are mentioned, preferably about 10 to about 30 mg / mL.
  • the separation method of the present invention is mainly carried out at room temperature.
  • the separation method of the present invention can be applied to any protein colored by modification caused by a saccharification reaction.
  • protein drugs that require high concentrations require that they be produced from cultured cells under high oxygen and high glucose (for example, COS cells and CHO cells), and therefore undergo coloring due to the glycation reaction.
  • antibodies are required to be applied by this separation method.
  • the separation method of the present invention can be widely applied to proteins having basically any molecular weight, but specifically, it targets proteins in the range of about 50 to 750 kDa and has a range of about 50 to about 150 kDa. Suitable for separating proteins in.
  • the separation method of the present invention can be widely applied to proteins having basically any isoelectric point, but preferably those in the range of about 5 to 9.5 are targeted.
  • the isoelectric points of the protein-colored product are in the range of about 5 to about 9.1, and those belonging to the range of about 6 to about 7 are mainly targeted, while the protein non-colored product is used.
  • the isoelectric point is in the range of about 7 to about 9.5, but specifically, about 7 or more and less than about 7.5, about 7.5 or more and less than about 8, about 8 or more and less than about 8.5, about 8.5 or more.
  • those belonging to any range selected from the group consisting of less than about 9 and more than about 9 and less than about 9.5 are mainly targeted.
  • the antibody to which the separation method of the present invention can be applied may be any type or form such as a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody and a multispecific antibody (for example, a bispecific antibody).
  • the type of the antibody is not particularly limited, and may be, for example, an antibody derived from a mouse, rat, rabbit, goat or human, but in a human medicine whose quality is strictly required, a chimeric antibody, a humanized antibody or a fully human antibody.
  • the form of type antibody is preferred.
  • they are mostly produced as monoclonal antibodies from producing cells such as COS cells and CHO cells, there are cases where coloring due to a glycation reaction becomes a problem.
  • the “antibody fragment” means a part of an antibody molecule that retains its binding property to an antigen, and includes, for example, F (ab') 2 , Fab', Fab, Fv, and single-chain FV. Is done.
  • the "bispecific antibody” means an antibody having binding specificity to two different antigen molecules or epitopes in one molecule.
  • the morphology of the bispecific antibody includes, for example, diabody, bispecific sc (Fv) 2 , bispecific minibody, bispecific F (ab') 2 , bispecific.
  • Hybrid antibody covalently bound diabody (bispecific DART), bispecific (FvCys) 2 , bispecific F (ab'-zipper) 2 , bispecific (Fv-zipper) 2 , 2
  • the "isotype" is used to refer to an antibody class (eg, IgM or IgG) encoded by a heavy chain constant region gene, and the preferred isotype for the bispecific antibody according to the present invention is IgG. Yes, more preferably IgG 1 or IgG 4 .
  • Antibodies to which the separation method of the present invention can be applied include, for example, anti-CD40 antibodies (eg, Bleselumab, Dacetuzumab, Iscalimab, Lucatumumab, Mitazalimab, Ravagalimab, Selicrelumab, Teneriximab, ABBV-428 and APX005M), anti-CD70 antibodies (eg, ABX005M, etc.).
  • anti-CD40 antibodies eg, Bleselumab, Dacetuzumab, Iscalimab, Lucatumumab, Mitazalimab, Ravagalimab, Selicrelumab, Teneriximab, ABBV-428 and APX005M
  • anti-CD70 antibodies eg, ABX005M, etc.
  • anti-HER1 antibody eg Cetuximab, Panitumumab, Necitumumab, Nimotuzumab, Depatuxizumab, Futuximab, Laprituximab, Matuzumab, Modotuximab, Petosemtamab, Tomuzotumab, Anti-HER2 antibody (eg Pertuzumab, Disitamab, Gancotamab, Margetuximab, Timigutuzumab, Zanidatamab, Ertumaxomab, Zenocutuzumab, Trastuzumab, MM-111, R48 and ZW33, etc.) Patritumab, Seribantumab and MM-111, etc.), anti-VEGFR1 antibody (eg, Icrucumab, etc.), anti-VEGFR2 antibody (eg,
  • anti-TNFRSF10B antibody eg Benufutamab, Conatumumab, Drozitumab, Lexatumumab, Tigatuzumab and DS-8273a etc.
  • anti-TNFRSF10A antibody eg Mapatumumab etc.
  • anti-MUC1 antibody eg Cantuzumab, Clivatuzumab, etc.
  • anti-MUC5AC antibody eg Ensituximab etc.
  • anti-MUC16 antibody eg Oregovomab, Abagovomab, Igovomab and Sofutumab
  • Anti-DLL4 antibody eg, Demcizumab, Dilpacimab, Navicixizuma
  • bispecific antibody to which the separation method of the present invention can be applied examples include an anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody and an anti-PD-1 / CD19 bispecific antibody (preferably WO2020 / Bispecific antibody described in 204152), anti-PD-1 / CD4 bispecific antibody, anti-HER1-MET bispecific antibody (eg, Amivantamab, etc.), anti-EPCAM-CD3 bispecific antibody (eg, Amivantamab)
  • Solidomab and Catumaxomab anti-Ang2-VEGF bispecific antibody (eg Vanucizumab, etc.), anti-HER2-CD3 bispecific antibody (eg, Ertumaxomab, etc.), anti-HER3-IGF1R bispecific antibody (eg, Ertumaxomab, etc.)
  • anti-PMSA-CD3 bispecific antibody eg, Pasotuxizumab, etc.
  • Examples of the antibody for which the separation method of the present invention is required to be applied include an anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody, and in particular, a heavy chain constituting an antigen-binding site that specifically binds to PD-1. And the light chain and the heavy chain and the light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to CD3, and (a) the heavy chain and the light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to PD-1.
  • the heavy chain consists of any one amino acid sequence (preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5) selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 (b).
  • the heavy and light chains that make up the antigen-binding site that specifically binds to CD3 consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and (c) the antigen-binding site that specifically binds to PD-1.
  • the bispecific antibody consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 in both the heavy chain and the light chain constituting the light chain and the light chain in the light chain constituting the antigen-binding site that specifically binds to the light chain and the CD3.
  • the solution containing (anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A) is found to be colored due to the generation of AGEs, and the application of the separation method of the present invention is required.
  • the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A can be produced according to the method disclosed in WO2019 / 156199, respectively, from anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody clones PD1-1 (Bi) to Corresponds to PD1-5 (Bi).
  • the heavy chain constant regions of the heavy chains and light chains constituting the antigen-binding site that specifically binds to PD-1 of the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A are respectively. It is substituted with a heavy chain constant region consisting of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: 13, and specifically binds to CD3.
  • the heavy chain constant region of each heavy chain and light chain constituting the antigen binding site is selected from SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 19, respectively.
  • the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody (anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody B) substituted with a heavy chain constant region consisting of any one of the amino acid sequences is also isolated from the present invention. The application of the method is required.
  • Each of these anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody B has an antigen-binding site that specifically binds to the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody clone PD1-5 (Bi) (PD-1).
  • the heavy chain in the constituent heavy and light chains is the 252nd methionine in the EU numbering system in the heavy chain constant region of the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • Glutamic acid, proline, arginine and aspartic acid respectively, antibody clones in which aspartic acid at position 434 is replaced with leucine, antibody clones in which glutamine at position 438 is replaced with glutamic acid, respectively. It can be produced by a method according to the technique.
  • the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody which cross-competites for binding of the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A to PD-1 and / or binding to CD3, is also the present invention. It may be required to apply the separation method of.
  • cross-competition is defined by binding to each epitope on PD-1 and / or CD3 that is identical or partially overlapping with the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A. It means inhibiting binding of anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A to PD-1 and / or CD3 to any extent, and cross-competition can be assessed by competitive binding assay. can.
  • FIG. 9 shows the heavy and light chains constituting the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A and the antigen binding sites that specifically bind to PD-1, and the antigen binding that specifically binds to CD3.
  • the amino acid sequences of the heavy chain and the light chain constituting the site are shown.
  • FIGS. 10 and 11 show each amino acid sequence of the heavy chain constant region constituting anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody B.
  • the "heavy chain and light chain constituting the antigen binding site that specifically binds to PD-1” specifically refers to PD-1 by associating the heavy chain and the light chain via a disulfide bond. It means a heavy chain / light chain complex that forms an antigen-binding site to which it binds.
  • An "antigen binding site” is the smallest unit for an antibody to have binding activity to its antigen, and "specifically binding to PD-1" means at least 1x10 -5 M, preferably 1x10 -7.
  • M more preferably capable of binding directly to PD-1 with a binding activity with 1x10 -9 higher than M affinity (dissociation constant (Kd value)), at least, such as CD28, CTLA-4 and ICOS , So-called, is used as a feature that does not substantially bind to other receptor members belonging to the CD28 family of receptors.
  • Kd value dissociation constant
  • the "heavy chain and light chain constituting the antigen binding site that specifically binds to CD3” is an antigen binding site that specifically binds to CD3 by associating the heavy chain and the light chain via a disulfide bond. It means a heavy chain / light chain complex that forms.
  • An "antigen binding site" the antibody is a minimum unit for having a binding activity to the antigen, where the "specifically binds to a CD3" means at least, 1x10 -5 M, preferably 1x10 - 7 M, and more preferably can be bonded directly to CD3 in binding activity with 1x10 -9 higher than M affinity (dissociation constant (Kd value)), as a feature to another protein that does not substantially bind used.
  • the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody according to the present invention specifically binds to the light chain and CD3 in the heavy chain and light chain constituting the antigen binding site that specifically binds to PD-1. It is characterized in that the light chain in the heavy chain and the light chain constituting the antigen-binding site to be bound has a structure having the same amino acid sequence.
  • a preferred embodiment of the separation method of the present invention is, for example, a method for separating a protein non-colored product from a solution containing a protein non-colored product and a protein colored product.
  • An elution buffer that forms a pH gradient that drops from the initial pH to the final pH under predetermined conditions for separating the non-colored protein and the colored protein is applied to the yin at a predetermined flow rate.
  • the protein is any antibody of the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A or any antibody of the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody B.
  • the anion exchange carrier is Toyopearl (registered trademark) NH2-750F.
  • the initial pH of the equilibration buffer and the elution buffer is an arbitrary pH value in the range of about 10.6 to about 8.4, and the final pH of the elution buffer is an arbitrary pH value in the range of about 7.0 to about 4.0 (provided that the pH value is arbitrary. , The initial pH is 2.0 or more higher than the final pH.)
  • the percentage (%) of buffer B in the elution buffer is at least about 50-100% at intervals corresponding to any column volume where the pH gradient is (a) in the range of about 4 to about 6 CV. It is carried out by stepwise increasing by any percentage in the range of about 1 to about 2% over the range of (b) corresponding to any column capacity in the range of about 30 to about 40 CV.
  • the separation method is (I) The step of charging the solution into the anion exchange carrier column, (Ii) The protein colorant in the solution binds to the anion exchange carrier, and an equilibrium buffer prepared so that the protein non-colorant does not bind is passed through the anion exchange carrier column at a predetermined flow rate. It comprises a step and (iii) a step of collecting a fraction containing a protein non-colored substance that flows through as it is in the above step.
  • the protein is any antibody of the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A or any antibody of the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody B.
  • the anion exchange carrier is Toyopearl (registered trademark) NH2-750F.
  • the pH of the equilibration buffer is an arbitrary pH value in the range of about 7.8 to about 8.2, and the electrical conductivity is an arbitrary electrical conductivity in the range of about 5 to about 7 mS / cm.
  • the linear flow velocity of the equilibration buffer is about 100 to about 400 cm / h, and (6) the color concentration of the solution containing the fractionated protein non-colored product is (i) the comparative standard solution. In a visual comparison test with BY5, the Em / UV * 100 value of the solution containing the protein non-colored product that was substantially the same as or thinner than that of BY5, or (ii) fractionated was about 6.3 or less. There is the separation method.
  • the present invention relates to a solution containing an anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody produced by a production method including a step corresponding to the separation method of the present invention as a part thereof. Specifically, at a concentration of about 100 to about 300 mg / mL, either antibody of anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A or anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody B. A colorless or slightly colored solution containing the antibody of. However, in a preferred embodiment of the solution containing the bispecific antibody, in any of the manufacturing steps thereof, no step for reducing or removing coloring as in the separation method of the present invention is performed. It does not contain solutions with colorless or slightly colored properties at concentrations of about 100 to about 300 mg / mL.
  • a solution containing either antibody of the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A or any antibody of anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody B has a concentration of less than about 100 mg / mL.
  • it may be produced by subjecting it to the separation method of the present invention at any concentration of about 10 to 50 mg / mL and then concentrating it if necessary.
  • the protein non-colored fraction can be concentrated by known methods such as ultrafiltration method, precipitation-resolution method and lyophilization-resolution method.
  • the color concentration of the colorless or slightly colored solution can be confirmed by the qualitative or quantitative analysis described above.
  • the solution containing the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody produced by a production method including a step corresponding to the separation method of the present invention is an autoimmune disease or a graft-versus-host disease (GVHD).
  • GVHD graft-versus-host disease
  • it is useful for prevention of blood cancer, suppression of symptom progression, suppression of recurrence and / or treatment.
  • autoimmune diseases that can be prevented, suppressed from developing symptoms, and / or treated by the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody according to the present invention include Bechet's disease, systemic scleroderma, chronic discoid scleroderma, and multiple autoimmune diseases.
  • Scleroderma (systemic scleroderma, progressive systemic scleroderma), scleroderma, polymyositis, dermatomyitis, nodular periarteritis (nodular polyartitis, microscopic polyangiitis), aortitis syndrome (Hyperan arteritis), rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis, spondyloarthritis, mixed connective tissue disease, Sjogren's syndrome, adult still disease, vasculitis, allergic granulomatous vasculitis, hypersensitivity vasculitis , Rheumatoid vasculitis, macroangiitis, ANCA-related vasculitis (eg, polyangiitis granulomatosis and eosinophilia polyangiitis granulomatosis), Cogan syndrome, RS3PE syndrome, temporal arteritis, rheumatic Poly
  • Hematological cancers that can be prevented, suppressed from developing symptoms, and / or treated by the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody according to the present invention include, for example, multiple myeloma and malignant lymphoma (eg, non-hodgkin lymphoma).
  • B-cell non-hodgkin lymphoma eg, precursor B-cell lymphoblastic lymphoma, precursor B-cell acute lymphocytic leukemia, chronic B-lymphocytic leukemia (eg, small lymphocytic lymphoma), B-precursor cell
  • Leukemia pre-B-cell lymphocytic leukemia, lymphoplasmacytic lymphoma, nodal marginal zone B-cell lymphoma, extranodal marginal zone B-cell lymphoma (MALT lymphoma), primary splenic marginal zone B-cell lymphoma , Hairy cell leukemia, hairy cell leukemia / variant type, follicular lymphoma, pediatric follicular lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma / non-specific type, splenic diffuse Red splenic small B-cell lymphoma, lymphoplasmocyte lymphoma, primary medias
  • treatment in the present invention means, for example, curing or ameliorating a certain disease or symptom thereof
  • prevention means preventing or constant occurrence of a certain disease or symptom. It means to delay the period
  • inhibition of symptom progression means to suppress the progression or worsening of symptom and stop the progression of the pathological condition.
  • prevention also includes suppression of recurrence.
  • suppression recurrence is meant preventing or reducing the likelihood of recurrence of a disease or symptom.
  • the solution containing the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody of the present invention is usually administered systemically or locally in a parenteral form as its pharmaceutical composition.
  • Specific examples of such an administration method include injection administration, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration.
  • Examples of the injection administration include intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection and the like, and in the case of intravenous injection, administration by infusion is preferable.
  • the dose varies depending on age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., but usually 0.1 ⁇ g / g of the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody per adult.
  • the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody is administered parenterally once to several times daily in the range of kg to 300 mg / kg, particularly preferably in the range of 0.1 mg / kg to 10 mg / kg as the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody. Alternatively, it is administered intravenously continuously for 30 minutes to 24 hours a day.
  • an amount smaller than the above dose may be sufficient, or administration beyond the range may be necessary.
  • the injection or infusion solution is an aqueous solution, suspension or milk. It may be in any form of turbid liquid.
  • Solvents used in infusions for injections or infusions include, for example, distilled water for injection, saline, glucose solutions and isotonic solutions (eg, sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, etc.
  • a solution of sodium chloride, propylene glycol, etc. can be used.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be contained, if necessary.
  • examples of the pharmaceutically acceptable carrier include stabilizers, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, soothing agents, buffers, preservatives, preservatives, pH adjusters, antioxidants and the like.
  • Stabilizers include, for example, various amino acids, albumin, globulin, gelatin, mannitol, glucose, dextran, ethylene glycol, propylene glycol, polyethylene glycol, ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium thiosulfate, sodium edetate, sodium citrate, Dibutylhydroxytoluene and the like can be used.
  • solubilizing agent examples include alcohols (eg, ethanol, etc.), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 20 (registered trademark), polysorbate 80 (registered trademark)). ), HCO-50, etc.), etc.
  • alcohols eg, ethanol, etc.
  • polyalcohols eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 20 (registered trademark), polysorbate 80 (registered trademark)).
  • HCO-50, etc. can be used.
  • the suspending agent for example, glycerin monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used.
  • emulsifier for example, gum arabic, sodium alginate, tragant and the like can be used.
  • the pain-relieving agent for example, benzyl alcohol, chlorobutanol, sorbitol and the like can be used.
  • the buffer for example, a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, a borate buffer solution, a carbon dioxide buffer solution, a citrate buffer solution, a Tris buffer solution, a glutamate buffer solution, an epsilon aminocaproic acid buffer solution and the like can be used.
  • Examples of the preservative include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, butyl paraoxybenzoate, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, and borax. Sand or the like can be used.
  • As the preservative for example, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • As the pH adjuster for example, hydrochloric acid, sodium hydroxide, phosphoric acid, acetic acid and the like can be used.
  • antioxidants for example, (1) water-soluble antioxidants such as (1) ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium bicarbonate, sodium metabisulfite, sodium sulfite, etc., (2) ascorbic palmitate, butylated hydroxyanisol, Use oil-soluble antioxidants such as butylated hydroxytoluene, lecithin, propyl gallate, ⁇ -tocopherol and (3) metal chelating agents such as citric acid, ethylenediamine tetraacetic acid, sorbitol, tartaric acid, phosphoric acid and the like. Can be done.
  • the infusion solution for injection or infusion can be produced by sterilization in the final step or by aseptic technique, for example, filtering with a filter or the like to sterilize, and then filling in a sterile container.
  • Example 1 Quantitative analysis of antibody colorant by reverse phase HPLC
  • an evaluation system by reverse phase HPLC was constructed. The equipment used at that time and the set implementation conditions are shown in Tables 1 and 2 below, respectively.
  • UV detection peak area having a wavelength of 280 nm. 280
  • Em / UV * 100 value was calculated and used as an index for quantification of coloring. Since the fluorescence detector is connected after the UV detector on the system, the fluorescence detection peak appears behind.
  • Em / UV * 100 value was compared with the comparative standard solution in item 2.65 "Color comparison test method" in the 17th revised Japanese Pharmacopoeia general test method.
  • the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody purified under the set conditions without paying attention to the removal of the colored substance was fractionated by strong cation exchange chromatography using a salt concentration gradient, and the obtained purified fraction was obtained. Is concentrated to 100 mg / mL, and the high-colored fraction and the low-colored fraction are mixed to visually prepare a sample having a color corresponding to the comparative standard solutions BY3.5, BY4, BY4.5, BY5 and BY6. And they were analyzed by HPLC. Comparing the chromatogram corresponding to BY3.5 (Fig.
  • Example 2 Anion exchange chromatography purification of antibody by Bind-elute mode (1)
  • pH step gradient anion exchange chromatography in Bind-elute mode was performed (Fig.). 4).
  • a separation column in which a Tricorn column (GE Healthcare) was filled with Toyopearl NH2-750F was used for flow packing.
  • Anion exchange chromatography used as a sample before purification. Table 3 shows the other devices used here and the set conditions.
  • the antibody After sufficiently equilibrating the column with commercially available buffer A (Thermo Scientific (registered trademark) CX-1 pH Gradient Buffer B (pH 10.2)) used as mobile phase A, the antibody is 9.3 mg / mL.
  • the solution was weighed in 4.3 mL and loaded in its entirety to a loading of 20 mg-IgG / mL-resin. After that, the ratio (% B in Fig. 4) of the commercially available buffer B (Thermo Scientific (registered trademark) CX-1 pH Gradient Buffer A (pH 5.6) of Thermo Fisher), which corresponds to the mobile phase B, was gradually increased from 25%.
  • Example 3 Purification of antibody anion exchange chromatography by Flow-through mode Further, another separation condition for reducing the colorant ratio of the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A according to the present invention is found. Therefore, anion exchange chromatography in Flow-through mode was performed using the same separation column system as in Example 1 (FIG. 5).
  • the solution containing the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A purified by Protein A affinity chromatography from the similarly clarified CHO cell culture solution was subjected to low pH treatment for virus inactivation to pH 8.0. It was prepared and used as a sample before purification by anion exchange chromatography.
  • Table 4 shows the other devices used here and the set conditions.
  • the Em / UV * 100 value of the fraction containing the Flow-through peak is 4.0, while the Em / UV of the antibody solution before purification and one predetermined fraction in the dissolution peak. Since the * 100 values were 9.1 and 22.2, respectively, it was confirmed that the colored bodies were highly separated even in the method of this example.
  • Example 4 Anion exchange chromatography purification of antibody by Bind-elute mode (2) A separation column packed with Capto adhere in a Tricorn column (GE Healthcare) by flow packing was used to find yet another separation condition to reduce the colorant ratio of anti-PD-1 / CD3 bispecific antibodies. Anion exchange chromatography was performed in Bind-elute mode (Fig. 6). The solution containing the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A purified by Protein A affinity chromatography from the similarly clarified CHO cell culture solution was subjected to low pH treatment for virus inactivation to pH 10.2. It was prepared and used as a sample before purification by anion exchange chromatography. Table 5 shows the other devices used here and the set conditions.
  • Em / UV * 100 values of the fractionation fraction near the peak are 1.7, 1.7, 6.5, 10.8 and 14.4, respectively (corresponding to arrows 1 to 5 in FIG. 6) from the weakly retained fraction, while the relevant fractions. Since the Em / UV * 100 value of the sample before purification of the antibody was 9.0, it was confirmed that the colored product was highly separated by the method of this example.
  • Example 5 Anion exchange chromatography purification of antibody by Bind-elute mode (3) Subsequently, anion exchange chromatography in Bind-elute mode was performed using a separation column in which Cellufine MAX IB was packed in a Tricorn column (GE Healthcare) by flow packing (Fig. 7). The solution containing the anti-PD-1 / CD3 bispecific antibody A purified by Protein A affinity chromatography from the similarly clarified CHO cell culture solution was subjected to low pH treatment for virus inactivation to pH 10.2. It was prepared and used as a sample before purification by anion exchange chromatography. Table 6 shows the other devices used here and the set conditions.
  • Em / UV * 100 values of the fractionation fraction near the peak are 1.6, 1.7, 2.1, 3.3 and 8.0, respectively (corresponding to arrows 1 to 5 in FIG. 7) from the weakly retained fraction, while the relevant fractions. Since the Em / UV * 100 value of the sample before purification of the antibody was 9.0, it was confirmed that the colored product was highly separated by the method of this example.
  • Example 6 Even when a protein other than the anion exchange chromatography-purified antibody of BSA is targeted, the colored product is included in order to verify whether the colored product can be separated as in the case of the antibody.
  • Anion exchange chromatography in Bind-elute mode was performed on BSA (bovine serum albumin; low salt concentration, Fuji Film Wako Pure Drug) (Fig. 8).
  • BSA bovine serum albumin; low salt concentration, Fuji Film Wako Pure Drug
  • a separation column filled with Capto Q in a Tricorn column GE Healthcare
  • the separation method of the present invention can be used for color removal of colorless protein solutions, especially antibody drugs that require strict quality control.

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Abstract

本発明の課題は、タンパク質製剤、特に、抗体製剤の原薬溶液の着色を除去する方法、それを一部の工程に含むタンパク質製剤の原薬溶液の製造方法および高濃度化された無色の当該製剤原薬溶液を提供することにある。　本発明は、タンパク質製剤、特に、抗体製剤の原薬溶液に含まれる着色原因となる終末糖化産物を陰イオン交換クロマトグラフィーにて除去する方法を提供する。この方法により、無色の製剤原薬溶液を提供することが可能となった。

Description

タンパク質製剤原薬の着色除去方法
　本発明は、タンパク質製剤の原薬溶液の着色を除去する方法および当該方法を含む製造工程にて製造された当該溶液に関する。
　抗体医薬に採用される処方形態として、患者負担やその利便性から、皮下注射による処方形態が選択されるケースが多い。皮下投与の場合、その投与量の限界から自ずと薬物の高濃度化が要求され、特に、抗体医薬の場合、それを原因とする幾つかの問題を内包している。その一つとして挙げられるのが、原薬溶液の着色であり、欧州薬局方では、原薬溶液の色について、無色もしくは僅かな着色という条件を要求している。また、原薬溶液の着色は、不純物の存在とそれに伴う原薬の不均一性を示している可能性があり、医薬の性能劣化または有効性もしくは安全性に影響を及ぼす可能性が否定できない（非特許文献１および２）。
　このような着色の原因の一つとして挙げられるのが、その産生細胞の培養環境である。特に、抗体産生に広く使用されるCHO細胞の培養は、高酸素・高グルコースの培養条件下で行われるため、産生されるタンパク質は著しい酸化と糖化環境に曝され、終末糖化産物（AGEs: Advanced Glycation End products）を形成し、その一部が着色の原因となっていることが報告されている（非特許文献３、４および５）。また、一方で、そのような終末糖化産物が、タンパク質医薬の有効性低下の原因となり得ることも報告されており、着色した原薬溶液からの原因物質の除去がその医薬の品質・性能の維持に重要である。
Anal. Chem. 2014, 86, 9816-9823 Biotechnology Progress (2013), 29 (5), 1270-1277 European Pharmacopoeia, 8.2 ed.; Council of Europe: Strasbourg, France, 2014. Analytical Chemistry (2013), 85 (23), 11401-11409 BMC Ophthalmol. 2006, 6, 10
　本発明の課題は、タンパク質製剤の原薬溶液の着色を除去する方法ならびに当該方法を含む製造工程にて製造された当該溶液を提供することにある。
　本発明者らは、当該方法を見出すべく鋭意研究した結果、当該原薬溶液の着色の原因となる物質をイオン交換クロマトグラフィーにて除去する方法を見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］　タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液から、タンパク質非着色体を分離する方法であって、
（ｉ）当該溶液をイオン交換担体カラムに投入し、所定の初期pHを有する平衡化バッファーを使用して、当該タンパク質非着色体およびタンパク質着色体をイオン交換担体に結合させる工程、
（ｉｉ）当該タンパク質非着色体およびタンパク質着色体が分離されるようあらかじめ定められた条件にて、当該初期pHから終期pHまで変動するpH勾配を形成する溶離バッファーを、所定の流速にて当該イオン交換担体カラムに流す工程、および
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）により溶離するタンパク質非着色体を含む所定の画分を分取する工程からなる、当該分離方法；
［２］　タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液から、タンパク質非着色体を分離する方法であって、
（ｉ）当該溶液をイオン交換担体カラムに投入する工程、
（ｉｉ）当該溶液中の当該タンパク質着色体が当該イオン交換担体に結合し、当該タンパク質非着色体が結合しないよう調製された平衡化バッファーを所定の流速にて当該イオン交換担体カラムに流す工程、および
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）においてそのままフロースルーするタンパク質非着色体を含む画分を回収する工程からなる、当該分離方法；
［３］　タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液またはその濃縮液の色濃度が、（１）第十七改正日本薬局方の一般試験法における項目2.65「色の比較試験法」における比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5よりも濃い、または（２）当該溶液またはその濃縮液の紫外線吸収測定および蛍光スペクトル測定に基づき算出された、280nm波長の紫外線吸光検出ピーク面積（以下、「UV280」と略記することがある。）に対する蛍光強度検出ピーク面積（但し、励起波長が380 nmであり、検出波長が560 nmである。以下、これを「Em560(ex380)」と略記することがある。）の比率に100を乗じた値（以下、「Em/UV*100値」と略記することがある。）が約6.3よりも高い、前項［１］または［２］記載の分離方法；
［４］　当該イオン交換担体が、陰イオン交換担体である、前項［１］～［３］の何れか一項記載の分離方法；
［５］　当該イオン交換担体または当該陰イオン交換担体が、小粒子、膜またはモノリスの形態である、前項［１］～［４］の何れか一項記載の分離方法；
［６］　当該陰イオン交換担体が、強陰イオン交換担体、弱陰イオン交換担体またはマルチモード・陰イオン交換担体である、前項［４］または［５］記載の分離方法；
［７］　当該陰イオン交換担体が、弱陰イオン交換担体またはマルチモード・陰イオン交換担体である、前項［４］または［５］記載の分離方法；
［８］　当該弱陰イオン交換担体が、Fractogel（登録商標）EMD DEAE、Fractogel（登録商標）EMD DMAE、Capto（登録商標）DEAE、DEAE Ceramic HyperD（登録商標）F、Toyopearl（登録商標）NH2-750F、TOYOPEARL（登録商標）DEAE-650C、TOYOPEARL（登録商標）DEAE-650M、TOYOPEARL（登録商標）DEAE-650S、Cellufine（登録商標）A-200、Cellufine（登録商標）A-500、Cellufine（登録商標）A-800およびCellufine（登録商標）MAX DEAEからなる群から選択される何れかである、前項［７］記載の分離方法；
［９］　当該マルチモード・陰イオン交換担体が、Toyopearl（登録商標）NH2-750F、Capto（登録商標）Adhere、Capto（登録商標）Adhere ImpRes、Capto（登録商標）MMC、Capto（登録商標）core 700およびCellufine（登録商標）IBからなる群から選択される何れかである（好ましくは、Toyopearl（登録商標）NH2-750F）、前項［７］記載の分離方法；
［１０］　当該強陰イオン交換担体が、Fractogel（登録商標）EMD TMAE (M)、Fractogel（登録商標）EMD TMAE Medcap (M)、Fractogel（登録商標）EMD TMAE Hicap (M)、Eshmuno（登録商標）Q、Eshmuno（登録商標）QPX、Eshmuno（登録商標）QPX Hicap、Capto（登録商標） Q、Capto（登録商標） Q ImpRes、Q Sepharose（登録商標）FF、Q Sepharose（登録商標）HP、Q Sepharose（登録商標）XL、Source（登録商標）30Q、Capto（登録商標）Adhere、Capto（登録商標）Adhere ImpRes、 POROS（登録商標）50 HQ、POROS（登録商標）50 XQ、POROS（登録商標）50 PI、Q HyperCel（登録商標）、Toyopearl（登録商標）GigaCap Q 650M、Toyopearl（登録商標）GigaCap Q 650S、Toyopearl（登録商標）Super Q、YMC（登録商標）BioPro Q、Macro-Prep（登録商標）High Q、Nuvia（登録商標）Q、UNOsphere（登録商標）Q、Cellufine（登録商標）Q-500、Cellufine（登録商標）MAX Q-rおよびCellufine（登録商標）MAX Q-hからなる群から選択される何れかである、前項［６］記載の分離方法；
［１１］　当該タンパク質着色体の等電点が、約5.0～約9.1（好ましくは、約6.0～約7.0）の範囲に属する、前項［１］～［１０］の何れか一項記載の分離方法；
［１２］　当該タンパク質非着色体の等電点が、約7.0以上かつ約7.5未満、約7.5以上かつ約8.0未満、約8.0以上かつ約8.5未満、約8.5以上かつ約9.0未満および約9.0以上かつ約9.5未満からなる群から選択される何れかの範囲に属する、前項［１］～［１１］の何れか一項記載の分離方法；
［１３］　当該イオン交換担体カラムに投入される、タンパク質非着色体およびタンパク質着色体の総濃度が、約2～約50 mg/mL(好ましくは、約10～約30 mg/mL)である、前項［１］～［１２］の何れか一項記載の分離方法；
［１４］　当該総濃度が、約5 mg/mL、約10 mg/mL、約15 mg/mL、約20 mg/mL、約25 mg/mL、約30 mg/mL、約35 mg/mL、約40 mg/mL、約45 mg/mLおよび約50 mg/mLからなる群から選択される何れかの濃度である、前項［１３］記載の分離方法；
［１５］　当該イオン交換担体カラムに投入される、タンパク質非着色体およびタンパク質着色体の総負荷量が、約2～約200 mg/mLである、前項［１］～［１２］の何れか一項記載の分離方法；
［１６］　当該イオン交換担体カラムに投入される、タンパク質非着色体およびタンパク質着色体の総負荷量が、約10 mg/mL、約20 mg/mL、約30 mg/mL、約40 mg/mL、約50 mg/mL、約60 mg/mL、約70 mg/mL、約80 mg/mL、約90 mg/mL、約100 mg/mL、約110 mg/mL、約120 mg/mL、約130 mg/mL、約140 mg/mL、約150 mg/mL、約160 mg/mL、約170 mg/mL、約180 mg/mL、約190 mg/mLおよび約200 mg/mLからなる群から選択される何れかである、前項［１５］記載の分離方法；
［１７］　当該初期pHから終期pHまでのpH勾配の範囲が、当該タンパク質着色体および／または当該タンパク質非着色体の各等電点を挟むように設定された、前項［１］および［３］～［１６］の何れか一項記載の分離方法；
［１８］　当該pH勾配が、当該初期pHから終期pHまで下降する、前項［１］および［３］～［１７］の何れか一項記載の分離方法；
［１９］　当該初期pHが、約11.0～約7.0の範囲における任意のpH（具体的には、約11.0、約10.8、約10.6、約10.4、約10.2、約10.0、約9.8、約9.6、約9.4、約9.2、約9.0、約8.8、約8.6、約8.4、約8.2、約8.0、約7.8、約7.6、約7.4、約7.2および約7.0からなる群から選択される何れかのpH）である、前項［１］および［３］～［１８］の何れか一項記載の分離方法；
［２０］　当該終期pHが、約4.0～約8.2の範囲における任意のpH（具体的には、約4.0、約4.2、約4.4、約4.6、約4.8、約5.0、約5.2、約5.4、約5.6、約5.8、約6.0、約6.2、約6.4、約6.6、約6.8、約7.0、約7.2、約7.4、約7.6、約7.8、約8.0および約8.2からなる群から選択される何れかのpH）（但し、当該初期pHは、当該終期pHよりも1.0以上高い。）前項［１］および［３］～［１９］の何れか一項記載の分離方法；
［２１］　当該pH勾配の範囲が、約11.0、約10.8、約10.6、約10.4、約10.2、約10.0、約9.8、約9.6、約9.4、約9.2、約9.0、約8.8、約8.6、約8.4、約8.2、約8.0、約7.8、約7.6、約7.4、約7.2および約7.0からなる群から選択される何れか一つの初期pHから、約4.0、約4.2、約4.4、約4.6、約4.8、約5.0、約5.2、約5.4、約5.6、約5.8、約6.0、約6.2、約6.4、約6.6、約6.8、約7.0、約7.2、約7.4、約7.6、約7.8、約8.0および約8.2からなる群から選択される何れか一つの終期pHの範囲（好ましくは、当該初期pHは、当該終期pHよりも2.0以上高い。）である前項［１］および［３］～［１８］の何れか一項記載の分離方法；
［２２］　当該pH勾配が、リニア勾配またはステップワイズ勾配である、前項［１］および［３］～［２１］の何れか一項記載の分離方法；
［２３］　前項［１］記載の溶離バッファーが、当該初期pHを有するバッファー（以下、「バッファーＡ」と略記することがある。）および終期pHを有するバッファー（以下、「バッファーＢ」と略記することがある。）の任意の比率による組合せからなる、前項［１］および［３］～［２２］の何れか一項記載の分離方法；
［２４］　当該バッファーＡおよび／またはバッファーＢが、MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、TAPSO、POPSO、HEPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSOおよびCAPSからなる群から各々選択される複数のグッド緩衝剤の組み合わせからなる、前項［２３］記載の分離方法；
［２５］　当該バッファーＡおよび／またはバッファーＢが、各々、MES、MOPS、TAPSおよびCAPSOからなる群から選択される複数のグッド緩衝剤の組み合わせ(好ましくは、MES、MOPS、TAPSおよびCAPSOの組み合わせ)からなる、前項［２３］記載の分離方法；
［２６］　当該バッファーＡが、Thermo Scientific（登録商標）CX-1 pH Gradient Buffer B(pH 10.2)であり、バッファーＢがThermo Scientific（登録商標）CX-1 pH Gradient Buffer A(pH 5.6)である、前項［２３］記載の分離方法；
［２７］　当該バッファーＡおよび／またはバッファーＢが、各々、Tris-acetate、Tris-phosphateおよびTris-citrateからなる群から選択される複数の緩衝剤の組み合わせからなる、前項［２３］記載の分離方法；
［２８］　当該バッファーＡおよびバッファーＢの組み合わせの比率を連続的または段階的に変化させることにより、当該溶離バッファーによるpH勾配を行う、前項［２３］～［２７］の何れか一項記載の分離方法；
［２９］　当該pH勾配が、約1～約20 CVの範囲における任意のカラム容量（具体的には、約1 CV、約2 CV、約3 CV、約4 CV、約5 CV、約6 CV、約7 CV、約8 CV、約9 CV、約10 CV、約15 CVおよび約20 CVからなる群から選択される何れかのカラム容量）に相当する間隔毎に、当該溶離バッファー中のバッファーＢの割合（％）を、約0.5％～約5％の範囲における任意の割合（具体的には、約0.5％、約1％、約1.5％、約2％、約2.5％、約3％、約3.5％、約4％、約4.5％および約5％からなる群から選択される何れかの割合）ずつ増加させることによって行われるステップワイズ勾配である、前項［２３］～［２８］の何れか一項記載の分離方法；
［３０］　当該pH勾配が、約1～約20 CVの範囲における任意のカラム容量（具体的には、約1 CV、約2 CV、約3 CV、約4 CV、約5 CV、約6 CV、約7 CV、約8 CV、約9 CV、約10 CV、約15 CVおよび約20 CVからなる群から選択される何れかのカラム容量）に相当する間隔毎に、当該溶離バッファーのpHを、約0.1～約1.0の範囲における任意の値（具体的には、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9および約1.0からなる群から選択される何れかの値）ずつ低下させることによって行われるステップワイズ勾配である、前項［２３］～［２８］の何れか一項記載の分離方法；
［３１］　当該pH勾配が、約20～約50 CVの範囲における任意のカラム容量（具体的には、約20 CV、約25 CV、約30 CV、約35 CV、約40 CV、約45 CVおよび約50 CVからなる群から選択される何れかのカラム容量）に相当する範囲において、当該溶離バッファー中のバッファーＢの割合（％）を、約0.5～約5％の範囲における任意の割合（具体的には、約0.5％、約1％、約1.5％、約2％、約2.5％、約3％、約3.5％、約4％、約4.5％および約5％からなる群から選択される何れかの割合）ずつ増加させることによって行われるステップワイズ勾配である、前項［２３］～［２８］の何れか一項記載の分離方法；
［３２］　当該pH勾配が、約20～約50 CVの範囲における任意のカラム容量（具体的には、約20 CV、約25 CV、約30 CV、約35 CV、約40 CV、約45 CVおよび約50 CVからなる群から選択される何れかのカラム容量）に相当する範囲において、当該溶離バッファーのpHを、約0.1～約1.0の範囲における任意の値（具体的には、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9および約1.0からなる群から選択される何れかの値）ずつ低下させることによって行われるステップワイズ勾配である、前項［２３］～［２８］の何れか一項記載の分離方法；
［３３］　当該pH勾配が、約20～約50 CVの範囲における任意のカラム容量（具体的には、約20 CV、約25 CV、約30 CV、約35 CV、約40 CV、約45 CVおよび約50 CVからなる群から選択される何れかのカラム容量）に相当する範囲において、当該溶離バッファー中のバッファーＢの割合（％）を連続的に増加させることによって行われるリニア勾配である、前項［２３］～［２８］の何れか一項記載の分離方法；
［３４］　当該pH勾配が、約20～約50 CVの範囲における任意のカラム容量（具体的には、約20 CV、約25 CV、約30 CV、約35 CV、約40 CV、約45 CVおよび約50 CVからなる群から選択される何れかのカラム容量）に相当する範囲において、当該溶離バッファーのpHを連続的に低下させることによって行われるリニア勾配である、前項［２３］～［２８］の何れか一項記載の分離方法；
［３５］　当該バッファーＢの割合（％）を、少なくとも、約10～約100％の範囲における任意の割合（具体的には、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％および約100％からなる群から選択される何れかの割合）から、約30％～約100％における任意の割合（好ましくは、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％および約100％からなる群から選択される何れかの割合）まで、段階的にあるいは連続的に増加させる、前項［２９］、［３１］および［３３］の何れか一項記載の分離方法；
［３６］　当該pH勾配が、（ａ）約4～約6 CVの範囲における任意のカラム容量に相当する間隔毎に、当該溶離バッファー中のバッファーＢの割合（％）を少なくとも約50～100％の範囲に渡って、約1～約2％の範囲における任意の割合ずつ段階的に増加させることによって実施されるか、または
（ｂ）約30～約40 CVのカラム容量に相当する範囲において、当該溶離バッファー中のpHを、約0.6～約1.0の範囲における任意のpHずつ段階的に低下させることによって行われる、前項［２３］～［２８］の何れか一項記載の分離方法；
［３７］　当該溶離バッファーおよび前項［２］記載の平衡化バッファーの線流速が、各々、約100～約800 cm/hの範囲における任意の線流速（具体的には、約100 cm/h、約150 cm/h、約200 cm/h、約250 cm/h、約300 cm/h、約350 cm/h、約400 cm/h、約450 cm/h、約500 cm/h、約550 cm/h、約600 cm/h、約650 cm/h、約700 cm/h、約750 cm/hおよび約800 cm/hからなる群から選択される何れかの線流速）である、前項［１］～［３６］の何れか一項記載の分離方法；
［３８］　前項［１］記載の平衡化バッファーおよび／または溶離バッファーの電気伝導度が、約1～約20 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度（好ましくは、約2～約15 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度であり、具体的には、約2 mS/cm、約3 mS/cm、約4 mS/cm、約5 mS/cm、約6 mS/cm、約7 mS/cm、約8 mS/cm、約9 mS/cm、約10 mS/cm、約11 mS/cm、約12 mS/cm、約13 mS/cm、約14 mS/cmおよび約15 mS/cmからなる群から選択される何れかの電気伝導度）である、前項［１］および［３］～［３７］の何れか一項記載の分離方法；
［３９］　前項［２］記載の平衡化バッファーの電気伝導度が、約1～約20 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度（好ましくは、約2～約15 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度であり、具体的には約2 mS/cm、約3 mS/cm、約4 mS/cm、約5 mS/cm、約6 mS/cm、約7 mS/cm、約8 mS/cm、約9 mS/cm、約10 mS/cm、約11 mS/cm、約12 mS/cm、約13 mS/cm、約14 mS/cmおよび約15 mS/cmからなる群から選択される電気伝導度であり、より好ましくは、約5～約7 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度）である、前項［２］～［１６］の何れか一項記載の分離方法；
［４０］　前項［２］記載の平衡化バッファーのpHが、約9.2～約7.4の範囲における任意のpH（具体的には、約9.2、約9.0、約8.8、約8.6、約8.4、約8.2、約8.0、約7.8、約7.6および約7.4からなる群から選択され、好ましくは、約8.2～約7.8の範囲における任意のpH）である、前項［２］～［１６］および［３９］の何れか一項記載の分離方法；
［４１］　前項［１］記載の平衡化バッファーおよび溶離バッファーの電気伝導度が実質的に同じである、前項［１］および［３］～［３８］の何れか一項記載の分離方法；
［４２］　前項［１］記載の分離方法における工程（ｉ）～（ｉｉｉ）の一もしくは二以上の工程、または前項［２］記載の分離方法における工程（ｉ）～（ｉｉｉ）の一もしくは二以上の工程において、適宜必要に応じて、洗浄バッファーによる当該イオン交換担体の洗浄工程を含む、前項［１］～［４１］の何れか一項記載の分離方法；
［４３］　分取もしくは回収されたタンパク質非着色体画分またはその濃縮液の色濃度が、当該日本薬局方の「色の比較試験法」における比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5と実質的に同じかあるいはそれよりも薄い、前項［１］～［４２］の何れか一項記載の分離方法；
［４４］　分取もしくは回収されたタンパク質非着色体画分またはその濃縮液の色濃度が、当該日本薬局方の「色の比較試験法」における比較標準溶液BY6との目視による比較試験において、当該BY6と実質的に同じかあるいはそれよりも薄い、前項［１］～［４２］の何れか一項記載の分離方法；
［４５］　分取もしくは回収されたタンパク質非着色体画分またはその濃縮液の色濃度が、当該日本薬局方の「色の比較試験法」における比較標準溶液BY7との目視による比較試験において、当該BY7と実質的に同じである、前項［１］～［４２］の何れか一項記載の分離方法；
［４６］　分取もしくは回収されたタンパク質非着色体画分またはその濃縮液のEm/UV*100値が約6.3以下である、前項［１］～［４２］の何れか一項記載の分離方法；
［４７］　分取もしくは回収されたタンパク質非着色体画分またはその濃縮液のEm/UV*100値が約4.1以下である、前項［１］～［４２］の何れか一項記載の分離方法；
［４８］　当該濃縮液のタンパク質濃度が、約50～約100 mg/mLの範囲における任意の濃度以上(具体的には、約50 mg/mL、約60 mg/mL、約70 mg/mL、約80 mg/mL、約90 mg/mLおよび約100 mg/mLからなる群から選択される何れかの濃度以上)である、前項［３］および［４３］～［４７］の何れか一項記載の分離方法；
［４９］　分取もしくは回収されたタンパク質非着色体画分における、タンパク質濃度が、約20～約300 mg/mLの範囲における任意の濃度である、前項［１］～［４８］の何れか一項記載の分離方法；
［５０］　分取もしくは回収されたタンパク質非着色体画分における、タンパク質濃度が、約100～約300 mg/mLの範囲における任意の濃度である、前項［１］～［４８］の何れか一項記載の分離方法；
［５１］　当該タンパク質が、抗体またはその抗体断片である、前項［１］～［５０］の何れか一項記載の分離方法；
［５２］　当該抗体が、二重特異性抗体である、前項［５１］記載の分離方法；
［５３］　当該抗体のアイソタイプが、IgG1またはIgG4である、前項［５１］または［５２］記載の分離方法；
［５４］　当該二重特異性抗体が、PD-1およびCD3に各々特異的に結合することができる二重特異性抗体（以下、「抗PD-1/CD3二重特異性抗体」と略記することがある。）である、前項［５２］または［５３］記載の分離方法；
［５５］　当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体が、WO2019/156199により特定される特許出願明細書に開示された当該PD-1/CD3二重特異性抗体である、前項［５４］記載の分離方法；
［５６］　当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体が、PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖ならびにCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖からなり、（ａ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなり、（ｂ）CD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号６のアミノ酸配列からなり、および（ｃ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖およびCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖がともに、配列番号７のアミノ酸配列からなる当該二重特異性抗体（以下、これら二重特異性抗体の一または二種以上を総称して「抗PD-1/CD3二重特異性抗体A」と略記することがある。）である、前項［５５］記載の分離方法；
［５７］　PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号５のアミノ酸配列からなる、前項［５６］記載の分離方法；
［５８］　前項［５６］または［５７］記載のPD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該各重鎖の重鎖定常領域が、各々、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる重鎖定常領域に置換され、前項［５６］または［５７］記載のCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該各重鎖の重鎖定常領域が、各々、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる重鎖定常領域に置換された、前項［５６］または［５７］記載の分離方法（以下、前項［５６］または［５７］記載の抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aの二つの重鎖定常領域が、各々本項の重鎖定常領域に置換された二重特異性抗体の一または二種以上を総称して「抗PD-1/CD3二重特異性抗体B」と略記することがある。）；
［５９］　タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液から、タンパク質非着色体を分離する方法であって、
（１）当該分離方法が、
（ｉ）当該溶液を陰イオン交換担体カラムに投入し、所定の初期pHを有する平衡化バッファーを使用して、当該タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を陰イオン交換担体に結合させる工程、
（ｉｉ）当該タンパク質非着色体およびタンパク質着色体が分離されるようあらかじめ定められた条件にて、当該初期pHから終期pHまで下降するpH勾配を形成する溶離バッファーを、所定の流速にて当該陰イオン交換担体カラムに流す工程、および
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）により溶離するタンパク質非着色体を含む所定の画分を分取する工程からなり、
（２）当該タンパク質が、PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖ならびにCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖からなり、（ａ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなり、（ｂ）CD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号６のアミノ酸配列からなり、および（ｃ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖およびCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖がともに、配列番号７のアミノ酸配列からなる、PD-1およびCD3に各々特異的に結合する二重特異性抗体であり、
（３）当該陰イオン交換担体が、Toyopearl（登録商標）NH2-750Fであり、
（４）当該平衡化バッファーおよび溶離バッファーの初期pHが約10.6～約8.4の範囲における任意のpHであり、当該溶離バッファーの終期pHが約7.0～約4.0の範囲における任意のpH（但し、当該初期pHは、当該終期pHよりも2.0以上高い。）であり、
（５）当該pH勾配が、（ａ）約4～約6 CVの範囲における任意のカラム容量に相当する間隔毎に、当該溶離バッファー中のバッファーＢの割合（％）を少なくとも約50～100％の範囲に渡って、約1～約2％ずつ段階的に増加させることによって実施されるか、（ｂ）約30～約40 CVのカラム容量に相当する範囲において、当該溶離バッファー中のpHを、約0.6～約1.0の範囲における任意のpHずつ段階的に低下させることによって行われ、
（６）当該溶離バッファーの線流速が、約100～約800 cm/hの任意の線流速であり、および
（７）分取されたタンパク質非着色体を含む溶液の色濃度が、（ｉ）当該比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5と実質的に同じかあるいはそれよりも薄い、もしくは（ｉｉ）分取されたタンパク質非着色体を含む溶液のEm/UV*100値が約6.3以下である、当該分離方法；
［６０］　タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液から、タンパク質非着色体を分離する方法であって、
（１）当該分離方法が、
（ｉ）当該溶液を陰イオン交換担体カラムに投入する工程、
（ｉｉ）当該溶液中の当該タンパク質着色体が当該陰イオン交換担体に結合し、当該タンパク質非着色体が結合しないよう調製された平衡化バッファーを所定の流速にて陰イオン交換担体カラムに流す工程、および
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）においてそのままフロースルーするタンパク質非着色体を含む画分を回収する工程からなり、
（２）当該タンパク質が、PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖ならびにCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖からなり、（ａ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなり、（ｂ）CD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号６のアミノ酸配列からなり、および（ｃ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖およびCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖がともに、配列番号７のアミノ酸配列からなる、PD-1およびCD3に各々特異的に結合する二重特異性抗体であり、
（３）当該陰イオン交換担体が、Toyopearl（登録商標）NH2-750Fであり、
（４）当該平衡化バッファーのpHが約8.2～約7.8の範囲における任意のpHであり、電気伝導度が約5～約7 mS/cmの任意の電気伝導度であり、
（５）当該平衡化バッファーの線流速が、約100～約400 cm/hの範囲における任意の線流速であり、および
（６）分取されたタンパク質非着色体を含む溶液の色濃度が、（ｉ）当該比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5と実質的に同じかあるいはそれよりも薄い、または（ｉｉ）分取されたタンパク質非着色体を含む溶液のEm/UV*100値が約6.3以下である、当該分離方法；
［１－１］　前項［１］～［６０］の何れか一項記載の分離方法（分離工程）を含む、タンパク質非着色体（好ましくは、前記［５１］～［５８］の何れか一項記載の抗体、二重特異性抗体または抗PD-1/CD3二重特異性抗体の非着色体）を含む溶液の製造方法；
［２－１］　約100～約300 mg/mLの濃度にて、前項［５５］～［５８］の何れか一項記載の抗PD-1/CD3二重特異性抗体を含む、無色または僅かに着色した溶液。
［２－２］　当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体の濃度が、約100～約200 mg/mLの範囲にある、前項［２－１］記載の溶液；
［２－３］　当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体の濃度が、約100～約150 mg/mLの範囲にある、前項［２－１］記載の溶液；
［２－４］　当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体の濃度が、約100～約120 mg/mLの範囲にある、前項［２－１］記載の溶液；
［２－５］　着色の低減ないし除去のための何れの工程も経ずに、無色または僅かに着色した性状である溶液を除く、前項［２－１］～［２－４］の何れか一項記載の溶液；
［２－６］　前項［５５］～［５８］の何れか一項記載の抗PD-1/CD3二重特異性抗体を含み、前項［１］～［６０］の何れか一項記載の分離方法を含む工程により製造された無色または僅かに着色した溶液；
［２－７］　前項［１］～［６０］の何れか一項記載の分離方法を含む工程により製造された、前項［２－１］～［２－５］の何れか一項記載の溶液；
［２－８］　さらに必要に応じて濃縮されて製造された、前項［２－１］～［２－７］の何れか一項記載の溶液；
［２－９］　当該比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5と実質的に同じかあるいはそれよりも薄い、前項［２－１］～［２－８］の何れか一項記載の溶液；
［２－１０］　当該比較標準溶液BY6との目視による比較試験において、当該BY6と実質的に同じかあるいはそれよりも薄い、前項［２－１］～［２－８］の何れか一項記載の溶液；
［２－１１］　当該比較標準溶液BY7との目視による比較試験において、当該BY7と実質的に同じである、前項［２－１］～［２－８］の何れか一項記載の溶液；
［２－１２］　当該溶液のEm/UV*100値が、約6.3以下である、前項［２－１］～［２－８］の何れか一項記載の溶液；
［２－１３］　当該溶液のEm/UV*100値が、約4.1以下である、前項［２－１］～［２－８］および［２－１０］の何れか一項記載の溶液；
［３－１］　前項［２－１］～［２－１３］の何れか一項記載の溶液を含む医薬組成物;ならびに
［４－１］　自己免疫疾患もしくは移植片対宿主病（GVHD）あるいは血液がんの予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療における、前項［３－１］記載の医薬組成物の使用。
　本発明のタンパク質製剤原薬の着色除去方法により、終末糖化産物を原因とするタンパク質溶液の着色を除去することが可能となる。
抗PD-1/CD3二重特異性抗体を強陽イオン交換クロマトグラフィーで分画し、当該分画フラクションを100 mg/mLに濃縮した後、その高着色フラクションと低着色フラクションを混合して比較標準溶液BY3.5に対応するよう調製したサンプルの逆相HPLC分析のクロマトグラムを表す。X軸は通液量（mL）を、Y軸はUV吸光検出ピーク面積（UV280）ならびに蛍光強度検出ピーク面積（Em560(ex380)）に各々10を乗じた値（UV280×10, Em560(ex380)×10）を各々表す。図中、実線はUV検出クロマトグラム（UV280_BY3.5）、破線は蛍光検出クロマトグラム（Fluorescene_BY3.5）を表す。矢印にて目的物のピークを示す。 抗PD-1/CD3二重特異性抗体を強陽イオン交換クロマトグラフィーで分画し、当該分画フラクションを100 mg/mLに濃縮した後、その高着色フラクションと低着色フラクションを混合して比較標準溶液BY6.0に対応するよう調製したサンプルの逆相HPLC分析のクロマトグラムを表す。X軸は通液量（mL）を、Y軸はUV吸光検出ピーク面積（UV280）ならびに蛍光強度検出ピーク面積（Em560(ex380)）に各々10を乗じた値（UV280×10, Em560(ex380)×10）を各々表す。図中、実線はUV検出クロマトグラム（UV280_BY6.0）、破線は蛍光検出クロマトグラム（Fluorescene_BY6.0）を表す。矢印にて目的物のピークを示す。 100 mg/mLに濃縮した抗PD-1/CD3二重特異性抗体の高着色フラクションと低着色フラクションを混合して調製した、比較標準溶液BY3.5、BY4、BY4.5、BY5、BY6に各々対照するサンプルをHPLC分析した結果を表す。横軸は比較標準溶液の番号、縦軸はEm/UV*100値を表し、各縦棒グラフ上部の数値は、各比較標準溶液のEm/UV*100値を表す。 Toyopearl（登録商標）NH2-750Fを充填したカラムを用いた陰イオン交換のBind-eluteモードでのpHステップワイズ勾配溶出クロマトグラムを表す。分離操作に供したサンプルは抗体である。X軸は通液量（mL）、左側のY軸はUV吸光検出ピーク面積（UV280）、右側のY軸は電気伝導度（mS/cm）に10を乗じた値を各々表す。また、右側のY軸は2台の移動相送液ポンプAおよびBのうち、Bでの送液量の割合（％B）の表記も兼ねている。図中、黒実線はUV検出クロマトグラム（UV280）、破線は電気伝導度（Conductivity）、灰色実線はBポンプでの送液割合（％B）を各々表す。また、番号１～４の矢印は着色分析に供した精製フラクションの位置を示している。 Toyopearl（登録商標）NH2-750Fを充填したカラムを用いた陰イオン交換のFlow-throughモードでのクロマトグラムを表す。分離操作に供したサンプルは抗体である。X軸およびY軸ならびに図中の黒実線、破線および灰色実線は各々図４と同じ意味を表す。逆U字は、精製後に分析に供した回収フラクションの範囲を表す。 Capto（登録商標）adhereを充填したカラムを用いた陰イオン交換のBind-eluteモードでのpHリニア勾配溶出クロマトグラムを表す。分離操作に供したサンプルは抗体である。X軸およびY軸ならびに図中の黒実線、破線および灰色実線は各々図４と同じ意味を表す。番号１～５の矢印は着色分析に供した精製フラクションの位置を示している。 Cellufine（登録商標） MAX IB充填したカラムを用いた陰イオン交換のBind-eluteモードでのpHリニア勾配溶出クロマトグラムを表す。分離操作に供したサンプルは抗体である。X軸およびY軸ならびに図中の黒実線、破線および灰色実線は各々図４と同じ意味を表す。番号１～５の矢印は着色分析に供した精製フラクションの位置を示している。 Capto（登録商標） Qを充填したカラムを用いた陰イオン交換のBind-eluteモードでのpHリニア勾配溶出クロマトグラムを表す。分離操作に供したサンプルはウシ血清由来のアルブミン（BSA）である。X軸およびY軸ならびに図中の黒実線、破線および灰色実線は各々図４と同じ意味を表す。番号１～３の矢印は着色分析に供した精製フラクションの位置を示している。 当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aを構成する、PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖ならびにCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖の各アミノ酸配列を示す。 当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体Bを構成する重鎖定常領域（PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における重鎖定常領域）の各アミノ酸配列を示す。 当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体Bを構成する重鎖定常領域（CD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における重鎖定常領域）の各アミノ酸配列を示す。
　本発明は、タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液から、タンパク質非着色体を分離する方法であって、
（１）当該溶液をイオン交換担体カラムに投入し、所定の初期pHを有する平衡化バッファーを使用して、当該タンパク質非着色体およびタンパク質着色体をイオン交換担体に結合させる工程、
（２）当該タンパク質非着色体およびタンパク質着色体が分離されるよう、当該初期pHから終期pHまで変動するpH勾配を形成する溶離バッファーを所定の流速にて当該イオン交換担体カラムに流す工程、および
（３）前記工程（２）により溶離するタンパク質非着色体を含む所定の画分を分取する工程からなる、分離方法（以下、「Bind-Elute法」とする。）に関する。
　また、本発明は、タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液から、タンパク質非着色体を分離する方法であって、
（１ａ）当該溶液をイオン交換担体カラムに投入する工程、
（２ａ）当該溶液中の当該タンパク質着色体が当該イオン交換担体に結合し、当該タンパク質非着色体が結合しないよう調製された平衡化バッファーを所定の流速にて当該イオン交換担体カラムに流す工程、および
（３ａ）前記工程（２ａ）においてそのままフロースルーするタンパク質非着色体を含む画分を回収する工程からなる分離方法（以下、「Flow-Through法」とする。）も含む。
　本発明における「タンパク質着色体」とは、本発明の課題である着色の原因となるタンパク質の修飾体であり、その着色の原因となるタンパク質修飾としては、複数種の終末糖化産物（以下、「AGEs」と略記することがある。）が挙げられ、それらが含まれる溶液は、その生成量に応じて、微黄色ないし黄色を呈する。ここで、終末糖化産物とは、タンパク質のリシン残基等における遊離のアミノ基がグルコースやフルクトースなどの還元糖と非酵素的に反応した後、不可逆的な脱水や縮合、酸化および／または還元などの反応を繰り返して生成される複数種のタンパク質修飾体の総称であり、グルコース由来AGEs、グリセルアルデヒド由来AGEs、グリコールアルデヒド由来AGEs、メチルグリオキサール由来AGEs、グリオキサール由来AGEsおよび3-デオキシグルコソン由来AGEsなど様々なAGEsの生成が確認されており、その一部に、黄褐色の蛍光を呈する修飾体が含まれていると報告されている。当該タンパク質着色体の等電点は、約5～約9.1の範囲にあり、概ね約6～約7の範囲にある。
　一方、「タンパク質非着色体」とは、当該タンパク質修飾が実質的に生じていないか、もしくはその溶液が目視により着色を呈さないと認識される程度に軽微である目的のタンパク質である。当該タンパク質非着色体の等電点は、約7～約9.5の範囲にあるが、具体的には、約7.0以上かつ約7.5未満、約7.5以上かつ約8.0未満、約8.0以上かつ約8.5未満、約8.5以上かつ約9.0未満および約9.0以上かつ約9.5未満からなる群から選択される何れかの範囲にある。
　本発明の分離方法の適用が求められるタンパク質溶液としては、例えば、それ自体もしくはその濃縮液の色濃度が、第十七改正日本薬局方の一般試験法における項目2.65「色の比較試験法」における比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5よりも濃い、またはEm/UV*100値として約6.3を超えるものが対象となる。
　本発明における「所定の初期pHを有する平衡化バッファー」とは、本発明において使用される溶離バッファーにより形成されるpH勾配の上限としてあらかじめ決定されたpH値と実質的に同じpH値を有するバッファーであり、イオン交換担体カラムに投入された溶液中のタンパク質非着色体およびタンパク質着色体の両者が、当該イオン交換担体に結合できる、所定の電気導電率およびｐH値となるよう、あらかじめ調製されたものである。
　本発明の分離方法（Bind-Elute法）において使用される平衡化バッファーおよび／または溶離バッファーの電気伝導度は、適用されるタンパク質の性質や当該陰イオン交換担体の種類に応じて、最適の電気伝導度をあらかじめ決定することができるが、例えば、約1～約20 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度を選択することができ、好ましくは、約2～約15 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度であり、具体的には、例えば、約2 mS/cm、約3 mS/cm、約4 mS/cm、約5 mS/cm、約6 mS/cm、約7 mS/cm、約8 mS/cm、約9 mS/cm、約10 mS/cm、約11 mS/cm、約12 mS/cm、約13 mS/cm、約14 mS/cmおよび約15 mS/cmが挙げられる。Bind-Elute法の場合、一般的に、平衡化バッファーおよび溶離バッファーの電気伝導度は、実質的に同じである。
　本発明の分離方法（Flow-Through法）において使用される平衡化バッファーのpHおよび電気伝導度は、溶液中の当該タンパク質着色体が当該イオン交換担体に結合し、当該タンパク質非着色体が結合しないようあらかじめ調製することができるが、当該pHは約9.2～約7.4における任意のpH値、具体的には、例えば、約9.2、約9.0、約8.8、約8.6、約8.4、約8.2、約8.0、約7.8、約7.6および約7.4が挙げられ、好ましくは、約8.6～約7.4の範囲における任意のpH値であり、より好ましくは、約8.2～約7.4の範囲における任意のpH値であり、さらに好ましくは約8.2～約7.8の範囲における任意のpH値である。一方、その電気伝導度は、約１～約20 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度を選択することができ、好ましくは、約2～15 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度、具体的には、例えば、2 mS/cm、約3 mS/cm、約4 mS/cm、約5 mS/cm、約6 mS/cm、約7 mS/cm、約8 mS/cm、約9 mS/cm、約10 mS/cm、約11 mS/cm、約12 mS/cm、約13 mS/cm、約14 mS/cmおよび約15 mS/cmが挙げられ、好ましくは約5～7 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度である。Flow-Through法において使用される平衡化バッファーとしては、例えば、HEPESバッファー（pH 8.0）が好ましい。
　本発明の分離方法において使用される洗浄バッファーは、当該タンパク質非着色体を溶離させる前に、当該陰イオン交換担体を洗浄するために主に使用される。洗浄バッファーとしては、例えば、目的とするタンパク質非着色体と着色体以外の不純物をイオン交換担体から除去できる組成を有するものや目的とするタンパク質非着色体の溶出範囲を十分に外れた高いpHあるいは低い電気伝導度を有するものなどが使用できる。
　本発明におけるイオン交換担体として好ましくは、陰イオン交換担体である。また、その形態としては、例えば、小粒子、膜またはモノリスの形態が挙げられるが、好ましくは、小粒子の形態である。なお、本発明におけるイオン交換担体カラムとは、イオン交換担体が充填されたカラムを意味する。
　ここで、陰イオン交換担体としては、陰イオン交換作用を示す限り限定されず、例えば、強陰イオン交換担体、弱陰イオン交換担体およびマルチモード・陰イオン交換担体などがある。
　強陰イオン交換担体としては、例えば、Fractogel（登録商標）EMD TMAE (M)、Fractogel（登録商標）EMD TMAE Medcap (M)、Fractogel（登録商標）EMD TMAE Hicap (M)、Eshmuno（登録商標）Q、Eshmuno（登録商標）QPX、Eshmuno（登録商標）QPX Hicap、Capto（登録商標）Q、Capto（登録商標）Q ImpRes、Q Sepharose（登録商標）FF、Q Sepharose（登録商標）HP、Q Sepharose（登録商標）XL、Source（登録商標）30Q、POROS（登録商標）50 HQ、POROS（登録商標）50 XQ、POROS（登録商標）50 PI、Q HyperCel（登録商標）、Toyopearl（登録商標）GigaCap Q 650M、Toyopearl（登録商標）GigaCap Q 650S、Toyopearl（登録商標）Super Q、YMC（登録商標）BioPro Q、Macro-Prep（登録商標）High Q、Nuvia（登録商標）Q、UNOsphere（登録商標）Q、Cellufine（登録商標）Q-500、Cellufine（登録商標）MAX Q-rおよびCellufine（登録商標）MAX Q-h等が挙げられる。
　また、弱陰イオン交換担体としては、例えば、Fractogel（登録商標）EMD DEAE、Fractogel（登録商標）EMD DMAE、Capto（登録商標）DEAE、DEAE Ceramic HyperD（登録商標）F、Toyopearl（登録商標）NH2-750F、TOYOPEARL（登録商標）DEAE-650C、TOYOPEARL（登録商標）DEAE-650M、TOYOPEARL（登録商標）DEAE-650S、Cellufine（登録商標）A-200、Cellufine（登録商標）A-500、Cellufine（登録商標）A-800およびCellufine（登録商標）MAX DEAE等が挙げられる。
　さらに、マルチモード・陰イオン交換担体としては、例えば、Toyopearl（登録商標）NH2-750F、Capto（登録商標）Adhere、Capto（登録商標）Adhere ImpRes、Capto（登録商標）MMC、Capto（登録商標）core 700およびCellufine（登録商標）IBなどが挙げられる。
　ここで、本発明の分離方法に使用できる陰イオン交換担体として好ましくは、マルチモード・陰イオン交換担体であり、より好ましくは、Toyopearl（登録商標）NH2-750Fである。
　本発明における「初期pHから終期pHまで変動するpH勾配を形成する溶離バッファー」とは、少なくとも、溶出させる目的のタンパク質の等電点を挟むpH範囲において、リニア勾配もしくはステップワイズ勾配にて変動するpH勾配を形成するように調製される、二種以上のバッファーの組み合わせからなる溶離液である。当該溶離バッファーは、例えば、目的とするタンパク質の等電点やその分布に応じて当該pH範囲を事前に決定し、当該pH範囲の上限である初期pHを有するバッファー（以下、「バッファーＡ」と略記することがある。）および当該pH範囲の下限である終期pHを有するバッファー（以下、「バッファーＢ」と略記することがある。）を、所定のpHとなるよう任意の比率で組み合わせて調製でき、両バッファーの当該組合せ比率を連続的にあるいは段階的に変動させることによって、当該工程におけるpH勾配を形成できる。
　本発明の分離方法において適用されるpH勾配としては、初期pHから終期pHまで下降するpH勾配である。ここで、当該初期pHとしては、例えば、約11.0～約7.0の範囲における任意のpH値、具体的には、約11.0、約10.8、約10.6、約10.4、約10.2、約10.0、約9.8、約9.6、約9.4、約9.2、約9.0、約8.8、約8.6、約8.4、約8.2、約8.0、約7.8、約7.6、約7.4、約7.2および約7.0からなる群から選択される何れかのpH値であり、好ましくは、約10.8～約7.2、約10.8～約7.4、約10.8～約7.6、約10.8～約7.8、約10.8～約8.0、約10.8～約8.2、約10.8～約8.4、約10.6～約7.2、約10.6～約7.4、約10.6～約7.6、約10.6～約7.8、約10.6～約8.0、約10.6～約8.2または約10.6～約8.4の各々の範囲における任意のpH値であり、より好ましくは、約10.6～約8.4の範囲における任意のpH値である。一方、当該終期pHとしては、例えば、約4.0～約8.2の範囲における任意のpH値、具体的には、約4.0、約4.2、約4.4、約4.6、約4.8、約5.0、約5.2、約5.4、約5.6、約5.8、約6.0、約6.2、約6.4、約6.6、約6.8、約7.0、約7.2、約7.4、約7.6、約7.8、約8.0および約8.2からなる群から選択される何れかのpH値であり、好ましくは、約4.0～約8.0、約4.0～約7.8、約4.0～約7.6、約4.0～約7.4、約4.0～約7.2または約4.0～約7.0の各々の範囲における任意のpH値であり、より好ましくは、約4.0～約7.0の範囲における任意のpH値である。但し、初期pHは、終期pHよりも約1.0以上高い。
　さらに、当該pH勾配の範囲としては、例えば、約11.0、約10.8、約10.6、約10.4、約10.2、約10.0、約9.8、約9.6、約9.4、約9.2、約9.0、約8.8、約8.6、約8.4、約8.2、約8.0、約7.8、約7.6、約7.4、約7.2および約7.0からなる群から選択される何れか一つの初期pHから、約4.0、約4.2、約4.4、約4.6、約4.8、約5.0、約5.2、約5.4、約5.6、約5.8、約6.0、約6.2、約6.4、約6.6、約6.8、約7.0、約7.2、約7.4、約7.6、約7.8、約8.0および約8.2からなる群から選択される何れか一つの終期pHへの範囲が挙げられるが、好ましくは、初期pHは、終期pHよりも2.0以上高い。当該pH勾配の範囲として具体的には、約11.0～約4.0、約11.0～約4.2、約11.0～約4.4、約11.0～約4.6、約11.0～約4.8、約11.0～約5.0、約11.0～約5.2、約11.0～約5.4、約11.0～約5.6、約11.0～約5.8、約11.0～約6.0、約11.0～約6.2、約11.0～約6.4、約11.0～約6.6、約11.0～約6.8、約11.0～約7.0、約11.0～約7.2、約11.0～約7.4、約11.0～約7.6、約11.0～約7.8、約11.0～約8.0、約11.0～約8.2、約10.8～約4.0、約10.8～約4.2、約10.8～約4.4、約10.8～約4.6、約10.8～約4.8、約10.8～約5.0、約10.8～約5.2、約10.8～約5.4、約10.8～約5.6、約10.8～約5.8、約10.8～約6.0、約10.8～約6.2、約10.8～約6.4、約10.8～約6.6、約10.8～約6.8、約10.8～約7.0、約10.8～約7.2、約10.8～約7.4、約10.8～約7.6、約10.8～約7.8、約10.8～約8.0、約10.8～約8.2、約10.6～約4.0、約10.6～約4.2、約10.6～約4.4、約10.6～約4.6、約10.6～約4.8、約10.6～約5.0、約10.6～約5.2、約10.6～約5.4、約10.6～約5.6、約10.6～約5.8、約10.6～約6.0、約10.6～約6.2、約10.6～約6.4、約10.6～約6.6、約10.6～約6.8、約10.6～約7.0、約10.6～約7.2、約10.6～約7.4、約10.6～約7.6、約10.6～約7.8、約10.6～約8.0、約10.6～約8.2、約10.4～約4.0、約10.4～約4.2、約10.4～約4.4、約10.4～約4.6、約10.4～約4.8、約10.4～約5.0、約10.4～約5.2、約10.4～約5.4、約10.4～約5.6、約10.4～約5.8、約10.4～約6.0、約10.4～約6.2、約10.4～約6.4、約10.4～約6.6、約10.4～約6.8、約10.4～約7.0、約10.4～約7.2、約10.4～約7.4、約10.4～約7.6、約10.4～約7.8、約10.4～約8.0、約10.4～約8.2、約10.2～約4.0、約10.2～約4.2、約10.2～約4.4、約10.2～約4.6、約10.2～約4.8、約10.2～約5.0、約10.2～約5.2、約10.2～約5.4、約10.2～約5.6、約10.2～約5.8、約10.2～約6.0、約10.2～約6.2、約10.2～約6.4、約10.2～約6.6、約10.2～約6.8、約10.2～約7.0、約10.2～約7.2、約10.2～約7.4、約10.2～約7.6、約10.2～約7.8、約10.2～約8.0、約10.2～約8.2、約10.0～約4.0、約10.0～約4.2、約10.0～約4.4、約10.0～約4.6、約10.0～約4.8、約10.0～約5.0、約10.0～約5.2、約10.0～約5.4、約10.0～約5.6、約10.0～約5.8、約10.0～約6.0、約10.0～約6.2、約10.0～約6.4、約10.0～約6.6、約10.0～約6.8、約10.0～約7.0、約10.0～約7.2、約10.0～約7.4、約10.0～約7.6、約10.0～約7.8、約10.0～約8.0、約9.8～約4.0、約9.8～約4.2、約9.8～約4.4、約9.8～約4.6、約9.8～約4.8、約9.8～約5.0、約9.8～約5.2、約9.8～約5.4、約9.8～約5.6、約9.8～約5.8、約9.8～約6.0、約9.8～約6.2、約9.8～約6.4、約9.8～約6.6、約9.8～約6.8、約9.8～約7.0、約9.8～約7.2、約9.8～約7.4、約9.8～約7.6、約9.8～約7.8、約9.6～約4.0、約9.6～約4.2、約9.6～約4.4、約9.6～約4.6、約9.6～約4.8、約9.6～約5.0、約9.6～約5.2、約9.6～約5.4、約9.6～約5.6、約9.6～約5.8、約9.6～約6.0、約9.6～約6.2、約9.6～約6.4、約9.6～約6.6、約9.6～約6.8、約9.6～約7.0、約9.6～約7.2、約9.6～約7.4、約9.6～約7.6、約9.4～約4.0、約9.4～約4.2、約9.4～約4.4、約9.4～約4.6、約9.4～約4.8、約9.4～約5.0、約9.4～約5.2、約9.4～約5.4、約9.4～約5.6、約9.4～約5.8、約9.4～約6.0、約9.4～約6.2、約9.4～約6.4、約9.4～約6.6、約9.4～約6.8、約9.4～約7.0、約9.4～約7.2、約9.4～約7.4、約9.2～約4.0、約9.2～約4.2、約9.2～約4.4、約9.2～約4.6、約9.2～約4.8、約9.2～約5.0、約9.2～約5.2、約9.2～約5.4、約9.2～約5.6、約9.2～約5.8、約9.2～約6.0、約9.2～約6.2、約9.2～約6.4、約9.2～約6.6、約9.2～約6.8、約9.2～約7.0、約9.2～約7.2、約9.0～約4.0、約9.0～約4.2、約9.0～約4.4、約9.0～約4.6、約9.0～約4.8、約9.0～約5.0、約9.0～約5.2、約9.0～約5.4、約9.0～約5.6、約9.0～約5.8、約9.0～約6.0、約9.0～約6.2、約9.0～約6.4、約9.0～約6.6、約9.0～約6.8、約9.0～約7.0、約8.8～約4.0、約8.8～約4.2、約8.8～約4.4、約8.8～約4.6、約8.8～約4.8、約8.8～約5.0、約8.8～約5.2、約8.8～約5.4、約8.8～約5.6、約8.8～約5.8、約8.8～約6.0、約8.8～約6.2、約8.8～約6.4、約8.8～約6.6、約8.8～約6.8、約8.6～約4.0、約8.6～約4.2、約8.6～約4.4、約8.6～約4.6、約8.6～約4.8、約8.6～約5.0、約8.6～約5.2、約8.6～約5.4、約8.6～約5.6、約8.6～約5.8、約8.6～約6.0、約8.6～約6.2、約8.6～約6.4、約8.6～約6.6、約8.4～約4.0、約8.4～約4.2、約8.4～約4.4、約8.4～約4.6、約8.4～約4.8、約8.4～約5.0、約8.4～約5.2、約8.4～約5.4、約8.4～約5.6、約8.4～約5.8、約8.4～約6.0、約8.4～約6.2、約8.4～約6.4、約8.2～約4.0、約8.2～約4.2、約8.2～約4.4、約8.2～約4.6、約8.2～約4.8、約8.2～約5.0、約8.2～約5.2、約8.2～約5.4、約8.2～約5.6、約8.2～約5.8、約8.2～約6.0、約8.2～約6.2、約8.0～約4.0、約8.0～約4.2、約8.0～約4.4、約8.0～約4.6、約8.0～約4.8、約8.0～約5.0、約8.0～約5.2、約8.0～約5.4、約8.0～約5.6、約8.0～約5.8、約8.0～約6.0、約7.8～約4.0、約7.8～約4.2、約7.8～約4.4、約7.8～約4.6、約7.8～約4.8、約7.8～約5.0、約7.8～約5.2、約7.8～約5.4、約7.8～約5.6、約7.8～約5.8、約7.6～約4.0、約7.6～約4.2、約7.6～約4.4、約7.6～約4.6、約7.6～約4.8、約7.6～約5.0、約7.6～約5.2、約7.6～約5.4、約7.6～約5.6、約7.4～約4.0、約7.4～約4.2、約7.4～約4.4、約7.4～約4.6、約7.4～約4.8、約7.4～約5.0、約7.4～約5.2、約7.4～約5.4、約7.2～約4.0、約7.2～約4.2、約7.2～約4.4、約7.2～約4.6、約7.2～約4.8、約7.2～約5.0、約7.2～約5.2、約7.0～約4.0、約7.0～約4.2、約7.0～約4.4、約7.0～約4.6、約7.0～約4.8および約7.0～約5.0の各範囲が挙げられる。
　ここで、バッファーＡおよび／またはバッファーＢは、個々の分離条件に応じて、例えば、MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、TAPSO、POPSO、HEPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSOおよびCAPSからなる群から選択される複数のグッド緩衝剤の組み合わせから各々調製できる。特に、本発明にかかる抗PD-1/CD3二重特異性抗体を含む溶液を当該分離方法に付す場合における当該両バッファーは、例えば、MES、MOPS、TAPSおよびCAPSOからなる群から選択されるグッド緩衝剤の組み合わせから調製するのが好ましく、特に、ThermoFisher社のThermo Scientific（登録商標）CX-1 pH Gradient Buffer A(pH 5.6)およびCX-1 pH Gradient Buffer B(pH 10.2)が好ましい。
　また、当該両バッファーは、例えば、Tris-acetate、Tris-phosphateおよびTris-citrateからなる群から選択される複数の緩衝剤の組み合わせから調製することもできる。
　当該pH勾配の条件は、当該分離方法に付すタンパク質の性質に応じて、その非着色体および着色体が分離されるようあらかじめ決定することができる。ここで、「タンパク質非着色体およびタンパク質着色体が分離される」とは、当該分離方法にて回収されたタンパク質非着色体を含む画分またはその濃縮液が、「無色または僅かに着色」という色濃度となるように事前に定められた条件にて両タンパク質が分離されること、あるいは回収されるタンパク質非着色体を含む画分に当該着色体が実質的に含まれないか、もしくは当該着色体の残存比率が当該非着色体に比べ、「無色または僅かに着色」という色濃度を形成するように低減されることを意味する。
　本発明において、着色の程度を表す定義として使用される「無色または僅かに着色」という色濃度は、定性的あるいは定量的解析によって評価でき、例えば、定性的解析としては、米国薬局方2012（USP Monograph 631, Color and Achromicity）、ヨーロッパ薬局方5.0（EP Method 2.2.2, Degree of Coloration of Liquids）または第十七改正日本薬局方の一般試験法における項目2.65「色の比較試験法」に挙げられている比較標準溶液との目視による比較試験により行うことができる。例えば、本発明におけるタンパク質の着色に関して、帯褐黄色比較標準液BY1～BY7におけるBY7と実質的に同じかそれよりも薄い場合には「無色」と評価でき、BY7よりも濃いものの、BY5と実質的に同じかそれよりも薄い場合には「僅かに着色」もしくは「微黄色」と評価できる。具体的には、Clarity, Opalescence and Coloration（COC）アッセイ、すなわち、平底の内径15～25 mmの無色透明な中性ガラス製の試験管に、層の深さが40 mmとなるよう、当該比較標準液と試験する溶液を各々注ぎ、両者を比較することで実施できる。
　また、定量的解析としては、例えば、上述のEm/UV*100値を算出する評価法が挙げられ、分光光度計による紫外線吸収測定および分光蛍光高度計による蛍光スペクトル測定にて実施することができる。ここで、当該「色の比較試験法」における帯褐黄色比較標準液BY6は、当該Em/UV*100値として約4.1に相当し、BY5は約6.3に相当する。
　本発明により分離もしくは分取されたタンパク質非着色体画分またはその濃縮液の色濃度は、当該比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5と実質的に同じかあるいはそれよりも薄いと評価されることが好ましく、さらには、当該BY6と実質的に同じかあるいはそれよりも薄いと評価されることがより好ましく、当該BY7と実質的に同じであると評価されることが最も好ましい。ここで、当該タンパク質非着色体画分の濃縮液（当該タンパク質濃度が、約50～約100 mg/mLの範囲における任意の濃度以上であり、好ましくは、約50 mg/mL、約60 mg/mL、約70 mg/mL、約80 mg/mL、約90 mg/mLおよび約100 mg/mLからなる群から選択される濃度以上)が、当該BY5と実質的に同じかあるいはそれよりも薄いと評価されるか、さらには、当該BY6と実質的に同じかあるいはそれよりも薄いと評価されるか、当該BY7と実質的に同じであると評価されることがより好ましい。なお、当該タンパク質非着色体画分の濃縮は、公知の方法、例えば、限外ろ過法、沈殿-再溶解法および凍結乾燥-再溶解法などで実施できる。
　本発明の分離方法におけるpH勾配のうち、ステップワイズ勾配の態様としては、例えば、約1～20 CVの範囲における任意のカラム容量（CV（Column Volume））、例えば、約1 CV、約2 CV、約3 CV、約4 CV、約5 CV、約6 CV、約7 CV、約8 CV、約9 CV、約10 CV、約15 CVおよび約20 CVからなる群から選択される何れかのカラム容量に相当する間隔毎に、当該溶離バッファー中のバッファーＢの割合（％）を、約0.5～約5％の範囲における任意の割合、例えば、約0.5％、約1％、約1.5％、約2％、約2.5％、約3％、約3.5％、約4％、約4.5％および約5％からなる群から選択される何れかの割合ずつ増加させることで、当該初期pHから終期pHまで段階的なpH勾配をかけることができる。ここで、当該バッファーＢの割合（％）を、少なくとも、約10～約100％の範囲における任意の割合、例えば、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約70％、約90％および約100％からなる群から選択される何れかの割合から、約30～約100％の範囲における任意の割合、例えば、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％および約100％からなる群から選択される何れかの割合まで、当該割合ずつ段階的に増加させて行うことができる。当該バッファーＢの割合（％）を増加させる範囲として具体的には、約10～約30％、約10～約40％、約10～約50％、約10～約60％、約10～約70％、約10～約80％、約10～約90％、約10～約100％、約20～約40％、約20～約50％、約20～約60％、約20～約70％、約20～約80％、約20～約90％、約20～約100％、約30～約50％、約30～約60％、約30～約70％、約30～約80％、約30～約90％、約30～約100％、約40～約60％、約40～約70％、約40～約80％、約40～約90％、約40～約100％、約50～約70％、約50～約80％、約50～約90％、約50～約100％、約60～約80％、約60～約90％、約60～約100％、約70～約90％、約70～約100％および約80～約100％の各範囲が挙げられる。なお、「カラム容量（CV）」とは、カラム内に充填された充填剤の隙間の体積、すなわち、その隙間を満たすために必要な溶媒量を意味し、その容量を「1CV」と表す。
　また、本発明の分離方法におけるpH勾配のうち、ステップワイズ勾配の別の態様として、約1～約20 CVの範囲における任意のカラム容量、例えば、約1 CV、約2 CV、約3 CV、約4 CV、約5 CV、約6 CV、約7 CV、約8 CV、約9 CV、約10 CV、約15 CVおよび約20 CVからなる群から選択される何れかのカラム容量に相当する間隔毎に、当該溶離バッファーのpHを、約0.1～約1.0の範囲における任意の値、例えば、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9および約1.0からなる群から選択される何れかの値ずつpHを低下させることで、当該初期pHから終期pHまで段階的なpH勾配を掛けることもできる。
　また、本発明の分離方法におけるpH勾配のうち、ステップワイズ勾配のさらにもう一つの別の態様として、約20～約50 CVの範囲における任意のカラム容量、例えば、約20 CV、25 CV、約30 CV、約35 CV、約40 CV、約45 CVおよび約50 CVからなる群から選択される何れかのカラム容量に相当する範囲において、当該溶離バッファー中のバッファーＢの割合（％）を、約0.5～約5％の範囲における任意の割合、例えば、約0.5％、約1％、約1.5％、約2％、約2.5％、約3％、約3.5％、約4％、約4.5％および約5％からなる群から選択される何れかの割合ずつ増加させることで、当該初期pHから終期pHまで段階的なpH勾配を掛けることができる。ここで、当該バッファーＢの割合（％）を、少なくとも、約10～約100％の範囲における任意の割合、例えば、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％および約100％からなる群から選択される何れかの割合から、約30～約100％の範囲における任意の割合、例えば、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％および約100％からなる群から選択される何れかの割合まで、当該割合ずつ段階的に増加させて行うことができる。
　同様に、本発明の分離方法におけるpH勾配のうち、ステップワイズ勾配のさらにもう一つの別の態様として、約20～約50 CVの範囲における任意のカラム容量、例えば、約20 CV、約25 CV、約30 CV、約35 CV、約40 CV、約45 CVおよび約50 CVからなる群から選択される何れかのカラム容量に相当する範囲において、当該溶離バッファーのpHを、約0.1～約1.0の範囲における任意の値、例えば、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9および約1.0からなる群から選択される何れかの値ずつpHを低下させることで、当該初期pHから終期pHまで段階的なpH勾配を掛けることもできる。
　一方、本発明の分離方法におけるpH勾配のうち、リニア勾配の態様として、約20～約50 CVの範囲における任意のカラム容量、例えば、約20 CV、25 CV、30 CV、約35 CV、約40 CV、約45 CVおよび約50 CVからなる群から選択される何れかのカラム容量に相当する範囲において、当該溶離バッファー中のバッファーＢの割合（％）を連続的に増加させることによって、当該初期pHから終期pHまで連続的なpH勾配を掛けることもできる。ここで、当該バッファーＢの割合（％）を、少なくとも、約10～約100％の範囲における任意の割合、例えば、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％および約100％からなる群から選択される何れかの割合から、約30％～約100％の範囲における任意の割合、例えば、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％および約100％からなる群から選択される何れかの割合まで連続的に増加させて行うことができる。
　また、本発明の分離方法におけるpH勾配のうち、リニア勾配の別の態様として、約20～約50 CVの範囲における任意のカラム容量、例えば、約20 CV、25 CV、30 CV、約35 CV、約40 CV、約45 CVおよび約50 CVからなる群から選択される何れかのカラム容量に相当する範囲において、当該溶離バッファーのpHを連続的に低下させることによって、当該初期pHから終期pHまで連続的なpH勾配を掛けることもできる。
　本発明の分離方法におけるpH勾配は、例えば、（ａ）約4～約6 CVの範囲における任意のカラム容量に相当する間隔毎に、当該溶離バッファー中のバッファーＢの割合（％）を少なくとも約50～100％の範囲に渡って、約1～約2％の範囲における任意の割合ずつ段階的に増加させることによって実施されるか、または
（ｂ）約30～約40 CVの範囲における任意のカラム容量に相当する範囲において、当該溶離バッファー中のpHを、約0.6～約1.0の範囲における任意のpHずつ段階的に低下させることによって行われるのが好ましい。
　本発明の分離方法における当該溶離バッファーは、使用するイオン交換担体の種類や当該着色体と非着色体との分離の程度に応じて、適宜あらかじめ決定した最適の線流速にて流すことができるが、約100～約800 cm/hの範囲における任意の線流速、例えば、約100 cm/h、約150 cm/h、約200 cm/h、約250 cm/h、約300 cm/h、約350 cm/h、約400 cm/h、約450 cm/h、約500 cm/h、約550 cm/h、約600 cm/h、約650 cm/h、約700 cm/h、約750 cm/hおよび約800 cm/hからなる群から選択され得る。ここで、線流速とは、溶離バッファーが、イオン交換担体カラムのカラム断面を通過する速度を意味し、次の式：線流速(cm/h)＝流量(cm3/h)/カラム断面積(cm2)で算出される。
　本発明の分離方法において、当該イオン交換担体カラムに投入される、タンパク質非着色体およびタンパク質着色体の総負荷量(mg/mL)は約2～約200 mg/mLであり、例えば、約10 mg/mL、約20 mg/mL、約30 mg/mL、約40 mg/mL、約50 mg/mL、約60 mg/mL、約70 mg/mL、約80 mg/mL、約90 mg/mL、約100 mg/mL、約110 mg/mL、約120 mg/mL、約130 mg/mL、約140 mg/mL、約150 mg/mL、約160 mg/mL、約170 mg/mL、約180 mg/mL、約190 mg/mLおよび約200 mg/mLが挙げられる。ここで、負荷量(mg/mL)とは、イオン交換担体カラムの体積当たりのサンプル添加量を意味する。
　当該イオン交換担体カラムに投入できる、タンパク質非着色体およびタンパク質着色体の総濃度は、同様に上記した条件にも依存するが、通常、約2～約50 mg/mLであり、具体的には、約5 mg/mL、約10 mg/mL、約15 mg/mL、約20 mg/mL、約25 mg/mL、約30 mg/mL、約35 mg/mL、約40 mg/mL、約45 mg/mLおよび約50 mg/mLが挙げられ、好ましくは、約10～約30 mg/mLである。
　本発明の分離方法は、主に、室温下で行われる。
　なお、本明細書において用いられる「約」とは、表記される数値を10％以内の範囲で下回って、または上回って変化してよいことを意味する。
［本発明におけるタンパク質］
　本発明の分離方法は、糖化反応に起因する修飾により着色した、何れのタンパク質にも適用できる。特に、高濃度化が求められるタンパク質医薬においては、高酸素・高グルコース下の培養細胞（例えば、COS細胞やCHO細胞）から産生されることを必要とするため、糖化反応に起因する着色を受けやすい。特に本分離方法の適用が求められるのが抗体である。
　本発明の分離方法は、基本的に何れの分子量を有するタンパク質にも幅広く適用できるが、具体的には、約50～750 kDaの範囲にあるものを対象とし、約50～約150 kDaの範囲にあるタンパク質の分離に適している。
　また、本発明の分離方法は、基本的に何れの等電点を有するタンパク質にも幅広く適用できるが、好ましくは、約5～9.5の範囲にあるものを対象とする。そのうち、当該タンパク質着色体については、その等電点が、約5～約9.1の範囲にあり、概ね約6～約7の範囲に属するものが主に対象となり、一方、当該タンパク質非着色体については、その等電点が約7～約9.5の範囲にあるが、具体的には、約7以上かつ約7.5未満、約7.5以上かつ約8未満、約8以上かつ約8.5未満、約8.5以上かつ約9未満および約9以上かつ約9.5未満からなる群から選択される何れかの範囲に属するものが主に対象となる。
　本発明の分離方法を適用できる抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）など、何れの種類もしくは形態のものであってもよい。当該抗体の種は特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはヒト由来の抗体でもよいが、その品質が厳格に求められるヒト用医薬においては、キメラ抗体、ヒト化抗体あるいは完全ヒト型抗体の形態が好ましい。また、それらは、モノクローナル抗体として、COS細胞やCHO細胞などの産生細胞から生成されることがほとんどであるため、糖化反応に起因する着色が問題となるケースがある。
　本発明において「抗体断片」とは、抗原への結合性を保持する抗体分子の一部を意味し、例えば、F(ab')2、Fab'、Fab、Fvおよびsingle-chain FVなどが含まれる。
　本発明において「二重特異性抗体」とは、二つの異なる抗原分子あるいはエピトープに対する結合特異性を一分子に備え持つ抗体を意味する。ここで、二重特異性抗体の形態には、例えば、ダイアボディ、二重特異性sc(Fv)2、二重特異性ミニボディ、二重特異性F(ab')2、二重特異性ハイブリッド抗体、共有結合型ダイアボディ(二重特異性DART)、二重特異性(FvCys)2、二重特異性F(ab'-ジッパー)2、二重特異性(Fv-ジッパー)2、二重特異性三鎖抗体および二重特異性mAb2等がある。
　本発明において「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、IgMまたはIgG）を称するものとして使用され、本発明にかかる二重特異性抗体として好ましいアイソタイプは、IgGであり、より好ましくはIgG1またはIgG4である。
　本発明の分離方法を適用し得る抗体としては、例えば、抗CD40抗体（例えば、Bleselumab、Dacetuzumab、Iscalimab、Lucatumumab、Mitazalimab、Ravagalimab、Selicrelumab、Teneliximab、ABBV-428およびAPX005M等）、抗CD70抗体(例えば、Cusatuzumab、VorsetuzumabおよびARGX-110等)、抗HER1抗体（例えば、Cetuximab、Panitumumab、Necitumumab、Nimotuzumab、Depatuxizumab、Futuximab、Laprituximab、Matuzumab、Modotuximab、Petosemtamab、Tomuzotuximab Losatuxizumab、Serclutamab、Imgatuzumab、FutuximabおよびZalutumumab等）、抗HER2抗体（例えば、Pertuzumab、Disitamab、Gancotamab、Margetuximab、Timigutuzumab、Zanidatamab、Ertumaxomab、Zenocutuzumab、Trastuzumab、MM-111、R48およびZW33等）、抗HER3抗体（例えば、Duligotuzumab、Elgemtumab、Istiratumab、Lumretuzumab、Zenocutuzumab、Patritumab、SeribantumabおよびMM-111等）、抗VEGFR1抗体（例えば、Icrucumab等）、抗VEGFR2抗体（例えば、Ramucirumab、AlacizumabおよびOlinvacimab等）、抗CD20抗体（例えば、Rituximab、Blontuvetmab、Epitumomab、Ibritumomab、Ocaratuzumab、Ocrelizumab、Nofetumomab、Tositumomab、Veltuzumab、Ofatumumab、Ublituximab、ObinutuzumabおよびNofetumomab等）、抗CD30抗体（例えば、BrentuximabおよびIratumumab等）、抗CD38抗体（例えば、Daratumumab、Isatuximab、Mezagitamab、AT13/5およびMOR202等）、抗TNFRSF10B抗体（例えば、Benufutamab、Conatumumab、Drozitumab、Lexatumumab、TigatuzumabおよびDS-8273a等）、抗TNFRSF10A抗体（例えば、Mapatumumab等）、抗MUC1抗体（例えば、Cantuzumab、Clivatuzumab、Epitumomab、Sontuzumab、Gatipotuzumab、Nacolomab、7F11C7、BrE-3、CMB-401、CTM01およびHMFG1等）、抗MUC5AC抗体（例えば、Ensituximab等）、抗MUC16抗体（例えば、Oregovomab、Abagovomab、IgovomabおよびSofituzumab等）、抗DLL4抗体（例えば、Demcizumab、Dilpacimab、NavicixizumabおよびEnoticumab等）、抗フコシルGM1抗体（例えば、BMS-986012等）、抗gpNMB抗体（例えば、Glembatumumab等）、抗Mesothelin抗体（例えば、Amatuximab、Anetumab、RG7784およびBMS-986148等）、抗MMP9抗体（例えば、Andecaliximab等）、抗GD2抗体（例えば、Dinutuximab、Naxitamab、14G2a、MORAb-028、Surek、TRBs07およびME361等）、抗MET抗体（例えば、Emibetuzumab、OnartuzumabおよびTelisotuzumab等）、抗FOLR1抗体（例えば、FarletuzumabおよびMirvetuximab等）、抗CD79b抗体（例えば、IladatuzumabおよびPolatuzumab等）、抗DLL3抗体（例えば、Rovalpituzumab等）、抗CD51抗体（例えば、Abituzumab、EtaracizumabおよびIntetumumab等）、抗EPCAM抗体（例えばAdecatumumab、Catumaxomab、Edrecolomab、Oportuzumab、CitatuzumabおよびTucotuzumab等）、抗CEACAM5抗体（例えば、Altumomab、Arcitumomab、Cergutuzumab、Labetuzumab、90Y-cT84.66、AMG211、BW431/26、CE25/B7、COL-1およびT84.66 M5A等）、抗CEACAM6抗体（例えば、Tinurilimab等）、抗体FGFR2抗体（例えば、AprutumabおよびBemarituzumab等）、抗CD44抗体（例えば、Bivatuzumab等）、抗PSMA抗体（例えば、Capromab、177Lu-J591およびES414等）、抗Endoglin抗体（例えば、Carotuximab等）、抗IGF1R抗体（例えば、Cixutumumab、Figitumumab、Ganitumab、Dalotuzumab、TeprotumumabおよびRobatumumab等）、抗TNFSF11抗体（例えば、Denosumab等）、抗GUCY2C（例えば、Indusatumab等）、抗SLC39A6抗体（例えば、Ladiratuzumab等）、抗SLC34A2抗体（例えば、Lifastuzumab等）、抗NCAM1抗体（例えば、LorvotuzumabおよびN901等）、抗ganglioside GD3抗体（例えば、EcromeximabおよびMitumomab等）、抗AMHR2抗体（例えば、Murlentamab等）、抗CD37抗体（例えば、Lilotomab、NaratuximabおよびOtlertuzumab等）、抗IL1RAP抗体（例えば、Nidanilimab等）、抗PDGFR2抗体（例えば、OlaratumabおよびTovetumab等）、抗CD200抗体（例えば、Samalizumab等）、抗TAG-72抗体（例えば、Anatumomab、Minretumomab、Satumomab、CC49、HCC49およびM4等）、抗SLITRK6抗体（例えば、Sirtratumab等）、抗DPEP3抗体（例えば、Tamrintamab等）、抗CD19抗体（例えば、Coltuximab、Denintuzumab、Inebilizumab、Loncastuximab、Obexelimab、Tafasitamab、TaplitumomabおよびhuAnti-B4等）、抗NOTCH2/3抗体（例えば、Tarextumab等）、抗tenascin C抗体（例えば、Tenatumomab等）、抗AXL抗体（例えば、EnapotamabおよびTilvestamab等）、抗STEAP1抗体（例えば、Vandortuzumab等）、抗CTAA16抗体（例えば、Votumumab等）、CLDN18抗体（例えば、Zolbetuximab等）、抗GM3抗体（例えば、Racotumomab、FCGR1およびH22等）、抗PSCA抗体（例えば、MK-4721等）、抗FN extra domain B抗体（例えば、AS1409等）、抗HAVCR1抗体（例えば、CDX-014等）、抗TNFRSF4抗体（例えば、MEDI6383等）、抗PD-1抗体（例えば、Nivolumab、Cemiplimab-rwlc、Pembrolizumab、Spartalizumab、Tislelizumab、Dostarlimab、Toripalimab、Camrelizumab、Genolimzumab、Sintilimab、Lodapolimab、Retifanlimab、Balstilimab、Serplulimab、Budigalimab、Prolgolimab、Sasanlimab、Cetrelimab、ZimberelimabおよびGeptanolimab等）、抗PD-L1抗体（例えば、Atezolizumab、Avelumab、Durvalumab、Manelimab、Pacmilimab、Envafolimab、CosibelimabおよびSugemalimab等）、抗CTLA-4抗体（例えば、Ipilimumab、Zalifrelimab、NurulimabおよびTremelimumab等）、抗TIM3抗体（例えば、CobolimabおよびMBG453等）、抗CD3抗体（例えば、Catumaxomab等）、抗CD4抗体（例えば、ZanolimumabおよびIT1208等）、抗CD27抗体（例えば、Varlilumab等）、抗CD73抗体（例えば、OleclumabおよびBMS-986179等）、抗CD80抗体(例えば、Galiximab等)、抗CD86抗体、抗CD160抗体、CD57抗体、CD226抗体、CD112抗体、CD155抗体、抗OX40抗体（例えば、MEDI6469、Ivuxolimab、MEDI0562、MEDI6383、Efizonerimod、GSK3174998、BMS-986178およびMOXR0916等）、OX40L抗体(例えば、OxelumabおよびTavolimab等)、抗ICOS抗体（例えば、VopratelimabおよびGSK3359609等）、抗4-1BB(CD137)抗体（例えば、UrelumabおよびUtomilumab等）、抗4-1BBL(CD137L)抗体、抗2B4抗体、抗GITR抗体（例えば、MK-4166、INCAGN01876、GWN323およびTRX-518等）、抗B7-H3抗体（例えば、Enoblituzumab、MirzotamabおよびOmburtamab等）、抗LAG-3抗体（例えば、Relatlimab、Ieramilimab、Fianlimab、EncelimabおよびMavezelimab等）、抗BTLA抗体、抗HVEM抗体、抗VISTA抗体（例えば、Onvatilimab等）、抗GITRL抗体、抗Galectin-9抗体、抗B7-H4抗体、抗B7-H5抗体、PD-L2抗体、KLRG-1抗体、E-Cadherin抗体、N-Cadherin抗体、R-Cadherin抗体、抗CSF-1R抗体（例えば、Cabiralizumab、Emactuzumab、LY3022855、Axatilimab、MCS-110、IMC-CS4、AMG820、Pexidartinib、BLZ945およびARRY-382等）、CXCR4抗体（例えば、Ulocuplumab等）、FLT-3抗体、抗TIGIT抗体（例えば、Tiragolumab、Etigilimab、VibostolimabおよびBMS-986207等）、抗KIR抗体（例えば、Lirilumab、IPH2101、LY3321367およびMK-4280等）、抗SLAMF7抗体（例えば、AzintuxizumabおよびElotuzumab等）、抗CD47抗体および抗NKG2A抗体（例えば、Monalizumab等）等が挙げられる。
　また、本発明の分離方法を適用し得る二重特異性抗体としては、例えば、抗PD-1/CD3二重特異性抗体、抗PD-1/CD19二重特異性抗体（好ましくは、WO2020/204152に記載される二重特異性抗体）、抗PD-1/CD4二重特異性抗体、抗HER1-MET二重特異性抗体（例えば、Amivantamab等）、抗EPCAM-CD3二重特異性抗体（例えば、SolitomabおよびCatumaxomab等）、抗Ang2-VEGF二重特異性抗体（例えば、Vanucizumab等）、抗HER2-CD3二重特異性抗体（例えば、Ertumaxomab等）、抗HER3-IGF1R二重特異性抗体（例えば、Istiratumab等）、抗PMSA-CD3二重特異性抗体（例えば、Pasotuxizumab等）、抗HER1-LGR5二重特異性抗体（例えば、Petosemtamab等）、抗SSTR2-CD3二重特異性抗体（例えば、Tidutamab等）、抗CD30-CD16A二重特異性抗体（例えば、AFM13等）、抗CEA-CD3二重特異性抗体（例えば、CibisatamabおよびRO6958688等）、抗CD3-CD19二重特異性抗体（例えば、DuvortuxizumabおよびBlinatumomab等）、抗IL3RA-CD3二重特異性抗体（例えば、FlotetuzumabおよびVibecotamab等）、抗GPRC5D-CD3二重特異性抗体（例えば、Talquetamab等）、抗TNFRSF17-CD3二重特異性抗体（例えば、Teclistamab等）、抗HER2-HER3二重特異性抗体（例えば、Zenocutuzumab等）および抗CD20-CD3二重特異性抗体（例えば、Plamotamab、Odronextamab、Mosunetuzumab、Epcoritamab、GlofitamabおよびREGN1979等）等が挙げられる。
　本発明の分離方法の適用が求められる抗体としては、例えば、抗PD-1/CD3二重特異性抗体が挙げられ、特に、PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖ならびにCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖からなり、（ａ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列（好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列）からなり、（ｂ）CD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号６のアミノ酸配列からなり、および（ｃ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における軽鎖およびCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖がともに、配列番号７のアミノ酸配列からなる当該二重特異性抗体（抗PD-1/CD3二重特異性抗体A）を含む溶液は、AGEsの発生に起因して着色することが認められ、本発明の分離方法の適用が求められる。
　当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aは、WO2019/156199に開示された方法に従って製造することができ、各々抗PD-1/CD3二重特異性抗体クローンPD1-1(Bi)～PD1-5(Bi)に対応する。
　さらに、上記抗PD-1/CD3二重特異性抗体AのPD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該各重鎖の重鎖定常領域が、各々、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる重鎖定常領域に置換され、CD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該各重鎖の重鎖定常領域が、各々、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる重鎖定常領域に置換された抗PD-1/CD3二重特異性抗体（抗PD-1/CD3二重特異性抗体B）も同様に本発明の分離方法の適用が求められる。
　これら抗PD-1/CD3二重特異性抗体Bは、各々、前記抗PD-1/CD3二重特異性抗体クローンPD1-5(Bi)（PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号５のアミノ酸配列からなる抗PD-1/CD3二重特異性抗体A）の重鎖定常領域中のEUナンバリングシステムにおける252番目のメチオニンを、グルタミン酸、プロリン、アルギニンおよびアスパラギン酸に各々置換した抗体クローン、434番目のアスパラギンをロイシンに置換した抗体クローン、438番目のグルタミンをグルタミン酸に置換した抗体クローンに各々対応し、当該アミノ酸置換に関する公知の技術に準じた方法にて作製できる。
　さらに、当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体AのPD-1への結合および／またはCD3への結合に各々交差競合する抗PD-1/CD3二重特異性抗体も同様に本発明の分離方法の適用が求められる場合がある。ここで、「交差競合する」とは、当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aと同一のあるいは一部重複する、PD-1および／またはCD3上の各エピトープに結合することによって、抗PD-1/CD3二重特異性抗体AのPD-1および／またはCD3への結合をその程度に関わらず阻害することを意味し、交差競合するかどうかは競合結合アッセイによって評価することができる。例えば、ビアコア分析、ELISAアッセイ、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、蛍光エネルギー転移測定法（FRET）や蛍光微量測定技術（FMAT（登録商標））を用いて判断することができる。
　図９に、抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aを構成する、PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖ならびにCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖の各アミノ酸配列を示す。また、図１０および１１に、抗PD-1/CD3二重特異性抗体Bを構成する重鎖定常領域の各アミノ酸配列を示す。
　ここで、「PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖」は、重鎖および軽鎖がジスルフィド結合を介して会合することで、PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を形成する重鎖・軽鎖複合体を意味する。「抗原結合部位」とは、抗体がその抗原に対する結合活性を有するための最小単位であり、「PD-1に特異的に結合する」とは、少なくとも、1x10-5M、好ましくは1x10-7M、より好ましくは1x10-9Mより高い親和性（解離定数（Kd値））を有する結合活性でPD-1に対して直接結合することができ、少なくとも、CD28、CTLA-4およびICOSなどの、所謂、CD28ファミリー受容体に属するほかの受容体メンバーには実質的に結合しない特徴として使用される。
　また、「CD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖」は、重鎖および軽鎖がジスルフィド結合を介して会合することで、CD3に特異的に結合する抗原結合部位を形成する重鎖・軽鎖複合体を意味する。「抗原結合部位」とは、抗体がその抗原に対する結合活性を有するための最小単位であり、ここで、「CD3に特異的に結合する」とは、少なくとも、1x10-5M、好ましくは1x10-7M、より好ましくは1x10-9Mより高い親和性（解離定数（Kd値））を有する結合活性でCD3に対して直接結合することができ、他のタンパク質には実質的に結合しない特徴として使用される。
　なお、本発明にかかる上記抗PD-1/CD3二重特異性抗体は、PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖およびCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖が、同じアミノ酸配列からなる構造を有することを特徴とする。
　本発明の分離方法として好ましい態様としては、例えば、タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液から、タンパク質非着色体を分離する方法であって、（１）当該分離方法が、
（ｉ）当該溶液を陰イオン交換担体カラムに投入し、所定の初期pHを有する平衡化バッファーを使用して、当該タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を陰イオン交換担体に結合させる工程、
（ｉｉ）当該タンパク質非着色体およびタンパク質着色体が分離されるようあらかじめ定められた条件にて、当該初期pHから終期pHまで下降するpH勾配を形成する溶離バッファーを、所定の流速にて当該陰イオン交換担体カラムに流す工程、および
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）により溶離するタンパク質非着色体を含む所定の画分を分取する工程からなり、
（２）当該タンパク質が、当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aの何れかの抗体または抗PD-1/CD3二重特異性抗体Bの何れかの抗体であり、
（３）当該陰イオン交換担体が、Toyopearl（登録商標）NH2-750Fであり、
（４）当該平衡化バッファーおよび溶離バッファーの初期pHが約10.6～約8.4の範囲における任意のpH値であり、当該溶離バッファーの終期pHが約7.0～約4.0の範囲における任意のpH値（但し、当該初期pHは、当該終期pHよりも2.0以上高い。）であり、
（５）当該pH勾配が、（ａ）約4～約6 CVの範囲における任意のカラム容量に相当する間隔毎に、当該溶離バッファー中のバッファーＢの割合（％）を少なくとも約50～100％の範囲に渡って、約1～約2％の範囲における任意の割合ずつ段階的に増加させることによって実施されるか、（ｂ）約30～約40 CVの範囲における任意のカラム容量に相当する範囲において、当該溶離バッファー中のpHを、約0.6～約1.0の範囲における任意のpHずつ低下させることによって行われ、
（６）当該溶離バッファーの線流速が、約100～約800 cm/hであり、および
（７）分取されたタンパク質非着色体を含む溶液の色濃度が、（ｉ）当該比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5と実質的に同じかあるいはそれよりも薄い、もしくは（ｉｉ）分取されたタンパク質非着色体を含む溶液のEm/UV*100値が約6.3以下である、当該分離方法である。
　本発明の分離方法として好ましい別の態様としては、例えば、タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液から、タンパク質非着色体を分離する方法であって、
（１）当該分離方法が、
（ｉ）当該溶液を陰イオン交換担体カラムに投入する工程、
（ｉｉ）当該溶液中の当該タンパク質着色体が当該陰イオン交換担体に結合し、当該タンパク質非着色体が結合しないよう調製された平衡化バッファーを所定の流速にて当該陰イオン交換担体カラムに流す工程、および
（ｉｉｉ）前記工程においてそのままフロースルーするタンパク質非着色体を含む画分を回収する工程からなり、
（２）当該タンパク質が、当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aの何れかの抗体または抗PD-1/CD3二重特異性抗体Bの何れかの抗体であり、
（３）当該陰イオン交換担体が、Toyopearl（登録商標）NH2-750Fであり、
（４）当該平衡化バッファーのpHが約7.8～約8.2の範囲における任意のpH値であり、電気伝導度が約5～約7 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度であり、
（５）当該平衡化バッファーの線流速が、約100～約400 cm/hであり、および
（６）分取されたタンパク質非着色体を含む溶液の色濃度が、（ｉ）当該比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5と実質的に同じかあるいはそれよりも薄い、または（ｉｉ）分取されたタンパク質非着色体を含む溶液のEm/UV*100値が約6.3以下である、当該分離方法である。
［本発明にかかる抗PD-1/CD3二重特異性抗体を含む溶液］
　本発明は、本発明の分離方法に相当する工程をその一部に含む製造法にて製造された抗PD-1/CD3二重特異性抗体を含む溶液に関する。具体的には、約100～約300mg/mLの濃度にて、抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aの何れかの抗体または抗PD-1/CD3二重特異性抗体Bの何れかの抗体を含む、無色または僅かに着色した溶液である。但し、当該二重特異性抗体を含む溶液の好ましい態様には、その製造工程の何れかにおいて、本発明の分離方法のような、着色の低減ないし除去のための何れの工程も経ずに、約100～約300 mg/mLの濃度において、無色または僅かに着色した性状を有する溶液を含まない。
　当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aの何れかの抗体または抗PD-1/CD3二重特異性抗体Bの何れかの抗体を含む溶液は、約100 mg/mL未満の濃度、例えば、約10～50 mg/mLの何れかの濃度において本発明の分離方法に付されたのち、必要に応じて濃縮して製造されてもよい。なお、当該タンパク質非着色体画分の濃縮は、公知の方法、例えば、限外ろ過法、沈殿-再溶解法および凍結乾燥-再溶解法などで実施できる。無色または僅かに着色した当該溶液の色濃度は、上記記載の定性的あるいは定量的解析にて確認することができる。
［医薬組成物および医薬用途］
　本発明の分離方法に相当する工程をその一部に含む製造法にて製造された抗PD-1/CD3二重特異性抗体を含む溶液は、自己免疫疾患もしくは移植片対宿主病（GVHD）あるいは血液がんの予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療に有用である。
　本発明にかかる抗PD-1/CD3二重特異性抗体が予防、症状進展抑制および／または治療可能な自己免疫疾患としては、例えば、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、慢性円板状エリテマトーデス、多発性硬化症（全身性強皮症、進行性全身性硬化症）、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎（結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発血管炎）、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、脊椎関節炎、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、リウマトイド血管炎、大型血管炎、ANCA関連血管炎（例えば、多発血管炎性肉芽腫症および好酸球性多発血管炎性肉芽腫症）、コーガン症候群、RS3PE症候群、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、IgG4関連疾患（例えば、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎など）、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、原発性胆汁性肝硬変、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病（グレーブス病（甲状腺機能亢進症））、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、アジソン病（慢性副腎皮質機能低下症）、特発性アジソン病、Ｉ型糖尿病、緩徐進行性Ｉ型糖尿病（成人潜在性自己免疫性糖尿病）、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、多巣性運動ニューロパチー、サルコイドーシス、巨細胞性動脈炎、筋委縮性側索硬化症、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、セリアック病、強直性脊椎炎、重症喘息、慢性蕁麻疹、移植免疫、家族性地中海熱、好酸球性副鼻腔炎、拡張型心筋症、全身性肥満細胞症および封入体筋炎などが挙げられる。
　また、本発明にかかる抗PD-1/CD3二重特異性抗体が予防、症状進展抑制および／または治療可能な血液がんとしては、例えば、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫（例えば、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫、前駆Ｂ細胞急性リンパ球芽性白血病、慢性Ｂリンパ性白血病（例えば、小リンパ球性リンパ腫）、Ｂ前駆細胞性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫（MALTリンパ腫）、脾原発辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、有毛細胞白血病・バリアント型、濾胞性リンパ腫、小児型濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫・非特定型、脾びまん性赤脾髄小型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症、脾Ｂ細胞リンパ腫／白血病・分類不能型、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症・IgM型、μ重鎖病、λ重鎖病、α重鎖病、形質細胞骨髄腫、骨孤在性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、単クローン性免疫グロブリン沈着病、IRF4再構成を伴う大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫・下肢型、EBV陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫・非特定型、EBV陽性粘膜皮膚潰瘍、慢性炎症関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、原発性体腔液リンパ腫、HHV8陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫・非特異型、11q異常を伴うバーキット様リンパ腫、MYCおよびBCL2とBCL6の両方か一方の再構成伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫・非特異型およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫の中間的特徴を伴うＢ細胞リンパ腫・分類不能型）、T/NK細胞性非ホジキンリンパ腫（例えば、前駆Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、慢性Ｔリンパ球性白血病、Ｔ細胞型大顆粒リンパ球性白血病、大顆粒ＮＫ細胞性白血病、急速進行性ＮＫ細胞白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫・非特定型、分類不能末梢性Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞性リンパ腫、未分化大細胞（CD30陽性）リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞性リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾型γ－δＴ細胞リンパ腫、皮下脂肪組織炎様Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、セザリー症候群、ホジキン様／ホジキン関連未分化大細胞リンパ腫、節外性NK/T細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞性リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、慢性ＮＫ細胞リンパ増殖異常症、小児全身性EBV陽性Ｔ細胞リンパ腫、種痘様水疱症様リンパ増殖異常症、節外性NK/T細胞リンパ腫・鼻型、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫、単形性上皮向性腸管Ｔ細胞リンパ腫、胃腸管緩徐進行性Ｔ細胞リンパ増殖異常症、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚CD30陽性Ｔ細胞リンパ増殖異常症、リンパ腫様丘疹症、原発性皮膚未分化大細胞型リンパ腫、原発性皮膚γδＴ細胞リンパ腫、原発性皮膚CD8陽性急速進行性表皮向性細胞傷害性Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚先端型CD8陽性Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚CD4陽性小型／中型Ｔ細胞リンパ増殖性症、濾胞Ｔ細胞リンパ腫、濾胞ヘルパーＴ細胞形質を伴う節性末梢性Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫・ALK陽性型、未分化大細胞リンパ腫・ALK陰性型および乳房インプラント関連未分化大細胞リンパ腫））およびホジキンリンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫（例えば、結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型およびリンパ球減少型）または結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫））、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ芽球性白血病（リンパ芽球性リンパ腫）、慢性リンパ性白血病（小リンパ球性リンパ腫）、骨髄異形成症候群および慢性骨髄性白血病）、中枢神経系原発悪性リンパ腫および骨髄増殖症候群などが挙げられる。
　ここで、本発明における「治療」とは、例えば、ある疾患もしくはその症状を治癒させることまたは改善させることを意味し、「予防」とは、ある疾患もしくは症状の発現を未然に防止するあるいは一定期間遅延させることを意味し、「症状進展抑制」とは症状の進展または悪化を抑制して病態の進行を止めることを意味する。なお、「予防」の意味には再発抑制も含まれる。「再発抑制」とは、ある疾患もしくは症状の再発を防止または再発の可能性を低減させることを意味する。
　本発明の抗PD-1/CD3二重特異性抗体を含む溶液は、その医薬組成物として、通常、全身的または局所的に、非経口の形で投与される。かかる投与方法として、具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射などが挙げられ、静脈内注射の場合には、点滴による投与が好ましい。その投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人当たり、一回につき、当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体として0.1μg/kgから300mg/kgの範囲で、特に好ましくは、当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体として0.1mg/kgから10mg/kgの範囲で、一日一回から数回非経口投与されるか、または一日30分から24時間の範囲で静脈内に持続投与される。もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて投与の必要な場合もある。
［製剤］
　本発明の抗PD-1/CD3二重特異性抗体を含む溶液は、注射剤または点滴のための輸液として製剤化されて用いられる場合、当該注射剤または輸液は、水溶液、懸濁液または乳濁液のいずれの形態であってもよい。注射剤または点滴のための輸液に使用される溶剤として、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖溶液および等張液（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、プロピレングリコール等の溶液）等を用いることができる。また、その際、必要に応じ、薬学的に許容できる担体を含んでいてもよい。ここで、薬学的に許容できる担体としては、例えば、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤、防腐剤、pH調整剤および抗酸化剤等が挙げられる。安定剤としては、例えば、各種アミノ酸、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン等を用いることができる。溶解補助剤としては、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート20（登録商標）、ポリソルベート80（登録商標）、HCO-50等）等を用いることができる。懸濁化剤としては、例えば、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等を用いることができる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等を用いることができる。防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。pH調整剤としては、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等を用いることができる。抗酸化剤として、例えば、（１）アスコルビン酸、システインハイドロクロライド、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性抗酸化剤、（２）アスコルビルパルミテート、ブチル化ハイドロキシアニソール、ブチル化ハイドロキシトルエン、レシチン、プロピルガレート、α－トコフェロール等のような油溶性抗酸化剤および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤等を用いることができる。
　注射剤または点滴のための輸液は、その最終工程において滅菌するかあるいは無菌操作法、例えば、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することによって製造することができる。
　本明細書において、明示的に引用されるすべての特許文献および非特許文献もしくは参考文献の内容は、全て本明細書の一部としてここに引用し得る。
　本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更または修飾が当業者には可能であり、これらの変更または修飾も本発明に含まれる。
［実施例］
実施例１：逆相系HPLCによる抗体着色体の定量分析
　抗PD-1/CD3二重特異性抗体の着色体量を定量的に評価するため、逆相系HPLCによる評価系を構築した。その際使用した機器および設定した実施条件を各々以下の表１および２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　所定のカラム温度と移動相Aで十分に安定化したカラムに、5 μg等量の抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aの溶液をロードして分析を開始した。得られたクロマトグラムから所定の目的ピークを、その前後において隣接するピークとの間で最も検出シグナルが低下する通液位置で垂直にカットしてピークとし、280 nm波長の紫外線検出ピーク面積（UV280）、蛍光強度検出ピーク面積（Em 560(ex380)）を得た後、Em/UV*100値を算出し、着色定量の指標とした。なお、システム上、UV検出器の後に蛍光検出器が接続されているため、蛍光検出ピークが後ろに出現している。
　本法を用いて、第十七改正日本薬局方の一般試験法における項目2.65「色の比較試験法」における比較標準溶液と当該Em/UV*100値を比較した。着色体の除去に留意せずに設定された条件で精製された抗PD-1/CD3二重特異性抗体を塩濃度グラジエントによる強陽イオン交換クロマトグラフィーで分画し、得られた精製分画を100 mg/mLに濃縮し、その高着色フラクションと低着色フラクションを混合して、視認にて比較標準溶液BY3.5、BY4、BY4.5、BY5およびBY6に対応する着色を有するサンプルを調製し、それらをHPLCにて分析した。BY3.5に対応するクロマトグラム（図１）およびBY6.0に対応するクロマトグラム（図２）を比較すると、Em/UV*100値がBY3.5に相当するサンプルにおいて大きいことが明らかである。比較標準溶液とHPLC分析サンプルを対比させたところ、本発明の方法により対象とするタンパク質の澄明度を比較標準溶液のBY5の澄明度よりも薄くする場合、Em/UV*100値として約6以下であることが望ましいことが確認できた（図３）。
実施例２：Bind-eluteモードによる抗体の陰イオン交換クロマトグラフィー精製（１）
　本発明にかかる抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aの着色体比率を削減するための分離条件を見出すため、Bind-eluteモードにおける、pHステップグラジエント陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した（図４）。なお、ここでは、フローパッキングにてTricornカラム（GEヘルスケア）にToyopearl NH2-750Fを充填した分離カラムを用いた。清澄化したCHO細胞培養液からProtein Aアフィニティクロマトグラフィーで精製した当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aを含む溶液を、ウイルス不活化のための低pH処理を経てpH 10.2に調製し、陰イオン交換クロマトグラフィー精製前のサンプルとした。ここで使用したその他の機器および設定した条件を各々表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　移動相Aとして使用する市販バッファーA（ThermoFisher社のThermo Scientific（登録商標）CX-1 pH Gradient Buffer B（pH10.2））にて十分にカラムを平衡化した後、9.3 mg/mLの当該抗体溶液を4.3 mL計量し、負荷量20 mg-IgG/mL-resinとなるように全量ロードした。その後、移動相Bに当たる市販バッファーB（ThermoFisher社のThermo Scientific（登録商標）CX-1 pH Gradient Buffer A（pH 5.6））の割合（図４中の％B）を25％から段階的に上昇させたところ、26（％B）付近から急激にピークが立ち上がり、通液体積20 mL付近に当該抗体のメインピークが出現した。当該ピーク付近の分画フラクションのEm/UV*100値は、保持が弱い画分から各々1.4、1.4、5.1および7.6（図４中の矢印１～４に各々対応）であった。当該抗体の精製前サンプルのEm/UV*100値が8.6であったことから、本実施例の方法により、着色体が高度に分離されていることが確認できた。
実施例３：Flow-throughモードによる抗体の陰イオン交換クロマトグラフィー精製
　さらに、本発明にかかる抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aの着色体比率を削減するための別の分離条件を見出すため、実施例１と同様の分離カラムシステムを用いて、Flow-throughモードによる陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した（図５）。同様に清澄化したCHO細胞培養液からProtein Aアフィニティクロマトグラフィーで精製した当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aを含む溶液を、ウイルス不活化のための低pH処理を経てpH 8.0に調製し、陰イオン交換クロマトグラフィー精製前のサンプルとした。ここで使用したその他の機器および設定した条件を各々表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　移動相Aとして使用するHEPESバッファー（pH 8.0）にて十分にカラムを平衡化した後、10.3 mg/mLの当該抗体溶液を3.9 mL計量し、負荷量20 mg-IgG/mL-resinとなるように全量ロードした。通液直後に当該抗体を含むFlow-throughピークが出現した。その後、移動相B（市販バッファーB（ThermoFisher社のThermo Scientific（登録商標）CX-1 pH Gradient Buffer A (pH5.6)）で連続的にpHを低下させたところ、吸着していた不純物と推測される溶出ピークが出現した。当該Flow-throughピークを含むフラクションのEm/UV*100値は4.0であり、一方、精製前の当該抗体溶液および当該溶出ピーク中の所定の１フラクションのEm/UV*100値は各々9.1および22.2であったことから、本実施例の方法においても、着色体が高度に分離されていることが確認できた。
実施例４：Bind-eluteモードによる抗体の陰イオン交換クロマトグラフィー精製（２）
　抗PD-1/CD3二重特異性抗体の着色体比率を削減するためのさらに別の分離条件を見出すため、Capto adhereをフローパッキングにてTricornカラム（GEヘルスケア）に充填した分離カラムを用いた、Bind-eluteモードによる陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した（図６）。同様に清澄化したCHO細胞培養液からProtein Aアフィニティクロマトグラフィーで精製した当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aを含む溶液を、ウイルス不活化のための低pH処理を経てpH 10.2に調製し、陰イオン交換クロマトグラフィー精製前のサンプルとした。ここで使用したその他の機器および設定した条件を各々表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　移動相Aとして使用する市販バッファーA（pH10.2）にて十分にカラムを平衡化した後、10.6 mg/mLの当該抗体溶液を3.8 mL計量し、負荷量20 mg-IgG/mL-resinとなるように全量ロードした。その後、移動相Bに当たる市販バッファーBの割合（図６中の％B）を25（％B）として4カラム体積分保持した後、25（％B）から連続的に移動相Bの割合を上昇させたとろ、通液体積40 mL以降に当該抗体のピークが出現した。当該ピーク付近の分画フラクションのEm/UV*100値は、保持が弱い画分から各々1.7、1.7、6.5、10.8および14.4（図６中の矢印１～５に各々対応）であり、一方、当該抗体の精製前サンプルのEm/UV*100値は9.0であることから、本実施例の方法によっても、着色体が高度に分離されていることが確認できた。
実施例５：Bind-eluteモードによる抗体の陰イオン交換クロマトグラフィー精製（３）
　続いて、Cellufine MAX IBをフローパッキングにてTricornカラム（GEヘルスケア）に充填した分離カラムを用いて、Bind-eluteモードによる陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した（図７）。同様に清澄化したCHO細胞培養液からProtein Aアフィニティクロマトグラフィーで精製した当該抗PD-1/CD3二重特異性抗体Aを含む溶液を、ウイルス不活化のための低pH処理を経てpH 10.2に調製し、陰イオン交換クロマトグラフィー精製前のサンプルとした。ここで使用したその他の機器および設定した条件を各々表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　移動相Aとして使用する市販バッファーA（pH10.2）にて十分にカラムを平衡化した後、10.6 mg/mLの当該抗体溶液を3.8 mL計量し、負荷量20 mg-IgG/mL-resinとなるように全量ロードした。その後、移動相Bに当たる市販バッファーBの割合（図７中の％B）を25（％B）として4カラム体積分保持した後、連続的に移動相Bの割合を上昇させたとろ、通液体積約30 mL以降に当該抗体のピークが出現した。当該ピーク付近の分画フラクションのEm/UV*100値は、保持が弱い画分から各々1.6、1.7、2.1、3.3および8.0（図７中の矢印１～５に各々対応）であり、一方、当該抗体の精製前サンプルのEm/UV*100値は9.0であることから、本実施例の方法によっても、着色体が高度に分離されていることが確認できた。
実施例６：BSAの陰イオン交換クロマトグラフィー精製
　抗体以外のタンパク質を対象とした場合においても、抗体の場合と同様に、その着色体の分離が可能であるかを検証するため、着色体を含むBSA（ウシ血清アルブミン；低塩濃度、富士フィルム和光純薬）を対象として、Bind-eluteモードによる陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した（図８）。ここでは、Capto QをTricornカラム（GEヘルスケア）に充填した分離カラムを用い、その他使用した機器および設定した条件を各々表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　移動相Aに相当するクエン酸-リン酸バッファー（pH 7.0）にて十分にカラムを平衡化した後、3.0 mg/mLの当該BSA溶液を157 mL計量し、負荷量40 mg-BSA/mL-resinとなるように全量ロードした。その後、移動相Bの割合（％B）を70（％B）にて4カラム体積分保持した後、連続的に移動相Bの割合を上昇させたとろ、通液体積約180 mL以降にBSAのピークが出現した。当該ピーク付近の分画フラクションのEm/UV*100値は、保持が弱い画分から各々7.7、10.3および13.8（図８中の矢印１～３に各々対応）であり、当該BSAの精製前サンプルのEm/UV*100値は10.7であることから、抗体に限らずその他のタンパク質においても、本発明の方法により、その着色体が高度に分離され得ることが確認できた。
　本発明の分離方法は、無色なタンパク質溶液、特に、厳格な品質管理が求められる抗体医薬の着色除去に利用できる。

Claims (43)

  1. タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液から、タンパク質非着色体を分離する工程を含む、当該タンパク質非着色体を含む溶液の製造方法であって、当該分離工程が、
    （ｉ）当該溶液をイオン交換担体カラムに投入し、所定の初期pHを有する平衡化バッファーを使用して、当該タンパク質非着色体およびタンパク質着色体をイオン交換担体に結合させる工程、
    （ｉｉ）当該タンパク質非着色体およびタンパク質着色体が分離されるようあらかじめ定められた条件にて、当該初期pHから終期pHまで変動するpH勾配を形成する溶離バッファーを、所定の流速にて当該イオン交換担体カラムに流す工程、ならびに
    （ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）により溶離するタンパク質非着色体を含む所定の画分を分取する工程からなる、当該製造方法。
  2. タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液から、タンパク質非着色体を分離する工程を含む、当該タンパク質非着色体を含む溶液の製造方法であって、当該分離工程が、
    （ｉ）当該溶液をイオン交換担体カラムに投入する工程、
    （ｉｉ）当該溶液中の当該タンパク質着色体が当該イオン交換担体に結合し、当該タンパク質非着色体が結合しないよう調製された平衡化バッファーを所定の流速にて当該イオン交換担体カラムに流す工程、ならびに
    （ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）においてそのままフロースルーするタンパク質非着色体を含む画分を回収する工程からなる、当該製造方法。
  3. タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液またはその濃縮液の色濃度が、（１）第十七改正日本薬局方の一般試験法における項目2.65に記載される色の比較試験法における比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5よりも濃い、または（２）当該溶液またはその濃縮液の紫外線吸収測定および蛍光スペクトル測定に基づき算出された、280 nm波長の紫外線吸光検出ピーク面積に対する蛍光強度検出ピーク面積（但し、励起波長が380 nmであり、検出波長が560 nmである。）の比率に100を乗じた値（Em/UV*100値）が約6.3を超える、請求項１または２記載の製造方法。
  4. 当該イオン交換担体が、陰イオン交換担体である、請求項１～３の何れか一項記載の製造方法。
  5. 当該陰イオン交換担体が、弱陰イオン交換担体またはマルチモード・陰イオン交換担体である、請求項４記載の製造方法。
  6. 当該弱陰イオン交換担体が、Fractogel（登録商標）EMD DEAE、Fractogel（登録商標）EMD DMAE、Capto（登録商標）DEAE、DEAE Ceramic HyperD（登録商標）F、Toyopearl（登録商標）NH2-750F、TOYOPEARL（登録商標）DEAE-650C、TOYOPEARL（登録商標）DEAE-650M、TOYOPEARL（登録商標）DEAE-650S、Cellufine（登録商標）A-200、Cellufine（登録商標）A-500、Cellufine（登録商標）A-800およびCellufine（登録商標）MAX DEAEからなる群から選択される、請求項５記載の製造方法。
  7. 当該マルチモード・陰イオン交換担体が、Toyopearl（登録商標）NH2-750F、Capto（登録商標）Adhere、Capto（登録商標）Adhere ImpRes、Capto（登録商標）MMC、Capto（登録商標）core 700およびCellufine（登録商標）IBからなる群から選択される、請求項５記載の製造方法。
  8. 当該イオン交換担体カラムに投入される、タンパク質非着色体およびタンパク質着色体の負荷量が、約2～約200 mg/mLである、請求項１～７の何れか一項記載の製造方法。
  9. 当該初期pHから終期pHまでのpH勾配の範囲が、当該タンパク質着色体および／または当該タンパク質非着色体の各等電点を挟むように設定される、請求項１および３～８の何れか一項記載の製造方法。
  10. 当該pH勾配が、当該初期pHから終期pHまで下降する、請求項１および３～９の何れか一項記載の製造方法。
  11. 当該初期pHが、約11.0～約7.0の範囲における任意のpH値である、請求項１および３～１０の何れか一項記載の製造方法。
  12. 当該終期pHが、約4.0～約8.2の範囲における任意のpH値（但し、当該初期pHは、当該終期pHよりも約1.0以上高い。）である、請求項１および３～１１の何れか一項記載の製造方法。
  13. 当該pH勾配が、リニア勾配またはステップワイズ勾配である、請求項１および３～１２の何れか一項記載の製造方法。
  14. 当該溶離バッファーが、当該初期pHを有するバッファーおよび終期pHを有するバッファーの任意の比率による組合せからなる、請求項１および３～１３の何れか一項記載の製造方法。
  15. 当該初期pHを有するバッファーおよび／または終期pHを有するバッファーが、MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、TAPSO、POPSO、HEPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSOおよびCAPSからなる群から各々選択される複数のグッド緩衝剤の組み合わせからなる、請求項１４記載の製造方法。
  16. 当該初期pHを有するバッファーが、Thermo Scientific（登録商標）CX-1 pH Gradient Buffer B(pH 10.2)であり、終期pHを有するバッファーがThermo Scientific（登録商標）CX-1 pH Gradient Buffer A(pH 5.6)である、請求項１４記載の製造方法。
  17. 当該初期pHを有するバッファーおよび終期pHを有するバッファーの組み合わせの比率を連続的または段階的に変化させることにより、当該溶離バッファーによるpH勾配を行う、請求項１４～１６の何れか一項記載の製造方法。
  18. 当該pH勾配が、（ａ）約4～約6 CVの範囲における任意のカラム容量に相当する間隔毎に、当該溶離バッファー中の終期pHを有するバッファーの割合（％）を少なくとも約50～100％の範囲に渡って、約1～約2％の範囲における任意の割合ずつ段階的に増加させることによって行われるか、（ｂ）約30～約40 CVの範囲における任意のカラム容量に相当する範囲において、当該溶離バッファー中のpHを、約0.6～約1.0の範囲における任意のpHずつ段階的に低下させることによって行われる、請求項１４～１７の何れか一項記載の製造方法。
  19. 請求項１記載の溶離バッファーおよび請求項２記載の平衡化バッファーの線流速が、各々、約100～約800 cm/hの範囲における任意の線流速である、請求項１～１８の何れか一項記載の製造方法。
  20. 請求項１記載の平衡化バッファーおよび／または溶離バッファーの電気伝導度が、約1～約20 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度である、請求項１および３～１９の何れか一項記載の製造方法。
  21. 請求項２記載の平衡化バッファーの電気伝導度が、約1～約20 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度である、請求項２～８および１９の何れか一項記載の製造方法。
  22. 請求項２記載の平衡化バッファーのpHが、約9.2～約7.4の範囲における任意のpH値である、請求項２～８、１９および２１の何れか一項記載の製造方法。
  23. 請求項１～２２の何れか一項記載の分離工程に含まれる各工程において、適宜必要に応じて、洗浄バッファーによる当該イオン交換担体の洗浄工程を含む、請求項１～２２の何れか一項記載の製造方法。
  24. 分取もしくは回収されたタンパク質非着色体画分またはその濃縮液の色濃度が、当該日本薬局方の「色の比較試験法」における比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5と実質的に同じかあるいはそれよりも薄い、請求項１～２３の何れか一項記載の製造方法。
  25. 分取もしくは回収されたタンパク質非着色体画分またはその濃縮液の色濃度が、当該日本薬局方の「色の比較試験法」における比較標準溶液BY6との目視による比較試験において、当該BY6と実質的に同じかあるいはそれよりも薄い、請求項１～２３の何れか一項記載の製造方法。
  26. 分取もしくは回収されたタンパク質非着色体画分またはその濃縮液の色濃度が、当該日本薬局方の「色の比較試験法」における比較標準溶液BY7との目視による比較試験において、当該BY7と実質的に同じである、請求項１～２３の何れか一項記載の製造方法。
  27. 分取もしくは回収されたタンパク質非着色体画分またはその濃縮液のEm/UV*100値が約6.3以下である、請求項１～２３の何れか一項記載の製造方法。
  28. 分取もしくは回収されたタンパク質非着色体画分またはその濃縮液のEm/UV*100値が約4.1以下である、請求項１～２３の何れか一項記載の製造方法。
  29. 分取もしくは回収されたタンパク質非着色体画分におけるタンパク質濃度が、約20～約300 mg/mLの範囲における任意の濃度である、請求項１～２８の何れか一項記載の製造方法。
  30. 当該タンパク質が、抗体またはその抗体断片である、請求項１～２９の何れか一項記載の製造方法。
  31. 当該抗体が、二重特異性抗体である、請求項３０記載の製造方法。
  32. 当該二重特異性抗体が、PD-1およびCD3に各々特異的に結合することができる二重特異性抗体である、請求項３１記載の製造方法。
  33. PD-1およびCD3に各々特異的に結合することができる二重特異性抗体が、PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖ならびにCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖からなり、（ａ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなり、（ｂ）CD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号６のアミノ酸配列からなり、および（ｃ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖およびCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖がともに、配列番号７のアミノ酸配列からなる当該二重特異性抗体である、請求項３２記載の製造方法。
  34. PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号５のアミノ酸配列からなる、請求項３３記載の製造方法。
  35. 請求項３３または３４記載のPD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該各重鎖の重鎖定常領域が、各々、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる重鎖定常領域に置換され、同記載のCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該各重鎖の重鎖定常領域が、各々、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなる重鎖定常領域に置換された、請求項３３または３４記載の製造方法。
  36. タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液から、タンパク質非着色体を分離する工程を含む、当該タンパク質非着色体を含む溶液の製造方法であって、
    （１）当該分離工程が、
    （ｉ）当該溶液を陰イオン交換担体カラムに投入し、所定の初期pHを有する平衡化バッファーを使用して、当該タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を陰イオン交換担体に結合させる工程、
    （ｉｉ）当該タンパク質非着色体およびタンパク質着色体が分離されるようあらかじめ定められた条件にて、当該初期pHから終期pHまで下降するpH勾配を形成する溶離バッファーを、所定の流速にて当該陰イオン交換担体カラムに流す工程、および
    （ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）により溶離するタンパク質非着色体を含む所定の画分を分取する工程からなり、
    （２）当該タンパク質が、PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖ならびにCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖からなり、（ａ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなり、（ｂ）CD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号６のアミノ酸配列からなり、および（ｃ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖およびCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖がともに、配列番号７のアミノ酸配列からなる、PD-1およびCD3に各々特異的に結合する二重特異性抗体であり、
    （３）当該陰イオン交換担体が、Toyopearl（登録商標）NH2-750Fであり、
    （４）当該平衡化バッファーおよび溶離バッファーの初期pHが約10.6～約8.4の任意のpH値であり、当該溶離バッファーの終期pHが約7.0～約4.0の範囲における任意のpH値（但し、当該初期pHは、当該終期pHよりも2.0以上高い。）であり、
    （５）当該pH勾配が、（ａ）約4～約6 CVの範囲における任意のカラム容量に相当する間隔毎に、当該溶離バッファー中のバッファーＢの割合（％）を少なくとも約50～100％の範囲に渡って、約1～約2％の範囲における任意の割合ずつ段階的に増加させることによって実施されるか、（ｂ）約30～約40 CVの範囲における任意のカラム容量に相当する範囲において、当該溶離バッファー中のpHを、約0.6～約1.0の範囲における任意のpHずつ段階的に低下させることによって行われ、
    （６）当該溶離バッファーの線流速が、約100～約800 cm/hであり、ならびに
    （７）分取されたタンパク質非着色体を含む溶液の色濃度が、（ｉ）第十七改正日本薬局方の一般試験法における項目2.65に記載される色の比較試験法における比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5と実質的に同じかあるいはそれよりも薄い、もしくは（ｉｉ）分取されたタンパク質非着色体を含む溶液のEm/UV*100値が約6.3以下である、当該製造方法。
  37. タンパク質非着色体およびタンパク質着色体を含む溶液から、タンパク質非着色体を分離する工程を含む、当該タンパク質非着色体を含む溶液の製造方法であって、
    （１）当該分離工程が、
    （ｉ）当該溶液を陰イオン交換担体カラムに投入する工程、
    （ｉｉ）当該溶液中の当該タンパク質着色体が当該陰イオン交換担体に結合し、当該タンパク質非着色体が結合しないよう調製された平衡化バッファーを所定の流速にて陰イオン交換担体カラムに流す工程、および
    （ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）においてそのままフロースルーするタンパク質非着色体を含む画分を回収する工程からなり、
    （２）当該タンパク質が、PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖ならびにCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖からなり、（ａ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなり、（ｂ）CD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号６のアミノ酸配列からなり、および（ｃ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖およびCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖がともに、配列番号７のアミノ酸配列からなる、PD-1およびCD3に各々特異的に結合する二重特異性抗体であり、
    （３）当該陰イオン交換担体が、Toyopearl（登録商標）NH2-750Fであり、
    （４）当該平衡化バッファーのpHが約7.8～約8.2の範囲における任意のpH値であり、電気伝導度が約5～約7 mS/cmの範囲における任意の電気伝導度であり、
    （５）当該平衡化バッファーの線流速が、約100～約400 cm/hであり、ならびに
    （６）分取されたタンパク質非着色体を含む溶液の色濃度が、（ｉ）第十七改正日本薬局方の一般試験法における項目2.65に記載される色の比較試験法における比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5と実質的に同じかあるいはそれよりも薄い、または（ｉｉ）分取されたタンパク質非着色体を含む溶液のEm/UV*100値が約6.3以下である、当該製造方法。
  38. 約100～約300 mg/mLの濃度にて、PD-1およびCD3に各々特異的に結合する二重特異性抗体を含む、無色または僅かに着色した溶液であって、
    PD-1およびCD3に各々特異的に結合する二重特異性抗体が、PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖ならびにCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖からなり、（ａ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される何れか一つのアミノ酸配列からなり、（ｂ）CD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該重鎖が、配列番号６のアミノ酸配列からなり、および（ｃ）PD-1に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖およびCD3に特異的に結合する抗原結合部位を構成する重鎖および軽鎖における当該軽鎖がともに、配列番号７のアミノ酸配列からなる、当該溶液。
  39. 当該溶液の色濃度が、（ｉ）第十七改正日本薬局方の一般試験法における項目2.65に記載される色の比較試験法における比較標準溶液BY5との目視による比較試験において、当該BY5と実質的に同じかあるいはそれよりも薄い、または（ｉｉ）分取されたタンパク質非着色体を含む溶液のEm/UV*100値が約6.3以下である、請求項３８記載の溶液。
  40. 着色の低減ないし除去のための何れの分離工程も経ずに、無色または僅かに着色した性状である溶液を除く、請求項３８または３９記載の溶液。
  41. 請求項３３～３５の何れか一項記載のPD-1およびCD3に各々特異的に結合する二重特異性抗体を含み、請求項１～３７の何れか一項記載の方法により製造された無色または僅かに着色した溶液。
  42. 請求項３８～４１の何れか一項記載の溶液を含む医薬組成物。
  43. 自己免疫疾患もしくは移植片対宿主病あるいは血液がんの予防、症状進展抑制、再発抑制および／または治療における、請求項４２記載の医薬組成物の使用。
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