JP2024000977A - 抗体の分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 クロマトグラフィと質量分析とを組み合わせた、試料中に含まれる抗体の分析方法において、試料中に含まれるインタクト抗体を直接、簡便かつ迅速に分析可能な方法を提供すること。【解決手段】 試料中に含まれるインタクト抗体を当該抗体と特異的に結合可能な物質を固定化した担体に吸着させる工程と、揮発性成分のみを含む緩衝液を用いて前記吸着したインタクト抗体を溶出させる工程と、前記溶出したインタクト抗体を含む画分を質量分析に供する工程、前記インタクト抗体を含む画分を質量分析に供する際に、ギ酸を含むアセトニトリル水溶液を添加する工程を含む前記インタクト抗体の分析方法により、前記課題を解決する。【選択図】 なし
Description
本発明は糖鎖を抗体から切り出すことなく抗体を分析する方法に関する。特に本発明は、液体クロマトグラフィと質量分析とを組み合わせて、糖鎖を結合したままのインタクトな状態の抗体を分析する方法に関する。
抗体医薬品はガンや免疫疾患等の治療に用いられている。抗体医薬品に使用されている抗体は、遺伝子工学的手法により製造された当該抗体を生産可能な動物細胞等（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞等）を培養後、液体クロマトグラフィ等を用いて高純度に精製し、製造する。近年、抗体医薬品が細胞を用いた生産中や保管時においても酸化還元、異性化または糖鎖付加などの修飾を受けることで多様な分子の集合体となっていることが判明しており、抗体医薬品の薬効や安全性への影響が懸念されている。特に、抗体に結合している糖鎖構造の違いは、抗体医薬品の活性や血中での動態、人への安全性に大きな影響を与えることが報告されており、糖鎖構造の詳細な解析が必要である（非特許文献１）。
抗体医薬品に用いられている抗体の糖鎖構造を分析する主な方法として、核磁気共鳴法、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ法）、質量分析法、レクチンアレイ法などの直接的な分析手法、ＬＣ－ＭＳ分析を用いて抗体から糖鎖を切り出して糖鎖構造を分析する方法（特許文献１および特許文献２）や、糖鎖の切り出しを伴わないインタクトな状態の抗体を直接ＬＣ－ＭＳ分析する手法（特許文献３）があげられる。しかしながら、これら分析方法では非常に煩雑な操作を伴い、多大な費用と時間を要する。
一方、より簡便な抗体の物性に関する分析方法として、液体クロマトグラフィによる分析が挙げられる。具体的には、サイズ排除クロマトグラフィを用いて、分子サイズに基づき抗体を分離することで多量体、凝集体や分解物を分離、定量することが可能である。またイオン交換クロマトグラフィを用いることで、抗体分子の電荷の違いに基づいた分離が可能である。しかしながら、これらのクロマトグラフィによる分析では、糖鎖構造などの抗体分子の非常に微小な構造の違いは識別、分離することができず、限定的な分析結果しか得られなかった。
抗体と親和性を持ったアフィニテイ基をリガンドとして活用したアフィニティクロマトグラフィを用いた分析は抗体とアフィニティリガンドとの親和性に基づいた分離が可能なことから、抗体分子の非常に微小な構造の違いの観察が可能な場合がある。例えば、Ｆｃレセプターをリガンドとして使用したアフィニティクロマトグラフィ法は、抗体に結合している糖鎖構造の違いに基づいた抗体の分離、分析が可能なため、抗体に結合している糖鎖構造の違いを分析可能である（特許文献４および特許文献５）。しかしながら本法のみでは、抗体に結合している詳細な糖鎖構造の種類の割合やその組成比などを知ることは困難である。
特許文献４および特許文献５では、前述したＦｃレセプターをリガンドとして活用したアフィニティクロマトグラフィと質量分析とを組み合わせることで、詳細な糖鎖構造の種類や含有割合、およびその組成比などを分析している。しかしながら、これら特許文献に記載の方法では、質量分析をする際に、糖鎖の切り出し操作など非常に煩雑な操作を伴い、多大な時間と労力を要する。
ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ，３４（２），８３－８８（２０１３）
本発明の課題は、クロマトグラフィと質量分析とを組み合わせた、試料中に含まれる抗体の分析方法において、試料中に含まれる糖鎖を結合したままのインタクトな状態の抗体を直接、簡便かつ迅速に分析可能な方法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、アフィニティクロマトグラフィにおける溶出緩衝液の成分及びインタクト抗体を含む溶出緩衝液に添加するメイクアップ溶媒の成分を最適化することで、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の［１］から［６］の態様を包含する。
［１］
インタクト抗体の分析方法であって、
（Ａ）吸着剤に吸着されたインタクト抗体を溶出緩衝液により溶出させる工程、
（Ｂ）インタクト抗体を含む溶出緩衝液にメイクアップ溶媒を添加する工程、および
（Ｃ）メイクアップ溶媒を添加した溶出緩衝液を質量分析装置に導入する工程
を含み、
前記溶出緩衝液が揮発性成分のみを含有し、
前記メイクアップ溶媒が０．０５～２．０ｗ／ｖ％のギ酸を含む４０～６０ｖ／ｖ％のアセトニトリル水溶液である
方法。
インタクト抗体の分析方法であって、
（Ａ）吸着剤に吸着されたインタクト抗体を溶出緩衝液により溶出させる工程、
（Ｂ）インタクト抗体を含む溶出緩衝液にメイクアップ溶媒を添加する工程、および
（Ｃ）メイクアップ溶媒を添加した溶出緩衝液を質量分析装置に導入する工程
を含み、
前記溶出緩衝液が揮発性成分のみを含有し、
前記メイクアップ溶媒が０．０５～２．０ｗ／ｖ％のギ酸を含む４０～６０ｖ／ｖ％のアセトニトリル水溶液である
方法。
［２］
吸着剤がＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体である、［１］に記載の方法。
吸着剤がＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体である、［１］に記載の方法。
［３］
インタクト抗体がヒトＦｃ領域を含むインタクトＩｇＧであり、Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである、［２］に記載の方法。
インタクト抗体がヒトＦｃ領域を含むインタクトＩｇＧであり、Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである、［２］に記載の方法。
［４］
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、以下の（１）から（３）のいずれから選択される［３］に記載の方法：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつＩｇＧ結合活性を有するポリペプチド、または（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチド。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、以下の（１）から（３）のいずれから選択される［３］に記載の方法：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつＩｇＧ結合活性を有するポリペプチド、または（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチド。
［５］
溶出緩衝液がｐＨ２．５からｐＨ６．５の酢酸アンモニウム水溶液である、［１］から［４］のいずれかに記載の方法。
溶出緩衝液がｐＨ２．５からｐＨ６．５の酢酸アンモニウム水溶液である、［１］から［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
［１］から［５］のいずれかに記載のインタクト抗体分析方法において、経時的に各糖鎖構造を含む抗体のスペクトルのクロマトグラムを収集し、抗体に結合している糖鎖構造の違いによる抗体分離の違いを明らかにする抗体分析方法。
［１］から［５］のいずれかに記載のインタクト抗体分析方法において、経時的に各糖鎖構造を含む抗体のスペクトルのクロマトグラムを収集し、抗体に結合している糖鎖構造の違いによる抗体分離の違いを明らかにする抗体分析方法。
本発明は、試料中に含まれるインタクト抗体をアフィニティクロマトグラフィ用吸着剤に吸着させ、溶出緩衝液を用いて当該吸着したインタクト抗体を溶出後、溶出したインタクト抗体を含む溶出緩衝液にメイクアップ溶媒を添加し、質量分析に供することで、インタクト抗体を分析する方法において、溶出緩衝液として揮発性成分のみ含む緩衝液を用い、メイクアップ溶媒としてギ酸を含むアセトニトリル水溶液を用いることを特徴としている。
本発明により、溶出したインタクト抗体を含む画分に対して前処理を行うことなく、当該画分を質量分析装置へ直接導入できるため、例えば、前記抗体に結合した糖鎖構造を直接、簡便、迅速かつ高分離能で分析できる。したがって、抗体医薬品の製造工程管理や品質管理がより簡便、迅速かつ精度良く実施できる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、試料中に含まれるインタクト抗体をアフィニティクロマトグラフィ用吸着剤に吸着させ、溶出緩衝液を用いて当該吸着したインタクト抗体を溶出後、溶出したインタクト抗体を含む溶出緩衝液にメイクアップ溶媒を添加し、質量分析に供することで、インタクト抗体を分析する方法において、溶出緩衝液として揮発性成分のみ含む緩衝液を用い、メイクアップ溶媒としてギ酸を含むアセトニトリル水溶液を用いることを特徴としている。
本発明においてインタクト抗体とは、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに完全な軽鎖定常領域（ＣＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、かつ少なくとも１ヶ所の非共有結合性相互作用を介して結合している完全長抗体のＦｃ領域２ヶ所にＮ－結合型糖鎖が結合し、一対の糖鎖構造を保有している抗体のことをいう。
本発明でインタクト抗体の吸着に用いる、アフィニティクロマトグラフィ用吸着剤は前記インタクト抗体と特異的に結合可能な物質を固定化した担体であり、インタクト抗体と吸着剤との親和性に基づきインタクト抗体を特異的に吸着できる。インタクト抗体と特異的に結合可能な物質の例として、抗体が有するＦｃ領域、Ｆａｂ領域および糖鎖に特異的に結合可能な物質があげられる。中でもＦｃ領域に特異的に結合可能な物質である、Ｆｃ結合性タンパク質が好ましい。
Ｆｃ結合性タンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＰｒｏｔｅｉｎ ＡやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ、Ｆｃ受容体、Ｆｃ結合能を有した前記Ｆｃ受容体の部分領域等があげられる。中でもインタクト抗体がヒトＦｃ領域を含むインタクトＩｇＧである場合、ヒトＦｃ受容体の一つであるヒトＦｃγＲＩＩＩａをＦｃ結合性タンパク質として用いると、アフィニティクロマトグラフィによりインタクト抗体が糖鎖構造の違いに基づき分離されるため、その後の質量分析による、インタクト抗体に結合した糖鎖構造の詳細な含有割合やその組成分析が容易となる点で好ましい。なお本明細書においてヒトＦｃ領域を含むインタクトＩｇＧは、糖鎖構造を保持したヒト由来のＦｃ領域を、部分構造として少なくとも有していればよく、一般的に抗体医薬品として用いられているキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体や、これらのアミノ酸置換体があげられる。また、二重特異性抗体（バイスペシフィック抗体）、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）、抗体Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質などの人工的に構造改変した抗体も含まれる。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａの好ましい態様として、
（１）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のメチオニンまでのアミノ酸残基）を少なくとも含むポリペプチド、および
（２）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域を少なくとも含み、ただし当該細胞外領域を構成するアミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド、
があげられる。
前記（２）において「１もしくは数個」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から５個のいずれかを意味する。
また前記（２）のさらに好ましい態様として、
特開２０１５－０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１６－１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１７－１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
ＷＯ２０１９／０８３０４８号で開示のＦｃ結合性タンパク質、
があげられる。
（１）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のメチオニンまでのアミノ酸残基）を少なくとも含むポリペプチド、および
（２）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域を少なくとも含み、ただし当該細胞外領域を構成するアミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド、
があげられる。
前記（２）において「１もしくは数個」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から５個のいずれかを意味する。
また前記（２）のさらに好ましい態様として、
特開２０１５－０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１６－１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１７－１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
ＷＯ２０１９／０８３０４８号で開示のＦｃ結合性タンパク質、
があげられる。
本発明において、インタクト抗体と特異的に結合可能な物質を固定化させる担体は、当該抗体の吸着／溶出に用いる溶液や溶剤に対して不溶性であり、かつ前記物質を共有結合で固定化するための官能基（例えばヒドロキシ基）を有した物質であればよく、ジルコニア、ゼオライト、シリカ、皮膜シリカ等の無機系物質に由来した担体であってもよいし、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然有機高分子物質に由来した担体であってもよいし、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート、ビニルポリマー等の合成有機高分子物質に由来した担体であってもよい。
なお担体表面に有する官能基がヒドロキシ基の場合、活性化剤を用いて、当該ヒドロキシ基から、インタクト抗体と特異的に結合可能な物質と共有結合可能な活性化基を形成させるとよい。当該活性化剤の具体例として、エピクロロヒドリン（活性化基としてエポキシ基を形成）、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（活性化基としてエポキシ基を形成）、トレシルクロリド（活性化基としてトレシル基を形成）、ビニルブロミド（活性化基としてビニル基を形成）があげられる。
またヒドロキシ基をアミノ基やカルボキシル基などに変換した後、活性化剤を作用させて活性化してもよい。当該活性化剤の具体例として３－マレイミドプロピオン酸Ｎ－スクシンイミジル（活性化基としてマレイミド基を形成）、１，１’－カルボニルジイミダゾール（活性化基としてカルボニルイミダゾール基を形成）、ハロゲン化酢酸（活性化基としてハロゲン化アセチル基を形成）があげられる。
本発明では、アフィニティクロマトグラフィ用吸着剤に吸着した試料中に含まれるインタクト抗体を、揮発性成分のみを含む緩衝液で溶出させる。本操作により、溶出した前記抗体を含む画分には溶媒として揮発性成分のみが含まれるため、当該画分をそのまま質量分析に供せる。すなわち、通常であれば、得られた画分からの抗体の回収、回収した抗体からの糖鎖の切り出し、切り出した糖鎖の精製、質量分析のための蛍光物質標識及び精製が、質量分析の前に必要となるところ、これらの工程をふまなくとも前記画分を質量分析に供することができる。揮発性成分の例として、ギ酸、酢酸、炭酸、重炭酸、ピリジン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、アンモニア、Ｎ－メチルモルホリン、エタノールアミン、およびそれらの塩があげられる。中でも酢酸塩である酢酸アンモニウムが、本発明の揮発性成分として好ましい。溶出緩衝液のｐＨは、インタクト抗体と、当該抗体と特異的に結合可能な物質との親和性などに基づき、適宜決定すればよいが、揮発性成分として酢酸アンモニウムを用いる場合はｐＨ２．５からｐＨ６．５までの範囲とするとよい。溶出緩衝液に含まれる揮発性成分の濃度は、当該成分のｐＫａなどに基づき、１ｍＭから１０００ｍＭの範囲、好ましくは１０ｍＭから５００ｍＭの範囲、さらに好ましくは２０ｍＭから２００ｍＭの範囲で適宜決定すればよい。
また、本発明では、アフィニティクロマトグラフィ用吸着剤に吸着した試料中に含まれるインタクト抗体を揮発性成分のみを含む緩衝液で溶出させた後、質量分析装置へ導入する際に、質量分析装置による分析時の感度向上の為に添加する補助溶媒であるメイクアップ溶媒を添加する。メイクアップ溶媒として、通常質量分析に使用される溶媒であれば特に限定は無く、例えば、メタノール、エタノール、２－プロパノール、およびアセトニトリル並びにそれらの水溶液があげられるが、好ましくは、メタノールおよびアセトニトリル、より好ましくはアセトニトリルがあげられる。また、水溶液の場合の濃度は例えば３０～７０ｖ／ｖ％、好ましくは４０～６０ｖ／ｖ％があげられる。本発明では、メイクアップ溶媒にギ酸を含むことを特徴としており、その濃度は、例えば０．０５～２．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．１～１．５ｗ／ｖ％、より好ましくは１．０ｗ／ｖ％である。メイクアップ溶媒の溶出緩衝液への添加割合は、質量分析に供する際に影響がない範囲で適宜変更可能だが、例えば１～９９ｖ／ｖ％、好ましくは２０～８０ｖ／ｖ％、より好ましくは４０～６０ｖ／ｖ％の割合で溶出緩衝液にメイクアップ溶媒を添加すれば良い。
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１ Ｆｃ結合性タンパク質固定化担体の調製
２ｍＬの分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製：液体クロマトグラフィ用充填剤）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、特開２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を４ｍｇ反応させることにより、ＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲルを得た。なおＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓ（配列番号２）のうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆ（配列番号１の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基であり、ただしＶａｌ２７Ｇｌｕ［この表記は配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換されていることを意味する、以下同じ］、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｖａｌ１７６Ｐｈｅのアミノ酸置換が生じたポリペプチド、特開２０１８－１９７２２４号公報）のアミノ酸配列であり、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。
２ｍＬの分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製：液体クロマトグラフィ用充填剤）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、特開２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を４ｍｇ反応させることにより、ＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲルを得た。なおＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓ（配列番号２）のうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆ（配列番号１の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基であり、ただしＶａｌ２７Ｇｌｕ［この表記は配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換されていることを意味する、以下同じ］、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｖａｌ１７６Ｐｈｅのアミノ酸置換が生じたポリペプチド、特開２０１８－１９７２２４号公報）のアミノ酸配列であり、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。
実施例２ Ｆｃ結合性タンパク質固定化担体充填カラムを用いた抗体の分離（その１）
（１）実施例１で作製したＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲル１．２ｍＬを、φ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填し、ＦｃＲ９＿Ｆカラムを作製した。
（１）実施例１で作製したＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲル１．２ｍＬを、φ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填し、ＦｃＲ９＿Ｆカラムを作製した。
（２）（１）で作製したＦｃＲ９＿Ｆカラムを高速液体クロマトグラフィ装置（東ソー製）に接続し、５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）（以下、平衡化緩衝液とも表記）で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎにて平衡化した。
（３）平衡化緩衝液で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業製、マウスとヒトのキメラ抗体）を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎにて２５μＬ添加した。
（４）流速１．０ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で２分洗浄後、５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエント（１８分で５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．０）が１００％となるグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
得られたモノクローナル抗体の分離パターンを図１に示した。
実施例３ Ｆｃ結合性タンパク質固定化担体充填カラムを用いた抗体の分離（その２）
（１） 実施例２（１）で作製したＦｃＲ９＿Ｆカラムを高速液体クロマトグラフィ装置（Ｗａｔｅｒｓ製）に接続し、２０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）（以下、平衡化緩衝液とも表記）で流速０．２ｍＬ／ｍｉｎにて平衡化した。
（１） 実施例２（１）で作製したＦｃＲ９＿Ｆカラムを高速液体クロマトグラフィ装置（Ｗａｔｅｒｓ製）に接続し、２０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）（以下、平衡化緩衝液とも表記）で流速０．２ｍＬ／ｍｉｎにて平衡化した。
（２）平衡化緩衝液で１０．０ｍｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業製、マウスとヒトのキメラ抗体）を流速０．２ｍＬ／ｍｉｎにて２．５μＬ添加した。
（３）流速０．２ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で２分洗浄後、２０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）によるｐＨグラジエント（１８分で２０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）が１００％となるグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
得られたモノクローナル抗体の分離パターンを図２に示した。
得られたモノクローナル抗体の分離パターンを図２に示した。
実施例４ Ｆｃ結合性タンパク質固定化担体充填カラムを用いた抗体の分離（その３）
実施例２（２）および（３）で使用した平衡化緩衝液を５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）とし、実施例２（４）の溶出を５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）によるｐＨグラジエント（１８分で５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）が１００％となるグラジエント）で行なった以外は、実施例２と同様にモノクローナル抗体を分離した。
実施例２（２）および（３）で使用した平衡化緩衝液を５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）とし、実施例２（４）の溶出を５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）によるｐＨグラジエント（１８分で５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）が１００％となるグラジエント）で行なった以外は、実施例２と同様にモノクローナル抗体を分離した。
得られたモノクローナル抗体の分離パターンを図３に示した。
実施例２から実施例４の結果から、溶出緩衝液として揮発性成分（酢酸アンモニウム）のみを含む緩衝液を用いても（実施例２および実施例３）、従来の不揮発性成分（クエン酸）を含む緩衝液（実施例４）と同等の抗体分離ができることを確認できた。なお実施例２および実施例３で得られる、溶出したインタクト抗体を含む画分には、溶媒として揮発性成分のみを含むため、当該画分は直接質量分析に供せる。
実施例５ インタクト抗体の質量分析
実施例２で使用した揮発性緩衝液を用いてモノクローナル抗体の質量分析装置を用いた解析を以下のとおり実施した。
測定条件
装置：Ｗａｔｅｒｓ社製Ｘｅｖｏ Ｇ２ ＸＳ Ｑ ＴＯＦ
導入速度：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
イオン化：ＥＳＩ＋
測定モード：Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＭＳ Ｍｏｄｅ
キャピラリー電圧：３ｋＶ
コーン電圧：１５０Ｖ
ソースオフセット：５０Ｖ
ソース温度：１５０℃
脱溶媒温度：６００℃
コーンガス：５０Ｌ／Ｈｒ
脱溶媒ガス：８００Ｌ／Ｈｒ
データ取り込み：ｍ／ｚ ５００－４０００、０．５ｓｅｃ
液体クロマトグラフィ装置を用いて測定したモノクローナル抗体のマススペクトル解析結果を図４に示した。また、図４のスペクトルから、Ｗａｔｅｒｓ社製質量分析装置付属の解析ソフトＵＮＩＦＩを用いてデコンボリューション操作を行い、図５のスペクトルを得た。
実施例２で使用した揮発性緩衝液を用いてモノクローナル抗体の質量分析装置を用いた解析を以下のとおり実施した。
測定条件
装置：Ｗａｔｅｒｓ社製Ｘｅｖｏ Ｇ２ ＸＳ Ｑ ＴＯＦ
導入速度：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
イオン化：ＥＳＩ＋
測定モード：Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＭＳ Ｍｏｄｅ
キャピラリー電圧：３ｋＶ
コーン電圧：１５０Ｖ
ソースオフセット：５０Ｖ
ソース温度：１５０℃
脱溶媒温度：６００℃
コーンガス：５０Ｌ／Ｈｒ
脱溶媒ガス：８００Ｌ／Ｈｒ
データ取り込み：ｍ／ｚ ５００－４０００、０．５ｓｅｃ
液体クロマトグラフィ装置を用いて測定したモノクローナル抗体のマススペクトル解析結果を図４に示した。また、図４のスペクトルから、Ｗａｔｅｒｓ社製質量分析装置付属の解析ソフトＵＮＩＦＩを用いてデコンボリューション操作を行い、図５のスペクトルを得た。
実施例６
実施例５において、メイクアップ溶媒として１．０ｗ／ｖ％ギ酸含有５０ｖ／ｖ％アセトニトリル水溶液を５０ｖ／ｖ％の比となるよう溶出緩衝液に添加したこと以外は実施例５と同様に実施し、得られたマススペクトル解析結果を図６に示した。また、同様にデコンボリューション操作により図７のスペクトルを得た。図７の各ピークの分子量から同定することで、モノクローナル抗体に結合している２つのＮ－結合型糖鎖構造の組成を帰属させることが可能となり、モノクローナル抗体に含まれる糖鎖構造を直接、簡便に分析できることがわかる。
実施例５において、メイクアップ溶媒として１．０ｗ／ｖ％ギ酸含有５０ｖ／ｖ％アセトニトリル水溶液を５０ｖ／ｖ％の比となるよう溶出緩衝液に添加したこと以外は実施例５と同様に実施し、得られたマススペクトル解析結果を図６に示した。また、同様にデコンボリューション操作により図７のスペクトルを得た。図７の各ピークの分子量から同定することで、モノクローナル抗体に結合している２つのＮ－結合型糖鎖構造の組成を帰属させることが可能となり、モノクローナル抗体に含まれる糖鎖構造を直接、簡便に分析できることがわかる。
なお、図７及び図９における糖鎖構造の種類（Ｍａｎ５、Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ）は図８に記載の糖鎖構造に対応する。
実施例７
実施例６で得られたモノクローナル抗体に結合しているＮ－結合型糖鎖構造の違いによるマススペクトルから経時的に抽出し、クロマトグラムを描画したものを図９に示した。この図から、Ｆｃ結合性タンパク質固定化担体充填カラムを用いた抗体分離において、初めに片側にのみＮ－結合型糖鎖を有するＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆが溶出し、次いでマンノースを多く含みフコースを含まないＧ０／Ｍａｎ５の組合せ、フコースを含まないＧ０／Ｇ０Ｆの組合せ、末端にガラクトースを含まないＧ０Ｆ／Ｇ０Ｆの組合せ、ガラクトースが一方の末端に結合したＧ０Ｆ／Ｇ１Ｆの組合せ、ガラクトースがともに末端に結合したＧ１Ｆ／Ｇ１Ｆの組合せ、Ｇ１Ｆ／Ｇ２Ｆの組合せ、最後にＧ２Ｆ／Ｇ２Ｆの組合せの順で溶出されることがわかる。これらにより、糖鎖構造の組合せの違いによる分離パターンの違いを明らかとすることが可能となる。
実施例６で得られたモノクローナル抗体に結合しているＮ－結合型糖鎖構造の違いによるマススペクトルから経時的に抽出し、クロマトグラムを描画したものを図９に示した。この図から、Ｆｃ結合性タンパク質固定化担体充填カラムを用いた抗体分離において、初めに片側にのみＮ－結合型糖鎖を有するＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆが溶出し、次いでマンノースを多く含みフコースを含まないＧ０／Ｍａｎ５の組合せ、フコースを含まないＧ０／Ｇ０Ｆの組合せ、末端にガラクトースを含まないＧ０Ｆ／Ｇ０Ｆの組合せ、ガラクトースが一方の末端に結合したＧ０Ｆ／Ｇ１Ｆの組合せ、ガラクトースがともに末端に結合したＧ１Ｆ／Ｇ１Ｆの組合せ、Ｇ１Ｆ／Ｇ２Ｆの組合せ、最後にＧ２Ｆ／Ｇ２Ｆの組合せの順で溶出されることがわかる。これらにより、糖鎖構造の組合せの違いによる分離パターンの違いを明らかとすることが可能となる。
実施例８
モノクローナル抗体としてトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、中外製薬製）を用いた以外は実施例２と同様の方法により、抗体の分離パターンのクロマトグラムを取得し（図１０）、実施例６と同様の方法によりマススペクトル解析結果からデコンボリューション操作を行ったスペクトルを取得した（図１１）。
モノクローナル抗体としてトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、中外製薬製）を用いた以外は実施例２と同様の方法により、抗体の分離パターンのクロマトグラムを取得し（図１０）、実施例６と同様の方法によりマススペクトル解析結果からデコンボリューション操作を行ったスペクトルを取得した（図１１）。
また、実施例７と同様の方法によりマススペクトルから経時的に抽出し、クロマトグラムを描画したものを図１２に示す。
本発明によればモノクローナル抗体をリツキサンからトラスツズマブに替えても、揮発性成分のみを含有する溶出緩衝液を用い、メイクアップ溶媒として０．０５～２．０ｗ／ｖ％のギ酸を含む４０～６０ｖ／ｖ％のアセトニトリル水溶液を用いることにより、糖鎖構造の組合せの違いに基づいて分離することが可能である。
実施例９
モノクローナル抗体としてベバシズマブ（アバスチン（登録商標）、中外製薬製）を用いた以外は実施例２と同様の方法により、抗体の分離パターンのクロマトグラムを取得し（図１３）、実施例６と同様の方法によりマススペクトル解析結果からデコンボリューション操作を行ったスペクトルを取得した（図１４）。
モノクローナル抗体としてベバシズマブ（アバスチン（登録商標）、中外製薬製）を用いた以外は実施例２と同様の方法により、抗体の分離パターンのクロマトグラムを取得し（図１３）、実施例６と同様の方法によりマススペクトル解析結果からデコンボリューション操作を行ったスペクトルを取得した（図１４）。
また、実施例７と同様の方法によりマススペクトルから経時的に抽出し、クロマトグラムを描画したものを図１５に示す。
本発明によればモノクローナル抗体をリツキサンからベバシズマブに替えても、揮発性成分のみを含有する溶出緩衝液を用い、メイクアップ溶媒として０．０５～２．０ｗ／ｖ％のギ酸を含む４０～６０ｖ／ｖ％のアセトニトリル水溶液を用いることにより、糖鎖構造の組合せの違いに基づいて分離することが可能である。
実施例１０
抗体－薬物複合体であるトラスツズマブエムタンシン（カドサイラ（登録商標）、中外製薬製）を用いた以外は実施例２と同様の方法により、抗体－薬物複合体の分離パターンのクロマトグラムを取得し（図１６）、実施例６と同様の方法によりマススペクトル解析結果からデコンボリューション操作を行ったスペクトルを取得した（図１７）。
抗体－薬物複合体であるトラスツズマブエムタンシン（カドサイラ（登録商標）、中外製薬製）を用いた以外は実施例２と同様の方法により、抗体－薬物複合体の分離パターンのクロマトグラムを取得し（図１６）、実施例６と同様の方法によりマススペクトル解析結果からデコンボリューション操作を行ったスペクトルを取得した（図１７）。
また、実施例７と同様の方法によりマススペクトルから経時的に抽出し、トラスツヅマブ１分子に対してエムタンシン１分子が結合した抗体－薬物複合体のクロマトグラムを描画したものを図１８、トラスツヅマブ１分子に対してエムタンシン２分子が結合した抗体－薬物複合体のクロマトグラムを描画したものを図１９、トラスツヅマブ１分子に対してエムタンシン３分子が結合した抗体－薬物複合体のクロマトグラムを描画したものを図２０に示す。
本発明によれば解析対象が抗体－薬物複合体である場合においても、抗体１分子に対して結合している薬物の分子数にかかわらず、揮発性成分のみを含有する溶出緩衝液を用い、メイクアップ溶媒として０．０５～２．０ｗ／ｖ％のギ酸を含む４０～６０ｖ／ｖ％のアセトニトリル水溶液を用いることにより、糖鎖構造の組合せの違いに基づいて分離することが可能である。
実施例１１
質量分析装置としてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳを用いた以外は実施例２と同様の方法により、抗体の分離パターンのクロマトグラムを取得した（図２１）。解析ソフトとしてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた以外は、実施例６と同様の方法によりマススペクトル解析結果からデコンボリューション操作を行ったスペクトルを取得した（図２２及び図２３）。
測定条件
装置：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計
導入速度：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
イオン化：Ｈ－ＥＳＩ＋
測定モード：Ｏｒｂｉｔｒａｐ
Ｏｒｂｉｔｒａｐ分解能：７５００
キャピラリー電圧：３．５ｋＶ
Ｓｈｅａｔｈガス：５０Ａｒｂ
Ａｕｘガス：１０ Ａｒｂ
Ｓｗｅｅｐガス：１ Ａｒｂ
Ｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｕｂｅ温度：３２５℃
Ｖａｐｏｒｉｚｅｒ温度：３５０℃
ＲＦ Ｌｅｎｓ：６０％
データ取り込み：ｍ/ｚ ８００－４０００（５０ ｍｓ）
また、実施例７と同様の方法によりマススペクトルから経時的に抽出し、クロマトグラムを描画したものを図２４及び図２５に示す。
質量分析装置としてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳを用いた以外は実施例２と同様の方法により、抗体の分離パターンのクロマトグラムを取得した（図２１）。解析ソフトとしてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた以外は、実施例６と同様の方法によりマススペクトル解析結果からデコンボリューション操作を行ったスペクトルを取得した（図２２及び図２３）。
測定条件
装置：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計
導入速度：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
イオン化：Ｈ－ＥＳＩ＋
測定モード：Ｏｒｂｉｔｒａｐ
Ｏｒｂｉｔｒａｐ分解能：７５００
キャピラリー電圧：３．５ｋＶ
Ｓｈｅａｔｈガス：５０Ａｒｂ
Ａｕｘガス：１０ Ａｒｂ
Ｓｗｅｅｐガス：１ Ａｒｂ
Ｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｕｂｅ温度：３２５℃
Ｖａｐｏｒｉｚｅｒ温度：３５０℃
ＲＦ Ｌｅｎｓ：６０％
データ取り込み：ｍ/ｚ ８００－４０００（５０ ｍｓ）
また、実施例７と同様の方法によりマススペクトルから経時的に抽出し、クロマトグラムを描画したものを図２４及び図２５に示す。
なお、図２５における糖鎖構造のＳＡとはＮ－アセチルノイラミン酸を示す。
本発明によれば質量分析計をＯｒｂｉｔｒａｐ ＭＳに変更した場合でも、揮発性成分のみを含有する溶出緩衝液を用い、メイクアップ溶媒として０．０５～２．０ｗ／ｖ％のギ酸を含む４０～６０ｖ／ｖ％のアセトニトリル水溶液を用いることにより、糖鎖構造の組合せの違いに基づいて分離することが可能であり、Ｗａｔｅｒｓ社製Ｘｅｖｏ Ｇ２ ＸＳ Ｑ ＴＯＦに比べ、分離度の高いクロマトグラムの描画が可能である。
実施例１２
モノクローナル抗体として抗体－薬物複合体であるトラスツズマブエムタンシン（カドサイラ（登録商標）、中外製薬製）を用い、質量分析装置としてＯｒｂｉｔｒａｐ ＭＳを用いた以外は実施例２と同様の方法により、抗体の分離パターンのクロマトグラムを取得し（図２６）、実施例６と同様の方法によりマススペクトル解析結果からデコンボリューション操作を行ったスペクトルを取得した（図２７）。
モノクローナル抗体として抗体－薬物複合体であるトラスツズマブエムタンシン（カドサイラ（登録商標）、中外製薬製）を用い、質量分析装置としてＯｒｂｉｔｒａｐ ＭＳを用いた以外は実施例２と同様の方法により、抗体の分離パターンのクロマトグラムを取得し（図２６）、実施例６と同様の方法によりマススペクトル解析結果からデコンボリューション操作を行ったスペクトルを取得した（図２７）。
また、実施例７と同様の方法によりマススペクトルから経時的に抽出し、トラスツヅマブ１分子に対してエムタンシン１分子が結合した抗体－薬物複合体のクロマトグラムを描画したものを図２８、トラスツヅマブ１分子に対してエムタンシン２分子が結合した抗体－薬物複合体のクロマトグラムを描画したものを図２９、トラスツヅマブ１分子に対してエムタンシン３分子が結合した抗体－薬物複合体のクロマトグラムを描画したものを図３０に示す。
本発明によれば解析対象が抗体－薬物複合体である場合においても、質量分析計をＯｒｂｉｔｒａｐ ＭＳに変更し、抗体１分子に対して結合している薬物の分子数にかかわらず、揮発性成分のみを含有する溶出緩衝液を用い、メイクアップ溶媒として０．０５～２．０ｗ／ｖ％のギ酸を含む４０～６０ｖ／ｖ％のアセトニトリル水溶液を用いることにより、糖鎖構造の組合せの違いに基づいて分離することが可能である。
本発明により、従来困難であった抗体医薬品や抗体類縁医薬品の糖鎖構造の違いによる分離や糖鎖構造の解析をより正確、かつ迅速に評価できる。本発明により抗体医薬品を製造する際の課題とされていた糖鎖構造に係わる品質の向上、すなわちロット間における糖鎖構造の割合や種類のバラつきが低減できる。
Claims (7)
- インタクト抗体の分析方法であって、
（Ａ）吸着剤に吸着されたインタクト抗体を溶出緩衝液により溶出させる工程、
（Ｂ）インタクト抗体を含む溶出緩衝液にメイクアップ溶媒を添加する工程、および
（Ｃ）メイクアップ溶媒を添加した溶出緩衝液を質量分析装置に導入する工程
を含み、
前記溶出緩衝液が揮発性成分のみを含有し、
前記メイクアップ溶媒が０．０５～２．０ｗ／ｖ％のギ酸を含む４０～６０ｖ／ｖ％のアセトニトリル水溶液である
方法。 - 吸着剤がＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体である、請求項１に記載の方法。
- インタクト抗体がヒトＦｃ領域を含むインタクトＩｇＧであり、Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである、請求項２に記載の方法。
- ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、以下の（１）から（３）のいずれから選択される請求項３に記載の方法：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつＩｇＧ結合活性を有するポリペプチド、または
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２４番目のグリシンから１９９番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチド - 溶出緩衝液がｐＨ２．５からｐＨ６．５の酢酸アンモニウム水溶液である、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のインタクト抗体分析方法において、経時的に各糖鎖構造を含む抗体のスペクトルのクロマトグラムを収集し、抗体に結合している糖鎖構造の違いによる抗体分離の違いを明らかにする抗体分析方法。
- 請求項５に記載のインタクト抗体分析方法において、経時的に各糖鎖構造を含む抗体のスペクトルのクロマトグラムを収集し、抗体に結合している糖鎖構造の違いによる抗体分離の違いを明らかにする抗体分析方法。
Applications Claiming Priority (6)
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|---|---|---|---|
| JP2022099287 | 2022-06-21 | ||
| JP2022099287 | 2022-06-21 | ||
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| JP2023008512 | 2023-01-24 | ||
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| JP2023071989 | 2023-04-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024000977A true JP2024000977A (ja) | 2024-01-09 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP2023095964A Pending JP2024000977A (ja) | 2022-06-21 | 2023-06-12 | 抗体の分析方法 |
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- 2023-06-12 JP JP2023095964A patent/JP2024000977A/ja active Pending
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