JP2022022958A - インタクト抗体の分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 クロマトグラフィと質量分析とを組み合わせた、試料中に含まれる抗体の分析方法において、試料中に含まれるインタクト抗体を直接、簡便かつ迅速に分析可能な方法を提供すること。【解決手段】 試料中に含まれるインタクト抗体を当該抗体と特異的に結合可能な物質を固定化した担体に吸着させる工程と、揮発性成分のみを含む緩衝液を用いて前記吸着したインタクト抗体を溶出させる工程と、前記溶出したインタクト抗体を含む画分を質量分析に供する工程とを含む、前記インタクト抗体の分析方法により、前記課題を解決する。【選択図】 なし
Description
本発明はインタクト抗体を分析する方法に関する。特に本発明は、クロマトグラフィと質量分析とを組み合わせて、インタクト抗体を分析する方法に関する。
近年、ガンや免疫疾患等の治療に抗体を含む医薬品（抗体医薬）が用いられている。抗体医薬に用いる抗体は、遺伝子工学的手法により得られた、当該抗体を発現可能な細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞等）を培養後、カラムクロマトグラフィ等を用いて高純度に精製し、製造する。近年、抗体医薬が酸化、還元、異性化または糖鎖付加などの修飾を受けることで多様な分子の集合体となっていることが判明しており、薬効や安全性への影響が懸念されている。特に、抗体に結合している糖鎖構造の違いは、抗体医薬品の活性や動態、安全性に大きな影響を与えることが報告されており、詳細な糖鎖構造の解析が必要である（非特許文献１）。
抗体医薬に用いる抗体の糖鎖構造を分析する方法として、糖鎖の切り出しを伴うＬＣ－ＭＳ分析（特許文献１および特許文献２）や、糖鎖の切り出しを伴わずインタクト抗体を直接ＬＣ－ＭＳ分析する手法（特許文献３）があげられる。しかしながら、これら分析方法では非常に煩雑な操作を伴い、多大な時間を要する。
より簡便な抗体の分子構造の分析方法として、クロマトグラフィによる分析があげられる。具体的には、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて、分子量に基づき抗体を分離することで凝集体や分解物を分離・定量可能である。またイオン交換クロマトグラフィを用いると、抗体分子が有する電荷の違いに基づき分離可能である。しかしながら、これらクロマトグラフィによる分析では、糖鎖構造などの抗体分子の微小な構造変化は識別できず、得られる分析結果も限定的であった。
アフィニティクロマトグラフィを用いた分析はアフィニティリガンドと抗体との親和性に基づく分離が可能なため、微小な構造変化の観察が可能な場合がある。例えば、Ｆｃ結合性タンパク質をリガンドとして用いたアフィニティクロマトグラフィ法は、糖鎖構造の違いに基づいた抗体の分離が可能なため、抗体に結合している糖鎖構造の違いを分析可能である（特許文献４および特許文献５）。しかしながら本法のみでは、詳細な糖鎖構造の含有割合やその組成を知ることは困難である。
特許文献４および特許文献５では、前述したＦｃ結合性タンパク質をリガンドとして利用したアフィニティクロマトグラフィと質量分析とを組み合わせることで、詳細な糖鎖構造の含有割合やその組成を分析している。しかしながら、これら特許文献に開示の方法は、質量分析する際、糖鎖の切り出し操作など煩雑な操作を伴い、多大な時間を要する。
ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ，３４（２），８３－８８（２０１３）
本発明の課題は、クロマトグラフィと質量分析とを組み合わせた、試料中に含まれる抗体の分析方法において、試料中に含まれるインタクト抗体を直接、簡便かつ迅速に分析可能な方法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、クロマトグラフィとしてアフィニティクロマトグラフィを用い、かつ当該クロマトグラフィにおける溶出緩衝液の成分を最適化することで、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の［１］から［９］の態様を包含する。
［１］
吸着剤に吸着されたインタクト抗体を溶出緩衝液により溶出させる方法であって、
前記溶出緩衝液が揮発性成分のみを含有する、方法。
吸着剤に吸着されたインタクト抗体を溶出緩衝液により溶出させる方法であって、
前記溶出緩衝液が揮発性成分のみを含有する、方法。
［２］
［１］に記載の方法により溶出させたインタクト抗体を含む溶出緩衝液を、質量分析に供する工程を含む、インタクト抗体分析方法。
［１］に記載の方法により溶出させたインタクト抗体を含む溶出緩衝液を、質量分析に供する工程を含む、インタクト抗体分析方法。
［３］
吸着剤がＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体である、［１］または［２］に記載の方法。
吸着剤がＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
インタクト抗体がヒトＦｃ領域を含むインタクトＩｇＧであり、Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである、［３］に記載の方法。
インタクト抗体がヒトＦｃ領域を含むインタクトＩｇＧであり、Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである、［３］に記載の方法。
［５］
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチド、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつＩｇＧ結合活性を有するポリペプチドである、
［４］に記載の方法。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチド、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつＩｇＧ結合活性を有するポリペプチドである、
［４］に記載の方法。
［６］
溶出緩衝液がｐＨ２．５からｐＨ６．５の酢酸アンモニウム水溶液である、［１］から［５］のいずれかに記載の方法。
溶出緩衝液がｐＨ２．５からｐＨ６．５の酢酸アンモニウム水溶液である、［１］から［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
［１］に記載の方法により溶出させたインタクト抗体を含む緩衝液を質量分析装置に直接供する工程を含むインタクト抗体分析方法。
［１］に記載の方法により溶出させたインタクト抗体を含む緩衝液を質量分析装置に直接供する工程を含むインタクト抗体分析方法。
［８］
［７］に記載の方法により溶出させたインタクト抗体を含む緩衝液に、質量分析装置に直接供するためのメイクアップ溶媒として４０～６０％のアセトニトリルを添加し、質量分析に供する工程を含むインタクト抗体分析方法。
［７］に記載の方法により溶出させたインタクト抗体を含む緩衝液に、質量分析装置に直接供するためのメイクアップ溶媒として４０～６０％のアセトニトリルを添加し、質量分析に供する工程を含むインタクト抗体分析方法。
［９］
［８］に記載のインタクト抗体分析方法において、経時的に各糖鎖構造を含む抗体のスペクトルのクロマトグラムを収集し、抗体に結合している糖鎖構造の違いによる抗体分離の違いを明らかにする抗体分析方法。
［８］に記載のインタクト抗体分析方法において、経時的に各糖鎖構造を含む抗体のスペクトルのクロマトグラムを収集し、抗体に結合している糖鎖構造の違いによる抗体分離の違いを明らかにする抗体分析方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、試料中に含まれるインタクト抗体をクロマトグラフィ用吸着剤に吸着させ、溶出緩衝液を用いて当該吸着したインタクト抗体を溶出後、溶出したインタクト抗体を含む画分を質量分析に供することで、インタクト抗体を分析する方法において、クロマトグラフィ用吸着剤としてアフィニティクロマトグラフィ用吸着剤を用い、溶出緩衝液として揮発性塩のみ含む緩衝液を用いることを特徴としている。
本発明においてインタクト抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに完全な軽鎖定常領域（ＣＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、かつ少なくとも１ヶ所の非共有結合性相互作用を介して結合している完全長抗体のＦｃ領域２ヶ所にＮ－結合型糖鎖が結合し、一対の糖鎖構造を保有している抗体のことをいう。
本発明でインタクト抗体の吸着に用いる、アフィニティクロマトグラフィ用吸着剤は前記インタクト抗体と特異的に結合可能な物質を固定化した担体であり、インタクト抗体と吸着剤との親和性に基づきインタクト抗体を特異的に吸着できる。インタクト抗体と特異的に結合可能な物質の例として、抗体が有するＦｃ領域、Ｆａｂ領域および糖鎖に特異的に可能な物質があげられる。中でもＦｃ領域に特異的に結合可能な物質である、Ｆｃ結合性タンパク質が好ましい。
Ｆｃ結合性タンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＰｒｏｔｅｉｎ ＡやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ、Ｆｃ受容体、Ｆｃ結合能を有した前記Ｆｃ受容体の部分領域等があげられる。中でもインタクト抗体がヒトＦｃ領域を含むインタクトＩｇＧである場合、ヒトＦｃ受容体の一つであるヒトＦｃγＲＩＩＩａをＦｃ結合性タンパク質として用いると、アフィニティクロマトグラフィによりインタクト抗体が糖鎖構造の違いに基づき分離されるため、その後の質量分析による、インタクト抗体に結合した糖鎖構造の詳細な含有割合やその組成分析が容易となる点で好ましい。
なお本明細書においてヒトＦｃ領域を含むインタクトＩｇＧは、糖鎖構造を保持したヒト由来のＦｃ領域を、部分構造として少なくとも有していればよく、一般的に抗体医薬品として用いられているキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体や、これらのアミノ酸置換体があげられる。また、二重特異性抗体（バイスペシフィック抗体）、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）、抗体Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質などの人工的に構造改変した抗体も含まれる。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａの好ましい態様として、
（１）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のメチオニンまでのアミノ酸残基）を少なくとも含むポリペプチド、および
（２）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域を少なくとも含み、ただし当該細胞外領域を構成するアミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド、
があげられる。
（１）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のメチオニンまでのアミノ酸残基）を少なくとも含むポリペプチド、および
（２）天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域を少なくとも含み、ただし当該細胞外領域を構成するアミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド、
があげられる。
前記（２）において「１もしくは数個」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から５個のいずれかを意味する。
また前記（２）のさらに好ましい態様として、
特開２０１５－０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１６－１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１７－１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
ＷＯ２０１９／０８３０４８号で開示のＦｃ結合性タンパク質、
があげられる。
また前記（２）のさらに好ましい態様として、
特開２０１５－０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１６－１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１７－１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
ＷＯ２０１９／０８３０４８号で開示のＦｃ結合性タンパク質、
があげられる。
本発明において、インタクト抗体と特異的に結合可能な物質を固定化させる担体は、当該抗体の吸着／溶出に用いる溶液や溶剤に対して不溶性であり、かつ前記物質を共有結合で固定化するための官能基（例えばヒドロキシ基）を有した物質であればよく、ジルコニア、ゼオライト、シリカ、皮膜シリカ等の無機系物質に由来した担体であってもよいし、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然有機高分子物質に由来した担体であってもよいし、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート、ビニルポリマー等の合成有機高分子物質に由来した担体であってもよい。
なお担体表面に有する官能基がヒドロキシ基の場合、活性化剤を用いて、当該ヒドロキシ基から、インタクト抗体と特異的に結合可能な物質と共有結合可能な活性化基を形成させるとよい。当該活性化剤の具体例として、エピクロロヒドリン（活性化基としてエポキシ基を形成）、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（活性化基としてエポキシ基を形成）、トレシルクロリド（活性化基としてトレシル基を形成）、ビニルブロミド（活性化基としてビニル基を形成）があげられる。
またヒドロキシ基をアミノ基やカルボキシル基などに変換した後、活性化剤を作用させて活性化してもよい。当該活性化剤の具体例として３－マレイミドプロピオン酸Ｎ－スクシンイミジル（活性化基としてマレイミド基を形成）、１，１’－カルボニルジイミダゾール（活性化基としてカルボニルイミダゾール基を形成）、ハロゲン化酢酸（活性化基としてハロゲン化アセチル基を形成）があげられる。
本発明では、アフィニティクロマトグラフィ用吸着剤に吸着した試料中に含まれるインタクト抗体を、揮発性成分のみを含む緩衝液で溶出させる。本操作により、溶出した前記抗体を含む画分には溶媒として揮発性のみが含まれるため、当該画分をそのまま質量分析に供せる。すなわち、通常であれば、得られた画分からの抗体の回収、回収した抗体からの糖鎖の切り出し、切り出した糖鎖の精製、質量分析のための蛍光物質標識及び精製が、質量分析の前に必要となるところ、これらの工程をふまなくとも前記画分を質量分析に供することができる。
揮発性成分の例として、ギ酸、酢酸、炭酸、重炭酸、ピリジン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、アンモニア、Ｎ－メチルモルホリン、エタノールアミン、およびそれらの塩があげられる。中でも酢酸塩である酢酸アンモニウムが、本発明の揮発性成分として好ましい。溶出緩衝液のｐＨは、インタクト抗体と、当該抗体と特異的に結合可能な物質との親和性などに基づき、適宜決定すればよいが、揮発性成分として酢酸アンモニウムを用いる場合はｐＨ２．５からｐＨ６．５までの範囲とするとよい。溶出緩衝液に含まれる揮発性成分の濃度は、当該成分のｐＫａなどに基づき、１ｍＭから１０００ｍＭの範囲、好ましくは１０ｍＭから５００ｍＭの範囲、さらに好ましくは２０ｍＭから２００ｍＭの範囲で適宜決定すればよい。
また、本発明では、アフィニティクロマトグラフィ用吸着剤に吸着した試料中に含まれるインタクト抗体を揮発性成分のみを含む緩衝液で溶出させた後、質量分析装置へ供する際に、補助溶媒として有機溶媒を添加しても良い。有機溶媒として、通常質量分析に使用される溶媒であれば特に限定は無く、例えば、メタノール、エタノール、２－プロパノール、およびアセトニトリルがあげられるが、好ましくは、メタノールおよびアセトニトリル、より好ましくはアセトニトリルがあげられる。有機溶剤の添加割合は、質量分析に供与する際に影響がない範囲で適宜変更可能だが、例えば１～９９ｖ／ｖ％、好ましくは２０～８０ｖ／ｖ％、より好ましくは４０～６０ｖ／ｖ％の割合で溶出液に有機溶媒を添加すれば良い。
本発明は、試料中に含まれるインタクト抗体をクロマトグラフィ用吸着剤に吸着させ、溶出緩衝液を用いて当該吸着したインタクト抗体を溶出後、溶出したインタクト抗体を含む画分を質量分析に供することで、インタクト抗体を分析する方法において、クロマトグラフィ用吸着剤としてアフィニティクロマトグラフィ用吸着剤を用い、溶出緩衝液として揮発性塩のみ含む緩衝液を用いることを特徴としている。
本発明により、溶出したインタクト抗体を含む画分を直接質量分析装置へ導入できるため、例えば、前記抗体に結合した糖鎖構造を直接、簡便、迅速かつ高分離能で分析できる。したがって、抗体医薬品の製造工程管理や品質管理がより簡便、迅速かつ精度良く実施できる。
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１ Ｆｃ結合性タンパク質固定化担体の調製
２ｍＬの分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製：液体クロマトグラフィ用充填剤）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、特開２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を４ｍｇ反応させることにより、ＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲルを得た。なおＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓ（配列番号２）のうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆ（配列番号１の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基であり、ただしＶａｌ２７Ｇｌｕ［この表記は配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換されていることを意味する、以下同じ］、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｖａｌ１７６Ｐｈｅのアミノ酸置換が生じたポリペプチド、特開２０１８－１９７２２４号公報）のアミノ酸配列であり、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。
２ｍＬの分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製：液体クロマトグラフィ用充填剤）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、特開２０１８－１９７２２４号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓ（配列番号２）を４ｍｇ反応させることにより、ＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲルを得た。なおＦｃＲ９＿Ｆ＿Ｃｙｓ（配列番号２）のうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９＿Ｆ（配列番号１の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基であり、ただしＶａｌ２７Ｇｌｕ［この表記は配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換されていることを意味する、以下同じ］、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１７１Ｓｅｒ、Ｖａｌ１７６Ｐｈｅのアミノ酸置換が生じたポリペプチド、特開２０１８－１９７２２４号公報）のアミノ酸配列であり、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。
実施例２ Ｆｃ結合性タンパク質固定化担体充填カラムを用いた抗体の分離（その１）
（１）実施例１で作製したＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲル１．２ｍＬを、φ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填し、ＦｃＲ９＿Ｆカラムを作製した。
（１）実施例１で作製したＦｃＲ９＿Ｆ固定化ゲル１．２ｍＬを、φ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填し、ＦｃＲ９＿Ｆカラムを作製した。
（２）（１）で作製したＦｃＲ９＿Ｆカラムを高速液体クロマトグラフィ装置（東ソー製）に接続し、５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）（以下、平衡化緩衝液とも表記）で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎにて平衡化した。
（３）平衡化緩衝液で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈したインタクト抗体（リツキサン、全薬工業製、マウスとヒトのキメラ抗体）を流速１．０ｍＬ／ｍｉｎにて２５μＬ添加した。
（４）流速１．０ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で２分洗浄後、５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエント（１８分で５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．０）が１００％となるグラジエント）で吸着したインタクト抗体を溶出した。
得られたインタクト抗体の分離パターンを図１に示した。
実施例３ Ｆｃ結合性タンパク質固定化担体充填カラムを用いた抗体の分離（その２）
実施例２（２）および（３）で使用した平衡化緩衝液を５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）とした以外は、実施例２と同様にインタクト抗体を分離した。
実施例２（２）および（３）で使用した平衡化緩衝液を５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）とした以外は、実施例２と同様にインタクト抗体を分離した。
得られたインタクト抗体の分離パターンを図２に示した。
実施例４ Ｆｃ結合性タンパク質固定化担体充填カラムを用いた抗体の分離（その３） 実施例２（２）および（３）で使用した平衡化緩衝液を５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）とし、実施例２（４）の溶出を５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）によるｐＨグラジエント（１８分で５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）が１００％となるグラジエント）で行なった以外は、実施例２と同様にインタクト抗体を分離した。
得られたインタクト抗体の分離パターンを図３に示した。
実施例２から実施例４の結果から、溶出緩衝液として揮発性成分（酢酸アンモニウム）のみを含む緩衝液を用いても（実施例２および実施例３）、従来の不揮発性成分（クエン酸）を含む緩衝液（実施例４）と同等の抗体分離ができることを確認できた。なお実施例２および実施例３で得られる、溶出したインタクト抗体を含む画分には、溶媒として揮発性成分のみを含むため、当該画分は直接質量分析に供せる。
実施例５ インタクト抗体の質量分析
実施例２で使用した揮発性緩衝液を用いてインタクト抗体の質量分析装置を用いた解析を以下のとおり実施した。
測定条件
装置：Ｗａｔｅｒｓ社製Ｘｅｖｏ Ｇ２ ＸＳ Ｑ ＴＯＦ
導入速度：０．１ｍＬ／ｍｉｎ
イオン化：ＥＳＩ＋
測定モード：Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＭＳ Ｍｏｄｅ
キャピラリー電圧：４ｋＶ
コーン電圧：１６５Ｖ
ソースオフセット：５０Ｖ
ソース温度：１５０℃
脱溶媒温度：６００℃
コーンガス：５０Ｌ／Ｈｒ
脱溶媒ガス：１２００Ｌ／Ｈｒ
データ取り込み：ｍ／ｚ ５００ ４０００、０．５ｓｅｃ
液体クロマトグラフィ装置を用いて測定したインタクト抗体のマススペクトル解析結果を図４に示した。また、図４のスペクトルから、Ｗａｔｅｒｓ社製質量分析装置付属の解析ソフトＵＮＩＦＩを用いてデコンボリューション操作を行い、図５のスペクトルを得た。
実施例２で使用した揮発性緩衝液を用いてインタクト抗体の質量分析装置を用いた解析を以下のとおり実施した。
測定条件
装置：Ｗａｔｅｒｓ社製Ｘｅｖｏ Ｇ２ ＸＳ Ｑ ＴＯＦ
導入速度：０．１ｍＬ／ｍｉｎ
イオン化：ＥＳＩ＋
測定モード：Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＭＳ Ｍｏｄｅ
キャピラリー電圧：４ｋＶ
コーン電圧：１６５Ｖ
ソースオフセット：５０Ｖ
ソース温度：１５０℃
脱溶媒温度：６００℃
コーンガス：５０Ｌ／Ｈｒ
脱溶媒ガス：１２００Ｌ／Ｈｒ
データ取り込み：ｍ／ｚ ５００ ４０００、０．５ｓｅｃ
液体クロマトグラフィ装置を用いて測定したインタクト抗体のマススペクトル解析結果を図４に示した。また、図４のスペクトルから、Ｗａｔｅｒｓ社製質量分析装置付属の解析ソフトＵＮＩＦＩを用いてデコンボリューション操作を行い、図５のスペクトルを得た。
実施例６
実施例５において、質量分析装置による解析時の感度向上の為、質量分析装置に導入する際の補助溶媒であるメイクアップ溶媒としてアセトニトリルを５０ｖ／ｖ％の比となるよう揮発性緩衝液に添加したこと以外は実施例５と同様に実施し、得られたマススペクトル解析結果を図６に示した。また、同様にデコンボリューション操作により図７のスペクトルを得た。図５および図７の各ピークの分子量から同定することで、インタクト抗体に結合している２つのＮ－結合型糖鎖構造の組成を帰属させることが可能となり、インタクト抗体に含まれる糖鎖構造を直接、簡便に分析できることがわかる。
実施例５において、質量分析装置による解析時の感度向上の為、質量分析装置に導入する際の補助溶媒であるメイクアップ溶媒としてアセトニトリルを５０ｖ／ｖ％の比となるよう揮発性緩衝液に添加したこと以外は実施例５と同様に実施し、得られたマススペクトル解析結果を図６に示した。また、同様にデコンボリューション操作により図７のスペクトルを得た。図５および図７の各ピークの分子量から同定することで、インタクト抗体に結合している２つのＮ－結合型糖鎖構造の組成を帰属させることが可能となり、インタクト抗体に含まれる糖鎖構造を直接、簡便に分析できることがわかる。
なお、図５および図７における糖鎖構造の種類（Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ）は図８に記載の糖鎖構造に対応する。
実施例７
実施例６で得られたインタクト抗体に結合しているＮ－結合型糖鎖構造の違いによるマススペクトルから経時的に抽出し、クロマトグラムを描画したものを図９に示した。この図から、Ｆｃ結合性タンパク質固定化担体充填カラムを用いた抗体分離において、初めに末端にガラクトースを含まないＧ０Ｆ／Ｇ０Ｆの組合せ、次いでガラクトースが一方の末端に結合したＧ０Ｆ／Ｇ１Ｆの組合せ、さらに、ガラクトースがともに末端に結合したＧ１Ｆ／Ｇ１Ｆの組合せ、次いでＧ１Ｆ／Ｇ２Ｆの組合せ、最後にＧ２Ｆ／Ｇ２Ｆの組合せの順で溶出されることがわかる。同様に、フコースを含まないＧ０／Ｇ０Ｆの組合せおよびＧ０／Ｇ０の組合せを含む抗体はこの順番に溶出されることがわかる。これらにより、糖鎖構造の組合せの違いによる分離パターンの違いを明らかとすることが可能となる。
実施例６で得られたインタクト抗体に結合しているＮ－結合型糖鎖構造の違いによるマススペクトルから経時的に抽出し、クロマトグラムを描画したものを図９に示した。この図から、Ｆｃ結合性タンパク質固定化担体充填カラムを用いた抗体分離において、初めに末端にガラクトースを含まないＧ０Ｆ／Ｇ０Ｆの組合せ、次いでガラクトースが一方の末端に結合したＧ０Ｆ／Ｇ１Ｆの組合せ、さらに、ガラクトースがともに末端に結合したＧ１Ｆ／Ｇ１Ｆの組合せ、次いでＧ１Ｆ／Ｇ２Ｆの組合せ、最後にＧ２Ｆ／Ｇ２Ｆの組合せの順で溶出されることがわかる。同様に、フコースを含まないＧ０／Ｇ０Ｆの組合せおよびＧ０／Ｇ０の組合せを含む抗体はこの順番に溶出されることがわかる。これらにより、糖鎖構造の組合せの違いによる分離パターンの違いを明らかとすることが可能となる。
本発明により、従来困難であった抗体医薬品や抗体類縁医薬品の糖鎖構造の違いによる分離や糖鎖構造の解析をより正確、かつ迅速に評価できる。本発明により抗体医薬品を製造する際の課題とされていた糖鎖構造に係わる品質の向上、すなわちロット間における糖鎖構造の割合や種類のバラつきが低減できる。
Claims (9)
- 吸着剤に吸着されたインタクト抗体を溶出緩衝液により溶出させる方法であって、
前記溶出緩衝液が揮発性成分のみを含有する、方法。 - 請求項１に記載の方法により溶出させたインタクト抗体を含む溶出緩衝液を、質量分析に供する工程を含む、インタクト抗体分析方法。
- 吸着剤がＦｃ結合性タンパク質を固定化した担体である、請求項１または２に記載の方法。
- インタクト抗体がヒトＦｃ領域を含むインタクトＩｇＧであり、Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩａである、請求項３に記載の方法。
- ヒトＦｃγＲＩＩＩａが、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチド、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基のうち、１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつＩｇＧ結合活性を有するポリペプチドである、
請求項４に記載の方法。 - 溶出緩衝液がｐＨ２．５からｐＨ６．５の酢酸アンモニウム水溶液である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
- 請求項１に記載の方法により溶出させたインタクト抗体を含む緩衝液を質量分析装置に直接供する工程を含むインタクト抗体分析方法。
- 請求項７に記載の方法により溶出させたインタクト抗体を含む緩衝液に、質量分析装置に直接供するためのメイクアップ溶媒として４０～６０％のアセトニトリルを添加し、質量分析に供する工程を含むインタクト抗体分析方法。
- 請求項８に記載のインタクト抗体分析方法において、経時的に各糖鎖構造を含む抗体のスペクトルのクロマトグラムを収集し、抗体に結合している糖鎖構造の違いによる抗体分離の違いを明らかにする抗体分析方法。
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