KR20220101168A - 이온 교환 크로마토그래피 동안 항체의 수율을 증가시키는 방법 - Google Patents

이온 교환 크로마토그래피 동안 항체의 수율을 증가시키는 방법 Download PDF

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다니엘라 다우베르트
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카린 펠데러
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모르포시스 아게
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Abstract

본 발명은 전도도를 조정하기 위해 NaCl을 사용하지 않고 Tris를 사용하여 샘플을 사전컨디셔닝함으로써, 유체-통과 모드에서 샘플로부터 이온 교환 크로마토그래피에 의한 항체 정제 동안 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

이온 교환 크로마토그래피 동안 항체의 수율을 증가시키는 방법
본 개시내용은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 샘플로부터 항체를 정제하는 동안 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 IEX 단계 전에 전도도를 조정하기 위해 NaCl을 사용하지 않고 Tris로 사전컨디셔닝된 항체 샘플의 유체-통과(flow-through) 모드에서 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한다. Tris를 첨가하고 전도도를 조정하면, 단량체 함량이 높은 통과액(flow-through) 중 항체의 수율이 개선된다. 나아가, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법으로 정제된 항체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
단일클론 항체(mAb)는 치료 및 진단 응용뿐만 아니라 기초 연구 내에서 광범위한 면역화학 기술에 사용된다. 약학 응용에 사용하기 위해, 치료 항체는 고품질 표준을 충족해야 한다. 따라서 이러한 요구사항을 충족시키기 위해 모든 제조 및 정제 공정 개발의 목표는 높은 수율 및 순도로 표적 생성물을 생성하는 강력하고 확장가능하며 신뢰성 있는 공정을 개발하는 것이다.
정제하는 동안, 표적 항체는 원하지 않는 오염물질, 예컨대 숙주 세포 단백질(HCP), 핵산, 바이러스, 배지 성분(예를 들어, 인슐린), 세포 배양 첨가제(예를 들어, PEG 에테르, 소포제)뿐만 아니라 잠재적으로 존재하는 임의의 응집 및 단편화된 생성물이 없도록 하는 것이다. 항체는 통상적으로 하이브리도마 또는 형질감염된 숙주 세포(예를 들어, CHO, HEK)에 의해 생성된다. 따라서, 정제 공정을 시작할 때 세포 배양물로부터 세포 물질을 제거해야 한다. 후속하여, 항체를 함유하는 샘플은 일반적으로 결합-용리 모드에서 친화성 크로마토그래피 단계(예를 들어 IgG 항체에 대해 단백질 A 크로마토그래피에 의한 "포획")를 통해 처리된 후, 바이러스 불활성화, 중화 및 심층 여과가 뒤따른다. 치료 등급 생성물의 품질 표준을 충족하기 위해, 추가의 소위 "폴리싱(polishing)" 단계가 정제 공정에 포함된다. 일반적으로, "포획" 단계 후에 2개 이상의 크로마토그래피 단계를 수행하여 잔류 응집체 및 불순물을 제거한다. 일반적으로 이러한 단계 동안 제거되는 불순물은 HCP, 핵산, 배지 성분, 침출된 단백질 A, 내독소 등과 같은 공정 유래 오염물질이다. 응집체 및 불순물의 제거는 종종 초기 항체 친화성 크로마토그래피 후 이온 교환 크로마토그래피(IEX)를 사용하는 것을 통해 달성된다. 특히, 다중모드 크로마토그래피(MMC) 배지가 mAb의 단백질 A 후 정제에 매우 적합하다(Pinto IF et al, Pharm. Bioprocess. (2015) 3(3), 263-279). 작동 모드 또한 성공적인 다중모드 크로마토그래피에 중요한 역할을 한다. 유체-통과(FT) 모드에서, 예를 들어 샘플 및 완충액의 pH는 항체가 컬럼에 결합하지 않고 오히려 컬럼을 통해 흐르게 하여 대부분의 불순물이 결합된 상태로 남도록 항체 또는 크로마토그래피 배지의 전하를 변경시키도록 선택된다. 통과액 분획에서 발견되는 항체의 순도는 단백질 부하, pH 및 전도도와 같은 조건을 최적화함으로써 증가될 수 있다.
예를 들어, WO2010071208은 20 mM 시트르산, pH 6.2 및 아르기닌, 히스티딘, 프롤린, 글루탐산 및 시트룰린으로부터 선택되는 특정 아미노산을 함유하는 로딩 용액을 사용하는 FT 모드에서 MMC에 의한 항체 정제 방법을 개시한다. US10,023,608은 MMC 수지를 로딩하기 전에 샘플의 적절한 전도도(약 15 내지 19 mS/cm) 및 pH(약 6.9 내지 7.3)를 각각 달성하기 위해 완충액으로서 NaCl 및 Tris 염기로 사전컨디셔닝된 샘플을 사용하는 유체-통과 모드에서 MMC 단계를 사용한 후 HIC 단계를 사용하는 아달리무맙의 정제를 기재한다. 여기서 전도도는 NaCl을 포함하는 완충액으로 조정된다. 다양한 다른 다단계 크로마토그래피 정제 방법이 과다하게 존재한다. 예를 들어, WO2005044856은 선택적으로 음이온 교환 크로마토그래피와 조합하여 하이드록시아파타이트 수지를 사용하여 항체 샘플로부터 고분자량 응집체를 제거하는 것에 관한 것이다. 유체-통과 모드 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 위한 제형에서, 항체 샘플은 0.2 내지 2.5 M NaCl을 함유하는 부하 완충액으로 조정된다. WO2010048183은 산 pH 및 HIC 크로마토그래피에서 연속 이온 교환에 의해 항체 샘플로부터 HCP를 제거하는 것에 관한 것이다. FT 모드에서 IEX 단계 전에, 샘플은 20 mM 인산나트륨 및 150 mM NaCl 또는 25 mM 트롤아민 및 40 mM NaCl을 갖는 완충액으로 평형화된다. WO2011090719는 다중 크로마토그래피 단계를 포함하는 항체 정제 방법을 기재하며, 여기서 단백질 A 크로마토그래피로부터의 낮은 pH 용리액이 pH를 조정할 필요 없이 추가로 정제된다. WO2012059308은 유체-통과 모드에서 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 크로마토그래피를 순서대로 포함하는 중간 폴리싱 단계를 개시한다. AEX 및 CEX 컬럼에 각각 들어가기 전에 pH 및 전도도를 조정하기 위해, 샘플을 최종 전도도 5 mS까지 탈염수로 희석하거나 50 mM NaH2PO4로 조정하였다.
하나 초과의 크로마토그래피 단계가 있는 방법의 일반적인 결점은, 각각의 미립자 단계 후에 표적 단백질이 손실되어 종종 항체 수율이 상당히 감소한다는 것이다. 더 많은 단계는 또한 더 긴 정제 시간을 의미하며, 이는 단백질 안정성 및 활성에 해로울 수 있다. 따라서, 개선된 수율과 동시에 만족스러운 순도를 생성하는 방법을 개발할 필요성이 계속 존재한다. 이러한 방법은 치료 및 진단 화합물의 정제 공정에 큰 가치가 있다.
유체-통과 모드에서, 항체가 결합하지 않고 대다수의 불순물이 컬럼에 결합된 상태로 수지를 통해 흐르도록, 표적 항체의 전하를 맞춤화하기 위해 적절한 pH 및 전도도 조건을 정의해야 한다. 유체-통과 모드의 이익은 더 높은 부하를 사용할 수 있고, 세척 및 용리 단계가 더 적다는 것이다. 통과액 중 항체의 순도는 부하, pH, 염 및 전도도와 같은 조건을 최적화함으로써 증가시킬 수 있지만, 오염물질 수준이 상이한 세포주들 사이에서 상이하기 때문에 최적의 조건을 예측하는 것은 어렵다. 나아가, 이전 정제 단계의 차이가 존재하여, 다양한 조성의 샘플을 로딩할 수 있다. 일반적으로, 선행 기술(GE Healthcare Instructions 28-9064-05 AA)은 유체-통과 모드에서 다중모드 Capto adhere를 사용하여 최상의 수율을 얻기 위해서는, 샘플 부하가 높고, pH가 낮고, 전도도가 높아야 한다고 교시한다. 최적의 응집체 제거를 위해 pH가 높아야 하며 부하 및 전도도는 낮아야 한다. 응집체 제거는 종종 단백질 A 및 HCP 제거보다 전도도에 의해 영향을 덜 받는다. 최상의 단백질 A 및 HCP-제거를 위해, pH는 높고 전도도는 낮아야 한다. 따라서 로딩 조건은 수율을 선호하는 조건과 오염물질 제거를 선호하는 조건 사이에서 절충될 것이다. 최적의 로딩 조건은 부하, pH 및 전도도 사이에서 균형을 이룰 것이다. NaCl은 전도도 조정에 유용한 염이며, 저렴한 가격 때문에 널리 사용된다. NaCl 농도 및 이에 따른 전도도의 변화는 이온 교환기에 결합되는 단백질의 하전된 기의 결합 강도에 영향을 미친다. 유체-통과 모드에서, 세척 단계는 약하게 결합된 단백질이 수집되는 것을 가능하게 하여 표적 항체의 수율을 높이는 데 사용될 수 있다.
추가의 정제 공정은 예를 들어, CEX를 사용하여 샘플로부터 단백질 응집체를 제거하는 방법에 관한 EP2639239에 개시된다. 여기서 공급 샘플은 Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 전도도 3 mS/cm로 투석된다. WO2014196780은 친화성 크로마토그래피를 사용하지 않고, CEX, 여과 및 AEX를 순차적으로 사용하여 불순물을 제거하는 방법에 관한 것이다. AEX 전에, 샘플은 Tris-HCl 및 Bis-Tris로 처리되고, 1.4 mS/cm의 전도도로 조정된다. WO2014207763은 친화성 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 아달리무맙의 정제를 개시한다. 선행 기술의 단백질 정제 방법 중 어느 것도 전도도를 조정하기 위한 화합물로서 Tris 염기를 기재하지 않는다.
본 출원의 기초가 되는 기술적 과제는 FT 모드에서 다중모드 이온 교환 크로마토그래피 동안 항체 수율을 증가시키는 동시에 항체-함유 샘플의 응집체 및 기타 불순물의 효율적인 감소를 유지하는 방법을 제공하는 데 있을 수 있다. 본 발명은, 유체-통과 모드에서 크로마토그래피 컬럼에 로딩하기 전에 Tris만으로(즉, NaCl 또는 임의의 기타 염을 사용하지 않고) 샘플을 사전컨디셔닝함으로써, 정제될 항체 샘플의 전도도를 증가시킴을 특징으로 하는 방법을 제공함으로써, 이러한 요구를 충족시킨다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 유체-통과 모드에서 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 로딩하기 전에, 초기 단백질 A 포획 크로마토그래피 후 항체 샘플 용리액에 중성 pH에서 Tris를 첨가하면, 샘플 용리액을 Tris로 사전컨디셔닝하지 않고(즉, 전도도 증가 없음), 또는 NaCl로 전도도를 조정함으로써 단계를 수행하는 것에 비하여, 놀랍게도 더 큰 항체 수율을 유도한다는 것을 알아내었다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 항체 및 응집체 및/또는 불순물을 포함하는 조성물로부터 항체를 정제하는 방법을 제공하며, 여기서 이 방법은 a) 조성물에 포획 크로마토그래피를 적용하여 포획 크로마토그래피 용리액을 생성하는 단계; b) 2 M Tris, pH 7.1을 5 내지 20%(v/v) 범위로 포획 용리액에 첨가하는 단계; c) 단계 b)로부터의 사전컨디셔닝된 용리액에 유체-통과 모드에서 혼합 모드(다중모드) 음이온 교환 크로마토그래피를 적용하여 혼합 모드 용리액을 생성하는 단계; d) 혼합 모드 용리액에 결합-용리 모드에서 제2 혼합 모드 크로마토그래피를 적용하여 제2의 혼합 모드 용리액을 생성하는 단계; 및 e) 항체를 포함하는 분획을 수집하는 단계를 포함하며, 이 방법은 항체의 수율을 증가시킨다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 항체 및 응집체 및/또는 불순물을 포함하는 조성물로부터 항체를 정제하는 방법을 제공하며, 여기서 이 방법은 a) 조성물에 포획 크로마토그래피를 적용하여 포획 크로마토그래피 용리액을 생성하는 단계; b) 2 M Tris, pH 7.1을 5 내지 20%(v/v) 범위로 포획 용리액에 첨가하는 단계; c) 단계 b)로부터의 사전컨디셔닝된 용리액에 유체-통과 모드에서 혼합 모드(다중모드) 음이온 교환 크로마토그래피를 적용하여 혼합 모드 용리액을 생성하는 단계; d) 혼합 모드 용리액에 결합-용리 모드에서 제2 혼합 모드 크로마토그래피를 적용하여 제2의 혼합 모드 용리액을 생성하는 단계; 및 e) 항체를 포함하는 분획을 수집하는 단계를 포함하며, 이 방법은 조성물로부터 응집체 및/또는 불순물의 양을 감소시킨다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 항체 및 응집체 및/또는 불순물을 포함하는 조성물로부터 항체를 정제하는 방법을 제공하며, 여기서 이 방법은 a) 조성물에 포획 크로마토그래피를 적용하여 포획 크로마토그래피 용리액을 생성하는 단계; b) 2 M Tris, pH 7.1을 5 내지 20%(v/v) 범위로 포획 용리액에 첨가하는 단계; c) 단계 b)로부터의 사전컨디셔닝된 용리액에 유체-통과 모드에서 혼합 모드(다중모드) 음이온 교환 크로마토그래피를 적용하여 혼합 모드 용리액을 생성하는 단계; d) 혼합 모드 용리액에 결합-용리 모드에서 제2 혼합 모드 크로마토그래피를 적용하여 제2의 혼합 모드 용리액을 생성하는 단계; 및 e) 항체를 포함하는 분획을 수집하는 단계를 포함하며, 이 방법은 항체의 수율을 증가시키고, 조성물로부터 응집체 및/또는 불순물의 양을 감소시킨다.
본 발명의 특정 구현예는 숙주 세포 단백질(HCP), 침출된 단백질 A, 응집체 및 기타 불순물이 실질적으로 없는 항체를 만들기 위해 샘플로부터 항-IL-17C 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 정제하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 세포 및 세포 파편을 제거하기 위한 초기 회수 단계를 포함하는 IL-17C 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 회수 단계는 하나 이상의 원심분리 또는 심층 여과 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 항체를 포함하는 초기 회수 샘플은 친화성 크로마토그래피 단계를 거친다. 예에는 단백질 A, 단백질 G, 다른 Fc 결합 단백질을 포함하는 친화성 지지체, 및 관심 항체에 대해 발생되는 항원을 포함하는 친화성 지지체가 포함된다. 특히, 단백질 A는 IgG 항체의 친화성 정제에 유용하다. 일 양태에서, 단백질 A 컬럼은 샘플 로딩 전에 적합한 완충액으로 평형화된다. 적합한 완충액의 예는 PBS, pH 7.0 내지 7.3이다. 평형화 후에, 샘플이 컬럼 상에 로딩될 수 있다. 컬럼을 로딩한 후, 예를 들어 평형화 완충액을 사용하는 1회 또는 다회의 세척 단계가 적용될 수 있다. 컬럼을 용리하기 전에 상이한 완충액을 사용하는 다른 세척도 사용할 수 있다. 친화성 컬럼으로부터 항체를 용리하는 것은 적절한 용리 완충액을 사용하여 수행된다. 적합한 용리 완충액의 예는 50 mM 아세테이트 완충액, pH 3.6이다. 용리액은 당업자에게 잘 알려진 기술들을 사용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들어, OD280에서 흡광도가 측정될 수 있다. 이어서 관심의 용리된 분획(들)이, 일반적으로 폴리싱 크로마토그래피를 포함하는 추가의 단계를 위해 준비될 수 있다.
일 구현예에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 후에 낮은 pH 조정 단계가 수행된다. 이러한 구현예에서, 항체를 포함하는 단백질 A 용리액은 샘플을 오염시킬 수 있는 pH-민감성 바이러스의 감소 및/또는 불활성화를 위해 1 M 아세트산을 사용하여 pH가 약 2.5 내지 약 3.5으로 조정된다. 특정 구현예에서, 친화성 용리액은 1 M 아세트산을 사용하여 pH가 3으로 조정된다. 정의된 인큐베이션 기간 후에, 이어서 용액은 pH 약 6.5 내지 약 7.5로 중화된다. 일 구현예에서, pH 중화는 1 M Tris, pH 9.5 완충액을 사용하여 달성될 수 있다. 일 구현예에서, 심층 여과는 바이러스 불활성화(즉, 낮은 pH 조정) 및 중화 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 후에 이온 교환 크로마토그래피가 수행된다. 다른 구현예에서, 이온 교환은 낮은 pH 조정 단계 후에 수행된다. 바람직한 구현예에서, 이온 교환은 바이러스 불활성화 단계 후 심층 여과 후에 수행된다. 이온 교환 단계는 양이온 또는 양이온 교환일 수 있다. 이 단계는 단일 이온 교환 절차일 수 있거나, 또는 양이온 교환 후 음이온 교환 또는 그 역과 같은 순차적인 조합의 다중 이온 교환 단계를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 다중모드 기능을 갖는 강력한 음이온 교환 크로마토그래피 수지로서 Capto adhere ImpRes(GE Healthcare)가 폴리싱 단계로서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 이 단계는 정제될 항체가 이온 교환 수지에 결합하지 않지만, DNA, RNA, 숙주 세포 단백질, 응집체 및 바이러스와 같은 주요 오염물질은 결합하여 효율적으로 분리되는 조건 하에 유체-통과 모드에서 수행된다.
일 양태에서, 항체 샘플(예를 들어, 친화성 크로마토그래피 용리액, 심층 여과 후의 여과액)은 샘플의 pH 및 이온 강도 또는 전도도를 조정하여 이온 교환 크로마토그래피를 위해 제조된다.
바람직한 구현예에서, 항체를 정제하는 방법은
a. 항체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b. 샘플의 전도도를 조정하는 단계;
c. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
d. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 b)에서 샘플의 전도도는 Tris, 바람직하게는 2 M Tris, pH 7.1을 사용하여 조정된다.
또 다른 구현예에서, 항체의 수율을 증가시키는 방법은
a. 항체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b. 샘플의 전도도를 조정하는 단계;
c. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
d. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 b)에서 샘플의 전도도는 Tris, 바람직하게는 2 M Tris, pH 7.1을 사용하여 조정된다.
일 양태에서, 항체를 정제하는 방법은
a. 항체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b. 샘플의 전도도를 조정하는 단계;
c. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
d. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 b)에서 샘플의 전도도는 Tris를 사용하여 약 10 내지 약 50 mS/cm의 전도도로 조정된다. 바람직하게는, 전도도는 약 10 내지 약 30 mS/cm로 조정된다. 특정 구현예에서, 단계 b)에서 Tris로 사전컨디셔닝한 후 샘플의 전도도는 적어도 10 mS/cm, 적어도 12 mS/cm, 적어도 14 mS/cm, 적어도 15 mS/cm이다. 특정 구현예에서, 단계 b)에서 Tris로 사전컨디셔닝한 후 항체 샘플의 전도도는, 샘플을 IEX 수지 상에 로딩하기 전에 약 10 mS/cm 내지 약 30 mS/cm의 범위, 약 12 mS/cm 내지 약 28 mS/cm의 범위, 약 14 mS/cm 내지 약 26 mS/cm의 범위, 약 15 mS/cm 내지 약 25 mS/cm의 범위이다. 중요하게는, 전도도의 조정은 Tris만을 사용하여 수행된다.
일 양태에서, 항체의 수율을 증가시키는 방법은
a. 항체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b. 샘플의 전도도를 조정하는 단계;
c. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
d. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 b)에서 샘플의 전도도는 Tris를 사용하여 약 10 내지 약 50 mS/cm의 전도도로 조정된다. 바람직하게는, 전도도는 약 10 내지 약 30 mS/cm로 조정된다. 특정 구현예에서, 단계 b)에서 Tris로 사전컨디셔닝한 후 샘플의 전도도는 적어도 10 mS/cm, 적어도 12 mS/cm, 적어도 14 mS/cm, 적어도 15 mS/cm이다. 특정 구현예에서, 단계 b)에서 Tris로 사전컨디셔닝한 후 항체 샘플의 전도도는, 샘플을 IEX 수지 상에 로딩하기 전에 약 10 mS/cm 내지 약 30 mS/cm의 범위, 약 12 mS/cm 내지 약 28 mS/cm의 범위, 약 14 mS/cm 내지 약 26 mS/cm의 범위, 약 15 mS/cm 내지 약 25 mS/cm의 범위이다. 중요하게는, 전도도의 조정은 Tris만을 사용하여 수행된다.
일 구현예에서, 항체를 포함하는 제공된 샘플은 단백질 A 크로마토그래피, 바이러스 불활성화, 중화 및 심층 여과 후, 이어서 샘플의 전도도를 조정한 다음, 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 제1 폴리싱 단계, 이어서 결합-용리 모드에서 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 제2 폴리싱 단계를 통해 조정된 샘플을 처리하여 수득된다. 결합 및 용리 모드에서 수행된 제2 혼합 모드 크로마토그래피는 구배 용리를 적용할 수 있다.
특정 구현예에서, 이온 교환 샘플은 제1 이온 교환 단계 전에, 2개의 이온 교환 단계 사이에, 또는 이들 둘 모두에서, 중간 여과 단계를 거친다. 특정 양태에서, 이 여과 단계는 포획 한외여과/투석여과("UF/DF")를 포함한다. 특히, 이러한 여과는 항체 및 이의 항원결합 부분의 농도 및 완충액 교환을 용이하게 한다.
일 구현예에서, 정제되는 항체는 단일클론 항체이다.
도 1에서 항체 정제는 1-, 2-, 또는 3-단계 절차를 사용할 수 있다. 숫자는 단계를 지칭한다. 통상적인 수율 및 순도 예상치가 표시된다. AC = 친화성 크로마토그래피; SEC = 크기 배제 크로마토그래피; IEX = 이온 교환 크로마토그래피; CIEX = 양이온 교환 크로마토그래피; AIEX = 음이온 교환 크로마토그래피.
도 2는 Tris를 사용하거나 사용하지 않고 사전컨디셔닝되고, 다중모드 AIEX에 의해 정제된 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄를 갖는 항체를 포함하는 샘플의 대표적인 유체-통과 용리 크로마토그램이다. 사전컨디셔닝: (1) Tris 첨가 없음, 전도도: 8.2[mS/cm], (2) 5%(v/v) Tris 첨가, 전도도 13.6 mS/cm, (3) 10%(v/v) Tris 첨가, 전도도 17.2 mS/cm, (4) 20%(v/v) Tris 첨가, 전도도 25.5 mS/cm. FT: 유체-통과. CIP: 제자리 세정.
크로마토그래피에 의한 단백질 정제
치료용 항체 제조는 통상적으로 i) 항체 단백질의 생성을 포함하는 업스트림 프로세싱(USP); ii) 정제에 의한 순수한 형태의 항체 산출을 포함하는 다운스트림 프로세싱(DSP); 및 iii) 생성물 온전성 및 안전성을 확보하기 위한 최종 프로세싱으로 나뉜다. 통상적으로, 생성 단계 이후의 다운스트림 정제 공정의 첫 번째 단계는 침전, 응집, (심층) 여과 및/또는 원심분리 단계 중 하나 이상을 사용하여 원하는 항체를 세포, 세포 파편, 및 기타 오염물질로부터 분리할 수 있는, 수확된 세포 배양 혼합물의 정화를 포함한다. 다운스트림 정제는 통상적으로 공정 및 생성물 관련 불순물을 효율적으로 제거하기 위한, 예를 들어 친화성, 이온 교환, 소수성 상호작용, 하이드록시아파타이트, 크로마토포커싱, 겔 여과 및 역상을 기반으로 하는 하나 이상의 (직교) 크로마토그래피 분리 단계를 포함한다. 이러한 오염물질에는 HCP, 침출된 단백질 A, 생성물 이소형, 고분자량(HMW), 저분자량(LMW), 및 잘린(clipped) 또는 분해된 생성물이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
친화성 크로마토그래피는 정제될 원하는 표적 단백질과 특이적으로 상호작용하는 화합물의 사용에 관한 것이다. 일반적으로, 화합물은 원하는 표적 생성물을 분리, 정제 또는 제거하기 위해 수지 상에 고정화된다. 항체 정제를 위해, 예를 들어 친화성 수지는 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)으로부터 수득된 단백질 A, 스트렙토코커스 종으로부터의 단백질 G, 펩토스트렙토코커스 마그너스(Peptostreptococcus magnus)로부터의 단백질 L, 및 이들의 재조합 또는 합성 버전 또는 펩티드를 포함한다. 이러한 수지는 MAbSelectTM(GE Healthcare), Prosep A®(Millipore) 및 기타를 포함한다. 실험실 규모 응용의 경우, 1단계 친화성 정제는 일반적으로 만족스러운 순도를 달성한다. 예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피는 IgG 항체를 포획하기 위해 가장 널리 사용되는 친화성 정제로서 IgG의 Fc 부분에 대한 높은 특이성으로 인해 95% 초과의 순도를 뛰어난 회수율과 함께 지원한다. 잘 확립된 정제 방법의 다른 예는 황친화성 흡착, 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피, 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피, 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다(Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).
응집체/불순물을 추가로 제거하는 것은 하이드록시아파타이트, 소수성 상호작용(HIC), 및 이온 교환 크로마토그래피(IEX, 예를 들어, 양이온 교환(CEX), 음이온 교환(AEX), 또는 혼합 모드 교환)를 포함할 수 있는 1개 또는 2개의 추가 직교 크로마토그래피 단계들을 조합하여 달성될 수 있다. 제조 규모에서, 응집체 및 불순물의 제거는 종종 초기 항체 친화성 크로마토그래피 후 IEX의 사용을 통해 달성된다. Capto MMC 및 Capto adhere뿐만 아니라, Capto MMC ImpRes와 Capto adhere ImpRes(모두 GE Healthcare)와 같은 상업적 다중모드 이온 교환기가 초기 친화성 포획의 다운스트림에서 오염물질을 제거하는 데 사용될 수 있다. IEX는 표면 전하가 상이한 단백질을 분리하여 높은 샘플 로딩 용량으로 고해상도 분리를 제공한다. 이러한 분리는 하전된 단백질(즉, 하전된 아미노산 측쇄)과 반대로 하전된 크로마토그래피 배지 사이의 가역적인 정전기 상호작용을 기반으로 한다. AEX는 양으로 하전된 작용기(예를 들어, 4차 아민 기를 갖는 강한 음이온 교환기 또는 2차 아민 기를 갖는 약한 음이온 교환기)를 갖는 수지 상에서의 단백질 정제를 포함한다. CEX는 음으로 하전된 작용기(예를 들어, 설파이트 기를 갖는 강한 양이온 교환기 또는 카르복실레이트 음이온을 갖는 약한 양이온 교환기)를 갖는 수지 상에서의 단백질 정제를 포함한다. AEX 및 CEX는 모두 생산 규모 공정 동안 응집체뿐만 아니라 다른 불순물들을 제거하는 데 효과적인 것으로 증명되었다. 양이온 교환 또는 음이온 교환 각각의 크로마토그래피 단계는 표적 단백질 및 불순물의 물리화학적 특성에 따라, 결합 및 용리 또는 유체-통과 모드로 수행될 수 있다. 단백질 분자는 전하 특성이 상당히 다양하며, 전체 전하, 전하 밀도 및 표면 전하 분포의 차이에 따라, 하전된 크로마토그래피 배지와의 상호작용 정도가 상이하다. 예를 들어, 단일클론 항체는 카르복실 기 및 아미노 기와 같은 이온화가능한 기를 포함한다. 이들 기의 전하는 pH에 따라 달라질 것이다. 따라서, 항체의 등전점(pI)에 따라, 단백질 분자의 전하는 벌크 생성물을 상이한 pH 조건에 노출시킴으로써 조작될 수 있다. 단일클론 IgG1 항체는 통상적으로 약 7~9의 기본 pI를 갖는다. 유체-통과 모드에서, 항체가 결합하지 않고 대다수의 불순물이 컬럼에 결합된 상태로 수지를 통해 흐르도록, 표적 항체의 전하를 맞춤화하기 위해 적절한 pH 및 전도도 조건을 정의해야 한다. AEX 크로마토그래피는 종종 생성물이 결합되지 않은 분획으로 수집되는 동안 수지에 결합될 것으로 예상되는 바이러스 및 DNA와 같은 불순물을 제거하기 위해, 중성 내지 약간 염기성인 pH에서 유체-통과 모드로 실행된다. AEX 크로마토그래피 수지의 분리 모드는 (염 농도에 의해 제어되는) 전도도와 같은 정전기 상호작용 요인을 기반으로 하므로, FT 모드에서의 AEX에서 DNA, 숙주 세포 단백질, 응집체 및 기타 불순물 제거 능력에도 영향을 미친다.
본 발명의 본질적인 핵심은 Tris만으로 샘플의 전도도를 조정한다는 점이다. 놀랍게도, (예를 들어 NaCl을 사용한) 전도도의 조정뿐만 아니라, Tris의 첨가가 FT 모드에서 다중모드 AEX 크로마토그래피의 수율을 개선한다는 것을 알아내었다. Tris만으로 조정된 샘플 부하 및 NaCl을 사용하여 동일한 전도도로 조정된 샘플 부하의 헤드-투-헤드 비교 결과, Tris만 첨가하면, FT 모드에서 MMC 후 항체 수율이 약 5% 더 높고 단량체 함량은 약간 더 낮지만 여전히 사양 내에 있다는 것을 알아내었다.
구현예
일 구현예에서, 본 개시내용은 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 샘플을 제공하는 단계;
b. 샘플의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 샘플의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 샘플의 pH 및 전도도는 Tris를 사용하여 조정된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 샘플을 제공하는 단계;
b. 샘플의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 샘플의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 샘플의 pH 및 전도도는 Tris를 사용하여 조정된다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 샘플을 제공하는 단계;
b. 샘플의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 샘플의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 샘플의 pH 및 전도도는 Tris를 사용하여 적어도 10 mS/cm의 전도도로 조정된다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 샘플을 제공하는 단계;
b. 샘플의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 샘플의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 샘플의 pH 및 전도도는 Tris를 사용하여 10 내지 50 mS/cm의 전도도로 조정된다. 바람직하게는, 전도도는 15 mS/cm로 조정된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 샘플을 제공하는 단계;
b. 샘플의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 샘플의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 샘플의 pH 및 전도도는 Tris를 사용하여 10 내지 50 mS/cm의 전도도로 조정된다. 바람직하게는, 전도도는 15 mS/cm로 조정된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 샘플을 제공하는 단계;
b. 샘플의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 샘플의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 샘플의 pH 및 전도도는 Tris를 사용하여 10 내지 30 mS/cm의 전도도, 및 약 6.5 내지 7.5의 제3 pH로 조정된다. 바람직하게는, 전도도는 15 mS/cm로, 및 pH는 약 7.1로 조정된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 샘플을 제공하는 단계;
b. 샘플의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 샘플의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 샘플의 pH 및 전도도는 Tris를 사용하여 10 내지 30 mS/cm의 전도도, 및 약 6.5 내지 7.5의 제3 pH로 조정된다. 바람직하게는, 전도도는 15 mS/cm로, 및 pH는 약 7.1로 조정된다.
바람직한 구현예에서, 단계 a)의 샘플은 친화성 크로마토그래피 단계 후에 수득된 친화성 크로마토그래피 용리액이다. 가장 바람직하게는, 단계 a)의 샘플은 약 3 내지 약 4의 제1 pH, 이상적으로는 3.6의 제1 pH를 갖는 단백질 A 크로마토그래피 용리액이다. 친화성 크로마토그래피 지지체의 비제한적인 예는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L 및 관심 항체가 생성된 항원을 포함하는 친화성 지지체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 단백질 A 크로마토그래피 수지는 ProSep Ultra Plus, MabSelect SuRe™, 또는 Amsphere Protein A™ 수지로부터 선택된다. 샘플 로딩 전에, 친화성 컬럼은 적합한 완충액(예를 들어, PBS, pH 7.0 내지 7.3)으로 평형화된다. 샘플이 컬럼 상에 로딩된 후, 컬럼은 적합한 세척 완충액(예를 들어, PBS, pH 7.0 내지 7.3)을 사용하여 한 번 또는 여러 번 세척된다. 이어서 친화성 지지체에 결합된 항체는 적절한 용리 완충액(예를 들어, Na-아세테이트 완충액, pH 3.6)을 사용하여 용리될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 개시내용은 단계 b)의 제2 pH가 약 5.2 내지 약 5.6의 pH로 조정되는, 선행하는 구현예들 중 임의의 것에 따른 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 제2 pH는 pH 5.5로 조정된다.
바람직한 구현예에서, 혼합 모드 또는 혼합 모드성 또는 다중 모드("MM") 크로마토그래피는 단계 d)에서 이온 교환 크로마토그래피로서 사용될 수 있다. 이러한 혼합 모드 단계는 양이온 또는 음이온 교환, 또는 이들 둘 모두의 조합을 특징으로 할 수 있다. 이 단계는 단일 유형의 이온 교환기 혼합 모드 절차를 기반으로 할 수 있거나, 양이온 교환 혼합 모드 단계 다음에 음이온 교환 혼합 모드 단계, 또는 이의 역과 같은 다중 이온 교환기 혼합 모드 단계를 포함할 수 있다. MM 크로마토그래피용 크로마토그래피 배지는 특히 음이온 교환 배지, 양이온 교환 배지, 소수성 상호작용 배지, 친수성 상호작용 배지, 수소 결합, pi-pi 결합, 및 금속 친화성의 혼합물들을 포함한다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 배지 또는 양이온 교환 배지와 같은 적어도 이온 교환 배지를 갖는 MM 크로마토그래피 배지가 MM 크로마토그래피에 사용된다. 적합한 양이온 교환 컬럼은 고정상이 음이온성 기를 포함하는 컬럼이다. 이러한 컬럼의 예는 Capto MMC™, Capto MMC™ ImpRes(GE Healthcare), Nuvia™ cPrime™(Biorad)이다. 일 구현예에서, 양이온 교환 혼합 모드 크로마토그래피는 N-벤질-n-메틸 에탄올아민을 포함한다. 또 다른 양태에서, 적합한 음이온 교환 컬럼은 고정상이 양이온성 기를 포함하는 컬럼이다. 일 구현예에서, 혼합 모드 크로마토그래피는 Capto™ Adhere 크로마토그래피 또는 Capto™ Adhere ImpRes 크로마토그래피(GE Healthcare)이다. 일 구현예에서, 제1 혼합 모드 크로마토그래피는 유체-통과 모드에서 수행된다. 샘플(예를 들어, 친화성 용리액)을 혼합 모드 컬럼 상에 로딩하기 전에, 컬럼은 적합한 완충액을 사용하여 평형화될 수 있다.
다른 구현예에서, 항체 샘플(예를 들어, 친화성 크로마토그래피 용리액)은 샘플의 부하, pH, 전도도 및 이온 강도를 조정함으로써 혼합 모드 단계를 위해 제조된다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 샘플을 제공하는 단계;
b. 샘플의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 샘플의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로, 및 부하 밀도를 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 샘플의 전도도는 10 내지 30 mS/cm의 전도도, 및 약 10 내지 약 200 g/L의 부하 밀도로 약 6.5 내지 7.5의 제3 pH로 조정된다. 바람직하게는, 전도도는 15 mS/cm로 조정되고, 제3 pH는 20 내지 40 g/L의 부하 밀도로 pH 7.1로 조정된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 샘플을 제공하는 단계;
b. 샘플의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 샘플의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로, 및 부하 밀도를 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 샘플의 전도도는 10 내지 30 mS/cm의 전도도, 및 약 10 내지 약 200 g/L의 부하 밀도로 약 6.5 내지 7.5의 제3 pH로 조정된다. 바람직하게는, 전도도는 15 mS/cm로 조정되고, 제3 pH는 20 내지 40 g/L의 부하 밀도로 pH 7.1로 조정된다.
일 구현예에서, 정제되는 항체는 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피 수지 상에서 10 mS/cm 초과의 전도도를 갖는 용액에 적용된다. 또 다른 구현예에서, 항체는 약 10 mS/cm 내지 약 30 mS/cm의 범위의 전도도를 갖는 용액에 적용된다. 일부 구현예에서, 항체는 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피 수지 상에서 약 15 mS/cm 초과의 전도도를 갖는 용액에 적용된다.
일 양태에서, 항체 샘플은 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 수지 재료 1 리터 당 약 1 내지 300 g, 약 5 내지 200 g, 약 10 내지 100 g, 약 20 내지 50 g, 20 내지 40 g의 범위로 적용된다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의해 IL-17C에 특이적인 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항-IL17C 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항-IL-17C 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 2 M Tris를 사용하여 5%(v/v), 10%(v/v), 15%(v/v), 20%(v/v) 또는 5%(v/v) 내지 20%(v/v) 범위의 Tris 농도로 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 8의 가변 중쇄 및 서열번호 7의 가변 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의해 IL-17C에 특이적인 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항-IL-17C 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 2 M Tris를 사용하여 5%(v/v), 10%(v/v), 15%(v/v), 20%(v/v) 또는 5%(v/v) 내지 20%(v/v) 범위의 Tris 농도로 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 8의 가변 중쇄 및 서열번호 7의 가변 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항-IL17C 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 2 M Tris를 사용하여 5%(v/v), 10%(v/v), 15%(v/v), 20%(v/v) 또는 5%(v/v) 내지 20%(v/v) 범위의 Tris 농도로 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항-IL17C 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 2 M Tris를 사용하여 5%(v/v), 10%(v/v), 15%(v/v), 20%(v/v) 또는 5%(v/v) 내지 20%(v/v) 범위의 Tris 농도로 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 8의 가변 중쇄 및 서열번호 7의 가변 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항-IL17C 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 2 M Tris를 사용하여 5%(v/v), 10%(v/v), 15%(v/v), 20%(v/v) 또는 5%(v/v) 내지 20%(v/v) 범위의 Tris 농도로 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 8의 가변 중쇄 및 서열번호 7의 가변 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항-IL17C 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 2 M Tris를 사용하여 5%(v/v), 10%(v/v), 15%(v/v), 또는 20%(v/v) 또는 5%(v/v) 내지 20%(v/v) 범위의 Tris 농도로 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
바람직한 구현예에서, Tris를 사용하는 단계 c)에서 항체 샘플의 pH 및 전도도의 조정은 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피 후의 통과액 중 항체의 수율을 증가시킨다. 일 구현예에서, 2 M Tris, pH 7.1을 사용하여 5%(v/v) 농도로 조정하면, 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후에 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% 이상의 항체 수율이 생성된다. 또 다른 구현예에서, 2 M Tris, pH 7.1을 사용하여 10%(v/v) 농도로 조정하면, 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후에 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% 이상의 항체 수율이 생성된다. 또 다른 구현예에서, 2 M Tris, pH 7.1을 사용하여 15%(v/v) 농도로 조정하면, 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후에 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% 이상의 항체 수율이 생성된다. 또 다른 구현예에서, 2 M Tris, pH 7.1을 사용하여 20%(v/v) 농도로 조정하면, 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후에 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% 이상의 항체 수율이 생성된다.
일 구현예에서, 정제되는 항체 또는 항체 단편은 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항체 단편이다.
특정 구현예에서, 정제되는 항체는 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 IgM 이소형 항체이다.
바람직한 구현예에서, 정제되는 항체는 IgG 이소형 또는 이의 변이체이다. 더 바람직하게는, 항체는 IgG1 항체이다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 IL-17C에 특이적인 항체의 정제에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 정제되는 mAb는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6의 CDR과 비교하여 CDR에서 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 공유한다.
본 발명이 적용될 수 있는 항체 제형은 천연, 합성, 또는 재조합 공급원으로부터의 정제되지 않거나 부분적으로 정제된 항체를 포함할 수 있다. 항체 샘플은 세포 배양 물질, 예를 들어 용해된 세포 및 세포 배양 상청액일 수 있다. 특정 구현예에서, 이는 정화된 세포 배양 수확물이다. 본 발명의 방법은 항체를 함유하는 임의의 혼합물로부터 항체를 정제하기 위한 폴리싱 단계로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 혼합물은 단백질 A 용리액일 수 있다.
나아가, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 정제된 하나 이상의 항체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
생성된 샘플 생성물에서 관심 항체의 순도는 당업자에게 잘 알려진 방법, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, Poros™ A HPLC 분석, HCP ELISA, 단백질 A ELISA, 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 분석할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 95.0%, 95.5%, 96.0%, 96.5%, 97.0%, 97.5%, 98.0%, 98.5%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 이상의 SEC 단량체 함량을 갖는 정제된 항체를 생성한다. 또 다른 구현예에서, 정제된 단백질은 100%의 SEC 단량체 함량을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 수율로 정제된 항체를 생성한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항-IL17C 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 8의 가변 중쇄 및 서열번호 7의 가변 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항-IL17C 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 8의 가변 중쇄 및 서열번호 7의 가변 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의해 IL-17C에 특이적인 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 8의 가변 중쇄 및 서열번호 7의 가변 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의해 IL-17C에 특이적인 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 8의 가변 중쇄 및 서열번호 7의 가변 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의해 IL-17C에 특이적인 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 NaCl의 부재 하에 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 8의 가변 중쇄 및 서열번호 7의 가변 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 NaCl의 부재 하에 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 8의 가변 중쇄 및 서열번호 7의 가변 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 NaCl의 부재 하에 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도 및 제2 pH를 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 NaCl의 부재 하에 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 8의 가변 중쇄 및 서열번호 7의 가변 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 NaCl의 부재 하에 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 8의 가변 중쇄 및 서열번호 7의 가변 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 NaCl의 부재 하에 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 영역, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3 영역, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1 영역, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 영역 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3 영역, 및 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 2 M Tris를 사용하여 5%(v/v), 10%(v/v), 15%(v/v), 또는 20%(v/v) 또는 5%(v/v) 내지 20%(v/v) 범위의 Tris 농도로 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 2 M Tris를 사용하여 5%(v/v), 10%(v/v), 15%(v/v), 또는 20%(v/v) 또는 5%(v/v) 내지 20%(v/v) 범위의 Tris 농도로 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 항체의 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항-IL17C 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 NaCl의 부재 하에 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항-IL17C 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 NaCl의 부재 하에 Tris를 사용하여 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체의 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로,
a. 항-IL17C 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 2 M Tris를 사용하여 NaCl의 부재 하에 5%(v/v), 10%(v/v), 15%(v/v), 또는 20%(v/v) 또는 5%(v/v) 내지 20%(v/v) 범위의 Tris 농도로 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 유체-통과 모드에서 다중모드 음이온 교환(MM-AIEX) 크로마토그래피에 의한 정제 동안 IL-17C에 특이적인 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로,
a. 항-IL17C 항체를 포함하는, 약 3 내지 약 4의 제1 pH를 갖는 친화성 크로마토그래피(AC) 용리액을 제공하는 단계;
b. AC 용리액의 제1 pH를 약 5.2 내지 약 5.6, 바람직하게는 5.5의 제2 pH로 조정하는 단계;
c. 용리액의 전도도를 10 내지 30 mS/cm, 바람직하게는 15 mS/cm의 전도도로, 및 제2 pH를 약 7.1의 제3 pH로 조정하는 단계;
d. 유체-통과 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 용리액을 처리하는 단계; 및
e. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
를 포함하며, 단계 c)에서 용리액의 pH 및 전도도는 2 M Tris를 사용하여 NaCl의 부재 하에 5%(v/v), 10%(v/v), 15%(v/v), 또는 20%(v/v) 또는 5%(v/v) 내지 20%(v/v) 범위의 Tris 농도로 조정되고, 여기서 상기 항체는 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄를 갖는다.
다른 구현예에서, 전도도는 적어도 10 mS/cm, 10 내지 50 mS/cm의 범위, 10 내지 30 mS/cm, 11 내지 30 mS/cm, 12 내지 30 mS/cm, 13 내지 30 mS/cm, 10 내지 29 mS/cm, 10 내지 28 mS/cm, 10 내지 27mS/cm, 10 내지 26 mS/cm, 11 내지 29 mS/cm, 11 내지 28 mS/cm, 11 내지 27mS/cm, 11 내지 26 mS/cm, 12 내지 29 mS/cm, 12 내지 28 mS/cm, 12 내지 27mS/cm, 12 내지 26 mS/cm, 13 내지 29 mS/cm, 13 내지 28 mS/cm, 13 내지 27mS/cm, 13 내지 26 mS/cm, 또는 13 내지 25 mS/cm의 범위로 조정된다.
정의
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "단백질"은 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산의 순차적인 사슬을 지칭한다. 이 용어는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 지칭하기 위해 사용되지만, 이 용어가 긴 사슬에 제한되지 않고, 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 두 개의 아미노산을 포함하는 최소 사슬을 지칭할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, "펩티드", "펩티드 단편", "폴리펩티드", "아미노산 사슬", "아미노산 서열" 또는 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 지칭하기 위해 사용되는 임의의 다른 용어는, 각각의 이러한 용어가 더 구체적인 의미를 가질 수 있음에도 불구하고 일반적으로 "단백질"의 정의에 포함된다. 용어 "단백질"은 이러한 용어들 중 임의의 것을 대신하여 또는 이와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 이 용어는 번역후 또는 합성후 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 또는 아미드화를 거친 단백질을 추가로 포함한다.
"완충액"은 이의 산-염기 콘주게이트 성분의 작용에 의한 pH의 변화에 저항하는 용액이다. 예를 들어 완충액의 원하는 pH에 따라 사용될 수 있는 다양한 완충액은 문헌[Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)]에 기재되어 있다. 이러한 범위의 pH를 제어할 완충액의 비제한적인 예는 MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 석시네이트, 및 암모늄 완충액뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.
"Tris" 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄은 화학식 (HOCH2)3CNH2의 유기 화합물이다. 동의어로는 TRIS, Tris, Tris 염기, Tris 완충액, 트리즈마, 트리사민, THAM, 트로메타민, 트로메타몰, 트로메탄, 트리사민올이 있다. 바람직한 IUPAC 명칭은 2-아미노-2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-디올이다. CAS 등록 번호: 77-86-1.
용어 "등전점(pI)"은 특정 분자 또는 표면이 순 전하를 띠지 않는 pH이다. 폴리펩티드의 pI는 폴리펩티드를 구성하는 아미노산에 따라 달라진다. pI보다 낮은 pH에서, 폴리펩티드는 순 양전하를 띤다. pI보다 높은 pH에서, 폴리펩티드는 음의 순 음전하를 띤다. 따라서 폴리펩티드는 주어진 pH에서 이온화 상태에 기초하여 분리될 수 있다. 폴리펩티드의 실제 pI는 번역후 변형과 같은 요인에 의해 영향받을 수 있다. 실제 pI는 등전점 포커싱과 같은 실험적 방법에 의해 결정될 수 있다.
용어 "크로마토그래피"는 예를 들어, 불순물 및/또는 기타 비-표적 분자의 제거에 의해 샘플로부터 하나 이상의 표적 분자를 정제하는, 임의의 현재 또는 미래의 크로마토그래피 기반 공정을 지칭한다. 크로마토그래피 동안 혼합물 중의 관심 용질, 예를 들어 폴리펩티드는, 혼합물 중의 개별 용질이 이동상의 영향 하에 또는 결합 및 용리 공정에서 고정상 배지를 통해 이동하는 속도의 차이의 결과로, 혼합물 중의 다른 용질과 분리된다. 액체 크로마토그래피 정제의 예는 친화성 크로마토그래피, 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 유체-통과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 모의 이동층 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과, 크로마토포커싱을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "혼합 모드 크로마토그래피" 또는 "다중모드 크로마토그래피"는 관심 폴리펩티드와 흡착제 리간드 사이의 소수성, 양이온 교환 및 수소 결합 상호작용과 같은 다중 상호작용 모드를 제공하는, 혼합 모드 흡착제를 사용하는 정제 공정을 지칭한다. 구매가능한 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 GE Healthcare Life Sciences의 Capto™ MMC, Capto™ MMC ImpRes, Capto Blue, Blue Sepharose™ 6 Fast Flow, Capto™ Adhere, 및 Capto™ Adhere ImpRes 또는 EMD Millipore의 Eshmuno® HCX, 또는 Bio-Rad의 Nuvia™ cPrime 을 포함한다.
용어 "양이온 교환 수지", "양이온 교환 흡착제", 또는 "양이온 교환 매트릭스"는 음으로 하전된 고체 상을 지칭하며, 따라서 고체 상 위로 지나가거나 이를 통과하는 수용액에서 양이온과 교환하기 위한 유리 양이온을 갖는다. 고체 상에 부착되어 양이온 교환 수지를 형성하는 음으로 하전된 리간드는, 예를 들어 카르복실레이트 또는 설포네이트일 수 있다. 구매가능한 양이온 교환 수지는 아가로스 상에 고정된 카르복시-메틸-셀룰로스, 설포프로필(SP)(예를 들어, GE Healthcare Life Sciences의 SP Sepharose™ XL, SP-Sepharose™ Fast Flow, SP Sepharose™ High Performance, CM Sepharose™ Fast Flow, CM Sepharose™ High Performance, Capto™ S, 및 Capto™ SP ImpRes, 또는 EMD Millipore의 Fractogel® EMD SE HiCap, Fractogel® EMD SO3", Fractogel® EMD COO", Eshmuno™ S, 및 Eshmuno™ CPX, 또는 Bio-Rad의 UNOsphere™ S 및 Nuvia™ S)을 포함한다.
용어 "음이온 교환 수지", "음이온 교환 흡착제", 또는 "음이온 교환 매트릭스"는, 예를 들어 그에 부착된 4차 아미노기와 같은 하나 이상의 양으로 하전된 리간드를 갖는, 양으로 하전된 고체 상을 지칭하기 위해 본 명세서에 사용된다. 구매가능한 음이온 교환 수지는 GE Healthcare Life Sciences의 DEAE Sepharose™ Fast Flow, Q Sepharose™ Fast Flow, Q Sepharose™ High Performance, Q Sepharose™ XL, Capto™ DEAE, Capto™ Q, 및 Capto™ Q ImpRes, 또는 EMD Millipore의 Fractogel® EMD TMAE HiCap, Fractogel® EMD DEAE, 및 Eshmuno Q, 또는 Bio-Rad의 U Osphere™ Q 및 Nuvia™ Q를 포함한다.
용어 "항체"는 면역글로불린의 5가지 주요 부류(이소형) IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이들의 하위 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 글리코실화 및 비글리코실화된 면역글로불린 중 임의의 것 및 이들의 조합 및 변이체를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어는 임의의 종(예를 들어, 뮤린, 개, 고양이, IgY 등)을 형성하는 항체 및 이들의 조합, 예를 들어, 인간, 인간화, 키메라 항체를 포함한다. 이 용어는 단일클론 및 다클론 항체, 및 단일특이성 및 다중특이성 항체(예컨대 이중특이성 항체)를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어는 또한 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화 공간 분포에 의해) 항원과 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 부분을 지칭하는 온전한 면역글로불린뿐만 아니라 항체 단편을 포함한다. 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv 및 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), 단일 사슬 Fv(scFv)(예를 들어, Bird et al., (1988) Science 242:423-426]; 및 문헌[Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항원에 특이적으로 결합하는, 임의의 천연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성, 대안적 스캐폴드, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드는, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "항체"에 포함되는 것으로 의도된다.
용어 "오염물질" 및 "불순물"은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, DNA, RNA와 같은 생물학적 거대 분자, 하나 이상의 숙주 세포 단백질, 세포내독소, 지질 및 하나 이상의 첨가제를 포함하는 임의의 적절하지 않은(objectionable) 분자를 지칭하며, 이는 본 발명의 공정을 사용하여 하나 이상의 외래 또는 적절하지 않은 분자들로부터 분리되는 표적 단백질을 함유하는 샘플 내에 존재할 수 있다. 추가적으로, 그러한 오염물질은 정제 공정 전에 일어날 수 있는 단계에서 사용되는 임의의 시약을 포함할 수 있다.
"고분자량(HMW) 종"은 다량체와 같이, 표적 단백질 질량보다 더 높은 분자량을 갖는 종을 포함한다. 다량체는 표적 단백질의 단량체 이외의 모든 것을 포함한다. 예를 들어, IgG 항체의 단량체는 2개의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 전통적인 4량체 항체 조성물을 포함한다. 다량체는 이량체(공유 또는 비공유 결합된 2개의 동일한 단백질) 및 응집체(공유 또는 비공유 결합된 전체 및/또는 부분 단백질)와 같이, 표적 단백질 질량보다 더 높은 분자 질량을 갖는 종을 포함한다.
"저분자량(LMW) 종"은 클립 및 분해 생성물과 같이, 표적 단백질 질량보다 더 낮은 분자량을 갖는 종을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "폴리싱"은 초기(친화성) 포획 단계 후의 다운스트림 프로세싱 단계를 지칭하며, 이는 생성물 스트림 중에 존재하고 통상적으로 포획 단계 동안 제거된 불순물보다 생성물과 더 유사한 잔여량의 불순물을 제거하기 위한 것이다.
폴리펩티드의 수율 및 순도의 결정 방법은 당업자에게 알려져 있다. 폴리펩티드의 수율 및 순도는 임의의 적합한 분석 방법(예를 들어, 은 염색된 겔 상의 밴드 강도, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, ELISA, HPLC 등)에 의해 결정될 수 있다. 예시적인 방법은 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)이다. 순도는 통상적으로 HPLC 크로마토그램과 같은 크로마토그램에서 피크에 대해 수득할 수 있는 상대 "곡선 아래 면적"(AUC) 값을 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "결합 및 용리 모드"는 샘플 내에 함유된 적어도 하나의 생성물(예를 들어, 단백질을 함유하는 Fc 영역)이 크로마토그래피 수지 또는 배지에 결합하고, 이어서 용리되는 생성물 분리 기술을 지칭한다.
용어 "유체-통과 모드"는 오염물질은 크로마토그래피 지지체에 결합하지만 표적 단백질은 통과하는 조건을 지칭한다.
표 1의 아미노산 및 인코딩 핵산 서열은 IL-17C 항체 및 이의 일부의 예이다.
[표 1]
예시적인 IL-17C 항체 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
작업 실시예
실시예 1:
유체-통과 모드에서 Capto adhere ImpRes 컬럼(GE Healthcare)을 로딩하기 전에 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄를 갖는 항체를 포함하는 샘플에 대한 Tris 첨가(즉, Tris 농도 증가)가 수율 및 순도에 미치는 영향을 시험하기 위해, 4개의 상이한 정제 실행을 수행하였다. 1개는 Tris 첨가 없이 실행하고, 3개는 샘플 용리액에 2 M Tris pH 7.1의 5, 10 및 20%(v/v)를 첨가하여 실행한다. 생성된 통과액의 항체 수율 및 순도(SEC 단량체)를 분석하였다. 결과는 표 2에 나열되어 있으며, 상응하는 크로마토그램은 도 2에 오버레이로 나타나 있다. 5%(v/v) Tris의 첨가는 생성된 풀의 SEC 단량체 부분이 0.4%만 감소된 20%의 수율 증가로 이어졌다. 샘플에 첨가된 Tris의 증가된 양은 수율을 더욱 증가시켰지만, 더 작은 정도(각각 10% 및 20%의 Tris 첨가에 대해 5% Tris 첨가와 비교하여 각각 약 4% 및 약 7% 증가)였고 추가로 단량체 부분이 약간 감소했다.
Capto® adhere ImpRes(GE Healthcare)를 사용한 다중모드 AEX 크로마토그래피 후 통과액 중 항체의 수율 및 단량체 함량
2 M Tris pH 7.1 [%(v/v)]
없음 5 10 20
전도도 [mS/cm] 8.2 13.6 17.2 25.5
수율 [%] 58.0 78.0 81.9 84.6
SEC 단량체 [%] 97.8 97.4 97.0 96.6
실시예 2:
전도도의 조정뿐만 아니라, 실시예 1에서와 같이 항체 샘플에 Tris를 첨가하는 것이 Capto adhere ImpRes 크로마토그래피 후 통과액 중 항체 수율을 개선한다는 것을 설명하기 위해, Tris를 사용한 샘플의 사전컨디셔닝(실행 1) 및 NaCl을 사용한 샘플의 사전컨디셔닝(실행 2)의 헤드-투-헤드 비교를 수행하였다. 샘플 제조를 위해 전도도는 2 M Tris pH 7.1을 사용한 실행 1 및 5 M NaCl을 사용한 실행 2에서 15 mS/cm의 목표 전도도로 조정되었다(표 3).
pH 전도도 비고
실행 시작 목표 시작[mS/cm] 목표[mS/cm]
1 5.50 7.10 6.80 15.00 2 M Tris pH 7.1로 조정된 전도도
2 5.49 7.10 7.00 15.00 5 M NaCl로 조정된 전도도
두 부하는 모두 동일한 전도도를 갖지만 완충액 매트릭스가 상이하였고, pH 및 전도도 측정은 상온 20℃±2℃에서 수행되었다. 정제 결과 및 QC 데이터는 표 4에 나타나 있다.
SEC/MALS
실행 모드 단량체
[%]		 HMW 불순물
[%]		 LMW 불순물[%] 정제 후 수율 [mg] 회수
(부하에 대하여) [%]
1 MM-AIEX 96.7 2.1 1.1 675.2 81.5% 2 M Tris pH 7.1로 조정된 전도도
2 MM-AIEX 97.1 1.7 1.2 644.6 77.3% 5 M NaCl로 조정된 전도도
Tris를 첨가하지 않으면(실행 2), 전도도가 2 M Tris pH 7.1로 15 mS/cm로 조정된 실행 1과 비교하여 수율이 약 5% 낮다.
SEQUENCE LISTING <110> MORPHOSYS AG <120> METHOD TO INCREASE ANTIBODY YIELD DURING ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY <130> MS293/PCT <140> <141> <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Tyr Ile Gly Gly Val Gly Glu Gly Thr Gln Tyr Ala Glu Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Gly Phe Ala Ile Arg Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT 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Claims (15)

  1. 항체 정제 동안 이온 교환 크로마토그래피의 통과액(flow through) 중 항체의 수율을 증가시키는 방법으로서,
    a. 항체를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    b. 샘플의 전도도를 조정하는 단계;
    c. 유체-통과(flow-through) 모드에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 조정된 샘플을 처리하는 단계; 및
    d. 항체를 포함하는 통과액을 수집하는 단계
    를 포함하며, 단계 b)에서 샘플의 전도도는 Tris를 사용하여 적어도 10 mS/cm로 조정되고, 여기서 전도도를 조정한 후의 pH는 pH 6.5 내지 7.5의 범위인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항체를 포함하는 샘플은 친화성 크로마토그래피 용리액인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 친화성 크로마토그래피 용리액은 약 3 내지 약 4의 pH를 갖는 단백질 A 크로마토그래피 용리액인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 샘플의 약 3 내지 약 4의 pH는, 약 5.2 내지 약 5.6의 pH, 바람직하게는 5.5의 pH로 조정되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 전도도는 10 내지 50 mS/cm의 전도도로 조정되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 전도도는 13 내지 30 mS/cm의 범위로 조정되는, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 전도도는 15 mS/cm로 조정되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피는 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 정제되는 단일클론 항체는 단일클론 항체인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 정제되는 단일클론 항체는 항-IL17c 항체인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 정제되는 단일클론 항-IL17C 항체는 서열번호 8의 VH 및 서열번호 7의 VL을 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 정제되는 단일클론 항-IL17C 항체는 서열번호 10의 중쇄 및 서열번호 9의 경쇄로 이루어지는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 통과액 중 정제된 항체의 수율은 75% 초과인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 샘플의 전도도는 NaCl의 부재 하에 Tris를 사용하여 조정되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 약학 조성물.
KR1020227020552A 2019-11-22 2020-11-20 이온 교환 크로마토그래피 동안 항체의 수율을 증가시키는 방법 KR20220101168A (ko)

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