KR20110071011A - Ｉｌ-18에 결합하는 항체 및 이의 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본원에는 항-IL-18 항체 및 이의 항원 결합부가 기재되어 있다. 샘플 매트릭스로부터 항-IL-18 항체를 분리 및 정제하는 하나 이상의 방법이 제시되어 있다. 이들 분리된 항-IL-18 항체는 연구 개발에서 뿐만 아니라 임상 환경에 사용될 수 있다. 분리된 항-IL-18 항체를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 기재되어 있다.

Description

ＩＬ-18에 결합하는 항체 및 이의 정제 방법{Antibodies that bind to IL-18 and methods of purifying the same}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2008년 10월 20일자 출원된 미국 임시특허원 제61/196,751호를 우선권으로 주장하며, 이는 전체가 본원에서 참조로서 인용된다.

발명의 배경

사람 인터류킨-18은 생물학적 불활성 193 아미노산 전구체 단백질로서 합성되는 확인된 사이토킨이다. 예를 들면, 카스파제-1 또는 카스파제-4에 의한 전구체 단백질의 분해는 156개 아미노산 성숙 단백질을 해리시키고, 이러한 성숙 단백질은 T 세포 증식의 공동-자극, NK 세포 세포독성의 증강, T 세포 및 NK 세포에 의한 IFN-γ 생성의 유도 및 T 헬퍼 타입 1(Th1) 분화의 효능을 포함하는 생물학적 활성을 나타낸다. 또한, IL-18은 IL-8, 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)를 포함하는 사람 단핵구 염증촉진성 매개인자의 효능있는 유도인자이다.

IL-18은 Th1 세포에 대한 Fas 리간드의 작용 활성을 증대시킴으로써 면역조절 및 염증에서 중요한 역할을 담당한다. 또한, IL-18은 부신 피질에서 발현되고, 따라서 분비된 신경-면역조절인자일 수 있으며, 이는 스트레스 경험 이후의 면역계를 조절하는데 중요한 역할을 담당한다.

IFN-γ, IL-2 및 TNF-β 등의 염증촉진성 사이토킨을 생성하는 Th1 세포는 다수의 자가면역 질환, 예를 들면, 다발성 경화증(MS), 류마티스성 관절염(RA), 타입 1 또는 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 염증성 장 질환(IBD) 및 건선을 매개하는데 연관될 수 있다. 따라서, IL-18 등의 TH1-촉진 사이토킨의 길항작용은 질병 발달을 억제할 것으로 예상된다. IL-18 특이적 mAb는 길항제로서 사용될 수 있다.

생체내에서, IL-18은 프로-IL-18의 분리에 의해 형성되고, 이의 내인성 활성은 피. 아크네스(P. acnes) 및 LPS 매개된 치사에서 IFN-γ 생성에 기인하는 것 같다. 사람 질병에서 IL-18의 생물학적 활성의 차단은 많은 질병에서 치료 방법이다. 이는 가용성 수용체를 사용하거나 세포 결합된 IL-18 수용체에 대한 항체를 차단하여 달성될 수 있다.

사이토킨 결합 단백질(가용성 사이토킨 수용체)는 이들 각각의 세포 표면 사이토킨 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인에 상응한다. 이들은 세포 표면 수용체에 통상적인 프리-mRNA의 선택적 스플라이싱 또는 세포 표면 수용체의 단백질 분해에 의해 유도된다. 이러한 가용성 수용체는 과거에 기재되어 있고, 이들 중에는 IL-6 및 IFN-γ의 가용성 수용체가 포함된다. TNFR/Fas 부류의 구성원인 하나의 사이토킨 결합 단백질(오스테오프로테게린(OPG, 또한 파골세포 억제 인자-OCIF로서 공지됨))은 단지 분비된 단백질로서 존재하는 가용성 수용체의 최초의 예인 것 같다.

IL-18은 내독소 쇼크, 간염 및 자가면역 당뇨병을 포함하는 만성 염증 질환에서 병인성의 진행에 연관되는 것이 제안되어 있다. 간 손상의 발달에서 IL-18의 가능한 역할은 마우스 모델의 리포폴리사카라이드 유도된 급성 간 손상에서 IL-18의 상승된 수준을 나타내는 실험에 기초하여 추정되었다. 그러나, 간 손상의 발달에서 다기능 인자 IL-18의 메카니즘은 아직까지 밝혀지지 않았다.

최근의 연구는 IL-18이 관절 메카니즘에서 염증촉진성 역할을 담당함을 나타낸다. 연구자들은 IL-18이 관절내 연골세포에 의해 생성되고 염증촉진성 및 대사 반응을 유도함을 밝혀냈다. IL-18 mRNA는 연골세포 중의 IL-1β에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌다. 연골세포는 IL-18 전구체를 생성하고, IL-1 자극에 반응하여 IL-18의 성숙한 형태를 분비했다. 연골세포에 대한 IL-18 효과의 연구들은 TGF-β 유도된 증식을 억제하고 산화질소 생성을 증강시킴을 추가로 나타냈다. IL-18은 유도성 산화질소 신타제, 유도성 사이클로옥시게나제, IL-6 및 스트로멜리신을 포함하여 정상 사람 관절 연골세포에서 몇몇 유전자의 발현을 자극했다. 유전자 발현은 상응하는 단백질의 합성과 관련된다. IL-18에 의한 정상 사람 관절 연골의 처리는 글리코스아미노글리칸의 방출을 증가시켰다. 이들 발견은 연골세포 반응을 조절하고 연골 열화에 관여하는 사이토킨으로서 IL-18을 확인했다.

IL-18은 류마티스성 관절염에서 염증촉진성 역할을 담당하는 것으로 제안되어 왔다. IL-18 수준은 류마티스성 관절염 환자의 활액에서 현저히 증가되는 것으로 밝혀졌다. 연구자들은 류마티스성 관절염 활액 조직 내의 IL-18 mRNA 및 단백질을 골관절염 대조군보다 현저히 높은 수준으로 검출했다. 또한, IL-12 또는 IL-15와 IL-18의 조합은 시험관내에서 활액 조직에 의한 IFN-γ 생성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 콜라겐/불완전 프로인트 보조제 면역화된 마우스의 IL-18 투여는 침식성의 염증성 관절염의 발달을 촉진시켰고, 이는 IL-18이 생체내에서 염증촉진성일 수 있음을 시사한다.

다른 자가면역 질환의 발달에서의 IL-18의 역할이 입증되었다. 따라서, IL-18 발현은 발병 직전에 비-비만형 당뇨병(NOD) 마우스의 췌장 및 비장에서 현저히 증가되는 것으로 증명됐다. 추가로, IL-18 투여는 쥐의 실험 알레르기성 뇌척수염(EAE), 다발성 경화증의 모델인 Th-1 매개된 자가면역 질환의 임상적 중증도를 증가시키는 것으로 입증되었다. 또한, 항-래트 IL-18 항혈청의 중화는 암컷 Lewis 래트에서 EAE의 발달을 방지하는 것으로 나타났다. 따라서, IL-18은 자가면역성에 대한 신규 요법의 개발을 위한 바람직한 표적이다.

IL-18은 염증 증강 및 약화 기능을 둘 다 갖는 다면 발현성 인터류킨이다. 한편, 이는 TNF-α와 같은 염증촉진성 사이토킨의 생성을 증강시키고, 따라서 염증을 촉진시킨다. 다른 한편으로, 이는 NO, 즉 카스파제-1의 억제제의 생성을 유도하고, 따라서 IL-1β 및 IL-18의 성숙을 차단하고 염증을 약독화시킬 수 있다. IL-18의 이러한 불분명한 역할은 염증 질환의 치료에 있어서 IL-18 억제제의 효능에 대해 문제를 제기했다. 추가로, 염증의 조절에 있어서, 상이한 사이토킨 및 케모킨의 다양한 상호작용 때문에, 이러한 복잡한 시나리오에서 관여자들 중의 하나만을 차단함으로써 유리한 효과가 수득될 수 있음은 예상할 수 없다.

상기 사실에도 불구하고, IL-18 항체의 중화는 자가면역 질환 및 관련 증상의 완화에 유용한 것으로 간주된다. 따라서, 당해 분야에서는 고친화성 IL-18 항체, 예를 들면, 사람 인터류킨 18에 대한 중화 모노클로날 항체가 요구되고 있다. 추가로, IL-18에 대한 항체를 포함하는 치료학적 요법은 고순도인 것이 중요하다. 본 발명은 단백질 A 컬럼 또는 등가의 단백질 A 기반 정제 단계의 사용 없이도 이러한 요구를 해결한다.

특정한 양태에서, 본 발명은 IL-18에 결합하는 정제된, 분리된 항체 및 항체 단편 뿐만 아니라 이러한 항체 및 단편을 포함하는 약제학적 조성물과 관련된다. 특정한 양태에서, 본 발명은 사람 IL-18에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 본 발명의 분리된 항-IL 18 항체는 연구 및 개발에서 뿐만 아니라 임상 환경에서 사용될 수 있다. 특정한 양태에서, 본 발명은 서열번호 1 및 2에서 확인된 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 항-IL-18 항체에 관한 것이다.

본 발명의 특정한 양태는 실질적으로 숙주 세포 단백질("HCP")를 함유하지 않도록 샘플 매트릭스로부터 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부를 정제하는 방법에 관한 것이다. 특정한 양태에서, 샘플 매트릭스(또는 간단히 "샘플")는 본 발명의 항-IL-18 항체를 생성하기 위해 사용된 세포주를 포함한다. 특정한 양태에서, 샘플은 사람 항-IL-18 항체를 생성하기 위해 사용된 세포주를 포함한다.

본 발명의 특정한 양태에서, 추정의 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 샘플 매트릭스는 pH 조절로 처리된다. 특정한 양태에서, pH는 약 3.5로 조절된다. 그 중에서도, 낮은 pH는 샘플을 오염시킬 수 있는 pH 민감성 바이러스의 감소 및/또는 불활성화를 촉진시킨다. 적합한 기간 후, pH를 약 5.0으로 조절하고, 샘플을 이온 교환 크로마토그래피로 처리하여 용출액을 생성한다. 특정한 양태에서, 이온 교환 용출액을 수집하고, 소수성 상호작용 크로마토그래피로 추가 처리하여 용출액을 생성한다. 이어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 용출액은 추가의 처리 또는 사용을 위해 수집할 수 있다.

특정한 양태에서, 본 발명은, 그 중에서도, 세포 및 세포 파편을 제거하기 위한 1차 회수 단계를 포함하는 IL-18 항체의 정제 방법을 제공한다. 상기한 방법의 특정한 양태에서, 1차 회수 단계는 하나 이상의 원심분리 또는 심층 여과 단계를 포함한다. 예를 들면, 제한되는 것은 아니지만, 이러한 원심분리 단계를 약 7000 × g 내지 약 11,000 ×g에서 수행할 수 있다. 또한, 상기 방법의 특정한 양태는 심층 여과 단계, 예를 들면, 탈지질 심층 여과 단계를 포함할 것이다.

상기 방법의 특정한 양태에서, 이온 교환 단계는 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 이들의 조합일 수 있다. 당해 단계는 다중 이온 교환 단계, 예를 들면, 양이온 교환 단계 및 이어서 음이온 교환 단계 또는 이들의 역순을 포함할 수 있다. 특정한 양태에서, 이온 교환 단계는 2단계 이온 교환 공정을 수반한다. 이러한 2단계 공정은, 예를 들면, 제한되는 되는 것은 아니지만, 1차 양이온 교환 단계, 이어서 2차 음이온 교환 단계에 의해 달성될 수 있다. 예시적 양이온 교환 컬럼은 정지상이 음이온성 그룹을 포함하는 컬럼, 예를 들면, CM Hyper DF^TM 컬럼이다. 이러한 이온 교환 포획 크로마토그래피 단계는 1차 회수 혼합물로부터 항-IL-18 항체의 분리를 촉진한다. 적합한 음이온 교환 컬럼은 정지상이 양이온성 그룹을 포함하는 컬럼이다. 이러한 컬럼의 예는 Q Sepharose^TM 컬럼이다. 하나 이상의 이온 교환 단계는 숙주 세포 단백질 및 DNA 또는, 적합한 경우, 친화성 매트릭스 단백질 등의 불순물을 감소시킴으로써 항-IL-18 항체를 추가로 분리한다. 이러한 음이온 교환 공정은 크로마토그래피의 관류 모드이고, 여기서 항-IL-18 항체는 음이온 교환 수지(또는 고정상)과 상호작용하지 않거나 이에 결합하지 않는다. 그러나, 다수의 불술물은 음이온 교환 수지와 상호작용하고 이에 결합한다

특정한 양태에서, 1차 및 2차 이온 교환 단계는 1차 회수 이후에 수행된다. 이러한 특정한 양태에서, 이온 교환 샘플은 두 가지 이온 교환 단계 사이의 1차 이온 교환 단계 전에 또는 둘 다에서 중간 여과 단계로 처리한다. 특정한 양태에서, 이러한 여과 단계는 포획 한외여과/정용여과("UF/DF")를 포함한다. 기타 활성 중에서도, 이러한 여과는 항-IL-18 항체 및 이의 항원 결합부의 농축 및 완충액 교환을 촉진시킨다.

본 발명의 특정한 양태는 하나 이상의 소수성 상호작용 크로마토그래피("HIC") 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 적합한 HIC 컬럼은 정지상이 소수성 그룹을 포함하는 것이다. 이러한 컬럼의 비제한적 예는 Phenyl HP Sepharose^TM 컬럼이다. 특정한 상황에서, 항-IL-18 항체는 분리/정제 공정 동안 응집체를 형성할 것이다. 하나 이상의 HIC 단계의 포함은 이러한 응집체의 감소 또는 제거를 촉진시킨다. HIC는 또한 불순물의 제거를 보조한다. 특정한 양태에서, HIC 단계는 소수성 컬럼과 항-IL-18 항체(또는 이의 응집체)와의 상호작용을 촉진시키기 위해 고농도 염 완충액을 사용한다. 이어서, 항-IL-18 항체는 보다 낮은 농도의 염을 사용하여 용출시킬 수 있다.

특정한 양태에서, HIC 용출물은 바이러스 제거 필터, 이로써 한정되는 것은 아니지만, Ultipor DV50^TM 필터(Pall Corporation, East Hills, N.Y.)을 사용하여 여과한다. 또 다른 필터, 예를 들면, Viresolve^TM 필터(Millipore, Billerica, Mass.); Zeta Plus VR^TM 필터(CUNO; Meriden, Conn.) 및 Planova^TM 필터(Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, Ill.)가 또한 이러한 양태에서 사용될 수 있다.

특정한 양태에서, 본 발명은 분리된 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부 및 허용되는 담체를 포함하는 하나 이상의 약제학적 조성물에 관한 것이다. 한 가지 양태에서, 당해 조성물은 항-IL-18 항체 이외에 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합부를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 당해 조성물은 하나 이상의 약제를 추가로 포함한다.

도 1은 본 발명의 정제 도식의 비제한적 예를 나타낸다.
도 2는 항-IL-18 항체의 비제한적 예(ABT-325)의 중쇄 및 경쇄 서열을 개시한다.

본 발명은 IL-18에 결합하는 항체에 관한 것이다. 한 가지 양태에서, 본 발명은 사람 IL-18에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 본 발명의 분리된 항-IL-18 항체는 연구 및 개발에서 뿐만 아니라 임상 환경에서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부를 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명과 관련하여 정제될 수 있는 적합한 항-IL-18 항체는 미국 특허원 제09/780,035호 및 제10/988,360호에 기재되어 있고, 여기에는 ABT-325로 후속적으로 확인된 항체를 포함한다. ABT-325의 중쇄 및 경쇄 서열은 도 2에 기재되어 있다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 항-IL-18 항체 또는 이의 결합부를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

명료화를 위해 및 비제한적으로, [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]은 다음과 같은 하위 부분으로 구분된다.

1. 정의

2. 항체 생성

3. 항체 제조

4. 항체 정제

5. 샘플 순도 분석 방법

6. 추가 변형

7. 약제학적 조성물 및

8. 항체 용도.

1. 정의

본 발명은 더 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해 먼저 특정 용어들을 정의한다.

용어 "항체"는 4개의 폴리펩타이드 쇄, 이황화 결합에 의해 쇄내 결합된 2개의 중(H) 쇄 및 두 개의 경(L) 쇄를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH로 약술됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR 또는 VL로 약술됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, 즉 CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 보다 보존된 영역, 즉 골격 영역(FR)인 영역과 함께 초가변성 영역, 즉 상보성 결정 영역(CDR)으로 추가로 세분할 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함하며, 이는 아미노 말단에서 카복실 말단으로 순서대로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된다.

용어 항체(또는 "항체 일부")의 "항원 결합부"는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편을 포함한다(예를 들면, hIL-18). 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 보인다. 용어 항체의 "항원 결합부" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편인, Fab 단편, (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편인, F(ab')₂ 단편, (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편[Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨], 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 각각의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 이들을 단일 단백질 쇄(이때, VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 일가 분자를 형성한다)로서 제조할 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법으로 결합시킬 수 있다[참조: 예를 들면, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨]. 상기 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원 결합부" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 디아바디(diabody) 같은 단일쇄 항체의 다른 형태도 또한 포함된다. 디아바디는, VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄로 발현되지만, 동일쇄 상에서 두 도메인 사이를 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 결과적으로 도메인들이 서로 다른 쇄의 상보적인 영역과 쌍을 이루게 하여 2개의 항원 결합부를 생성시키는, 이가 이특이성 항체이다[참조: 예를 들면, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al.(1994) Structure 2:1121-1123, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨]. 또한, 항체 또는 이의 항원 결합부는 항체 또는 항체 일부와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드의 공유결합성 또는 비-공유결합성 연결에 의해 형성된 보다 큰 면역흡착 분자의 일부일 수 있다. 상기 면역흡착 분자의 예는 스트렙토아비딘 코어 영역을 사용하여 사량체 scFv 단편[참조: Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨]을 제조하는 것 및 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그를 사용하여 이가 및 바이오티닐화된 scFv 분자를 제조하는 것[참조: Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨]을 포함한다. Fab 및 F(ab')₂ 같은 항체 일부는 각각, 파파인 또는 펩신 절단 같은 통상적인 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체 일부 및 면역흡착 분자는 본원에 기술되는 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 한 가지 양태에서, 항원 결합부는 완전 도메인 또는 완전 도메인의 쌍이다.

본원에 사용되는 용어 "사람 인터류킨 18"(hIL-18 또는 IL-18로 약술됨)는 사람 사이토킨을 포함하고, 이는, 예를 들면, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 카스파제-1 또는 카스파제-4에 의한 전구체 단백질의 분해에 의해 생성된 156개 아미노산 성숙 단백질 뿐만 아니라 생물학적으로 불활성의 193개 아미노산 전구체로서 최초로 합성되고, T 세포 증식의 공동-자극, NK 세포 세포독성의 증강, T 세포 및 NK 세포에 의한 IFN-γ 생성의 유도 및 T 헬퍼 타입 1(Th1) 분화의 강화를 포함하는 생물학적 활성을 나타낸다. IL-18을 암호화하는 핵산은 GenBank 등록번호 NM_001562로서 입수가능하고, 폴리펩타이드 서열은 GenBank 등록번호 NP_001553으로 입수가능하다. 용어 사람 IL-18은 표준 재조합 발현 방법에 의해 제조할 수 있는 재조합체 사람 IL-18(rh IL-18)을 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "캐뱃(Kabat) 번호", "캐뱃 정의" 및 "캐뱃 표지"는 상호교환적으로 본원에서 사용된다. 이러한 용어는 당해 분야에서 인지되며 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기보다 더 가변적인(즉, 초가변성) 아미노산 잔기의 번호를 매기는 시스템을 의미한다[참조: Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391, 및 kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨]. 중쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1에 있어서 아미노산 31 내지 35 부위, CDR2에 있어서 아미노산 50 내지 65 부위, 및 CDR3에 있어서 아미노산 95 내지 102 부위의 범위이다. 경쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1에 있어서 아미노산 24 내지 34 부위, CDR2에 있어서 아미노산 50 내지 56 부위, 및 CDR3에 있어서 아미노산 89 내지 97 부위의 범위이다.

용어 "사람 항체"는 문헌[참조: Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Services, NIH Publication No. 91-3242]에 기술된 바와 같이 사람 배선 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 사람 항체는, 예를 들면, CDR 및 특히 CDR3에서, 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해서 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들면, 무작위 또는 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해서 또는 생체내 체세포성 돌연변이화에 의해서 도입된 돌연변이화)를 포함할 수 있다. 돌연변이화는 "선택적 돌연변이유발 방법"을 사용하여 도입된다. 사람 항체는 아미노산 잔기, 예를 들면, 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해서 암호화되지 않는 활성 증강 아미노산 잔기로 교체된 하나 이상의 부위를 가질 수 있다. 사람 항체는 최고 20개 부위까지 사람 배선 면역글로불린 서열의 일부가 아닌 아미노산 잔기로 교체시킬 수 있다. 다른 양태에서, 10개 이하, 5개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하의 부위가 교체된다. 바람직한 양태에서, 이러한 교체는 CDR 영역내에 존재한다. 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "사람 항체"는 마우스 같은 또 다른 포유동물 종의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 사람 골격 서열내로 이식되는 항체를 포함하지는 않는 것으로 의도된다.

문구 "선택적 돌연변이유발 방법"은 하나 이상의 선택적 돌연변이유발 부위, 초돌연변이 및/또는 접촉 부위에서 CDR 아미노산을 선택하고 각각 돌연변이시킴으로써 항체의 활성을 개선시키는 방법을 포함한다. "선택적으로 돌연변이된" 사람 항체는 선택적 돌연변이유발 방법을 사용하여 선택된 부위에 돌연변이를 포함하는 항체이다. 또 다른 양태에서, 선택적 돌연변이유발 방법은 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3(이하 각각 H1, H2 및 H3이라 함) 또는 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3(이하 각각 L1, L2 및 L3이라 함)에서 선택된 각각의 아미노산 잔기를 우선적으로 돌연변이시키는 방법을 제공하는 것으로 의도된다. 아미노산 잔기는 선택적 돌연변이유발 부위, 접촉 부위 또는 초돌연변이 부위로부터 선택될 수 있다. 개개 아미노산은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 내의 이들의 위치에 기초하여 선택된다. 초돌연변이 위치는 또한 접촉 영역일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 한 가지 양태에서, 선택적 돌연변이 방법은 "표적화 방법"이다. 어구 "표적화 방법"은 표적화 방식, 예를 들면, "그룹식(Group-wise) 표적화 방법" 또는 "CDR식(CDR-wise) 표적화 방법"으로 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 또는 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내의 선택된 개개 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 방법을 포함하는 것으로 의도된다. "그룹식 표적화 방법"에서, 개개 아미노산 잔기, 특히 그룹은 그룹 I(L3 및 H3 포함), 그룹 II(H2 및 L1 포함) 및 그룹 III(L2 및 H1 포함)을 포함하는 선택적 돌연변이에 대해 표적화되고, 당해 그룹은 표적화에 대한 기타 참조문헌에 수록되어 있다. "CDR식 표적화 방법"에서, 개개 아미노산 잔기, 특히 그룹은 다음과 같은 표적화 기준 순서로 선택적 돌연변이에 대해 표적화된다: H3, L3, H2, L1, H1 및 L2. 선택된 아미노산 잔기는, 예를 들면, 적어도 2개의 기타 아미노산 잔기에 대해 돌연변이되고, 항체의 활성에 대한 돌연변이의 효과가 측정된다. 활성은 항체의 결합 특이성/친화성 및/또는 항체의 중화 효능의 변화로서 측정된다. 선택적 돌연변이유발 방법은 파지 디스플레이를 포함하는 임의의 공급원, 즉 사람 IgG 배선 유전자를 갖는 유전자도입 동물로부터 유도된 임의의 항체, 즉 사람 B-세포로부터 분리된 사람 항체의 최적화를 위해 사용될 수 있다. 선택적 돌연변이유발 방법은 파지 디스플레이 기술을 사용하여 추가로 최적화될 수 없는 항체에 사용될 수 있다. 파지 디스플레이를 포함하는 임의의 공급원, 즉 사람 IgG 배선 유전자를 갖는 유전자도입 동물로부터 유도된 항체, 즉 사람 B-세포로부터 분리된 항체는 선택적 돌연변이유발 방법의 전후에 역돌연변이시킬 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

용어 "재조합 사람 항체"는 숙주 세포내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합 조합 사람 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 사람 면역글로불린 유전자에 대해서 형질전환되는 동물(예를 들면, 마우스)로부터 분리된 항체[참조: 예를 들면, Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨], 또는 사람 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것과 관련되는 모든 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체 같은 재조합 방법으로 제조, 발현, 생성 또는 분리된 사람 항체를 포함한다. 상기 재조합 사람 항체는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다[참조: Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Servies, NIH Publication No. 91-3242]. 그러나, 특정 양태에서, 상기 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발시켜(또는, 사람 Ig 서열을 형질전환시킨 동물을 사용하는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발), 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열이 사람 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되거나 이와 관련된 서열인 반면, 생체내에서 사람 항체 배선 레퍼토리내에 천연적으로 존재하지는 않을 것이다. 그러나, 특정 양태에서 상기 재조합 항체는 선택적인 돌연변이유발 방법 또는 역돌연변이화 또는 둘 모두의 결과이다.

"분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 실질적으로 포함하지 않는 항체(예를 들면, hIL-18에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 hIL-18 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 포함하지 않는다)를 포함한다. hIL-18에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종의 IL-18 분자에 결합할 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 포함하지 않을 수 있다.

"중화 항체"(또는 "hIL-18 활성을 중화시키는 항체")는 hIL-18의 생물학적 활성의 억제를 초래하는 hIL-18에 결합하는 항체를 포함한다. hIL-18의 생물학적 활성의 이러한 억제는 hIL-18 생물학적 활성의 하나 이상의 지표, 예를 들면, T 세포 또는 NK 세포에 의한 IFNγ 생성의 유도 또는 사람 IL-18 수용체 결합 분석에서 IL-18 수용체 결합의 억제를 측정함으로써 평가할 수 있다. hIL-18 생물학적 활성의 이들 지표는 당해 분야에 공지된 몇몇 표준 시험관내 또는 생체내 분석법 중의 하나 이상으로 평가할 수 있다.

용어 "활성"은 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화도, 예를 들면, IL-18 항원에 결합하는 항-hIL-18 항체 및/또는 항체의 중화 잠능 등의 활성을 포함하고, 예를 들면, hIL-18에 결합하는 항-hIL-18 항체는 hIL-18의 생물학적 활성을 억제, 예를 들면, PHA 모세포 증식을 억제 또는 사람 IL-18 수용체 결합 분석에서 수용체 결합을 억제한다.

용어 "표면 플라스몬 공명"은, 예를 들면, BIAcore 시스템(제조원: Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)을 사용하여, 생체센서 매트릭스내에서 단백질 농도의 변화를 검출함으로써 실시간 생체특이적인 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 포함한다. 추가의 기술에 대해서는 문헌[참조: Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Jonsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; 및 Johnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로 인용됨]을 참조한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "K_off"는 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리에 대한 오프 속도 상수를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "K_d"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미하는 것이다.

용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있지만, 이본쇄 DNA가 바람직하다.

hIL-18에 결합하는 항체 또는 항체 일부(예를 들면, VH, VL, CDR3)("분리된 항체" 포함)을 암호화하는 핵산에 대한 참조로 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분리된 핵산 분자"는, 항체 또는 항체 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 hIL-18 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 항체 일부를 암호화하는 다른 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않는 핵산 분자를 포함하며, 상기 다른 서열은 사람 게놈 DNA에서 상기 핵산에 천연적으로 플랭킹할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 항-IL-18 항체의 VH 영역을 암호화하는 본 발명의 분리된 핵산은 IL-18 이외의 항원에 결합하는 다른 VH 영역을 암호화하는 어떠한 다른 서열도 함유하지 않는다. 문구 "분리된 핵산 분자"는 또한 VH 및 VL 영역이 디아바디(diabody)의 서열 이외의 어떠한 다른 서열도 함유하지 않는 디아바디 같은 이가 이특이성 항체를 암호화하는 서열을 포함한다.

용어 "재조합 숙주 세포"(또는 단순히, "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 포함한다. 이는 상기 용어가 특정 당해 세포 뿐만 아니라 상기 세포의 자손 세포들도 의미하는 것으로 의도됨을 이해해야만 한다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해, 특정 변형이 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 상기 자손 세포들은 사실 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위내에 또한 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변형되는"은 항체 또는 이의 항원 결합부에서 하나 이상의 아미노산이 변화되는 것을 의미한다. 상기 변화는 하나 이상의 부위에서 아미노산의 부가, 치환 또는 결실에 의해서 생성될 수 있다. 상기 변화는 PCR 돌연변이유발 등의 공지된 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 참조된 값보다 대략 10 내지 20% 크거나 작은 범위를 의미하는 것으로 의도된다. 특정한 상황에서, 당업자는, 참조된 값의 성질에 기인하여, 용어 "약"이 당해 값으로부터 10 내지 20% 이상 벗어남을 의미할 수 있음을 인지할 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "바이러스 감소/불활성화"는 특정한 샘플에서 바이러스 입자 수의 감소("감소") 뿐만 아니라, 이로 한정되는 것은 아니지만, 특정한 샘플에서 바이러스 입자의 활성의 감소, 예를 들면, 감염성 또는 복제능의 감소("불활성화")를 의미하는 것으로 의도된다. 바이러스 입자의 수 및/또는 활성의 이러한 감소는 약 1 내지 약 99%, 바람직하게는 약 20 내지 약 99%, 보다 바람직하게는 약 30 내지 약 99%, 보다 바람직하게는 약 40 내지 약 99%, 보다 더 바람직하게는 약 50 내지 약 99%, 보다 더 바람직하게는 약 60 내지 99%, 보다 더 바람직하게는 약 70 내지 약 99%, 보다 더 바람직하게는 약 80 내지 약 99% 및 보다 더 바람직하게는 약 90 내지 약 99% 정도일 수 있다. 특정한 비제한적 양태에서, 경우에 따라, 정제된 항체 생성물 중의 바이러스의 양은 당해 바이러스의 ID50(표적 모집단의 50%를 감염시킬 수 있는 바이러스의 양)보다 작고, 바람직하게는 당해 바이러스의 ID50보다 10배 이상, 보다 바람직하게는 당해 바이러스의 ID50보다 100배 이상, 보다 더 바람직하게는 당해 바이러스의 ID50보다 1000배 이상 더 작다.

문구 "접촉 위치"는 26개의 공지된 항체-항원 구조체 중의 하나에서 항원을 접촉하는 아미노산에 의해 점유되는 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중의 아미노산 위치를 포함한다. 항체-항원 복합체의 26개 공지된 해석 구조체 내의 CDR 아미노산이 항원과 접촉하는 경우, 당해 아미노산은 접촉 위치를 점유하는 것으로 간주될 수 있다. 접촉 위치는 비접촉 위치보다 항원을 접촉하는 아미노산에 의해 점유될 가능성이 높다. 한 가지 양태에서, 접촉 위치는 26개 구조체 중 3개 초과(>1.5%)의 항원을 접촉하는 아미노산을 함유하는 CDR 위치이다. 또 다른 양태에서, 접촉 위치는 25개 구조체 중 8개 초과(>32%)의 항원을 접촉하는 아미노산을 함유하는 CDR 위치이다.

2. 항체 생성

본 단락에서 사용된 용어 "항체"는 완전 항체 또는 이의 항원 결합부를 의미한다.

본 명세서의 항체는 목적하는 항원을 사용한 동물의 면역화 후에 통상의 모노클로날 항체 방법, 예를 들면, 문헌[참조: Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495]의 표준 체세포 하이브리드화 기술을 포함하는 다양한 기술로 생성할 수 있다. 체세포 하이브리드화 공정이 원칙적으로 바람직하지만, 모노클로날 항체를 생성하는 다른 기술, 예를 들면, B 림프구의 바이러스 또는 종양원성 형질전환이 사용될 수도 있다.

하이브리도마를 제조하는 한 가지 바람직한 동물 시스템은 쥐 시스템이다. 하이브리도마 생성은 매우 잘 확립된 공정이다. 면역화 프로토콜 및 주입을 위한 면역화 비장세포의 분리 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 융합 파트너(예: 쥐 골수종 세포) 및 융합 공정도 또한 공지되어 있다.

항체는 바람직하게는 사람, 키메라 또는 사람화 항체일 수 있다. 본 명세서의 키메라 또는 사람화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 비사람 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 DNA는 목적하는 비사람 하이브리도마로부터 입수할 수 있고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-쥐(예: 사람) 면역글로불린 서열을 함유하도록 유전자 조작할 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체를 생성하기 위해, 당해 기술분야에 공지된 방법[참조: US 특허 제4,816,567호(Cabilly et al.)]을 사용하여 쥐 가변 영역을 사람 불변 영역에 결합시킬 수 있다. 사람화 항체를 생성하기 위해, 당해 분야에 공지된 방법[참조: US 특허 제5,225,539호(Winter), 및 US 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호(Queen et al.)]을 사용하여 쥐 CDR 영역을 사람 골격에 삽입할 수 있다.

한 가지 비제한적 양태에서, 본 명세서의 항체는 사람 모노클로날 항체이다. IL-18에 대해 지시된 이러한 사람 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 사람 면역계의 부분을 포함하는 유전자도입 또는 염색체도입 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이들 유전자도입 및 염색체도입 마우스는 HuMAb Mouse^R(Medarex, Inc.), KM Mouse^R(Medarex, Inc.) 및 XenoMouse^R(Amgen)로서 본원에 인용된 마우스를 포함한다.

더욱이, 사람 면역글로불린 유전자를 발현하는 또 다른 염색체도입 동물 시스템은 당해 기술분야에서 입수가능하고, 본 명세서의 항-IL-18 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 사람 중쇄 도입염색체 및 사람 경쇄 도입염색체를 포함하는 마우스("TC 마우스"라 함)를 사용할 수 있고, 이러한 마우스는 문헌[참조: Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 더욱이, 사람 중쇄 및 경쇄 도입염색체를 포함하는 소는 문헌[참조: Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20: 889-894 및 PCT 출원 번호 제WO 2002/092812]에 기재되어 있고, 본 명세서의 항-IL-18 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

항-IL-18 항체 또는 이의 결합부 또는 본원에 개시된 항-IL-18 관련 항체를 포함하는 본 발명의 재조합 사람 항체는 사람 림프구로부터 유도된 mRNA로부터 제조한 사람 VL 및 VH cDNA를 사용하여 제조한 재조합체 조합 항체 라이브러리, 예를 들면, scFv 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝에 의해 분리할 수 있다. 이러한 라이브러리를 제조 및 스크리닝하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 파지 디스플레이이 라이브러리를 생성하기 위한 상업적으로 입수가능한 키트(예: Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene surfZAP^TM 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 인용됨) 이외에, 항체 디스플레이 라이브러리의 생성 및 스크리닝에 특히 사용이 용이한 방법 및 시약의 예는 문헌[참조: Ladner et al. U.S. Patent No. 5,223,409; Kang et al. PCT Publication No. WO 92/18619; Dower et al. PCT Publication No. WO 91/17271; Winter et al. PCT Publication No. WO 92/20791; Markland et al. PCT Publication No. WO 92/15679; Breitling et al. PCT Publication No. WO 93/01288; McCafferty et al. PCT Publication No. WO 92/01047; Garrard et al PCT Publication No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al, Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al (1992) J MoI Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; 및 Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982; 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨]에서 발견할 수 있다.

본 명세서의 사람 모노클로날 항체는 또한 사람 면역 세포가 재구성되어 사람 항체 반응이 면역화로 생성될 수 있는 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들면, 윌슨(Wilson) 등의 미국 특허 제5,479,996호 및 제5,698,767호에 기재되어 있다.

한 가지 양태에서, 본 발명의 방법은 항-IL-18 항체 및 항체 일부, 항-IL-18 관련 항체 및 항체 일부, 및 항-IL-18 항체에 대한 등가의 특성, 예를 들면, 낮은 해리 동역학 및 높은 중화능으로 hIL-18에 대한 높은 친화성 결합을 갖는 사람 항체 및 항체 일부를 포함한다. 한 가지 양태에서, 본 발명은, 표면 플라스몬 공명으로 측정한 바에 의하면, 약 1×10^-8M 이하의 K_d 및 약 1×10^-3s^-1 이하의 K_off 속도 상수로 사람 IL-18로부터 해리되는 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부를 사용한 처리를 제공한다. 구체적인 비제한적 양태에서, 본 발명에 따라 정제된 항-IL-18 항체는 생리학적 조건하에 IL-18에 대한 ABT-325의 결합을 경쟁적으로 억제한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 항-IL-18 항체 또는 이의 단편은 개조될 수 있고, 여기서 항체의 불변 영역은 변형되어 비변형된 항체와 비교하여 하나 이상의 불변 영역 매개된 생물학적 작동인자 기능을 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 감소된 결합을 나타내도록 본 발명의 항체를 변형시키기 위해, 당해 항체의 면역글로불린 불변 영역 절편을 Fc 수용체(FcR) 상호작용에 필요한 특정 영역에서 돌연변이시킬 수 있다[참조: Canfield and Morrison (1991) J. Exp. Med. 173: 1483-1491; 및 Lund et al. (1991) J. of Immunol. 147: 2657-2662, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨]. 항체의 FcR 결합능의 감소는 또한 옵소닌화 및 식균작용 및 항원-의존성 세포 세포독성 등과 같은 FcR 상호작용에 의존하는 기타 작동인자 기능을 감소시킬 수 있다.

3. 항체 제조

본 발명의 항체를 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 DNA를 하나 이상의 발현 벡터에 삽입하여, 유전자를 전사 및 해독 조절 서열에 작동가능하게 연결시킨다(참조: 미국 특허 제6,914,128호, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨). 이와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 항체 유전자를 벡터에 연결시켜, 벡터내의 전사 및 해독 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 해독을 조절하는 의도된 기능을 하도록 함을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 적합하도록 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터에 삽입시킬 수 있거나, 보다 전형적으로는 2개의 유전자 모두 동일한 발현 벡터내에 삽입시킨다. 항체 유전자를 표준 방법(예를 들면, 상보적 제한 부위의 항체 유전자 단편 및 벡터 상에의 연결, 또는 제한 부위가 존재하지 않을 경우에는 평활 말단 연결)에 의해 발현 벡터내에 삽입시킨다. 항체 또는 항체 관련 경쇄 또는 중쇄 서열의 삽입 전에, 발현 벡터는 미리 항체 불변 영역 서열을 보유할 수 있다. 예를 들면, 항-IL-18 항체 또는 항-IL-18 항체 관련 VH 및 VL 서열을 전장 항체 유전자로 전환시키는 한가지 접근법은 이들을 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 각각 미리 암호화하는 발현 벡터내에 삽입시켜, VH 절편을 벡터내에서 CH 절편에 작동가능하게 연결시키고, VL 절편을 벡터내에서 CL 절편에 작동가능하게 연결시키는 것이다. 추가로 또는 대체적으로, 재조합 발현 벡터는 항체 쇄의 숙주 세포로부터의 분비를 용이하게 하는 시그널 펩타이드를 암호화한다. 항체 쇄 유전자를 벡터내로 클로닝시켜, 시그널 펩타이드를 항체 쇄 유전자의 아미노산 말단에 프레임내(in-frame) 연결시킬 수 있다. 시그널 펩타이드는 면역글로불린 시그널 펩타이드 또는 이종성 시그널 펩타이드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 시그널 펩타이드)일 수 있다.

항체 쇄 유전자 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포내에 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 보유한다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 해독을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 인자(예를 들면, 폴리아데닐화 시그널)을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은, 예를 들면, 문헌[참조: Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990), 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨]에 기술되어 있다. 조절 서열의 선택을 포함한 발현 벡터의 디자인은 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 바람직한 단백질 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위해 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포내에서 단백질 발현의 고 수준을 지시하는 바이러스성 인자, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들면, CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40(SV40)로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들면, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들면, 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마를 포함한다. 바이러스성 조절 인자 또는 이의 서열의 추가의 기술에 대해서는, 이의 전체 내용이 본원에서 참조로서 인용되는, 미국 특허 제5,168,062호(Stinski), 미국 특허 제4,510,245호(Bell et al.), 미국 특허 제4,968,615호(Schaffner et al.)를 참조한다.

항체 쇄 유전자 및 조절 서열 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들면, 숙주 세포내에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들면, 복제 오리진) 및/또는 선택가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다[참조: 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호(Axel et al.), 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨]. 예를 들면, 전형적으로는 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에서 약물, 예를 들면, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 제공한다. 적합한 선택가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭을 갖는 dhfr^- 숙주 세포내에서 사용하기 위해) 및 neo 유전자(G418 선택의 경우)를 포함한다.

본 발명의 항체 또는 항체 일부는 숙주 세포내에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조할 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포내에서 발현되도록, 바람직하게는 숙주 세포가 배양되는 배지내로 분비되어, 당해 배지로부터 항체가 회수될 수 있도록, 숙주 세포를 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 단편을 보유하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질감염시킨다. 표준 재조합 DNA 방법론을 이용하여, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이들 유전자를 재조합 발현 벡터내에 도입하고, 벡터를 문헌[참조: Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. et al., (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) 및 미국 특허 제4,816,397호 및 제6,914,128호(Bosset al.), 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨]에 기술된 바와 같은 숙주 세포내에 도입한다.

경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)를 표준 기법에 의해 숙주 세포내로 형질감염시킨다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA의 원핵 또는 진핵 숙주 세포로의 도입에 통상적으로 사용되는 다양한 기법, 예를 들면, 전기천공, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함함을 의미한다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포내에서 발현시키는 것이 이론적으로 가능하다 하더라도, 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포내에서의 항체의 발현이, 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다 적합하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블링하고 분비하기에 적합하기 때문에 가장 바람직하다. 항체 유전자의 원핵세포 발현은 활성 항체를 높은 수율로 제조하는데 비효과적인 것으로 보고되었다[참조: Boss and Wood (1985) Immunology Today 6:12-13, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨].

본원의 벡터 내에서 DNA를 클로닝 또는 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포는 상기한 원핵세포, 효모 또는 보다 고등 진핵 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들면, 그람-음성 또는 그람-양성 유기물, 예를 들면, 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae), 예를 들면, 에스케리키아(Escherichia)(예: 이. 콜라이(E. coli)), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬랄(Salmonella)(예: 살모넬라 티피무리움(Samonella typhimurium)), 세라티아(Serratia)(예: 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescans)) 및 시겔라(Shigella) 뿐만 아니라 바실리(Bacilli), 예를 들면, 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis)(예: 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 기재된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas)(예: 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces))를 포함한다. 한가지 적합한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294(ATCC 31,446)이지만, 기타 적합한 균주, 예를 들면, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776(ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110(ATCC 27,325)도 적합하다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다.

원핵생물 이외에, 진핵생물 미생물, 예를 들면, 사상 진균 또는 효모가 폴리펩타이드 암호화 벡터의 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 베이커 효모가 하등 진핵세포 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용되는 것이다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주, 예를 들면, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들면, 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프래길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 윅커라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스(K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스(K. Marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa); 슈와니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들면, 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 및 사상 진균, 예를 들면, 뉴로스로파(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼길루스(Aspergillus) 숙주, 예를 들면, 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)가 통상적으로 입수가능하고, 본원에 유용하다.

글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물체로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 배큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주로부터 상응하는 허용되는 곤충 숙주, 예를 들면, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(모충), 아에데스 아에기프티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(과일 파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들면, 오토그라파 칼리포니카(Autographa califormica) NPV의 L-1 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주는 공개적으로 입수가능하고, 이러한 바이러스는 본 발명에 따르는 바이러스, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염용 바이러스로서 사용될 수 있다. 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물도 또한 숙주로서 사용될 수 있다.

본 발명의 재조합 항체의 발현에 적합한 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(문헌[참조: Urlaub and Chasin, (1980) PNAS USA 77:4216-4220]에 기재되고 DHFR 선별 마커에 사용된 dhfr-CHO 세포, 예를 들면, 이의 전체 내용이 본원에서 참조로서 인용된 문헌[참조: Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 세포를 포함함), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포로 도입하는 경우, 항체는 숙주 세포에서 항체를 발현시키거나 당해 숙주 세포가 증식하는 배양 배지로 항체를 분비하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 사람 배아 신장 세포주(현탁 배지에서 증식시키기 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포; 참조: Graham et al., J. Gen Virol. 36-59(1977)); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216(1980)); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251(1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리칸 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 사람 경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2), 개과 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(참조: Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68(1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 사람 간세포암 세포주(Hep G2)이고, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용된다.

숙주 세포는 항체 생성을 위해 상기한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터의 유도, 형질전환체의 선별 또는 상기 서열을 암호화하는 유전자의 증폭을 위해 적절하게 변형시킨 통상의 영양 배지에서 배양한다.

항체의 생성에 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상업적으로 시판되는 배지, 예를 들면, Ham's F10^TM(Sigma), Minimal Essential Medium^TM((MEM), (Sigma), RPMI-1640(Sigma) 및 Dulbecco's Modified Eagle's Medium^TM((DMEM), Sigma)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌[참조: Ham et al., Meth. Enz. 58:44(1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255(1980), U.S. Pat. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195 또는 US. Pat. No. Re. 30,985]에 기재된 임의의 배지를 숙주 세포용 배양 배지로서 사용할 수 있고, 이의 전체 교시는 본원에서 참조로서 인용된다. 이들 임의 배지에는 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예: 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염(예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액(예: HEPES), 뉴클레오타이드(예: 아데노신 및 티미딘), 항생제(예: 젠타마이신 약물), 미량 원소(통상 마이크로몰 범위의 최종 농도를 제공하는 유기 화합물로서 정의됨) 및 글루코즈 또는 등가의 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 기타 임의 필수 보충물을 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 적절한 농도로 포함시킬 수 있다. 배양 조건, 예를 들면, 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대해 이미 사용된 것들이고, 당업자에게 명백할 것이다.

또한, 숙주 세포를 사용하여 완전한 항체, 예를 들면, Fab 단편 또는 scFv 분자의 부분을 생성할 수 있다. 상기 공정에 대한 변경은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 예를 들면, 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄(그러나 둘 다는 아님) 중의 하나를 암호화하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 사용하여 IL-18, 특히 hIL-18에의 결합에 필수적이지 않은 경쇄 및 중쇄 중의 어느 하나 또는 둘 다를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거할 수 있다. 또한, 이러한 절두된 DNA 분자로부터 발현된 분자는 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 하나의 중쇄와 하나의 경쇄가 본 발명의 항체이고 다른 중쇄 및 경쇄가 본 발명의 항체를 표준 화학 가교결합 방법으로 제2 항체에 가교결합시킴으로써 IL-18 이외의 항원에 특이적인 이작용성 항체를 제조할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부의 재조합체 발현에 적합한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 인산칼륨 매개된 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포에 도입한다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄는 각각 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자에 작동가능하게 결합되어 유전자의 고도의 전사를 유도한다. 또한, 재조합 발현 벡터는 DHFR 유전자를 포함하고, 이는 메토트렉세이트 선별/증폭을 사용하여 벡터로 형질감염시킨 CHO 세포의 선별을 가능하게 한다. 선별된 형질전환체 숙주 세포를 배양하여 항체 중쇄 및 경쇄를 발현시키고, 완전한 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 회수하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수한다.

재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포질막 주위 공간에서 세포내에서 생성되거나 배지로 직접 분비될 수 있다. 한 가지 양태에서, 항체가 세포내에서 생성되는 경우, 제1 단계로서, 미립자 파편, 숙주 세포 또는 용해된 세포(예: 균질화 유도)를, 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 상업적으로 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들면, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축시킬 수 있다.

본 발명의 방법에 앞서, 세포 파편으로부터의 항체의 정제 공정은 항체의 발현 부위에 처음 의존한다. 일부 항체는 세포로부터 주변의 증식 배지 내로 직접 분비될 수 있고, 다른 항체는 세포 내에서 제조된다. 후자의 항체에 있어서, 정제 공정의 제1 단계는 통상 세포의 용해를 수반하고, 이는 기계적 절단, 삼투압 충격 또는 효소적 처리를 포함하는 다양한 방법으로 수행할 수 있다. 이러한 붕괴는 세포의 전체 내용물을 균질물로 방출하고, 또한 이들의 작은 크기로 인해 제거가 곤란한 아세포 단편을 생성한다. 이들은 일반적으로 시차 원심분리 또는 여과에 의해 제거한다. 항체가 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 상업적으로 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들면, 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 장치를 사용하여 먼저 농축시킨다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 재조합 숙주 세포는 또한, 예를 들면, 접선 유동 여과에 의해 세포 배양 배지로부터 분리할 수 있다. 항체는 본 발명의 항체 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 추가로 회수할 수 있다.

4. 항체 정제

4.1 항체 정제 일반

본 발명은 항체 및 적어도 하나의 HCP를 포함하는 혼합물로부터 정제된(또는 "HCP 감소된") 항체 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 정제 방법은, 상기한 방법 및 당해 기술분야의 통상의 방법을 사용하여 항체가 생성되는 경우, 분리 단계에서 개시한다. 당해 기술분야에서 통상적으로, 항체-HCP 혼합물은 최초 정제 단계로서 단백질 A 포획(예: 단백질 A 컬럼)으로 처리하는데, 이는 항체는 단백질 A에 결합하고 HCP는 관류되기 때문이다. 본 발명의 정제 방법은 항체와 적어도 하나의 HCP를 포함하는 혼합물을 최초 단계로서 또는 정제 방법의 임의의 단계로서 단백질 A 포획(예: 단백질 A 컬럼)으로 처리할 필요가 없다는 이점을 갖는다. 표 1은 정제 도식의 한 가지 양태를 요약한 것이다. 이러한 도식의 변형은 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 간주된다.

정제 단계	목적
1차 회수	샘플 매트릭스의 정화
양이온 교환 크로마토그래피	항체 포획, 숙주 세포 단백질 및 관련 불순물 감소
한외여과/정용여과	농축 및 완충액 교환
음이온 교환 크로마토그래피	숙주 세포 단백질 및 DNA의 감소
Phenyl Sepharose HP 크로마토그래피	항체 응집체 및 숙주 세포 단백질의 감소
바이러스 여과	존재하는 경우, 거대 단백질의 제거
최종 한외여과/정용여과	항체 농축 및 제형화

항체를 포함하는 정화 용액 및 혼합물이 수득되는 경우, HCP 등과 같이 세포에 의해 생성된 다른 단백질로부터 항체의 정제는 이온 교환 분리 단계(들) 및 소수성 상호작용 분리 단계(들)를 포함하는 상이한 정제 기술의 조합을 사용하여 수행한다. 분리 단계는 단백질의 혼합물을 이들의 전하, 소수성 정도 또는 크기에 따라 분리한다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 분리는 양이온, 음이온 및 소수성 상호작용을 포함하는 크로마토그래피를 사용하여 수행한다. 몇몇 상이한 크로마토그래피 수지가 각각의 이들 기술에 이용가능하고, 이는 수반된 특정 단백질에 대한 정제 도식의 정확한 조정을 가능하게 한다. 각 분리 방법의 정수는 단백질이 컬럼 하부로 상이한 속도로 이동하거나(이는 이들이 컬럼 하부로 추가로 통과함에 따라 증가하는 물리적 분리를 달성한다) 분리 매질에 선택적으로 부착한 다음 상이한 용매에 의해 상이하게 용출되도록 한다는 것이다. 몇몇 경우에, 항체는, 불순물이 특히 컬럼에 부착하고 항체가 부착하지 않는, 즉 항체가 관류물에 존재하는 경우에 불순물로부터 분리된다.

상기 주시한 바와 같이, 정제 도식의 정확한 조정은 정제되는 단백질에 의존한다. 특정한 양태에서, 본 발명의 분리 단계는 하나 이상의 HCP로부터 항체를 분리하기 위해 사용된다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 성공적으로 정제될 수 있는 항체는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 사람 IgA₁, IgA₂, IgD, IgE, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄ 및 IgM 항체를 포함한다. 특정한 양태에서, 본 발명의 정제 방법은 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 사용을 제외한다. 이러한 양태는 IgG₃ 항체가 단백질 A에 비효율적으로 결합하는 것으로 공지되어 있기 때문에 IgG₃ 항체의 정제에 특히 유용하다. 정제 도식의 특정한 조정을 가능하게 하는 다른 요인은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, Fc 영역의 존재 또는 부재(예: 이의 Fab 단편과 비교된 전장 항체와 관련하여); 목적하는 항체의 생성에 사용된 특정 배선 서열; 및 항체의 아미노산 조성(예를 들면, 분자의 전체 전하/소수성 뿐만 아니라 항체의 1차 서열)을 포함한다. 하나 이상의 특성을 공유하는 항체는 당해 특성의 이점을 취하도록 조정된 정제 방법을 사용하여 정제할 수 있다.

4.2 1차 회수

본 발명의 정제 방법의 최소 단계는 샘플 매트릭스로부터 항-IL-18 항체를 정화하고 1차 회수하는 제1 상을 수반한다. 또한, 1차 회수 공정은 샘플 매트릭스에 존재할 수 있는 바이러스를 불활성화시키는 시점일 수 있다. 예를 들면, 다양한 바이러스 불활성화 방법 중의 하나 이상을 열 불활성화(저온 살균), pH 불활성화, 용매/세제 처리, UV 및 γ-선 조사 및 특정 화학적 불활성화제, 예를 들면, β-프로피오락톤 또는 미국 특허 제4,534,972호(이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨)와 같은 구리 페난트롤린의 첨가를 포함하는 정제의 1차 회수 상 동안 사용할 수 있다. 본 발명의 특정한 양태에서, 샘플 매트릭스는 1차 회수 상 동안 pH 바이러스 불활성화에 노출된다.

pH 바이러스 불활성화 방법은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 낮은 pH에서 소정 시간 동안 혼합물을 항온처리하고, 이어서 pH를 중화시키고, 여과에 의해 미립자를 제거하는 것을 포함한다. 특정한 양태에서, 혼합물은 pH 2 내지 5, 바람직하게는 pH 3 내지 4, 보다 바람직하게는 pH 3.5에서 항온처리할 수 있다. 샘플 혼합물의 pH는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 시트르산, 아세트산, 카프릴산 또는 기타 적합한 산을 포함하는 임의의 적합한 산으로 저하시킬 수 있다. pH 수준의 선택은 주로 항체 생성물의 안정성 프로파일 및 완충액 성분에 의존한다. 낮은 pH 바이러스 불활성화 동안 표적 항체의 성질은 pH 및 낮은 pH의 항온처리 기간에 영향을 받는 것으로 공지되어 있다. 특정한 양태에서, 낮은 pH 항온처리는 0.5시간 내지 2시간, 바람직하게는 0.5시간 내지 1.5시간이고, 보다 바람직하게는 당해 기간은 1시간일 것이다. 바이러스 불활성화는, 고농도에서 불활성화를 감소시킬 수 있는 단백질 농도 이외에 이들 동일한 파라미터에 의존한다. 따라서, 단백질 농도, pH 및 불활성화 기간의 적절한 파라미터는 바이러스 불활성화의 목적하는 수준을 달성하기 위해 선택될 수 있다.

특정한 양태에서, 바이러스 불활성화는 적합한 필터를 사용하여 달성할 수 있다. 적합한 필터의 비제한적 예는 Ultipor DV50^TM 필터(Pall Corporation사 제조)이다. 본 발명의 특정한 양태가 1차 회수 상 동안 이러한 여과를 사용하더라도, 다른 양태에서는 끝에서 두번째 또는 최종 정제 단계로서 포함하는 정제 단계의 다른 상이 사용된다. 특정한 양태에서, 대체 필터, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, Viresolve^TM 필터(Millipore, Billerica, Mass.); Zeta Plus VR^TM 필터(CUNO; Meriden, Conn.) 및 Planova^TM 필터(Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, Ill.)를 바이러스 불활성화에 사용할 수 있다.

바이러스 불활성화가 사용되는 이들 양태에서, 샘플 혼합물은, 필요한 경우, 추가의 정제 단계를 위해 조정될 수 있다. 예를 들면, 낮은 pH 바이러스 불활성화 후, 샘플 혼합물의 pH는 정제 공정의 계속 전에 통상적으로 보다 중성의 pH(예: 약 5.0 내지 약 8.5)로 조정된다. 추가로, 혼합물은 목적하는 전도성을 수득하기 위해 주사용수(WFI)로 세정할 수 있다.

특정한 양태에서, 1차 회수는 하나 이상의 원심분리 단계를 포함하여 샘플 매트릭스를 추가로 정화하고, 이에 의해 항-IL-18 항체의 정제를 보조할 수 있다. 샘플의 원심분리는, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 7000×g 내지 약 12,750×g에서 수행할 수 있다. 대규모 정제와 관련하여, 이러한 원심분리는, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 생성 상청액에서 150 NTU의 혼탁도 수준을 달성하기 위해 유속 설정으로 온-라인 수행할 수 있다. 이어서, 이러한 상청액은 추가의 정제를 위해 수집할 수 있다.

특정한 양태에서, 1차 회수는 하나 이상의 심층 여과 단계의 사용을 포함하여 샘플 매트릭스를 추가로 정제하고, 이에 의해 항-IL-18 항체의 정제를 보조할 수 있다. 심층 여과는 등급화 밀도를 갖는 여과 매질을 포함한다. 이러한 등급화 밀도는, 보다 큰 입자는 필터 표면 부근에 포획되도록 하고, 보다 작은 입자는 필터의 중심에 더 가까운 보다 작은 개구에 포획되는 경우에만 필터의 표면에서 보다 큰 개구 부분을 통과하도록 한다. 특정한 양태에서, 심층 여과 단계는 탈지질 심층 여과 단계일 수 있다. 특정한 양태가 1차 회수 상 동안에만 심층 여과 단계를 사용하는 경우에도, 다른 양태는 하나 이상의 추가의 정제 상 동안 탈지질 심층 필터를 포함하는 심층 필터를 사용한다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 심층 필터의 비제한적 예는 Cuno^TM 모델 30/60ZA 심층 필터(3M Corp.) 및 0.45/0.2㎛ Sartopore^TM 이층 필터 카트리지를 포함한다.

4.3 이온 교환 크로마토그래피

특정한 양태에서, 본 발명은 항체를 포함하는 용출물이 수득되도록 항체와 적어도 하나의 HCP를 포함하는 혼합물을 하나 이상의 이온 교환 분리 단계로 처리함으로써 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 이온 교환 분리는 2개 물질이 이들의 각 이온 전하의 차이에 기초하여 분리되는 임의의 방법을 포함하며, 양이온 교환 물질 또는 음이온 교환 물질을 사용할 수 있다.

양이온 교환 물질 대 음이온 교환 물질의 사용은 단백질의 전체 전하에 기초한다. 따라서, 양이온 교환 단계의 사용 전의 음이온 교환 단계의 사용 또는 음이온 교환 단계의 사용 전의 양이온 교환 단계의 사용도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 추가로, 양이온 교환 단계 또는 음이온 교환 단계를 단독으로 사용하거나 이들 둘의 연속 조합을 사용하는 것도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

분리의 수행에 있어서, 최초 항체 혼합물은 다양한 기술, 예를 들면, 배치식 정제 기술 또는 크로마토그래피 기술을 사용하여 이온 교환 물질과 접촉시킬 수 있다.

예를 들면, 배치식 정제와 관련하여, 이온 교환 물질은 목적하는 출발 완충액 속에서 또는 이와 평형으로 제조된다. 제조 또는 평형화시키면, 이온 교환 물질의 슬러리가 수득된다. 항체 용액을 슬러리와 접촉시켜 분리될 항체를 이온 교환 물질에 흡수시킨다. 이온 교환 물질에 결합하지 않는 HCP를 포함하는 용액은, 예를 들면, 슬러리를 정치시키고 상청액을 제거함으로써 당해 슬러리로부터 분리한다. 당해 슬러리를 하나 이상의 세척 단계로 처리할 수 있다. 경우에 따라, 당해 슬러리를 고전도성의 용액과 접촉시켜, 이온 교환 물질에 결합된 HCP를 흡수시킬 수 있다. 결합된 폴리펩타이드를 용출시키기 위해, 완충액의 염 농도를 증가시킬 수 있다.

또한, 이온 교환 크로마토그래피는 이온 교환 분리 기술로서 사용할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 분자의 전체 전하 사이의 차이에 기초하여 분자를 분리시킨다. 항체의 정제에 있어서, 당해 항체는 결합을 위해 이온 교환 물질(예: 수지)에 부착된 작용성 그룹의 전하와 반대의 전하를 가져야 한다. 예를 들면, 이의 pI보다 낮은 완충액 pH에서 전체 양성 전하를 일반적으로 갖는 항체는 음성 하전된 작용성 그룹을 함유하는 양이온 교환 물질에 양호하게 결합할 것이다.

이온 교환 크로마토그래피에 있어서, 용질 표면 상의 하전된 패치는 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 반대 전하에 의해 부착되고, 단 주위 완충액의 이온 강도는 낮다. 용출은 일반적으로 완충액의 이온 강도(즉, 전도성)를 증가시켜 이온 교환 매트릭스의 하전된 부위에 대해 용질과 경쟁함으로써 일반적으로 달성된다. 전도성 또는 pH의 변화는 점진적(구배 용출) 또는 단계식(단계 용출)으로 이루어질 수 있다.

음이온 또는 양이온 치환체가 물질에 부착하여 크로마토그래피용 음이온 또는 양이온 지지체를 형성할 수 있다. 음이온 교환 치환체의 비제한적 예에는 디에틸아미노에틸(DEAE), 4급 아미노에틸(QAE) 및 4급 아민(Q) 그룹이 포함된다. 양이온 교환 치환체에는 카복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)가 포함된다. 셀룰로즈 이온 교환 수지, 예를 들면, DE23^TM, DE32^TM, DE52^TM, CM-23^TM, CM-32^TM 및 CM-52^TM은 와트만 리미티드(Whatman Ltd., Maidstone, Kent, U.K.)사로부터 시판되고 있다. 세파덱스(SEPHADEX^R)-기반 및 -가교결합된 이온 교환제도 또한 공지되어 있다. 예를 들면, DEAE-, QAE-, CM- 및 SP-SEPHADEX^R 및 DEAE-, Q-, CM- 및 S-SEPHAROSE^R 및 SEPHAROSE^R Fast Flow는 파마시아 에이비(Pharmacia AB)로부터 시판되고 있다. 추가로, DEAE 및 CM 유도된 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체, 예를 들면, TOYOPEARL^TM DEAE-650S 또는 M 및 TOYOPEARL^TM CM-650S 또는 M은 토소 하스 캄파니(Toso Haas Co., Philadelphia, Pa)로부터 시판되고 있다.

항체와 불순물(예: HCP)을 포함하는 혼합물을 이온 교환 컬럼, 예를 들면, 양이온 교환 컬럼에 로딩한다. 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 당해 혼합물을 사용된 컬럼에 따라 약 80g 단백질/L 수지의 로딩량으로 로딩할 수 있다. 적합한 양이온 교환 컬럼의 예는 직경 80cm × 길이 23cm 컬럼이고, 이의 상 용적은 약 116L이다. 이러한 양이온 컬럼에 로딩된 혼합물은 후속적으로 세척 완충액(평형 완충액)으로 세척할 수 있다. 이어서, 항체를 컬럼으로부터 용출시키고, 1차 용출물을 수득한다.

이러한 이온 교환 단계는 HCP 등의 불순물을 감소시키면서 목적하는 항체의 포획을 촉진한다. 특정한 양태에서, 이온 교환 컬럼은 양이온 교환 컬럼이다. 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 이러한 양이온 교환 컬럼에 적합한 수지는 CM HyperDF 수지이다. 이들 수지는 폴 코포레이션(Pall Corporation) 등의 상업적 공급원으로부터 시판되고 있다. 이러한 양이온 교환 공정은 실온 또는 실온 근방에서 수행할 수 있다.

4.4 한외여과 / 정용여과

본 발명의 특정한 양태는 한외여과 및/또는 정용여과 단계를 사용하여 항-IL-18 항체 샘플을 추가로 정제 및 농축시키고, 한외여과는 문헌[참조: Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman and A. Zydney(Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996)] 및 문헌[참조: Ultrafiltration Handbook, Munir CherYan(technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762-459-9]에 상세히 기재되어 있다. 바람직한 여과 공정은 문헌[참조: Millipore catalogue entiltled "Pharmaceutical Process Filtration Cataloque" pp. 177-202(Bedford, Mass., 1995/96)]에 기재된 바와 같은 접선 유동 여과이다. 한외여과는 일반적으로 0.1㎛보다 작은 공극 크기를 갖는 필터를 사용하는 여과를 의미한다. 이러한 작은 공극 크기를 갖는 필터를 사용함으로써, 샘플 용적은 항-IL-18 항체를 유지하면서 필터를 통한 샘플 완충액의 투과를 감소시킨다.

정용여과는 염, 당, 비수성 용매를 제거 및 교환하고, 결합된 종으로부터 유리된 종을 분리하며, 저분자량 물질을 제거하거나 이온성 및/또는 pH 환경의 신속한 변화를 유발하기 위해 한외여과기를 사용하는 방법이다. 이러한 미세용질은 용질을 한외여과 속도와 동등한 속도로 한외여과되는 용액에 첨가함으로써 가장 효율적으로 제거된다. 이는 미세종을 용액으로부터 일정한 속도로 세척하고, 체류된 항체를 효율적으로 정제한다. 본 발명의 특정한 양태에 있어서, 정용여과 단계는, 항체 제제로부터 불순물을 제거하기 위해서 뿐만 아니라, 임의로 추가의 크로마토그래피 또는 기타 정제 단계 전에, 본 발명과 결합하여 사용된 다양한 완충액을 교환하기 위해 사용된다.

4.5 소수성 상호작용 크로마토그래피

본 발명은 또한 소수성 상호작용 분리 단계를 추가로 포함하여 항체와 적어도 하나의 HCP를 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 예를 들면, 이온 교환 컬럼으로부터 수득된 1차 용출물을 소수성 상호작용 물질로 처리하여, 감소된 수준의 HCP를 갖는 2차 용출물을 수득한다. 본원에 기재된 바와 같은 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계는 일반적으로 단백질 응집체, 예를 들면, 항체 응집체 및 공정 관련 불순물을 제거하기 위해 수행된다.

당해 분리의 수행에 있어서, 샘플 혼합물은, 예를 들면, 배치식 정제 기술 또는 컬럼을 사용하여 HIC 물질과 접촉시킨다. HIC 정제 전에, 예를 들면, 예비-컬럼을 통해 혼합물을 통과시킴으로써 임의의 카오트로픽제(chaotropic agent) 또는 고도의 소수성 물질을 제거하는 것이 바람직하다.

예를 들면, 배치식 정제와 관련하여, HIC 물질은 목적하는 평형 완충액에서 또는 이와 평형으로 제조된다. HIC 물질의 슬러리를 수득한다. 항체 용액을 슬러리와 접촉시켜 분리될 항체를 HIC 물질에 흡수시킨다. HCP 물질에 결합하지 않는 HCP를 포함하는 용액을, 예를 들면, 슬러리를 침전시키고 상청액을 제거함으로써 당해 슬러리로부터 분리한다. 슬러리를 1회 이상의 세척 단계로 처리할 수 있다. 경우에 따라, 슬러리를 보다 낮은 전도성의 용액과 접촉시켜 HIC 물질에 결합한 항체를 흡수시킬 수 있다. 결합된 항체를 용출시키기 위해, 염 농도를 감소시킬 수 있다.

이온 교환 크로마토그래피는 이들을 분리하기 위한 항체의 전하에 의존하지만, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 항체의 소수성을 이용한다. 항체 상의 소수성 그룹은 컬럼 상의 소수성 그룹과 상호작용한다. 보다 소수성일수록, 단백질은 컬럼과 보다 강력하게 상호작용할 것이다. 따라서, HIC 단계는 숙주 세포 유도된 불순물(예를 들면, DNA 및 기타 고분자량 및 저분자량 생성물 관련 종)을 제거한다.

소수성 상호작용은 고도의 이온 강도에서 가장 강력하고, 따라서 이러한 형태의 분리는 염 침전 또는 이온 교환 공정 후에 편리하게 수행된다. HIC 컬럼에 대한 항체의 흡수는 높은 염 농도가 양호하지만, 실제 농도는 항체의 성질 및 선택된 특정 HIC 리간드의 성질에 따라 광범위하게 달라질 수 있다. 이온들이 소수성 상호작용을 촉진하거나(염석 효과) 물의 구조를 파괴하고(카오트로픽 효과) 소수성 상호작용의 약화를 유도하는지에 따라 다양한 이온은 소위 소용질성(soluphobic) 계열로 정렬될 수 있다. 양이온은 염석 효과의 증가 측면에서 Ba⁺⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺, Li⁺, Cs⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺, NH₄ ⁺로서 정렬되고, 음이온은 카오트로픽 효과의 증가 측면에서 PO^--, SO₄ ^--, CH₃CO₃ ^-, Cl^-, Br^-, NO₃ ^-, ClO₄ ^-, I^-, SCN^-로서 정렬될 수 있다.

일반적으로, Na, K 또는 NH₄ 설페이트는 HIC에서 리간드-단백질 상호작용을 촉진시킨다. 다음 관계로 제시된 바와 같이 상호작용의 강도에 영향을 주는 염이 제형화될 수 있다: (NH₄)₂SO₄ > Na₂SO₄ > NaCl > NH₄Cl > NaBr > NaSCN. 일반적으로, 약 0.75 내지 약 2M 황산암모늄 또는 약 1 내지 4M NaCl의 염 농도가 유용하다.

HIC 컬럼은 통상적으로 소수성 리간드(예: 알킬 또는 아릴 그룹)이 커플링되는 기재 매트릭스(예: 가교결합된 아가로즈 또는 합성 공중합체 물질)을 포함한다. 적합한 HIC 컬럼은 페닐 그룹으로 치환된 아가로즈 수지(예: Phenyl Sepharose^TM 컬럼)를 포함한다. 다수의 HIC 컬럼은 상업적으로 시판되고 있다. 이의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 낮거나 높은 치환도를 갖는 Phenyl Sepharose^TM 6 Fast Flow 컬럼(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Phenyl Sepharose^TM High Performance 컬럼(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Swenden); Octyl Sepharose^TM High Performance 컬럼(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Fractogel^TM EMD Propyl 또는 Fractogel^TM EMD Phenyl 컬럼(E. Merck, Germany); Macro-Prep^TM Methyl 또는 Macro-Prep^TM t-Butyl Support(Bio-Rad, California); WP HI-Propyl(C₃)^TM 컬럼(J.T. Baker, New Jersey) 및 Toyopearl^TM Ether, Phenyl 또는 Butyl 컬럼(TosoHaas, PA)이 포함된다.

4.6 예시적 정제 방법

특정한 양태에서, 1차 회수는 생성 생물반응기 산물로부터 세포 및 세포 파편(HCP 포함)을 제거하기 위해 pH 저하, 원심분리 및 여과 단계를 순차로 사용함으로써 진행시킬 수 있다. 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 이러한 1차 회수는 먼저 원심분리(6900×g) 및 pH 저하에 의해 숙주 세포를 제거하고 원심분리(12750×g) 및 심층 여과에 의해 최종 정화시킴으로써 달성될 수 있다. 특정한 양태에서, 항체 및 매질을 포함하는 배양물은 약 20℃에서 약 1 내지 1.5시간 동안 약 3.5 내지 약 4.0의 pH를 사용하여 pH 불활성화로 처리할 수 있다. pH 저하는 공지된 산 제제, 예를 들면, 시트르산, 3M 시트르산, 인산, 아세트산, 포름산 등을 사용하여 촉진시킬 수 있다. 이러한 pH 저하는, 완전히 제거하지는 않지만, pH 민감성 바이러스 오염을 감소/불활성화시키고, 일부 배지 및 숙주 세포 오염물을 침전시킨다. 이러한 저하 후, 산성화된 산물의 pH는 수산화나트륨(예: 3M 수산화나트륨) 등의 염기를 사용하여 약 4.5 내지 약 5.5로 조정하고, 약 16 내지 24시간 동안 약 8℃에서 유지시킬 수 있다. 16 내지 24시간의 기간 후, 온도를 약 20℃로 조정할 수 있다. pH 조절된 배양물은 대략 12,750×g에서 원심분리할 수 있다. 이어서, 생성된 샘플 상청액을, 예를 들면, 약 0.2 내지 약 0.8㎛ 범위의 정상 공극 크기의 3개의 12인치 Cuno^TM 모델 60ZA 심층 필터에 고정된 하나의 3×12" 필터 하우징 및 3개의 30"-0.22㎛ 소수성 필터 카트리지에 고정된 하나의 3×30" 필터 하우징을 포함하는 필터 트레인에 통과시킬 수 있다. 다른 적합한 필터 시스템은 상업적으로 시판되고 있고, 본 발명의 범위에 포함된다. 당업자는 상기 인용된 조건을 달리할 수 있고 이들도 본 발명의 범위 내에 포함됨에 주목해야 한다.

특정한 양태에서, 정화된 상청액은 양이온 교환 컬럼을 사용하여 추가로 정제된다. 특정한 양태에서, 평형 완충액은 pH 약 5.0의 완충액이다. 적합한 완충액의 비제한적 예는 65nM NaCl(pH 5.0)을 포함하는 약 20mM 나트륨 시트레이트/시트르산이다. 평형화 후, 컬럼에 상기 1차 회수 단계에서 제조된 샘플을 로딩한다. 이어서, 컬럼은 평형 완충액을 사용하여 세척한다. 이어서, 컬럼은 평형 완충액과 비교하여 보다 큰 이온 강도를 갖는 완충액을 사용하는 용출 단계로 후속 처리한다. 예를 들면, 적합한 용출 완충액은 약 20mM 나트륨 시트레이트/시트르산, 300mM NaCl(pH 5.0)일 수 있다. 항-IL-18 항체를 용출시키고, OD_280nm로 설정된 UV 분광계를 사용하여 모니터링할 수 있다. 특정한 예에서, 컬럼 용출물은 흡광이 3 초과의 OD_280nm에서 일어나고 대략 2의 OD_280nm까지 지속됨에 따라 수집될 수 있다. 당업자는 당해 조건이 달라질 수 있고 이들도 본원 발명에 포함됨을 이해해야 한다.

특정한 양태에서, 양이온 교환 용출물은, 예를 들면, 30kD MW 컷오프 필터를 사용하여 여과한다. 이러한 여과 단계에 적합한 필터는, 예를 들면, 밀리포어 30kD 분자량 컷-오프(MWCO) 셀룰로즈 한외여과기 막 카세트이다. 한외여과는 용출물이, 예를 들면, 30mg/mL의 최종 목적 농도에 도달할 때까지 지속할 수 있다. 이어서, 당해 여과액은 적절한 완충액을 사용하여 정용여과할 수 있다. 적절한 완충액의 예는 20mM 인산나트륨 및 150mM 염화나트륨(pH 대략 7.0)이다.

특정한 양태에서, 상기 포획 여과 단계로부터의 샘플은 음이온 교환 크로마토그래피 단계와 같은 2차 이온 교환 분리로 처리한다. 또는, 양이온 교환 용출물은 양이온 교환 용출물이 적절한 완충액으로 평형화되는 음이온 교환 크로마토그래피로 처리할 수 있다. 이러한 음이온 교환 단계는 숙주 세포 단백질 및 DNA 등의 핵산 등의 공정 관련 불순물을 감소시킨다. 이러한 이온 교환 단계는 목적하는 항체가 컬럼의 고체 상, 예를 들면, Q Sepharose^TM와 상호작용하지 않거나 결합하지 않는 크로마토그래피의 관류 방식이다. 그러나, 다수의 불순물은 사실 컬럼의 고체 상과 상호작용하고 이에 결합할 것이다. 음이온 교환은 약 12℃에서 수행할 수 있다.

이러한 단계에 적합한 컬럼의 비제한적 예는 Q Sepharose^TM Fast Flow(GE Healthcare, Piscatway, NJ) 등의 음이온 교환 수지로 충전된 것이다. 당해 컬럼은 트롤아민/염화나트륨 등의 적절한 완충액의 다중(예: 약 5 내지 7) 컬럼 용적을 사용하여 평형화시킬 수 있다. 적절한 조건의 예는 pH 8.0의 약 40mM 염화나트륨을 갖는 약 25mM 트롤아민을 포함한다. 또한, 당업자는 당해 조건을 변화시킬 수 있고, 이들도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 요약된 UF/DF 단계로부터의 수집된 샘플을 2용적의 50mM 트롤아민(pH 8)로 희석시키고, 음이온 교환 컬럼에 로딩한다. 또 다른 양태에서, 당해 컬럼은 pH 및 전도성 조절 후 양이온 교환 동안 수집된 용출물로부터 로딩된다. 컬럼의 로딩 후, 당해 컬럼을 평형 완충액으로 세척한다. 항-IL-18 항체를 포함하는 관류물은 OD_280nm에서 UV 분광계를 사용하여 모니터링할 수 있다. 특정한 예에서, 용출 수집은 상부측 0.4 OD_280nm로부터 하부측 0.6 OD_280nm까지 존재할 수 있다.

본 발명은 또한, 소수성 상호작용 분리 단계를 추가로 포함하는, 항체와 적어도 하나의 HCP를 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제를 제조하는 방법을 특징으로 하고, 여기서 이온 교환 관류물은 감소된 수준의 HCP를 갖는 2차 용출물이 수득되도록 소수성 상호작용 물질로 처리된다.

분리의 수행에 있어서, 샘플 혼합물은, 예를 들면, 배치식 정제 기술 및 컬럼을 사용하여 HIC 물질과 접촉시킨다. HIC 정제 전에, 카오트로픽제 또는 고도의 소수성 물질을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 배치식 정제에 있어서, HIC 물질은 목적하는 평형 완충액에서 제조되거나 당해 완충액에 대해 평형화시킨다. HIC 물질의 슬러리가 수득된다. 항체 용액을 슬러리와 접촉시켜, 분리될 항체를 HIC 물질에 흡착시킨다. HIC 물질에 결합하지 않는 HCP를 포함하는 용액은, 예를 들면, 당해 슬러리를 침전시키고 상청액을 제거함으로써 슬러리로부터 분리된다. 당해 슬러리는 하나 이상의 세척 단계로 처리할 수 있다. 경우에 따라, 당해 슬러리를 보다 낮은 전도성의 용액과 접촉시켜, HIC 물질에 결합된 항체를 흡수시킬 수 있다. 결합된 항체를 용출시키기 위해, 염 농도를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 특정한 양태에서, 항-IL-18 항체를 함유하는 샘플은 소수성 상호작용 분리 단계를 사용하여 추가로 처리할 수 있다. 특정한 양태에서, 소수성 상호작용 분리 단계는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계를 포함할 것이다. HIC 단계에 적합한 컬럼의 비제한적 예에는 HIC 수지로 충전된 것, 예를 들면, 페닐 HP Sepharose^TM(GE Healthcare Pharmacia, Piscatway, NY)이다. 목적하는 항체를 포함하는 선행 단계로부터 수득한 관류물 제제는 동일 용적의 대략 2.2M 황산암모늄, 40mM 인산나트륨(pH 7.0)으로 희석시킬 수 있다. 이어서, 이를 약 0.45/0.2㎛ Sartopore^TM 2 이층 필터 또는 이의 등가물을 사용하는 여과로 처리할 수 있다. 특정한 양태에서, 소수성 크로마토그래피 공정은 2회 이상의 사이클을 포함한다.

특정한 양태에서, HIC 컬럼은 먼저 적합한 완충액을 사용하여 평형화시킨다. 적합한 완충액의 예는 1.1M 황산암모늄, 20mM 인산나트륨(pH 7.0)이다. 당업자는 완충액의 농도를 변경하고/하거나 등가의 완충액을 치환함으로써 평형 완충액을 변경할 수 있고, 이들도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 당해 컬럼에 희석된 음이온 교환 관류 샘플을 로딩하고, 평형 완충액으로 수회, 예를 들면, 3회 세척한다.

당해 컬럼은 적절한 용출 완충액을 사용하여 용출시킨다. 이러한 용출 완충액의 적합한 예는 0.3M 황산암모늄, pH 약 7.0의 9mM 인산나트륨이다. 목적하는 항체는 상부측 1 OD_280nm로부터 하부측 피크 4 OD_280nm까지의 통상의 분광계를 사용하여 검출하고 수집할 수 있다.

본 발명의 특정한 양태에서, 소수성 크로마토그래피 단계로부터의 용출물은 완전한 바이러스를 포함하는 바이러스 입자의 제거를 위해 여과로 처리한다. 적합한 필터는 Ultipor DV50^TM 필터(Pall Filtron, Northborough, MA)이다. 기타 바이러스 필터가 이러한 단계에 사용될 수 있고, 당업자에게 공지되어 있다. 특정한 양태에서, HIC 용출물은 약 34psig에서 0.1㎛ 필터 및 10인치 Ultipor DV50^TM 나노필터로 이루어진 예비 습윤 필터 트레인에 통과된다. 임의로, 여과 공정 후, 필터는, 예를 들면, HIC 용출 완충액을 사용하여 세척하여 필터 하우징에 보유된 임의의 항체를 제거한다. 여과액은 약 12℃에서 예비 멸균된 용기에 저장할 수 있다.

추가의 양태에서, 상기로부터의 여과액을 한외여과/정용여과로 다시 처리한다. 이 단계는 실시자의 최종 목적이 항체를, 예를 들면, 약제학적 제형에 사용하는 것인 경우에 중요하다. 한외여과는 항체의 농축을 촉진시키고, 정용여과는 이미 사용된 완충 염의 제거를 촉진하며, 이를 특정 제형 완충액으로 대체한다. 다중 용적, 예를 들면, 2용적 이상의 제형 완충액을 사용한 정용여과가 수행된다. 적합한 제형 완충액의 예는 5mM 메티오닌, 2% 만니톨, 0.5% 수크로즈, pH 5.9 완충액이다. 정용여과가 완료되면, 항체를 농축시킨다. 당업자는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 이 시점에서 항체 생성물을 추가로 여과하고 싶을 수도 있다.

본 발명의 특정한 양태는 정제 단계를 추가로 포함한다. 이온 교환 크로마토그래피 공정 전, 공정 동안 또는 공정 후에 수행될 수 있는 추가의 정제 공정의 예는 에탄올 침전, 등전 집중, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 그로마토그래피, 헤파린 Sepharose^TM 상에서의 크로마토그래피, 추가의 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 추가의 양이온 교환 크로마토그래피, 크로마토집중(chromatofocusing), SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피(예: 단백질 A, 단백질 G, 항체, 특이적 기질, 리간드 또는 항원을 포획 시약으로서 사용)을 포함한다.

5. 샘플 순도의 분석 방법

본 발명은 또한 분리된/정제된 항체 조성물 중의 숙주 세포 단백질(HCP) 농도의 잔류 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 기재한 바와 같이, HCP는 바람직하게는 최종 표적 물질 생성물, 즉 항-IL-18 항체로부터 제외된다. HCP의 예는 항체 생성의 공급원으로부터 유래하는 단백질을 포함한다. 표적 항체로부터 HCP를 확인하고 충분히 제거하지 못하면, 당해 반응의 효율을 감소시키고/시키거나 부작용을 유도할 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "HCP ELISA"는 당해 분석에 사용된 2차 항체가 항체, 즉 항-IL-18 항체의 생성에 사용된 세포(예: CHO 세포)로부터 생성된 HCP에 특이적인 ELISA를 의미한다. 2차 항체는 당업자에게 공지된 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 2차 항체는 샴 생성 및 정제 작업으로 수득한 HCP를 사용하여 생성할 수 있다. 즉, 목적하는 항체의 생성에 사용된 동일한 세포주가 사용되지만, 당해 세포주는 항체 DNA로 형질감염되지 않는다. 특정한 양태에서, 2차 항체는 선택된 세포 발현 시스템, 즉 표적 항체의 생성에 사용된 세포 발현 시스템에서 발현된 것들과 유사한 HPC를 사용하여 생성된다.

일반적으로, HCP ELISA는 2개 항체 층, 즉 1차 항체와 2차 항체 사이에 HCP를 포함하는 액체 샘플의 샌드위칭을 포함한다. 당해 샘플을 배양하고, 이때 샘플 중의 HCP는 1차 항체, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 염소 항-CHO, 즉 친화성 정제된 염소 항-CHO(Cygnus)에 의해 포획된다. 항체의 생성에 사용된 세포로부터 생성된 HCP에 특이적인 표지화된 2차 항체 또는 항체의 블렌드, 예를 들면, 항-CHO HCP 비오티닐화된 항체를 첨가하고, 샘플 내의 HCP에 결합시킨다. 특정한 양태에서, 1차 및 2차 항체는 폴리클로날 항체이다. 특정한 양태에서, 1차 및 2차 항체는 HCP에 대해 생성된 폴리클로날 항체의 블렌드, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 비오티닐화된 염소 항 숙주 세포 단백질 혼합물 599/626/748이다. 샘플에 함유된 HCP의 양은 2차 항체의 표지에 기반한 적절한 시험을 사용하여 측정된다.

HCP ELISA는 상기 단락 III에 기재된 공정을 사용하여 수득한 용출물 또는 관류물 등과 같이 항체 조성물 중의 HCP의 수준의 측정에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한, HCP 효소 결합된 면역흡착 분석("ELISA")로 측정하는 경우에 측정가능한 수준의 HCP를 포함하지 않는, 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.

6. 추가의 변형

본 발명의 항-IL-18 항체는 변형시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부는 목적하는 효과를 제공하기 위해 화학적으로 변형된다. 예를 들면, 본 발명의 항체 및 항체 단편의 페길화는, 예를 들면, 문헌[참조: Focus on Growth Factors 3:4-10(1992); EP 0 154 316; 및 EP 0 401 384, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨]에 기재되어 있는 바와 같은 당해 기술분야에 공지된 페길화 반응에 의해 수행할 수 있다. 한 가지 양태에서, 페길화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)를 사용한 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 페길화에 적합한 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 본원에 사용되는 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질의 유도체화에 사용된 PEG의 형태, 예를 들면, 모노(Cl-ClO) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜을 포함함을 의미한다.

본 발명의 페길화된 항체 및 항체 단편의 제조방법은 일반적으로 (a) 항체 또는 항체 단편을 적합한 조건하에 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들면, PEG의 반응성 에테르 또는 알데히드 유도체와 반응시켜 항체 또는 항체 단편을 하나 이상의 PEG 그룹에 결합시키는 단계 및 (b) 반응 생성물을 수득하는 단계를 포함한다. 당업자에게는 공지된 파라미터 및 목적하는 결과에 기반하여 최적 반응 조건 또는 아실화 반응을 선택하는 것이 명백할 것이다.

페길화된 항체 및 항체 단편은 일반적으로 본원에 기재된 항-IL-18 항체 및 항체 단편의 투여에 의한 본 발명의 IL-18 관련된 장애의 치료에 사용될 수 있다. 일반적으로, 페길화 항체 및 항체 단편은 페길화되지 않은 항체 및 항체 단편과 비교하여 증가된 반감기를 갖는다. 페길화 항체 및 항체 단편은 단독으로 또는 함께 사용되거나, 다른 약제학적 조성물과 병용할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 일부는 유도체화되거나 다른 작용성 분자(예: 또 다른 펩타이드 또는 단백질)에 결합시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 일부는 면역글로불린 분자를 포함하여 본원에 기재된 사람 항-IL-18 항체의 유도체화된 및 기타 변형된 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 본 발명의 항체 및 항체 일부는 하나 이상의 기타 분자 개체, 예를 들면, 또 다른 분자(예: 스트렙트아비딘 코어 영역 또는 폴리시스티딘 태그)와 항체 또는 항체 일부의 결합을 매개할 수 있는 또 다른 항체(예: 이특이적 항체 또는 디아바디), 검출제, 세포독성제, 약제 및/또는 단백질 또는 펩타이드에 기능적으로 연결(화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 등에 의해)시킬 수 있다.

유도체화된 항체의 한 가지 형태는 (예를 들면, 이특이적 항체를 생성하기 위해 동일한 종류 또는 상이한 종류의) 2개 이상의 항체를 가교결합시켜 생성한다. 적합한 가교결합제는 적절한 스페이서(예: m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르)에 의해 분리된 2개의 독특한 반응성 그룹을 갖는 헤테로이작용성이거나 호모이작용성(예: 디석신이미딜 수베레이트)인 것들을 포함한다. 이러한 링커는 피어스 케미칼 컴파니(Pierce Chemical Company, Rockford, IL)사로부터 시판된다.

본 발명의 항체 또는 항체 일부를 유도체화시킬 수 있는 유용한 검출제는 형광성 화합물을 포함한다. 예시적인 형광성 검출제에는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린 등이 포함된다. 또한, 항체는 검출가능한 효소, 예를 들면, 알칼리 포스파타제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코즈 옥시다제 등으로 유도체화시킬 수 있다. 항체가 검출가능한 효소로 유도체화되는 경우, 이는 검출가능한 반응 생성물의 생성에 당해 효소를 사용하는 추가의 시약을 첨가함으로써 검출된다. 예를 들면, 검출제 서양고추냉이 퍼옥시다제가 존재하는 경우, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출가능한 착색 반응 생성물을 유도한다. 항체는 또한 비오틴으로 유도체화시킬 수 있고, 아비딘 또는 스트렙트아비딘 결합의 간접적 측정을 통해 검출할 수 있다.

7. 약제학적 조성물

본 발명의 항체 및 항체 일부를 환자에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물내에 혼입할 수 있다. 전형적으로는, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 일부 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 특정 및 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항살균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 중의 하나 이상, 및 이의 배합물을 포함한다. 다수의 경우에, 등장성 제제, 예를 들면, 당, 폴리알콜, 예를 들면, 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 조성물내에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 항체 또는 항체 일부의 반감기 또는 효능을 증진시키는, 미량의 보조 물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 및 항체 일부를 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물 내에 혼입할 수 있다. 항체 또는 항체 일부를 항체 0.1 내지 250mg/ml를 함유하는 주사가능한 용제로서 제조할 수 있다. 주사가능한 용제는 플린트 또는 호박색 바이알, 앰풀 또는 예비 충전된 주사기내에 액체 또는 동결건조된 투여형으로 구성될 수 있다. 완충액은 pH 5.0 내지 7.0(최적으로 pH 6.0)에서 L-히스티딘 약 1-50mM(최적으로 5-10mM)일 수 있다. 다른 적합한 완충액은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 석신산나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨 또는 인산칼륨을 포함한다. 염화나트륨을 사용하여, 0 내지 300mM(액체 투여 형태에 경우 최적으로 150mM)의 농도에서 용제의 독성을 개질시킬 수 있다. 동결방지제, 주로 0-10% 수크로즈(최적으로 0.5-1.0%)을 동결건조된 투여 형태의 경우에 포함시킬 수 있다. 다른 적합한 동결방지제는 트레할로즈 및 락토즈를 포함한다. 벌킹제, 주로 1-10% 만니톨(최적으로 2-4%)을 동결건조된 투여 형태의 경우에 포함시킬 수 있다. 안정화제, 주로 1-50mM L-메티오닌(최적으로 5-10mM)을 액체 및 동결건조된 투여 형태 둘 다에 사용할 수 있다. 다른 적합한 벌킹제는 글리신 및 아르기닌을 포함하고, 0-0.05% 폴리솔베이트-80(최적으로는 0.005-0.01%)로서 포함될 수 있다. 추가의 계면활성제는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제를 포함한다.

한 가지 양태에 있어서, 약제학적 조성물은 항체를 약 0.01 내지 10mg/kg의 투여량으로 포함한다. 또 다른 양태에서, 항체의 투여량은 매주 투여되는 1mg/kg 또는 매주 투여되는 0.3mg/kg을 포함한다. 당업자는 환자에 투여하기 위한 적절한 투여량 및 요법을 인지할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은, 예를 들면, 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예를 들면, 액체 용제(예를 들면, 주사가능하고 주입가능한 용제), 분산제 또는 현탁제, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌제를 포함한다. 당해 형태는 의도된 투여 방식 및 치료학적 용도에 따라 달라진다. 전형적인 조성물은 사람의 다른 항체와의 수동 면역화에 사용되는 것들과 유사한 조성물과 같이 주사가능하거나 주입가능한 용제 형태이다. 한 가지 투여 방식은 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 한 가지 양태에 있어서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여한다. 또 다른 양태에 있어서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여한다.

치료학적 조성물은 전형적으로는 제조 및 저장 조건하에 무균적이고 안정하여야만 한다. 당해 조성물은 용제, 미세유제, 분산제, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 지시된 구조로서 제형화시킬 수 있다. 멸균 주사가능한 용제는 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체 일부)을, 필요한 경우에 상기한 성분 중의 하나 또는 배합물과 함께 필요량으로 적합한 용매내에 혼입시킨 다음, 여과 멸균시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로는, 분산제는 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기한 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사가능한 용제의 제조를 위한 멸균, 동결건조된 분말의 경우에, 제조 방법은 활성 성분과 이의 선행 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 분무 건조법이다. 용제의 적합한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 피복물의 사용에 의해, 분산제의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 내에 포함시킴으로써 달성할 수 있다.

본 발명의 항체 및 항체 일부를 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여할 수 있으나, 한 가지 투여 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 수 있다. 특정 양태에 있어서, 활성 화합물은 당해 화합물을 신속한 방출에 대해 보호할 수 있는 담체와 함께, 예를 들면, 삽입물, 경피 패치 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함한 조절된 방출 제형과 같이 제조할 수 있다. 생체분해가능하고, 생체적합한 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 상기 제형을 제조하는 다수의 방법은 특허출원되었거나 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다[참조: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed. Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨].

특정 양태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부를, 예를 들면, 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 경구적으로 투여할 수 있다. 화합물(및 필요한 경우에 다른 성분)을 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐 내에 봉입하거나, 정제로 압축하거나, 환자의 식이에 직접적으로 혼입할 수도 있다. 경구용 치료학적 투여의 경우에, 화합물을 부형제와 함께 혼입하여, 섭취가능한 정제, 거환 정제, 트로키, 캡슐제, 엘릭시르, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼 등의 형태로 사용할 수 있다. 비경구 투여 이외의 방식에 의해 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물을 이의 불활성화를 방지하는 재료로 피복시키거나, 이와 함께 공동투여하는 것이 필요할 수 있다.

보충적인 활성 화합물을 또한 조성물 내에 혼입할 수도 있다. 특정 양태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부를 IL-18 활성이 손상되는 장애를 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 공동제형화시키고/거나 공동투여할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항-hIL-18 항체 또는 항체 일부는 다른 표적에 결합하는 하나 이상의 추가의 항체(예: 다른 사이토킨에 결합하거나 세포 표면 분자에 결합하는 항체)와 함께 공동제형화하고/하거나 공동투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 항체는 2종 이상의 치료제와 함께 사용할 수 있다. 이러한 병용 요법은 유리하게는 투여된 치료제의 보다 낮은 투여량을 이용하여, 다양한 단독요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증은 방지할 수 있다. 본 발명의 항체를 병용 요법의 일부로서 사용할 경우에, 항체를 단독으로 환자에게 투여하는 경우보다 낮은 투여량의 항체가 바람직할 수 있음(예를 들면, 상승작용성 치료학적 효과는 교대로 보다 낮은 투여량의 항체의 사용이 목적하는 치료학적 효과를 달성하게 하는 병용 요법의 사용에 의해 달성할 수 있다)은 당업자에게 명백할 것이다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 단독으로 또는 배합물로 사용하여 상기 질환을 치료할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 단독으로 또는 의도된 목적을 위해 당업자에 의해 선택된 추가의 제제, 예를 들면, 치료제와 배합하여 사용할 수 있음을 이해하여야만 한다. 예를 들면, 추가의 제제는 본 발명의 항체에 의해 치료할 질환 또는 상태를 치료하는데 유용한 것으로 당해 분야에 인지된 치료제일 수 있다. 추가의 제제는 또한 치료학적 조성물에 유익한 특성을 제공하는 제제, 예를 들면, 조성물의 점도에 영향을 주는 제제일 수 있다.

또한, 본 발명 내에 포함될 수 있는 배합물은 이들의 의도된 목적에 유용한 배합물임을 이해하여야만 한다. 아래에 기재된 제제는 설명을 위한 것이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일부인 배합물은 본 발명의 항체 및 아래에 기재된 것으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 제제일 수 있다. 당해 배합물은 또한 하나 이상의 추가의 제제, 예를 들면, 배합물이, 형성된 조성물이 이의 의도된 기능을 수행할 수 있도록 하는 배합물인 경우에, 2종 또는 3종의 추가의 제제를 포함할 수 있다.

몇몇 배합물은 이부프로펜과 같은 약물을 포함하는 NSAIDS로도 불리는 비-스테로이드계 항염증성 약물이다. 다른 배합물은 프레드니솔론을 포함한 코르티코스테로이드이고, 스테로이드 사용의 익히 공지된 부작용은 본 발명의 항-IL-18 항체와 함께 사용하여 환자를 치료할 경우에 필요로 하는 스테로이드 투여량을 점감시킴으로써 감소시키거나 심지어 배제할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 일부와 병용할 수 있는 류마티스성 관절염용 치료제의 비제한적인 예는 다음과 같다: 사이토킨 억제 항염증성 약물(CSAID); 다른 사람 사이토킨 또는 성장 인자, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-12, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF에 대한 항체 또는 이의 길항제를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 세포 표면 분자, 예를 들면, CD2, CD3, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD90 또는 C154(gp39 또는 CD40L)을 포함한 이의 리간드에 대한 항체와 배합할 수 있다.

치료제의 몇몇 배합물은 자가면역 및 후속적인 염증성 캐스케이드에서 상이한 지점에서 방해할 수 있으며, 이의 예는 키메라, 사람화 또는 사람 TNF 항체, D2E7(1996년 2월 9일에 출원된 미국 특허원 제08/599,266호, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 인용됨), cA2(Remicade™), CDP 571, 항-TNF 항체 단편(예를 들면, CDP870) 및 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, 이의 유도체, p75TNFR1gG(Enbrel™) 또는 p55TNFR1gG(Lenercept), 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)와 같은 TNF 길항제, 및 또한 TNFα 전환 효소(TACE) 억제제를 포함하며, 유사하게는, IL-1 억제제(예를 들면, 인터류킨-1-전환 효소 억제제, 예를 들면, Vx740 또는 IL-1RA 등)가 동일한 이유로 효과적일 수 있다. 다른 배합물은 인터류킨 11, 항-P7 및 p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL)를 포함한다. 또 다른 배합물은 IL-12 기능에 상당하게, 이에 의존적으로 또는 이와 동시에 작용할 수 있는 자가면역 반응의 다른 주요 기능제이다. IL-12 및 IL-18이 오버랩핑되기는 하나, 독특한 기능 및 둘 다에 대한 길항제의 배합물이 가장 효과적인 것으로 제시되어 있다. 또 다른 배합물은 비-결핍 항-CD4 억제제이다. 또 다른 배합물은 항체, 가용성 수용체 또는 길항성 리간드를 포함한 공동-자극 경로 CD80(B7.1) 또는 CD86(B7.2)의 길항제를 포함한다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부를 또한 제제, 예를 들면, 메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린, 설파살라진, 메살라진, 올살라진 클로로퀴닌/하이드록시클로로퀸, 펜실라민, 아우로티오말레이트(근육내 및 경구), 아자티오프린, 콜히친, 코르티코스테로이드(경구, 흡입 및 국부 주사), β-2 아드레노수용체 효능제(살부타몰, 테르부탈린, 살메테랄), 크산틴(테오필린, 아미노필린), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로퓸 및 옥시트로퓸, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트, 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예를 들면, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를 들면, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린성 제제, 염증촉진성 사이토킨, 예를 들면, TNFα 또는 IL-1에 의한 시그널링을 방해하는 제제(예를 들면, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환 효소 억제제(예를 들면, Vx740), 항-P7, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), TNFα 전환 효소(TACE) 억제제, T-세포 시그널링 억제제, 예를 들면, 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예를 들면, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체 및 유도체 p75TNFIgG(Enbrel™) 및 p55TNFRIgG(Lenercept), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)) 및 항염증성 사이토킨(예를 들면, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ)과 배합할 수도 있다. 몇몇 배합물은 메토트렉세이트 또는 레플루노미드와 중등증 또는 중증의 류마티스성 관절염의 경우에, 사이클로스포린을 포함한다. IL-18 항체와 배합하여 사용될 수 있는 기타 제제는 COX-2 억제제이다. COX-2 억제제는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 구체적인 COX-2 억제제는 이의 전체 내용이 본원에서 참조로서 인용되는 국제 공개공보 제WO 01/00229호에 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 일부의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 목적하는 치료학적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 및 시간 동안 유효한 양을 의미한다. 항체 또는 항체 일부의 치료학적 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 항체 또는 항체 일부의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 항체 또는 항체 일부의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료학적으로 유리한 효과보다 덜 한 양이다. "예방학적 유효량"은 목적하는 예방학적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 및 시간 동안 유효한 양을 의미한다. 전형적으로는, 예방학적 투여량은 질환의 직전에 또는 초기에 환자에게 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량 미만일 것이다.

활성 단백질(들)의 치료학적 유효량은 항-IL-18 항체의 종류, IL-18에 대한 항체의 친화성, 당해 항체에 의해 나타나는 잔류 세포독성 활성, 투여 경로, 환자의 임상 조건(내인성 IL-18 활성의 무독성 수준을 유지하는 능력을 포함)을 포함하는 다수의 변수의 함수일 것이다.

"치료학적 유효량"은, 투여하는 경우, IL-18 억제제가 IL-18의 생물학적 활성을 억제하는 양이다. 개체에게 단독으로 또는 복수 투여로 투여되는 투여량은 IL-18 억제제 약력학적 특성, 투여 경로, 환자 상태 및 특성(성별, 연령, 체중, 건장, 크기), 증상 정도, 병용 치료, 치료 빈도 및 목적하는 효과를 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 설정된 투여량 범위의 조정 및 취급은 개체에서 IL-18의 억제를 측정하는 시험관내 및 생체내 방법 뿐만 아니라 당업자의 능력 내에 있다.

투여 요법을 조정하여, 최적의 목적하는 반응(예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공할 수 있다. 예를 들면, 단일 일시투여로 투여할 수 있거나, 다수의 분할된 투여량을 경시적으로 투여할 수 있거나, 투여량을 치료학적 상태의 필요성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 비경구 조성물로 제형화시키는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료할 포유동물 환자에 대한 단일 투여량으로서 적당한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 목적하는 치료학적 효과를 생성시키기 위해 계산된 활성 화합물의 예정된 양을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 상술은 (a) 활성 화합물의 특유의 특성 및 달성할 특정한 치료학적 또는 예방학적 효과 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위해 상기한 활성 화합물을 배합하는 분야에서의 고유의 제한에 의해 및 이에 직접적으로 의존하여 지시된다.

본 발명의 항체 또는 항체 일부의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 예시적인 비제한적인 범위는 0.01-20mg/kg, 1-10mg/kg, 또는 0.3-1mg/kg이다. 투여량 수치는 완화시킬 상태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있음을 주지하여야 한다. 또한, 임의의 특유의 환자에 있어서, 구체적인 투여량 요법을 개체의 필요성 및 조성물을 투여하고 이의 투여를 지시하는 사람의 전문적인 판단에 따라 경시적으로 조정하여야 하고, 본원에 기재된 투여량 범위는 단지 예시적인 것이지, 청구된 조성물의 범주 또는 시행을 제한하고자 하는 것이 아님을 추가로 이해하여야만 한다.

8. 항- IL -18 항체의 용도

8.1 용도 일반

IL-18에 결합하는 능력이 제공될 경우, 본 발명의 항-IL-18 항체 또는 이의 일부를 사용하여, 통상적인 면역분석법, 예를 들면, 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA), 방사성면역분석법(RIA) 또는 조직 면역조직화학을 이용하여, (예를 들면, 샘플 매트릭스에서, 한 가지 양태에서, 혈청 또는 혈장 등의 생물학적 샘플에서) IL-18, 한 가지 양태에서 hIL-18을 검출할 수 있다. 본 발명은 생물학적 샘플을 본 발명의 항체 또는 항체 일부와 접촉시키고, IL-18에 결합된 항체(또는 항체 일부) 또는 결합되지 않은 항체(또는 항체 일부)을 검출하여, 생물학적 샘플 중의 IL-18을 검출함을 포함하여, 생물학적 샘플 중의 IL-18을 검출하는 방법을 제공한다. 항체를 검출가능한 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지화시켜, 결합되거나 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 한다. 적합한 검출가능한 물질은 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고, 적합한 보결분자단 복합체의 예는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고, 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고, 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고, 적합한 방사성 물질의 예는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H를 포함한다. 샘플 중의 IL-18의 검출은 진단, 예를 들면, 증가된 IL-18과 관련된 상태의 진단에 유용할 수 있고/있거나, 항-IL-18 항체를 사용한 치료가 유리할 수 있는 환자의 확인에 유용할 수 있다.

항체를 표지화하는 대안으로, IL-18은, 예를 들면, 검출가능한 물질로 표지화된 rhIL-18 표준물 및 항-IL-18 항체, 예를 들면, 항-hIL-18 항체를 사용하여 경쟁 면역검정에 의해 샘플 중에서 분석할 수 있다. 이러한 분석에 있어서, 표지화된 rhIL-18 및 항-hIL-18 항체를 조합하고, 표지화되지 않은 항체에 결합된 표지화된 rhIL-18 표준물의 양을 측정한다. 샘플 중의 hIL-18 표준물의 양은 항-IL-18 항체에 결합된 표지화된 rhIL-18 표준물의 양에 역비례한다.

본 발명의 항체 및 항체 일부는 시험관내 및 생체내에서 IL-18 활성, 한가지 양태에서 hIL-18 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 일부는, 본 발명의 항체가 교차 반응하는 IL-18을 갖는 사람 개체 또는 기타 포유동물 개체(예를 들면, 비비, 원숭이 및 붉은털 원숭이 등의 영장류)의 IL-18을 함유하는 세포 배양물에서 IL-18 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 한 가지 양태에서, 본 발명은 사람 IL-18의 활성 및 비비 IL-18, 마모셋 IL-18, 침팬지 IL-18, 원숭이 IL-18 및 붉은털 원숭이 IL-18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 영장류 IL-18의 활성을 중화시키지만 마우스 IL-18의 활성을 중화시키지 않는 분리된 사람 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다. 한 가지 양태에서, IL-18은 사람 IL-18이다. 예를 들면, hIL-18을 함유하거나 함유하는 것으로 예상되는 세포 배양물에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부를 세포 배지에 첨가하여 배양물 중의 hIL-18 활성을 억제할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 IL-18 활성이 해로운 장애를 앓고 있는 환자에서 IL-18 활성을 억제시키는 방법을 제공한다. 인터류킨 18은 면역 및 염증 요인을 수반하는 다양한 질병과 관련된 병인에 있어서 중요한 역할을 담당한다.

본원에 사용되는 문구 "IL-18 활성이 해로운 장애"는 당해 장애를 앓고 있는 환자에서 IL-18의 존재가 당해 장애의 병인에 관여하거나 당해 장애의 악화에 기여하는 인자인 것으로 밝혀지거나 의심되는 질환 및 기타 장애를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, IL-18 활성이 해로운 장애는 IL-18 활성의 억제가 당해 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시킬 것으로 예상되는 장애이다. 이러한 장애는, 예를 들면, 당해 장애를 앓고 있는 환자의 체액에서 IL-18의 농도의 증가(예를 들면, 환자의 혈청, 혈장 및 활액 등의 농도의 증가)에 의해 입증될 수 있고, 이는, 예를 들면, 상기한 항-IL-18 항체를 사용하여 검출할 수 있다. IL-18 활성이 해로운 장애에는 다수의 예가 있다. 한 가지 양태에서, 당해 항체 또는 이의 항원 결합부는 본원에 기재된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료에서 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는 본원에 기재된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 몇몇 비제한적인 특정한 장애의 치료에 있어서 본 발명의 항체 또는 항체 일부의 용도는 하기에서 추가로 설명된다.

본 발명은 IL-18 활성의 조절을 필요로 하는 질환 또는 상태를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 이들 질환 또는 상태에는 자가면역 질환, 타입 I 당뇨병, 류마티스성 관절염, 이식 거부, 염증성 장 질환, 패혈증, 다발성 경화증, 허혈성 심장 질환(심장 발작 포함), 허혈성 뇌 손상, 만성 간염, 건선, 만성 췌장염, 급성 췌장염 등이 포함된다.

따라서, 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부 또는 생체내에서 이들을 발현하는 벡터는, IL-18의 이상 발현이 존재하여 과다한 IL-18을 유도하거나 외래 투여된 IL-18에 기인한 합병증의 경우에, 자가면역 질환, 타입 I 당뇨병, 류마티스성 관절염, 이식 거부, 염증성 장 질환, 패혈증, 다발성 경화증, 급성 심장 발작을 포함하는 허혈성 심장 질환, 허혈성 뇌 손상, 만성 간염, 건선, 만성 췌장염 및 급성 췌장염 및 유사한 질환의 치료를 위해 지시된다.

8.2 간 손상에서의 용도

본 발명의 한 가지 양태는 간 손상을 치료 및/또는 예방하는 신규 수단을 제공한다. IL-18 억제제는 간 손상의 예방 및 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 간 손상의 치료 및/또는 예방용 의약을 제조하기 위한 IL-18 억제제의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 알콜성 간염, 바이러스성 간염, 면역 간염, 전격성 간염, 간경화 및 원발성 담즙성 간경변에 의해 유발된 간 손상의 치료 및/또는 예방과 관련된다.

8.3 관절염에서의 용도

본 발명에 따르면, IL-18의 억제제는 관절염의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 당해 치료 효과는 당해 질환의 중증도의 감소 뿐만 아니라 당해 질환의 확산의 방지를 포함한다. 따라서, 본 발명은 관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 IL-18의 억제제의 용도에 관한 것이다. 이는, 상기 개략된 당해 기술분야의 상태로부터는 관절염에 수반된 하나의 특정 인자, 즉 인터류킨 IL-18의 차단이 관절염의 완화 또는 심지어 발병된 관절의 치유를 유발할 수 있다고 결론지을 수 없기 때문에 예상할 수 없었던 것이다.

용어 "관절염"은 관절염에 대해 워싱턴 대학의 정형외과 학과의 홈페이지에 정의된 바와 같이, 모든 상이한 유형의 관절염 및 관절염 상태, 급성 및 만성 관절염을 포함한다. 관절염 상태의 예는 강직성 척추염, 허리 통증, 손목 침착 증후군, 엘러스-단로스-증후군(Ehlers-Danlos-Syndrome), 통풍, 연소자 관절염, 홍반성 낭창, 근염, 골형성 부전, 골다공증, 다발성 관절염, 다발성 근염, 건선성 관절염, 라이터 증후근(Reiter's syndrome), 경피증, 장 질환을 동반한 관절염, 베체트병(Behcets's disease), 소아 관절염, 퇴행성 관절 질환, 섬유근육통, 감염성 관절염, 라임 질환(Lyme disease), 마르팡 증후군(Marfan syndrome), 골관절염, 골괴사, 파제트병(Pagets Disease), 류마티스성 다발성 근육통, 가성 통풍, 반사성 교감신경 이영양증, 류마티스성 관절염, 류마티즘, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 가족성 선종성 용종증 등이다.

류마티스성 관절염(RA)은 관절(활액 구성원, 하나의 세포 층 상피) 및/또는 내부 기관의 내층에서 염증을 유발한다. 당해 질환은 수년 동안 지속하는 경향이 있고, 통상 신체 전체의 다수의 상이한 관절에 영향을 미치며, 궁극적으로는 연골, 골, 건 및 인대에 손상을 유발할 수 있다. RA에 의해 영향을 받을 수 있는 관절은, 예를 들면, 목, 어깨, 팔꿈치, 엉덩이, 손목, 손, 무릎, 발목 및 발에 위치하는 관절이다. 다수의 경우에, 관절은 RA에서 대칭 패턴으로 염증을 일으킨다.

RA는 미국 내에서 인구의 약 1%에서 일반적이고, 모든 인종 그룹 및 연령에 분포되어 있다. 전 세계에 걸쳐 발생하며, RA를 갖는 인구 중에서 여성이 3 대 1로 남성을 압도한다.

IL-18 억제제의 투여는 관절염의 쥐 모델에서 연골 침식을 현저히 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 또한 연골 파괴를 치료 및/또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 IL-18 억제제의 용도에 관한 것이다.

실시예

1. IL -18 항체의 분리 및 정제

본 실시예는 다른 불순물로부터 뿐만 아니라 숙주 세포 단백질(HCP)로부터 항-IL-18 항체를 정제하는 한 가지 도식을 제공한다. 본 정제 공정을 도시하는 흐름도는 도 1에 제공되어 있다.

1.1 산성화에 의한 정화를 사용한 1차 회수

원심분리에 의한 1차 회수를 사용하여 3000L 생성 생물반응기 수거물로부터 세포 및 세포 파편을 제거한다. 원심분리는 30L/분의 공급 속도로 6900×g에서 작동시키고, 정화된 상청액은 예비 멸균된 3000L 수거 탱크에서 수집했다. 낮은 pH 산성화 단계의 목적은 유리한 바이러스를 불활성화시키고 후속 양이온 포획 크로마토그래피 단계를 위한 배양 상청액을 제조하는 것이다. 원심분리되고 정화된 수거물은 3M 시트르산을 사용하여 pH 3.5±0.1로 조정하고, 당해 pH에서 1시간 동안 20℃에서 유지시켰다. 이어서, 정화된 수거물은 3M NaOH를 사용하여 pH 4.9±0.1로 조정하고, 16 내지 24시간 동안 8℃에서 유지시켰다. pH 조절된 수거물을 20℃로 다시 되게 한 다음, 30L/분의 공급 속도로 12,750×g에서 원심분리하여 정화시키고, 상청액을 2000L 탱크에서 수집했다. 양이온 교환 크로마토그래피 전에, 정화된 수거물은 표준 공극 크기 0.2-0.8㎛의 심층 필터 및 0.22㎛ 친수성 필터 카트리지를 포함하는 필터 트레인에 통과시켰다. 원심분리, 낮은 pH 처리 및 재원심분리의 결과는 표 2에 제시되어 있다. 단계 수율은 69±6%(n=7)이었다.

1.2 양이온 교환 크로마토그래피

IL-18 항체는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정화된 수거물로부터 포획했다. 또한, 공정 관련 불순물(예: 숙주 세포 단백질, DNA 및 기타 공정 관련된 불순물)을 공정 스트림으로부터 제거했다. 직경 80cm ×길이 20cm 컬럼(층 용적 101L)을 당해 작업에 사용했다. 컬럼에 Fractogel^TM S 수지(EMD Industries, Gibbstown, NJ)를 충전시키고, 등가의 이론적 플레이트의 높이(HETP) 및 비대칭을 측정하여 충전 품질을 측정했다. 당해 컬럼의 작동은 주위 온도에서 수행했다.

당해 컬럼은 20mM Na 시트레이트/시트르산 완충액, 65mM NaCl(pH 5)를 사용하여 평형화시켰다. 심층 여과액을 물로 희석하여 전도성을 9±0.5mS/cm까지 감소시키고, 180cm/hr의 선속도로 로딩했다. 당해 크로마토그래피 단계를 위한 최대 로딩은 수지 L당 단백질 27g으로 설정했다. 이어서, 컬럼을 200cm/hr의 선속도로 평형 완충액에 의해 기준선까지 세척했다. 생성물을 125cm/hr의 선속도에서 20mM Na 시트레이트/시트르산 완충액, 200mM NaCl(pH 5)로 용출시켰다. 컬럼 용출물은 흡광도가 OD 3.0(A₂₈₀) 이상으로 상승할 때에 수집하고, 피크의 꼬리에 따라 흡광도가 OD 2.0까지 감소될 때까지 지속했다. 수집된 물질은 0.8㎛ 필터를 통해 여과한 다음, 0.2㎛ 필터로 여과했다. 양이온 교환 크로마토그래피의 결과는 표 3에 제시되어 있다. 단계 수율은 88±6%(n=7)이고, SEC HPLC에 의한 순도는 98.29±0.52% 단량체이었다(n=7).

1.3 한외여과 / 정용여과

Fractogel^TM S 용출물의 농축은 30kD 분자량 컷오프(MWCO) 재생된 셀룰로즈 아세테이트 한외여과 막 카트리지(7m²의 총 면적)를 사용하여 수행했다. 용출물의 한외여과는 최종 목표 농도 30g/L까지 지속했다. 이어서, 농축물을 20mM 인산나트륨 완충액, 150mM NaCl(pH 7)의 6용적으로 정용여과했다.

이어서, UF 시스템으로부터 생성물을 배제하고, 정용여과 완충액으로 세정하여 당해 시스템에 보유된 생성물을 회수했다. 농축 Fractogel^TM SO₃ ^- 용출물을 즉시 유지 탱크 내로 0.2㎛ 여과하고, 다시 처리할 때까지 8℃에서 유지했다. Fractogel^TM S 용출물의 농축 결과는 표 4에 제시되어 있다. 단계 수율은 88±7%(n=7)이고, SEC HPLC에 의한 순도는 97.67±0.59% 단량체이었다(n=7).

1.4 음이온 교환 크로마토그래피

음이온 교환 크로마토그래피는 공정 관련된 불순물, 예를 들면, DNA, 바이러스 및 내독소를 감소시킨다. 직경 45cm × 길이 30cm의 컬럼(층 용적 48L)을 당해 작업에 사용했다. 컬럼에 Q Sepharose^TM FF 수지(GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 충전시키고, 비대칭 및 HETP를 측정하여 충전 품질을 측정했다. 희석된 물질을 밀폐된 휴대용 스테인레스 강 탱크에 수집하고, 12℃에서 작동시킨 클래스 10,000 정제 기구로 이동시켰다.

당해 작업은 12℃에서 수행했다. 수지의 평형화는 25mM 트롤아민, 40mM NaCl(pH 8)로 달성했다. 당해 크로마토그래피 단계의 최대 단백질 로딩은 수지 L당 단백질 60g으로 설정했다. 희석되고 여과된 바이러스 불활성화된 물질을 Q Sepharose^TM FF 컬럼 로딩으로 지정했다. 공정 관련 불순물을 수지에 흡수시키고, 항체를 컬럼을 통해 관류시킨다. Fractogel^TM S 용출물 농축물은 2용적의 Q Sepharose^TM 컬럼 로딩 평형(50mM 트롤아민, pH 8)으로 희석하고, 당해 컬럼에 로딩시켰다. 당해 컬럼의 로딩은 150cm/hr로 수행하고, 컬럼 관류물은 A₂₈₀이 0.4 OD 이상으로 상승할 때에 수집했다. 이어서, 당해 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고, 세척물을 A₂₈₀이 0.6의 OD로 되돌아올 때까지 수집했다. 관류물 및 세척물을 합하여 용출물 생성물 풀을 형성했다. 음이온 교환 크로마토그래피의 결과는 표 5에 제시되어 있다. 당해 단계 수율은 92±4%(n=7)이었고, SEC HPLC에 의한 순도는 99.04±0.51% 단량체이었다(n=7).

1.5 소수성 상호작용 크로마토그래피

소수성 상호작용 크로마토그래피는 항체 응집체 및 공정 관련 불순물을 제거한다. 직경 45cm × 길이 15cm의 컬럼(층 용적 24L)를 당해 작업에 사용했다. 컬럼에 Phenyl Sepharose^TM HP 수지(GE Healthcare, Piscatway, NJ)를 충전시키고, 비대칭 및 HETP를 측정하여 충전 품질을 측정했다. 이러한 단위의 작업은 또한 클래스 10,000 정제 기구로 12℃에서 수행했다.

당해 작업은 12℃에서 수행했다. 수지의 평형화는 20mM 인산나트륨, 1.1M 황산암모늄(pH 7)로 달성했다. 당해 단계의 최대 단백질 로딩은 수지 L당 단백질 40g으로 설정했다. 당해 컬럼의 로딩은 75cm/hr에서 수행했다. Q Sepharose^TM FTW를 동일 용적의 40mM 인산나트륨(pH 7), 2.2M 황산암모늄으로 희석시키고, 혼합하고, 0.2㎛로 여과했다. 로딩 후, 컬럼을 20mM 인산나트륨(pH 7), 1.1M (NH₄)₂SO₄로 세척했다. 생성물은 38cm/hr의 선속도로 9mM 인산나트륨(pH 7), 0.3M 황산암모늄을 사용하여 단계 염 구배를 수행함으로써 용출시켰다. 생성물은 흡광도가 A_280nm에서 1.0 OD 이상으로 상승할 때에 수집하고, 피크의 절단에 따라 흡광도가 4.0 OD까지 감소할 때까지 지속했다. Q Sepharose^TM FTW의 전체 배치를 처리하기 위해서는 1 또는 2 사이클이 요구되었다. 소수성 상호작용 크로마토그래피의 결과는 표 6에 제시되어 있다. 단계 수율은 97±4%(n=7)이고, SEC HPLC에 의한 순도는 99.30±0.55% 단량체이었다(n=7).

1.6 바이러스 여과

Ultipor DV50^TM 나노여과 단계는 Phenyl Sepharose^TM 컬럼 용출물에 존재할 수도 있는 직경 50nm 이상의 유리한 바이러스를 제거한다. 당해 작업은 12℃에서 수행했다. Phenyl Sepharose^TM HP 컬럼 용출물은 0.1㎛로 여과했고, 예비 습윤된 10" Ultipor DV50^TM 필터(Pall Filtron, Northborough, MA)를 통해 35psig에서 통과시켰다. 이어서, 필터를 Phenyl Sepharose^TM HP 컬럼 용출 완충액으로 세정하여 필터 하우징에 보유된 항-IL-18을 제거했다. Ultipor DV50^TM 여과액을 밀폐된 휴대용 스테인레스 강 탱크에 10-14℃에서 저장했다. DV50^TM 나노여과의 결과는 표 7에 제시되어 있다. 단계 수율은 96±4%(n=7)이었고, SEC HPLC에 의한 순도는 99.51±0.26% 단량체이었다(n=7).

1.7 최종 한외여과 / 정용여과

UF/DF 단계는 IL-18 항체의 농축물이고, 황산암모늄을 제거하고, 항체를 제형 완충액에 정용여과한다. 밀리포어 30kD 분자량 컷오프(MWCO) 재생된 셀룰로즈 한외여과 막 카트리지(7m²)를 당해 단계에 사용했다. 당해 단계는 12℃에서 수행했다. Ultipor DV50^TM 나노여과액을 약 65g/단백질 L로 농축시켰다. 이어서, 최소 8용적의 제형 완충액을 사용한 연속 정용여과를 수행했다. 이어서, UF/DF 시스템으로 생성물을 제거하고, 정용여과 완충액으로 세정하여 당해 시스템에 보유된 생성물을 회수한다. 농축물과 세척물을 합하여 정용여과된 항체를 생성했다. 이어서, 항체 샘플을 Millipak Opticap^TM 10" 필터(0.7m²)를 통해 0.2㎛로 여과했다. 한외여과/정용여과 작업의 결과는 표 8에 제시되어 있다. 단계 수율은 96±4%(n=7)이었고, SEC HPLC에 의한 순도는 99.51±0.26% 단량체이었다(n=7).

1.8 최종 여과, 병입 ( bottling ) 및 동결

제형화된 항체를 2L PETG 용기에 0.2㎛ 여과하고, -80℃(표준)에서 동결시켰다. 한외여과/정용여과 작업의 결과는 표 9에 제시되어 있다. 단계 수율은 96±4%(n=7)이었다.

2. 항- IL -18 항체 조성물 중의 숙주 세포 단백질 농도의 측정

당해 공정은 항-IL-18 항체 샘플 중의 잔류 숙주 세포 단백질 농도를 측정하는 시험 방법을 기재한다. 효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA)를 사용하여 특이적 항체의 2개 층 사이에 숙주 세포 단백질(Antigens)을 샌드위칭시켰다. 이는 카제인으로 비특이적 부위를 차단하여 수행했다. 이어서, 숙주 세포 단백질을 항온처리하고, 이때 항원 분자는 제1 항체(피복 항원)에 의해 포획된다. 이어서, 항원(숙주 세포 단백질)에 고착되는 제2 항체(항-숙주 세포 단백질(비오티닐화됨))을 첨가한다. 비오티닐화된 항-숙주 세포 단백질에 결합하는 뉴트라비딘 HRP(접합됨)을 첨가했다. 이는 K 블루 기질을 첨가하여 수행했다. 염색체 기질은 결합된 효소 접합된 항체에 의해 가수분해되어, 청색을 생성한다. 반응은 2M H₃PO₄로 중단시키고, 이때 색이 황색으로 변한다. 색 강도는 웰에서 결합된 항원의 양에 직접 비례한다.

50mM 중탄산나트륨(피복 완충액)(pH 9.4)의 제조

1L 비이커에 900mL 밀리-Q 물, 4.2g±0.01g 중탄산나트륨을 첨가했다. 완전히 용해될 때까지 교반시켰다. 1N NaOH로 pH를 9.4로 조정했다. 1L 용적의 플라스크로 옮기고, 밀리-Q 물로 소정 용적으로 되게 했다. 균질해질 때까지 뒤집어 혼합했다. 0.22㎛ 멸균 필터 장치로 여과했다. 표준 4℃에서 제조일로부터 7일 이하 동안 저장했다.

0.104M Na₂HPO₄*7H₂O, 1.37M NaCl, 0.027M KCl, 0.0176M KH₂PO₄(pH 6.8-6.0)(10×PBS)의 제조

유리 비이커에 대략 400mL의 밀리-Q 물을 첨가했다. 13.94±0.01g의 Na₂HPO₄×7H₂O를 첨가했다. 40.0g±0.1g NaCl을 첨가했다. 1.00g±0.01g의 KCl을 첨가했다. 1.20g±0.01g의 KH₂PO₄를 첨가했다. 균질해질 때까지 교반했다. 500mL 용적의 플라스크로 옮겼다. QS를 밀리-Q 물로 500mL 용적으로 되게 했다. 뒤집어 혼합했다. 0.2㎛ 멸균 필터 장치를 통해 여과했다. 실온에서 7일 이하 동안 저장했다.

1×PHS + 0.1% 트리톤 X-100(pH 7.40)의 제조(플레이트 세척 완충액): 4L 등급화 실린더에서, 400mL 10×PBS(단계 5.2)를 3500mL 밀리-Q 물과 혼합했다. pH를 검사하고, 필요한 경우, 1N HCl 또는 1N NaOH로 7.40±0.05로 조정했다. 용적에 밀리-Q 물을 가했다. 실린더를 완전하게 밀봉하고, 균질해질 때까지 뒤집어 혼합했다. 4L 병에 옮겼다. 4mL의 1×PBS를 제거하고 버렸다. 4mL 트리톤 X-100을 3996mL의 1×PBS에 첨가했다. 교반 플레이트 상에 위치시키고, 완전히 용해될 때까지 교반시켰다. 희석 완충액 제제에 필요한 플레이트 세척 완충액의 양을 0.22㎛ 멸균 필터 장치를 통해 여과했다. 실온에서 7일 이하 동안 저장했다.

피복 항체 혼합물의 제조. 염소 항 CHO 599/626/748(lot# G11201@1.534mg/mL), 친화성 정제됨. 주의: 스톡을 표준 80℃에서 바이알 속에 저장했다. 분취량을 제조했다. 사용시에 플레이트당 1분취량을 취했다. 사용 직전: 항체 혼합물을 희석하여, 다음과 같이 차가운 50mM 중탄산나트륨에서 4㎍/mL의 최종 농도를 수득했다. 예: 31μL 피복 항체 혼합물을 11969㎕ 차가운 피복 완충액에 첨가했다. 뒤집어 서서히 혼합했다.

비오티닐화된 염소 항 숙주 세포 단백질 혼합물의 제조.

599/626/748(lot# G11202@ 0.822mg/mL): 주의: 스톡을 표준 -80℃에서 바이알 속에 저장했다. 분취량을 제조했다. 사용시에 플레이트당 1분취량을 취했다. 사용 직전: 비오티닐화된 항체 혼합물을 희석하여, 다음과 같이 37℃±2℃ 카제인에서 1㎍/mL의 최종 농도를 수득했다. 예: 14.6㎕ 비오티닐화된 항체 혼합물을 11985㎕의 37℃±2℃ 카제인에 첨가했다. 뒤집어 서서히 혼합했다.

뉴트라비딘-HRP의 제조. 새로운 로트(2mg/바이알)를 다음과 같이 1mg/mL로 재구성했다: 바이알에 400㎕의 밀리-Q 물을 첨가한 다음, 1600㎕ 1×PBS를 첨가하여 총 2mL로 되게 했다. 서서히 와동시켜 혼합했다. 표준 -20℃에서 저장했다. 목적하는 용적의 분취량을 제조하여, 플레이트당 1분취량을 사용했다. 폴리프로필렌 관에서 제조했다. 새로운 로트를 정성분석하여 작업 농도를 측정했다. 제조일로부터 6개월의 만료일을 지정했다. 예를 들면, 작업 농도가 0.2㎍/mL인 것으로 측정되는 경우, 다음과 같이 제조했다. 사용 직전: 뉴트라비딘-HRP를 실온에서 해동시켰다. 1mg/mL 뉴트라비딘 용액을 37℃±2℃ 카제인으로 0.1mg/mL(100㎍/mL)까지 희석시켰다. 예를 들면, ×10으로 희석시키고, 50㎕의 뉴트라비딘을 450㎕ 카제인에 첨가했다. 서서히 와동시켜 혼합했다. 100㎍/mL 용액을 37℃±2℃ 카제인으로 0.2㎍/mL까지 추가로 희석시켰다. 예: ×500으로 희석시키고, 24㎕ 뉴트라비딘(100㎍/mL)을 11976㎕의 카제인에 첨가했다. 서서히 와동시켜 혼합했다.

5.7 2M 인산(중단 용액)의 제조. 다음과 같이 농축 인산으로부터 2M 인산 용액을 제조했다. 표지, 밀도(1.685g/mL) 및 화학식량(98g/mol) 상에 명시된 인산(%)으로부터 필요한 농축 인산의 용적을 계산하여 2M 인산 500mL를 제조했다. 상기 계산된 농축된 인산의 용적을 플라스크에 첨가했다. 용적에 밀리-Q 물을 가하고, 균질해질 때까지 뒤집어 혼합했다. 제조일로부터 6개월 이하 동안 주위 온도에서 저장했다.

희석 완충액(1×PBS + 0.1% 트리톤 X 100(pH 7.4)로 ×100 희석시킨 카제인)의 제조. 0.22㎛ 멸균 희석된 1×PBS + 0.1% 트리톤 X 100(pH 7.4)(상기로부터)에서 37℃±2℃ 카제인 ×100으로 희석했다. 예: 1mL의 37℃±2℃ 카제인을 0.22㎛ 멸균된 1×PBS + 0.1% 트리톤 X 100(pH 7.4)에 첨가했다. 잘 혼합했다. 각각의 사용을 위해 새롭게 제조했다.

표준물의 제조. 숙주 세포 단백질(항원 표준물)(lot#G11203 @ 1.218mg/mL): 주의: 스톡을 표준 -80℃에서 70㎕ 분취량 속에 저장했다. 분취량을 실온에서 해동시켰다. 희석 완충액을 사용하여 폴리프로필렌 관에서 멸균 희석을 수행했다.

샘플의 제조. 폴리프로필렌 관에서, 희석 완충액에서 24mg/ml까지 최종 벌크 샘플을 희석시켰다. 농도를 기록했다. 주의: 하기 용액을 사용하여, 스파이킹된 샘플을 제조하고 하기 참조된 12mg/mL 용액을 제조했다. 폴리프로필렌 마이크로관에서, 24mg/mL 용액을 희석 완충액에서 12mg/mL까지 추가로 희석시켰다. 총 6개 웰의 플레이트 상에 웰당 12mg/mL 용액을 삼중으로 로딩했다.

스파이크의 제조. 폴리프로필렌 마이크로관에서, 희석 완충액으로 ×2로 희석하여 상기 제조한 20ng/mL 표준물로부터 10ng/mL 숙주 세포 단백질 스파이크를 제조했다. 플레이트 상에 웰당 10ng/mL 스파이크 용액을 삼중으로 로딩한다. 샘플 스파이킹을 위해 단계 6.1로부터의 20ng/mL 표준 용액을 사용했다.

스파이킹된 샘플의 제조. 폴리프로필렌 마이크로관에서, 20ng/mL 스파이크 용액(6.1)으로 300㎕의 각 24mg/mL 최종 벌크 용액을 스파이킹했다. 총 6개 웰에 대해 웰당 각 스파이킹된 샘플 용액을 삼중으로 로딩했다.

대조군의 제조. 대조군 범위는 통상적인 시험의 사용 전에 모든 새로운 대조군 스톡 용액에 대해 설정되어야 한다. 대조군 스톡: ABT-874 약물 물질 농축물의 150㎕ 분취량을 제조하고, 3년 이하 동안 표준 -80℃에서 동결 상태로 저장했다.

작업 대조군의 제조. 실온에서 대조군의 분취량을 해동시켰다. 폴리프로필렌 관에서, 희석 완충액으로 대조군을 24mg/mL까지 희석시켰다. 폴리프로필렌 마이크로관에서, 24mg/mL 대조군 용액을 희석 완충액으로 12mg/mL까지 희석시켰다. 단일 희석물을 제조하고, 대조군을 플레이트의 3개 웰에 로딩했다.

ELISA 공정. 플레이트 세척 병을 플레이트 세척 완충액(단계 5.3 참조, 1×PBS + 0.1% 트리톤 X-100)으로 충전시켰다. 플레이트 세척기를 준비했다. 다음 파라미터를 검사했다: 파라미터는 다음과 같이 설정되어야 한다: 플레이트 타입: 각 사이클(총 5 사이클)당 1: 용적: 400μl; 침지 시간: 10초; Asp. 시간: 4초.

분석 공정. 플레이트를 차가운 50mM 중탄산나트륨 중의 4㎍/mL 염소 피복 항체 혼합물 100㎕/웰로 피복시켰다. 피복 용액이 웰의 하부를 균일하게 덮을 때까지 플레이트의 측면을 가볍게 두드리고, 밀봉 테이프로 덮고, 플레이트 진탕기(또는 등가물) 상에서 속도 3으로 18시간 ± 1시간 동안 진탕시키면서, 표준 4℃에서 항온처리했다. 밤새 항온처리한 후, 플레이트를 냉동기로부터 제거하고, 실온으로 평형화시켰다. 피복물을 진탕 제거했다. 플레이트를 페이퍼 타올로 블롯팅했다. 300㎕/웰의 37℃±2℃ 카제인으로 차단하고, 밀봉 테이프로 덮고, 랩-라인 엔비론(Lab-line Environ) 플레이트 진탕기(또는 등가물) 상에서 80rpm±5rpm으로 1시간 동안 진탕시키면서, 37℃±2℃에서 항온처리했다. 표준물, 샘플, 대조군, 스파이크 및 스파이킹된 샘플을 차단 항온처리 동안 제조했다. 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척했다. 플레이트를 페이퍼 타올로 블롯팅했다. 8-채널 피펫을 사용하여, 100㎕/웰의 표준물, 샘플, 스파이크, 스파이킹된 샘플 및 대조군을 플레이트의 삼중 웰에 피펫팅했다. 100㎕/웰의 희석 완충액을 플레이트의 모든 텅빈 웰에 피펫팅했다. 밀봉 테이프로 덮고, 80rpm±5rpm으로 1시간 동안 랩-라인 엔비론 플레이트 진탕기(또는 등가물) 상에서 진탕시키면서, 37℃±2℃에서 항온처리했다. 주형을 충전시켜 플레이트 로딩시에 가이드로서 사용했다.

플레이트 판독기 설정. 주형을 설정하여, 표준물에 대해 농도를 입력했다. 샘플, 대조군, 스파이크 또는 스파이킹된 샘플의 경우에 희석 인자를 입력하지 않는다. 희석제를 함유하는 웰을 블랭크로서 지정하여 모든 웰로부터 뺀다. 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척했다. 플레이트를 페이퍼 타올로 블롯팅했다. 100㎕/웰 비오티닐화된 염소 항체를 첨가했다. 밀봉 테이프로 덮고, 80rpm±5rpm에서 1시간 동안 랩-라인 엔비론 플레이트 진탕기(또는 등가물)로 진탕시키면서, 37℃±2℃에서 항온처리했다. 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척했다. 플레이트를 페이퍼 타올로 블롯팅했다. 100㎕/웰의 뉴트라비딘-HRP 접합체 용액을 첨가했다. 밀봉 테이프로 덮고, 80rpm±5rpm에서 1시간 동안 랩-라인 엔비론 플레이트 진탕기(또는 등가물)로 진탕시키면서, 37℃±2℃에서 항온처리했다. 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척했다. 플레이트를 페이퍼 타올로 블롯팅했다. 100㎕/웰의 차가운 K-블루 기질을 첨가하고, 밀봉 테이프로 덮고, 랩-라인 역가 플레이트 진탕기(또는 등가물)로 속도 3에서 진탕시키면서, 실온에서 10분 동안(기질이 최초 열에 첨가되자마자 타이머 개시) 항온처리했다. 100㎕/웰 2M 인산(단계 5.7)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 플레이트를 플레이트 진탕기 상에 속도 3에서 3 내지 5분 동안 위치시켰다. 플레이트를 450nm에서 판독했다.

데이터 분석 및 계산. 주의: 표준 곡선의 실제 정량 한계(2.5ng/mL 표준)에 포함되고 하기 언급된 %CV 또는 % 차이 기준에 부합하는 샘플, 스파이크, 스파이킹된 샘플 및 대조군만이 허용된다. 샘플 OD가 2.5ng/mL 표준 이하에 속하는 경우, 당해 결과는 2.5ng/mL 미만인 것으로 보고되어야 한다. 당해 값을 희석된 샘플 농도(12mg/mL)로 나누어 값을 ng/mg으로 보고한다. 샘플의 숙주 세포 농도가 높아 스파이킹되지 않은 및/또는 스파이킹된 샘플을 상기 표준 곡선 위에 존재하게 하는 경우, 값을 100ng/mL 초과인 것으로 보고한다. 이어서, 당해 값을 희석 샘플 농도(12mg/mL)로 나누어 값을 ng/mg으로 보고한다. 샘플이 2.5ng/mL 표준 이하에 존재하는 경우, 스파이크 회수 계산치에 대해 샘플 값을 0으로 간주한다.

표준 곡선. 표준 농도는 프로토콜 주형에 입력해야 한다. 2차 곡선 적합이 사용된다. 결정 계수는 0.99이어야 하고, 삼중 웰 사이의 %CV는 20%이어야 한다. 이러한 기준이 부합되지 않는 경우: 하나의 표준(1수준, 3개 웰)을 제외시킬 수 있다. 1.25ng/mL가 제외되면, 2.5ng/mL 및 100ng/mL(잔류 표준 곡선 포인트) 광학 밀도에 포함되는 광학 밀도를 갖는 샘플 및 스파이킹된 샘플만이 허용된다. 추가로, 각 표준 수준의 삼중 웰에 있어서, 단일 웰이 명백히 오염되거나 낮은 결합을 나타내는 경우, 이는 제외시킬 수 있다. 웰이 표준 수준으로부터 제외되는 경우, 나머지 복제물은 % 차이 = 20%를 가져야 한다. 플레이트의 배경(블랭크)에 근접한 OD 값을 나타내는 최저 표준물에 대한 % CV는 30%이어야 한다. 하나의 웰이 제외되는 경우, 나머지 복제물에 대한 % 차이는 35%이어야 한다. 최저 표준이 제외되는 경우, 나머지 표준 곡선 수준 광학 밀도에 포함되는 광학 밀도를 갖는 샘플 및 스파이킹된 샘플만이 허용된다.

샘플. % CV는 삼중 웰 사이에서 20%이어야 한다. 삼중 웰 사이의 % CV를 보고한다. 각 샘플 희석으로부터의 하나의 웰은 제외될 수 있다. 나머지 복제물은 20%의 % 차이를 가져야 한다. 주의: 스파이킹되지 않은 샘플 OD가 2.5ng/mL 표준 OD 미만인 경우, % 차이 기준은 스파이킹되지 않은 결과에 적용하지 않는다. 상기 계산을 참조한다. 다음과 같이 평균(ng/mL) 값으로부터 실제 숙주 세포 농도를 ng/mg으로 계산한다: CHO 숙주 세포 단백질(ng/mg) = 평균 "스파이킹되지 않은 샘플 결과(ng/mL)" - 희석된 샘플 농도(12mg/ml).

스파이크. % CV는 삼중 웰 사이에서 20%이어야 한다. % CV를 보고한다. 스파이크로부터의 하나의 웰을 제외할 수 있다. 나머지 포인트는 % 차이가 20%이어야 한다. 상기 계산을 참조한다. 숙주 세포 농도를 ng/mL로 보고한다. 이 결과는 스파이크 회수 계산에 사용될 것이다. 스파이크(ng/mL)에 대해 수득한 농도는 이론적 스파이크 농도의 ±20%이어야 한다. 결과를 보고하고, 합격 또는 실패를 나타낸다. 스파이크 결과가 이론치의 20% 이내에 존재하지 않는 경우, 분석은 반복되어야 한다. 평균 스파이크 농도(ng/mL) × 100은 100% ± 20% 10ng/mL이어야 한다.

스파이킹된 샘플. % CV는 삼중 웰 사이에서 20%이어야 한다. 삼중 웰 사이의 % CV를 보고한다. 각 스파이킹된 샘플 희석으로부터의 하나의 웰은 제외할 수 있다. 나머지 복제물은 % 차이가 20%이어야 한다. 상기 계산을 참조한다. 각 희석에 대해 "스파이킹된 샘플 결과"를 ng/mL로 보고한다. 이중 희석물 사이의 % 차이를 보고한다. 희석물 사이의 % 차이는 25%이어야 한다. 이들 결과는 스파이크 회수 계산에 사용될 것이다. 하기 식을 사용하여 각 희석 설정에 대해 % 스파이크 회수를 계산한다: % 스파이크 회수 = 스파이킹된 샘플 값 - 스파이킹되지 않은 샘플 값 × 100 스파이크 값. 주의: (1) 스파이킹되지 않은 샘플의 값 OD가 2.5ng/mL 표준 이하에 포함되는 경우, % 스파이크 회수 계산에서 당해 값을 0으로 간주한다. % 스파이크 회수는 각 샘플의 각 희석에 있어서 100%±50%(50%-150%)이어야 한다. 결과 및 합격/실패를 보고한다.

대조군. % CV는 삼중 웰 사이에서 20%이어야 한다. % CV 결과를 보고한다. 대조군으로부터의 하나의 웰은 제외할 수 있다. 나머지 복제물은 % 차이가 20%이어야 한다. 상기 계산을 참조한다. 대조군 중의 숙주 세포 농도를 ng/mL로 보고한다. 숙주 세포 농도를 다음과 같이 ng/mL로 계산한다: 숙주 세포 단백질(ng/mg) = 대조군 숙주 세포 단백질 결과(ng/mL).

다수의 공개문헌이 본원에 인용되어 있고, 이들의 전체 내용은 참조로서 본원에 인용된다.

Claims (44)

1. 항체와 적어도 하나의 숙주 세포-단백질(HCP)을 포함하는 샘플 혼합물로부터 HCP 감소된 IL-18 항체 제제를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
   (a) 상기 샘플 매트릭스의 pH를 감소시켜 1차 회수 샘플을 형성하는 단계(여기서, 상기 pH의 감소는 약 3.0 내지 약 4.0이다),
   (b) 상기 1차 회수 샘플의 pH를 약 4.5 내지 약 5.5로 조정한 다음, 상기 1차 회수 샘플을 이온 교환 수지에 공급하고 이온 교환 샘플을 수집하는 단계 및
   (c) 상기 이온 교환 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지에 공급하고 HIC 샘플을 수집하는 단계(여기서, 상기 HIC 샘플은 상기 HCP 감소된 항체 제제를 포함한다)를 포함하는,
   항체와 적어도 하나의 숙주 세포-단백질(HCP)을 포함하는 샘플 혼합물로부터 HCP 감소된 IL-18 항체 제제를 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 pH의 감소가 적합한 산을 상기 샘플 혼합물과 혼합함으로써 수행되고, 상기 적합한 산이 시트르산, 아세트산, 카프릴산 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 이온 교환 수지가 음이온 교환 수지 또는 양이온 교환 수지인, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 이온 교환 수지가 양이온 교환 수지인, 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지가 프랙토겔(Fractogel), 카복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지가 프랙토겔인, 방법.
7. 제3항에 있어서, 상기 이온 교환 수지가 음이온 교환 수지인, 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지가 큐 세파로즈(Q sepharose), 디에틸아미노에틸(DEAE), 4급 아미노에틸(QAE) 및 4급 아민(Q) 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지가 큐-세파로즈인, 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 이온 교환 단계가 1차 이온 교환 단계 및 2차 이온 교환 단계를 포함하는, 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 1차 이온 교환 단계는 양이온 교환 단계이고, 그 다음은 2차 음이온 교환 단계인, 방법.
12. 제10항에 있어서, 중간 단계를 추가로 포함하고, 상기 중간 단계가 상기 1차 및 상기 2차 이온 교환 단계 사이에 수행되는 여과 단계인, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 여과 단계가 포획 한외여과/정용여과에 의해 수행되는, 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 HIC가 하나 이상의 소수성 그룹을 포함하는 컬럼을 사용하여 수행되는, 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 소수성 그룹이 알킬-, 아릴-그룹 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 컬럼이 페닐 세파로즈(예: Phenyl Sepharose^TM 6 Fast Flow 컬럼, Phenyl Sepharose^TM High Performance 컬럼), Octyl Sepharose^TM High Performance 컬럼, Fractogel^TM EMD Propyl, Fractogel^TM EDM Phenyl 컬럼, Macro-Prep^TM Methyl, Macro-Prep^TM t-Butyl Support, WP HI-Propyl(C₃)^TM 컬럼 및 Toyopearl^TM Ether, Phenyl 또는 Butyl 컬럼으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 컬럼이 페닐 세파로즈를 포함하는, 방법.
18. 제1항에 있어서, 여과 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 HIC 샘플이 바이러스 입자 제거 및 완충액 교환 촉진을 위해 여과 처리되는, 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 HCP 감소된 항체 제제가 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하는, 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부가 사람화 항체, 키메라 항체 또는 다가 항체인, 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부가 사람화 항체인, 방법.
22. 제20항에 있어서, 상기 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부가, 표면 플라스몬 공명으로 측정한 바에 의하면, 약 1.34×10^-4M 이하의 K_d 및 약 0.1s^-1 이하의 K_off 속도 상수로 사람 IL-18로부터 해리되는 분리된 사람 항체인, 방법.
23. 제19항에 있어서, 상기 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부가 생체내 및 시험관내에서 IL-18을 중화시키는, 방법.
24. 제1항에 있어서, 상기 제제가 실질적으로 HCP를 포함하지 않는, 방법.
25. 항체와 적어도 하나의 숙주 세포-단백질(HCP)을 포함하는 샘플 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 상기 샘플 매트릭스의 pH를 감소시켜 1차 회수 샘플을 형성하는 단계(여기서, 상기 pH의 감소는 약 3.0 내지 약 4.0이다),
    (b) 상기 1차 회수 샘플의 pH를 약 4.5 내지 약 5.5로 조정한 다음, 상기 1차 회수 샘플을 양이온 교환 수지에 공급하고 양이온 교환 샘플을 수집하는 단계,
    (c) 상기 양이온 교환 샘플을 음이온 교환 수지에 공급하고 음이온 교환 샘플을 수집하는 단계 및
    (d) 상기 음이온 교환 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지에 공급하고 HIC 샘플을 수집하는 단계(여기서, 상기 HIC 샘플은 상기 HCP 감소된 항체 제제를 포함한다)를 포함하는,
    항체와 적어도 하나의 숙주 세포-단백질(HCP)을 포함하는 샘플 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제를 제조하는 방법.
26. 항체와 적어도 하나의 숙주 세포-단백질(HCP)을 포함하는 샘플 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 상기 샘플 매트릭스의 pH를 감소시켜 1차 회수 샘플을 형성하는 단계(여기서, 상기 pH의 감소는 약 3.0 내지 약 4.0이다),
    (b) 상기 1차 회수 샘플의 pH를 약 4.5 내지 약 5.5로 조정한 다음, 상기 1차 회수 샘플을 양이온 교환 수지에 공급하고 양이온 교환 샘플을 수집하는 단계,
    (c) 상기 양이온 교환 샘플을 여과하고 여과액을 수집하는 단계,
    (d) 상기 단계(c)로부터의 여과액을 음이온 교환 수지에 공급하고 음이온 교환 샘플을 수집하는 단계 및
    (d) 상기 음이온 교환 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지에 공급하고 HIC 샘플을 수집하는 단계(여기서, 상기 HIC 샘플은 상기 HCP 감소된 항체 제제를 포함한다)를 포함하는,
    항체와 적어도 하나의 숙주 세포-단백질(HCP)을 포함하는 샘플 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제를 제조하는 방법.
27. 제1항의 방법에 의해 생산된 HCP 감소된 항체 제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
28. 제27항에 있어서, 상기 항체가 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부인, 약제학적 조성물.
29. 제27항에 있어서, 상기 조성물이 실질적으로 HCP를 포함하지 않는, 약제학적 조성물.
30. 제27항에 있어서, IL-18에 의해 촉진된 장애를 중화시키는데 사용되는, 약제학적 조성물.
31. 제30항에 있어서, 상기 장애가 자가면역 질환, 타입 I 당뇨병, 관절염, 류마티스성 관절염, 이식 거부, 염증성 장 질환, 패혈증, 다발성 경화증, 허혈성 심장 질환(심장 발작 포함), 허혈성 뇌 손상, 만성 간염, 건선, 만성 췌장염, 급성 췌장염, 알콜성 간염, 바이러스성 간염, 면역 간염, 전격성 간염, 간 간경변 및 원발성 담즙성 간경변으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
32. 제31항에 있어서, 상기 관절염이 강직성 척추염, 허리 통증, 손목 침착 증후군, 엘러스-단로스-증후군(Ehlers-Danlos-Syndrome), 통풍, 연소자 관절염, 홍반성 낭창, 근염, 골형성 부전, 골다공증, 다발성 관절염, 다발성 근염, 건선성 관절염, 라이터 증후근(Reiter's syndrome), 경피증, 장 질환을 동반한 관절염, 베체트병(Behcets's disease), 소아 관절염, 퇴행성 관절 질환, 섬유근육통, 감염성 관절염, 라임 질환(Lyme disease), 마르팡 증후군(Marfan syndrome), 골관절염, 골괴사, 파제트병(Pagets Disease), 류마티스성 다발성 근육통, 가성 통풍, 반사성 교감신경 이영양증, 류마티스성 관절염, 류마티즘, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 가족성 선종성 용종증 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
33. 제27항에 있어서, 비스테로이드성 또는 스테로이드성 항염증 약물을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
34. 제33항에 있어서, 비스테로이드성 항염증 약물을 포함하는, 약제학적 조성물.
35. 제34항에 있어서, 상기 비스테로이드성 항염증 약물이 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 프레드니솔론 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
36. 제33항에 있어서, 스테로이드성 항염증 약물을 포함하는, 약제학적 조성물.
37. 제27항에 있어서, 하나 이상의 다른 항체 또는 이의 항원 결합부를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
38. 제27항에 있어서, 약제(pharmaceutical agent)를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
39. 제38항에 있어서, 상기 약제가 메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린, 설파살라진, 메살라진, 올살라진, 클로로퀴닌/하이드록시클로로퀸, 펜실라민, 오로티오말레이트, 아자티오프린, 콜히친, 코르티코스테로이드, β-2-아드레노수용체 효능제(살부타몰, 테르부탈린, 살메테랄), 크산틴(테오필린, 아미노필린), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로피움 및 옥시트로피움, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린제, TNFα 또는 IL-1 등의 염증촉진성 사이토킨에 의한 시그날링을 간섭하는 제제(예: IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환 효소 억제제(예: Vx740), 항-P7, p-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), TNFα 전환 효소(TACE) 억제제, T-세포 시그날링 억제제, 예를 들면, 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토-퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체 및 이들의 유도체(예: 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체 및 유도체 p75TNFRIgG(Enbrel^TM) 및 p55TNFRIgG(Lenercept), sIL-1 RI, sIL-1RII, sIL-6R, 가용성 IL-13 수용체(sIL-13)) 및 항염증 사이토킨(예: IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
40. 제1항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCP 감소된 항체 제제가 하나 이상의 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하고 표지화되는, 방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 표지가 방사성인, 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 방사성 표지가 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 및 ³H로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
43. 제40항에 있어서, 상기 표지가 비방사성인, 방법.
44. 제1항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCP 감소된 항체 제제가 하나 이상의 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합부를 포함하고 페길화되는, 방법.

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