JP2012506239A - Ｉｌ−１８に結合する抗体およびそれを精製する方法 - Google Patents

Abstract

本明細書において、抗ＩＬ−１８抗体が開示され、これは、この抗原結合部分を包含する。試料母体から抗ＩＬ−１８抗体を単離および精製するための１つ以上の方法が示される。これらの単離された抗ＩＬ−１８抗体は、臨床現場および研究開発に使用することができる。単離された抗ＩＬ−１８抗体を含む医薬組成物も記載される。

Description

（関連出願への参照）
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２００８年１０月２０日に出願した米国仮出願第６１／１９６，７５１号の利益を主張するものである。

（発明の背景）
ヒトインターロイキン１８は、１９３個のアミノ酸の生物学的に不活性な前駆体タンパク質として合成される、同定されたサイトカインである。例えばカスパーゼ１またはカスパーゼ４による前駆体タンパク質の切断により、Ｔ細胞増殖の同時刺激、ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強、Ｔ細胞およびＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生の誘導ならびに１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）の分化の強化を含む生物活性を示す、１５６個のアミノ酸の成熟タンパク質が遊離される。さらに、ＩＬ−１８は、ＩＬ−８、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびプロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ_２）を含むヒト単球炎症誘発性メディエーターの効果的なインデューサーである。

ＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞におけるＦａｓリガンドの機能活性を増大させることによって、免疫調節または炎症に潜在的な役割を果たす。ＩＬ−１８はまた、副腎皮質において発現し、したがってストレスの多い経験の後に免疫系を編成するのに重要な役割を果たす神経免疫調節物質を分泌し得る。

ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−βなどの炎症誘発性サイトカインを産生するＴｈ１細胞は、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、１型すなわちインスリン依存性糖尿病（ＥＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および乾癬を含む多くの自己免疫疾患の媒介に関連付けられた。したがって、ＩＬ−１８などのＴＨ１促進性サイトカインのアンタゴニストは、疾患の発症を阻害することが期待され得る。Ｉｌ−１８特異的ｍＡｂは、アンタゴニストとして使用でき得る。

インビボにおいて、ＩＬ−１８はプロＩＬ−１８の切断によって形成され、その内在的活性は、Ｐ．アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）およびＬＰＳ媒介性致死におけるＩＦＮ−γ産生の原因となるようである。ヒト疾患においてＩＬ−１８の生物活性をブロックすることは、多くの疾患における治療戦略である。これは、可溶性受容体、または細胞結合性ＩＬ−１８受容体に対する遮断抗体を用いて遂行することができる。

サイトカイン結合性タンパク質（可溶性サイトカイン受容体）は、それらのそれぞれの細胞表面サイトカイン受容体の細胞外リガンド結合性ドメインに相当する。それらは、その細胞表面受容体に共通のｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシング、またはその細胞表面受容体のタンパク質分解性切断のいずれかに由来する。とりわけＩＬ−１６およびＩＦＮ−γの可溶性受容体を含む、かかる可溶性受容体が過去に記載されている。ＴＮＦＲ／Ｆａｓファミリーのメンバーである、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ、破骨細胞抑制因子−ＯＣＥＦとしても知られる）と名付けられた、１つのサイトカイン結合性タンパク質は、分泌タンパク質としてのみ存在する可溶性受容体の最初の例のようである。

ＩＬ−１８は、エンドトキシンショック、肝炎および自己免疫性糖尿病を含む慢性炎症性疾患において病原性の進行に関わることが示唆された。肝損傷の発症におけるＩＬ−１８の可能性のある役割は、マウスモデルにおいてリポ多糖誘導性急性肝損傷でのＩＬ−１８の上昇したレベルを示す実験に基づいて仮定された。しかし、肝損傷の発症における多機能性因子ＩＬ−１８のメカニズムは今のところ解明されていない。

最近の研究では、ＩＬ−１８が、関節の代謝に炎症誘発の役割を果たすことが示されている。研究者らは、ＩＬ−１８が関節軟骨細胞によって産生され、炎症誘発および異化反応を誘導することを示した。ＩＬ−１８ｍＲＮＡは、軟骨細胞中でＩＬ−１βによって誘導された。軟骨細胞は、ＩＬ−１８前駆体を産生し、ＩＬ−１刺激に応答して、ＩＬ−１８の成熟形態を分泌した。軟骨細胞へのＩＬ−１８の影響についての研究により、それがＴＧＦ−β誘導性増殖を阻害し、一酸化窒素の産生を増強することがさらに示された。ＩＬ−１８は、誘導型一酸化窒素合成酵素、誘導型シクロオキシゲナーゼ、ＩＬ−６およびストロメライシンを含む、いくつかの遺伝子の発現を正常なヒト関節軟骨細胞において刺激した。遺伝子発現が、対応するタンパク質の合成に伴った。ＩＬ−１８を用いる正常なヒト関節軟骨の治療により、グリコサミノグリカンの放出が増加した。これらの発見により、ＩＬ−１８は、軟骨細胞の応答を制御し、軟骨の分解に寄与するサイトカインとして同定された。

ＩＬ−１８は、関節リウマチにおいて炎症誘発の役割を果たすことが示唆された。ＩＬ−１８のレベルは、関節リウマチ患者の滑液中で著しく上昇することが示された。研究者らは、骨関節炎の対照より顕著に高いレベルで、関節リウマチの滑膜組織内でＩＬ−１８ｍＲＮＡおよびタンパク質を検出した。ＩＬ−１２またはＩＬ−１５とＩＬ−１８との組合せが、インビトロで滑膜組織によるＩＦＮ−γ産生を誘導することも示された。その上、コラーゲン／不完全フロイントアジュバンド免疫化マウスへのＩＬ−１８の投与により、びらん性炎症性関節炎の発症が促進され、このことは、ＩＬ−１８がインビボにおいて炎症誘発性であり得ることを示唆する。

他の自己免疫疾患の発症において、ＩＬ−１８の役割が実際に示された。それにより、疾患発症の直前に、ＩＬ−１８の発現が、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスの膵臓および脾臓において顕著に増加することが実際に示された。その上、ＩＬ−１８の投与により、マウス実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、すなわち多発性硬化症用のモデルであるＴｈ１媒介性自己免疫疾患の臨床的重症度が増加することが実際に示された。さらに、中和型抗ラットＩＬ−１８抗血清により、メスのＬｅｗｉｓラットにおいてＥＡＥの発症が予防されることが示された。したがって、ＩＬ−１８は、自己免疫のための新規治療の開発についての望ましい標的である。

ＩＬ−１８は、炎症性の増強および機能の減衰化の両方を有する多面的インターロイキンである。一方でそれは、炎症誘発性サイトカイン様ＴＮＦ−αの産生を増強し、したがって炎症性を促進する。他方でそれは、ＮＯ、すなわちカスパーゼ１の阻害剤の産生を誘導し、したがってＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の成熟をブロックし、炎症性を減衰化させる可能性がある。このＩＬ−１８の多義的役割により、炎症性疾患の治療におけるＩＬ−１８阻害剤の有効性に対する疑問が生じた。その上、炎症性の制御における幅広い様々な異なるサイトカインおよびケモカインの相互作用のため、かかる複雑なシナリオにおいて、１つのプレーヤーのみをブロックすることによって有益な効果が得られることは期待できなかった。

上記にかかわらず、中和型ＩＬ−１８抗体は、自己免疫疾患および関連症状の軽減に有用であると考えられる。したがって、ヒトインターロイキン１８に対する中和型モノクローナル抗体などの高親和性ＩＬ−１８抗体の必要性が、当技術分野にある。その上、ＩＬ−１８に対する抗体を含む治療計画が、高純度のものであることが重要である。本発明は、プロテインＡカラムの使用または同等のプロテインＡベースの精製ステップなしに、この必要性に取り組む。

（発明の要旨）
ある種の実施形態では、本発明は、ＩＬ−１８に結合する、精製され単離された抗体および抗体フラグメント、ならびにかかる抗体およびフラグメントを含む医薬組成物を対象とする。ある種の実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−１８に結合する、単離された抗体またはこの抗原結合部分に関する。本発明の単離された抗ＩＬ−１８抗体は、臨床現場および研究開発に使用することができる。ある種の実施形態では、本発明は、配列番号１および２で確認される重鎖および軽鎖配列を含む抗ＩＬ−１８抗体を対象とする。

本発明のある種の実施形態は、それらが宿主細胞タンパク質（「ＨＣＰ」）を実質的に含まないようにするために、試料母体から抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合部分を精製する方法を対象とする。ある種の態様では、試料母体（または単に「試料」）は、本発明の抗ＩＬ−１８抗体を産生するために採用される細胞株を含む。特定の態様では、試料は、ヒト抗ＩＬ−１８抗体を産生するために使用される細胞株を含む。

本発明のある種の実施形態では、推定上の抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合部分を含む試料母体は、ｐＨ調整に供する。ある種の態様では、ｐＨは、約３．５に調整する。低ｐＨは、とりわけ、試料に混入し得るｐＨ感受性ウイルスの減少および／または不活性化を促進する。適した期間の後、ｐＨをおよそ５．０に調整し、試料をイオン交換クロマトグラフィに供して溶出液を生成する。ある種の態様では、イオン交換の溶出液を収集し、疎水性相互作用クロマトグラフィにさらに供して、溶出液を生成する。疎水性相互作用クロマトグラフィの溶出液は、次いでさらなる処理または使用のために収集することができる。

ある種の実施形態では、本発明は、とりわけ、細胞および細胞の残骸を除去するための一次回収ステップを含む、ＩＬ−１８抗体の精製方法を提供する。上記方法のある種の実施形態では、一次回収ステップは、１つ以上の遠心分離または深層濾過のステップを含む。例えば、限定するものではないが、かかる遠心分離ステップは、およそ７０００×ｇからおよそ１１，０００×ｇで行うことができる。さらに、上記方法のある種の実施形態は、デリピッド深層濾過ステップなどの深層濾過ステップを含む。

上記方法のある種の実施形態では、イオン交換ステップは、陽イオンもしくは陰イオン交換クロマトグラフィのいずれかまたは両方の組合せであってよい。このステップは、陽イオン交換ステップに続いて陰イオン交換ステップまたはその逆などの複数のイオン交換ステップを含むことができる。ある種の態様では、イオン交換ステップは、２つのステップのイオン交換工程を含む。かかる２つのステップの工程は、例えば、限定するものではないが、第１陽イオン交換ステップに続いて第２の陰イオン交換ステップによって達成することができる。典型的な陽イオン交換カラムは、固定相が陰イオン基を含む、ＣＭ Ｈｙｐｅｒ ＤＦ（商標）カラムなどのカラムである。このイオン交換捕獲クロマトグラフィステップは、一次回収の混合物からの抗ＩＬ−１８抗体の単離を促進する。適した陰イオン交換カラムは、固定相が陽イオン基を含むカラムである。かかるカラムの例は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムである。１つ以上のイオン交換ステップは、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡ、適用できる場合は親和性基質タンパク質のような不純物を減少させることによって抗ＩＬ−１８抗体をさらに単離する。この陰イオン交換手順は、クロマトグラフィのフロースルー様式であり、抗ＩＬ−１８抗体は、陰イオン交換樹脂（または固相）と相互作用または結合しない。しかし、多くの不純物は、陰イオン交換樹脂と相互作用および結合する。

ある種の実施形態では、第１および第２のイオン交換ステップは、一次回収に続いて行う。かかる実施形態のある種のものでは、イオン交換試料は、第１のイオン交換ステップの前、２つのイオン交換ステップの間、または両方のいずれかで、中間濾過ステップに供する。ある種の態様では、この濾過ステップは、捕獲限外濾過／透析濾過（「ＵＦ／ＤＦ」）を含む。他の活動の中で、かかる濾過は、抗ＩＬ−１８抗体およびその抗原結合部分の濃縮およびバッファー交換を促進させる。

本発明のある種の実施形態は、１つ以上の疎水性相互作用クロマトグラフィ（「ＨＩＣ」）ステップを含む方法を提供する。適したＨＩＣカラムは、固定相が疎水基を含むものである。かかるカラムの非限定的な例は、Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムである。ある種の環境では、抗ＩＬ−１８抗体は、単離／精製工程の間に凝集体を形成する。１つ以上のＨＩＣステップを含むことにより、かかる凝集の減少または排除が促進される。ＨＩＣは、不純物の除去にも役立つ。ある種の実施形態では、ＨＩＣステップは、抗ＩＬ−１８抗体（またはその凝集）と疎水性カラムとの相互作用を促進するために、高塩濃度バッファーを採用する。抗ＩＬ−１８抗体は、次いでより低い濃度の塩を用いて溶出することができる。

ある種の実施形態では、ＨＩＣ溶出液は、これに限定されないが、Ｕｌｔｉｐｏｒ ＤＶ５０（商標）フィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、Ｎ．Ｙ．）などのウイルス性除去フィルターを用いて濾過する。Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓ．）、Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ ＶＲ（商標）フィルター（ＣＵＮＯ；Ｍｅｒｉｄｅｎ、Ｃｏｎｎ．）およびＰｌａｎｏｖａ（商標）フィルター（旭化成ファーマ、Ｐｌａｎｏｖａ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、Ｉｌｌ．）などの代替的なフィルターも、かかる実施形態で使用することができる。

ある種の実施形態では、本発明は、単離された抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合部分および許容可能な担体を含む、１つ以上の医薬組成物を対象とする。１つの態様では、組成物は、抗ＩＬ−１８抗体に加えて、１つ以上の抗体またはこの抗原結合部分をさらに含む。別の態様では、組成物は、１つ以上の医薬品をさらに含む。

本発明の精製計画の非限定的な例を表す図である。 抗ＩＬ−１８抗体（ＡＢＴ−３２５）の非限定的な例の重鎖および軽鎖配列を開示する図である。

（発明の詳細な記述）
本発明は、ＩＬ−１８に結合する抗体を対象とする。１つの態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１８に結合する、単離された抗体またはこの抗原結合部分に関する。本発明の単離された抗ＩＬ−１８抗体は、臨床現場および研究開発に使用することができる。本発明は、抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合部分を精製するための方法にも関する。本発明に関連して精製できる適した抗ＩＬ−１８抗体は、ＵＳＳＮ０９／７８０，０３５および１０／９８８，３６０に開示され、続いてＡＢＴ−３２５と同定された抗体を含む。ＡＢＴ−３２５の重鎖および軽鎖配列は、図２に示される。本発明は、本明細書で記載された、抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合部分を含む医薬組成物にも関する。

明確にするために、限定するものではないが、この詳細な記述は、次の従属部に分割される：
１．定義、
２．抗体の生成、
３．抗体の産生、
４．抗体の精製、
５．試料純度をアッセイする方法、
６．さらなる修飾、
７．医薬組成物および
８．抗体の使用

１．定義
本発明をより容易に理解するために、ある種の用語を最初に定義する。

用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖から成る免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖の可変領域（本明細書でＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖の定常領域（ＣＨ）から成る。重鎖の定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から成る。各軽鎖は、軽鎖の可変領域（本明細書でＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖の定常領域から成る。軽鎖の定常領域は、１つのドメイン、すなわちＣＬから成る。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存される領域が散在し、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に次の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。

抗体の「抗原結合部分」（または「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ｈＩＬ−１８）と特異的に結合する能力を保持する抗体のフラグメントを含む。抗体の抗原結合の機能は、完全長抗体のフラグメントによって果たせることが示された。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合性フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを含む１価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインを含むＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂフラグメント（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６頁）ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、すなわちＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を用いて連結されることができ、合成リンカーによって、ＶＬおよびＶＨ領域対により一価の分子を形成できる単一タンパク質鎖としてそれらをつくることが可能になる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６頁およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３頁を参照されたい）。かかる単一鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図する。二重特異性抗体などの単一鎖抗体の他の形態も包含される。二重特異性抗体は、２価の二重特異的な抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインが、単一ポリペプチド鎖上で発現するが、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対にできないリンカーを用い、それによってドメインを別の鎖の相補性ドメインと対にさせ、２つの抗原結合部位がつくられる（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３頁を参照されたい）。その上さらに、抗体またはこの抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドと共有または非共有結合によって形成される、より大きな免疫接着分子の一部であってよい。かかる免疫接着分子の例には、ストレプトアビジンのコア領域を用いて四量体のｓｃＦｖ分子をつくること（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６；９３−１０１頁）、およびシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグを用いて２価のビオチン化ｓｃＦｖ分子をつくること（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８頁）が挙げられる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントなどの抗体部分は、全抗体のそれぞれに、パパインまたはペプシン消化などの従来技法を用いて、全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、本明細書に記載のような標準的な組換えＤＮＡ技法を用いて得ることができる。１つの態様では、抗原結合部分は、完全ドメインまたは完全ドメインの対である。

表現「ヒトインターロイキン１８」（本明細書でｈＩＬ−１８またはＩＬ−１８と省略される）は、本明細書で使用するとき、１９３個のアミノ酸の生物学的に不活性な前駆体タンパク質が最初に合成され、１５６個のアミノ酸の成熟タンパク質が、限定するものではないが、例えばカスパーゼ１またはカスパーゼ４による、例えば前駆体タンパク質の切断により産生され、Ｔ細胞増殖の同時刺激、ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強、Ｔ細胞およびＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生の誘導ならびに１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）の分化の強化を含む生物活性を示すヒトサイトカインを含む。ＩＬ−１８をコードする核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１５６２として入手でき、ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１５５３として入手することができる。用語ヒトＩＬ−１８は、標準的な組換え発現方法によって調製できる、組換えヒトＩＬ−１８（ｒｈＩＬ−１８）を含むことを意図する。

用語「Ｋａｂａｔの番号付け」、「Ｋａｂａｔの規定」および「Ｋａｂａｔの標識化」は、本明細書では互換的に使用される。当技術分野で認識されるこれらの用語は、抗体またはこの抗原結合部分の重鎖および軽鎖の可変領域における他のアミノ酸残基より可変的（すなわち、超可変的）であるアミノ酸残基を番号付けるシステムをいう（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔら（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１頁およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）。重鎖の可変領域について、超可変領域は、ＣＤＲ１についてはアミノ酸位置３１から３５、ＣＤＲ２についてはアミノ酸位置５０から６５、およびＣＤＲ３についてはアミノ酸位置９５から１０２に及ぶ。軽鎖の可変領域について、超可変領域は、ＣＤＲ１についてはアミノ酸位置２４から３４、ＣＤＲ２についてはアミノ酸位置５０から６５、およびＣＤＲ３についてはアミノ酸位置８９から９７に及ぶ。

用語「ヒト抗体」は、Ｋａｂａｔらによって記載されたような、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列に対応する、可変および定常領域を有する抗体を含む（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含むことができる。変異は、「選択的変異誘発アプローチ」を用いて導入することができる。ヒト抗体は、アミノ酸残基、例えば、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列によってコードされない活性増強型アミノ酸残基と置換された、少なくとも１つの位置を有することができる。ヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列の一部ではないアミノ酸残基と置換された、最大２０個の位置を有することができる。他の実施形態では、最大１０、最大５、最大３または最大２つの位置が置換される。１つの実施形態では、これらの置換は、ＣＤＲ領域内である。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用するとき、ＣＤＲ配列が、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来し、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含まないことを意図する。

表現「選択的変異誘発アプローチ」は、少なくとも１つの適した選択的変異誘発位置、高頻度変異および／または接触位置で、ＣＤＲアミノ酸を選択し、個々に変異させることによって、抗体の活性を改善する方法を含む。「選択的に変異させた」ヒト抗体は、選択的変異誘発アプローチを用いて選択された位置での変異を含む抗体である。別の態様では、選択的変異誘発アプローチは、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３（下文ではそれぞれＨ１、Ｈ２およびＨ３）または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３（下文ではそれぞれＬ１、Ｌ２およびＬ３という）において、選択された個々のアミノ酸残基を優先的に変異させる方法を提供することを意図する。アミノ酸残基は、選択的変異誘発位置、接触位置または高頻度変異位置から選択することができる。個々のアミノ酸は、軽鎖または重鎖の可変領域におけるそれらの位置に基づいて選択される。高頻度変異位置が、接触位置であってもよいことを理解されたい。１つの態様では、選択的変異誘発アプローチは、「標的型アプローチ」である。言葉「標的型アプローチ」は、標的法、例えば、「群に対する標的型アプローチ」または「ＣＤＲに対する標的型アプローチ」において、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３において選択された個々のアミノ酸残基を変異させる方法を含むことを意図する。「群に対する標的型アプローチ」では、特定の群における個々のアミノ酸残基は、群Ｉ（Ｌ３およびＨ３を含む）、ＩＩ（Ｈ２およびＬ１を含む）およびＩＩＩ（Ｌ２およびＨ１を含む）を含む選択的変異について標的にされ、前記群は、標的の優先度の順番で載せる。「ＣＤＲに対する標的型アプローチ」では、特定のＣＤＲにおける個々のアミノ酸は、次のような標的の優先度の順番：Ｈ３、Ｌ３、Ｈ２、Ｌ１、Ｈ１およびＬ２で、選択的変異について標的にされる。選択されたアミノ酸残基は、例えば、少なくとも２つの他のアミノ酸残基に変異させ、抗体の活性への変異の効果を決定する。活性は、抗体の結合特異性／親和性、および／または抗体の中和効力における変化として測定する。選択的変異誘発アプローチは、ファージ提示、ヒトＩｇＧ生殖系列遺伝子を有するトランスジェニック動物、ヒトＢ細胞から単離したヒト抗体が挙げられる任意の供給源に由来する任意の抗体の最適化に使用することができることを理解されたい。選択的変異誘発アプローチは、ファージ提示技術を用いてさらに最適化できない抗体に置いて使用することができる。ファージ提示、ヒトＩｇＧ生殖系列遺伝子を有するトランスジェニック動物、ヒトＢ細胞から単離したヒト抗体が挙げられる任意の供給源由来の抗体を、選択的変異誘発アプローチの前または後に逆突然変異に供することができることを理解されたい。

表現「組換えヒト抗体」は、宿主細胞に形質移入した組換え発現ベクターを用いて発現した抗体、組換え体から単離した抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリ、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離した抗体（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５頁を参照されたい）または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライスを含む任意の他の手段によって調製、発現、作成もしくは単離した抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作成または単離するヒト抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列に由来する可変および定常領域を有する（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）。しかし、ある種の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、インビトロでの変異誘発（または、ヒトＩｇ配列のトランスジェニック動物を使用するときは、インビボでの体細胞変異誘発）に供し、したがって組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来および関連するが、インビボにおいて生殖系列のヒト抗体レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。しかし、ある種の実施形態では、かかる組換え抗体は、選択的変異誘発アプローチもしくは逆突然変異または両方の結果である。

「単離した抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を含む（例えば、ｈＩＬ−１８と特異的に結合する単離した抗体は、ｈＩＬ−１８以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ｈＩＬ−１８と特異的に結合する単離した抗体は、他の種由来のＩＬ−１８分子と結合することができる。さらに、単離した抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含み得ない。

「中和抗体」（またはｈＩＬ−１８活性を中和した抗体）は、ｈＩＬ−１８との結合により、ｈＩＬ−１８の生物活性の阻害をもたらす抗体を含む。ｈＩＬ−１８の生物活性のこの阻害は、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生の誘導またはヒトＩＬ−１８受容体結合アッセイにおけるＩＬ−１８受容体結合の阻害などの、ｈＩＬ−１８の生物活性の１つ以上の指標を測定することによって評価することができる。ｈＩＬ−１８の生物活性のこれらの指標は、当技術分野で既知のインビトロまたはインビボにおける１つ以上のいくつかの標準的なアッセイによって評価することができる。

用語「活性」は、例えば、ＩＬ−１８抗原に結合する抗ｈＩＬ−１８抗体などの抗体の抗原に対する結合特異性／親和性、および／または例えば、ｈＩＬ−１８との結合により、ｈＩＬ−１８の生物活性を阻害する抗ｈＩＬ−１８抗体などの抗体の中和効力、例えば、ＰＨＡ芽細胞増殖の阻害またはヒトＩＬ−１８受容体結合アッセイにおける受容体結合の阻害などの活性を含む。

表現「表面プラズモン共鳴」は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムの生体特異的相互作用の解析を可能にする光学現象を含む。さらなる説明については、その全体の教示が本明細書に組み込まれる、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６頁；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０−６２７頁；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１頁およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７頁を参照されたい。

用語「Ｋ_ｏｆｆ」は、本明細書で使用するとき、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定数をいうことを意図する。

用語「Ｋ_ｄ」は、本明細書で使用するとき、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数をいうことを意図する。

表現「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含む。核酸分子は、単一鎖または二重鎖でよいが、１つの態様では、二重鎖ＤＮＡである。

ｈＩＬ−１８と結合する（単離した抗体を含む）抗体または抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関して本明細書で使用するとき、表現「単離した核酸分子」は、抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、ｈＩＬ−１８以外の抗原と結合する抗体または抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まず、他の配列が、天然ではヒトゲノムＤＮＡにおける該核酸に隣接し得る、核酸分子を含む。したがって、例えば、抗ＩＬ−１８抗体のＶＨ領域をコードする本発明の単離した核酸は、ＩＬ−１８以外の抗原と結合する他のＶＨ領域をコードする他の配列を含まない。表現「単離した核酸分子」は、ＶＨおよびＶＬ領域が、二重特異性抗体の配列以外の他の配列を含まない二重特異性抗体などの、２価の二重特異的な抗体をコードする配列を含むことも意図する。

表現「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を含む。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫もいうことを意図すると理解されたい。変異または環境の影響のいずれかにより、後の世代である種の改変が起こり得るため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではあり得ないが、本明細書で使用するとき、用語「宿主細胞」の範囲内にやはり含まれる。

用語「改変」は、本明細書で使用するとき、抗体またはこの抗原結合部分における１つ以上のアミノ酸の変更をいうこと意図する。変更は、１つ以上の位置でアミノ酸を付加、置換または欠失させることによって生じさせることができる。変更は、ＰＣＲ変異誘発などの既知の技法を用いて生じさせることができる。

用語「約」は、本明細書で使用するとき、基準値よりおよそ１０−２０％大きいまたは小さい範囲をいうことを意図する。ある種の環境では、当業者は、基準値の性質のため、用語「約」は、その値から１０−２０％より多くまたは少なく逸脱することを意味できると理解する。

表現「ウイルスの減少／不活性化」は、本明細書で使用するとき、特定の試料中のウイルス粒子の数の低下（「減少」）および例えば、これに限定されないが、特定の試料中のウイルス粒子の感染力または複製能などの活性の低下（「不活性化」）をいうことを意図する。ウイルス粒子の数および／または活性のかかる低下は、およそ約１％から約９９％、好ましくは約２０％から約９９％、より好ましくは約３０％から約９９％、より好ましくは約４０％から約９９％、さらにより好ましくは約５０％から約９９％、さらにより好ましくは約６０％から約９９％、さらにより好ましくは約７０％から約９９％、さらにより好ましくは約８０％から約９９％、さらにより好ましくは約９０％から約９９％程度であってよい。ある種の非限定的な実施形態では、ウイルスの量は、精製した抗体産物中に少しでも存在すれば、そのウイルスについてＩＤ５０（標的集団の５０％に感染するウイルスの量）より少なく、好ましくはそのウイルスについてＩＤ５０より少なくとも１０倍少ない、より好ましくはそのウイルスについてＩＤ５０より少なくとも１００倍少ない、さらにより好ましくはそのウイルスについてＩＤ５０より少なくとも１０００倍少ない。

表現「接触位置」は、２６の既知の抗体−抗原構造のうち１つにおいて、抗原と接触するアミノ酸によって占められる抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３におけるアミノ酸位置を含む。２６の既知の解明された抗体−抗原複合体の構造のいずれかにおいて、ＣＤＲアミノ酸が抗原と接触すれば、そのときそのアミノ酸は接触位置を占めると考えることができる。接触位置は、抗原と接触するアミノ酸によって占められる確率が、非接触位置より高い。１つの態様では、接触位置は、２６の構造の３つより多い構造において抗原と接触するアミノ酸を含むＣＤＲ位置である（＞１．５％）。別の態様では、接触位置は、２５の構造のうち８つより多い構造において抗原と接触するアミノ酸を含むＣＤＲ位置である（＞３２％）。

２．抗体の生成
用語「抗体」は、このセクションで使用するとき、インタクトな抗体またはこの抗原結合フラグメントをいう。

本開示の抗体は、対象とする抗原による動物の免疫化を含む様々な技法に続き、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５頁の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技法によって生成させることができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が原則として好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換を採用することができる。

ハイブリドーマを調製するための１つの好ましい動物系は、マウス系である。ハイブリドーマの産生は、非常によく確立された手順である。免疫化プロトコールおよび融合のために免疫化した脾細胞を単離するための技法は、当技術分野で既知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も既知である。

抗体は、好ましくは、ヒト、キメラまたはヒト化抗体であってよい。本開示のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製された非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖の免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象とする非ヒトハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学的技法を用いて、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作成するために、当技術分野で既知の方法を用いて、マウス可変領域を、ヒト定常領域に連結させることができる（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）。ヒト化抗体を作成するために、当技術分野で既知の方法を用いて、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒらの米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。

１つの非限定的な実施形態では、本開示の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ＩＬ−１８を対象とするかかるヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりむしろヒト免疫系の部分を保有するトランスジェニックまたはトランスクロモソミックマウスを用いて生成させることができる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミックマウスは、ＨｕＭＡｂ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）、ＫＭ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）およびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ）として本明細書で称されるマウスを含む。

さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的なトランスクロモソミック動物系は、当技術分野で入手でき、本開示の抗ＩＬ−１８抗体を産生させるために使用することができる。例えば、「ＴＣマウス」として称される、ヒト重鎖トランスクロモソームおよびヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を保有するマウスを使用でき、かかるマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７２２−７２７頁に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモソームを保有する雌ウシは、当技術分野で記載されており（例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：８８９−８９４頁およびＰＣＴ出願ＷＯ２００２／０９２８１２）、本開示の抗ＩＬ−１８抗体を産生するために使用することができる。

本明細書で開示される、抗ＩＬ−１８抗体もしくはその抗体結合性部分または抗ＩＬ−１８関連抗体を含む本発明の組換えヒト抗体は、コンビナトリアル組換え抗体ライブラリ、例えば、ヒトリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製したヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを用いて調製したｓｃＦｖファージ提示ライブラリの選別によって単離することができる。かかるライブラリを調製および選別するための方法論は、当技術分野で既知である。ファージ提示ライブラリを作成するための市販のキット（例えば、その全体の教示が本明細書に組み込まれる、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージ提示キット、カタログ番号２４０６１２）に加えて、抗体提示ライブラリの作成および選別の使用に特に適した方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号明細書；ＫａｎｇらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／１８６１９；ＤｏｗｅｒらのＰＣＴ出願ＷＯ９１／１７２７１；ＷｉｎｔｅｒらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／２０７９１；ＭａｒｋｌａｎｄらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／１５６７９；ＢｒｅｉｔｌｉｎｇらのＰＣＴ出願ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／０１０４７；ＧａｒｒａｒｄらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２頁；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５頁；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１頁；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４頁；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９−８９６頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８頁；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：３５７６−３５８０頁；Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３−１３７７頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３−４１３７頁およびＢａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７９７８−７９８２頁で見出すことができ、その全体の教示が本明細書に組み込まれる。

本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体応答が免疫化において生成できるようにヒト免疫細胞を再構築したＳＣＩＤマウスを用いて調製することもできる。かかるマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらの米国特許第５，４７６，９９６および５，６９８，７６７号明細書に記載されている。

１つの実施形態では、本発明の方法は、抗ＩＬ−１８抗体および抗体部分、抗ＩＬ−１８関連抗体および抗体部分、ならびに低度の解離速度によるｈＩＬ−１８との高親和性結合および高中和能などの、抗ＩＬ−１８抗体と同等の特性を有するヒト抗体および抗体部分を含む。１つの態様では、本発明は、共に表面プラズモン共鳴による測定にて約１×１０^−８Ｍ以下のＫ_ｄ速度定数および１×１０^−３ｓ^−１以下のＫ_ｏｆｆ速度定数でｈＩＬ−１８から解離する単離されたヒト抗体またはこの抗原結合部分を用いる治療を提供する。具体的な非限定的な実施形態では、本発明に従って精製した抗ＩＬ１８抗体は、生理的条件下で、ＡＢＴ−３２５とＩＬ１８との結合を競合的に阻害する。

本発明のさらなる別の実施形態では、抗ＩＬ−１８抗体またはこのフラグメントは、変化させることができ、抗体の定常領域が、非改変の抗体と比較して、少なくとも１つの定常領域媒介性生物学的エフェクター機能を低下させるように改変される。本発明の抗体がＦｃ受容体との低下した結合性を示すように、それを改変するために、抗体の免疫グロブリンの定常領域セグメントを、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）相互作用に必要な特定の領域で変異させることができる（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、ＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１頁ならびにＬｕｎｄら（１９９１）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２頁を参照されたい）。抗体のＦｃＲ結合能の低下により、オプソニン作用および食作用および抗原依存性細胞毒性などの、ＦｃＲ相互作用に頼る他のエフェクター機能も低下させることができる。

３．抗体の産生
本発明の抗体を発現させるために、遺伝子が、転写および翻訳調節配列に操作的に連結されるように、部分的または完全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、１つ以上の発現ベクターに挿入される（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９１４，１２８号明細書を参照されたい）。この文脈では、用語「操作的に連結される」は、ベクター内の転写および翻訳調節配列が、それらが目的とする抗体遺伝子の転写および翻訳の制御機能を果たすように、抗体遺伝子がベクター中にライゲートされることを意味すると意図する。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体の軽鎖遺伝子および抗体の重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入でき、またはより典型的には、両遺伝子は、同じ発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位がなければ平滑末端のライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。抗体または抗体関連軽鎖または重鎖配列の挿入の前に、発現ベクターは、抗体の定常領域配列を既に保有することができる。例えば、抗ＩＬ−１８抗体または抗ＩＬ−１８抗体関連ＶＨおよびＶＬ配列を、完全長抗体遺伝子に転換する１つのアプローチは、ＶＨセグメントが、ベクター内のＣＨセグメント（複数可）に操作的に連結し、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントに操作的に連結するように、重鎖の定常および軽鎖の定常領域をそれぞれ既にコードする発現ベクター中にそれらを挿入することである。追加的または代替的には、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進させるシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクター中にクローニングさせることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってよい。

抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を調節する１つ以上の制御配列を保有することができる。用語「制御配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を調節するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。かかる制御配列は、例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子によって決められることは、当業者に理解されよう。哺乳動物宿主細胞の発現に適した制御配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、主要な後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高いタンパク質発現レベルを指示するウイルス性エレメントを含む。ウイルス性制御エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号明細書、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号明細書およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号明細書を参照されたい。

抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中のベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）などの１つ以上の追加の配列および／または選択可能なマーカー遺伝子を保有することができる。選択可能なマーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞の選択が促進される（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、全てＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６、４，６３４，６６５および５，１７９，０１７号明細書を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞において、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える。適した選択可能なマーカー遺伝子には、（メトトレキサートの選択／増幅を用いるｄｈｆｒ宿主細胞の使用については）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８の選択については）ネオ遺伝子が挙げられる。

本発明の抗体または抗体部分は、宿主細胞における免疫グロブリンの軽鎖および重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。組換えで抗体を発現させるために、軽鎖および重鎖が、宿主細胞中で発現され、宿主細胞を培養する培地中に分泌され、抗体が培地から回収できるように、宿主細胞に、抗体の免疫グロブリンの軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを保有する１つ以上の組換え発現ベクターを形質移入する。抗体の重鎖および軽鎖遺伝子を得て、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組込み、ベクターを宿主細胞中に導入するために、標準的な組換えＤＮＡ方法論が使用され、これらは、その全体の教示が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）ならびに米国特許第４，８１６，３９７および６，９１４，１２８号明細書などに記載されている。

軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は、標準的な技法によって宿主細胞中に形質移入される。用語「形質移入」の様々な形態は、原核または真核宿主細胞中への外来性ＤＮＡの導入に一般的に使用される幅広い様々な技法、例えば、電気穿孔法、カルシウム−リン酸沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入などを包含することを意図する。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて、本発明の抗体を発現させることは理論上可能であるが、かかる真核細胞、特に哺乳動物細胞は、原核細胞に比べて、正確にフォールドされた免疫学的な活性抗体を会合および分泌しやすいため、哺乳動物宿主細胞などの真核細胞中での抗体の発現が適している。抗体遺伝子の原核生物の発現は、活性抗体の高収率の産生に効果がないことが報告された（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、ＢｏｓｓおよびＷｏｏｄ（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ６：１２−１３頁）。

本明細書でベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、上記の原核生物、酵母またはより高等な真核生物である。この目的に適した真核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例として、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエシュリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、例えばサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）などのセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）およびシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）ならびにＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日に出版されたＤＤ２６６，７１０に開示されたＢ．リケニフォルミス４１Ｐ）などのバチリ属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、Ｐ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ならびにストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。Ｅ．コリＢ、Ｅ．コリＸ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）およびＥ．コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の菌株が適しているが、宿主をクローニングする１つの適したＥ．コリは、Ｅ．コリ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）である。これらの例は、限定というよりむしろ実例となるものである。

原核微生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物が、ベクターをコードするポリペプチドに適したクローニングまたは発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または一般的なパン酵母が、より下等な真核宿主微生物の中でもっとも一般的に使用される。しかし、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）；Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリカス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィケラミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィララム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）およびＫ．マルキシアナス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主；ヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；スクワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのスクワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；ならびに例えば、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラミジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）ならびにＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主などの糸状菌などの多くの他の属、種および菌株が一般的に入手でき、本明細書に有用である。

グリコシル化された抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、アエデス・アエギプティ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、アエデス・アルボピクタス（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、ドロソフィラ・メラノガスタ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）およびボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの対応する許容昆虫宿主細胞が同定された。形質移入のための様々なウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびボンビクス・モリＮＰＶのＢｍ−５菌株が公的に利用でき、かかるウイルスは、本発明に従う本明細書でのウイルスとして、特に、スポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質移入のために使用することができる。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。

本発明の組換え抗体の発現に適した哺乳動物宿主細胞には、（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１頁に記載のようなＤＨＦＲ選択可能なマーカーを用いて使用される、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０頁に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを、哺乳動物宿主細胞中に導入する場合、宿主細胞中での抗体の発現または宿主細胞を増殖させる培養液中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体は産生される。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されるサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養物中での増殖のためにサブクローニングした２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９頁（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６頁（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１頁（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８頁（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞種株（Ｈｅｐ Ｇ２）であり、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる。

宿主細胞は、抗体産生のために上記の発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に修正された従来の栄養培地で培養する。

抗体を産生するために使用する宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。ＨａｍのＦ１０（商標）（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（商標）（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ ＥａｇｌｅのＭｅｄｉｕｍ（商標）（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４頁（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５頁（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５または５，１２２，４６９号明細書；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許第Ｒｅ．３０，９８５号明細書に記載の任意の培地を、宿主細胞用の培養液として使用でき、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる。任意のこれらの培地は、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（通常マイクロモーラーの範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義する）およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補充することができる。任意の他の必要な補充も、当業者に既知である適切な濃度で含むことができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前に使用したものであり、当業者には明白である。

宿主細胞は、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子などの、インタクトな抗体の部分を産生するために使用することもできる。上記の手順のバリエーションが、本発明の範囲内であることは理解されよう。例えば、宿主細胞に、本発明の抗体の軽鎖または重鎖のいずれか（両方ではない）をコードするＤＮＡを形質移入することを所望することができる。ＩＬ−１８、具体的にはｈＩＬ−１８との結合に必要ではない軽鎖および重鎖のいずれかまたは両方をコードするいくらかまたは全てのＤＮＡを除去するために、組換えＤＮＡ技術を使用することもできる。かかる切断されたＤＮＡ分子から発現された分子も、本発明の抗体に包含される。さらに、標準的な化学的架橋法により、本発明の抗体と第２抗体を架橋することによって、一方の重鎖および一方の軽鎖が、本発明の抗体であり、他方の重鎖および軽鎖が、ＩＬ−１８以外の抗原に特異的である二機能性抗体を、産生することができる。

本発明の抗体またはこの抗原結合部分の組換え発現のための適した系では、抗体の重鎖および抗体の軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターは、リン酸カルシウム媒介型形質移入によって、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内では、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子は、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーターの制御エレメントにそれぞれ操作的に連結して、遺伝子の高レベルの転写を駆動する。組換え発現ベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子も保有し、これにより、メトトレキサートの選択／増幅を用いて、ベクターに形質移入したＣＨＯ細胞を選択することが可能になる。選択された形質転換体宿主細胞は、抗体の重鎖および軽鎖の発現を可能にするために培養され、インタクトな抗体は、培養液から回収される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞に形質移入し、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養液から抗体を回収するために、標準的な分子生物学的技法が用いられる。

組換え技法を使用するとき、抗体は、細胞膜周辺腔中で細胞内に産生され得、または培地中に直接分泌され得る。１つの態様では、抗体が細胞内に産生されれば、第１ステップとして、（例えば、遠心分離の結果として生じた）粒状の残骸、宿主細胞または溶解した細胞のいずれかを、例えば、遠心分離または限界濾過によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、かかる発現系からの懸濁液を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限界濾過ユニットを用いて、まず濃縮することができる。

本発明の工程の前に、細胞の残骸から抗体を精製するための手順を、抗体の発現部位によって最初に決める。いくつかの抗体は、細胞から増殖培地の周辺に直接分泌され得、他の抗体は、細胞内につくられる。後者の抗体について、精製工程の第１ステップは、典型的には、機械的な剪断、浸透圧ショックまたは酵素処理が挙げられる様々な方法によって起こり得る細胞の溶解を伴う。かかる破壊により、細胞の全体の内容物が破砕物中に放出され、さらに、それらの小ささのために除去するのが難しい細胞内の断片が産生される。これらは、一般的に、異なる遠心分離によって、または濾過によって除去される。抗体が分泌される場合、かかる発現系からの懸濁液は、一般的に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限界濾過ユニットを用いて、まず濃縮される。抗体が培地中に分泌される場合、組換え宿主細胞は、例えば、接線流濾過によって、細胞培養液から分離することもできる。抗体は、本発明の抗体精製方法を用いて、培養液からさらに回収することができる。

４．抗体の精製
４．１ 一般的な抗体の精製
本発明は、抗体および少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物から精製された（または「ＨＣＰ減少型」）抗体調製物を生成するための方法を提供する。本発明の調製工程は、上記の方法および当技術分野の従来の方法を用いて抗体を生成する場合、分離のステップで始まる。当技術分野において典型的には、最初の精製ステップとして、抗体−ＨＣＰ混合物をプロテインＡの捕獲（例えば、プロテインＡカラム）に供し、抗体はプロテインＡに結合する一方、ＨＣＰは通り抜けて流れる。本発明の精製方法は、精製方法における最初のステップまたは任意のステップとして、抗体および少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物を、プロテインＡの捕獲（例えば、プロテインＡカラム）に供する必要がないという利点を有する。表１に、精製計画の１つの実施形態をまとめる。この計画のバリエーションが想定され、これは本発明の範囲内である。

抗体を含む清澄化した溶液または混合物を得たらすぐに、細胞が産生したＨＣＰなどの他のタンパク質からの抗体の分離を、イオン交換分離ステップ（複数可）および疎水性相互作用分離ステップ（複数可）を含む異なる精製技法の組合せを用いて行う。分離ステップにより、それらの電荷、疎水性の程度または大きさに基づいて、タンパク質の混合物が分離される。本発明の１つの態様では、分離は、陽イオン、陰イオンおよび疎水性相互作用が挙げられるクロマトグラフィを用いて行う。いくつかの異なるクロマトグラフィ樹脂をこれらの各技法に利用でき、関連する特定のタンパク質に対する精製計画の正確な組立てを可能にする。各分離方法の本質は、タンパク質が、異なる速度でカラムを横切り落ちることにより、カラムをさらに通って落ちるにつれて物理的分離の増加が達成されること、または分離媒体に選択的に付着することにより、次いで異なる溶媒によって別個に抽出されることのいずれかをもたらせることである。いくつかの場合では、不純物がカラムに特異的に付着し、抗体が付着しない、すなわち抗体がフロースルー中に存在するとき、抗体は不純物から分離される。

上述のように、精製計画の正確な組立ては、精製するタンパク質の濃度に依存する。ある種の実施形態では、本発明の分離ステップは、１つ以上のＨＣＰから抗体を分離するステップが採用される。本明細書に記載の方法を用いてうまく精製できる抗体には、これに限定されないが、ヒトＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４およびＩｇＭ抗体が挙げられる。ある種の実施形態では、本発明の精製戦略は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィの使用を除外する。かかる実施形態は、ＩｇＧ_３抗体が、プロテインＡに非効率に結合することが知られているため、特にＩｇＧ_３抗体の精製に有用である。精製計画の具体的な組立てを可能にする他の因子には、これに限定されないが、（例えば、抗体のＦａｂフラグメントと比べて完全長抗体に関連する）Ｆｃ領域の存在または非存在、対象とする抗体の生成に採用する特定の生殖系列の配列および抗体のアミノ酸組成（例えば、抗体の一次配列および分子の全体の変化／疎水性）が挙げられる。１つ以上の特徴を共有する抗体は、その特徴を利用するように組み立てた精製戦略を用いて精製することができる。

４．２一次回収
本発明の精製方法の最初のステップは、清澄化の第１相および試料母体からの抗ＩＬ−１８抗体の一次回収に関連する。さらに、一次回収工程は、試料母体中に存在し得るウイルスを不活性化する時点であってもよい。例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５３４，９７２号明細書のような、熱不活性化（低温殺菌）、ｐＨ不活性化、溶媒／洗剤処理、ＵＶおよびγ線照射ならびにβ−プロピオラクトンまたは例えば銅フェナントリンなどの追加のある種の化学的不活性剤が挙げられる、任意の１つ以上の様々なウイルス不活性化方法を、精製の一次回収相の間に使用することができる。本発明のある種の実施形態では、試料母体は、一次回収相の間にｐＨウイルス不活性化に供する。

ｐＨのウイルス不活性化の方法には、これに限定されないが、低ｐＨである期間混合物を温置するステップ、続いてｐＨを中和するステップ、および濾過によって粒子を除去するステップが挙げられる。ある種の実施形態では、混合物は、ｐＨ２から５、好ましくはｐＨ３から４、より好ましくはｐＨ３．５で温置する。試料母体のｐＨは、これに限定されないが、クエン酸、酢酸、カプリル酸が挙げられる任意の適した酸または他の適した酸によって低下させることができる。ｐＨレベルの選択は、主として抗体産物の安定性プロファイルおよびバッファー成分に依存する。低ｐＨのウイルス不活性化の間の標的抗体の質は、ｐＨおよび低ｐＨ温置の持続時間に影響を受けることが知られている。ある種の実施形態では、低ｐＨ温置の持続時間は、０．５時間から２時間、好ましくは０．５時間から１．５時間であり、より好ましくは、持続時間は１時間である。ウイルス不活性化は、タンパク質濃度に加えて、高濃度で不活性化を低下させ得るこれらのいくつかのパラメータに依存する。したがって、タンパク質濃度、ｐＨおよび不活性化の持続時間の適したパラメータは、ウイルス不活性化の所望のレベルを達成するように選択することができる。

ある種の実施形態では、ウイルス不活性化は、適したフィルターの使用によって達成することができる。適したフィルターの非限定的な例は、Ｐａｌｌ社のＵｌｔｉｐｏｒ ＤＶ５０（商標）フィルターである。本発明のある種の実施形態は、一次回収相の間にかかる濾過を採用するが、他の実施形態では、それは、精製の最後から２番目または最終ステップのいずれかが挙げられる、精製工程の他の相で採用する。ある種の実施形態では、これに限定されないが、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓ．）；Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ ＶＲ（商標）フィルター（ＣＵＮＯ；Ｍｅｒｉｄｅｎ、Ｃｏｎｎ．）およびＰｌａｎｏｖａ（商標）フィルター（旭化成ファーマ、Ｐｌａｎｏｖａ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、Ｉ１１．）などの代替的なフィルターが、ウイルス不活性化に採用される。

それらの実施形態では、ウイルス不活性化を採用する場合、必要に応じて、さらなる精製ステップのために、試料母体を調整することができる。例えば、低ｐＨのウイルス不活性化に続いて、試料母体のｐＨは、典型的には精製工程を続ける前に、より中性ｐＨ、例えば、約５．０から約８．５に調整する。さらに、混合物を注射用水（ＷＦＩ）で流して、所望の伝導性を得ることができる。

ある種の実施形態では、一次回収は、試料母体をさらに清澄化し、それによって抗ＩＬ−１８抗体の精製を助ける１つ以上の遠心分離ステップを含む。試料の遠心分離は、例えば、限定するものではないが、７，０００×ｇからおよそ１２，７５０×ｇで実行することができる。大規模な精製に関して、かかる遠心分離は、例えば、限定するものではないが、結果として生じる懸濁液において１５０ＮＴＵの濁度レベルに達成する流速設定によりオンラインで行うことができる。かかる懸濁液は、次いでさらなる精製のために収集することができる。

ある種の実施形態では、一次回収は、試料母体をさらに清澄化し、それによって抗ＩＬ−１８抗体の精製を助ける１つ以上の深層濾過ステップの使用を含む。深層濾過は、段階的密度を有する濾過媒体を含む。かかる段階的密度により、より大きい粒子はフィルターの表面付近で捕捉する一方、より小さい粒子はフィルターの表面のより大きく開いた部分を透過し、フィルターの中央により近いより小さい開きのみで捕捉することが可能になる。ある種の実施形態では、深層濾過ステップは、デリピッド深層濾過ステップであってよい。ある種の実施形態は、一次回収相の間のみ深層濾過ステップを採用するが、他の実施形態は、１つ以上の追加の精製の相の間にデリピッド深層濾過を含む深層濾過を採用する。本発明に関して使用できる深層濾過の非限定的な例には、Ｃｕｎｏ（商標）モデル３０／６０ＺＡ深層フィルター（３Ｍ社）および０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）二重層フィルターカートリッジが挙げられる。

４．３ イオン交換クロマトグラフィ
ある種の実施形態では、本発明は、抗体を含む溶出液が得られるように、少なくとも１つのイオン交換分離ステップに混合物を供することによって、抗体および少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物からＨＣＰ減少型抗体調製物を生成するための方法を提供する。イオン交換分離は、２つの基質を、それらのそれぞれのイオン電荷の差に基づいて分離する任意の方法を含み、陽イオン交換物質または陰イオン交換物質のいずれかを採用することができる。

陽イオン交換物質対陰イオン交換物質の使用は、タンパク質の全体の電荷に基づく。したがって、陽イオン交換ステップの使用の前に陰イオン交換ステップ、または陰イオン交換ステップの使用の前に陽イオン交換ステップを採用することは、本発明の範囲内である。さらに、陽イオン交換ステップのみ、陰イオン交換ステップのみまたは２つの任意の連続的な組合せを採用することも、本発明の範囲内である。

分離の実行において、最初の抗体混合物は、任意の様々な技法を用いて、例えば、バッチ精製技法またはクロマトグラフィ技法を用いて、イオン交換物質と接触させることができる。

例えば、バッチ精製に関して、イオン交換物質は、所望の開始バッファー中で調製する、またはそれに平衡化する。調製または平衡化において、イオン交換物質のスラリーを得る。抗体溶液をスラリーに接触させて、分離する抗体をイオン交換物質に吸着させる。イオン交換物質に結合しないＨＣＰ（複数可）を含む溶液は、例えば、スラリーの定着を可能にし、懸濁液を除去することによって、スラリーから分離する。スラリーは、１つ以上の洗浄ステップに供することができる。必要であれば、スラリーを、より高い伝導性の溶液に接触させて、イオン交換物質に結合したＨＣＰを脱着させることができる。結合したポリペプチドを溶出するために、バッファーの塩濃度を上昇させることができる。

イオン交換クロマトグラフィは、イオン交換分離技法として使用することもできる。イオン交換クロマトグラフィは、分子の全体の電荷の間の差に基づいて分子を分離する。抗体の精製について、抗体は、結合するために、イオン交換物質、例えば樹脂に付着される官能基の電荷と反対の電荷をもたなければならない。例えば、一般的にそのｐＩより低いｐＨのバッファー中で、全体的に正電荷を有する抗体は、負に荷電した官能基を含む陽イオン交換物質によく結合する。

イオン交換クロマトグラフィにおいて、溶質の表面上の荷電したパッチは、クロマトグラフィのマトリックスに付着した反対の電荷によって誘引され、これにより周囲のバッファーのイオン強度は低くなる。溶出は、一般的にイオン交換マトリックスの荷電部位について溶質と競合するようにバッファーのイオン強度（すなわち、伝導性）を増加させることによって達成される。ｐＨを変更し、それにより溶質の電荷を変化させることは、溶質の溶出を達成する別のやり方である。伝導性またはｐＨの変更は、漸進的（勾配溶出）または段階的（段階溶出）であってよい。

陰イオンまたは陽イオン置換基は、クロマトグラフィのための陰イオンまたは陽イオン担体を形成するために、マトリックスに付着させることができる。陰イオン交換置換基の非限定的な例には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、４級アミノエチル（ＱＡＥ）および４級アミン（Ｑ）基が挙げられる。陽イオン置換基には、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸（Ｐ）およびスルホン酸（Ｓ）が挙げられる。ＤＥ２３（商標）、ＤＥ３２（商標）、ＤＥ５２（商標）、ＣＭ−２３（商標）、ＣＭ−３２（商標）およびＣＭ−５２（商標）などのセルロースイオン交換樹脂は、Ｗｈａｔｍａｎ社、メイドストーン、ケント、Ｕ．Ｋ．から入手することができる。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ベースのおよびロクロスリンク型イオン交換体も既知である。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−およびＳＰ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ならびにＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−およびＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ならびにＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢから全て入手することができる。さらに、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＭおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ−６５０ＳまたはＭなどのＤＥＡＥおよびＣＭ両方の誘導体化エチレングリコール−メタクリル酸コポリマーは、Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ社、フィラデルフィア、Ｐａ．から入手することができる。

抗体および不純物、例えばＨＣＰ（複数可）を含む混合物は、陽イオン交換カラムなどのイオン交換カラム上に負荷する。例えば、限定するものではないが、混合物は、使用するカラムに依存して、約８０ｇのタンパク質／Ｌ樹脂の負荷で負荷する。適した陽イオン交換カラムの例は、ベッドボリュームが約１１６Ｌであり、直径８０ｃｍ×長さ２３ｃｍのカラムである。この陽イオンカラム上に負荷された混合物は、続いて洗浄用バッファー（平衡バッファー）で洗浄することができる。抗体は、次いでカラムから溶出し、最初の溶出液を得る。

このイオン交換ステップにより、対象とする抗体の捕獲が促進される一方、ＨＣＰなどの不純物が減少する。ある種の態様では、イオン交換カラムは、陽イオン交換カラムである。例えば、限定するものではないが、かかる陽イオン交換カラムに適した樹脂は、ＣＭ ＨｙｐｅｒＤＦ樹脂である。これらの樹脂は、Ｐａｌｌ社などの商業的供給源から入手することができる。この陽イオン交換手順は、室温またはその付近で行うことができる。

４．４ 限界濾過／透析濾過
本発明のある種の実施形態は、抗ＩＬ−１２抗体試料をさらに精製および濃縮するために、限界濾過および／または透析濾過ステップを採用し、限界濾過は、「Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｌ．ＺｅｍａｎおよびＡ．Ｚｙｄｎｅｙ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９６）および「Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｍｕｎｉｒ Ｃｈｅｒｙａｎ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８６；ＩＳＢＮ Ｎｏ．８７７６２−４５６−９）に詳細に記載されている。好ましい濾過方法は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログの表題「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ」、１７７−２０２頁（ベッドフォード、Ｍａｓｓ．、１９９５／９６）に記載のような接線流濾過である。限界濾過とは、一般的に０．１μｍより小さい孔径を有するフィルターを用いる濾過をいう。かかる小さい孔径を有するフィルターを採用することによって、試料の体積が、フィルターを通る試料バッファーの透過により減少できる一方、抗ＩＬ−１２抗体は保持される。

透析濾過は、塩、糖、非水溶媒の除去および交換、結合した種からの遊離した種の分離、低分子量の物質の除去またはイオンおよび／もしくはｐＨ環境の迅速な変化を引き起こすために、限界フィルターを用いる方法である。かかるマイクロ溶質は、限界濾過速度と同等の速度で限界濾過する溶液に溶媒を添加することによって、もっとも効率的に除去される。これにより、一定体積で溶液から微細種が洗浄され、保持された抗体が効率的に精製される。本発明のある種の実施形態では、透析濾過ステップは、場合によってさらなるクロマトグラフィまたは他の精製ステップの前に、および抗体調製物から不純物を除去するために、本発明に関連して使用される様々なバッファーを交換するために採用される。

４．５ 疎水性相互作用クロマトグラフィ
本発明は、疎水性相互作用分離ステップをさらに含み、抗体および少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物からＨＣＰ減少型抗体調製物を生成するための方法も取り上げる。例えば、減少したレベルのＨＣＰを有する第２溶出液が得られるように、イオン交換カラムから得た最初の溶出液を、疎水性相互作用物質に供することができる。本明細書に記載されているものなどの疎水性相互作用クロマトグラフィステップは、一般的に抗体凝集体などのタンパク質凝集体および工程関連不純物を除去するために行う。

分離の実行において、試料混合物は、例えば、バッチ精製技法を用いて、またはカラムを用いてＨＩＣ物質と接触させる。ＨＩＣ精製の前に、例えば、混合物をプレカラムに通すことによって、任意のカオトロピック剤または非常に疎水的な物質を除去することを所望することができる。

例えば、バッチ精製に関して、ＨＩＣ物質は、所望の平衡バッファー中で調製する、またはそれに平衡化する。ＨＩＣ物質のスラリーを得る。抗体溶液をスラリーと接触させて、分離する抗体をＨＩＣ物質に吸着させる。ＨＩＣ物質に結合しないＨＣＰを含む溶液は、例えば、スラリーの定着を可能にし、懸濁液を除去することによって、スラリーから分離する。スラリーは、１つ以上の洗浄ステップに供することができる。必要であれば、スラリーをより低い伝導性の溶液と接触させて、ＨＩＣ物質に結合した抗体を脱着させることができる。結合した抗体を溶出するために、塩濃度を低下させることができる。

イオン交換クロマトグラフィは、抗体の電荷に依存してそれらを単離する一方、疎水性相互作用クロマトグラフィは、抗体の疎水性特性を用いる。抗体上の疎水基は、カラム上の疎水基と相互作用する。より疎水的なタンパク質ほど、より強くカラムと相互作用する。したがって、ＨＩＣステップにより、宿主細胞由来の不純物（例えば、ＤＮＡならびに他の高および低分子量産物関連種）が除去される。

疎水性相互作用は、高いイオン強度でもっとも強く、したがって、この分離の形態は、塩析またはイオン交換手順に続いて便利に行われる。ＨＩＣカラムへの抗体の吸着は、高い塩濃度が好ましいが、実際の濃度は、抗体の性質および選択された特定のＨＩＣリガンドに依存して、非常に広範にわたることができる。様々なイオンは、それらが疎水性相互作用を促進するか（塩析効果）、または水の構造を破壊し（カオトロピック効果）、疎水性相互作用の減退を引き起こすかどうかに依存する、いわゆる疎溶媒性系列において配置することができる。Ｂａ^＋＋、Ｃａ^＋＋、Ｍｇ^＋＋、Ｌｉ^＋、Ｃｓ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｒｂ^＋、ＮＨ_４ ^＋のような陽イオンは、塩析効果の増加に関して位置づけられる一方、ＰＯ⁻⁻⁻、ＳＯ_４ ⁻⁻、ＣＨ_３ＣＯ_３ ⁻、Ｃｌ⁻、Ｂｒ⁻、ＮＯ_３ ⁻、ＣｌＯ_４ ⁻、Ｉ⁻、ＳＣＮ⁻のような陰イオンは、カオトロピック効果の増加に関して位置づけることができる。

一般的に、Ｎａ、ＫまたはＮＨ_４の硫酸塩は、ＨＩＣにおけるリガンド−タンパク質相互作用を効果的に促進する。次の関係：（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４＞Ｎａ_２ＳＯ_４＞ＮａＣｌ＞ＮＨ_４Ｃｌ＞ＮａＢｒ＞ＮａＳＣＮによって相互作用の強度に影響を与える塩を処方することができる。一般的に、約０．７５から２Ｍの間の塩濃度の硫酸アンモニウムまたは約１から４Ｍの間のＮａＣｌが有用である。

ＨＩＣカラムは、通常、疎水性リガンド（例えば、アルキルまたはアリル基）が共役する基盤マトリックス（例えば、架橋結合したアガロースまたは合成コポリマー物質）を含む。適したＨＩＣカラムは、フェニル基で置換されたアガロース樹脂を含む（例えば、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム）。多くのＨＩＣカラムが、商業的に入手可能である。例には、これに限定されないが、低いまたは高い置換を有するＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ ＰｒｏｐｙｌまたはＦａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ Ｐｈｅｎｙｌカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）；Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ＭｅｈｙｌまたはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ｔ−Ｂｕｔｙｌ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア）；ＷＰ ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー）およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）フェニルまたはブチルいずれかのカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ、ＰＡ）が挙げられる。

４．６ 模範的な精製戦略
ある種の実施形態では、一次回収は、産生バイオリアクターの収集物から細胞および細胞残骸（ＨＣＰを含む）を除去するために、ｐＨの低下、遠心分離および濾過のステップを連続的に採用することによって行うことができる。例えば、限定するものではないが、かかる一次回収は、遠心分離（１２７５０×ｇ）および深層濾過による最終清澄化を用いて、遠心分離（６９００×ｇ）およびｐＨの低下により宿主細胞を除去することによって最初に遂行することができる。ある種の実施形態では、抗体および培地を含む培養物は、約２０℃でおよそ１から１．５時間、約３．５から約４．０のｐＨを用いて、ｐＨ不活性化に供することができる。ｐＨの低下は、クエン酸、例えば３Ｍのクエン酸、リン酸、酢酸、ギ酸などの既知の酸調製を用いて促進することができる。ｐＨ感受性ウイルス混入物を完全に排除しない場合、このｐＨの低下により、この混入物を減少および／または不活性化させ、いくらかの培地／宿主細胞混入物を沈殿させる。この低下の後に、酸性化した収集物のｐＨを、水酸化ナトリウム、例えば３Ｍの水酸化ナトリウムなどの塩基を用いて、約４．５から約５．５に調整し、約８℃で約１６−２４時間維持することができる。１６−２４時間の後、温度をおよそ２０℃にさせることができる。ｐＨ調節した培養物を、およそ１２，７５０×ｇで遠心分離することができる。結果として生じた試料懸濁液を、次いで、例えば約０．２から約０．８μｍの範囲に及ぶ通常の孔径の３つの１２インチのＣｕｎｏ（商標）モデル６０ＺＡ深層フィルターに装着した１つの３×１２”フィルターハウジングおよび３つの３０”−０．２２μｍの疎水性フィルターカートリッジに装着した１つの３×３０”フィルターハウジングを含むフィルタートレインに通すことができる。他の適したフィルター系も市販されており、本発明の範囲内である。当業者は上述の条件を変えることができ、これも本発明の範囲内であることに注目されたい。

ある種の実施形態では、清澄化した懸濁液は、次いで陽イオン交換カラムを用いてさらに精製する。ある種の態様では、平衡化バッファーは、約５．０のｐＨを有するバッファーである。適したバッファーの非限定的な例は、ｐＨ５．０の、約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム／クエン酸、６５ｍＭのＮａＣｌである。平衡化に続いて、カラムに、上記の一次回収ステップから調製した試料を負荷する。カラムは、次いで平衡化バッファーを用いて洗浄する。カラムは、次に平衡化バッファーと比較してより大きいイオン強度を有するバッファーを用いて、溶出ステップに供する。例えば、適した溶出バッファーは、ｐＨ５．０の、約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム／クエン酸、３００ｍＭのＮａＣｌであってよい。抗ＩＬ−１８抗体を溶出し、ＯＤ_{２８０ｎｍ}に設定したＵＶ分光光度計を用いてモニターする。特定の実施例では、カラム溶出液は、吸光度が３ＯＤ_{２８０ｎｍ}を超えるときに収集でき、およそ２ＯＤ_{２８０ｎｍ}まで続けることができる。当業者は条件を変えることができ、これもさらに本発明の範囲内であることを理解されたい。

ある種の実施形態では、陽イオン交換溶出液は、次に例えば３０ｋＤのＭＷカットオフフィルターを用いて濾過する。この濾過ステップに適したフィルターは、例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅの３０ｋＤの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）セルロース限界フィルターメンブレンカセットである。限界濾過は、溶出液が、例えば３０ｍｇ／ｍＬの最終標的濃度に到達するまで続けることができる。この濾過物は、次いで適切なバッファーを用いて透析濾過することができる。適切なバッファーの例は、ｐＨおよそ７．０の、２０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウムである。

ある種の実施形態では、上記の捕獲濾過ステップからの試料を、陰イオン交換クロマトグラフィステップなどの第２のイオン交換分離に供する。あるいは、陽イオン交換溶出液を、適切なバッファーに平衡化する場合、陽イオン交換溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィに供することができる。この陰イオン交換ステップにより、核酸様宿主タンパク質およびＤＮＡなどの工程関連不純物が減少する。対象とする抗体が、カラムの固相、例えば、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）と相互作用も結合もしない場合、このイオン交換ステップは、クロマトグラフィのフロースルー様式である。しかし、多くの不純物は、実際、カラムの固相と相互作用および結合する。陰イオン交換は、約１２℃で行うことができる。

このステップに適したカラムの非限定的な例は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔｗａｙ、ＮＪから得たＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗなどの陰イオン交換樹脂を充填したものである。カラムは、トロラミン／塩化ナトリウムなどの適切なバッファーの複数の（例えば約５−７）のカラム体積を用いて平衡化することができる。適した条件の例には、ｐＨ８．０で、約４０ｍＭの塩化ナトリウムを含む約２５ｍＭのトロラミンが挙げられる。再び当業者は条件を変えることができるが、これも本発明の範囲内である。上記に概説したＵＦ／ＤＦステップから収集した試料は、ｐＨ８の５０ｍＭのトロラミンの２容量で希釈し、陰イオン交換カラム上に負荷する。代替的な実施形態では、ｐＨおよび伝導性の調整後、陽イオン交換の間に収集された溶出液からカラムに負荷する。カラムの負荷に続いて、カラムを平衡バッファーで洗浄する。抗ＩＬ−１８抗体を含むフロースルーは、ＯＤ_{２８０ｎｍ}でのＵＶ分光光度計を用いてモニターすることができる。ある種の実施例では、溶出収集物は、上側０．４ＯＤ_{２８０ｎｍ}から下側０．６ＯＤ_{２８０ｎｍ}であってよい。

本発明は、疎水性相互作用分離ステップをさらに含む、抗体および少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物から精製したＨＣＰ減少型抗体を精製するための方法であって、減少したレベルのＨＣＰを有する第２溶出液が得られるように、前記イオン交換のフロースルーを疎水性相互作用物質に供する方法も取り上げる。

分離の実行において、試料混合物は、例えば、バッチ精製技法またはカラムを用いて、ＨＩＣ物質と接触させる。ＨＩＣ精製の前に、任意のカオトロピック剤または非常に疎水的な物質を除去することを所望することができる。例として、バッチ精製について、ＨＩＣ物質は、所望の平衡バッファー中で調製またはこれに平衡化する。ＨＩＣ物質のスラリーを得る。抗体溶液をスラリーに接触させて、分離する抗体をＨＩＣ物質に吸着させる。ＨＩＣ物質に結合しないＨＣＰを含む溶液は、例えば、スラリーの定着を可能にし、懸濁液を除去することによって、スラリーから分離する。スラリーは、１つ以上の洗浄ステップに供することができる。必要であれば、スラリーを、より低い伝導性の溶液に接触させて、ＭＩＣ物質に結合した抗体を脱着させることができる。結合した抗体を溶出するために、塩濃度を低下させることができる。

本発明のある種の実施形態では、抗ＩＬ−１８抗体を含む試料は、疎水性相互作用分離ステップを用いてさらに処理する。ある種の実施形態では、疎水性相互作用分離ステップは、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）ステップを含む。ＨＩＣステップに適したカラムの非限定的な例は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔｗａｙ、ＮＪから得るＰｈｅｎｙｌ ＨＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）などのＨＩＣ樹脂を充填したものである。対象とする抗体を含む前のステップから得たフロースルー調製物は、ｐＨ７．０の同等量のおよそ２．２Ｍの硫酸アンモニウム、４０ｍＭのリン酸ナトリウムで希釈することができる。これを、次いで約０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）２二重層フィルターまたはその同等物を用いて、濾過に供することができる。ある種の実施形態では、疎水性クロマトグラフィ手順は、２つ以上のサイクルを含む。

ある種の実施形態では、ＨＩＣカラムは、適したバッファーを用いて最初に平衡化する。適したバッファーの例は、ｐＨ７．０の、１．１Ｍの硫酸アンモニウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウムである。当業者は、緩衝剤の濃度を変化させることによって、および／または同等のバッファーを代用することによって、平衡化バッファーを変えることができ、これも本発明の範囲内である。カラムに、希釈した陰イオン交換フロースルー試料を負荷し、複数回、例えば３回、平衡バッファーで洗浄する。

カラムは、適切な溶出バッファーを用いて溶出する。かかる溶出バッファーの適した例は、ｐＨおよそ７．０で、０．３Ｍの硫酸アンモニウム、９ｍＭのリン酸ナトリウムである。対象とする抗体は、ピークの上側１ＯＤ_{２８０ｎｍ}から下側４ＯＤ_{２８０ｎｍ}まで従来の分光光度計を用いて検出および収集することができる。

本発明のある種の実施形態では、疎水性クロマトグラフィステップから得た溶出液は、インタクトなウイルスを含むウイルス粒子の除去のために濾過に供する。適したフィルターは、Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ、ノースボロー、ＭＡから得るＵｌｔｉｐｏｒ ＤＶ５０（商標）フィルターである。他のウイルスフィルターもこの濾過ステップに使用でき、当業者によく知られている。特定の態様では、ＨＩＣ溶出液は、およそ３４ｐｓｉｇで、０．１μｍのフィルターおよび１０インチのＵｌｔｉｐｏｒ ＤＶ５０（商標）ナノフィルターから成る事前に湿潤したフィルタートレインに通す。場合によって、濾過工程に続いて、フィルターハウジング中に保持された任意の抗体を除去するために、例えばＨＩＣ溶出バッファーを用いてフィルターを洗浄する。濾過物は、およそ１２℃で事前に滅菌した容器中に保管することができる。

さらなる実施形態では、上記で得た濾過物は、限界濾過／透析濾過に再び供する。当業者の終点が、例えば医薬製剤における抗体の使用であれば、このステップは重要である。限界濾過により、抗体の濃縮が促進され、透析濾過により、前に使用した緩衝塩の除去およびそれと特定の処方バッファーとの取換えが促進される。処方バッファーの複数容量、例えば２容量またはそれ以上を用いる連続的透析濾過を行う。適した処方バッファーの例は、ｐＨ５．９の、５ｍＭのメチオニン、２％のマンニトール、０．５％のショ糖のバッファーである。透析濾過が完了すると、抗体は濃縮される。当業者は、当技術分野でよく知られている方法を用いて、この時点で抗体産物をさらに濾過することを望むことができる。

本発明のある種の実施形態は、さらなる精製ステップを含む。イオン交換クロマトグラフィ方法の前、間または後に行うことができる追加の精製手順の例は、エタノール沈殿、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、シリカにおけるクロマトグラフィ、ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）におけるクロマトグラフィ、さらなる陰イオン交換クロマトグラフィおよび／またはさらなる陽イオン交換クロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティクロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体、特異的な基質、リガンドまたは捕獲剤としての抗原を用いる）が挙げられる。

５．試料純度のアッセイ方法
本発明は、単離／精製した抗体組成物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の残留レベルを決定するための方法も提供する。上記のように、ＨＣＰは、望ましくは最終標的物質産物、すなわち抗ＩＬ−１８抗体から排除される。典型的なＨＣＰは、抗体産生の源から生じるタンパク質を含む。標的抗体からＨＣＰを同定し、十分に除去できなければ、低下した有効性および／または被験者の有害な反応を引き起こし得る。

本明細書で使用するとき、用語「ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ」は、アッセイに使用する二次抗体が、抗体、すなわち抗ＩＬ−１８抗体を生成するために使用される細胞、例えばＣＨＯ細胞から産生されるＨＣＰに特異的である場合のＥＬＩＳＡをいう。二次抗体は、当業者に既知の従来の方法によって産生することができる。例えば、二次抗体は、見せかけの産生および精製の実行によって得られるＨＣＰを用いて、産生することができる、すなわち、対象とする抗体を産生するために使用する同じ細胞株を使用するが、細胞株に抗体ＤＮＡを形質移入しない。典型的な実施形態では、二次抗体は、最適な細胞発現系、すなわち、標的抗体を産生するために使用する細胞発現系において発現するＨＣＰと同様のものを用いて産生する。

一般的に、ＨＣＰ ＥＬＩＳＡは、抗体の２つの層、すなわち一次抗体および二次抗体の間にＨＣＰを含む液体試料をサンドイッチするステップを含む。試料中のＨＣＰが一次抗体、例えばこれに限定されないが、アフィニティ精製したヤギ抗ＣＨＯ（Ｃｙｇｎｕｓ）によって捕獲される時間の間、試料を温置する。抗体を生成するために使用した細胞から精製したＨＣＰに特異的な、標識した二次抗体または抗体のブレンド、例えばビオチン化した抗ＣＨＯ ＨＣＰを添加し、試料内のＨＣＰに結合させる。ある種の実施形態では、一次および二次抗体は、ポリクローナル抗体である。ある種の態様では、一次および二次抗体は、ＨＣＰに対して産生されたポリクローナル抗体のブレンド、例えば、これに限定されないが、ビオチン化ヤギ抗宿主細胞タンパク質混合物５９９／６２６／７４８である。試料中に含まれるＨＣＰの量は、二次抗体の標識に基づく適切な試験を用いて決定される。

ＨＣＰ ＥＬＩＳＡは、上記のセクションＩＩＩに記載した方法を用いて得た溶出液またはフロースルーなどの抗体組成物中のＨＣＰのレベルを決定するために使用することができる。本発明は、抗体を含む組成物も提供し、ＨＣＰの酵素結合免疫吸着測定法（「ＥＬＩＳＡ」）によって決定するとき、前記組成物は、検出可能なレベルのＨＣＰを有さない。

６．さらなる修飾
本発明の抗ＩＬ−１８抗体は、修飾することができる。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合フラグメントを化学的に修飾し、所望の効果をもたらす。例えば、本発明の抗体および抗体フラグメントのペグ化は、例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる次の文献：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ３：４−１０頁（１９９２）；ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４に記載のような、当技術分野で既知の任意のペグ化反応によって行うことができる。１つの態様では、ペグ化は、ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行う。本発明の抗体および抗体フラグメントのペグ化のための適した水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書で使用するとき、「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃｌ−ＣｌＯ）アルコキシまたはアリールオキシポリエチレングリコールなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの任意の形態を包含することを意味する。

本発明のペグ化された抗体および抗体フラグメントを調製するための方法は、一般的に（ａ）抗体または抗体フラグメントが、１つ以上のＰＥＧ基に付着するのに適した条件下で、抗体または抗体フラグメントと、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコールとを反応させるステップおよび（ｂ）反応生成物を得るステップを含む。既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは、当業者に明らかである。

ペグ化した抗体および抗体フラグメントは、一般的に本明細書に記載の抗ＩＬ−１８抗体および抗体フラグメントを投与することによって、本発明のＩＬ−１８関連障害を治療するために使用することができる。一般的に、ペグ化した抗体および抗体フラグメントは、非ペグ化抗体および抗体フラグメントと比較して、増加した半減期を有する。ペグ化した抗体および抗体フラグメントは、単独に、一緒にまたは他の医薬組成物との組合せで、採用することができる。

本発明の抗体または抗体部分は、別の機能性分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に誘導体化または連結することができる。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、イムノアドへシン分子を含む、本明細書に記載の誘導体化および他のやり方で修飾したヒト抗ｈＩＬ−１８抗体の形態を含むことを意図する。例えば、本発明の抗体または抗体部分は、別の抗体（例えば、二重特異的な抗体または二重特異性抗体）、検出可能な薬剤、細胞毒性薬、医薬品および／または抗体もしくは抗体分子と（ストレプトアビジンのコア領域またはポリヒスチジンタグなどの）他の分子との会合を媒介できるタンパク質もしくはペプチドなどの１つ以上の分子要素に、（化学的共役、遺伝子的融合、非共有結合または他のやり方によって）機能的に連結することができる。

誘導体化した抗体の１つのタイプは、（例えば、二重特異的な抗体を作成する、同じタイプまたは異なるタイプの）２つ以上の抗体と架橋結合することによって生成する。適したクロスリンカーは、適切なスペーサーによって明瞭に分離される２つの反応基を有するヘテロ二重機能的（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二重機能的（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）なものが挙げられる。かかるリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、ＩＬ．から入手することができる。

本発明の抗体または抗体部分を誘導体化できる有用な検出可能な薬剤は、蛍光性化合物を含む。典型的な検出可能な蛍光性薬剤には、フルオレセン、フルオレセンイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルフォニルクロリド、フィコエリトリンなどが挙げられる。抗体は、アルカリンホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素で誘導体化することもできる。抗体を検出可能な酵素で誘導体化するとき、それは、酵素が検出可能な反応産物の生成に使用する追加の試薬を添加することによって検出することができる。例えば、検出可能な薬剤の西洋ワサビペルオキシダーゼが存在するとき、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加により、検出可能な有色の反応生成物がもたらされる。抗体は、ビオチンを用いて誘導体化することもでき、アビジンまたはスプレプトアビジン結合の直接的な測定によって検出することもできる。

７．医薬組成物
本発明の抗体および抗体部分は、患者への投与に適した医薬組成物中に組み込むことができる。典型的に、医薬組成物は、本発明の抗体または抗体部分および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合性のある任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体の例には、１つ以上の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどおよびこれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えばマンニトール、ソルビトールなどの糖、多価アルコールまたは塩化ナトリウムを含むことが望ましい。薬学的に許容される担体は、抗体または抗体部分の有効期間または効果を増強させる、少量の湿潤剤または乳化剤などの補助物質、保存剤またはバッファーをさらに含むことができる。

本発明の抗体および抗体部分は、非経口投与に適した医薬組成物中に組み込むことができる。抗体または抗体部分は、例えば、０．１−２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含む注射可能な溶液として調製することができる。注射可能な溶液は、フリントまたはアンバーバイアル中の液体または凍結乾燥型投与形態、アンプルまたは事前に満たしたシリンジのいずれかから構成することができる。バッファーは、ｐＨ５．０から７．０（最適はｐＨ６．０）のＬ−ヒスチジンおよそ１−５０ｍＭ（最適は５−１０ｍＭ）であってよい。他の適したバッファーには、これに限定されないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムが挙げられる。塩化ナトリウムは、０−３００ｍＭの濃度（最適は液体型投与形態について１５０ｍＭ）で、溶液の毒性を修正するために使用することができる。抗凍結剤は、凍結乾燥型投与形態について、主に０−１０％のスクロース（最適は０．５−１．０％）を含むことができる。他の適した抗凍結剤には、トレハロースおよびラクトースが挙げられる。バルク剤は、凍結乾燥型投与形態について、主に１−１０％のマンニトール（最適は２４％）を含むことができる。安定化剤は、液体および凍結乾燥型投与形態の両方で使用でき、主に１−５０ｍＭのＬ−メチオニン（最適は５−１０ｍＭ）である。他の適したバルク剤には、グリシン、アルギニンが挙げられ、０−０．０５％のポリソルベート８０（最適は０．００５−０．０１％）として含むことができる。追加の界面活性剤には、これに限定されないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が挙げられる。

１つの態様では、医薬組成物は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇの投薬量で抗体を含む。別の態様では、抗体の投薬量には、１週間おきの投与でおよそ１ｍｇ／ｋｇまたは毎週の投与でおよそ０．３ｍｇ／ｋｇが挙げられる。当業者は、患者への投与のために適切な投薬量および投与計画を突き止めることができる。

本発明の組成物は、様々な形態であってよい。これらには、例えば、液体溶液（例えば、注射および注入可能な溶液）、分散剤または懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソームおよび坐薬などの液体、半固体および固体の投与形態が挙げられる。形態は、例えば目的とする投与様式および治療の適用に依存する。典型的な組成物は、他の抗体によるヒトの受動免疫化に使用するものと同様の組成物などの、注射および注入可能な溶液の形態である。１つの投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。１つの態様では、抗体は、静脈内注射または注入によって投与する。別の態様では、抗体は、筋肉内または皮下注射によって投与する。

治療用組成物は、典型的に、製品および貯蔵の条件下で無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散剤、リポソームまたは高い薬物濃度に適した他の整った構造として処方することができる。無菌の注射可能な溶液は、適切な溶媒中で必要とされる量の活性化合物（すなわち、抗体または抗体部分）に、上記に列挙される成分の１つまたは組合せを組み込むことによって調製することができ、必要に応じて、続いて濾過滅菌する。一般的に、分散剤は、基本的な分散剤媒体および上記の列挙からの必要とされる他の成分を含む無菌媒介物中に、活性化合物を組み込むことによって調製する。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の凍結乾燥した粉末の場合、調製方法は、前に滅菌濾過したその溶液から、活性成分の粉末に加えて任意の追加の所望の成分を生成する、真空乾燥および噴霧乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散剤の場合に必要とされる粒子サイズの維持および界面活性剤の使用によって維持することができる。注射可能な組成物の遷延性吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアレート塩およびゼラチンを含むことによってもたらすことができる。

本発明の抗体および抗体部分は、当技術分野で既知の様々な方法によって投与することができ、投与の１つの経路／様式は、皮下注射、静脈内注射または注入である。当業者に理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に依存して変わる。ある種の実施形態では、活性化合物は、移植、経皮パッチおよびマイクロカプセル化した送達系が挙げられる放出調節した製剤などの、迅速な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤を調製するための多くの方法は、特許を取られている、または一般的に当業者に既知である。例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。

ある種の態様では、本発明の抗体または抗体部分は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体を用いて、経口的に投与することができる。化合物（および所望されれば他の成分）は、錠剤中に圧縮したまたは患者の食事の中に直接組み込んだ硬いまたは柔らかいゼラチンシェル中に封入することもできる。経口の治療用投与のために、組成物は、賦形剤とともに組み込むことができ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形態で使用することができる。非経口投与以外によって本発明の化合物を投与するために、その不活性化を防ぐ物質で化合物をコートするまたはそれと化合物とを共投与することが必要になり得る。

補充的な活性化合物も、組成物中に組み込むことができる。ある種の態様では、本発明の抗体または抗体部分は、ＩＬ−１８活性が有害である障害を治療するのに有用である１つ以上の追加の治療剤と共処方および／または共投与する。例えば、本発明の抗ｈＩＬ−１８抗体または抗体部分は、他の標的と結合する１つ以上の追加の抗体（例えば、他のサイトカインと結合するまたは細胞表面分子と結合する抗体）と共処方および／または共投与することができる。さらに、本発明の１つ以上の抗体は、２つ以上の前述の治療剤と組み合わせて使用することができる。かかる組合せ治療は、より低い投薬量の投与される治療剤を好都合に利用することができ、したがって可能性のある毒性または様々な単独治療に関連する合併症を回避することができる。本発明の抗体を、組合せ治療の一部として使用するとき、抗体を単独で患者に投与するときより、低い投薬量の抗体を所望することができることは当業者に理解される（例えば、相乗的な治療効果が、組合せ治療の使用によって達成でき、順により低い用量の抗体の使用により、所望の治療効果の達成が可能になる）。

本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、かかる疾患を治療するために、単独でまたは組み合わせて使用することができる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、単独でまたは追加の薬剤、例えば治療剤と組み合わせて使用でき、前記追加の薬剤が、その意図する目的のために当業者によって選択されることを理解されたい。例えば、追加の薬剤は、本発明の抗体によって治療する疾患または状態を治療するのに有用であると当技術分野で認識されている治療剤であってよい。追加の薬剤は、治療用組成物に有益な貢献をもたらす薬剤、例えば、組成物の粘性に影響する薬剤であってもよい。

本発明内に含まれ得る組合せが、それらの意図する目的に有用なそれらの組合せであることもさらに理解されたい。以下に示される薬剤は例示であり、限定することを意図していない。本発明の一部である組合せは、本発明の抗体および以下のリストから選択される少なくとも１つの追加の薬剤であってよい。組合せは、１つ以上の追加の薬剤、例えば、形成される組成物がその意図される機能を果たせるような組合せであれば、２または３つの追加の薬剤を含むこともできる。

いくつかの組合せは、イブプロフェン様薬物を含むＮＳＡＩＤＳともいわれる非ステロイド性抗炎症薬（複数可）である。他の組合せは、プレドニゾロンを含む副腎皮質ステロイドであり、よく知られているステロイド使用の副作用は、本発明の抗ＩＬ−１８抗体と組み合わせて患者を治療するときに必要とされるステロイド用量を減らすことによって、低下または排除することさえできる。本発明の抗体または抗体部分と組み合わせることができる、関節リウマチ用の治療剤の非限定的な例には、次のもの：サイトカイン抑制性抗炎症薬（複数可）（ＣＳＡＩＤ）；他のヒトサイトカインまたは増殖因子、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦに対する抗体またはこのアンタゴニストが挙げられる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０またはＣＤ１５４を含むそれらのリガンド（ｇｐ３９またはＣＤ４０Ｌ）などの細胞表面分子に対する抗体と組み合わせることができる。

治療剤のいくつかの組合せは、自己免疫および続く炎症カスケードにおける異なる時点で干渉でき、例にはＴＮＦアンタゴニスト様キメラ、ヒト化またはヒトＴＮＦ抗体、Ｄ２Ｅ７、（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、１９９６年２月９日に出願された米国出願第０８／５９９，２２６号明細書）、ｃＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））、ＣＤＰ５７１、抗ＴＮＦ抗体フラグメント（例えばＣＤＰ８７０）および可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体、その誘導体、すなわちｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））またはｐ５５ＴＮＦＲ１ｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３）およびＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤も挙げられ、同様にＩＬ−１阻害剤（例えば、Ｖｘ７４０またはＩＬ−１ＲＡなどのインターロイキン１変換酵素阻害剤）は、同じ理由から効果的であり得る。他の組合せは、インターロイキン１１、抗Ｐ７およびｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）を含む。さらなる他の組合せは、ＩＬ−１２の機能に平行、依存または協調して働き得る自己免疫応答の他のキープレーヤーを含む。ＩＬ−１２およびＩＬ−１８は、オーバーラップを有するが、両方に対するアンタゴニストの異なる機能および組合せは、もっとも効果的であり得ることが示された。さらなる別の組合せは、非枯渇性抗ＣＤ４阻害剤を含む。さらなる他の組合せは、抗体、可溶性受容体またはアンタゴニストのリガンドを含む、同時刺激経路ＣＤ８０（Ｂ７．１）またはＣＤ８６（Ｂ７．２）のアンタゴニストを含む。

本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、メトトレキサート、６−ＭＰ、アザチオプリンスルファサラジン、メサラジン、オルサラジンクロロキニン／ヒドロキシクロロキン、ペンシルアミン、金チオリンゴ酸（筋肉内および経口）、アザチオプリン、コチシン、副腎皮質ステロイド（経口、吸入および局所注射）、β−２アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテラル）、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリク酸、ネドクロミル、ケトチフェン、イプラトロピウムおよびオキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤｓ、例えば、イブプロフェン、プレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデンソシンアゴニスト、抗血栓薬、補体阻害薬、アドレナリン系薬剤、ＴＮＦαまたはＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインによってシグナル伝達に干渉する薬剤（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤（例えばＶｘ７４０）、抗Ｐ７、ｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびその誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体および誘導体ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ．ＴＭ．）およびｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３））および抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）などの薬剤と組み合わせることができる。いくつかの組合せは、メトトレキサートまたはレフルノミドを含み、中等度または重度の関節リウマチの場合、シクロスプリンを含む。ＩＬ−１８抗体と組み合わせて使用できる他の薬剤は、ＣＯＸ−２阻害剤である。ＣＯＸ−２阻害剤は当技術分野で既知である。特異的ＣＯＸ−２阻害剤は、ＷＯ０１／００２２９に開示されており、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の医薬組成物は、本発明の抗体または抗体部分の「治療的有効量」または「予防的有効量」を含むことができる。「治療的有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な投薬量および期間での効果的な量をいう。抗体または抗体部分の治療的有効量は、病態、年齢、性別および個人の体重などの因子ならびに個人において所望の応答を誘発する抗体または抗体部分の能力によって変えることができる。治療的有効量は、抗体または抗体部分の任意の毒性または有害な効果より、治療的に有益な効果が勝るものでもある。「予防的有効量」とは、所望の予防効果を達成するために必要な投薬量および期間での効果的な量をいう。典型的に、予防的用量は、疾患の初期段階より前またはそのときに患者において使用し、予防的有効量は、治療的有効量より少なくなる。

活性タンパク質（複数可）の治療的有効量は、抗ＩＬ−１８抗体のタイプ、ＩＬ−１８に対する抗体の親和性、抗体により示される任意の残留毒性活性、投与経路、患者の臨床状態（内在性ＩＬ−１８活性の非毒性レベルの維持の望ましさを含む）を含む、多くの変数の関数である。

「治療的有効量」は、投与したときに、ＩＬ−１８阻害剤が、ＩＬ−１８の生物活性の阻害をもたらすほどの量である。単一以上用量として、個人に投与する投薬量は、ＩＬ−１８阻害剤の薬物動態的特性、投与経路、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康、大きさ）、症状の程度、併用治療、治療の頻度ならびに所望の効果を含む様々な因子に依存して変わる。確立された投薬量の範囲の調整および操作は、十分に当業者の能力内であり、個人においてＩＬ−１８の阻害を決定するインビトロおよびインビボの方法も同様である。

投薬計画は、最適な所望の応答（例えば、治療または予防の応答）をもたらすように調整することができる。例えば、単回ボーラスを投与でき、いくつかの分割した用量を経時的に投与でき、または治療状況の緊急性が示されるとき、用量を比例的に減少または増加させることができる。各投与についての投薬単位形態および投与の均一性において、非経口組成物を処方することは特に好都合である。本明細書で使用するとき、投薬単位形態とは、治療する哺乳動物の患者に対する単一の投薬量として適した、物理的に別々の単位をいい、各単位は、必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすために計算された、活性化合物の所定の量を含む。本発明の投薬単位形態に関する規格は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成すべき特定の治療または予防効果ならびに（ｂ）個人における感受性の治療のための、かかる活性化合物の配合の当技術分野における固有の制限によって決定され、およびこれに直接依存する。

本発明の抗体または抗体部分の治療的または予防的有効量に関する典型的な非限定的範囲は、０．０１−２０ｍｇ／ｋｇまたは１−１０ｍｇ／ｋｇまたは０．３−１ｍｇ／ｋｇである。投薬量の値が、緩和すべき状態のタイプおよび重症度とともに変わり得ることに注目されたい。任意の特定の患者に関する具体的な投与計画は、個人の必要性および投与するまたは組成物の投与を監督する人の専門的な判断に従って、経時的に調整されるべきであり、本明細書に示される投薬量の範囲は、単に模範例であり、特許請求される組成物の範囲または実行を制限することを意図しないことをさらに理解されたい。

８．抗ＩＬ−１８抗体の使用
８．１ 一般的な使用
ＩＬ−１８に結合するそれらの能力を所与とし、本発明の抗ＩＬ−１８抗体またはこの部分は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織の免疫組織化学などの従来のイムノアッセイを用いて、（例えば、試料母体、１つの態様では血清または血漿などの生物試料中の）ＩＬ−１８、１つの態様ではｈＩＬ−１８を検出するために使用することができる。本発明は、本発明の抗体または抗体部分と試料を接触させるステップおよびＩＬ−１８に結合した抗体（もしくはは抗体部分）または結合していない抗体（もしくは抗体部分）のいずれかを検出し、それによって試料中のＩＬ−１８を検出するステップを含む、生物試料中のＩＬ−１８を検出するための方法を提供する。抗体は、検出可能な物質で直接または間接的に標識し、結合したまたは結合していない抗体の検出を促進する。適した検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が挙げられる。適した酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリンホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適した補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、適した蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセン、フルオレセンイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例には、ルミノールが挙げられ、適した放射性物質の例には、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^３Ｈが挙げられる。試料中のＩＬ−１８の検出は、診断状況、例えば、増加したＩＬ−１８に関連する状態の診断に有用であり得、および／または抗ＩＬ−１８抗体での治療から恩恵を受け得る患者を同定するのに有用であり得る。

抗体の標識の代替として、例えば、検出可能な物質で標識したｒｈＩＬ−１８基準物質および標識していない抗ｈＩＬ−１８抗体などの抗ＩＬ−１８抗体を利用して、競合的イムノアッセイによって試料中でＩＬ−１８をアッセイすることができる。このアッセイにおいて、試料、標識ｒｈＩＬ−１８標準物質および抗ｈＩＬ−１８抗体を組合せ、非標識抗体に結合した標識ｒｈＩＬ−１８標準物質の量を決定する。試料中のｈＩＬ−１８の量は、抗ｈＩＬ−１８抗体に結合した標識ｒｈＩＬ−１８標準物質の量に反比例する。

本発明の抗体および抗体部分は、インビトロおよびインビボでのＩＬ−１８活性、１つの態様ではｈＩＬ−１８活性を中和することができる。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、例えば、ＩＬ−１８を含む細胞培養物中、ヒト患者中または本発明の抗体が架橋反応するＩＬ−１８を有する他の哺乳動物患者（例えば、ヒヒ、カニクイザルおよびアカゲザルなどの霊長類）中で、ＩＬ−１８活性を阻害するために使用することができる。１つの態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１８ならびにヒヒＩＬ−１８、マーモセットＩＬ−１８、チンパンジーＩＬ−１８、カニクイザルＩＬ−１８およびアカゲザルＩＬ−１８から成る群から選択される少なくとも１つの追加の霊長類ＩＬ−１８の活性を中和するが、マウスＩＬ−１８の活性は中和しない、単離されたヒト抗体またはこの抗体結合部分を提供する。１つの態様では、ＩＬ−１８は、ヒトＩＬ−１８である。例えば、ｈＩＬ−１８を含むまたは含む疑いのある細胞培養物中で、本発明の抗体または抗体部分を培養液に添加し、培養物中のｈＩＬ−１８活性を阻害することができる。

別の態様では、本発明は、ＩＬ−１８活性が有害である障害に苦しむ患者において、ＩＬ−１８活性を阻害するための方法を提供する。インターロイキン１８は、免疫および炎症の要素に関わる様々な疾患に関連する病理において、重要な役割を果たす。

本明細書で使用するとき、表現「ＩＬ−１８活性が有害である障害」は、障害に苦しむ患者においてＩＬ−１８の存在が、障害または障害の悪化に寄与する因子のいずれかの病態生理の原因であることが示された、またはその疑いがある疾患および他の障害を含むことを意図する。したがって、ＩＬ−１８活性が有害である障害は、ＩＬ−１８活性の阻害により、障害の症状および／または進行が緩和することが期待される障害である。かかる障害は、例えば、障害に苦しむ患者の体液中のＩＬ−１８濃度の増加（例えば、患者の血清、血漿、滑液などにおけるＩＬ−１８濃度の増加）によって証明でき、例えば、上記のような抗ＩＬ−１８抗体を用いて検出することができる。ＩＬ−１８活性が有害である障害の例は多数ある。１つの態様では、抗体またはこの抗原結合部分は、本明細書に記載の疾患または障害を扱う治療に使用することができる。別の態様では、抗体またはこの抗原結合部分は、本明細書に記載の疾患または障害を治療するための医薬品の製造に使用することができる。数種の非限定的で具体的な疾患の治療における本発明の抗体および抗体部分の使用は、以下にさらに議論する。

本発明は、ＩＬ−１８活性の調節を必要とする疾患または状態の治療のための医薬組成物を提供する。これらの疾患または状態には、自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、移植片拒絶、炎症性腸疾患、敗血症、多発性硬化症、虚血性心疾患（心臓発作を含む）、虚血性脳障害、慢性肝炎、乾癬、慢性膵炎、急性膵炎などが挙げられる。

したがって、抗ＩＬ−１８抗体もしくはその抗原結合部分またはインビボでそれを発現するベクターは、過剰なＩＬ−１８を引き起こすＩＬ−１８の異常な発現があるまたは外因的に投与されたＩＬ−１８による合併症の場合の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、移植片拒絶、炎症性腸疾患、敗血症、多発性硬化症、心臓発作を含む虚血性心疾患、虚血性脳障害、慢性肝炎、乾癬、慢性膵炎および急性膵炎ならびに同様の疾患の治療のために必要である。

８．２ 肝損傷における使用
本発明の１つの態様は、肝損傷の治療および／または予防のための新規の手段を提供する。ＩＬ−１８阻害剤は、肝傷害の予防および治療に効果的であることが見出された。本発明は、したがって肝損傷の治療および／または予防用薬剤を製造するためのＩＬ−１８阻害剤の使用にも関する。より具体的には、本発明は、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、免疫性肝炎、劇症肝炎、肝硬変および原発性胆汁性肝硬変により引き起こされる肝損傷の治療および／または予防に関する。

８．３ 関節炎における治療
ＩＬ−１８の阻害剤は関節炎の治療に効果的であることも、本発明にしたがって見出された。治療効果には、疾患の重症度の低下および疾患の拡張の予防が挙げられる。本発明は、したがって関節炎の治療および／または予防のためのＩＬ−１８の阻害剤の使用に関する。上記に概説した当技術分野の状況から、関節炎に関与する１つの具体的な因子、すなわちインターロイキンＩＬ−１８の遮断が、関節炎の緩和または罹患した関節部の治癒さえ引き起こし得ると結論付けられなかったため、この発見は予想外である。

用語「関節炎」は、例えばＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ｏｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓのホームページに規定されるような、関節炎の異なる全タイプおよび関節炎の状態、急性および慢性両方の関節炎を含む。関節炎の状態についての例は、強直性脊椎炎、背部痛、手根沈着症候群（ｃａｒｐａｌ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、エーラーダンロス症候群、痛風、若年性関節炎、エリテマトーデス、筋炎、骨形成不全症、骨粗鬆症、多発性関節炎（ｐｏｌｙａｒｔｈｅｒｉｔｉｓ）、多発性筋炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、強皮症、腸疾患を伴う関節炎、ベーチェット病、子供の関節炎、変性関節疾患、線維筋痛症、感染性関節炎、ライム病、マルファン症候群、骨関節炎、骨壊死、パジェット病、リウマチ性多発筋痛症、偽痛風、反射性交感神経性ジストロフィー、関節リウマチ、リウマチ、シェーグレン症候群、家族性大腸腺腫症などである。

関節リウマチ（ＲＡ）は、関節部の裏打ち（滑膜、１層の細胞層上皮）および／または内臓に炎症を引き起こす。この疾患は長年持続する傾向があり、典型的には身体中の多くの異なる関節部に影響を及ぼし、最終的に、軟骨、骨、腱および靭帯に傷害をもたらし得る。ＲＡによる影響を受け得る関節部は、例えば、首、肩、肘、臀部、手首、手、膝、足首および足に位置する関節部である。多くの場合、関節部は、ＲＡにおいて対照的なパターンの炎症性である。

ＲＡは、合衆国の人口の約１％に蔓延し、全民族および年齢内に分布する。それは全世界中で起こり、ＲＡを有するヒトのうち女性の数が男性を３対１で上回る。

ＩＬ−１８阻害剤の投与により、関節炎のマウスモデルにおいて軟骨びらんが顕著に減少することが見出された。本発明は、したがって軟骨破壊の治療および／または予防のための薬剤の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の使用にも関する。

ＩＬ−１８抗体の単離および精製
この実施例は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および他の不純物から抗ＩＬ−１８抗体を精製する１つの計画を提供する。本精製工程を概説するフロー図を図１に示す。

１．１ 酸性化による清澄化を用いる一次回収
遠心分離による一次回収を、３０００Ｌの産生バイオリアクター収集物から細胞および細胞残骸を除去するために使用した。遠心分離機は、３０Ｌ／分の供給速度で６９００×ｇで実行し、清澄化した上澄みを、事前に滅菌した３０００Ｌの収集タンク中に収集した。低ｐＨ酸性化ステップの目的は、外来性ウイルスの不活性化および続く陽イオン捕獲クロマトグラフィステップのための培養上清の調製である。遠心分離して清澄化した収集物を、３Ｍのクエン酸を用いてｐＨ３．５±０．１に調整し、２０℃で１時間そのｐＨで維持した。次いで、清澄化した収集物を、３ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ４．９±０．１に調整し、８℃で１６−２４時間維持した。ｐＨ調整した収集物を２０℃に戻し、次いで３０Ｌ／分の供給速度で１２，７５０×ｇで遠心分離することによって清澄化し、上清を２０００Ｌのタンク中に収集した。陽イオン交換クロマトグラフィの前に、清澄化した収集物を、通常の孔径０．２−０．８μｍの深層フィルターおよび０．２２μｍの親水性フィルターカートリッジを含むフィルタートレインに通した。遠心分離、低ｐＨ処理および再遠心分離についての結果を表２に示す。ステップの収率は、６９±６％（ｎ＝７）であった。

１．２ 陽イオン交換クロマトグラフィ
ＩＬ−１８抗体を、陽イオン交換クロマトグラフィによって、清澄化した収集物から捕獲した。さらに、工程関連不純物（例えば、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡおよび他の工程関連不純物）をプロセスストリームから除去した。直径８０ｃｍ×長さ２０ｃｍのカラム（ベッドボリューム１０１Ｌ）をこの操作に使用した。カラムにＦｔａｃｔｏｇｅｌ（商標）Ｓ樹脂（ＥＭＤ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ギブスタウン、ＮＪ）で充填し、非対称および理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）を、充填の質を決定するために測定した。このカラムの操作は外気温であった。

カラムを、ｐＨ５の、２０ｍＭのクエン酸Ｎａ／クエン酸バッファー、６５ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化した。深層濾過物を、９±０．５ｍＳ／ｃｍに伝導率を低下させるために水で希釈し、１８０ｃｍ／時の線速度で負荷した。このクロマトグラフィステップの最大負荷を、樹脂１リットルにつきタンパク質２７ｇで設定した。カラムを、次いで２００ｃｍ／時の線速度で平衡バッファーを用いて洗浄してベースラインにした。１２５ｃｍ／時の線速度で、ｐＨ５の、２０ｍＭのクエン酸Ｎａ／クエン酸バッファー、３００ｍＭのＮａＣｌで、産物を溶出した。吸光度がＯＤ３．０（Ａ_２８０）以上に上昇したときにカラム溶出液を収集し、ピークが終わるにつれて吸光度がＯＤ２．０に減少するまで続けた。プールした物質を、０．８μｍのフィルターに続いて０．２μｍのフィルターに通して濾過した。陽イオン交換クロマトグラフィについての結果を表３に示す。ステップの収率は８８±６％（ｎ＝７）であり、ＳＥＣ ＨＰＬＣによる純度は９８．２９±０．５２％の単量体（ｎ＝７）であった。

１．３ 限界濾過／透析濾過
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）Ｓ溶出液の濃縮を、３０ｋＤの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）再生酢酸セルロース限界濾過メンブレンカートリッジを用いて行った（総面積７平方メートル）。溶出液の限界濾過を、３０ｇ／Ｌの最終標的濃度まで濃縮した。濃縮物を、次いでｐＨ７の、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、１５０ｍＭのＮａＣｌの６容量を用いて透析濾過した。

ＵＦ系は、次いで産物を排出し、透析濾過バッファーでリンスして系に維持された産物を回収した。濃縮および洗浄を組み合わせて、透析濾過したＩＬ−１８抗体を生成した。濃縮したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＳＯ_３ ⁻溶出液を、貯蔵タンク中に０．２μｍですぐに濾過し、処理を再開する準備ができるまで８℃で維持した。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）Ｓ溶出液の濃縮についての結果は表４に示す。ステップは８８±７％（ｎ＝７）であり、ＳＥＣ ＨＰＬＣによる純度は９７．６７±０．５９％の単量体（ｎ＝７）であった。

１．４ 陰イオン交換クロマトグラフィ
陰イオン交換クロマトグラフィにより、ＤＮＡ、ウイルスおよびエンドトキシンなどの工程関連不純物が減少する。直径４５ｃｍ×長さ３０ｃｍのカラム（ベッドボリューム４８Ｌ）をこの操作に使用した。カラムにＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を充填し、非対称およびＨＥＴＰを、充填の質を決定するために測定した。希釈した物質を、近くの可動性ステンレススチールタンク中に収集し、１２℃で操作したＣｌａｓｓ １０，０００精製スーツに移した。

この操作は１２℃で行った。樹脂の平衡化は、ｐＨ８の、２５ｍＭのトロラミン、４０ｍＭのＮａＣｌを用いて遂行した。このクロマトグラフィステップについての最大タンパク質負荷は、樹脂１リットルにつきタンパク質６０グラムで設定した。希釈し、濾過し、ウイルス不活性化した物質を、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦカラム負荷と名付けた。工程関連不純物を樹脂に吸着させ、抗体をカラムに通して流す。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）Ｓ溶出液の濃縮物を、２容量のＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム負荷平衡液（ｐＨ８の５０ｍＭのトロラミン）で希釈し、カラム上に負荷した。カラムの負荷は１５０ｃｍ／時で行い、Ａ_２８０が０．４ＯＤ以上に上昇したときに、カラムのフロースルーを収集した。次いでカラムを平衡バッファーで洗浄し、Ａ_２８０が０．６のＯＤに戻るまで洗浄物を収集した。フロースルーおよび洗浄を組み合わせて、溶出液産物プールを形成した。陰イオン交換クロマトグラフィについての結果は表５に示す。ステップの収率は９２±４％（ｎ＝７）であり、ＳＥＣ ＨＰＬＣによる純度は９９．０４±０．５１％の単量体（ｎ＝７）であった。

１．５ 疎水性相互作用クロマトグラフィ
疎水性相互作用クロマトグラフィにより、抗体凝集体および工程関連不純物が除去される。直径４５ｃｍ×長さ１５ｃｍのカラム（ベッドボリューム２４Ｌ）をこの操作に使用した。カラムにＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔｗａｙ、ＮＪ）を充填し、非対称およびＨＥＴＰを、充填の質を決定するために測定した。このユニットの操作も、ｃｌａｓｓ １０，０００精製スーツにおいて１２℃で行った。

この操作を１２℃で行った。樹脂の平衡化は、ｐＨ７の、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１．１Ｍの硫酸アンモニウムで遂行した。このステップについての最大タンパク質負荷は、樹脂１リットルにつきタンパク質４０グラムで設定した。カラムの負荷は、７５ｃｍ／時で行った。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＴＷを、ｐＨ７の同等量の４０ｍＭのリン酸ナトリウム、２．２Ｍの硫酸アンモニウムで希釈し、混合して０．２μｍで濾過した。負荷に続いて、カラムをｐＨ７の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１．１Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４で洗浄した。３８ｃｍ／時の線速度で、ｐＨ７の９ｍＭのリン酸ナトリウム、０．３Ｍの硫酸アンモニウムを用いてステップ塩勾配を行うことにより、産物を溶出した。吸光度がＡ_２８０で１．０ＯＤ以上に上昇したときに産物を収集し、ピークが終わるにつれて吸光度が４．０ＯＤに減少するまで続けた。１または２サイクルが、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＴＷの完全なバッチを処理するために必要であった。疎水性相互作用クロマトグラフィについての結果は表６に示す。ステップの収率は９７±４％（ｎ＝７）であり、ＳＥＣ ＨＰＬＣによる純度は９９．３０±０．５５％の単量体（ｎ＝７）であった。

１．６ ウイルス濾過
Ｕｌｔｉｐｏｒ ＤＶ５０（商標）ナノ濾過ステップにより、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰカラム溶出液中に存在し得る直径≧５０ｎｍの外来性ウイルスが除去される。この操作は１２℃で行った。Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰカラム溶出液を０．１μｍで濾過し、事前に湿潤した１０”Ｕｌｔｉｐｏｒ ＤＶ５０（商標）フィルター（Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ、ノースボロー、ＭＡ）に３５ｐｓｉｇで通した。フィルターを、次いでＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰカラム溶出バッファーで流し、フィルターハウジング中に保持された任意の抗ＩＬ−１８抗体を除去した。Ｕｌｔｉｐｏｒ ＤＶ５０（商標）濾過物を、近くの可動性ステンレススチールタンク中に１０−１４℃で貯蔵した。ＤＶ５０（商標）ナノ濾過についての結果は表７に示す。ステップの収率は９６±４％（ｎ＝７）であり、ＳＥＣ ＨＰＬＣによる純度は９９．５１±０．２６％の単量体（ｎ＝７）であった。

１．７ 最終限界濾過／透析濾過
ＵＦ／ＤＦステップは、ＩＬ−１８抗体の濃縮であり、硫酸アンモニウムの除去および処方バッファー中への抗体のダイアフィルターである。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの３０ｋＤの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）再生セルロース限界濾過メンブレンカートリッジ（７平方メートル）をこのステップに使用した。このステップは１２℃で行う。Ｕｌｔｉｐｏｒ ＤＶ５０（商標）ナノ濾過物を、およそ６５ｇ／Ｌタンパク質に濃縮した。次いで、最小８容量の処方バッファーを用いる連続的透析濾過を行った。ＵＦ／ＤＦ系は、次いで産物を排出し、透析濾過バッファーでリンスして系に維持された産物を回収した。濃縮および洗浄を組み合わせて、透析濾過した抗体を生成した。次いで抗体試料を、Ｍｉｌｌｉｐａｋ Ｏｐｔｉｃａｐ（商標）１０”フィルター（０．７平方メートル）に０．２μｍで通した。限界濾過／透析濾過操作の結果は表８に示す。ステップの収率は９６±４％（ｎ＝７）であり、ＳＥＣ ＨＰＬＣによる純度は９９．５１±０．２６％の単量体（ｎ＝７）であった。

１．８ 最終濾過、瓶詰めおよび凍結
処方した抗体を、２ＬのＰＥＴＧ容器中に０．２μｍで濾過し、−８０℃（名目上）で凍結した。限界濾過／透析濾過操作の結果は表９に示す。ステップの収率は９６±４％（ｎ＝７）であった。

２．抗ＩＬ−１８抗体組成物における宿主細胞タンパク質濃度の決定
この手順では、抗ＩＬ−１８抗体試料中の残留宿主細胞タンパク質濃度を決定するための試験方法論を記載する。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、特異抗体の２つの層の間に宿主細胞タンパク質（抗原）をサンドイッチする。これに続いて、カゼインを用いて非特異的部位をブロックする。宿主細胞タンパク質を、次いで抗原分子が一次抗体に捕獲される間、温置する（抗原のコーティング）。抗原（宿主細胞タンパク質）に固定する二次抗体（ビオチン化した抗宿主細胞タンパク質）を次いで添加する。ビオチン化抗宿主細胞タンパク質に結合するＨＲＰコンジュゲート型ニュートラアビジンを添加する。これに続いてＫブルーサブストレートを添加する。青色を生成する発色性基質を、結合した酵素コンジュゲート型抗体によって加水分解する。色を黄色に変える２ＭのＨ_３ＰＯ_４で反応を止める。色の強度は、ウェル中の結合した抗原の量に直接的に比例する。

ｐＨ９．４の５０ｍＭの重炭酸ナトリウム（コーティングバッファー）の調製。１Ｌのビーカーに、９００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑウォーター；４．２０ｇ±０．０１ｇの重炭酸ナトリウムを添加する。完全に溶解するまで撹拌する。１ＮのＮａＯＨでｐＨ９．４まで調整する。１Ｌのメスフラスコに移行し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑウォーターで体積を増やす。均一になるまで逆回転により混合する。０．２２μｍの無菌フィルターユニットに通して濾過する。調製の日から最大７日間、名目上４℃で貯蔵する。

０．１０４ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４ ^＊７Ｈ_２Ｏ、１．３７ＭのＮａＣｌ、０．０２７ＭのＫＣｌ、０．０１７６ＭのＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ＝６．８−６．９（１０×ＰＢＳ）の調製。およそ４００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑウォーターをガラスビーカーに添加する。１３．９４ｇ±０．０１ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４×７Ｈ_２Ｏを添加する。４０．０ｇ±０．１ｇのＮａＣｌを添加する。１．００ｇ±０．０１ｇのＫＣｌを添加する。１．２０ｇ±０．０１ｇのＫＨ_２ＰＯ_４を添加する。均一になるまで撹拌する。５００ｍＬのメスフラスコに移行する。Ｍｉｌｌｉ−ＱウォーターでＱＳを５００ｍＬの体積にする。逆回転により混合する。０．２μｍの無菌フィルターユニットに通して濾過する。室温で最大７日間貯蔵する。

１×ＰＢＳ＋０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ７．４０（プレート洗浄バッファー）の調製。４Ｌのメスシリンダー中で、４００ｍＬの１０×ＰＢＳ（ステップ５．２）と３５００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑウォーターを混合する。ｐＨを確認し、必要に応じて１ＮのＨＣｌまたは１ＮのＮａＯＨで７．４０±０．０５に調整する。Ｍｉｌｌｉ−Ｑウォーターで体積を増やす。シリンダーをパラフィルムできつく覆い、均一になるまで逆回転により混合する。４Ｌのボトルに移行する。４ｍＬの１×ＰＢＳを除去し、捨てる。４ｍＬのトリトンＸ−１００を３９９６ｍＬの１×ＰＢＳに添加する。撹拌プレート上に置き、完全に溶解するように撹拌する。希釈バッファーの調製に必要な量のプレート洗浄バッファーを、０．２２μｍの無菌フィルターユニットに通して濾過する。最大７日間、室温で貯蔵する。

コーティング抗体混合物：アフィニティ精製したヤギ抗ＣＨＯ５９９／６２６／７４８（ロット＃Ｇ１１２０１＠１．５３４ｍｇ／ｍＬ）の調製。注意：バイアル中で名目上−８０℃で貯蔵した貯蔵物である。アリコートを調製する。使用時に１プレートにつき１アリコート取り出す。使用する前にすぐに、次のように冷たい５０ｍＭの重炭酸ナトリウム中で最終濃度４μｇ／ｍＬになるように抗体混合物を希釈する。例えば、３１μＬのコーティング抗体混合物を１１９６９μＬの冷たいコーティングバッファーに添加する。逆回転により穏やかに混合する。

ビオチン化ヤギ抗宿主細胞タンパク質混合物、５９９／６２６／７４８（ロット＃Ｇ１１２０２＠０．８２２ｍｇ／ｍＬ）の調製。注意：バイアル中で名目上−８０℃で貯蔵した貯蔵物である。アリコートを調製する。使用時に１プレートにつき１アリコート取り出す。使用する前にすぐに、次のように３７℃±２℃のカゼイン中で最終濃度１μｇ／ｍＬになるようにビオチン化抗体混合物を希釈する。例えば、１４．６μＬのビオチン化抗体混合物を１１９８５μＬの３７℃±２℃のカゼインに添加する。逆回転により穏やかに混合する。

ニュートラアビジン−ＨＲＰの調製。次のように新しいロット（２ｍｇ／バイアル）を１ｍｇ／ｍＬに再構築する。４００μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑウォーターをバイアルに添加し、次いで１６００μＬの１×ＰＢＳを添加し、全体で２ｍＬにする。混合するために穏やかにボルテックスする。名目上−２０℃で貯蔵する。１プレートにつき１アリコートを使用できるように、所望の体積のアリコートを調製する。ポリプロピレンチューブ中で調製する。新しいロットを限定して作業用濃度を決定する。調製の日から６カ月の終了を指定する。例えば、作業用濃度が０．２μｇ／ｍＬと決定されれば、次のように調製する。使用する前にすぐに、室温でニュートラアビジン−ＨＲＰのアリコートを解凍する。１ｍｇ／ｍＬのニュートラアビジン溶液を３７℃±２℃のカゼインで０．１ｍｇ／ｍＬ（１００μｇ／ｍＬ）に希釈する。例えば、×１０希釈し、５０μＬのニュートラアビジンを４５０μＬのカゼインに添加する。混合するために穏やかにボルテックスルする。１００μｇ／ｍＬ溶液を３７℃±２℃のカゼインで０．２μｇ／ｍＬにさらに希釈する。例えば、×５００希釈し、２４μＬのニュートラアビジン（１００μｇ／ｍＬ）を１１９７６μＬのカゼインに添加する。混合するために穏やかにボルテックスする。

５．７２Ｍのリン酸（停止液）の調製。次のように濃縮したリン酸から２Ｍのリン酸溶液を調製する。ラベル上に提示された％リン酸、密度（１．６８５ｇ／ｍＬ）および式量（９８ｇ／モル）から、２Ｍのリン酸５００ｍＬを調製するのに必要な濃縮したリン酸の体積を計算する。上記で計算した濃縮したリン酸の体積をフラスコに添加する。Ｍｉｌｌｉ−Ｑウォーターで体積を増やし、均一になるまで逆回転により混合する。調製の日から最大６カ月間、外気温で貯蔵する。

希釈溶液（ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００中で×１００希釈したカゼイン）の調製。（上記から得た）ｐＨ７．４の０．２２μｍの滅菌濾過した１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００中で３７℃±２℃のカゼインＸ１００を希釈する。例えば、１ｍＬの３７℃±２℃のカゼインを９９ｍＬの０．２２μｍの滅菌濾過した１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００、ｐＨ７．４に添加する。ウェルを混合する。各使用について新鮮に調製する。

標準物質の調製。宿主細胞タンパク質標準物質（抗原標準物質）（ロット＃Ｇ１１２０３＠１．２１８ｍｇ／ｍＬ）。注意：７０μＬアリコート中で名目上−８０℃で貯蔵した貯蔵物である。室温でアリコートを解凍する。希釈バッファーを用いて、ポリプロピレンチューブ中で連続希釈を行う。

試料の調製。ポリプロピレンチューブにおいて、希釈バッファー中で最終バルク試料を２４ｍｇ／ｍＬに希釈する。濃度を記録する。注意：スパイクした試料の調製および以下に参照の１２ｍｇ／ｍＬの溶液の調製のために以下の溶液を使用する。ポリプロピレンマイクロチューブにおいて、希釈バッファー中で２４ｍｇ／ｍＬの溶液を１２ｍｇ／ｍＬにさらに希釈する。全部で６ウェルについて、プレート上に１２ｍｇ／ｍＬの各溶液をトリプリケートでウェルに負荷する。

スパイクの調製。ポリプロピレンマイクロチューブにおいて、希釈バッファーで２Ｘ希釈することによって、上記で調製した２０ｎｇ／ｍＬの標準物質から１０ｎｇ／ｍＬの宿主細胞タンパク質スパイクを調製する。１０ｎｇ／ｍＬのスパイク溶液をプレート上の３ウェルに負荷する。スパイク試料について、ステップ６．１から得た２０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を使用する。

スパイクした試料の調製。ポリプロピレンマイクロチューブにおいて、２４ｍｇ／ｍＬの各最終バルク溶液３００μＬを、３００μＬの２０ｎｇ／ｍＬのスパイク溶液（６．１）でスパイクする。全部で６ウェルについて、スパイクした各試料溶液をトリプリケートでウェルに負荷する。

対照の調製。対照の範囲は、通例の試験で使用する前に、新しい対照貯蔵溶液ごとに設定しなければならない。対照貯蔵物は、１５０μＬのアリコートのバッチのＡＢＴ−８７４薬物濃度を調製し、最大３年間、名目上−８０℃で凍結貯蔵する。

作業用対照の調製。対照のアリコートを室温で解凍する。ポリプロピレンチューブ中で、希釈バッファーで対照を２４ｍｇ／ｍＬに希釈する。ポリプロピレンマイクロチューブ中で、２４ｍｇ／ｍＬの対照溶液を希釈バッファーで１２ｍｇ／ｍＬにさらに希釈する。単一の希釈液を調製し、プレートの３ウェル中に対照を負荷する。

ＥＬＩＳＡの手順。プレート洗浄ボトルをプレート洗浄バッファーで満たす（ステップ５．３を参照されたい。１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００）。プレートウォッシャーを用意する。次のパラメータを確認する。パラメータは、プレートタイプ：各サイクルについて１（全部で５サイクル）、体積：４００μｌ、浸漬時間：１０秒、Ａｓｐ．時間：４秒に設定すべきである。

アッセイの手順。冷たい５０ｍＭの重炭酸ナトリウム中の４μｇ／ｍＬのヤギコーティング抗体混合物を１００μＬ／ウェルでプレートにコートする。コーティング溶液が、ウェルの底を均一に覆うまで、プレートの側面をたたき、密封テープで覆い、プレートシェーカー（または同等物）上で、１８時間±１時間、スピード３で振動させながら、名目上４℃で温置する。一晩中温置した後、冷蔵庫からプレートを取り出し、室温に平衡化することができる。コーティングを振り落とす。ペーパータオル上でプレートをブロットする。３００μＬ／ウェルの３７℃±２℃のカゼインでブロックし、密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（または同等物）上で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで１時間、振動させながら、３７℃±２℃で温置する。ブロッキング温置の間、標準物質、試料、対照、スパイクおよびスパイクした試料を調製する。洗浄バッファーで５回プレートを洗浄する。ペーパータオル上でプレートをブロットする。８チャンネルピペットを用いて、１００μＬ／ウェルの標準物質、試料、スパイク、スパイクした試料およびコントロールを、プレートのトリプリケートのウェル中にピペットで入れる。１００μＬ／ウェルの希釈バッファーを、プレートの全て空のウェル中にピペットで入れ、ブランクとして役立てる。密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（または同等物）上で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで１時間、振動させながら、３７℃±２℃で温置する。鋳型を記入し、プレートに負荷するときにガイドとして使用する。

プレートリーダーの設定。標準物質についての濃度を入力してテンプレートを設定する。試料、対照、スパイクまたはスパイクした試料についての希釈因子は入力しない。全ウェルから差し引く、ブランクとしての希釈液を含むウェルを指定する。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄する。ペーパータオル上でプレートをブロットする。１００μＬ／ウェルのビオチン化ヤギ抗体を添加する。密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（または同等物）上で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで１時間、振動させながら、３７℃±２℃で温置する。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄する。ペータータオル上でプレートをブロットする。１００μＬ／ウェルのニュートラアビジン−ＨＲＰコンジュゲート溶液を添加する。密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（または同等物）上で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで１時間、振動させながら、３７℃±２℃で温置する。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄する。ペーパータオル上でプレートをブロットする。１００μＬ／ウェルの冷たいＫブルーサブストレートを添加し、密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅタイタープレートシェーカー（または同等物）上でスピード３で振動させながら、室温で１０分間温置する（基質を最初の列に添加したらすぐにタイマーを開始する）。１００μＬ／ウェルの２Ｍのリン酸を添加することによって反応を停止させる（ステップ５．７）。スピード３で３−５分間プレートシェーカー上にプレートを置く。４５０ｎｍでプレートを読み込む。

データ解析および計算。注意：光学密度が標準曲線の実際的な定量化の限界内に入り、後述の％ＣＶまたは％差の基準を満たす、試料、スパイク、スパイクした試料および対照のみが許容可能である。試料のＯＤが、２．５ｎｇ／ｍＬの標準物質より下に入れば、結果は２．５ｎｇ／ｍＬ以下として報告すべきである。この値を次いで希釈した試料濃度（１２ｍｇ／ｍＬ）で割って、ｎｇ／ｍｇでの値を報告すべきである。上記の標準曲線となる非スパイクおよび／またはスパイクした試料を引き起こす宿主細胞濃度において試料が高ければ、＞１００ｎｇ／ｍＬとして値を報告する。この値を次いで希釈した試料濃度（１２ｍｇ／ｍＬ）で割って、ｎｇ／ｍｇでの値を報告すべきである。試料が、２．５ｎｇ／ｍＬの標準物質より下であるとき、スパイクリカバリー計算について試料の値をゼロと考える。

標準曲線。標準物質の濃度は、プロトコールのテンプレート中に入力すべきである。二次曲線適合を用いる。決定係数は＝０．９９でなければならず、トリプリケートのウェル間の％ＣＶは＝２０％でなければならない。この基準が満たされなければ、１つの標準物質（１つの濃度、３ウェル）を滴下することができる。１．２５ｎｇ／ｍＬを滴下すれば、光学密度が２．５ｎｇ／ｍＬ内に入る、および１００ｎｇ／ｍＬ（維持標準曲線の点）の光学密度である試料およびスパイクした試料のみが許容可能である。さらに、各標準物質の濃度のトリプリケートについて、単一のウェルが明らかに汚染されているまたは低い結合性を示す場合、それを滴下することができる。標準物質の濃度でウェルに滴下すれば、維持複写は％差＝２０％をもたなければならない。プレートのバックグラウンド（ブランク）に近いＯＤ値を示すもっとも低い標準物質についての％ＣＶは、＝３０％であるべきである。１つのウェルに滴下すれば、維持複写の％差は＝３５％であるはずである。もっとも低い標準物質を滴下すれば、光学密度が維持標準曲線レベル光学密度内に入る試料およびスパイクした試料のみが許容可能である。

試料。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％であるべきである。トリプリケートのウェル間の％ＣＶを報告する。各試料希釈からの１つのウェルを滴下することができる。維持複写は＝２０％の％差をもたなければならない。注意：非スパイクの試料のＯＤが、２．５ｎｇ／ｍＬの標準物質のＯＤより下であれば、％差の基準は、非スパイクの結果に適用しない。上記の計算を参照する。ｎｇ／ｍｇにおける実際の宿主細胞濃度を、次のように平均（ｎｇ／ｍＬ）値から計算する：ＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ｎｇ／ｍｇ）＝平均の「非スパイクの試料の結果（ｎｇ／ｍＬ）」＿希釈した試料濃度（１２ｍｇ／ｍＬ）。

スパイク。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％であるべきである。％ＣＶを報告する。スパイクからの１つのウェルを滴下することができる。維持点は％差＝２０％でなければならない。上記の計算を参照する。ｎｇ／ｍＬにおける宿主細胞濃度を報告する。この結果は、スパイクリカバリー計算に使用する。スパイクについての結果の濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、理論上のスパイクの濃度の±２０％でなければならない。結果を報告し合否を示す。スパイクの結果が、理論上の２０％以内でなければ、アッセイは繰り返さなければならない。平均のスパイク濃度（ｎｇ／ｍＬ）×１００は、＝１００％±２０％ １０ｎｇ／ｍＬでなければならない。

スパイクした試料。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％であるべきである。トリプリケートのウェル間の％ＣＶを報告する。スパイクした各試料希釈からの１つのウェルを滴下することができる。維持複写は、％差＝２０％をもたなければならない。上記の計算を参照する。各希釈についてｎｇ／ｍＬで「スパイクした試料の結果」を報告する。デュプリケートの希釈物間での％差を報告する。希釈物間の％差は＝２５％でなければならない。これらの結果はスパイクリカバリー計算に使用する。以下の式を用いて、各希釈物セットについて％スパイクリカバリーを計算する：％スパイクリカバリー＝スパイクした試料の値−非スパイクの試料の値×１００スパイクの値。（１）非スパイク試料の値のＯＤが、２．５ｎｇ／ｍＬの標準物質より下に入れば、％スパイクリカバリー計算においてゼロと値を考えることに注目する。％スパイクリカバリーは、各試料の各希釈について、１００％±５０％（５０％−１５０％）でなければならない。結果および合否を報告する。

対照。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％であるべきである。％ＣＶ結果を報告する。対照からの１つのウェルを滴下することができる。維持複写は％差＝２０％をもたなければならない。上記の計算を参照する。ｎｇ／ｍＬにおける対照での宿主細胞濃度を報告する。次のようにｎｇ／ｍｇでの宿主細胞濃度を計算する：宿主細胞タンパク質（ｎｇ／ｍｇ）＝ｎｇ／ｍＬでの対照の宿主細胞タンパク質の結果。

様々な文献が本明細書に引用され、その内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (44)

1. 抗体および少なくとも１つの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む試料混合物からＨＣＰ減少型ＩＬ−１８抗体調製物を生成するための方法であって、
   （ａ）試料母体をｐＨの低下に供して一次回収試料を形成するステップであり、前記ｐＨの低下が約３．０から約４．０の間であるステップ、
   （ｂ）前記一次回収試料を約４．５から約５．５の間のｐＨに調整し、続いて前記一次回収試料をイオン交換樹脂に通し、イオン交換試料を収集するステップ、ならびに
   （ｃ）前記イオン交換試料を疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）樹脂に通し、ＨＩＣ試料を収集するステップであり、前記ＨＩＣ試料が前記ＨＣＰ減少型抗体調製物を含むステップ
   を含む、方法。
2. 前記ｐＨの低下が、適した酸と前記試料混合物とを混合することによって達成され、ならびに前記適した酸が、クエン酸、酢酸、カプリル酸などから成る群から選択される、請求項１の方法。
3. 前記イオン交換樹脂が、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂のいずれかである、請求項１の方法。
4. 前記イオン交換樹脂が陽イオン交換樹脂である、請求項３の方法。
5. 前記陽イオン交換樹脂が、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸（Ｐ）およびスルホン酸（Ｓ）から成る群から選択される、請求項４の方法。
6. 前記陽イオン交換樹脂がＦｒａｃｔｏｇｅｌである、請求項５の方法。
7. 前記イオン交換樹脂が陰イオン交換樹脂である、請求項３の方法。
8. 前記陰イオン交換樹脂が、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、４級アミノエチル（ＱＡＥ）および４級アミン（Ｑ）基から成る群から選択される、請求項７の方法。
9. 前記陰イオン交換樹脂がＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅである、請求項８の方法。
10. 前記イオン交換ステップが、第１のイオン交換ステップおよび第２のイオン交換ステップを含む、請求項１の方法。
11. 前記第１のイオン交換ステップが陽イオン交換ステップであり、第２の陰イオン交換ステップが続く、請求項１０の方法。
12. 前記第１および前記第２のイオン交換ステップの間に起こる濾過ステップである中間ステップをさらに含む、請求項１０の方法。
13. 前記濾過ステップが、捕獲限界濾過／透析濾過によって達成される、請求項１２の方法。
14. 前記ＨＩＣが、１つ以上の疎水基を含むカラムを用いて達成される、請求項１の方法。
15. 前記１つ以上の疎水基が、アルキル基、アリル基およびこれらの組合せから成る群から選択される、請求項１４の方法。
16. 前記カラムが、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムなど）、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ Ｐｒｏｐｙｌ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ Ｐｈｅｎｙｌカラム、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）Ｍｅｔｈｙｌ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ｔ−Ｂｕｔｙｌ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、ＷＰ ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ_３）（商標）カラムおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）エーテル、フェニルまたはブチルカラムから成る群から選択される、請求項１４の方法。
17. 前記カラムがＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを含む、請求項１６の方法。
18. 前記ＨＩＣ試料を濾過に供してウイルス粒子を除去し、バッファー交換を促進させる、濾過ステップをさらに含む、請求項１の方法。
19. 前記ＨＣＰ減少型抗体調製物が、抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合部分を含む、請求項１の方法。
20. 前記抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合部分が、ヒト化抗体、キメラ抗体または多価抗体である、請求項１９の方法。
21. 前記抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合部分がヒト化抗体である、請求項２０の方法。
22. 前記抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合部分が、共に表面プラズモン共鳴による測定にて約１．３４×１０^−４Ｍ以下のＫ_ｄ速度定数および約０．１ｓ^−１以下のＫ_ｏｆｆ速度定数でヒトＩＬ−１８から解離する単離されたヒト抗体である、請求項２０の方法。
23. 前記抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合部分が、インビボおよびインビトロの両方でＩＬ−１８を中和する、請求項１９の方法。
24. 前記調製物がＨＣＰを実質的に含まない、請求項１の方法。
25. 抗体および少なくとも１つの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む試料混合物からＨＣＰ減少型抗体調製物を生成するための方法であって、
    （ａ）試料母体をｐＨの低下に供して一次回収試料を形成するステップであり、前記ｐＨの低下が約３．０から約４．０の間であるステップ、
    （ｂ）前記一次回収試料を約４．５から約５．５の間のｐＨに調整し、続いて前記一次回収試料を陽イオン交換樹脂に通し、陽イオン交換試料を収集するステップ、
    （ｃ）前記陽イオン交換試料を陰イオン交換樹脂に通し、陰イオン交換試料を収集するステップ、ならびに
    （ｄ）前記陰イオン交換試料を疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）樹脂に通し、ＨＩＣ試料を収集するステップであり、前記ＨＩＣ試料が、前記ＨＣＰ減少型抗体調製物を含むステップ
    を含む、方法。
26. 抗体および少なくとも１つの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む試料混合物からＨＣＰ減少型抗体調製物を生成するための方法であって、
    （ａ）試料母体をｐＨの低下に供して一次回収試料を形成するステップであり、前記ｐＨの低下が約３．０から約４．０の間であるステップ、
    （ｂ）前記一次回収試料を約４．５から約５．５の間のｐＨに調整し、続いて前記一次回収試料を陽イオン交換樹脂に通し、陽イオン交換試料を収集するステップ、
    （ｃ）前記陽イオン交換試料を濾過に供し、濾過物を収集するステップ、
    （ｄ）（ｃ）からの前記濾過物を陰イオン交換樹脂に通し、陰イオン交換試料を収集するステップ、ならびに
    （ｅ）前記陰イオン交換試料を疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）樹脂に通し、ＨＩＣ試料を収集するステップであり、前記ＨＩＣ試料が、前記ＨＣＰ減少型抗体調製物を含むステップ
    を含む、方法。
27. 請求項１の方法によって生成されるＨＣＰ減少型抗体調製物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
28. 前記抗体が、抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合部分である、請求項２７の医薬組成物。
29. ＨＣＰを実質的に含まない、請求項２７の医薬組成物。
30. ＩＬ−１８によって促進される障害を中和するために使用される、請求項２７の医薬組成物。
31. 前記障害が、自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病、関節炎、関節リウマチ、移植片拒絶、炎症性腸疾患、敗血症、多発性硬化症、虚血性心疾患（心臓発作を含む）、虚血性脳障害、慢性肝炎、乾癬、慢性膵炎、急性膵炎、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、免疫性肝炎、劇症肝炎、肝硬変および原発性胆汁性肝硬変から成る群から選択される、請求項３０の医薬組成物。
32. 前記関節炎が、強直性脊椎炎、背部痛、手根沈着症候群、エーラーダンロス症候群、痛風、若年性関節炎、エリテマトーデス、筋炎、骨形成不全症、骨粗鬆症、多発性関節炎（ｐｏｌｙａｒｔｈｅｒｉｔｉｓ）、多発性筋炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、強皮症、腸疾患を伴う関節炎、ベーチェット病、子供の関節炎、変性関節疾患、線維筋痛症、感染性関節炎、ライム病、マルファン症候群、骨関節炎、骨壊死、パジェット病、リウマチ性多発筋痛症、偽痛風、反射性交感神経性ジストロフィー、関節リウマチ、リウマチ、シェーグレン症候群、家族性大腸腺腫症などから成る群から選択される、請求項３１の医薬組成物。
33. 非ステロイド性またはステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項２７の医薬組成物。
34. 非ステロイド性抗炎症薬を含む、請求項３３の医薬組成物。
35. 前記非ステロイド性抗炎症薬が、イブプロフェン、副腎皮質ステロイド、プレドニゾロンなどから成る群から選択される、請求項３４の医薬組成物。
36. ステロイド性抗炎症薬を含む、請求項３３の医薬組成物。
37. １つ以上の他の抗体またはこの抗原結合部分をさらに含む、請求項２７の医薬組成物。
38. 医薬品をさらに含む、請求項２７の医薬組成物。
39. 前記医薬品が、メトトレキサート、６−ＭＰ、アザチオプリンスルファサラジン、メサラジン、オルサラジンクロロキニン／ヒドロキシクロロキン、ペンシルアミン、金チオリンゴ酸、アザチオプリン、コチシン、副腎皮質ステロイド、β−２アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテラル）、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリク酸、ネドクロミル、ケトチフェン、イプラトロピウムおよびオキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル、レフルノミド、ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデンソシンアゴニスト、抗血栓薬、補体阻害薬、アドレナリン系薬剤、ＴＮＦαまたはＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインによってシグナル伝達に干渉する薬剤（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤（例えばＶｘ７４０）、抗Ｐ７、ｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびその誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体および誘導体ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））およびｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３））および抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）から成る群から選択される、請求項３８の医薬組成物。
40. 前記ＨＣＰ減少型抗体調製物が、１つ以上の抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合部分を含み、ならびに標識される、請求項１、２５および２６の方法。
41. 前記標識が放射性である、請求項４０の方法。
42. 前記放射性標識が、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓおよび^３Ｈから成る群から選択される、請求項４１の方法。
43. 前記標識が非放射性である、請求項４０の方法。
44. 前記ＨＣＰ減少型抗体調製物が、１つ以上の抗ＩＬ−１８抗体またはこの抗原結合部分を含み、ならびにペグ化される、請求項１、２５および２６の方法。

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