本發明係關於具有對製程雜質(諸如HCP，包括PLBL2)降低之相互作用之抗體。已發現某些位置之殘基之胺基酸之修飾(例如，藉由取代、嵌入或刪除)導致某些抗體結合HCP(諸如PLBL2)之能力降低。此降低之相互作用之傾向導致製程雜質(諸如PLBL2)之下降之共純化水平，其消除對旨在清除此製程相關雜質之特定純化策略之需求。事實上，例如，PLBL2對併入此等胺基酸殘基變化之IgG4分子之結合力水平係與彼等其中未發現PLBL2共純化問題的情況一致。此進一步增大製程之效率、降低相關成本、減輕對過多產品測試之需求及最終有助於確保病患安全。除此之外，脂酶(諸如PLBL2)已經識別為降解調配賦形劑諸如聚山梨醇酯80之潛在病原體，該等賦形劑係使產品蛋白(重組抗體)在最終調配物中穩定化所必需的。降低PLBL2之結合力將有助於最小化此HCP在最終調配藥物中之可能濃度，藉此最大化該產品(重組抗體)之儲架期，其將進一步降低成本及確保安全。 IgG4之效應子功能 IgG4與IgG同型物IgG1、IgG2及IgG3在重鏈恆定區中共用超過95%序列同源性。相較於IgG1，IgG4對活化Fcγ受體：FcγRIIa及FcγRIIIa具有低結合親和力。相較於IgG1，IgG4對高親和力FcγRI具有弱至中度之結合親和力。類似於IgG1，IgG4對抑制FcγRIIb維持結合親和力。IgG4亦以與IgG1相同之方式結合至FcRn。IgG4對C1q蛋白複合體顯示無或可忽略之結合力及無法活化經典補體途徑，藉此具有降低之CDC活性。IgG4具有降低之ADCC活性或無ADCC活性。效應子結合力之此降低已導致對IgG4重鏈恆定域之選擇以用於其中效應子功能係不必要或不希望的重組抗體中。 核心IgG4鉸鏈包含序列CPSC (SEQ ID NO: 19)，而核心IgG1鉸鏈包含更不易還原之CPPC (SEQ ID NO: 20)。IgG4中之S241 (Kabat)導致更可撓之鉸鏈，其能形成鏈內環化二硫鍵及導致「半抗體」之出現，該等半抗體含有來自不同抗體之非共價連接之重鏈，通常被稱為IgG4 Fab臂交換。如在IgG1中，IgG4之核心鉸鏈藉由將S241修飾為脯胺酸(即，S241P)可穩定。 許多治療IgG4抗體具有鉸鏈改造區，包括S241P取代。IgG4‐S241P單取代在缺乏L248E變體之情況下係可能的，以保持正常之FcγRI結合。相比於IgG1，IgG4 L248E變體降低IgG4‐PE對FcγRI之結合親和力，且相較於IgG4野生型，對FcγRI具有弱約20倍之親和力。 IgG4序列修飾 本發明者們已識別IgG分子之保守區與該分子結合製程雜質(諸如HCP，包括但不限於PLBL2)之能力之間之意外關係。具體言之，本發明者們已識別IgG4子類之抗體之高度保守鉸鏈區及周圍序列中負責導致此等抗體結合至HCP(諸如PLBL2)之關鍵胺基酸殘基。當此等胺基酸殘基經修飾時，所得經修飾之IgG4分子相較於無前述修飾之親代IgG4分子顯示對HCP(諸如PLBL2)降低之結合能力，同時維持與無該(等)修飾相同之IgG4效應子功能(例如，IgG4分子之FcRn受體結合行為)。此外，經修飾之IgG4分子至少維持(或增強)無該(等)修飾之IgG4之生物物理性質，諸如穩定性、剪切行為。 因此，根據本發明之第一態樣，提供重鏈恆定區之處在Kabat殘基203與256之間的區域中之胺基酸之任何一者或組合已經修飾之變體IgG4抗體，其中該變體IgG4抗體相較於未經修飾之IgG4抗體具有對宿主細胞蛋白(HCP)降低之結合力水平。 在一項實施例中，胺基酸之任何一者或組合係在Kabat殘基203與243之間。在另一實施例中，胺基酸之任何一者或組合係在Kabat殘基222與243之間。在一替代性實施例中，胺基酸之任何一者或組合係在Kabat殘基222與256之間。 在一項實施例中，胺基酸之任何一者或組合係選自由以下組成之群：(i)在Kabat殘基226與243之間的鉸鏈區之一或更多個胺基酸；及/或(ii)Kabat殘基203；及/或(iii)Kabat殘基222。 在一項實施例中，未經修飾之IgG4抗體具有ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 21)或ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 22) (即，Kabat位置226至243)之鉸鏈區序列。 在一項實施例中，該鉸鏈區係在Kabat殘基203與256之間。在一項實施例中，該鉸鏈區係在Kabat殘基226與243之間。在另一實施例中，該鉸鏈區係在Kabat殘基226與238之間。在一替代性實施例中，該鉸鏈區係在Kabat殘基234與250之間。 在一項實施例中，該變體IgG4抗體包含序列CPPC (SEQ ID NO: 20) (Kabat殘基239或242)。此亦被稱為「核心鉸鏈」。在一替代性實施例中，該變體IgG4抗體包含序列CPSC (SEQ ID NO: 19) (Kabat殘基239或242)。 在一項實施例中，該修飾包含在Kabat殘基203與256之間的區域中之胺基酸之任何一者或組合之刪除。 在一項實施例中，該修飾包含在Kabat殘基203與256之間的區域中之一或更多個胺基酸之嵌入。 在一項實施例中，該修飾包含在Kabat殘基203與256之間的區域中之一或更多個胺基酸之取代。 存在於重鏈之鉸鏈區中或在重鏈之鉸鏈區附近之關鍵IgG4胺基酸殘基係：於位置197處之絲胺酸(S197)、於位置198處之白胺酸(L198)、於位置203處之離胺酸(K203)、於位置207處之蘇胺酸(T207)、於位置211處之天冬胺酸鹽(D211)、於位置222處之精胺酸(R222)、於位置226處之麩胺酸鹽(E226)、於位置227處之絲胺酸(S227)、於位置229處之酪胺酸(Y229)、於位置230處之甘胺酸(G230)、於位置237處之脯胺酸(P237)、於位置238處之脯胺酸(P238)、於位置246處之麩胺酸鹽(E246)、於位置247處之苯丙胺酸(F247)、於位置249處之甘胺酸(G249)、於位置250處之甘胺酸(G250)及於位置251處之脯胺酸(P251)。受關注之序列係顯示於圖8及9中。 關鍵IgG4胺基酸殘基係：於位置203處之離胺酸(K203)、於位置222處之精胺酸(R222)、於位置226處之麩胺酸鹽(E226)、於位置227處之絲胺酸(S227)、於位置229處之酪胺酸(Y229)、於位置230處之甘胺酸(G230)、於位置237處之脯胺酸(P237)及於位置238處之脯胺酸(P238)。IgG4鉸鏈區之修飾可包含在此等位置周圍作出一或更多個胺基酸取代，導致具有對HCP(諸如PLBL2)降低之結合能力之經修飾IgG4分子。 另外，IgG4鉸鏈區之修飾可包含移除於位置229處之酪胺酸(Y229)及/或於位置230處之甘胺酸(G230)，及在某些實施例中，此等消除係與於先前列舉之位置之任何一者之至少一個胺基酸取代或另一消除組合，導致相較於親代IgG4抗體具有對HCP(諸如PLBL2)降低之結合能力之變體IgG4抗體。 在另一實施例中，IgG4鉸鏈區之修飾可包含移除於位置229處之酪胺酸(Y229)及/或於位置230處之甘胺酸(G230)，與於位置237及238處之脯胺酸殘基(P237及P238)之至少一個胺基酸取代或另一消除組合，導致相較於親代IgG4抗體具有對HCP(諸如PLBL2)降低之結合能力之變體IgG4抗體。在一項實施例中，該修飾包含YGPP (SEQ ID NO: 23) (Kabat殘基229至238)經SCDKTHT (SEQ ID NO: 24)或CCVE (SEQ ID NO: 25)之置換。 在一項實施例中，該修飾包含取代成IgG1、IgG2及/或IgG3抗體生殖系序列中之相等胺基酸序列。在另一實施例中，該IgG1、IgG2及/或IgG3抗體生殖系序列係人類。此項技術中熟知IgG抗體生殖系序列。例如，在位置203與256(包含203及256)之間的IgG1生殖系序列係顯示於圖8中及作為SEQ ID NO: 8顯示。在位置203與256(包含203及256)之間的IgG2生殖系序列係顯示於圖8中及作為SEQ ID NO: 9顯示。 在一項實施例中，IgG4鉸鏈區之修飾包含用於來自替代性同型物之人類抗體之生殖系序列之相應位置處之胺基酸殘基取代下文關鍵胺基酸殘基中之一或更多者：於位置203處之離胺酸(K203)、於位置222處之精胺酸(R222)、於位置226處之麩胺酸鹽(E226)、於位置227處之絲胺酸(S227)、於位置229處之酪胺酸(Y229)、於位置230處之甘胺酸(G230)、於位置237處之脯胺酸(P237)及於位置238處之脯胺酸(P238)。替代性同型物可為IgG1、IgG2或IgG3。在作出不止一個取代的此等實施例中，該等取代無需基於僅一種替代性IgG同型物進行選擇，但可相反為來自不止一種替代性人類抗體同型物之殘基之組合。此實施例之變體IgG4可因此可預測地在此等關鍵位置中由來自IgG1生殖系序列及IgG2生殖系序列或IgG1生殖系序列及IgG3生殖系序列或IgG2生殖系序列及IgG3生殖系序列或IgG1、IgG2及IgG3生殖系序列的胺基酸殘基組成。 在其中替代性同型物之生殖系序列在對應於IgG4生殖系序列中的關鍵上述殘基之位置處不含有胺基酸之實施例中，則該此實施例之變體IgG4之該(等)位置之胺基酸殘基已自蛋白序列消除。 在一項實施例中，該修飾包含以下之任何一者或組合： (i) 包含以下之一或更多個胺基酸之取代：K203取代成R、E或Q；R222取代成T、K或Q；E226取代成L或I；S227取代成R、P、A、N或T；Y229取代成S、C、F、W或H；G230取代成C、A、N或S；P237取代成H、E、D或V；及/或P238取代成T、K或E；及/或 (ii) ESKYGPP (SEQ ID NO: 26) (Kabat殘基226至238)經EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 27)或ERKYGPP (SEQ ID NO: 28)或ERKCCVE (SEQ ID NO: 29)或ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 30)之置換；及/或 (iii) YGPP (SEQ ID NO: 23) (Kabat殘基229至238)經SCDKTHT (SEQ ID NO: 24)或CCVE (SEQ ID NO: 25)之置換。此等修飾係總結於表1中。 在一項實施例中，該變體IgG4分子之生殖系序列的位置203處的離胺酸已經麩醯胺酸(K203Q)取代。 在一項實施例中，該變體IgG4分子之生殖系序列的位置222處的精胺酸已經選自由以下組成之群之殘基取代：離胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸鹽、半胱胺酸、麩胺酸鹽、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。在另一實施例中，該變體IgG4分子之生殖系序列的位置222處的精胺酸已經選自由以下組成之群之殘基取代：離胺酸及蘇胺酸。在又另一實施例中，該變體IgG4分子之生殖系序列的位置222處的精胺酸已經蘇胺酸(R222T)取代。在又另一實施例中，該變體IgG4分子之生殖系序列的位置222處的精胺酸已經離胺酸(R222K)取代。如本文描述之實例中顯示，於此位置處之修飾顯示PLBL2結合力之最大降低。 在一項實施例中，該變體IgG4分子之生殖系序列的位置226處的麩胺酸鹽已經選自由以下組成之群之殘基取代：異白胺酸及白胺酸。例如，該取代為E226L。 在一項實施例中，該變體IgG4分子之位置227處之絲胺酸已經選自由以下組成之群之殘基取代：脯胺酸及精胺酸。例如，該取代為S227P。 在一項實施例中，該變體IgG4分子不含有在生殖系人類IgG4序列中於位置229處之酪胺酸。 在一項實施例中，該變體IgG4分子不含有在生殖系人類IgG4序列中於位置230處之甘胺酸。 在一項實施例中，該變體IgG4分子不含有在生殖系人類IgG4序列中於位置237處之脯胺酸。 在一項實施例中，該變體IgG4分子不含有在生殖系人類IgG4序列中於位置238處之脯胺酸。 在一項實施例中，該變體IgG4分子之位置229處之酪胺酸已經選自由以下組成之群之殘基取代：離胺酸、天冬醯胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、脯胺酸、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽、丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、酪胺酸、絲胺酸、色胺酸、半胱胺酸、白胺酸及苯丙胺酸。 在一項實施例中，該變體IgG4分子之位置230處之甘胺酸已經選自由以下組成之群之殘基取代：離胺酸、天冬醯胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、脯胺酸、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽、丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、酪胺酸、絲胺酸、色胺酸、半胱胺酸、白胺酸及苯丙胺酸。 在一項實施例中，該變體IgG4分子之位置237處之脯胺酸已經選自由以下組成之群之殘基取代：離胺酸、天冬醯胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、脯胺酸、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽、丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、酪胺酸、絲胺酸、色胺酸、半胱胺酸、白胺酸及苯丙胺酸。 在一項實施例中，該變體IgG4分子之位置238處之脯胺酸已經選自由以下組成之群之殘基取代：離胺酸、天冬醯胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、脯胺酸、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽、丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、酪胺酸、絲胺酸、色胺酸、半胱胺酸、白胺酸及苯丙胺酸。 在一項實施例中，該變體IgG4分子不含有於位置229處之酪胺酸、於位置230處之甘胺酸、於位置237處之脯胺酸及於位置238處之脯胺酸，而相反含有下列肽序列：SCDKTHT (SEQ ID NO: 24)。在一替代性實施例中，該變體IgG4分子不含有於位置229處之酪胺酸、於位置230處之甘胺酸、於位置237處之脯胺酸及於位置238處之脯胺酸及相反含有下列肽序列：CCVE (SEQ ID NO: 25)。例如，該變體IgG4包含Kabat 229至238 YGPP (SEQ ID NO: 23)之刪除及CCVE (SEQ ID NO: 25)之嵌入。例如，該變體IgG4包含Kabat 229至238 YGPP (SEQ ID NO: 23)經CCVE (SEQ ID NO: 25)之置換。本文描述之實例，於此等位置處之修飾顯示PLBL2結合力之最大降低。 在一項實施例中，該變體IgG4分子之位置247處之苯丙胺酸已經白胺酸取代。 在一項實施例中，該修飾包含EFLGGP (SEQ ID NO: 31) (Kabat殘基246至251)經PAAAS (SEQ ID NO: 32)或PAAAP (SEQ ID NO:33)之置換。 可對IgG4抗體作出於特定Kabat殘基處之可能胺基酸修飾(例如，取代及/或嵌入及/或刪除)之實例(其等總結於表1中)以產生具有對HCP(諸如PLBL2)降低之結合能力之IgG4抗體。此等修飾可於胺基酸之任何一者或更多者(即，組合)處作出。 表1：IgG4重鏈內之胺基酸修飾之實例
在一項實施例中，該變體IgG4抗體係人類或人類化。在另一實施例中，取代成IgG1、IgG2及/或IgG3抗體生殖系序列中之相等胺基酸序列涉及人類抗體生殖系序列。 在一項實施例中，該修飾係對變體IgG4分子之兩個重鏈作出。在一替代性實施例中，該修飾係對該變體IgG4分子之重鏈之僅一者作出。 在一項實施例中，相較於未經修飾之IgG4抗體，未在重鏈恆定區中作出其他修飾。 在一項實施例中，未對IgG4效應子功能所需之胺基酸殘基作出修飾。例如，野生型IgG4 F247 (Kabat) (EU F234)對減弱之ADCC及CDC活性而言係重要的。此外，經修飾之E248 (Kabat)可衰減效應子功能，具體言之降低對FcγRI之結合力。 在一項實施例中，該變體IgG4抗體包含S241取代成P及/或L248取代成E之另一取代。在一項實施例中，該變體IgG4抗體包含S241取代成P之另一取代。此修飾有助於改善IgG4分子之穩定性。在一項實施例中，該變體IgG4抗體包含EFLGGP序列(SEQ ID NO: 31) (Kabat殘基246至251)經序列PAAAP (SEQ ID NO: 33)之另一取代。 根據本發明之另一態樣，提供編碼如本文定義之變體IgG4抗體之核酸構築體。 該核酸構築體可轉染至宿主細胞系內。因此，根據本發明之另一態樣，提供編碼如本文定義之變體IgG4抗體之細胞系。 其他序列修飾 根據本發明之另一態樣，提供在重鏈恆定區之處在Kabat殘基203與256之間的區域中之胺基酸之任何一者或組合已經修飾之變體IgG抗體，其中該變體IgG抗體相較於未經修飾之IgG抗體具有對宿主細胞蛋白(HCP)降低之結合力水平。例如，該變體IgG抗體已於重鏈恆定區之處在Kabat殘基203與256之間之1至25個胺基酸經修飾。例如，該變體IgG抗體已於重鏈恆定區之處在Kabat殘基203與256之間之一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、二十一、二十二或二十三個胺基酸經修飾。例如，該變體IgG抗體已於在重鏈恆定區之處在Kabat位置197、198、203、207、211、222、226、227、229、230、232、233、234、235、236、237、238、246、247、248、249、250或251之任何一者或組合經修飾。例如，該變體IgG抗體已於重鏈恆定區之處在Kabat位置203、222、226、227、229、230、232、233、234、235、236、237、238、247、248或251之任何一者或組合經修飾。 宿主細胞蛋白 宿主細胞蛋白或「HCP」係指與受關注之蛋白質(即，重組蛋白/變體IgG4)無關之蛋白質，其等由宿主細胞在細胞培養或發酵期間產生，其等包括細胞內及/或分泌之蛋白質。宿主細胞蛋白之實例係蛋白酶，其若在純化期間及之後仍存在則可對受關注之蛋白質造成損害。例如，若蛋白酶仍留於包含受關注之蛋白質之樣品中，則其可產生起初不存在之與產品相關聯之物質或雜質。蛋白酶之存在可使受關注之蛋白質在純化過程期間及/或最終調配中經時衰減。 在一項實施例中，宿主細胞蛋白係產生/衍生自哺乳動物細胞或細菌細胞。在另一實施例中，該哺乳動物細胞係選自人類或嚙齒動物(諸如倉鼠或小鼠)細胞。 在某些實施例中，用以表現抗體之宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、K562細胞、BHK細胞、PER.C6細胞及HEK細胞(即，該等宿主細胞蛋白係衍生自此等宿主細胞)。或者，該宿主細胞可為選自由以下組成之群之細菌細胞：大腸桿菌(例如，W3110、BL21)、枯草芽孢桿菌(
B. subtilis
)及/或其他合適之細菌；真核細胞(諸如真菌或酵母細胞)(例如，畢赤酵母(
Pichia pastoris
)、麴菌屬(
Aspergillus sp.
)、釀酒酵母(
Saccharomyces cerevisiae
)、粟酒裂殖酵母(
Schizosaccharomyces pombe
)、紅麵包黴(
Neurospora crassa
))。例如，該宿主細胞係CHO細胞。或者，該宿主細胞係HEK細胞。 在一項實施例中，宿主細胞蛋白係推定磷脂酶B樣2 (PLBL2)。PLBL2亦被稱為含磷脂酶B域蛋白2(PLBD2)。 降低IgG4分子對HCP(諸如PLBL2)之結合力導致此等過程相關之雜質及產品IgG4之共純化水平同時降低。此進一步消除對特定純化策略(諸如在填充床管柱層析術期間之嚴苛清洗條件)之需求以自藥物產品清除HCP。如此可增強製程之效用、減少相關成本及減輕對使用潛在定製免疫分析之過多產品測試之需求。最後，此等修飾有助於潛在減輕HCP(諸如PLBL2)存在於最終藥物產品中之風險及因此最小化其等在病患中引起免疫反應之可能性。 此等經修飾之IgG4分子對HCP(諸如PLBL2)降低之結合能力可基於實例中提供之方法進行定量。 存在其中可量測對宿主細胞蛋白降低之結合能力之數種方法。例如，降低之結合力水平可在宿主細胞蛋白一經純化(例如由親和層析術)後，藉由簡單量測存在於含該抗體之溶液中之宿主細胞蛋白之量進行評估(相較於未經修飾之IgG4降低之量指示降低之宿主細胞蛋白結合力)。在一項實施例中，該IgG4抗體相較於未經修飾之IgG4抗體具有對宿主細胞蛋白降低之結合親和力及/或活性。 在一項實施例中，變體IgG4抗體相較於未經修飾之IgG4抗體具有至少10%之結合活性降低，諸如至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%之結合活性降低。 在一項實施例中，變體IgG4抗體相較於未經修飾之IgG4抗體具有至少10倍之結合親和力降低，諸如至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%之結合親和力降低。 包含抗體變體之組合物 根據本發明之另一態樣，提供包含如本文定義之變體IgG4抗體之組合物。 本發明之組合物可根據習知技術以醫藥上可接受之載劑或稀釋劑及任何其他已知的佐劑及賦形劑調配。該等醫藥上可接受之載劑或稀釋劑及任何其他已知的佐劑及賦形劑應適用於本發明之所選化合物及所選投與模式。 在一項實施例中，變體IgG4係在至少10 mg/mL，例如至少20 mg/mL、25 mg/mL、30 mg/mL、35 mg/mL、40 mg/mL、45 mg/mL、50 mg/mL、55 mg/mL、60 mg/mL、65 mg/mL、70 mg/mL、75 mg/mL、80 mg/mL、85 mg/mL、90 mg/mL或95 mg/mL或100 mg/mL之濃度下。 本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量水平可改變以便於獲得針對特定病患、組合物及投與模式有效達成所需治療反應而對該病患無毒之活性成分之量。所選劑量水平將取決於各種藥物動力學因素，其等包括採用之本發明之特定組合物之活性、投與途徑、投與時間、治療之持續時間、與採用之特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、治療中之病患之年齡、性別、體重、病情、一般健康及先前病史及醫學領域中熟知的類似因素。具有此領域中之一般技術之醫師或獸醫可容易判定及規定所需醫藥組合物之有效量。 在一項實施例中，組合物中推定磷脂酶B樣2 (PLBL2)之濃度係小於500 ppm，例如，小於400 ppm、300 ppm、200 ppm、100 ppm、90 ppm、80 ppm、70 ppm、60 ppm、50 ppm、40 ppm、30 ppm、20 ppm或10 ppm。 在一項實施例中，組合物中推定磷脂酶B樣2 (PLBL2)之濃度係小於約200 ng PLBL2/mg產品(即，ng/mg)；小於約150 ng/mg；小於約100 ng/mg；或小於約50 ng/mg。 在一項實施例中，組合物額外包含緩衝劑及/或脂肪酸酯。在另一實施例中，該脂肪酸酯係聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。 如上文提及，PLBL2已經識別為降解調配賦形劑(諸如聚山梨醇酯)之潛在病原體，其等使產品蛋白在最終調配物中穩定化而言係必需的。因此，降低PLBL2之結合力將進一步最小化最終調配藥物中之PLBL2之濃度，藉此最大化該產品之儲架期。因此，根據本發明之另一態樣，提供包含如本文定義之變體IgG4抗體之具有延長/改善之儲架期之組合物。 此外，根據本發明之另一態樣，提供延長抗體組合物之儲架期之方法，其包括藉由修飾抗體序列之重鏈恆定區中之處在Kabat殘基203與256之間的區域中之胺基酸之任何一者或組合以產生具有對PLBL2降低之結合力之IgG4抗體。 抗體變體之用途 根據本發明之另一態樣，提供如本文定義用於治療之變體IgG4抗體。熟習此項技術者將瞭解本發明可應用至針對不同標靶之各種IgG4抗體，因此該等IgG4變體可用以治療一定範圍之疾病。 本文描述之抗體亦可用於治療之方法中。治療可為治療、預防或防止性的。治療包含疾病之至少一個態樣或症狀之減輕、減少或防止及包含本文描述之疾病之防止或治癒。 本文描述之抗體可以有效量用於治療、預防或防止性治療。本文描述之抗體之治療有效量係有效減輕或減少疾病之一或更多種症狀或有效防止或治癒該疾病之量。 製備抗體變體之方法 本文提供抗體變體及用以產生該等抗體變體之方法，該等抗體變體已經由胺基酸序列變化進行修飾以降低製程雜質結合力之水平。此等修飾具有減少存在於所得醫學產品中之製程雜質之量的有利作用。 因此，根據本發明之另一態樣，提供修飾IgG抗體以降低對製程雜質之結合力之方法，該方法包括以下步驟： a)識別涉及製程雜質之結合之至少一個胺基酸；及 b)藉由以不同胺基酸取代經識別涉及結合製程雜質之胺基酸來產生該IgG抗體之變體。 根據本發明之另一態樣，提供用於產生相較於未經修飾之IgG抗體具有對製程雜質降低之結合力之IgG抗體之變體的方法，該方法包括以下步驟： a)識別涉及製程雜質之結合之至少一個胺基酸；及 b)藉由以不同胺基酸取代經識別涉及結合製程雜質之胺基酸來產生該IgG抗體之變體。 在一項實施例中，涉及製程雜質之結合之胺基酸係通過使用可用以研究蛋白質-蛋白質相互作用之方法或方法之組合進行識別。在一項實施例中，用於研究蛋白質-蛋白質相互作用之方法係選自由以下組成之群：氫氘交換質譜(HDX-MS)、結晶學、酵母2-雜交篩選、矽中3D結構建模或其任何組合。此等實施例可能需要組合許多此等方法之輸出，及可通過施用適當之科學推理胺基酸或涉及製程雜質之結合之胺基酸之同一性進行推導。 在一項實施例中，經識別涉及製程雜質之結合之胺基酸係存在於恆定區中。在另一實施例中，經識別涉及製程雜質之結合之胺基酸係存在於重鏈恆定區中。 恆定區中由蛋白質-蛋白質相互作用方法(例如，HDX-MS)測定之確實與製程雜質相互作用之IgG同型物相對於不與製程雜質相互作用之同型物的序列比對容許識別涉及製程雜質之結合之胺基酸。保守生殖系至生殖系取代，自不與製程雜質結合之IgG同型物變為與製程雜質結合之IgG，將然後容許產生不結合至該製程雜質之變體。因此，在一項實施例中，經識別涉及結合製程雜質之胺基酸係經來自替代性IgG抗體生殖系序列之相等胺基酸取代。 在一項實施例中，經識別涉及結合製程雜質之胺基酸係通過抗體序列之保守區中保守、相同物種、免疫球蛋白生殖系-至-生殖系胺基酸變化而經修飾。 因此，本文提供產生具有對宿主細胞蛋白(HCP)降低之結合力之IgG4抗體之方法，該方法包括修飾抗體序列之重鏈恆定區中之處在Kabat殘基203與256之間的區域中之胺基酸之任何一者或組合。在一項實例中，該宿主細胞蛋白係推定磷脂酶B樣2 (PLBL2)。該方法可額外包括使用親和層析技術純化IgG4抗體。該方法可額外包括使用至少一種其他正交層析技術進一步純化IgG4抗體。在一項實例中，該正交層析技術係離子交換層析術。 本發明因此提供抗體變體，其係藉由定點突變產生，而不是藉由更經典之層析術方法純化，以降低相關製程雜質之濃度。根據本發明之另一態樣，提供藉由本文定義之方法獲得之IgG抗體。 在一項實施例中，該IgG抗體係IgG4抗體。因此，在此實施例中，經識別涉及結合製程雜質之胺基酸係經來自IgG1、IgG2及/或IgG3抗體生殖系序列之相等胺基酸取代。 製備IgG4抗體變體之方法 根據本發明之另一態樣，提供產生具有對宿主細胞蛋白(HCP)降低之結合力之IgG4抗體之方法，該方法包括修飾抗體序列之重鏈恆定區中之處在Kabat殘基203與256之間的區域中之胺基酸之任何一者或組合。 熟習此項技術者熟知產生抗體之方法。例如，該方法可包括製備經針對該IgG4抗體編碼之重組多核苷酸轉形或轉染之重組宿主細胞之懸浮培養物；及在允許該IgG4抗體之表現之條件下培養該宿主細胞培養物。該方法可額外包括使用親和層析技術純化IgG4抗體。該方法可額外包括使用至少一種其他正交層析技術進一步純化IgG4抗體。在一項實例中，該正交層析技術係離子交換層析術。 在一項實施例中，該方法額外包括(例如)使用親和層析技術純化IgG4抗體(例如，在培養後)。在另一實施例中，該親和層析技術係超抗原親和層析術。在一項實施例中，該超抗原係選自蛋白A、蛋白G及蛋白L。因此，在另一實施例中，該超抗原親和層析術係選自蛋白A親和層析術、蛋白G親和層析術及蛋白L親和層析術。 在一項實施例中，該方法額外包括使用至少一種其他層析技術(諸如離子交換層析術)進一步純化IgG4抗體。在一項實施例中，該等一或更多個其他層析步驟係選自由以下組成之群：陰離子交換層析術、陽離子交換層析術及混合模式層析術，特定言之陰離子交換層析術。在一項實施例中，該至少一種其他層析技術不包括疏水相互作用層析術。 該方法亦可包括過濾步驟，諸如深度過濾(用於移除細胞及細胞碎片)及奈米過濾(用於移除病毒)。該純化步驟亦可包括針對使用哺乳動物表現系統產生之材料之任何病毒失活步驟。 根據本發明之另一態樣，提供產生如本文定義之變體IgG4抗體之方法，該方法包括在宿主細胞中表現編碼該抗體之核酸構築體及視需要純化該抗體。 根據本發明之另一態樣，提供藉由本文定義之方法獲得之IgG4抗體。 定義 除非本文另有定義，否則本文使用之所有技術及科學術語具有與一般技術(例如，在細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術、蛋白質純化及生物化學)者通常瞭解之相同含義。標準技術係用於分子、基因及生物化學方法及化學方法。 如本文使用，術語「抗體」係指所有免疫球蛋白或IgG (諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、IgA、IgD或IgE抗體，無論其等衍生自天然產生抗體之任何物種，或由重組DNA技術產生；無論其等分離自血清、B細胞、雜交瘤、轉染瘤、酵母或細菌。該抗體可為單株、重組、多株、嵌合(例如，來自不同之來源(例如，人類/小鼠嵌合抗體)或不同抗體類型(例如，IgG2/4抗體))、人類、人類化、多特異性(包括雙特異性)或異質共軛抗體。該術語亦包括單一可變域(例如，VH、VHH、VL)、域抗體(dAb®)、抗原結合片段、免疫有效片段、Fab、F(ab’)2、Fv、二硫鍵連接之Fv、單鏈Fv、密閉構象多特異性抗體、二硫鍵連接之scFv、雙功能抗體、TANDABS™等。在一項實施例中，該抗體係IgG4。在另一實施例中，該抗體係重組IgG4。在另一實施例中，該抗體係變體IgG4。在另一實施例中，該抗體係重組變體IgG4。 如本文使用，術語「CDR」係定義為抗體之互補決定區胺基酸序列，其等係免疫球蛋白重鏈及輕鏈之高度可變區。在免疫球蛋白之30個可變部分中存在三個重鏈及三個輕鏈CDR (或CDR區)。因此，如本文使用之「CDR」係指所有三個重鏈CDR或所有三個輕鏈CDR (或視需要，所有重鏈及所有輕鏈CDR兩者)。抗體之結構及蛋白折疊可意謂認為其他殘基係抗原結合區之一部分及熟習此項技術者將瞭解此點。 如本文使用，術語「域」係指經折疊之蛋白結構，其具有無關該蛋白質之剩餘部分之三級結構。通常，域負責蛋白質之離散功能性質及在許多情況下可添加、移除或轉移至其他蛋白質而不損失該蛋白質及/或該域之剩餘部分之功能。 抗體係蛋白產品，即，受關注之蛋白質。例如，該蛋白產品係變體IgG4。例如，該蛋白產品係重組IgG4。例如，該蛋白產品係重組變體IgG4。 如本文使用，術語「鉸鏈區」及/或「鉸鏈序列」係指通常被稱為抗體之鉸鏈區者，即IgG分子之覆蓋分子蛋白序列之位置226至243(包括226及243)(其中該胺基酸編號係根據Kabat編號)或位置216至230(包括216及230)(根據EU編號)處之胺基酸之域。此等區亦可被稱為「遺傳鉸鏈」。除此之外，如本文使用之術語「鉸鏈區」及「鉸鏈序列」亦可認為包括於分子蛋白序列之位置203至223(包括203及223)(其中該胺基酸編號係根據Kabat編號)或根據EU編號之位置196至215(包括196及215)處之胺基酸。此外，如本文使用之術語「鉸鏈區」及「鉸鏈序列」可認為包括於分子蛋白序列之位置244至256(包括244及256)(其中該胺基酸編號係根據Kabat編號)或根據EU編號之位置231至243(包括231及243)處之胺基酸。 或者，基於在H/L鏈二硫鍵之後的殘基處開始及在Fc域之前的殘基處結束之鉸鏈，「結構鉸鏈」已被識別為Kabat位置234至250 (或EU位置221至237)。 該鉸鏈可在結構上分為上鉸鏈(Kabat位置234至238；或EU位置221至225)，其係Fab域之末端至由一個螺旋轉彎形成之第一內重二硫鍵；及自最後二硫鍵至該Fc域之開始之下鉸鏈(Kabat位置243至250或EU位置230至237)。中間或核心鉸鏈係人類IgG1中之「CPPC」 (SEQ ID NO: 20)模體(Kabat位置239至242或EU位置226至229)，其包含由二硫鍵連接之兩個平行聚脯胺酸雙螺旋。 應注意此領域中大多數編號係基於人類IgG1及因插入缺失將在特定鉸鏈序列中變化。例如，針對IgG4靠近核心鉸鏈之「YGPP」 (SEQ ID NO: 23)模體係等於IgG1中之「SCDKTHT」 (SEQ ID NO: 24)模體，因此IgG4之「YGPP」 (SEQ ID NO: 23)分別係位置229、230、237及238，而非僅位置229至232。 如本文使用，在描述抗體分子之內文中，術語「鉸鏈經修飾」係指其中在蛋白序列之位置203至256(包括203及256)之間的胺基酸殘基相較於未經修飾及/或親代抗體之序列已經變化之任何抗體。此等變化可涉及以殘基取代替代性胺基酸或以整個肽序列取代替代性序列。變化亦可涉及自該蛋白質消除胺基酸或肽序列。 如本文使用，術語「未經修飾」係指在降低對製程雜質之結合力之修飾前的抗體。此可包括呈天然、生殖系形式之抗體。其亦可包括已經修飾以改善除降低宿主細胞蛋白結合力外之性質(諸如於Kabat殘基239至242處之取代S241P (即，導致序列CPPC [SEQ ID NO: 20]))之抗體，S241P係用於許多IgG4抗體中以改善穩定性。因此，在一項實施例中，未經修飾之抗體包含取代S241P。其亦可包括已經取代L248E修飾之抗體，L248E係用於許多IgG4抗體中以改善效應子功能。因此，在一項實施例中，該未經修飾之抗體包含取代L248E。 本文使用術語「經修飾」描述重鏈恆定區之Kabat殘基203與256之間的區域中之胺基酸之一者或組合之取代及/或刪除及/或嵌入中之任何一者或組合。例如，該修飾可包含一或更多個胺基酸取代及/或一或更多個胺基酸嵌入及/或一或更多個胺基酸刪除。本文使用之術語「刪除」、「移除」、「置換」、「消除」可互換使用。 例如，變體IgG抗體之重鏈恆定區之處在Kabat殘基203與256之間之1至25個胺基酸已經修飾。例如，該變體IgG抗體之重鏈恆定區之處在Kabat殘基203與256之間之一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、二十一、二十二或二十三個胺基酸已經修飾。例如，該變體IgG抗體之重鏈恆定區之Kabat位置197、198、203、207、211、222、226、227、229、230、232、233、234、235、236、237、238、246、247、248、249、250或251之任何一者或組合已經修飾。例如，該變體IgG抗體之重鏈恆定區之Kabat位置203、222、226、227、229、230、232、233、234、235、236、237、238、247、248或251之任何一者或組合已經修飾。 如本文使用，術語「宿主細胞」係指任何生物體(原核及真核兩者)，其等可經基因改造以表現無法由未經基因改造之生物體表現之多肽。在某些實施例中，該宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、COS細胞、K562細胞、BHK細胞、PER C6細胞及HEK細胞。該宿主細胞可為選自由以下組成之群之細菌細胞：大腸桿菌(例如，W3110、BL21)、枯草芽孢桿菌及/或其他合適之真核細胞(諸如真菌或酵母細胞(例如，畢赤酵母(
Pichia pastoris
)、麴菌屬(
Aspergillus sp.
)、釀酒酵母(
Saccharomyces cerevisiae
)、粟酒裂殖酵母(
Schizosaccharomyces pombe
)、紅麵包黴(
Neurospora crassa
)))。 如本文使用，術語「宿主細胞蛋白」及縮寫「HCP」可互換使用及係指除宿主細胞已經改造以表現之免疫球蛋白(即，受關注之蛋白質)外之由宿主細胞表現之任何多肽。 如本文使用，術語「製程雜質」可遵循人用(ICH)藥物(例如，ICH Q6B)註冊技術要求國際協調委員會指南定義，及被認為係指作為其中產生受關注之蛋白質之方法之結果存在之雜質。因此，此定義包含源自製程之雜質，即，細胞受質(例如，宿主細胞蛋白、宿主細胞DNA/RNA)、細胞培養物(例如，誘導物、抗生素或介質組分)或源自其下游處理之雜質。術語「製程雜質」不包括與產品相關聯之雜質(例如，抗體聚集物及/或片段)。 本文識別之所有「胺基酸」殘基可呈天然L構形。與標準多肽系統命名法一致，用於胺基酸殘基之縮寫係顯示於表2中： 表2：胺基酸縮寫
本文由從左至右為胺基端至羧基端之習知方向之規則詳細說明所有胺基酸序列。 如本文使用，如內文中使用以描述抗體之胺基酸序列之術語「生殖系」描述通過(例如)免疫攜載人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠或藉由篩選人類免疫球蛋白基因庫自使用人類免疫球蛋白序列的系統獲得之任何抗體之胺基酸序列，及其中所選人類抗體之胺基酸序列係與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列具有至少90%一致性。 如本文使用，當提及「保守生殖系至生殖系胺基酸變化」時，此係定義為對抗體之保守變化，其中抗體之初始生殖系序列之至少一個胺基酸係經修飾為衍生自相同物種之另一抗體生殖系序列之經比對相等位置胺基酸之不同胺基酸序列。 如本文使用，在描述抗體之內文中之術語「親代」或「親代之」係指由天然生成之生殖系人類免疫球蛋白之胺基酸序列組成之任何免疫球蛋白。在描述IgG4子類之抗體之內文中之術語「親代」或「親代之」係指以下之任何免疫球蛋白：在人類IgG4分子之重鏈及輕鏈兩者之保守恆定區含有天然生成之人類生殖系胺基酸序列，而在包括互補決定區之可變域中包含任何胺基酸序列，且其中該鉸鏈區含有胺基酸序列：半胱胺酸-脯胺酸-脯胺酸-半胱胺酸或半胱胺酸-脯胺酸-絲胺酸-半胱胺酸。 如本文使用，術語「經修飾之IgG4」或「變體IgG4」或「重組IgG4」可互換使用且係指包含與「親代」 IgG4抗體相同之胺基酸序列，但一或更多個胺基酸有所差異之任何IgG4抗體。在某些實施例中，此等差異可構成表1中詳細描述或如本文描述之修飾中之至少一者。 如本文使用，在抗體結合至宿主細胞蛋白(HCP)(諸如PLBL2)之內文中之術語「結合力」係指該抗體與該宿主細胞蛋白(HCP)之間的特異性及/或非特異性、可逆及不可逆相互作用兩者。本文中「結合力水平」、「結合能力」、「相互作用之傾向」、「相互作用」可互換使用。抗體與HCP之間的此等結合相互作用可由熟習此項技術者定量測定。例如，抗-PLBL2西方墨點轉漬法可如實例2中進行。 此等結合相互作用亦可藉由(例如)使用表面電漿子共振(SPR)技術於BIAcore™ 3000或BIAcore™ T200儀器中使用抗體作為配體及宿主細胞蛋白作為分析物進行定量測定。 如本文使用，術語「親和力」係指一個分子(例如，本發明之抗體)對HCP(諸如PLBL2)之結合強度。抗體對其標靶或污染物(諸如HCP)之結合親和力可藉由平衡方法進行測定。用以定量結合親和力之方法包括生物層干涉術(BLI)，例如，與Octet® RED 384儀器(參見實例6)組合。其他方法包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA))或動力學(例如，BIACORE
TM
分析)。 如本文使用，在抗體結合至宿主細胞蛋白(諸如PLBL2)之內文中之術語「活性」係指結合至抗體之HCP之量。例如，結合至PLBL2之抗體之數量。定量結合活性之方法包括：酶聯免疫吸附分析(ELISA)用以測定結合至抗體之HCP之數量(例如，PLBL2 ng/mg)，參見實例3；於BIAcore™ 3000或BIAcore™ T200儀器中之表面電漿子共振(SPR)技術用以測定結合至抗體之HCP之數量(例如，PLBL2結合(RU))，參見實例4。 如本文使用，用於描述一種抗體對宿主細胞蛋白之結合力相較於另一抗體對相同宿主細胞蛋白之結合力之變化之內文中之術語「降低之」係指兩種抗體對該宿主細胞蛋白之結合力之相對差異。親和力或活性之差異可藉由(例如)使用表面電漿子共振(SPR)技術於BIAcore™ 3000或BIAcore™ T200儀器中使用抗體作為配體及宿主細胞蛋白作為分析物定量地測定，在該情況下，若存在大於10%之結合活性降低及/或大於10倍之結合親和力降低，則一種抗體定義為相較於另一者具有「降低之」結合力水平。因此，在一項實施例中，相較於未經修飾之抗體，該變體抗體具有至少10%之結合活性降低及/或至少10倍之結合親和力降低。 如本文使用，在描述組分(諸如PLBL2)之濃度或量之內文中之術語「百萬分率」或「ppm」係指該組分相對於產品(諸如IgG4抗體)之濃度之濃度。「ppm」值基本上係組分與抗體產品之間的莫耳比率及可(例如)藉由使該組分之濃度(以ng/mL進行量測)除以該抗體之濃度(以mg/mL進行量測)進行計算。此計算之結果係然後每百萬份該抗體產品之該組分之份數。或者，經偵測之HCP可由「ppb」(「每十億分率」)量測，其係等於pg/mg。 如本文使用，「親和層析術」係利用生物分子之間的特異性、可逆相互作用而非生物分子之一般性質(諸如等電位點、疏水性或尺寸)以影響層析分離之層析方法。 「超抗原」係指與免疫球蛋白超家族之成員在不同於此等蛋白質之靶配體-結合位點之位點處相互作用之一般配體(generic ligand)。葡萄球菌腸毒素係與T細胞受體相互作用之超抗原之實例。結合抗體之超抗原包括(但不限於)結合IgG恆定區之蛋白G；結合IgG恆定區及VH域之蛋白A；及結合VL域之蛋白L。因此，在一項實施例中，該超抗原係選自由以下組成之群：蛋白A、蛋白G及蛋白L。 當本文中使用時，術語「蛋白A」包含回收自其天然來源(例如，金黃色釀膿葡萄球菌之細胞壁)之蛋白A、合成(例如，藉由肽合成或藉由重組技術)產生之蛋白A及其變體(其等保留結合具有C
H
2/C
H
3區之蛋白質之能力)。 「蛋白A親和層析術」或「蛋白A層析術」係指利用蛋白A之IgG結合域對免疫球蛋白分子之Fc部分之親和力之特異性親和層析方法。此Fc部分包含人類或動物免疫球蛋白恆定域C
H
2及C
H
3或大體上類似於此等之免疫球蛋白域。在實務中，蛋白A層析術涉及使用經固定化至固體載體之蛋白A。蛋白G及蛋白L亦可用於親和層析術。該固體載體係其上黏附蛋白A之非水性基材(例如，管柱、樹脂、基材、珠、凝膠等)。此等載體包括瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、玻璃、二氧化矽、聚苯乙烯、膠棉炭、沙、聚甲基丙烯酸酯、交聯之聚(苯乙烯-二乙烯基苯)及具有葡聚糖表面延伸劑之瓊脂糖及任何其他合適之材料。此等材料係此項技術中熟知。任何合適之方法可用以將超抗原黏附至固體載體。用於將蛋白質黏附至合適之固體載體之方法係此項技術中熟知。有無固定化蛋白A或蛋白L之此等固體載體易於獲得自許多商業來源，包括諸如Vector Laboratory (Burlingame, Calif.)、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Calif.)、BioRad (Hercules, Calif.)、Amersham Biosciences (GE Healthcare, Uppsala, Sweden之一部分)及Millipore (Billerica, Mass.)。 術語「緩衝劑」意謂穩定溶液之pH之緩衝溶液或緩衝劑。緩衝劑通常包含弱酸及其共軛鹼或弱鹼及其共軛酸。在最佳pH下或接近最佳pH之蛋白溶液之緩衝有助於確保適當之蛋白折疊及功能。 術語「脂肪酸酯」意謂含有經由酯鍵連接至首基之脂肪酸鏈之任何有機化合物。酯鍵係在羥基(例如，醇或羧酸)經烷氧基置換時形成。脂肪酸酯之實例通常包括磷脂、脂質(例如，首基係甘油，包括單甘油酯、雙甘油酯及三甘油酯)及表面活性劑與乳化劑，包括(例如)諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯60及聚山梨醇酯80之聚山梨醇酯，其等係非離子清潔劑。表面活性劑及乳化劑係適用於作為共溶劑及穩定劑使用，且可添加至蛋白調配物以增強針對機械應力(諸如空氣/液體界面及固體/液體界面剪切)之蛋白穩定性。 本發明現將相對於下列非限制性實例進行描述。 實例 實例1：最終散裝mAb之HCP ELISA稀釋線性度 先前研究已顯示，宿主細胞蛋白(HCP)磷脂酶B樣2 (PLBL2)可存在於已使用哺乳動物細胞宿主所形成之抗體樣品中。此外，當藉由ELISA定量樣品中總HCP濃度時，PLBL2之存在可引起可見稀釋非線性度。為嘗試識別最終原料藥中可能含有PLBL2之mAb產品，進行HCP ELISA以評估該等樣品之稀釋線性度。專有ELISA係經內部研究以定量CHO衍生之產品樣品中免疫原性HCP之總量。此HCP ELISA使用定製山羊抗-CHO HCP多株抗體及內部產生之HCP參考標準，在GSK用於跨CHO衍生之產品之多產品用途，及已用作用於監測跨多種生物醫藥mAb產品之純化過程樣品之HCP之清除之平臺方法。此分析具有2.0 ng/mL之靈敏度。針對處理中及最終原料藥樣品之中間精度的範圍在5.7至14.9% CV而重複性的範圍在3.5至8.8% CV。 藉由ELISA分析各樣品之最少四份稀釋液。各稀釋液之經調整之HCP值係藉由將經量測之HCP濃度乘以稀釋因子，及然後除以產品濃度進行計算。各樣品稀釋液之經調整之HCP值係以雙對數尺度繪製為稀釋因子之函數。各樣品之稀釋坡度係使用下列雙對數方程計算： Log (經調整之HCP) = A + B * Log (稀釋因子) 其中A係y-截距及B係斜率。隨稀釋增加而增加之經調整之HCP值指示稀釋非線性度，且可表明PLBL2之存在。 分析不同亞型之人類化IgG產品，包括IgG1、IgG2、IgG4及IgG2/IgG4嵌合體。該IgG2/IgG4嵌合體係具有人類IgG4生殖系序列之抗體，即使鉸鏈區與人類IgG2之鉸鏈區交換。如藉由隨稀釋因子增加而之增加之經調整之HCP值測定，結果證實稀釋非線性度係僅針對mAb7 (IgG4分子(圖1))可見。下表3含有在HCP ELISA中針對各此等mAb產品獲得之稀釋斜率值。 表3：在HCP ELISA中針對不同之mAb產品獲得之稀釋斜率值。
此等結果表明mAb7最終原料藥中存在HCP，其過量且飽含用於ELISA中之抗-CHO HCP偵測抗體。為證實該HCP是否為PLBL2，需進行另一實驗。 實例2：不同mAb之抗-PLBL2西方墨點轉漬法 實例1證實mAb7在HCP ELISA中顯示稀釋非線性度。為判定PLBL2是否可能造成稀釋非線性度，對先前藉由ELISA(實例1)分析之相同人類化IgG產品進行抗-PLBL2西方墨點轉漬法。 含有100 µg之mAb產品之樣品用2x樣品緩衝劑(Novex)1:1稀釋，及然後裝載於4至20%梯度凝膠(Novex)內。SDS-PAGE係在每個凝膠24 mA的恆定電流下進行30分鐘，接著在每個凝膠36 mA下進行50分鐘。電泳後，固定該等凝膠及用SYPRO® Ruby (Thermo Fisher Scientific)染色蛋白質。將經Sypro® RUBY染色之凝膠於FLA-3000螢光影像分析儀(Fujifilm Corp.)上成像。該Sypro® RUBY影像(圖2A)證實各產品以相等裝載量裝載於該凝膠上。 西方墨點轉漬法係藉由使用XCell II™ Blot Module (Novex)將凝膠轉移至PVDF膜(Bio-Rad)，在25 V之恆定電壓下運行105分鐘進行。轉移後，該等膜用經TBST (Sigma) 1:10稀釋之螢光阻斷緩衝劑(Rockland Immunochemicals)阻斷整夜。阻斷後，該等膜用TBST清洗及用1 µg/mL的抗-PLBD2多株抗體(Abcam, ab138334)在室溫下培養兩小時。培養後，該等膜用TBST清洗三次，歷時10分鐘。該等膜然後用1 µg/mL的小鼠抗-兔cy3結合物(Jackson Immunoresearch)在室溫下培養一小時。培養後，該等膜用TBST清洗三次，歷時10分鐘。清洗後，讓該等膜乾燥30分鐘。使乾膜於FLA-3000螢光影像分析儀上成像。此西方墨點轉漬法具有20 ng之PLBL2之偵測下限。該西方墨點轉漬法影像(圖2B)證實PLBL2係在最終原料藥中針對mAb7而非任何一個其他IgG產品偵測到。此結果支持實例1中描述，針對mAb7可見之PLBL2負責稀釋非線性度之論點，且應進行另一分析以定量樣品中存在之PLBL2之量。 實例3：定量mAb樣品中之PLBL2 鑒於在mAb7中偵測到PLBL2，研發ELISA以精確定量樣品中PLBL2之濃度。此ELISA係經內部研發及使用重組倉鼠PLBL2作為參考標準，及定製內部產生之多株抗-PLBL2抗體用於偵測。此分析具有2.0 ng/m之靈敏度。針對樣品之中間精度係3.23% CV。 使用PLBL2 ELISA以定量針在對先前已研究之四種不同mAb產品進行之整個純化過程中獲取之樣品中之PLBL2濃度。該等PLBL2濃度係在獲取後、後續之第一層析步驟(步驟1)及最終原料藥(最後)後測定且可見於下表4中。 表4：在mAb純化樣品中由PLBL2 ELISA定量之PLBL2濃度。
表4中發現之結果證實大量PLBL2仍留在最終原料藥mAb7中而非其他經測試之mAb產品中。有趣地，收獲材料中之PLBL2之僅52%係在針對mAb7的第一層析純化步驟期間移除，而在此步驟期間99.92%係移除自mAb1。鑒於兩種產品針對純化使用相同樹脂，因此很可能PLBL2係與mAb分子而非層析樹脂直接相互作用。 實例4：藉由SPR進行之PLBL2對不同mAb之結合力 基於先前資料，一種可能的解釋係PLBL2優先結合至mAb7而非其他mAb產品。如先前指示，mAb7係IgG4分子，其可能為PLBL2提供在其他亞型中不存在的結合位點。為進一步研究PLBL2在針對mAb7之純化期間未移除之原因，進行表面電漿子共振(SPR)結合實驗。在此實驗中，使用Biacore™ T200儀器(GE Healthcare)將抗-人類IgG Fc抗體(GE Healthcare)固定至Series S CM5感測器晶片(GE Healthcare)之兩個流動細胞(FC4及FC3)至~7000反應單位(RU)之水平。經固定之抗體係用以捕獲1x HBS-EP+ 緩衝劑(GE Healthcare)中之mAb產品至~2500 RU之水平於FC4上，使用FC3作為針對背景扣除之在線(in line)參考細胞。使用HBS-EP+緩衝劑將重組倉鼠PLBL2稀釋至5 µM，及在30 µL/分鐘下注射60秒。PLBL2之分解係在再生表面前使用製造商推薦之方案量測180秒。 藉由SPR使用此方案分析不同亞型之七種不同人類化IgG產品之PLBL2結合，該等不同人類化IgG產品包括IgG1、IgG2、IgG4及IgG2/IgG4嵌合體(參見下表5)。結果證實PLBL2結合至所有三種經測試之IgG4分子，且不結合至其他亞型中之任何一者(圖3B、圖3C)，儘管幾乎相等地捕獲mAb於感測器晶片上 (圖3A)。對各mAb之PLBL2結合力水平可見於下表5中。 表5：藉由SPR測定之mAb產品之PLBL2結合力水平。
表5中之結果顯示PLBL2對IgG4亞型之抗體具有增加之結合傾向。此外，因為mAb 2、3、5及6全部含有相同之可變區，因此該等結果將指示IgG4分子之恆定區負責其增強之PLBL2結合能力。 顯著地，PLBL2不結合至mAb4，其係含有IgG2之生殖系鉸鏈區之IgG2/IgG4嵌合體，而該恆定區之剩餘部分係由IgG4之生殖系鉸鏈區組成。此等結果表明PLBL2在mAb7之純化期間因直接結合至mAb產品而未經移除。 此等結果將指示不僅IgG4分子之恆定域主要負責驅動PLBL2之結合，而且此恆定域之鉸鏈區亦很可能負責PLBL2之結合。 為計算重組PLBL2對mAb7之結合親和力，進行第二SPR實驗。此實驗使用相同之固定化抗-人類IgG Fc晶片，但僅捕獲mAb7至~170 RU之水平。捕獲後，PLBL2係以30 µL/分鐘注射120秒，及每次注射濃度在自1.25 µM至80 µM之範圍內變化。結合親和力(K
D
)係使用Biacore T200評估軟體，使用1:1結合模型在穩定狀態下進行測定。 結果證實PLBL2對mAb7之結合力隨濃度增加而增加(圖4A)。在穩定狀態(PLBL2注射開始後之~110秒)下之結合反應係用以計算結合親和力(圖4B)。40.0 µM之K
D
係針對結合至mAb7之PLBL2進行計算。雖然此係相對較弱之結合力，但此結果有助於HDX-MS實驗之設置，以在該實驗中使mAb7分子飽含PLBL2。 實例5：表現系統對PLBL2之結合之影響 先前實例已顯示相較於其他抗體亞型(例如，IgG1及IgG2)，IgG4亞型之抗體對結合PLBL2增加之傾向。進行研究以判定用以產生此等抗體之宿主細胞表現系統是否可影響其等結合PLBL2之能力。研究係使用mAb6 (IgG4)及mAb3 (IgG2)進行，其等皆具有相同之可變域但為不同之IgG子類。此等分子之行為差異可因此直接歸因於恆定抗體域。 簡而言之，單獨培養表現IgG4 mAb6 (分別指示mAb6A及mAb6B)之CHO K1及HEK293細胞，並行進行表現mAb3 (IgG2)之CHO K1a細胞之另一單獨培養。在適當之時間點獲取此等培養物，接著通過標準mAb澄清及下游純化過程。然後使用Biacore™ T200使用表面電漿子共振(SPR)分析各此等抗體之純化樣品及比較其等結合PLBL2之能力。 樣品(表6)在HBS-EP緩衝劑中稀釋至20 µg/mL及歷時60秒以10 µL/min注射在預固定蛋白A晶片(GE Healthcare)之主動流動細胞上。在HBS-EP中稀釋至100 µg/mL之PLBL2係然後歷時120秒以5 µL/min注射在主動流動細胞及參考流動細胞兩者上。兩種流動細胞係使用10 mM甘胺酸pH 1.5以30 µL/min再生10秒及然後使用HBS-EP以30 µL/min再生30秒。 表6：用以產生抗體之分子形式及宿主細胞表現系統
結果(圖5)證實兩種IgG4分子儘管在不同細胞系中產生但同等地與PLBL2相互作用。同時，IgG2分子不相互作用。表7證實由各樣品產生之任意值。 表7：PLBL2對表現於不同宿主系統中之IgG4及IgG2分子之結合力
實例6：IgG2及IgG4亞型之抗體之結合親和力之定量 先前實驗已顯示相較於其他子類之抗體(例如，IgG1及IgG2)，IgG4子類之抗體對PLBL2增加之結合能力。亦進行研究以定量IgG4抗體對PLBL2之親和力。 樣品係如實例5中描述產生。在此等樣品中PLBL2與抗體結合之親和力係然後使用Octet® RED 384儀器藉由生物層干涉術(BLI)評估。樣品(與如表6中提及的一樣)係在PBS-T中經稀釋至10 µg/mL。在1000 RPM下將商業可獲得之蛋白A生物感測器(Pall)在各樣品中浸漬120秒。經裝載之生物感測器係然後在各種濃度(1538 nM經連續稀釋2倍至16 nM)下在1000 RPM下於PLBL2中浸漬300秒以評估結合，接著在1000 RPM下於PBS-T中浸漬300秒以評估分解。生物感測器係使用10 mM甘胺酸pH 1.5及PBS-T根據製造商之說明再生。 結果(表8)係使用局部擬合以1:1結合模型產生。無法針對mAb3獲取親和力資料，因為不存在相互作用(圖6A)。mAb6A及mAb6B兩者均具有低親和力；mAb6A之親和力相較於mAb6B因較快之結合速率而具有約14倍之增加。同時分解速率係相似的。mAb6A及mAb6B之擬合係分別顯示於圖6B及6C中。 此等結果顯示儘管宿主細胞表現系統不影響經表現之IgG4對PLBL2之結合能力，但可能影響分子之結合親和力。 表8：IgG2及IgG4分子之結合親和力
實例7：由HDX-MS探測之mAb7與PLBL2之間的相互作用 為進一步瞭解mAb7與PLBL2之間的科學潛在相互作用，使用偶合至Synapt G2-S質譜儀之Waters HDX管理系統進行mAb7樣品及與PLBL2結合之mAb7樣品之HDX-MS分析。基於SPR之40.0 µM之K
D
，~70%之mAb在氘標記後與PLBL2結合。氘標記係在0.5 min、5 min、60 min、120 min、180 min及240 min下進行量測。資料係使用Waters DynamX軟體及產生之HDX微分圖(圖7)進行分析。豎桿表示來自六個標記時間點之各肽之總HDX差值。未結合及結合PLBL2之mAb7之HDX曲線之比較顯示重鏈中區域K218至F256顯示一經結合至PLBL2即降低之氘攝取。此指示此區域因PLBL2結合至mAb7而穩定且與其他實驗結合結果較好相關。 實例8：不同mAb之鉸鏈區之序列比對 先前結果證實PLBL2藉由直接結合至產品及共純化污染mAb7 (IgG4分子)。同樣地，先前實例已顯示mAb5及mAb6 (其等亦為IgG4亞型)亦可結合PLBL2。結合至不同同型物之mAb之PLBL2之分析表明該結合最可能在IgG4分子之鉸鏈區中發生，其係由HDX-MS資料支持。鑒於不同IgG同型物中不同胺基酸之較小數量，很可能可識別涉及PLBL2結合之個別胺基酸殘基。為測定涉及PLBL2結合之IgG4胺基酸殘基，生成mAb產品之鉸鏈區之胺基酸序列比對。 在分析序列比對中，受關注之殘基係彼等在其中可見PLBL2結合之IgG4分子(mAb5、mAb6及mAb7)中保守及在其中PLBL2不結合之其他IgG亞型中不保守的殘基(即，不同之殘基)。此分析產生10個此等殘基，其等係由黑盒(圖8)標示。具體言之，受關注之殘基係：K203、R222、S227、Y229、G230、P237、P238、E246、F247及E248。 預期來自IgG4中發現之胺基酸之此等10個殘基突變為來自IgG2或IgG1中發現之胺基酸可防止PLBL2結合至IgG4分子。 實例9：IgG4鉸鏈區殘基之誘變以減輕對PLBL2之結合力 實例1至8中詳細描述之研究已顯示IgG4分子之恆定區係主要負責使此等免疫球蛋白結合至PLBL2。此外，在IgG4與IgG2/ IgG4嵌合體之間所作之比較已容許與PLBL2之此等相互作用局限於該分子之鉸鏈區處或在該分子之鉸鏈區附近。已經研究之各種分子之胺基酸序列之比對已容許通過消除之方法識別鉸鏈區內之在PLBL2結合中發揮重要作用之特定胺基酸。最終步驟係驗證性進行誘變實驗以顯示IgG4分子之鉸鏈區之修飾如何可減輕此子類免疫球蛋白對PLBL2之結合力。 進行其中10個胺基酸殘基中經識別為負責引起PLBL2結合至IgG4子類之抗體之7個胺基酸殘基取代替代性胺基酸(諸如彼等於人類IgG1及/或IgG2抗體之生殖系鉸鏈序列中發現者)之研究。使用mAb5作為模型分子，進行其中HEK293宿主細胞表現系統經針對具有經修飾之鉸鏈區之許多mAb5變體編碼之載體DNA瞬態轉染的誘變實驗。 mAb5之鉸鏈區之突變係在先前經識別為對影響PLBL2結合力有一定作用的胺基酸序列位置(實例8)。突變係作為單點突變(如表1中已描述)及以其各種組合引入，導致產生7種不同鉸鏈經修飾之IgG4變體分子(mAb5-1B、2B、3B、4B、6B及7B)。平行地，亦設置培養以瞬態表現未經修飾之親代IgG4 (mAb5B)。除此之外，作為單點突變及以其各種組合亦對mAb7(亦IgG4，即使針對不同抗原標靶)之鉸鏈區作出突變，導致產生3種不同鉸鏈經修飾之變體(mAb7-2B、4B及5B)。 此等變體之後綴編號反映所作突變及該編號跨兩組鉸鏈經修飾之IgG4變體仍保持不變。因此，mAb5-2B之鉸鏈區係與mAb7-2B之鉸鏈區相同。 此外，設置培養以表現IgG2 (mAb3B)及IgG4 (mAb6B)作為額外之對照及鉸鏈經修飾之IgG1變體(mAb2-αB)。圖9闡述此等IgG4變體之經修飾之鉸鏈區，且將其相對於針對研究中包括之其他mAb分子之鉸鏈區序列進行比對。表9詳細描述經評估之不同分子。分子名稱上之後綴「A」及「B」指示該抗體是否分別表現於CHO K1或HEK293細胞中。 表9：經評估之IgG1、IgG2、IgG4及IgG4變體之詳細說明
由HEK293細胞產生之材料係使用標準mAb純化方法純化。簡而言之，在培養適當週期以實現產品mAb之足夠瞬態表現後，移除細胞及使用蛋白A親和層析術純化澄清的細胞培養上清液。使用Tris溶液將蛋白A溶析液滴定至中性pH。使研究下含有不同mAb分子之經中和蛋白A溶析液然後經歷如實例10至12中描述之一系列結合分析。 實例10：對IgG2、IgG4及IgG4變體分子進行之PLBL2相互作用分析 實例9中產生及描述之各種mAb與重組人類PLBL2之相互作用係使用Biacore™ T200 (GE Healthcare)結合方法藉由表面電漿子共振(SPR)進行評估。歷時60秒以10 µL/min將20 µg/mL之mAb注射於商業可獲得之預固定蛋白A晶片(GE Healthcare)之流動細胞4上，及容許在HBS-EP+運行緩衝劑中穩定10秒。捕獲之抗體之濃度變化係小於10%。然後歷時120秒以5 µL/min將100 µg/mL (1538 nM)重組人類PLBL2注射於流動細胞4及3上。流動細胞3充當在線參考細胞，減小之5 µL/min流動速率係用以鼓勵低親和力相互作用。感測器係然後在30 µL/min下用10 mM甘胺酸pH 1.5再生10秒。 基於先前實驗之結果，已知mAb8A (其係IgG1)不與重組人類PLBL2相互作用。因此，其可用作陰性對照以將結果標準化。 SPR分析之結果(圖10)指示PLBL2對mAb5-2B及mAb5-4B之RU’s相較於其等親代分子(mAb5B)大致減小90%，及PLBL2對mAb7-2B及mAb7-4B之RU相較於其等親代分子(mAb7A)約下降80%。mAb5-3B證實結合無變化，其指示此突變單獨無法成功減少相互作用。mAb5-2B於位置222處含有自精胺酸至離胺酸的單一胺基酸取代。mAb5-3B於位置227處含有自絲胺酸至脯胺酸的單一胺基酸取代。mAb5-4B含有存在於mAb5-2B及mAb5-3B兩者中之突變；其指示儘管位置227中之脯胺酸取代不減少PLBL2相互作用，但亦無不利影響，及可見PLBL2結合力之減少係由於在位置222處之離胺酸取代。事實上，當相較於顯示對PLBL2無結合之親代分子(mAb2)時，在mAb2中於位置222處之離胺酸(圖9)取代成精胺酸(其表示在此位置處之IgG1至IgG4生殖系之轉換)導致藉由SPR之具有對PLBL2增加之結合力之突變(mAb2-αB)。相較於親代分子(mAb5)，將在mAb5中於位置222處之精胺酸(圖9)轉換為蘇胺酸(其表示在此位置處之IgG4至IgG2生殖系之轉換)導致藉由SPR之具有對PLBL2下降約30%之結合力之突變(mAb5-8B)。 如藉由由mAb5-5B顯示之降低之PLBL2結合力證實，儘管此資料表明位置222處之精胺酸係促進PLBL2結合力之顯著因素，但其他鉸鏈殘基亦可影響此HCP之結合力(圖10)。同時mAb8A證實不與PLBL2相互作用；mAb6B證實結合之最大量。 實例11：對IgG2、IgG4及IgG4變體分子進行之PLBL2親和力分析 PLBL2對實例9中產生及描述之各種mAb之相互作用之親和力係以與實例6中描述之相同方式使用Octet® RED 384儀器(ForteBio)藉由生物層干涉術(BLI)進行測試。 在1000 RPM下以10 µg/mL將商業可獲得之蛋白A生物感測器於樣品中浸漬120秒。在1000 RPM下將生物感測器於分析緩衝劑(HBS-EP+)中浸漬30秒以容許經鬆散結合之蛋白質之分解。然後將經裝載之生物感測器浸漬於各種濃度(1538、769.2、384.6、192.3、96.15、48.15、24、0 nM)的重組人類PLBL2中及最終在HBS-EP+中浸漬5分鐘。 結合速率及分解速率係使用具有整體擬合之1:1結合模型進行量測；然而因較快之快分解速率而僅分析分解曲線之僅前50秒。結果係證實於表10中。 表10：IgG1、IgG2、IgG4及IgG4變體分子之結合親和力
*基於mAb5B之K
D
計算之倍數變化 因較差之曲線擬合而無法計算mAb5-2B、mAb5-4B、mAb7-2B、mAb7-4B及mAb8A的動力學值，此指示此等分子不與PLBL2相互作用。此等結果與來自實例10之發現一致，實例10中之發現亦證實就此等樣品而言對PLBL2之結合有所影響。相較於親代分子(mAb5B)，針對mAb5-6B可見K
D
之較大降低(超過10x)。mAb5-1B及mAb5-7B證實因稍快結合速率(k
on
)(其係非所需的)而對PLBL2略有增加之親和力。當相較於親代分子時，所有剩餘突變證實對PLBL2之結合力降低小於10x及因此認為結合親和力之變化係不顯著的。 實例12：IgG2、IgG4及變體IgG4分子之抗原結合 抗體分子mAb3、mAb5 (包括所有鉸鏈經修飾之變體)及mAb6全部包含相同之可變區，因為此等抗體係針對相同之抗原。為證實樣品誘變對各分子之抗原結合活性無不利影響，抗原結合係使用Biacore™ T200 (GE Healthcare)藉由表面電漿子共振(SPR)進行評估。活性係藉由使用預固定蛋白A感測器(GE Healthcare)以捕獲配體來評估。在使用前，5x啟動週期在所有流動細胞上運行以再生感測器表面(在30 µL/min下使用10 mM甘胺酸pH 1.5，歷時60秒)。各mAb樣品係以10 µg/mL稀釋於PBS-T中及歷時60秒以10 µL/min注射於流動細胞4上，穩定週期為10秒。然後歷時60秒以10 µL/min將10 µg/mL靶抗原注射於流動細胞4及3上，之後停止注射及歷時100秒以10 µL/min之流動速率注射分析緩衝劑以容許分解。該感測器表面係然後在30 µL/min下使用10 mM甘胺酸pH 1.5再生60秒，以為下次注射做準備。 為計算各分子之活性，將抗原結合反應(RU)除以抗體捕獲反應(RU)及以百分率之形式記錄。記錄之百分率指示存在於樣品中之仍可結合至其抗原之抗體之量。歸因於此實驗之分析誤差係10%。表11顯示所有mAb證實對靶抗原之100±10%活性，此指示不存在結合損失或變化。所有突變體可同等地進行。特定言之，在mAb5B或其鉸鏈經修飾之變體(mAb5-1B至7B)之任何一者之結合不存在差異。 表11：各mAb之IgG2及IgG4子類對靶抗原之結合力
實例13：IgG4對宿主細胞蛋白(HCP)之結合力之減輕 懸而未決之宿主細胞蛋白通常與產品共純化及儘管通常係僅痕量存在，已存在其中經完全純化之藥物物質中存在之濃度可呈現安全性及藥物效用問題兩者之情況。儘管PLBL2之結合呈現此情況之重要實例，但存在報導其他懸而未決之宿主細胞蛋白與受關注之抗體產品相互作用之情況。 因此，進行研究以證實IgG4鉸鏈區修飾對減輕其他HCP之結合力之影響。第一階段將為識別具有與IgG4相互作用之傾向之HCP，例如，使用mAb6作為模型分子。此等HCP可使用HCP富集方法識別，藉此mAb之Fc區將結合至商業可獲得之蛋白A珠及經歷用無CHO K1澄清之未處理散裝(CUB)材料之多個10分鐘培養週期。最終經結合之複合體然後自該等珠析出及使用LC-MS/MS分析。多反應監測(MRM)方法可用以定量存在之宿主細胞蛋白。 倘若此等HCP已經成功識別，則先前實例中詳細描述之方法可用以評估此等HCP對原始mAb5分子及經修飾之mAb5突變體(其等之產生係描述於實例9中)兩者之結合力。此等研究將有助於闡述不僅使用為本發明之標的之鉸鏈區修飾減輕PLBL2對IgG4之結合能力，而且更廣泛地降低更通常結合至HCP之傾向之能力。