TW202246346A - 與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明是關於與酸性鞘磷脂酶(ASM,acid sphingomyelinase)蛋白特異性結合的抗體。具體地,本發明的抗體或其抗原結合片段可通過以高結合力與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合來有效地用於酸性鞘磷脂酶蛋白的檢測或因酸性鞘磷脂酶蛋白的過表達而產生的疾病的診斷等。
Description
本發明是關於與酸性鞘磷脂酶(ASM,acid sphingomyelinase)蛋白特異性結合的抗體。
鞘脂代謝會對正常細胞訊號傳遞進行調節,鞘脂代謝的不正常變化會對包括阿爾茨海默疾病在內的多種神經退行性疾病產生影響。作為調節鞘脂代謝的酶的酸性鞘磷脂酶(ASM,acid sphingomyelinase)蛋白為幾乎在所有種類的細胞表達的蛋白質,對鞘脂代謝以及細胞膜周轉(turnover)起到重要作用。
在阿爾茨海默疾病等神經退行性疾病患者的大腦中,酸性鞘磷脂酶蛋白的活性比正常人明顯增加。與之相關的內容有韓國專利授權第10-1521117號,其中揭示了通過抑制過表達的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性或抑制表達成酸性鞘磷脂酶蛋白來抑制β-澱粉樣蛋白的堆積並改善學習能力以及記憶力,從而可治療神經退行性疾病。並且,近期在抑鬱症等神經疾病中也表現出酸性鞘磷脂酶蛋白的活性增加,因而可通過抑制上述酸性鞘磷脂酶蛋白的表達或活性來改善抑鬱症。
但是,直接抑制酸性鞘磷脂酶蛋白的表達或活性的物質尚未被開發,只是間接抑制酸性鞘磷脂酶蛋白的表達的幾種抑制劑問世。例如,在抑鬱症的治療中會用到三環抗抑鬱藥(tricyclic antidepressant),其中有阿米替林(amitriptyline)、地昔帕明(desipramine)、米帕明(mipramine)等。這些三環抗抑鬱藥的開發雖不是以酸性鞘磷脂酶蛋白抑制劑作為目的,但通過多種研究結果證明了呈現出酸性鞘磷脂酶蛋白抑制效果。三環抗抑鬱藥的主要藥理機制為通過在神經細胞中抑制神經遞質的再吸收來增加它們的活性,作為酸性鞘磷脂酶抑制劑的作用為附帶作用。但是,三環抗抑鬱藥可通過對神經系統以及神經細胞產生作用來誘發視線模糊、光感受性增加、嘔吐等的副作用。
[發明所欲解決之問題]
本發明的一目的在於提供與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段。
本發明的再一目的在於提供上述抗體或其抗原結合片段的製備方法。
本發明的還有一目的在於提供上述抗體或其抗原結合片段的酸性鞘磷脂酶蛋白檢測用途。
[解決問題之技術手段]
為了實現上述目的,本發明提供與酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase)蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段。
並且,本發明提供對上述抗體或其抗原結合片段進行編碼的核酸。
並且,本發明提供包含上述核酸的表達載體。
並且,本發明提供包含上述核酸或表達載體的宿主細胞。
並且,本發明提供將通過培養上述宿主細胞來生產抗體或其抗原結合片段的步驟包含在其中的與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段的生產方法。
並且,本發明提供包含上述抗體或其抗原結合片段的酸性鞘磷脂酶蛋白檢測用組合物及試劑盒。
進而,本發明提供將使上述抗體或其抗原結合片段與試樣產生反應的步驟包含在其中的酸性鞘磷脂酶蛋白檢測方法。
[對照先前技術之功效]
本發明的抗體或其抗原結合片段以高結合力與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合,因而可有效地用於酸性鞘磷脂酶蛋白的檢測或因酸性鞘磷脂酶蛋白的過表達而產生的疾病的診斷等。
以下,詳細說明本發明。
本發明提供與酸性鞘磷脂酶(ASM,acid sphingomyelinase)蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段。
在本說明書中使用的術語“酸性鞘磷脂酶(ASM,acid sphingomyelinase)蛋白”意味著作為調節鞘脂代謝的SMase(sphingomyelinase)族之一的酶。上述酸性鞘磷脂酶蛋白促進將鞘磷脂(sphingomyelin)分解成神經醯胺(ceramide)以及磷酸膽鹼(phosphorylcholine)的過程,可根據表示最佳酶活性的pH來分為鹼性、中性或酸性。
上述酸性鞘磷脂酶蛋白可包括發明所屬技術領域中周知的所有種類的酸性鞘磷脂酶蛋白。具體地,上述酸性鞘磷脂酶蛋白可源自哺乳動物,更具體地,可源自人、猴子、大鼠或小鼠。並且,上述酸性鞘磷脂酶蛋白可包含發明所屬技術領域中被知曉為酸性鞘磷脂酶蛋白的所有胺基酸序列。作為一例,上述酸性鞘磷脂酶蛋白可以為由分別由序列識別號66或67所示的胺基酸序列組成的多肽或對其進行編碼的核酸。
只要可維持相同或相對應的生物學活性,則上述酸性鞘磷脂酶蛋白可以為在由序列識別號66或67所示的胺基酸序列添加、缺失或置換一個或一個以上的胺基酸的。在此情況下,胺基酸的置換可以為在不對整個蛋白質的電荷,即極性或疏水性產生影響的情況或影響程度低的範圍內執行的保守性置換。並且,上述酸性鞘磷脂酶蛋白可與分別由序列識別號66或67所示的胺基酸序列具有80%以上、90%以上、95%以上、97%以上或99%以上的同源性。並且,只要能夠維持相同或相對應的生物學活性,則上述酸性鞘磷脂酶蛋白可以僅包含酸性鞘磷脂酶蛋白的一部分。
在本說明書中使用的術語“抗體(antibody)”意味著通過與抗原相結合來妨礙抗原的作用或去除抗原的免疫蛋白。上述抗體可包括發明所屬技術領域中所包含的所有種類的抗體。具體地,上述抗體可包括IgM、IgD、IgG、IgA以及IgE,分別包括由作為對重鏈恆定區域進行編碼的基因的μ、δ、γ、α以及ε組成的重鏈。通常,在抗體技術中主要使用IgG,這重新由IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的同型(isotype)組成,它們各自的結構以及功能特性可不同。上述抗體可包括將源自非-人抗體的最小序列包含在其中的人化抗體、由源自人的序列組成的人抗體或混合源自不同物種的序列的嵌合抗體等的全部。
上述IgG可由2個約50kDa的重鏈(heavy chain)蛋白和2個約25kDa的輕鏈(light chain)蛋白形成Y字形的非常穩定的結構(約150kDa)。組成抗體的輕鏈以及重鏈可在抗體之間劃分為胺基酸序列不同的可變區域(variable region)以及胺基酸序列相同的恆定區域(constant region)。在此情況下,重鏈恆定區域包括CH1域、絞合(hinge,H)域、CH2域以及CH3域,各個域由兩個β-折疊(β-sheet)組成,可由分子內二硫鍵(disulfide bond)相連接。並且,輕鏈恆定區域可包括CL域。另一方面,由重鏈的可變區域以及輕鏈的可變區域這兩個相結合來形成抗原結合部位(antigen binding site),上述抗原結合部位可在Y字形的兩個分支各存在一個。在全長的抗體中,將可與抗原相結合的部分稱作Fab(antibody binding fragment),將不與抗原相結合的部分稱作Fc(crystallizable fragment),Fab以及Fc可由絞合相連接。在本發明的一實施例中,上述IgG可以為源自小鼠的IgG,具體地,可包括由序列識別號74所示的胺基酸序列組成的小鼠IgG重鏈恆定區域以及由序列識別號76所示的胺基酸序列組成的小鼠輕鏈λ恆定區域。並且,源自上述小鼠的IgG可包括由序列識別號75所示的鹼基序列組成的小鼠IgG重鏈恆定區域以及由序列識別號77所示的鹼基序列組成的小鼠輕鏈λ恆定區域。
本發明的抗體不僅包括全長的抗體,還包括其的抗原結合片段。具體地,上述抗原結合片段可意味著除了起到向細胞或補體傳遞與抗原之間的結合刺激的功能的Fc的部分。作為一例,抗體的抗原結合片段可包括Fab、scFv、F(ab)
2以及Fv等的全部,還可包括單域抗體(single domain antibody)或微型抗體(minibody)等的第三代抗體片段。
在本發明的一實施方式中,上述抗體或抗原結合片段與選自由從酸性鞘磷脂酶蛋白的N-末端起第53位胺基酸片段至第72位胺基酸片段、第101位胺基酸片段至第123位胺基酸片段、第135位胺基酸片段至第159位胺基酸片段、第135位胺基酸片段至第155位胺基酸片段、第218位胺基酸片段至第228位胺基酸片段以及第259位胺基酸片段至第269位胺基酸片段組成的組中的一個以上的表位相結合。在此情況下,上述酸性鞘磷脂酶蛋白可具有如上所述的特徵。在本發明的一實施例中,從上述酸性鞘磷脂酶蛋白的N-末端起第53位胺基酸片段至第72位胺基酸片段可以為由序列識別號68(TAINLGLKKEPNVARVGSVA)所示的胺基酸序列組成的多肽,第101位胺基酸片段至第123位胺基酸片段可以為由序列識別號69(VWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGH)所示的胺基酸序列組成的多肽,第135位胺基酸片段至第159位胺基酸片段可以為由序列識別號70(PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF)所示的胺基酸序列組成的多肽,第135位胺基酸片段至第155位胺基酸片段可以為由序列識別號71(PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS)所示的胺基酸序列組成的多肽,第218位胺基酸片段至第228位胺基酸片段可以為由序列識別號72(SGLGPAGPFDM)所示的胺基酸序列組成的多肽,第259位胺基酸片段至第269位胺基酸片段可以為由序列識別號73(VRKFLGPVPVY)所示的胺基酸序列組成的多肽。即,在本發明的另一實施方式中,上述抗體或抗原結合片段可與選自由分別由序列識別號68至73所示的多肽組成的組中的一個以上的表位相結合。
上述“表位(epitope)”這一術語為抗體可識別抗原的特定部位,意味著可使抗體特異性結合的蛋白質決定部位。上述表位以相同的含義來與與決定部位(determinant)或抗原決定部位(antigenic determinant)等的術語通用。上述表位由具有化學活性的表面分子組組成,例如由胺基酸或糖側鏈組成,通常具備特定三維結構特徵,不僅如此,具備特定電荷特性。
在本發明的一實施方式中,上述抗體或其抗原結合片段可包括:重鏈可變區域,包含由序列識別號61所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1(X
1YX
2MS)、由序列識別號62所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR2(X
3IX
4X
5X
6X
7X
8X
9X
10YYADSVKG)以及選自由分別由序列識別號27、30、33、36、39以及42所示的胺基酸序列組成的組中的重鏈CDR3;以及輕鏈可變區域,包含由序列識別號63所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1(X
11GSSSNIGX
12NX
13VX
14)、由序列識別號64所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR2(X
15X
16X
17X
18RPS)以及由序列識別號65所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR3(X
19X
20WDX
21SLX
22X
23YV)。
上述術語“CDR(complementarity determining region)”為作為每個抗體在抗體的重鏈以及輕鏈可變區域內具有不同胺基酸序列的部位的高變區(hypervariable region),意味著實際與抗原相結合的部位。在抗體的立體結構中,CDR以環狀(loop)位於抗體的表面,可在環下方存在結構性地對其進行支撐的FR(framework region)。重鏈以及輕鏈均分別具有三個環結構,這些六個環結構可相合併與抗原直接接觸。方便起見,可將作為具有上述六個環結構的抗原結合部位的CDR分別稱作重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2或輕鏈CDR3。
作為一例,在由上述序列識別號61所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1(X
1YX
2MS)中,X
1以及X
2可分別從酸性胺基酸以及中性胺基酸中選擇。具體地上述X
1可以是酸性胺基酸或中性胺基酸,X
2可以是中性胺基酸。例如,上述X
1以及X
2可分別從由天冬醯胺(asparagine,Asn)、甘胺酸(glycine,Gly)、絲胺酸(serine,Ser)、天冬胺酸(aspartic acid,Asp)、丙胺酸(alanine,Ala)以及酪胺酸(tyrosine,Tyr)組成的組中選擇。具體地,上述X
1可以是天冬醯胺、甘胺酸、絲胺酸或天冬胺酸,X
2可以是丙胺酸或酪胺酸。在本發明的一實施例中,上述重鏈CDR1可由序列識別號25、28、31、34、37或40所示的胺基酸序列組成。
並且,在由上述序列識別號62所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR2(X
3IX
4X
5X
6X
7X
8X
9X
10YYADSVKG)中,X
3至X
10可分別從中性胺基酸以及鹼性胺基酸中選擇。具體地,上述X
3以及X
4至X
9可分別是中性胺基酸,X
10可以是中性胺基酸或鹼性胺基酸。例如,上述X
3至X
10可分別從由甘胺酸、白胺酸(leucine,Leu)、丙胺酸、絲胺酸、酪胺酸、脯胺酸(proline,Pro)、天冬醯胺、離胺酸(lysine,Lys)以及異白胺酸(isoleucine,Ile)組成的組中選擇。具體地,上述X
3可以是甘胺酸、白胺酸、丙胺酸或絲胺酸,X
4可以是酪胺酸或絲胺酸,X
5可以是脯胺酸或酪胺酸,X
6可以是天冬醯胺或甘胺酸,X
7以及X
8可分別是甘胺酸或絲胺酸,X
9可以是天冬醯胺或絲胺酸,X
10可以是離胺酸或異白胺酸。在本發明的一實施例中,上述重鏈CDR2可由序列識別號26、29、32、35、38或41所示的胺基酸序列組成。
並且,在由上述序列識別號63所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1(X
11GSSSNIGX
12NX
13VX
14)中,X
11至X
14可分別從中性胺基酸中選擇。例如上述X
11至X
14可分別從由蘇胺酸(threonine,Thr)、絲胺酸、天冬醯胺、丙胺酸、脯胺酸以及酪胺酸組成的組中選擇。具體地,上述X
11可以是蘇胺酸或絲胺酸,X
12可以是天冬醯胺或絲胺酸,X
13可以是丙胺酸、脯胺酸、蘇胺酸或酪胺酸,X
14可以是天冬醯胺、酪胺酸或絲胺酸。在本發明的一實施例中,上述輕鏈CDR1可由序列識別號43、46、49、52、55或58所示的胺基酸序列組成。
並且,在由上述序列識別號64所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR2(X
15X
16X
17X
18RPS)中,X
15至X
18可分別從酸性胺基酸、鹼性胺基酸以及中性胺基酸選擇。具體地,上述X
15以及X
16可分別是酸性胺基酸或中性胺基酸,X
17可以是中性胺基酸,X
18可以是鹼性胺基酸或中性胺基酸。例如,上述X
15至X
18可分別從由酪胺酸、丙胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、組胺酸(histidine,His)、麩醯胺酸(glutamine,Gln)以及離胺酸組成的組中選擇。具體地,X
15可以是酪胺酸、丙胺酸、天冬胺酸或絲胺酸,X
16可以是天冬胺酸或天冬醯胺,X
17可以是絲胺酸或天冬醯胺,X
18可以是組胺酸、麩醯胺酸或離胺酸。在本發明的一實施例中,上述輕鏈CDR2由序列識別號44、47、50、53、56或59所示的胺基酸序列組成。
並且,在由上述序列識別號65所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR3(X
19X
20WDX
21SLX
22X
23YV)中,X
19至X
23可分別從中性胺基酸選擇。例如,上述X
19至X
23可從由甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、天冬胺酸以及天冬醯胺組成的組中選擇。具體地,X
19可以是甘胺酸或丙胺酸,X
20可以是丙胺酸、絲胺酸或蘇胺酸,X
21可以是酪胺酸、絲胺酸、丙胺酸或天冬胺酸,X
22可以是絲胺酸或天冬醯胺,X
23可以是丙胺酸或甘胺酸。在本發明的一實施例中,上述輕鏈CDR3由序列識別號45、48、51、54、57或60所示的胺基酸序列組成。
在本發明的另一實施方式中,上述抗體或其抗原結合片段可包括:重鏈可變區域,包含選自由分别由序列識別號25、28、31、34、37以及40所示的胺基酸序列組成的組中的重鏈CDR1、選自由分別由序列識別號26、29、32、35、38以及41所示的胺基酸序列組成的組中的重鏈CDR2以及選自由分別由序列識別號27、30、33、36、39以及42所示的胺基酸序列組成的組中的重鏈CDR3;以及輕鏈可變區域,包含選自由分別由序列識別號43、46、49、52、55以及58所示的胺基酸序列組成的組中的輕鏈CDR1、選自由分別由序列識別號44、47、50、53、56以及59所示的胺基酸序列組成的組中的輕鏈CDR2以及選自由分別由序列識別號45、48、51、54、57以及60所示的胺基酸序列組成的組中的輕鏈CDR3。
並且,上述抗體或其抗原結合片段可包括:重鏈可變區域,選自由將由分別由序列識別號25、26以及27所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域、將由分別由序列識別號28、29以及30所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域、將由分別由序列識別號31、32以及33所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域、將由分別由序列識別號34、35以及36所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域、將由分別由序列識別號37、38以及39所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號40、41以及42所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域組成的組;以及輕鏈可變區域,選自由將由分別由序列識別號43、44以及45所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域、將由分別由序列識別號46、47以及48所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域、將由分別由序列識別號49、50以及51所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域、將由分別由序列識別號52、53以及54所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域、將由分別由序列識別號55、56以及57所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域以及將由分別由序列識別號58、59以及60所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域組成的組。
進而,上述抗體或其抗原結合片段可包括:將由分別由序列識別號25、26以及27所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號43、44以及45所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域;將由分別由序列識別號28、29以及30所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號46、47以及48所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域;將由分別由序列識別號31、32以及33所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號49、50以及51所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域;將由分別由序列識別號34、35以及36所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號52、53以及54所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域;將由分別由序列識別號37、38以及39所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號55、56以及57所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域;或將由分別由序列識別號40、41以及42所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號58、59以及60所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域。
作為一例,上述重鏈可變區域可以是由序列識別號1、3、5、7、9或11所示的胺基酸序列組成的多肽,上述輕鏈可變區域可以是由序列識別號13、15、17、19、21或23所示的胺基酸序列組成的多肽。
並且,本發明的抗體或其抗原結合片段可根據需求變形而得。具體地,上述抗體或其抗原結合片段可通過綴合(conjugation)、糖化(glycosylation)、標記或它們的組合來變形。具體地,上述抗體或其抗原結合片段可通過辣根過氧化物酶(HRP,horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、半抗原(hapten)、生物素、鏈酶親和素、螢光物質、放射性物質、量子點、聚乙二醇(PEG,polyethylene glycol)、組胺酸標記等變形。不僅如此,上述抗體或其抗原結合片段還可根據需求來與其他藥物綴合。
上述抗體或其抗原結合片段可根據發明所屬技術領域中周知的單克隆抗體製備方法來製備,上述製備方法可由發明所屬技術領域中具有通常知識者進行適當變形。作為一例,上述抗體可通過在使用從由抗原實現免疫的動物獲取的B淋巴細胞製備雜交瘤來實現製備,或可利用噬菌體顯示技術來製備。
並且,本發明提供對上述抗體或其抗原結合片段進行編碼的核酸。
本發明的核酸進行編碼的抗體或其抗原結合片段可具備如上所述的特徵。組成本發明的抗體或其抗原結合片段的胺基酸序列已公知,因而對其進行編碼的核酸序列也對於發明所屬技術領域中具有通常知識者而言是周知的。並且,只要上述核酸序列維持由此翻譯的抗體或該抗體的抗原片段的活性,則可以是添加、缺失或置換一個或一個以上的鹼基的。
作為一例,本發明的對抗體或其抗原結合片段中所包含的重鏈可變區域進行編碼的核酸可以是由序列識別號2、4、6、8、10或12所示的鹼基序列組成的多核苷酸,對輕鏈可變區域進行編碼的核酸可以是由序列識別號14、16、18、20、22或24所示的鹼基序列組成的多核苷酸。
並且,本發明提供包含上述核酸的表達載體。
本發明的包含在表達載體的核酸可以是對具備如上所述的特徵的抗體或其抗原結合片段進行編碼的。
在本說明書中使用的術語“表達載體(expression vector)”作為在宿主細胞中表達靶基因的手段,可包括質粒載體、黏粒載體、噬菌體載體、病毒載體等全部。上述表達載體可為了從其所包含的核酸生成肽而包含必要的要素。具體地,上述表達載體可包含訊號序列、複製源、標記基因、啟動子、轉錄終止序列等。在此情況下,本發明的抗體或其抗原結合片段被編碼的核酸可與啟動子動作性地相連接。
作為一例,用於原核細胞的表達載體可包含進行轉錄的啟動子、用於開始解讀的核糖體結合位置以及轉錄和解讀的終止序列。另一方面,用於真核細胞的表達載體可包含源自哺乳動物或哺乳動物病毒的啟動子以及多腺苷酸化序列。
並且,上述表達載體所包含的標記基因可使用發明所屬技術領域中周知的所有標記基因,具體地,可以是抗生素耐藥性基因。具體地,上述抗生素耐藥性基因可以是包括氨苄西林、艮他黴素、羧比西林、氯黴素、鏈黴素、卡那黴素、新黴素、四環素等在內的對抗生素表現出耐藥性的基因。
並且,本發明提供包含上述核酸或表達載體的宿主細胞。
本發明的包含在宿主細胞的核酸或表達載體可具備如上所述的特徵。作為一例,上述核酸可對本發明的與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段進行編碼,上述表達載體可包含如上所述的核酸。
上述宿主細胞可使用在發明所屬技術領域中可用於抗體或其抗原結合片段生產的所有種類的細胞。具體地,上述宿主細胞可以是原核細胞、酵母或真核細胞。上述原核細胞可包括大腸菌(E.coli)、芽孢桿菌屬菌株、碳黴素屬菌株、假單胞菌屬菌株、葡萄球菌屬菌株等,上述酵母可包括釀酒酵母等。另一方面,上述真核細胞可包括COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、HEK293、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PERC6、SP2/0、NS-0、U20S以及HT1080等。
並且,上述宿主細胞可以是根據發明所屬技術領域中周知的方法轉染如上所述的核酸或表達載體的。具體地,上述轉染可通過暫態轉染(transient transfection)、微注射、轉導(transduction)、細胞融合、磷酸鈣沉澱法、脂質體介導轉染(liposome-mediated transfection)、DEAE葡聚糖-介導轉染(DEAE dextran-mediated transfection)、凝聚胺-介導轉染(polybrene-mediated transfection)、電穿孔法、基因槍(gene gun)等的方法來執行。並且,上述方法可由發明所屬技術領域中具有通常知識者進行適當變形。
進而,本發明提供與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段的生產方法,其包括通過培養上述宿主細胞來生產抗體或其抗原結合片段的步驟。
通過本發明的生產方法生產的抗體或其抗原結合片段可具備如上所述的特徵。
上述培養可根據生產中使用的宿主細胞的種類來使用合適的培養基執行,可根據需求包含適當的補充物。並且,上述培養可根據宿主細胞的種類來在合適的環境下執行。
本發明的生產方法還可包括對由宿主細胞生產的抗體或其抗原結合片段進行回收的步驟。上述回收可根據發明所屬技術領域中周知的方法來執行,這可根據需求來由發明所屬技術領域中具有通常知識者進行適當變形。作為一例,上述回收可通過利用離心分離或超濾去除雜物並通過色譜法等進一步純化所得到的產物來執行。上述色譜法可包括親和色譜法、負離子色譜法、疏水性相互作用色譜法等。
並且,本發明提供包含上述抗體或其抗原結合片段的酸性鞘磷脂酶蛋白檢測用組合物及試劑盒。
本發明的酸性鞘磷脂酶蛋白檢測用組合物及試劑盒中包含的抗體或其抗原結合片段可具備如上所述的特徵。
並且,上述組合物可包含與本發明的抗體或其抗原結合片段特異性結合的配體。上述配體可以是發色酵素、螢光物質、放射性同位素或膠體等的檢測體被標示的綴合物以及鏈酶親和素或抗生物素蛋白被處理的配體。除如上所述的試劑之外,本發明的檢測用組合物還可包含能穩定維持它們的結構的蒸餾水或緩衝液。
並且,上述試劑盒可與固體基質相結合,以使得其所包含的抗體或其抗原結合片段的清洗或複合物的分離等的之後步驟變得容易。在此情況下,固體基質可使用合成樹脂、硝化纖維素、玻璃基板、金屬基板、玻璃纖維、微細球體或微細珠。並且,合成樹脂可使用聚酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、PVDF或尼龍等。
並且,上述試劑盒可通過發明所屬技術領域中具有通常知識者周知的現有製造方法進行製造,還可包含緩衝液、穩定化劑、非活性蛋白等。
進而,本發明提供酸性鞘磷脂酶蛋白檢測方法,其包括使上述抗體或其抗原結合片段與試樣產生反應的步驟。
在本發明的酸性鞘磷脂酶蛋白檢測方法中使用的抗體或其抗原結合片段可具備如上所述的特徵。
只要是用於檢測酸性鞘磷脂酶蛋白的試樣,則上述試樣可包含所有種類的試樣。並且,利用抗體或其抗原結合片段檢測靶蛋白的方法在發明所屬技術領域中周知,這可由發明所屬技術領域中具有通常知識者根據需求適當變形執行。
以下,通過以下的實施例詳細說明本發明。但是,以下的實施例僅屬於本發明的例示,本發明並不限定於此。只要形成實際與本發明的發明要求保護範圍中的技術思想相同的結構並提供相同的作用效果,則將屬於本發明的技術範圍。
實施例1.製備與酸性鞘磷脂酶(ASM,acid sphingomyelinase)蛋白特異性結合的抗體
通過以下方法製備了與人酸性鞘磷脂酶蛋白(序列識別號66)以及小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白(序列識別號67)特異性結合的抗體。
具體地,重組人以及小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白以及人合成scFv-噬菌體展示文庫來按普通方法執行篩選(panning)來挑選了具有與人酸性鞘磷脂酶蛋白或小鼠與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的scFv的噬菌體。對所挑選的scFv進行編碼的核酸序列進行了分析並確認了由此生成的胺基酸序列。以在所確認到的scFv序列的重鏈可變區域以及輕鏈可變區域各自的羧基端(carboxy terminus)連接由分別由序列識別號75以及77所示的鹼基序列組成的小鼠重鏈恆定區域(constant region)以及小鼠輕鏈λ恆定區域的形態表達的方式製備了表達載體。在此情況下,將組成所製備的表達載體所包含的scFv的重鏈可變區域的胺基酸序列以及核酸序列顯示在表1,將輕鏈可變區域的胺基酸序列以及核酸序列顯示在表2。
表1
抗體# | 序列 | 序列識別號 |
#9101 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPNGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAYRFDYWGQGTLVTVSS | 序列識別號1 |
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTATCCTAATGGTGGTAATAAATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAAATGCTTATCGTTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA | 序列識別號2 | |
#9102 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYYMSWVRQAPGKGLEWVSLISPGSGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSWHHFDYWGQGTLVTVSS | 序列識別號3 |
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCGGTTATTATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATTGATCTCTCCTGGTAGTGGTAGTATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAATCTTGGCATCATTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA | 序列識別號4 | |
#9104 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVSGIYYGSGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTPGFDYWGQGTLVTVSS | 序列識別號5 |
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAATTATTATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTATTATGGTAGTGGTAATATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATACGCCTGGGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA | 序列識別號6 | |
#9108 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYPGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVLGLTPKPFDYWGQGTLVTVSS | 序列識別號7 |
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCGATCTATCCTGGTGGTGGTAGTATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGTTTTGGGTCTGACTCCTAAGCCGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA | 序列識別號8 | |
#9113 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSSISPGGSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGASLFDYWGQGTLVTVSS | 序列識別號9 |
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTTATTATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCGATCTCTCCTGGTGGTAGTAGTATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGCGTCTCTGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA | 序列識別號10 | |
#9123 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISYGGGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGGMCTRRQCYYDYGMDVWGQGTLVTVSS | 序列識別號11 |
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCGATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCGATCTCTTATGGTGGTGGTAATATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTTGGTGGTATGTGTACTAGGCGTCAGTGTTATTATGATTATGGTATGGACGTCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA | 序列識別號12 |
表2
抗體# | 序列 | 序列識別號 |
#9101 | QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYADSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIGGLRSEDEADYYCGSWDYSLNAYVFGGGTKLTVL | 序列識別號13 |
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCCAATATTGGCAATAATTATGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTGATAGTAAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCGCTGGCCATCGGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTATAGCCTGAATGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA | 序列識別號14 | |
#9102 | QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNPVYWYQQLPGTAPKLLIYANNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDSSLSGYVFGGGTKLTVL | 序列識別號15 |
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATCCTGTCTACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAATAATCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCTGCTTGGGATTCTAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA | 序列識別號16 | |
#9104 | QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNAVNWYQQLPGTAPKLLIYYDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLSAYVFGGGTKLTVL | 序列識別號17 |
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATGCTGTCAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTATGATAGTCATCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATTATAGCCTGAGTGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA | 序列識別號18 | |
#9108 | QSVLTQPPSASGTPGQRVTLSCTGSSSNIGSNTVYWYQQLPGTAPKLLIYANSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVL | 序列識別號19 |
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCCTCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATACTGTCTACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAATAGTCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTATAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA | 序列識別號20 | |
#9113 | QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNAVSWYQQLPGTAPKLLIYSDNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDASLNAYVFGGGTKLTVL | 序列識別號21 |
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATGCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTCTGATAATAAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTACTTGGGATGCTAGCCTGAATGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA | 序列識別號22 | |
#9123 | QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYDNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDDSLSGYVFGGGTKLTVL | 序列識別號23 |
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATACTGTCAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATAATAGTAAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAAGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTACTTGGGATGATAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA | 序列識別號24 |
在此情況下,表達載體使用了哺乳類表達載體(mammalian expression vector)。在CHO或HEK293細胞株將所製備的表達載體轉化,由此製備了與人酸性鞘磷脂酶蛋白相結合或與人酸性鞘磷脂酶蛋白以及小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白均結合的全長抗體。
實施例2.確定互補性決定區域(complementarity determining region,CDR)
通過常規方法確認了根據上述內容製備的scFv中的互補性決定區域,最終,將重鏈可變區域的CDR序列顯示在表3,將輕鏈可變區域的CDR序列顯示在表4。
表3
抗體# | CDR | 序列 | 序列識別號 |
#9101 | CDR1 | NYAMS | 序列識別號25 |
CDR2 | GIYPNGGNKYYADSVKG | 序列識別號26 | |
CDR3 | NAYRFDY | 序列識別號27 | |
#9102 | CDR1 | GYYMS | 序列識別號28 |
CDR2 | LISPGSGSIYYADSVKG | 序列識別號29 | |
CDR3 | SWHHFDY | 序列識別號30 | |
#9104 | CDR1 | NYYMS | 序列識別號31 |
CDR2 | GIYYGSGNIYYADSVKG | 序列識別號32 | |
CDR3 | DTPGFDY | 序列識別號33 | |
#9108 | CDR1 | NYAMS | 序列識別號34 |
CDR2 | AIYPGGGSIYYADSVKG | 序列識別號35 | |
CDR3 | DVLGLTPKPFDY | 序列識別號36 | |
#9113 | CDR1 | SYYMS | 序列識別號37 |
CDR2 | SISPGGSSIYYADSVKG | 序列識別號38 | |
CDR3 | GASLFDY | 序列識別號39 | |
#9123 | CDR1 | DYAMS | 序列識別號40 |
CDR2 | AISYGGGNIYYADSVKG | 序列識別號41 | |
CDR3 | VGGMCTRRQCYYDYGMDV | 序列識別號42 |
表4
抗體# | CDR | 序列 | 序列識別號 |
#9101 | CDR1 | SGSSSNIGNNYVS | 序列識別號43 |
CDR2 | ADSKRPS | 序列識別號44 | |
CDR3 | GSWDYSLNAYV | 序列識別號45 | |
#9102 | CDR1 | SGSSSNIGNNPVY | 序列識別號46 |
CDR2 | ANNQRPS | 序列識別號47 | |
CDR3 | AAWDSSLSGYV | 序列識別號48 | |
#9104 | CDR1 | TGSSSNIGNNAVN | 序列識別號49 |
CDR2 | YDSHRPS | 序列識別號50 | |
CDR3 | GAWDYSLSAYV | 序列識別號51 | |
#9108 | CDR1 | TGSSSNIGSNTVY | 序列識別號52 |
CDR2 | ANSQRPS | 序列識別號53 | |
CDR3 | GSWDYSLSGYV | 序列識別號54 | |
#9113 | CDR1 | SGSSSNIGNNAVS | 序列識別號55 |
CDR2 | SDNKRPS | 序列識別號56 | |
CDR3 | GTWDASLNAYV | 序列識別號57 | |
#9123 | CDR1 | SGSSSNIGSNTVN | 序列識別號58 |
CDR2 | DNSKRPS | 序列識別號59 | |
CDR3 | GTWDDSLSGYV | 序列識別號60 |
實驗例1.確認與酸性鞘磷脂酶蛋白之間的結合
通過ELISA分析方法確認了與根據上述內容製備的與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體的酸性鞘磷脂酶蛋白之間的結合。
首先,向多方陣96-孔板(Thermo scientific)添加100µl的1µg/ml的重組人酸性鞘磷脂酶蛋白(R&D systems)並在4℃的溫度下放置16個小時,從而塗敷了板。向所塗敷的板添加含有5%的BSA的200µl的PBS,從而在37℃的溫度下進行2個小時的反應來進行預處理,之後用含有0.05%的吐溫20(Tween 20)的PBS進行了3次清洗。其中,進行0.0001nM、0.001nM、0.01nM、0.1nM、1nM、10nM或100nM的抗-酸性鞘磷脂酶抗體處理,在37℃的溫度下進行了1個小時的反應。反應之後,用含有0.05%的吐溫的PBS清洗3次板,作為2次抗體添加了100µl的山羊抗鼠IgG-HRP(Jackson Immunoresearch)抗體。在37℃的溫度下重新對其進行1個小時的反應,用含有0.05%的吐溫的PBS進行了3次清洗。其中,添加了100µl的TMB基質(tetramethylbenzidine),在常溫下追加反應5分鐘,之後用100µl的2N硫酸溶液中斷反應,在450nm的波長下測定了吸光度。最終,將所測定的吸光度顯示在圖2,將由吸光度值計算的抗體的EC
50值顯示在表5。
表5
抗體# | EC 50(nM) |
#9101 | 0.0815 |
#9102 | 0.0954 |
#9104 | 1.948 |
#9108 | 0.3269 |
#9123 | 0.7578 |
如圖2所示,根據上述內容製備的5種抗體均以濃度依賴性地與酸性鞘磷脂酶蛋白相結合。尤其,如表5所示,#9101抗體呈現出最低的EC
50值,與酸性鞘磷脂酶蛋白之間的結合力最高。
實驗例2.確認與酸性鞘磷脂酶蛋白之間的結合親和性
使用Octet® QK384系統(Pall Life Sciences)測定了與根據上述內容製備的與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體的酸性鞘磷脂酶蛋白之間的結合親和性以及相互作用動力學。
首先,通過在AR2G感測器(ForteBio)處理20mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)以及40mM的N-羥基磺基琥珀酸醯亞胺(磺-NHS)溶液來使羧基活性化。另一方面,在10mM的乙酸鈉(pH 5.0,ForteBio)溶液稀釋10µg/ml的重組人酸性鞘磷脂酶蛋白或2.5µg/ml的重組小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白進行了準備。向羧基被活性化的AR2G感測器加上稀釋上述酸性鞘磷脂酶蛋白的溶液來獲得重組人或小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白被固定的AR2G感測器。向所獲得的酸性鞘磷脂酶蛋白被固定的感測器添加1M的乙醇胺(ForteBio)來使得未反應的剩餘羧基非活性化。其中,添加0.4nM、2nM或10nM濃度的在實施例1中製備的抗體並觀察了約900秒為止的反應物的結合相。之後,添加1×動力學緩衝液(kinetics buffer,ForteBio)並觀察了約1200秒鐘的反應物的分離相。使用Octet®分析軟體(Pall Life Sciences)確定了對於各個抗體的締合常數(association constant:Kon)、離解常數(dissociation constant:Kdis)以及平衡解離常數(equilibrium dissociation constant:KD)。最終,將對於重組人酸性鞘磷脂酶蛋白的分析結果顯示在表6,將對於重組小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白的分析結果顯示在表7。
表6
抗體# | KD(M) | Kon(1/Ms) | Kdis(1/s) | RMax | Full R 2 |
#9101 | 1.16E-09 | 6.26E+05 | 7.28E-04 | 0.4527 | 0.9861 |
#9102 | 2.52E-10 | 4.16E+05 | 1.05E-04 | 0.8652 | 0.997 |
#9104 | 2.09E-10 | 3.92E+05 | 8.18E-05 | 0.3324 | 0.9759 |
#9108 | 1.19E-10 | 2.49E+05 | 2.96E-05 | 0.45 | 0.999 |
#9113 | 5.64E-10 | 1.16E+06 | 6.56E-04 | 0.2868 | 0.9635 |
表7
抗體# | KD(M) | Kon(1/Ms) | Kdis(1/s) | RMax | Full R 2 |
#9101 | 4.25E-11 | 3.76E+06 | 1.59E-04 | 0.0185 | 0.5527 |
#9102 | 4.98E-10 | 4.89E+05 | 2.43E-04 | 0.4281 | 0.9944 |
#9104 | 6.38E-10 | 3.10E+05 | 1.98E-04 | 0.7027 | 0.9971 |
#9108 | 3.39E-09 | 4.59E+05 | 1.56E-03 | 0.3921 | 0.9865 |
#9113 | <1.0E-12 | 1.00E+06 | <1.0E-07 | 0 | 0 |
如表6所示,在實施例1中製備的5種抗體以10
-10至10
-9M水準的結合力與人酸性鞘磷脂酶蛋白相結合。另一方面,如表7所示,對於小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白,只有#9102、#9104或#9108的抗體呈現出了10
-10至10
-9M水準的結合力。
實驗例3.確定酸性鞘磷脂酶蛋白的抗原決定部位
通過HDX-MS(hydrogen deuterium exchange mass spectrometry)方法確認了作為本發明的抗體與酸性鞘磷脂酶蛋白相結合的部位的抗原決定部位。
首先,將1000µg/ml的酸性鞘磷脂酶蛋白、1000µg/ml的#9101 mIgG1、1250µg/ml的#9102 mIgG2、1000µg/ml的#9104 mIgG4、1000µg/ml的#9108 mIgG1、3300µg/ml的#9113 mIgG1或2932µg/ml的#9123 mIgG1抗體連續稀釋成2倍,從而準備了128倍稀釋液。
將所準備的稀釋液分別取1µl來與等量的10mg/ml的芥子酸基質(K200 MALDI kit,CovalX)混合來形成混合物,將1µl的上述混合物噴注在SCOUT384MALDI板,並在常溫下實現結晶化而形成結晶。之後,使用MALDI品質分析儀(mass spectrometer)測定了)上述結晶。另一方面,為了得到用於非共價相互作用分析的交聯(cross-link)數據,將1µl的128倍稀釋液與等量的2mg/ml的K200穩定化溶液(K200stabilizer reagent,K200 MALDI kit,CovalX)進行混合,在常溫下對其進行了3個小時的反應。反應結束後,利用1µl的混合液並以與上述方式相同的MALDI品質分析儀進行測定,測定的結果將用高質量MALDI MS(high-mass MALDI MS)模式進行了分析。最終,將確認到與酸性鞘磷脂酶蛋白質內重氫插入存在明顯差異的部位的胺基酸序列顯示在表8,將在與酸性鞘磷脂酶蛋白質結構模型中的抗體結合的與酸性鞘磷脂酶蛋白質的結合位置顯示在圖3。並且,將對於酸性鞘磷脂酶蛋白中的以及蛋白皂角素(saposin)域的各個抗體的重氫置換率熱點圖顯示在圖4。
表8
#抗體 | 肽區域 | 胺基酸序列 |
#9101 | 135-159 | PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF |
#9102 | 135-159 | PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF |
218-228 | SGLGPAGPFDM | |
#9104 | 53-72 | TAINLGLKKEPNVARVGSVA |
135-159 | PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF | |
#9108 | 53-72 | TAINLGLKKEPNVARVGSVA |
135-155 | PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS | |
259-269 | VRKFLGPVPVY | |
#9113 | 53-72 | TAINLGLKKEPNVARVGSVA |
101-123 | VWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGH | |
135-155 | PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS | |
259-269 | VRKFLGPVPVY | |
#9123 | 259-269 | VRKFLGPVPVY |
如表8以及圖3所示,本發明的抗體與從酸性鞘磷脂酶蛋白的N-末端起第53位胺基酸片段至第72位胺基酸片段(序列識別號68:TAINLGLKKEPNVARVGSVA)、第101位胺基酸片段至第123位胺基酸片段(序列識別號69:VWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGH)、第135位胺基酸片段至第159位胺基酸片段(序列識別號70:PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF)、第135位胺基酸片段至第155位胺基酸片段(序列識別號71:PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS)、第218位胺基酸片段至第228位胺基酸片段(序列識別號72:SGLGPAGPFDM)或第259位胺基酸片段至第269位胺基酸片段(序列識別號73:VRKFLGPVPVY)相結合。尤其,如圖4所示,本發明的抗體主要與蛋白皂角素域中的α-螺旋1以及α-螺旋2部位相結合。
無
圖1為示出在本發明一實施例中製備的抗體的重鏈以及輕鏈可變區域胺基酸序列的示意圖。
圖2為通過ELISA分析法對在本發明一實施例中製備的抗體與酸性鞘磷脂酶蛋白之間的結合進行確認的結果圖表。
圖3為在與酸性鞘磷脂酶蛋白質結構模型中表示抗體結合的與酸性鞘磷脂酶蛋白質的結合位置的示意圖。
圖4為以熱點圖示出對於在本發明一實施例中製備的抗體的酸性鞘磷脂酶蛋白蛋白皂角素(saposin)域的重氫替換的結果圖。
無
Claims (18)
- 一種抗體或其抗原結合片段,其中,與酸性鞘磷脂酶(ASM,acid sphingomyelinase)蛋白特異性結合。
- 請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中,上述抗體或其抗原結合片段與選自由從酸性鞘磷脂酶蛋白的N-末端起第53位胺基酸片段至第72位胺基酸片段、第101位胺基酸片段至第123位胺基酸片段、第135位胺基酸片段至第159位胺基酸片段、第135位胺基酸片段至第155位胺基酸片段、第218位胺基酸片段至第228位胺基酸片段以及第259位胺基酸片段至第269位胺基酸片段組成的組中的一個以上的表位相結合。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中,上述抗體或其抗原結合片段與選自由分別由序列識別號68至序列識別號73所示的多肽組成的組中的一個以上的表位相結合。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中,上述抗體或其抗原結合片段包括: 重鏈可變區域,包含由序列識別號61所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1(X 1YX 2MS)、由序列識別號62所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR2(X 3IX 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10YYADSVKG)以及選自由分別由序列識別號27、30、33、36、39以及42所示的胺基酸序列組成的組中的重鏈CDR3;以及 輕鏈可變區域,包含由序列識別號63所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1(X 11GSSSNIGX 12NX 13VX 14)、由序列識別號64所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR2(X 15X 16X 17X 18RPS)以及由序列識別號65所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR3(X 19X 20WDX 21SLX 22X 23YV)。
- 如請求項4之抗體或其抗原結合片段,其中, 上述X 1以及X 2分別選自由天冬醯胺(asparagine,Asn)、甘胺酸(glycine,Gly)、絲胺酸(serine,Ser)、天冬胺酸(aspartic acid,Asp)、丙胺酸(alanine,Ala)以及酪胺酸(tyrosine,Tyr)組成的組, 上述X 3至X 10分別選自由甘胺酸、白胺酸(leucine,Leu)、丙胺酸、絲胺酸、酪胺酸、脯胺酸(proline,Pro)、天冬醯胺、離胺酸(lysine,Lys)以及異白胺酸(isoleucine,Ile)組成的組, 上述X 11至X 14分別選自由蘇胺酸(threonine,Thr)、絲胺酸、天冬醯胺、丙胺酸、脯胺酸以及酪胺酸組成的組, 上述X 15至X 18分別選自由酪胺酸、丙胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、組胺酸(histidine,His)、麩醯胺酸(glutamine,Gln)以及離胺酸組成的組, 上述X 19至X 23分別選自由甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、天冬胺酸以及天冬醯胺組成的組。
- 如請求項5之抗體或其抗原結合片段,其中, 上述X 1為天冬醯胺、甘胺酸、絲胺酸或天冬胺酸, 上述X 2為丙胺酸或酪胺酸, 上述X 3為甘胺酸、白胺酸、丙胺酸或絲胺酸, 上述X 4為酪胺酸或絲胺酸, 上述X 5為脯胺酸或酪胺酸, 上述X 6為天冬醯胺或甘胺酸, 上述X 7以及X 8分別為甘胺酸或絲胺酸, 上述X 9為天冬醯胺或絲胺酸, 上述X 10為離胺酸或異白胺酸, 上述X 11為蘇胺酸或絲胺酸, 上述X 12為天冬醯胺或絲胺酸, 上述X 13為丙胺酸、脯胺酸、蘇胺酸或酪胺酸, 上述X 14為天冬醯胺、酪胺酸或絲胺酸, 上述X 15為酪胺酸、丙胺酸、天冬胺酸或絲胺酸, 上述X 16為天冬胺酸或天冬醯胺, 上述X 17為絲胺酸或天冬醯胺, 上述X 18為組胺酸、麩醯胺酸或離胺酸, 上述X 19為甘胺酸或丙胺酸, 上述X 20為丙胺酸、絲胺酸或蘇胺酸, 上述X 21為酪胺酸、絲胺酸、丙胺酸或天冬胺酸, 上述X 22為絲胺酸或天冬醯胺, 上述X 23為丙胺酸或甘胺酸。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中,上述抗體或其抗原結合片段包括: 重鏈可變區域,包含選自由分别由序列識別號25、28、31、34、37以及40所示的胺基酸序列組成的組中的重鏈CDR1、選自由分別由序列識別號26、29、32、35、38以及41所示的胺基酸序列組成的組中的重鏈CDR2以及選自由分別由序列識別號27、30、33、36、39以及42所示的胺基酸序列組成的組中的重鏈CDR3;以及 輕鏈可變區域,包含選自由分別由序列識別號43、46、49、52、55以及58所示的胺基酸序列組成的組中的輕鏈CDR1、選自由分別由序列識別號44、47、50、53、56以及59所示的胺基酸序列組成的組中的輕鏈CDR2以及選自由分別由序列識別號45、48、51、54、57以及60所示的胺基酸序列組成的組中的輕鏈CDR3。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中,上述抗體或其抗原結合片段包括: 重鏈可變區域,選自由將由分別由序列識別號25、26以及27所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域、將由分別由序列識別號28、29以及30所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域、將由分別由序列識別號31、32以及33所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域、將由分別由序列識別號34、35以及36所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域、將由分別由序列識別號37、38以及39所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號40、41以及42所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域組成的組;以及 輕鏈可變區域,選自由將由分別由序列識別號43、44以及45所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域、將由分別由序列識別號46、47以及48所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域、將由分別由序列識別號49、50以及51所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域、將由分別由序列識別號52、53以及54所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域、將由分別由序列識別號55、56以及57所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域以及將由分別由序列識別號58、59以及60所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域組成的組。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中,上述抗體或其抗原結合片段包括: 將由分別由序列識別號25、26以及27所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號43、44以及45所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域; 將由分別由序列識別號28、29以及30所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號46、47以及48所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域; 將由分別由序列識別號31、32以及33所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號49、50以及51所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域; 將由分別由序列識別號34、35以及36所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號52、53以及54所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域; 將由分別由序列識別號37、38以及39所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號55、56以及57所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域;或 將由分別由序列識別號40、41以及42所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號58、59以及60所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中,上述酸性鞘磷脂酶蛋白源自哺乳動物。
- 如請求項1之抗體或其抗原結合片段,其中,上述酸性鞘磷脂酶蛋白為由序列識別號66或67所示的胺基酸序列組成的多肽。
- 一種核酸,其中,對如請求項1之抗體或其抗原結合片段進行編碼。
- 一種表達載體,其中,包含如請求項12之核酸。
- 一種宿主細胞,其中,包含如請求項12之核酸或如請求項13之表達載體。
- 一種與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段的生產方法,其中,包括通過培養如請求項14之宿主細胞來生產抗體或其抗原結合片段的步驟。
- 一種酸性鞘磷脂酶蛋白檢測用組合物,其中,包含如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 一種酸性鞘磷脂酶蛋白檢測用試劑盒,其中,包含如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 一種酸性鞘磷脂酶蛋白檢測方法,其中,包括使如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段與試樣產生反應的步驟。
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