KR102171950B1

KR102171950B1 - 먹장어 유래 vlrb 검출용 단클론항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102171950B1
Application number: KR1020190117997A
Authority: KR
Inventors: 정태성; 김영림
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2020-10-30

Abstract

본 발명은 기탁번호가 KCTC18759P인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되며, 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptors B)의 stalk 부위에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

먹장어 유래 VLRB 검출용 단클론항체 및 이의 용도{Monoclonal antibody for detecting hagfish VLRB and uses thereof}

본 발명은 먹장어 유래 VLRB 검출용 단클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 기탁번호가 KCTC18759P인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되며, 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptors B)의 stalk 부위에 특이적으로 결합하는 단클론항체에 관한 것이다.

먹장어(hagfish)의 획득면역체계를 이용하여 마우스 항체보다 훨씬 높은 항원결합력을 보이는 새로운 항체개발에 대한 가능성이 이전 연구를 통해 제시되었다. 먹장어는 진화론적으로 최하위 척추동물인 무악류(Jawless vertebrate)의 현존 생명체이다. 최근 이들의 선천면역과 획득면역은 유악류(Jawed vertebrate)와 유사한 기작으로 이루어진다는 사실이 밝혀졌으며, 이들의 임파구-유사 세포로부터 세가지 다른 형태의 VLR(variable lymphocyte receptor)-A, B 및 C가 발견되었다. VLR-A 및 VLR-C는 포유동물의 T-림프구와 같은 역할을, VLR-B는 임파구-유사 세포로부터 분비되는 B-림프구 타입과 같은 역할을 하는 것으로 알려졌다. 특히 포유류의 항체 역할을 주관하는 VLRB 단백질은 포유류의 면역글로불린(immunoglobulin)과 달리 유전자 조립(gene assembly)을 통해 다양성이 유도되지만, 훨씬 간단한 구조의 단일 폴리펩타이드로 발현되고, 그 다양성이 산술적으로 대략 10¹⁴개 이상의 조합이 형성 가능하며 pH, 온도 등과 같은 주변 환경의 변화에 훨씬 안정적인 장점이 있다. 따라서, 먹장어의 획득면역체계를 이용하면 원하는 특정 항원에 대한 맞춤형 항체를 보다 저렴하며, 쉽고, 빠르게 제작할 수 있어, 기존의 항체 시장에 맞설 수 있는 강력한 경쟁적 대체항체 후보물질이 될 것으로 예측되고 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 먹장어 유래 VLRB 단백질의 다양한 응용을 위해, 먹장어 유래 VLRB 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 단클론항체를 개발하고자 하였다.

한편, 한국공개특허 제2018-0078741호에는 '먹장어 유래 VLRB 단백질의 소수성 테일 도메인을 포함하는 다량체 다가 중합체'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2018-0119047호에는 '소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질과 C4bp 올리고머화 도메인이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 먹장어 유래 VLRB 검출용 단클론항체 및 이의 용도에 대해서는 전혀 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 먹장어 유래 VLRB 단백질의 stalk 부위 단백질을 면역원으로 하여 단클론항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주 VLR 12G6을 제조하였으며, 상기 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 단클론항체가 먹장어 유래 VLRB 단백질을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18759P인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되며, 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptors B)의 stalk 부위에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 생산하는 기탁번호가 KCTC18759P인 하이브리도마 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 유효성분으로 포함하는 먹장어 유래 VLRB 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 먹장어 유래 VLRB의 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 유효성분으로 포함하는 먹장어 유래 VLRB 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 먹장어 VLRB 특이적 단클론항체는 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)가 우수하여 먹장어 VLRB 단백질의 검출이 가능하므로, 먹장어 VLRB를 이용한 다양한 응용분야에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 단클론항체 VLR 12G6의 표적인 먹장어 유래 VLRB 단백질의 부위를 보여주는 그림 및 재조합 항원의 발현을 확인한 겔 사진과, 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 제조과정을 보여주는 그림이다.
도 2는 본 발명의 단클론항체 VLR 12G6의 항원(먹장어 VLRB) 인식능을 검증한 웨스턴블랏 결과이다. 11G5; 먹장어 VLRB에 결합하는 단클론항체.
도 3은 본 발명의 단클론항체 VLR 12G6의 항원(먹장어 VLRB) 인식능을 검증한 ELISA 결과이다. 11G5; 먹장어 VLRB에 결합하는 단클론항체.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18759P인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되며, 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptors B)의 stalk 부위에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.

본 발명의 단클론항체에 있어서, 상기 먹장어 유래 VLRB의 stalk 부위는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 기탁번호가 KCTC18759P인 하이브리도마 세포주(VLR 12G6)에 의하여 생산되며, 먹장어 유래 VLRB의 stalk 부위에 특이적으로 결합하는 단클론항체(12G6)는, 동일 항원 표적 단클론항체인 11G5에 비해 민감도가 현저히 증가된 것이 특징이다.

본 발명에 따른 단클론항체는 IgG1의 면역글로불린 아이소타입일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 '단클론항체'란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 단클론항체는 단세포군 항체라고 불리기도 한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.

상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리될 수 있다.

항원을 검출하는데 단클론항체를 사용하는 경우의 이점은 단일 에피토프를 인지함으로써 특정한 상호작용을 갖는다는 것이다.

본 발명의 항체는 또한, 본 발명의 먹장어 유래 VLRB의 stalk 부위에 특이적으로 결합하는 항체의 단편, 재조합 항체, 화학적으로 수식된 항체를 포함한다. 여기서 항체의 단편의 예로서는 Fab, F(ab')2, scFv(중쇄나 경쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 항체), Fv, Fab/c(1개의 Fab와 완전한 Fc를 가지는 항체), 항체를 단백질 절단효소 예컨대, 파파인, 펩신으로 처리하여 얻어진 항체 단편, 단편에 대한 유전자를 유전자 재조합 방법으로 숙주세포에 도입·발현시켜 얻어지는 항체 단편을 포함하는 의미이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 상기 단클론항체를 생산하는 기탁번호가 KCTC18759P인 하이브리도마 세포주를 제공한다.

본 발명의 단클론항체는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2018년 12월 18일자로 기탁된 KCTC18759P인 하이브리도마 세포주(VLR 12G6)로부터 제조된 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 상기 단클론항체를 유효성분으로 포함하는 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptors B) 검출용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 유효성분으로 기탁번호가 KCTC18759P인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 먹장어 유래 VLRB의 stalk 부위에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 유효성분으로 포함하며, 상기 항체를 이용하여 stalk 항원에 대해 형성된 항원-항체 복합체를 검출함으로써 먹장어 유래 VLRB를 면역학적으로 검출할 수 있는 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptors B)의 검출 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 먹장어 유래 VLRB의 stalk 부위 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론 항체 또는 이의 절편의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.

본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.

검출 표지체로서 사용되는 바람직한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 β-락타마제가 있으며, 바람직한 형광물로는 플루오레세인, Eu³⁺, Eu³⁺ 킬레이트 또는 크립테이트가 있으며, 바람직한 리간드로는 바이오틴 유도체가 있고, 바람직한 발광물로는 아크리디늄 에스테르 또는 이소루미놀 유도체가 있으며, 바람직한 미소입자로는 콜로이드 금 또는 착색된 라텍스가 있고, 바람직한 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I 또는 ¹²⁵I-볼톤(Bolton) 헌터(Hunter) 시약이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

항원-항체 복합체를 검출하는 방법은 바람직하게는 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 효소면역흡착법은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 상기 단클론항체를 유효성분으로 포함하는 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptors B) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 검출용 키트는 상기 단클론항체, 기질과 반응하여 발색하는 표지체와 축합된 항체 및 발색기질을 포함한다. 본 발명의 검출용 키트에서 상기 단클론항체는 기판에 흡착된 상태로 제공될 수 있다. 상기 기판으로는 PVDF 막, 플레이트 및 슬라이드가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 표지체로는 HRP, 발색기질로는 TMB가 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 검출용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 검출용 키트의 최종 검출방법으로는 면역크로마토그래피법 래피드 진단법, 효소면역흡착법(ELISA) 또는 웨스턴 블롯이 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 검출용 키트에 사용되는 검출방법은 면역크로마토그래피법(immunochromatography) 및 효소면역흡착법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 먹장어 유래 VLRB를 검출할 수 있는 단클론항체의 제조

BALB/c 마우스(Koatech Inc)를 변치않는 stalk 부위(서열번호 2의 아미노산 서열)를 포함하는 재조합 VLRB 단백질을 이용하여 면역화하였다. stalk 부위를 포함하는 재조합 VLRB 단백질은 상기 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 세포의 배양 용해물로부터 Ni-NTA 친화 컬럼 크로마토그래피(Qiagen, 독일)를 통해 정제하였다. 상기 정제된 단백질(=면역원) 50㎍을 완전 프로인트 애쥬번트(complete Freund's Adjuvant)와 1:1로 혼합하여 복강주사하여 1차 면역화를 시도하고, 2주 간격으로 2차 및 3차 면역화를 수행하였다. 2차 및 3차 면역화시에는 불완전 프로인트 애쥬번트를 사용하였다. 3차 면역화 수행 1주 후, 꼬리 정맥 혈관을 통해 프로인트 애쥬번트 없이 면역원만 주입하여 부스팅시켰다. 3일 후, 면역화된 마우스로부터 비장 세포를 수거하여 PEG(polyethylene glycol)를 사용하여 Sp2/o 골수종(myeloma) 세포(#CRL-1581; ATCC)와 융합시켰다. 융합된 하이브리도마 세포를 마우스 혈액 세포의 피더레이어(feeder layer)를 포함하는 96-웰 플레이트에 배양하였다(도 1). 재조합 VLRB 단백질에 대한 단클론항체는 ELISA 및 웨스턴블랏을 통해 스크리닝하였다.

실시예 1. 단클론항체 12G6의 항원 결합능 검증

기존 먹장어 항체 검출을 위한 마우스 단클론항체 11G5의 검출 민감도를 개선하기 위해 먹장어 항체에 반응하는 마우스 단클론항체의 다른 후보군들을 준비하였으며, 이 중 ELISA 실험을 통해 먹장어 항체에 결합력이 우수한 것으로 스크리닝된 12G6 항체를 이용하여 11G5와 비교 실험을 수행하였다.

먼저 무작위로 선별한 먹장어 항체 유전자들(#1, #2, #3과 #4)을 발현/분비 벡터에 클로닝하고 293 세포주에 도입하여 48시간 후 상층액을 회수하고 분비된 먹장어 항체들을 수득하였다. 수득한 먹장어 항체들을 항원으로 하여, 각각 11G5와 12G6 마우스 단클론항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 10% SDS-PAGE를 통해 각 4 종류의 먹장어 항체를 전기영동으로 분리하였으며 5% 탈지유(in PBST)로 블록킹하고 11G5 또는 12G6 마우스 단클론항체 하이브리도마 상층액을 5% 탈지유(in PBST)와 1:5로 5배 희석하여 처리하였다. 1시간 동안 각각의 항체를 반응시킨 후, 10분간 3회 세척하였다. 발색을 위해 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 마우스 항체 특이 염소 항체 (goat anti mouse IgG-HRP)를 다시 1시간 처리하였고, 그 후 10분 동안 3번 세척한 후 ECL 검출 키트로 발색시켰다. 그 결과, 도 2에서 확인되는 것과 같이, 각 4개의 먹장어 항체 클론은 발현 정도에 차이가 있음을 확인할 수 있었고, 11G5 항체를 이용한 결과에 비해 12G5 항체를 이용한 경우, 동량의 먹장어 항체 단백질을 보다 높은 민감도로 감지할 수 있음을 알 수 있었다.

다음으로, 먹장어 항체를 96 웰 ELISA 플레이트에 농도별로 (0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 및 1,000 ng/well) 코팅하고 11G5 혹은 12G6 마우스 단클론항체 하이브리도마 상층액을 5% 탈지유(in PBST)와 1:5로 5배 희석하여 1시간 동안 처리하였다. TBST로 3번 세척한 다음, HRP가 결합된 마우스 항체 특이 염소 항체를 다시 1시간 처리하고 10분간 5번 세척한 후, TMB/H₂O₂로 발색시키고, 20분 후 황산(H₂SO₄)으로 고정한 후, 450 nm에서 흡광도를 분석하였다. 그 결과, 도 3에서와 같이 12G6 항체가 11G5에 비해 보다 높은 민감도를 나타내었으며, 특히 먹장어 항체를 3 ng 혹은 1 ng 코팅한 경우에서도 결합력을 보이는 것으로 확인되었다. 따라서 상기 웨스턴 블랏과 ELISA 실험을 통해 12G6 항체가 기존의 11G5 항체보다 낮은 농도까지 정확하게 먹장어 항체를 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

한국생명공학연구원

KCTC18759P

20181218

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Monoclonal antibody for detecting hagfish VLRB and uses thereof <130> PN18473 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 222 <212> DNA <213> Eptatretus burgeri <400> 1 cgaagtatca tctgccctac tacgactacc actaccacga cgactaccat gccgaccacg 60 actaccttgc ccaccacgac caagatgtcc atggtgaagg tgccgttggt acctcctgaa 120 gcgttcggcc gtgtcatgaa cgcgtgcgcg tactttcctt catacatctt cctccacctg 180 gtacacggac tcgcggccgt gcccctggtt tacctcatat gt 222 <210> 2 <211> 74 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 2 Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr 1 5 10 15 Met Pro Thr Thr Thr Thr Leu Pro Thr Thr Thr Lys Met Ser Met Val 20 25 30 Lys Val Pro Leu Val Pro Pro Glu Ala Phe Gly Arg Val Met Asn Ala 35 40 45 Cys Ala Tyr Phe Pro Ser Tyr Ile Phe Leu His Leu Val His Gly Leu 50 55 60 Ala Ala Val Pro Leu Val Tyr Leu Ile Cys 65 70

Claims

기탁번호가 KCTC18759P인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되며, 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptors B)의 stalk 부위에 특이적으로 결합하는 단클론항체.
제1항에 있어서, 상기 먹장어 유래 VLRB의 stalk 부위는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 단클론항체.
제1항에 있어서, 상기 단클론항체는 IgG1의 면역글로불린 아이소타입인 것을 특징으로 하는 단클론항체.
제1항의 단클론항체를 생산하는 기탁번호가 KCTC18759P인 하이브리도마 세포주.
제1항의 단클론항체를 유효성분으로 포함하는 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptors B) 검출용 조성물.
제1항의 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptors B)의 검출 방법.
제1항의 단클론항체를 유효성분으로 포함하는 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptors B) 검출용 키트.