KR20180126770A - 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 vlrb 단백질에 칠성장어 유래 vlrb 단백질의 c 말단 서열이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptor B) 단백질을 코딩하는 유전자의 3'-말단에 연결된 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C-말단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 숙주 세포에 의해 생산된, 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질과 칠성장어 VLRB 단백질의 C-말단이 연결된 융합 단백질 및 상기 융합 단백질이 자가조립에 의해 다량체로 이루어진 것을 특징으로 하는, 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가 항체에 관한 것으로, 본 발명의 먹장어 유래 융합 항체는 바이오마커 개발 및 진단 분야에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질에 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C 말단 서열이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도{Fusion protein comprising C-terminus from lamprey VLRB protein linked to hagfish VLRB protein with deleted hydrophobic tail domain and uses thereof}

본 발명은 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질에 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C 말단 서열이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

일반적으로 항체는 대부분의 척추동물에 존재하는 면역글로불린(immunoglobulin, Ig) 형태의 단백질로 알려져 있으며, 항체의 항원 특이적 결합능은 생명공학 및 의약 분야에 다양하게 활용되고 있다. 하지만, 항체는 결합 면적의 한계, 결합부위(epitope) 선택의 제한성, 복잡한 생산 공정 등과 같은 한계점들이 존재한다. 이로 인해 현재 많은 연구자들이 새로운 항체후보를 발굴하기 위한 노력을 아끼지 않고 있다.

최근 가장 오래된 척추동물이자 무악동물인 먹장어(hagfish)와 칠성장어(lamprey)에서 유악류의 후천면역을 담당하는 면역글로불린과 유사한 역할을 하는 VLR(variable lymphocyte receptor) 단백질의 존재가 밝혀졌다. VLR-A 및 VLR-C는 포유동물의 T-림프구와 같은 역할을, VLR-B는 림프구-유사 세포로부터 분비되는 B-림프구 타입과 같은 역할을 하는 것으로 알려졌다. VLR 단백질은 LRR(leucine-rich repeat) 모듈들의 조합으로 형성이 되며, 구성요소로는 아미노 말단(N-말단)부터 SP(signal peptide), LRRNT(N-terminal capped LRR), LRRVs(variable LRRs), CP(connecting peptide), LRRCT(C-terminal capped LRR), Stalk 그리고 HP(hydrophobic tail) 도메인이 있다. 이 중 항원을 인지하는 부분인 LRRV 모듈은 1개에서부터 최대 9개까지 포함되는 것으로 알려져있다. 체세포 재구성(somatic rearrangement)에 의해 모듈이 조합되는 VLR 단백질은 이론적으로 약 10¹⁴개 이상의 다양성을 보유한다고 밝혀졌다.

먹장어와 칠성장어에서 새로운 형태의 항체인 VLR 단백질이 동정된 이후 Ig 단백질을 대체할 많은 시도들이 진행되어 왔다. 하지만, 이러한 시도들은 오직 칠성장어의 VLR 단백질만을 이용하여 진행되어 왔는데, 이는 전반적으로 유사한 구조를 가진 칠성장어 또는 먹장어 유래 VLR 단백질의 구조 중, 매우 상이한 서열을 가진 C-말단(C-terminus) 도메인 때문이다. 소수성 아미노산들에 의해 높은 소수성을 띄는 먹장어 VLR의 C-말단 부위와는 다르게 칠성장어 VLR의 C-말단에는 이황화결합을 유도하는 시스테인 잔기들과 GPI(Glycosylphosphatidylinositol) 절개 서열이 존재한다. 상기와 같은 특성으로 인해 칠성장어의 VLR은 분비형의 8 합체 혹은 10 합체의 VLR 복합체들이 형성된다.

이에, 본 발명에서는 먹장어 항체 VLRB 단백질에서 항원과 결합할 수 있는 부위는 그대로 유지하면서 소수성의 C-말단 부위를 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C-말단으로 치환하여, 보다 높은 분비능과 보다 높은 항원 결합력을 부여하고자 하였다.

한편, 한국공개특허 제2009-0024648호에는 'LRR 패밀리 단백질간의 융합방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2016-0147787호에는 '인간화 가변 림프구 수용체(VLR) 및 이와 관련된 조성물 및 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질에 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C 말단 서열이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 먹장어 항체 VLRB 단백질 중 항원과의 결합 부위는 유지하면서, C-말단의 소수성 테일 도메인을 칠성장어 항체 VLRB 단백질의 C-말단으로 치환한 융합 단백질을 제조하였다. 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킨 결과, 본 발명의 융합 단백질이 숙주 세포 내에서 8합체 또는 10합체의 다량체 형태로 형성되는 것을 확인하였고, 상기 다량체 형태의 먹장어 항체가 동일한 항원 인식 부위를 가진 단일체(모노머) 먹장어 항체에 비해 표적 항원에 대한 결합능이 현저히 높음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptor B) 단백질을 코딩하는 유전자의 3'-말단에 연결된 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C-말단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 숙주 세포에 의해 생산된, 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질과 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C-말단 도메인이 연결된 융합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질의 자가조립에 의해 8합체 또는 10합체의 다량체로 이루어진 것을 특징으로 하는, 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가(multivalent) 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 융합 단백질의 8합체 또는 10합체의 다량체를 수득하는 단계를 포함하는, 표적 항원데 대한 결합력이 증가된 다가 항체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 다가 항체를 표적 항원 함유 의심 시료에 처리하여 표적 항원을 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 다가 항체를 유효성분으로 함유하는 표적 항원 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 항체는 단순한 먹장어 항체가 아니라 항원과의 결합부위를 8개 혹은 10개를 가짐으로써 항원-항체 결합력이 극대화되고, 소수성 테일 도메인이 제거됨으로써 숙주 세포 내에서 발현율이 증가되었으며, 항체 자체의 안정성 또한 증가되는 장점이 있다. 마우스 항체와는 달리 먹장어 항체는 단일 펩타이드로 이루어져 있어 유전자 조작이 자유로워 그 응용가능성이 무궁무진하므로, 본 발명의 먹장어 유래 융합항체는 항원에 대한 높은 결합력과 특이성을 이용하여 바이오마커 개발 및 진단 분야에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 야생형 VLRB 단백질 발현 또는 VLRB 융합 단백질 발현에 이용된 pKINGeo/ccdB 및 pTEL의 벡터맵이다.
도 2는 야생형 먹장어 VLRB 단백질의 구조(A) 및 무작위로 선별된 야생형 먹장어 VLRB 단백질이 형질도입된 HEK 293-F 세포의 세포배양액과 세포 용해물의 웨스턴 블롯팅 결과(B)이다.
도 3은 먹장어 VLRB 단백질의 소수성 C-말단을 칠성장어 VLRB 단백질의 C-말단 서열로 치환하기 위한 실험 모식도(A)와 칠성장어 C-말단이 융합된 먹장어 VLRB 융합 단백질의 발현 패턴을 환원 및 비환원 조건에서 확인한 웨스턴 블롯팅 결과(B)이다.
도 4는 칠성장어 VLRB 단백질의 C-말단 서열로 치환된 먹장어 VLRB 융합 단백질 제조를 위해 VHSV로 면역화한 먹장어로부터 유래한 VLR 라이브러리를 클로닝한 pTEL 플라스미드의 확인 결과(A 및 B)와, 선별된 각 클론들을 형질도입한 293-F 세포의 세포배양액을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과(C)이다.
도 5는 칠성장어 VLRB 단백질의 C-말단 서열로 치환된 먹장어 VLRB 융합 단백질 각 클론들의 VHSV 특이적 결합능을 ELISA로 확인한 결과이다.
도 6은 칠성장어 VLRB 단백질의 C-말단 서열로 치환된 먹장어 VLRB 융합 단백질 클론들 중, VHSV 특이적 결합능을 가진 것으로 선별된 43LC와 7LC의 중합체 형성 유무를 확인한 결과(A)와, VHSV 외 다른 종류의 항원에 대한 결합능을 ELISA로 확인한 결과(B 및 C) 및 43LC와 7LC를 1차 항원으로 사용한 웨스턴 블롯팅 결과(D)이다. 43LC 또는 7LC; 칠성장어 VLRB 단백질의 C-말단 서열로 치환된 먹장어 VLRB 융합 단백질 43 클론 또는 7 클론 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질도입된 293-F 세포의 세포배양액, AIV; 조류인플루엔자 바이러스, HA; 헤마글루티닌, AgX; 항원 무처리, VNNV; 바이러스성 신경 괴사증 바이러스, G protein; VHSV의 표면 당단백질.
도 7은 VHS 바이러스를 감염시킨 HINAE 세포에 43LC와 7LC를 처리하고, 반응 정도를 면역세포화학분석을 통해 확인한 결과이다.
도 8은 43LC와 43LC의 먹장어 VLRB 부분만을 발현하는 단일체(mono 43)를 환원 및 비환원 조건에서 전기영동하여 확인한 결과이다.
도 9는 43LC와 43LC의 먹장어 VLRB 부분만을 발현하는 단일체(mono 43)의 항원 특이적 결합능을 ELISA를 통해 확인한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptor B) 단백질을 코딩하는 유전자의 3'-말단에 연결된 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C-말단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질은 N-말단(N-terminus)에서 C-말단(C-terminus)으로 신호 펩타이드(SP), LRRNT(N-terminal capped LRR), LRR(leucine-rich repeat), LRRVs(variable LRR modules), CP(connecting peptide), LRRCT(C-terminal capped LRR) 및 Stalk 도메인으로 이루어진 단백질일 수 있으며, 항원 인식 부위인 LRRVs와 LRRCT 도메인을 포함하고 있어 표적 항원에 대한 결합능이 있는 VLRB 단백질이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질은 신호 펩타이드가 뮤린(murine) 면역글로불린 κ 사슬 리더 서열(leader sequence)인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 재조합 단백질의 세포 외 분비능을 보다 향상시킬 수 있는 시그널 펩타이드 또는 서열이면 그 종류에 제한없이 사용가능하다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 뮤린 면역글로불린 κ 사슬 리더 서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 상기 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질을 코딩하는 유전자는, 표적하는 항원에 대해 결합력이 가장 우수한 VLRB 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 표적 항원으로 면역화된 먹장어의 VLRB cDNA 라이브러리로부터 유래할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C-말단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 칠성장어 VLRB 단백질의 C-말단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

칠성장어 VLRB 단백질의 C-말단 도메인은 시스테인(cystein, Cys) 잔기가 8개 존재하며, GPI(Glycosylphosphatidylinositol) 절개서열이 존재한다. 이와 같은 특성으로 인해 칠성장어 VLRB 단백질은 8~10개의 단일체(monomer)가 합쳐진 400 kDa 정도의 VLRB 다량체로 형성되어져 세포 표면에 발현되고, 또한 혈청 속으로 분비되게 된다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

본 발명의 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질을 코딩하는 유전자와 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C-말단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

상기 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 대장균(Escherichia coli) Rosetta, 대장균 JM109, 대장균 BL21, 대장균 RR1, 대장균 LE392, 대장균 B, 대장균 X 1776, 대장균 Dα, 대장균 W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 및 동물세포(예컨대, HEK(Human embryonic kidney) 293, CHO(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 숙주 세포에 의해 생산된, 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptor B) 단백질과 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C-말단 도메인이 연결된 융합 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 융합 단백질은 먹장어 유래 VLRB 단백질의 stalk 도메인의 C-말단에 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C-말단 도메인이 연결된 융합 단백질이다.

본 발명은 또한, 상기 융합 단백질이 자가조립에 의해 8합체 또는 10합체의 다량체로 이루어진 것을 특징으로 하는, 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가(multivalent) 항체를 제공한다. 본 발명의 다가 항체는, 표적 항원에 대한 결합능은 유지하면서 C-말단의 소수성 테일 도메인이 칠성장어의 C-말단 서열로 치환된 먹장어 VLRB 융합 단백질이 8합체 또는 10합체의 다량체 형태로 이루어진 것으로, 시스테인(cystein) 잔기가 풍부한 칠성장어 C-말단 도메인에 의해 8합체 또는 10합체 등의 다량체 형태를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 다량체, 복합체 또는 중합체는 서로 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명의 다가 항체는 먹장어 항체인 VLRB 단백질을 8개 혹은 10개 포함하고 있어, 항원 결합능이 현저히 증가된 다가 항체이다.

본 발명은 또한,

(a) 본 발명의 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 배양한 숙주 세포 또는 이의 배양액으로부터 융합 단백질의 8합체 또는 10합체의 다량체를 수득하는 단계를 포함하는, 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가(multivalent) 항체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 상기 다가 항체의 제조방법은 구체적으로, 면역원 또는 항원을 먹장어에 주사하여 면역화시키고, 면역화된 먹장어의 혈액을 채취하여 림프구를 분리하고, 림프구의 총 RNA를 추출하여 이를 기반으로 성숙한 VLRBs의 mRNA를 확보한 후, 이를 주형으로 중합효소연쇄반응을 수행하여 카복시 말단의 소수성 부위를 제외한 VLRBs의 cDNA 풀(pool)을 준비하였다. 상기와 같이 준비된 cDNA의 각 클론들을 칠성장어 VLRB의 C-말단 염기서열을 포함하고 있는 pTEL 벡터(도 1B)로 클로닝하여 각기 다른 항원 인식 서열을 가진 먹장어 VLRBs와 칠성장어 VLRB의 C-말단이 연결된 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제작하였다. 그 후, 각 재조합 발현 벡터로 293-F 세포를 형질도입(transfection)시키고, 형질도입된 293-F 세포를 배양한 후, 배양액을 수득하여 면역원 또는 항원과의 반응성을 ELISA 실험을 통해 확인하였다. 최종적으로 면역원 또는 항원과의 결합력이 우수한 클론들을 선별하고, 선별된 클론들의 배양액을 비환원 및 환원 조건에서 웨스턴 블롯팅하여 융합단백질이 다량체로 형성된 것을 확인하였다. 상기 면역원 또는 항원은 이에 한정하지 않으나, 바이러스, 미생물 등일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가 항체를 제공한다.

본 발명의 상기 다가 항체는 먹장어 VLRB 단백질에서 표적 항원에 대한 결합능은 유지하면서 소수성 테일 도메인이 칠성장어 VLRB 단백질의 C-말단 서열로 치환된 융합 단백질이 8합체 또는 10합체의 다량체 형태로 이루어진 것으로, 표적 항원과 결합할 수 있는 먹장어 VLRB 단백질을 8개 또는 10개 포함하고 있어, 단일체에 비해 항원 결합능이 현저히 증가된 다가 항체이다.

본 발명은 또한, 상기 다가 항체를 표적 항원 함유 의심 시료에 처리하여 표적 항원을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 표적 항원 검출 방법에서, 상기 항원은 이에 한정되지 않으나, 바이러스 또는 미생물일 수 있다.

본 발명의 표적 항원 검출 방법에서, 상기 시료는 음식물, 물, 특정 또는 불특정 미생물을 포함하는 용액, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 표적 항원 검출 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 검출하고자 하는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 본 발명의 다가 항체를 이용하여 실시될 수 있다. 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 표적 항원 존재 여부를 검출하는데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 방법에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 다가 항체와 표적 항원과의 결합체 검출은 간접(indirect) ELISA(direct enzyme linked immunosorbent assay) 또는 샌드위치(sandwich) ELISA 방법을 통해 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 간접 ELISA 방법 및 샌드위치-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 다가 항체의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다.

또한, 본 발명은 상기 다가 항체를 유효성분으로 함유하는 표적 항원 검출용 조성물 및 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 표적 항원 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 표적 항원 검출용 조성물은 표적 항원에 대한 결합능은 유지하면서 소수성 테일 도메인이 칠성장어 유래의 것으로 치환된 먹장어 VLRB 융합 단백질이 다량체 형태로 이루어진 다가 항체를 유효성분으로 포함하고 있으며, 상기 검출용 조성물을 포함하는 본 발명의 키트는 이에 한정되지는 않으나, 바람직하게는 면역분석용 키트이며, 상기 면역분석용 키트는 직접-ELISA, 간접-ELISA, 샌드위치-ELISA, 단백질 마이크로어레이, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay) 등일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 야생형 먹장어 VLRB 단백질의 세포 외부로의 분비 효율 분석

먹장어(hagfish) VLRB 단백질의 C-말단(C-terminus)은 소수성(hydrophobicity)이 높은 아미노산들로 구성되어져 있음을 확인하였다(도 2A). 먹장어 혈액의 mRNA로부터 합성된 cDNA로부터 온전한 형태의 VLRB 유전자들을 PCR로 증폭한 뒤 pKINGeo/ccdB 벡터에 클로닝하였다. 이 중 무작위로 선별된 플라스미드를 293-F 세포주에 형질도입(transfection)하여 VLRB 단백질들을 발현시켰다. 형질도입 2일 후, 세포배양액(supernatant)과 세포(pellet)들을 각각 따로 분리하여 회수하였다. 세포배양액은 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 찌꺼기들을 제거한 뒤 동결건조기로 10배 농축하였다. 회수된 세포는 프로테아제 저해제 칵테일(protease inhibitor cocktail)이 함유된 세포 용해액(Promega, 미국)을 처리하여 세포내 단백질들이 용출되도록 유도하였다. 상기와 같이 준비된 세포배양액과 세포 시료를 1% β-mercaptoethanol(이하, 2-ME)이 포함된 로딩버퍼에 섞어 전기영동 하였다. 전기영동 후 PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼한 다음, 먹장어 VLRB 단백질을 검출할 수 있는 마우스 항-VLRB 항체 11G5를 이용하여 VLRB 단백질을 확인하였다. 그 결과, 선별된 8개의 클론들 모두 세포 펠렛에서 재조합된 VLRB 단백질이 관찰되었지만, 세포배양액에서는 일부 클론에서만 VLRB 단백질이 확인되었다(도 2B). 상기의 결과는 야생형 먹장어 VLRB 단백질이 세포 외부로 분비되는 효율이 낮음을 의미하였다.

실시예 2. 먹장어 VLRB의 C-말단 서열 치환

본 발명에서는 먹장어 VLRB의 C-말단 서열을 칠성장어 VLRB의 C-말단 서열로 치환하여 먹장어 VLRB 단백질의 세포 외부로의 낮은 분비 효율을 극복하는 동시에 복합체 형성을 유도하여 항원에 대한 VLRB 항체의 결합능 향상을 도모하였다.

먼저, 인체 세포주를 통한 재조합 단백질 발현 시스템을 확립하기 위해 외래 유전자 발현율이 가장 높다고 알려진 인간 배아 신장 세포주(HEK, Human embryonic kidney)에서 유래된 세포주 중, 부유 형태(suspension)로도 생장이 가능하며 외래 단백질의 발현양이 높은 293-F 세포주를 선택하여 사용하였다. 인체 세포주에서 발현 가능한 벡터 시스템 개발을 위해 본 발명자들은 pTracer-EF/V5-His(# V887-20, Invitrogen, 미국) 벡터를 기본 골격으로 하여 재조합 발현 벡터를 제작하였다. 먼저, 외래 단백질의 세포 외부로의 분리를 위해, 분비신호 펩타이드를 도입하였다. 이를 위해, pSecTag2A(# V900-20, Invitrogen) 벡터로부터 뮤린(murine) Ig κ 사슬 리더 서열을 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭시키고, VLRB 유전자 도입을 용이하게 하기 위한 Sfi I 제한효소 자리가 양 말단에 위치한 Cm/ccdB 유전자를 pEF-DEST 게이트웨이 벡터(#12285-011, Invitrogen)로부터 분리해내어 연결시키고, pTracer-EF/V5-His 벡터의 Kpn I과 Not I 사이에 클로닝하여 pKINGeo/ccdB 벡터를 제작하였다(도 1A).

그 후, 먹장어 VLRB의 C-말단 서열을 칠성장어 VLRB의 C-말단 서열(lamprey C-term, 이하 LC)로 치환하기 위해 PCR 기법을 통해 임의로 선정된 먹장어 VLRB 유전자의 stalk 부분 뒤에 LC 서열을 융합하였다(도 3A).

칠성장어 VLRB의 C-말단 융합을 위한 프라이머 세트

프라이머명	염기서열(5'→3')	서열번호
Primer SP	CAGGTACCATGGAGACAGACACACTCCTG	3
Primer 1	TTGTGCAGGCGGGCTTTCCGCAGTCGCCACCGTCCGCGCACGCGTTCATGACACG	4
Primer 2	CGGAAAGCCCGCCTGCACAACTCTCCTGAACTGCGCGAATTTCCTCAGCTGCCT	5
Primer 3	TCAACGTTTCCTGCAGAGGGCGCAGGTCGAGCAGAGGCAGCTGAGGAAATTCGC	6

상기 PCR 산물을 pKINGeo/ccdB 벡터로 클로닝한 뒤 293-F 세포주로 형질도입하여 발현 패턴을 확인하였다. 그 결과, LC 융합 먹장어 VLRB 재조합 단백질은 세포배양액과 세포용해물 모두에서 검출되었으며(도 3B), 특히, 야생형 먹장어 VLRB의 경우와 비교하여 세포 외부로 분비되는 VLRB 단백질의 양이 많은 것으로 확인되었다. 또한, 비환원 조건에서 전기영동된 결과에서는 단량체 크기를 비롯하여 여러 종류의 복합체 형태(2합체, 4합체, 8합체 및 10합체)의 VLRB가 확인되었다.

실시예 3. 칠성장어 C-말단 서열로 치환된 먹장어 VLRB 융합 단백질의 발현 경향 분석

LC 서열을 이용하여 라이브러리 형태의 먹장어 VLRB 단백질들을 생산하기 위해 LC 서열을 포함하는 pTEL 벡터를 제작하였다. pTEL 벡터는 pKINGeo/ccdB 벡터를 뼈대로 하여 기존의 V5 및 6 x His 태그 서열을 대신해 LC 서열을 도입함으로써, 클로닝되는 라이브리러 형태의 VLRB 유전자들이 LC 서열과 같이 발현될 수 있도록 제작하였다(도 1B).

먹장어 혈액 내의 림프구로부터 총 RNA를 추출하고, 이를 주형으로 라이브러리 형태의 VLRBs cDNA를 확보하였다. 확보된 VLRB 유전자를 pTEL 벡터에 클로닝한 후, E.coli DH5α 컴피턴트 세포로 형질주입(transformation)하였다. 무작위로 선택된 콜로니들로부터 다양한 크기의 VLRB 삽입 유전자들을 확인함으로써 라이브러리를 검증하였다(도 4B). 무작위로 선택된 VLRB 플라스미드들을 293-F 세포주로 각각 형질도입하여 발현 패턴을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. 형질도입 3일 후 세포배양액들을 모아 2-ME를 첨가하지 않은 비환원 조건으로 전기영동을 실시하였다. 그 결과, 3개의 클론(3LC, 6LC, 14LC)을 제외한 나머지 11개의 클론에서 VLRB 단백질의 발현을 확인할 수 있었다(도 4C). 특히, LC 융합 VLRB 단백질이 발현된 모든 클론에서 2배체 이상의 복합체들이 관찰되었으며, 발현 정도의 차이는 있지만 모두 8배체 또는 10배체의 복합체를 포함하고 있는 것으로 확인되었다. 이상의 결과로부터 본 발명자들은 pTEL 벡터에서 생산된 LC 융합 VLRB 단백질들은 높은 비율로(78.6%) 세포배양액으로 VLRB 단백질을 분비하며 이들 대부분이 복합체 형태를 이룬다는 것을 확인하였다.

실시예 4. 표적 항원 특이적 결합능을 가진 융합 단백질 스크리닝

바이러스성 출혈성 패혈증(VHS)의 원인체인 VHSV(Viral Hemorrhagic Septicemia virus)는 국내에서 겨울과 봄의 저수온기에 양식 넙치에 주로 감염되어 피해를 일으킨다고 알려져 있으며 그 사례가 점점 증가하고 있는 추세이다. 본 발명자들은 VHSV에 대한 먹장어 VLRB 항체를 제작하기 위해 VHSV를 면역화한 먹장어로부터 VLRB 라이브러리를 얻어 pTEL 벡터로 클로닝하였다. 재조합 플라스미드는 E.coli DH5α 컴피턴트 세포로 형질전환시킨 후 증폭시켜, 293-F 세포주로 각각 형질도입하였다. VHSV에 특이적인 VLRB 항체를 찾기 위해 형질도입 3일 후의 세포배양액을 이용하여 ELISA를 실시하였다.

실험은 VHSV(200 ng) 또는 HEL(20 ng) 항원이 코팅된 멀티 웰 플레이트를 3% 탈지유 용액으로 블록킹한 뒤 형질도입된 293-F 세포 배양 상층액을 처리하였다. 총 96개의 클론들 중 VHSV에 대해 가장 높은 반응성을 보인 두 개의 클론, 43LC와 7LC를 선별하였다. VHSV와 HEL에 모두에서 비특이적 결합능을 가지는 7LC 클론과 VHSV에서 특이적 반응성을 보이는 43LC의 추가 실험을 위해 2번의 스트리킹 과정을 거친 후 DNA prep 키트로 높은 순도의 DNA를 추출하였다. 본 발명자들은 이 두가지 클론들의 아미노산 서열을 분석하였고, 웨스턴 블롯팅을 통해 293-F 세포주로부터의 발현 패턴을 분석하였다.

융합 단백질 43LC 및 7LC의 서열 분석 결과

	43LC	7LC
LRR1	VLWLGGNKIPSLPHGVFD (서열번호 7)	VLQLQGNKLQSLPSGVFD (서열번호 14)
LRRv1	KLTSLTLLSLHTNQLQSLPDGVFD (서열번호 8)	KLTQLTYLSLSTNQLQSLPNGVFD (서열번호 15)
LRRv2	KLTSLTLLSLHTNQLQSLPSGVFD (서열번호 9)	KLTQLTVLGLQTNQLKSVPDGVFD (서열번호 16)
LRRv3	KLTELKELRLYENKLQSLPHGVFD (서열번호 10)	-
LRRv4	KLTQQLKDLRLHQNQLKSVPDGVFD (서열번호 11)	-
CP	RLTSLQTIYLYSNP (서열번호 12)	RLTSLQKIYLYSNP (서열번호 17)
LRRCT	WDCTCPGVDYLSRWLHTNSKKETSDSAKCSGSGFPVRSIICP (서열번호 13)	WDCTCPGIRYFSEWINKHSGVVRDSSNNVNPDSAKCSGSGKPVRSIICP (서열번호 18)

이 두 클론은 항원을 인식하는데 중요한 역할을 하는 LRRv 모듈에서 큰 차이를 보였으며, 총 4개의 LRRv 모듈을 포함하는 43LC에 비해 7LC는 2개의 LRRv 모듈을 가지는 것으로 확인되었다(표 2). 또한, 이러한 모듈 갯수의 차이에 의해 재조합 된 43LC의 분자량이 7LC 보다 큰 것으로 웨스턴 블롯을 통해 확인되었다(도 6A).

선별된 두 개의 클론들이 ELISA에서 비특이적 결합능을 보였기에 다양한 항원을 이용해서 이들의 항원 특이성을 살펴보았다. VHSV, AIV(조류인플루엔자 바이러스), HA(헤마글루티닌) 및 HEL 항원으로 코팅한 웰 그리고 항원을 코팅하지 않은 웰(AgX)에 대해 43LC 및 7LC 클론들의 반응성을 검사해본 결과, 7LC는 항원의 종류에 상관없이 높은 OD값을 보여 비특이적인 결합능을 가진 클론으로 확인된 반면, 43LC는 약간의 OD값을 보였지만 VHSV에 가장 높은 결합능을 보이며 항원 특이적 반응성이 있음을 확인하였다(도 6B). 상기에서 관찰된 비특이적 반응성을 제거하기위해 43LC 및 7LC에 5% 탈지유 용액을 1:1의 비율로 처리한 뒤 ELISA를 실시하였다. 그 결과 VHSV와 특이적 결합능을 가지는 43LC 클론의 비특이적 결합성이 더 낮게 확인되었으며 7LC 클론은 모든 항원과의 반응성이 거의 없는 것으로 나타났다(도 6C). 43LC가 인지하는 VHSV 항원의 부위를 알아보기 위해 VHSV 항원 및 VHSV 표면 당단백질(G 단백질)에 대한 43LC의 결합능을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. 간단하게, PVDF 멤브레인에 각 항원들을 전이시킨 뒤 43LC와 7LC 클론들을 각각 1차 항체로 처리하고, 먹장어 VLRB의 stalk 부위를 인식할 수 있는 항-마우스 항체(11G)를 2차 항체로 처리하였다. 그 결과, 7LC를 1차 항체로 처리한 멤브레인에서는 아무 반응이 확인되지 않은 반면, 43LC를 1차 항체로 처리한 멤브레인에서는 VHSV와 재조합 G 단백질이 확인되었다(도 6D). 상기의 결과로부터, 43LC 클론은 VHS 바이러스의 외막 단백질인 G 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 알 수 있었다.

또한, 넙치 유래의 HINAE(Hirame natural embryo cell) 세포주에 1X10⁵ TCID50/ml 농도의 VHSV를 감염시키고 증폭된 VHS 바이러스에 대한 43LC 클론의 결합능을 면역세포화학분석을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 7에서 보이는 바와 같이 43LC가 VHS 바이러스에 특이적으로 결합되어 녹색의 형광이 확인되었다. 그리고 앞선 결과와 일치하게 7LC를 처리한 세포에서는 아무런 형광이 관찰되지 않았다.

실시예 5. 표적 항원 특이적 결합능을 가진 융합단백질의 단일체 및 중합체의 항원 결합능 비교

43LC 클론의 중합체 형성을 유도하는 LC 부위의 존재 유무에 따른 중합체 형성 여부를 조사하였다. 도 8에서 보이는 바와 같이 LC 부위가 포함된 43LC와 유전적으로 LC 부위를 결실시킨 mono 43 단백질은 2-ME를 처리하지 않는 비환원 조건에서 각각 복합체 및 단일체 형태로 확인되었으며, 2-ME를 처리한 환원 조건에서는 모두 단일체 형태로 분리된다는 결과를 확인하였다.

이 두가지 항체, 즉 단일체 형태인 mono 43과 중합체 형태의 43LC의 VHSV-특이적 결합능을 ELISA로 조사해 본 결과, 중합체인 43LC에서만 VHSV에 대해 특이적으로 높은 결합능이 관찰되었다(도 9).

본 발명의 소수성 테일 도메인이 칠성장어 VLRB의 C-말단 서열로 치환된 먹장어 유래 VLRB 항체는, 형질도입된 세포에서 발현 시 복합체 형태로 형성되었으며, 야생형 VLRB 대비 증가된 세포 외 분비능과, 동일한 항원 인식 서열을 가진 단일체 대비 현저히 증가된 표적 항원 결합능이 있음을 보여주었다. 본 발명의 방법을 통해 선별된 VLRB 항체들은 추후 마우스 항체와 같이 다양한 항체 관련 실험에 활용될 수 있을 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY IMMUCELL CO., LTD. <120> Fusion protein comprising C-terminus from lamprey VLRB protein linked to hagfish VLRB protein with deleted hydrophobic tail domain and uses thereof <130> PN17036 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 63 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gac 63 <210> 2 <211> 102 <212> DNA <213> Lampetra japonica <400> 2 gacggtggcg actgcggaaa gcccgcctgc acaactctcc tgaactgcgc gaatttcctc 60 agctgcctct gctcgacctg cgccctctgc aggaaacgtt ga 102 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caggtaccat ggagacagac acactcctg 29 <210> 4 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttgtgcaggc gggctttccg cagtcgccac cgtccgcgca cgcgttcatg acacg 55 <210> 5 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cggaaagccc gcctgcacaa ctctcctgaa ctgcgcgaat ttcctcagct gcct 54 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcaacgtttc ctgcagaggg cgcaggtcga gcagaggcag ctgaggaaat tcgc 54 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 7 Val Leu Trp Leu Gly Gly Asn Lys Ile Pro Ser Leu Pro His Gly Val 1 5 10 15 Phe Asp <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 8 Lys Leu Thr Ser Leu Thr Leu Leu Ser Leu His Thr Asn Gln Leu Gln 1 5 10 15 Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp 20 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 9 Lys Leu Thr Ser Leu Thr Leu Leu Ser Leu His Thr Asn Gln Leu Gln 1 5 10 15 Ser Leu Pro Ser Gly Val Phe Asp 20 <210> 10 <211> 24 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 10 Lys Leu Thr Glu Leu Lys Glu Leu Arg Leu Tyr Glu Asn Lys Leu Gln 1 5 10 15 Ser Leu Pro His Gly Val Phe Asp 20 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 11 Lys Leu Thr Gln Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu His Gln Asn Gln Leu 1 5 10 15 Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp 20 25 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 12 Arg Leu Thr Ser Leu Gln Thr Ile Tyr Leu Tyr Ser Asn Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 42 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 13 Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Val Asp Tyr Leu Ser Arg Trp Leu His 1 5 10 15 Thr Asn Ser Lys Lys Glu Thr Ser Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser 20 25 30 Gly Phe Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro 35 40 <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 14 Val Leu Gln Leu Gln Gly Asn Lys Leu Gln Ser Leu Pro Ser Gly Val 1 5 10 15 Phe Asp <210> 15 <211> 24 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 15 Lys Leu Thr Gln Leu Thr Tyr Leu Ser Leu Ser Thr Asn Gln Leu Gln 1 5 10 15 Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp 20 <210> 16 <211> 24 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 16 Lys Leu Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Leu Gln Thr Asn Gln Leu Lys 1 5 10 15 Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp 20 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 17 Arg Leu Thr Ser Leu Gln Lys Ile Tyr Leu Tyr Ser Asn Pro 1 5 10 <210> 18 <211> 49 <212> PRT <213> Eptatretus burgeri <400> 18 Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr Phe Ser Glu Trp Ile Asn 1 5 10 15 Lys His Ser Gly Val Val Arg Asp Ser Ser Asn Asn Val Asn Pro Asp 20 25 30 Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys 35 40 45 Pro

Claims (10)

1. 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptor B) 단백질을 코딩하는 유전자의 3'-말단에 연결된 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C-말단 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 신호 펩타이드(SP), LRRNT(N-terminal capped LRR), LRR(leucine-rich repeat), LRRVs(variable LRR modules), CP(connecting peptide), LRRCT(C-terminal capped LRR) 및 Stalk 도메인으로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
3. 제2항에 있어서, 상기 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질은 신호 펩타이드(SP)가 뮤린(murine) 면역글로불린 κ 사슬 리더 서열인 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
4. 제1항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
5. 제4항의 숙주 세포에 의해 생산된, 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB(variable lymphocyte receptor B) 단백질과 칠성장어 유래 VLRB 단백질의 C-말단 도메인이 연결된 융합 단백질.
6. 제5항의 융합 단백질이 자가조립에 의해 8합체 또는 10합체의 다량체로 이루어진 것을 특징으로 하는, 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가(multivalent) 항체.
7. (a) 제1항의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계의 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
   (c) 상기 (b) 단계의 배양한 숙주 세포 또는 이의 배양액으로부터 융합단백질의 8합체 또는 10합체의 다량체를 수득하는 단계를 포함하는, 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가(multivalent) 항체의 제조방법.
8. 제7항의 방법에 의해 제조된 표적 항원에 대한 결합력이 증가된 다가 항체.
9. 제6항 또는 제8항의 다가 항체를 표적 항원 함유 의심 시료에 처리하여 표적 항원을 검출하는 방법.
10. 제6항 또는 제8항의 다가 항체를 유효성분으로 함유하는 표적 항원 검출용 조성물.

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