JP2016193899A - 抗体又はその抗原結合性フラグメント及びハイブリドーマ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記の特徴を有する抗体又はその抗原結合性フラグメント
(1)配列番号1で示されるproBDNFの19番目〜128番目のBDNFプロドメイン及びproBDNFの19番目〜128番目のBDNFプロペプチドを認識するが、成熟BDNFを認識しない
(2)BDNFプロドメインの領域Aは認識しないが、領域B及び/又は領域Cを特異的に認識する、
【化1】
(下波線部は領域Aと領域Bの共通部分であり、下線部は領域Bと領域Cの共通部分である。)
【選択図】なし
Description
項1. 下記の特徴を有する抗体又はその抗原結合性フラグメント
(1)配列番号1で示されるproBDNFの19番目〜128番目のBDNFプロドメイン及びproBDNFの19番目〜128番目のBDNFプロペプチドを認識するが、成熟BDNFを認識しない
(2)BDNFプロドメインの領域Aは認識しないが、領域B及び/又は領域Cを特異的に認識する。
項2. BDNFプロドメインの領域Aは認識しないが、領域Cを特異的に認識する、項1に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
項3. KVRPNEENNKDADLYで示されるペプチドで免疫された抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることにより得られるハイブリドーマから産生され得る、項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
項4. 抗体がモノクローナル抗体である、項1、2又は3に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
項5. 受託番号P-02011,P-02012,P-02013として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体と同じBDNFプロドメインのエピトープと反応する、項4に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
項6. proBDNFもしくはBDNFプロペプチドに起因する神経病態を組織化学的に解析し得る、項1〜5のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
項7. 下記の(1)及び(2)
(1)配列番号1で示されるproBDNFの19番目〜128番目のBDNFプロドメイン及びproBDNFの19番目〜128番目のBDNFプロペプチドに結合する
(2)BDNFプロドメインの領域Aに対し、領域B及び/又は領域Cを特異的に認識する。
の特徴を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターにおいて受託番号NITE P-02011,P-02012,P-02013として寄託されている、ハイブリドーマ。
proBDNFのプロドメインに対するモノクローナル抗体の作製
抗体作製の抗原
proBDNFのプロドメイン内のペプチドと大腸菌組み換えBDNFプロペプチド(図2、アミノ酸19-128:作製方法は特許4457216号に記載)を用いた。
1. Fluorenyl-MethOxy-Carbonyl(Fmoc)固相合成法により各ペプチドを80%以上の純度で各々5 mg合成した。ペプチドはHPLC法にて純度80%以上とし、MASS分析で目的ペプチドの分子量理論値と一致していることを確認した。
2. ペプチド1 mg相当を免疫用にKeyhole limpet hemocyanin (KLH)に架橋し、もう1 mg相当をアッセイ用にBSAに架橋した。架橋方法はきわめてペプチド損失のない手段をとり、かつ立体構造についても十分な配慮を行った。組み換えタンパクに対しても構造を伴わない架橋方法で免疫直前にキャリア架橋することで免疫原性を効果的に上げる試みを行い、更に架橋していないオリジナル組み換え抗原と共に投与抗原とした。
1. 抗原は76-90C:KVR16-KLH 0.6 mg/300μlとヒトBDNFプロペプチド(組み換えタンパク) 500μl (0.75 mg/ml)を混合したものを用い、同量のフロイントコンプリートアジュバンド(Pierce)と共にエマルジョン化させ、等分してC57BL6マウス4匹免疫した。リンパ節融合を成功させる効果的な位置に免疫感作を行った。
2. 初回免疫13日後に、体内の複数箇所に腫大化しているリンパ節を可能な限り全て摘出し、抗体産生細胞の由来となるリンパ球を得た。
3. マウスミエローマ細胞P3-X63-Ag8-Uと免疫動物体内から得られたリンパ球を50 % ポリエチレングリコール存在下にて細胞融合させた。融合細胞は96ウェル培養プレート10枚以上に培養した(960ウェルの候補群)。更に、無血清に近い組成で調製したHAT選択培地での培地交換を3-4回にわたって実施した。
1. 抗原種類別にスクリーニングを実施した。低分子のペプチド抗原は、全てBSA架橋物としておき、アッセイ抗原(i)MSM20ペプチド、(ii)HSD13ペプチド、(iii)ヒトproBDNF組み換えタンパクを各々2 μg/ml濃度にPBSで希釈してELISA用96ウェルプレートを調製した。ELISAに使用する検出用酵素標識二次抗体は、サブクラスにおいてIgGクラスの検出を期待でき、検出感度と特異性に優れたものを使用した。ELISA法にて抗血清及び培養上清中の抗体の有無を検出した。各抗原に対して959ウェルについて測定した。
2. 得られた陽性株に対して、それぞれ各種免疫原との競合反応を実施して、エピトープを認識しているかどうかの特異性を確認した。
1. 細胞融合で得られた抗原陽性株(組み換え抗原に反応する抗体を産生している細胞)をコロニー捕捉(Colony Capture Method)を行った。
2. 捕捉細胞はただちに限界希釈法により完全クローニングを実施した。
3. シングル細胞から成長したハイブリドーマクローン細胞を、同一系統から不測の事態に備え2系統(本株、亜株)取得し、拡大培養した。
1. 容積2 ml用クライオバイアルに本株7本、亜株3本を凍結し、本株の1本を復元テスト用に後日融解する。納品は本株4本、亜株2本の送付とし、残りは輸送中等の不測の事態を回避するためのスペア細胞として委託会社が保管する。
2. 得られた全てのハイブリドーマ培養上清を良質な抗体含有液として保存・納品する。
図3A,図3Bに示されるBDNFプロドメイン配列内の3つの領域A, B, Cを大腸菌で発現・精製した。
図3A 3つの領域A, B, CのBDNFプロドメイン内の位置を示す。
図3B 各々のアミノ酸数、予想分子量、アミノ酸配列を示す。重複するアミノ酸配列は下線又は2重下線で示している。
図3C 領域A,B,Cと各抗体の結合をビアコアで調べた。ビアコアセンサーチップに領域A,B又はCのリコンビナントタンパクを結合させ、各抗体を流して結合の強さを比較した。
図3D ドットブロットによる各抗体と領域A,B,C, BDNFプロドメイン、成熟型BDNFとの反応。Rb pAbはBDNFプロドメインに対するウサギポリクロ―ナル抗体、N20は成熟型BDNFに対するウサギポリクロ―ナル抗体 (既製品)である。
ビアコア 大腸菌で発現させ精製したBDNFプロペプチドの領域A, B, CをBIAcoreセンサーチップCM5に10 mM Acetate, pH4.7の溶媒を用いて固定化を行った。測定パラメーターは温度:20℃、流速:20μL/min、Injection Volume:120μL、Dissociation Time:300sec、洗浄液:50mM NaOH、Injection Volume:60μL。この条件で各抗体と領域A,B,Cの相互作用を解析した。
図4 抗体#111,113,101を用いて、成獣マウス海馬組織切片の免疫染色と核染色(DAPI)の2重染色を行った。どの抗体もCA3領域の錐体細胞の細胞体に強い染色が見られた。
15.7週齢の野生型マウスをPBSと4% PFAを含むPBSで灌流固定を行い、固定後の脳組織を取り出した。1晩、4% PFAを含むPBSで後固定を行った後、30% ショ糖を含むPBSに徐々に置き換えた。溶液を置き換えた後の脳組織を凍結し、クリオスタットで30 μm厚のcoronal切片を作成し使用前までエチレングリコール:グリセロール:PBS=1:1:2の溶液につけて-30℃で保存した。
以下の染色操作は切片を浮遊させて行った。切片をPBSで10分、3回洗浄し、その後0,2% Triton X-100を含むPBS(PBST)で10分、3回洗浄した。続いて3 % ウシ血清アルブミンを含むPBSでブロッキングを室温、2時間行った。その後、1次抗体(ブロッキング液で500倍希釈)液で4℃、2晩インキュベーションした。PBSTで5分、3回洗浄した後、2次抗体液(Alexa555-conjugated anti mouse IgGをブロッキング液で1000倍希釈かつ1 μg/ml DAPIを含む溶液)で室温、2時間インキュベーションした。PBSTで5分、3回洗浄した後、切片をスライドガラスに封入剤PermaFluorを用いて封入した。画像は共焦点レーザー顕微鏡で取得した。
抗体#111,113,101を用いて、BDNFpro/+成獣マウス海馬組織ライセートより免疫沈降を行った。その結果、#101,103,111共にproBDNFを免疫沈降できることが明らかになった(図5)。
IP, 免疫沈降に使用した抗体。Control IgGは市販のマウスIgG。IB, ウエスタンブロットによる検出に使用した抗体(既製品)。
BDNFpro/+成獣マウス海馬組織を1% TritonX-100を含む可溶化溶液で溶かし、遠心後の上清を海馬組織ライセートとした。ライセートのタンパク量1 mgに対して、1 μgの各抗体とコントロール抗体を各々混合し、4℃、1晩インキュベーションした。前もって可溶化溶液で洗浄したProtein G セファロース 10 μlを添加し、さらに1時間インキュベーションした。セファロースを可溶化溶液1 mlで4回洗浄した後、SDSサンプルバッファーを加えて100℃、5分処理した。これらをIPサンプルとした。IPサンプルをSDS-PAGE, 市販のBDNFプロドメイン抗体でウエスタンブロットを行った。
Claims (7)
- 下記の特徴を有する抗体又はその抗原結合性フラグメント
(1)配列番号1で示されるproBDNFの19番目〜128番目のBDNFプロドメイン及びproBDNFの19番目〜128番目のBDNFプロペプチドを認識するが、成熟BDNFを認識しない
(2)BDNFプロドメインの領域Aは認識しないが、領域B及び/又は領域Cを特異的に認識する、
- BDNFプロドメインの領域Aを認識せず領域Cを特異的に認識する、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- KVRPNEENNKDADLYで示されるペプチドで免疫された抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることにより得られるハイブリドーマから産生され得る、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項1、2又は3に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 受託番号P-02011,P-02012,P-02013として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体と同じBDNFプロドメインのエピトープと反応する、請求項4に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- proBDNFもしくはBDNFプロペプチドに起因する神経病態を組織化学的に解析し得る、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 下記の(1)及び(2)
(1)配列番号1で示されるproBDNFの19番目〜128番目のBDNFプロドメイン及びproBDNFの19番目〜128番目のBDNFプロペプチドに結合する
(2)BDNFプロドメインの領域Aを認識せず、領域B及び/又は領域Cを特異的に認識する。
の特徴を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターにおいて受託番号NITE P-02011,P-02012,P-02013として寄託されている、ハイブリドーマ。
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JPWO2018181846A1 (ja) * | 2017-03-31 | 2020-02-13 | 株式会社Adeka | 硬化性組成物、硬化物の製造方法、その硬化物、およびそれを用いた接着剤 |
EP3755380A4 (en) * | 2018-02-20 | 2021-12-08 | Carmel-Haifa University Economic Corporation Ltd. | COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR THE ADMINISTRATION AND EXPRESSION OF SMALL PEPTIDES INHIBITORS AND THEIR USE |
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