WO2006132272A1 - 抗体の作製方法 - Google Patents

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WO2006132272A1
WO2006132272A1 PCT/JP2006/311422 JP2006311422W WO2006132272A1 WO 2006132272 A1 WO2006132272 A1 WO 2006132272A1 JP 2006311422 W JP2006311422 W JP 2006311422W WO 2006132272 A1 WO2006132272 A1 WO 2006132272A1
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WO
WIPO (PCT)
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antigen
gitr
antibody
cells
protein
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/311422
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shimon Sakaguchi
Tatsuhiko Kodama
Takao Hamakubo
Toshiko Sakihama
Shinichi Funabashi
Hiroko Iwanari
Original Assignee
The University Of Tokyo
Kyoto University
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Perseus Proteomics Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The University Of Tokyo, Kyoto University, Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha, Perseus Proteomics Inc. filed Critical The University Of Tokyo
Priority to JP2007520139A priority Critical patent/JP4984160B2/ja
Publication of WO2006132272A1 publication Critical patent/WO2006132272A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a method for artificially suppressing immune tolerance and producing an antibody against a peptide or protein that is apt to be tolerated by an immunized animal.
  • Non-patent Document 1 T cells are involved in maintaining this immune tolerance, of which CD25 + CD4 + T cells are involved.
  • CD25 + CD4 + T cells are deeply involved in the control of tumor immunity (Non-Patent Document 2), suppression of rejection in organ transplantation (Non-Patent Document 3), and the onset of various autoimmune diseases such as rheumatism. It was revealed that!
  • GITR induced tumor necrosis factor receptor lamily— relatea gene, —a member of the t, which belongs to the TNF receptor superfamily, also known as TNFRSF18, is used for immune tolerance by CD25 + CD4 + T cells.
  • umor necrosis factor nerve growth factor receptor gene superfamily
  • antibodies produced from antigens of new or known peptides and proteins may be used as tools for elucidating the mechanism of their action, elucidating their mechanism of action, and as therapeutic drugs for diseases. .
  • new or known peptides and proteins are collected, and the collected peptides or proteins are administered as antigens to animals such as mice and rats to produce antibodies against the antigens.
  • animals such as mice and rats to produce antibodies against the antigens.
  • an antibody against the antigen cannot be produced and the target antibody cannot be recovered. There is.
  • Non-Patent Document 10 a peptide or protein antigen, which is easily tolerated in normal animals such as mice, is administered to a knockout mouse of the antigen gene to sensitize the antigen.
  • An example of the production and recovery of sapphire has been reported (Non-Patent Document 10).
  • Non-Patent Document l Sakaguchi, S. et al., Immunol., 1995, 155 ⁇ , 1151—1164
  • Non-patent literature 2 Shimizu, J. et al., J. Immunol., 1999, 163 ⁇ , 5211—18
  • Non-patent literature 3 Sakaguchi, S. et al., Immunol. Rev., 2001, 182 ⁇ , 18— Page 32
  • Non-Patent Document 4 Nocentini, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, USA, 9 4 ⁇ , 9216-9221
  • Non-Patent Literature 5 June, Shimizu et al., Nature, Immunol., 2002, 3 (2), 135-142
  • Non-Patent Document 6 Reinhold, F et al., B. B. R. C., 1993, 196 (3), pp. 1496-1503
  • Non-Patent Document 7 E., Rothermel et al., Scand. J. Imminol., 2000, 52 ⁇ , 401-410
  • Non-Patent Document 8 Nobuo Kamada et al., Abstracts of the 26th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, 2003, IPC—162
  • Non-Patent Document 9 Yamada Ryosuke et al., Abstracts of the 26th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, 2003, IPC—163
  • Non-Patent Document 10 Toshihiko Otomo et al., Abstracts of the 26th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, 2003, IPC-164
  • An object of the present invention is to provide a method for producing an antibody against an antigen of a peptide or a protein, which can easily establish immune tolerance by conventional methods, by artificially suppressing immune tolerance in a living body.
  • the present inventors administered an anti-GITR antibody having GITR agonist activity to mice, artificially suppressed immune tolerance, and treated mice with Edgl protein, which is a kind of GPCR, as an antigen.
  • the present invention was completed by sensitizing and successfully producing an antibody against the Edgl protein efficiently.
  • the present invention provides an antibody against an antigen characterized by administering a GITR agonist to an immunized animal to suppress immune tolerance in the immunized animal and administering the antigen to the immunized animal. It provides a way to
  • FIG. 1 is a photograph showing lane numbers 31 to 56 as a result of Western blot (WB) analysis using purified EDGlFlag antigen.
  • FIG. 2 Comparison of homology between human and mouse Edgl. It is the figure which compared the homology of mouse Edgl and human Edgl by NCBI Blast search. Upper row (Query) is human Edgl (Gen The amino acid sequence of Bank No .: NP-001391) is shown, and the lower part (Sbjct) shows the amino acid sequence of mouse Edgl (Gen Bank No .: NP-031927).
  • Methods for suppressing immune tolerance include, for example, the method of suppressing immune tolerance by administering GITR agonist, the removal of CD25 + CD4 + T cells, which are responsible for immune tolerance, by administering anti-IL 2 receptor antibody
  • immune tolerance is suppressed by administering GITR agonist.
  • GITR is a membrane protein and is a protein belonging to the TNF a-NGF receptor gene superfamily (hereinafter referred to as GITR protein).
  • GITR protein The amino acid sequence of GITR in mice and the gene sequence encoding it are described as GenBank numbers (NM-02 1985, NM-1009400).
  • the GITR protein means both a full-length protein and a fragment thereof.
  • a GITR protein fragment is a partial polypeptide containing an arbitrary region and has the function of a natural GITR protein!
  • the GITR agent is not limited as long as it has the function of being able to bind to the GITR protein and transmit a signal. It may be in any form such as a fragment, a fusion protein, or a modified protein.
  • the GITR agonist include TNFSF18 (tumor necrosis lactor (ligand) superfamily, memoer 18), a soluble GITR ligand, an anti-GITR antibody, and the like. Of these GITR antigens, anti-GITR antibodies having GITR antigen activity are preferred.
  • TNFSF18 is a protein belonging to the TNF superfamily, and the mouse amino acid sequence and gene sequence are disclosed in GenBank No. (NM_183391). The power to perform according to the method of S is pretty (Takahashi, et al., Int. Immunol., 1969-80 (1998)). Specifically, after adding GITR agonist to the cell proliferation measurement system, CD25 + CD4 It is detected by assaying the effect of canceling the growth inhibitory effect on other T cells by + T cells.
  • a method for producing a GITR antigen will be described using an anti-GITR antibody having GITR antigen activity.
  • the present invention is not limited to anti-GITR antibodies, and other GITR antigens such as GITR ligands may be prepared.
  • an anti-GITR antibody is prepared by administering a GITR protein to an animal.
  • the anti-GITR antibody (including fragments thereof) used in the present invention is required to have an agonistic (agonizing) activity against GITR not only by binding to a GITR protein of an animal that suppresses immune tolerance. Regardless of the origin, type (monoclonal, polyclonal) and shape of anti-GITR antibody.
  • the anti-GITR antibody is a force that can be obtained by administering a GITR protein derived from the following animals to animals such as mice, rats, birds, birds, mustaches, guinea pigs, and rabbits, preferably from mice or rat cells. It is preferable that the monoclonal anti-GITR antibody is produced by this hyperpridoma.
  • the anti-GITR antibody may be produced in a host transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques.
  • the hybridomas that produce monoclonal anti-GITR antibodies are used.
  • the hybridoma uses GITR protein as an antigen, obtains immune cells according to a normal immunization method, fuses the obtained immune cells with a known parent cell by a normal cell fusion method, and further performs a normal screening method. This is done by screening monoclonal antibody-producing cells.
  • the GITR protein used as an antigen for preparing an anti-GITR antibody is represented by the GITR gene Z amino acid sequence disclosed in GenBank numbers (NM 021985, NM 009400). Obtained by expressing the sequence. After inserting a gene sequence encoding GITR protein into a known expression vector system and transforming a suitable host cell (Jun Shimizu et al., Nature Immunol., 3 (2), 135-42, 2002), The target GITR protein is purified from the host cell or culture supernatant by a known method.
  • the origin of the GITR protein is not particularly limited, but the GITR protein derived from rodents such as humans, dogs, cats, mice, mustaches, guinea pigs, rabbits, goats, mice and rats is preferred. More preferred is protein or rat GITR protein.
  • Natural GITR protein can also be used after purification.
  • partial peptides that are fragments of the GITR protein must be obtained by chemical synthesis based on the amino acid sequence of the GITR protein, incorporation of a part of the GITR gene into an expression vector, and degradation of the natural GITR protein by proteolytic enzymes. Can do.
  • the amino acid sequence and size of the GITR protein used as a partial peptide are not limited! /.
  • the purified GITR protein is used as an antigen to immunize animals used for the production of anti-GITR antibodies.
  • the immunization method is performed according to a known method. For example, as a general method, it is carried out by injecting a GITR protein antigen intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the GITR protein antigen is diluted with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline to an appropriate amount and suspended, and then mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, such as Freund's complete adjuvant, after emulsification. Administer to mammals several times every 4-21 days.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline physiological saline
  • a normal adjuvant such as Freund's complete adjuvant
  • immune cells After administering an antigen of GITR protein to an animal used for production of an anti-GITR antibody, after confirming that the anti-GITR antibody level has increased in the serum and immunized, immune cells are collected from the animal. Preferable immune cells include spleen cells.
  • the animal used for the production of the anti-GITR antibody is not particularly limited, but it is generally preferable to select it in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Similar animals, such as mice, rats, mice, musters, guinea pigs or birds, rabbits, monkeys, etc., are used.
  • GITR protein antigen when administered to an animal used for production of an anti-GITR antibody for immunization, the antigen can also be used in combination with a suitable carrier. Especially low molecular weight When a partial peptide is used as a sensitizing antigen, it is desirable to immunize by binding to a carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.
  • an anti-GITR antibody can also be obtained using the GITR protein present in CD25 + CD4 + T cells as an antigen.
  • the method of obtaining CD25 + CD4 + T cells is described in Takahashi, T et al., Int. Immunol. 10, 1969—80 (1998).
  • the cell fusion between the collected immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Kohler and Milstein (Cohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) Can be done in accordance with etc.
  • mammalian myeloma cells are used as the other parent cell to be fused with the collected immune cells.
  • this myeloma cell examples include P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Im mnol. (1979) 123, 1548— 1550), P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7) , NS-l (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511— 519), MPC—ll (Margulies. DH et al., Cell (1976) 8, 405-415 ), SP2 / 0 (Shulman, M.
  • cell fusion between the collected immune cells and myeloma cells is performed in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter, for example.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used.
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide is added to increase the fusion efficiency if desired.
  • the usage ratio of the collected immune cells and myeloma cells can be arbitrarily set.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion include RPMI1640 culture medium suitable for the growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other cell cultures of this type.
  • the normal culture solution used in the above can be used, and serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • a predetermined amount of the collected immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution and pre-warmed to about 37 ° C (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000).
  • the cells are fused to form the desired fused cells (hereinafter referred to as “hypridoma”).
  • hypothala a concentration of ⁇ 60% (w / v)
  • cell fusion agents and the like that are undesirable for growth of hybridomas are removed by repeating the operation of adding an appropriate culture solution to the hyperidoma sequentially and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma obtained in this way is a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution.
  • the anti-GITR antibody that recognizes the GITR protein may be produced using the method described in International Publication WO 03/104453.
  • the normal limiting dilution method is then performed to screen for hyperidoma producing the desired anti-GITR antibody and perform single cloning.
  • Screening and single cloning of a hybridoma producing an anti-GITR antibody may be performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • the antigen is bound to a carrier such as a polystyrene bead or a commercially available 96-well microtiter plate, reacted with the culture supernatant of the hybridoma, and the carrier, and then the enzyme-labeled secondary antibody is washed.
  • a carrier such as a polystyrene bead or a commercially available 96-well microtiter plate
  • the enzyme-labeled secondary antibody is washed.
  • Hypridoma that produces anti-GITR antibody can be cloned by limiting dilution or the like. In this case, the antigen used for immunization may be used.
  • the thus-prepared monoclonal anti-GITR antibody-nobridoma can be subcultured in a normal culture solution and maintained for a long time in liquid nitrogen. It is possible to exist.
  • the hyperpridoma obtained above is cultured according to a usual method, and the anti-GITR antibody is collected from the culture supernatant, or obtained above.
  • a method may be used in which an anti-GITR antibody is obtained as an ascites by administering a hyperprideoma to a compatible mammal.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity anti-GITR antibodies, while the latter method is suitable for mass production of anti-GITR antibodies!
  • the gene expressed by the above-described high-pridoma force anti-GITR antibody is cloned, incorporated into an appropriate expression vector, introduced into a host, and monoclonal using a gene recombination technique.
  • Anti-GITR antibodies can be produced. (See, for example, Vand amme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990.
  • mRNA encoding the variable (V) region of the anti-GITR antibody is isolated from a hyperidoma that produces an anti-GITR antibody against the GITR protein.
  • This mRNA is isolated by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemi stry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) etc. to prepare total RNA, and mRNA of interest is prepared using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Alternatively, mRNA can be directly prepared using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA of the V region of anti-GITR antibody is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis is performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Seikagaku Corporation).
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit manufactured by Seikagaku Corporation.
  • To synthesize and amplify cDNA use the 5, — Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and PCR, 5 — RACE method (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA). (1988) 8 5, 8998—9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.
  • the target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated with vector DNA. Furthermore, a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare the desired recombinant vector. Then, the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method such as the dideoxynucleotide chain termination method. After obtaining DNA encoding the V region of each antibody of interest, this is incorporated into an expression vector containing DNA encoding the desired antibody constant region (C region).
  • an anti-GITR antibody gene is incorporated into an expression vector so that the gene is expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or promoter, and the host cell is transformed with this expression vector to produce an anti-GITR antibody. Produced by expressing.
  • the expression of the anti-GITR antibody gene may be carried out by co-transforming the host cell by separately incorporating DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) into an expression vector, or It is also possible to transform host cells by incorporating DNAs encoding H and L chains into a single expression vector! (See WO 94Z11523).
  • transgenic animals can be used.
  • an antibody gene is inserted in the middle of a gene encoding a protein (goat) 8 casein or the like inherently produced in milk to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing a fusion gene into which a gene expressing an anti-GITR antibody is inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • Milk mosquitoes produced by transgenic goats born from goats that received embryos or their progeny also obtain anti-GITR antibodies.
  • hormones may be used as appropriate in transgenic dogs to increase milk production, including anti-GITR antibodies that are also produced by transgenic goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994)). ) 12, 699-702).
  • any expression system for example, a eukaryotic cell or a prokaryotic cell system can be used.
  • eukaryotic cells include established mammalian cell lines, insect cell lines, filamentous fungal cells, and animal cells such as yeast cells.
  • Prokaryotic cells include bacterial cells such as E. coli cells. Can be mentioned.
  • Preferred are mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK, Vero, and HeLa cells.
  • the transformed host cell is cultured in vitro or in vivo to produce the desired anti-GITR antibody.
  • Host cells are cultured according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as the culture medium, and serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • the produced anti-GITR antibody is separated and purified from cells and host animals by conventional protein separation and purification methods.
  • the affinity column chromatography that can specifically separate and purify the anti-GITR antibody is preferred.
  • a protein A column Hyper D, POROS, Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) ) Etc.
  • immune tolerance of an immunized animal is suppressed by administration of a GITR agonist, etc., and a desired antigen is administered to the immunized animal.
  • An antibody against the antigen may be prepared by administering a desired antigen to an immunized animal and suppressing immune tolerance of the immunized animal by administering a GITR agonist.
  • an immunized animal with suppressed immune tolerance is sensitized to a desired antigen, and an antibody against the desired antigen can be produced.
  • each of the antigens it is more preferable to sequentially administer each of the antigens to be administered with the antigen of GITR agonistist, and more preferably to perform the administration with each internal.
  • the number of operations for repeated administration, the interval (administration interval) and the total administration period are for example, in mice and rats, the number of repeated administrations is preferably 2 or more, more preferably 3 to 8, more preferably 3 to 8 days.
  • the total administration period in which the daily interval is more preferable is preferably 3 weeks or more, more preferably 5 weeks or more, and further preferably 7 to 11 weeks.
  • the desired antigen in the present invention may be any peptide or protein.
  • it is a peptide or protein that establishes immune tolerance in an immunized animal, and is an antigen that has a high degree of homology with a peptide or protein that exists (derived from) the body of an immunized animal, particularly in the blood cell system or vascular system. Is more preferable.
  • an antigen having high homology with an amino acid sequence of a peptide or protein present in an immunized animal has an immunological tolerance, so that it is difficult to produce an antibody even when the antigen is administered.
  • Examples include GPCRs such as chemokine receptors.
  • Edgl antigen is mentioned as GPCR.
  • high homology in the present invention is usually 70% or more homology, preferably 90% or more homology, and further 95% or more homology in the amino acid sequence.
  • This homology determination is based on the algorithm described by Wilbur, W. J. and Lipman D. J. (Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730).
  • the peptide or protein that is abundant in the blood cell system / vascular system means the following.
  • blood cells include peptides or proteins expressed in B cells or macrophages, rod cells, etc.
  • blood vessels include peptides or proteins expressed in endothelial cells.
  • GPCRs such as chemokine receptors and cell adhesion factors.
  • GITR protein described in the method for producing a GITR antigen
  • desired protein also referred to as desired antigen
  • the “anti-GITR antibody” can be replaced with “an antibody against the antigen”.
  • an antibody against the antigen is produced by using an immune cell such as a spleen of a sensitized product that produces an antibody against the antigen, and a monoclonal antibody against the antigen is produced by the above-described monoclonal antibody production method. May be.
  • an immune cell such as a spleen of a sensitized product that produces an antibody against the antigen
  • a monoclonal antibody against the antigen is produced by the above-described monoclonal antibody production method. May be.
  • the above-mentioned affinity column chromatography or the like can be used. Can be used.
  • BV expressing human Edgl gene is flagged at the C-terminus using pBlueBac-TOPO cloning kit (Invitrogen). Designed to be inserted.
  • pBlueBac-His-Edg 1 was used in a saddle type, and the human Edg 1 gene amplified by PCR ( GenBank No. NM-001400) was cloned and a recombinant BV was prepared according to the manual for pBlueBac expression kit.
  • a membrane fraction of EdglFlag-expressing BV-infected cells was prepared and further purified by affinity column chromatography to obtain a sensitizing antigen for immunization.
  • EdglFlag-expressing BV was infected with Sf9 cells with a cell density of 2xl0 6 cells ZmL in infected Moy 5, and cultured at 27 ° C for 3 days. The cells and culture supernatant were separated by low-speed centrifugation at 1500 rpm. did. The cells were washed once with PBS and stored frozen in an 80 ° C freezer until needed.
  • a membrane fraction was prepared using a cell precipitate corresponding to 2 L to 3 L of infected cells as a material.
  • the membrane fraction was 10 mL sonication buffer (20 mM Tris—HC1 per 500 mL culture. (pH7.4) / 10mM MgCl / ImM EDTA, 0.25M sucrose / 2mM DTT,
  • the suspension was suspended in Complete Mini protease inhibitor 'EDTA-free (Roche Diagnostatus) and passed through an 18-gauge and 25-gauge needle several times in order to prepare a uniform suspension.
  • e Mini protease inhibitor'EDTA Elution with 0.5 mL of free. Fractionate on a 12% SDS-PAGE gel and dialyz the fraction with a high content of EDGlFlag by WB using anti-FLAG antibody against PBS / 0.5% octylglucoside for immunization as the desired antigen. did.
  • BV was prepared as follows.
  • Sf9 cells infected with EdglFlagBV with MOI (multiplicity of infection) 5 were collected on the third day of infection, and centrifuged at 1500 rpm for 15 minutes to obtain a culture supernatant. Further gain The obtained culture supernatant was centrifuged at 30, OOOxG for 2 hours with Beckman HP-25, and BV was collected as a precipitate. Add PBS and leave it at 4 ° C to stand until it is uniformly suspended. Centrifuge at 1500xG for 15 minutes to remove cell debris as a precipitate, and remove the supernatant by 45, OOOxG. Centrifugation was performed for 30 minutes and dissolved in PBSZlmM EDTA to prepare a BV preparation for immunization. Proteins were quantified using DC protein assay kit (manufactured by Bio Rad) using BS A as a standard, and the amount of antigen used for immunization was calculated.
  • DC protein assay kit manufactured by Bio Rad
  • mice were immunized using gp64 transgenic mice.
  • mice immunization group A In the mouse immunization group A (3 animals), antigen immunization and anti-GITR antibody administration were alternately performed at 1-week intervals. The total administration period was 9 weeks and the number of repetitions was 5. The antiserum of Example 6 below was evaluated at regular intervals.
  • the first immunization (7 weeks old, average body weight 50 g) was immunized by administering 100 L of purified EdglFlag antigen (antigen) into the peritoneal cavity together with FCA (Freund 'complete' adjuvant) and lOOng pertussis toxin.
  • 100 / zg was administered from the tail vein.
  • 0.25 mg of EdglFlag BV was subcutaneously administered, and 50 ⁇ L of purified EdglFlag antigen was intraperitoneally injected with 50 ⁇ L of FICA (Freund 'incomplete' adjuvant).
  • FICA Feund 'incomplete' adjuvant
  • Example 5 the same procedure as in Example 4 was used, and mouse immunization group B (3 mice) was immunized with immunization antigen and anti-GITR antibody every week, and the sensitizing antigen was immunized 3 days after the administration of anti-GITR antibody.
  • the mice were immunized by the method described above. The total administration period was 5 weeks and the number of repetitions was 5. Six weeks after the fifth immunization, the sixth immunization was performed as the final immunization.
  • mice were immunized with the immunization immunization group (3 mice) using the usual immunization method without the administration of anti-GITR antibody. I got it.
  • the total administration period was 5 weeks from the first to 5 immunizations, and 6 weeks after the final immunization, for a total of 6 administrations.
  • Anti-sera of immunized mice in mouse immunization group A (Example 4), mouse immunization group B (Example 5), and mouse immunity control group (Comparative Example 1) were evaluated using Western blot and EdglZCHO cells using purified EdglFlag antigen. And FACS using vectorZCHO cells and ELISA with purified EdglFlag antigen.
  • EdglZCHO cells are cells that express a gene in which the HA tag is added to the N-terminus of the mouse Edgl gene at the N-terminus (Reference TAK AYUKI KOHNO et al. The FASEB Journal. 2002; 16: 983-992) .
  • F ACSPBS / lmM EDTA treatment allows cells detached from the culture dish to be suspended in FA CS buffer (1% BSA / PBS / 0.1% NaN3) so that 100 000 cells can be placed in 50 L each.
  • FA CS buffer 1% BSA / PBS / 0.1% NaN3
  • Falcon353910 1 L of mouse antiserum from each group of mouse immunity was added and the reaction was observed. After reacting at 4 ° C for 1 hour, centrifuge at 15 OOrpm for 5 minutes to precipitate the cells, remove the supernatant, add 200 ⁇ L ⁇ FA CS buffer, suspend and then 1500rpm for 5 minutes. The cells were washed by centrifugation.
  • FITC AffiniPure F (ab ') 2 diluted with F ACS buffer 100 times after removing the supernatant again
  • Mouse immunity Group A mouse spleen cells No. 3075 and No. 3083 and mouse myeloma cell NS-1 were prepared by the method of Kohler and G. Milstein. mol., 1981, 73, 3-46). Specifically, the spleen cells and NS-1 were mixed at a ratio of 10: 1 cells, centrifuged at 400 ⁇ G10 for minutes, the culture supernatant was removed, and 50% (wZv) polyethylene glycol (PEG) 1500 was added to the cell pellet. (Roche Diagnostics) (PEG) was added and mixed well to form fused cells.
  • PEG polyethylene glycol
  • the fusion reaction was stopped by sequentially adding 10 mL of RPMI1640 (Sigma) added with 15% FBS (Sigma), and centrifuged at 400 ⁇ G for 10 minutes to remove the culture supernatant containing PEG.
  • the above culture solution was added sequentially to the pellet containing the cells and hybridomas, and the cells were suspended to prepare 0.5xl0 7 cells / mL, and 100 L was poured into a 96-well culture plate.
  • Hypridoma is selectively cultured in HAT medium (ICN), and on the 8th day after cell fusion, cells other than the fused cells die, and the fused cells form multiple good colonies. confirmed. The culture supernatant on day 8 was sampled and screened.
  • the above culture broth was added to the pellet containing the cellophore and hybridoma in order to suspend the cells, and prepared to 0.5 x 10 7 cells / mL, and 100 L each was placed in a 96-well culture plate. .
  • Hypridoma should be selected and cultured in HAT culture medium (ICN). On the 8th day after cell fusion, cells other than fused cells will die, and the fused cells will form multiple good colonies. Was confirmed. The culture supernatant on day 8 was sampled and screened.
  • Hypridoma screening was performed by BV-ELISA, FACS, purified antigen ELISA, and FM AT.
  • BV—ELISA was prepared by coating the BV prepared in the above-mentioned preparation method on a 96-well plate with 4 / z gZwell, and shaking with 10 ⁇ L of Hyperidoma supernatant for 1 hour, diluted 30,000 times The HRP rabbit anti-mouse IgG (H + L) (Jackson ImmunoResearch) was reacted, and the absorbance A450 was measured using TMB (Sigma) as a substrate. Compare the reactivity of purified EdglFlag with the reactivity of GPCRFlag as a control, and proceed to secondary screening of the top 10 samples with a ratio of measured values of A450 of 1.5 or more and the largest difference in measured values. It was.
  • Reactivity was determined by WB analysis and FMAT analysis using hyperpridoma culture supernatant monocloned by limiting dilution.
  • the FACS analysis column shows the mean (average value) of the signal.
  • Lane number This is the lane number for WB analysis.
  • Clones ⁇ j is a single clone, “2” is a mixture of 2 clones, “PC” is a mixture before cloning.
  • FACS analysis Mean and Geoean indicate the average value of signal and average of signal peak, respectively. The two values indicate high antibody reactivity.
  • the results of Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1 and 2 are shown in FIGS. 1 and 2 and Tables 1 and 2.
  • anti-GITR antibody GITR agonist
  • sensitized animals to inhibit immune tolerance, and it is difficult to produce immune tolerance under normal circumstances.
  • anti-Edgl antibody can be produced by administration to sensitized animals.
  • a high-pridoma can be formed from the cells of the sensitized animal, and a monoclonal anti-Edgl antibody can be efficiently produced.

Abstract

　生体内の免疫寛容を人為的に抑制することによって、従来方法では免疫寛容が成立しやすいペプチドや蛋白質の抗原に対する抗体の作製する方法を提供すること。 　ＧＩＴＲアゴニストを免疫動物に投与して当該免疫動物生体内の免疫寛容を抑制し、当該免疫動物に抗原を投与することを特徴とする。

Description

明 細 書
抗体の作製方法
技術分野
[0001] 本発明は、免疫寛容を人為的に抑制し、免疫動物が寛容となりやすいペプチドや 蛋白質に対する抗体を作製する方法に関する。
背景技術
[0002] 自然界には、動物由来、植物由来、細菌由来等の多くのペプチド及び蛋白質が存 在している。生体内では、これらペプチドや蛋白質を異物と認識した場合には、異物 に対する生体の拒否反応、いわゆる免疫反応が惹起してこれらを排除しょうとする。 一方で、生体内では、自己のペプチドや蛋白質等を異物と認識しないように、自己の ペプチドや蛋白質等に対して免疫反応を惹起しないように制御する免疫寛容が維持 されている。
[0003] この免疫寛容の維持には、 T細胞が関与しており、その中でも CD25+CD4+T細 胞が関わっていることが明らかにされた (非特許文献 1)。さらに、 CD25+CD4+T細 胞は、腫瘍免疫の制御 (非特許文献 2)、臓器移植における拒絶反応の抑制 (非特 許文献 3)、リウマチ等の各種自己免疫疾患の発症の抑制に深く関与して!/、ることが 明らかにされた。
[0004] CD25+CD4+T細胞による免疫寛容には、 TNFレセプタースーパーファミリーに属 し、別名 TNFRSF18とも呼ばれている GITR (glucocorticoid— induced tumor necrosis factor receptor lamily― relatea gene, —a member of the t umor necrosis factor— nerve growth factor receptor gene superfami ly. )が関与していることが明らかにされた (非特許文献 4及び 5)。
[0005] 一般的に、新規又は既知のペプチドや蛋白質の抗原から作製された抗体は、生体 内分布の確認'その作用機序解明のツール、さらに疾患の治療薬等になり得る可能 性がある。このため、新規又は既知のペプチドや蛋白質を採取し、採取したペプチド 又は蛋白質を抗原としてマウス、ラット等動物に投与して当該抗原に対する抗体を作 製することが行われている。 [0006] しかし、採取したペプチド又は蛋白質の抗原の中には、投与した動物において免 疫寛容が成立しているために当該抗原に対する抗体が作製されず、目的の抗体を 回収することができない場合がある。この理由としては、生物種間において構造的に アミノ酸配列における相同性が高い場合が多ぐ相同性の高い蛋白質やペプチドの 場合には異なる生物種由来の抗原であっても自己抗原と認識して免疫寛容のシステ ムが働くことが考えられている。さらに、血球系'血管系に存在するペプチドや蛋白質 の多くは、免疫機構に晒される機会が多いことから免疫寛容のシステムが働きやすく なっている。例えば、ケモカイン受容体等の GPCR(G protein -coupled recept or) ,細胞接着因子等が挙げられる。（非特許文献 6〜10)。
[0007] 近年では、通常のマウス等の動物で免疫寛容が成立しやすいペプチドや蛋白質の 抗原を，当該抗原遺伝子のノックアウトマウスに投与して当該抗原を感作させることに よって、当該抗原に対する抗体を作製し回収した例が報告されるに至っている (非特 許文献 10)。
非特許文献 l : Sakaguchi, S.等， Immunol. , 1995年， 155卷， 1151— 1164 頁
非特許文献 2 : Shimizu, J.等， J. Immunol. , 1999年， 163卷, 5211— 18頁 非特許文献 3 : Sakaguchi, S.等， Immunol. Rev. , 2001年， 182卷， 18— 32頁 非特許文献 4:Nocentini, G.等， Proc. Natl. Acad. Sci. , 1997年， USA. , 9 4卷， 9216— 9221頁
非特許文献 5 :June, Shimizu等， Nature, Immunol. , 2002年， 3卷（2) , 135— 142頁
非特許文献 6 :Reinhold, F等， B. B. R. C. , 1993年， 196卷（3) , 1496- 1503 頁
非特許文献 7 :E. , Rothermel等， Scand. J. Imminol. , 2000年， 52卷， 401— 410頁
非特許文献 8 :鎌田宣夫等，第 26回日本分子生物学会年会講演要旨集， 2003年， IPC— 162
非特許文献 9 :山田良榭等，第 26回日本分子生物学会年会講演要旨集， 2003年， IPC— 163
非特許文献 10 :大友俊彦等，第 26回日本分子生物学会年会講演要旨集， 2003年 , IPC- 164
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] し力しながら、ノックアウトマウスの作製には多大な時間、労力、費用がかかる上、胎 生致死の場合や、生育したノックアウトマウスに抗原を投与しても目的の抗体を回収 できない場合もある。
[0009] 本発明の目的は、生体の免疫寛容を人為的に抑制することによって、従来方法で は免疫寛容が成立しやすいペプチドや蛋白質の抗原に対する抗体を作製する方法 を提供することである。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者等は、 GITRァゴ-スト活性を有する抗 GITR抗体をマウスに投与し、免 疫寛容を人為的に抑制して、 GPCRの 1種である Edgl蛋白質を抗原としてマウスを 感作し、当該 Edgl蛋白質に対する抗体を効率良く作製する事に成功したことから本 発明を完成するに至った。
[0011] すなわち、本発明は、 GITRァゴニストを免疫動物に投与して当該免疫動物生体内 の免疫寛容を抑制し、当該免疫動物に抗原を投与することを特徴とする、当該抗原 に対する抗体を作製する方法を提供するものである。
発明の効果
[0012] 本発明によれば、生体で免疫寛容が成立しやす!/、既知又は新規のペプチドゃ蛋 白質等の抗原に対する抗体を効率よく作製することができる。 図面の簡単な説明
[0013] [図 1]精製 EDGlFlag抗原を用いたウェスタンブロット (WB)解析の結果レーン番号 31〜56までを示した写真である。
[図 2]ヒト及びマウス Edglの相同性を比較した図である。 NCBI Blast検索によりマ ウス Edglとヒト Edglの相同性を比較した図である。上段（Query)はヒト Edgl (Gen Bank番号： NP— 001391)のアミノ酸配列を示し、下段（Sbjct)はマウス Edgl (Ge nBank番号： NP— 031927)のアミノ酸配列を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 以下、本発明について、詳細に説明する。
免疫寛容を抑制する方法としては、例えば、 GITRァゴニストを投与することにより 免疫寛容を抑制する方法、抗 IL 2受容体抗体を投与することにより免疫寛容担当 細胞である CD25+CD4+T細胞を除去する方法等が挙げられる力 本発明におい ては、 GITRァゴ-ストを投与することにより免疫寛容を抑制する。
[0015] (l) GITRァゴ-ストの作製方法
本発明において、 GITRは、膜蛋白質であり、 TNF a— NGFレセプター遺伝子ス 一パーファミリーに属する蛋白質である（以下、 GITR蛋白質とする）。マウスにおける GITRのアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子配列は GenBank番号（NM— 02 1985、 NM一 009400)【こ開示されて ヽる。
本発明において、 GITR蛋白質とは、全長蛋白質及びその断片の両方を意味する 。 GITR蛋白質の断片とは、任意の領域を含む部分ポリペプチドであり、天然の GIT R蛋白質の機能を有して!/、なくてもよ!、。
[0016] 本発明にお 、て、 GITRァゴ-ストは、 GITR蛋白質に結合し、シグナルを伝達させ ることが可能なものであれば如何なるものでもよぐその機能を有している限り、断片、 融合蛋白質、修飾蛋白質など、如何なる形態でもよい。 GITRァゴニストは、例えば、 TNFSF18 (tumor necrosis lactor (ligand) superfamily, memoer 18)並 びに可溶性 GITRリガンド、抗 GITR抗体等である。これらの GITRァゴ-ストのうち、 GITRァゴ-スト活性を有する抗 GITR抗体が好ましい。
本発明において、 TNFSF18は、 TNFスーパーファミリーに属する蛋白質でマウス アミノ酸配列及び遺伝子配列は GenBank番号 (NM_183391)に開示されている なお、 GITRァゴ-スト作用を有しているか否かは、 Takahashi等の方法に従って 行うこと力 S可會である（Takahashi, et al. , Int. Immunol. , 1969— 80 (1998) ) 。具体的には、 GITRァゴニストを Τ細胞増殖測定系へ添カ卩した後に、 CD25+CD4 +T細胞による他の T細胞への増殖抑制作用解除効果を検定することによって検出 する。
[0017] GITRァゴ-ストの作製方法については、 GITRァゴ-スト活性を有する抗 GITR抗 体を用いて説明する。なお、抗 GITR抗体に限定されず、他の GITRァゴ-スト、例え ば GITRリガンドを作製してもよ 、。
まず、 GITR蛋白質を動物に投与することにより抗 GITR抗体を作製する。 本発明で用いられる抗 GITR抗体 (その断片も含む。）は、免疫寛容を抑制させる 動物の GITR蛋白質に結合するだけでなぐ GITRに対しァゴニスト (作動)活性を有 することが必要である。抗 GITR抗体の由来、種類 (モノクローナル、ポリクローナル） 及び形状等を問わない。
[0018] 抗 GITR抗体は、下記動物由来の GITR蛋白質をマウス、ラット、トリ、ノ、ムスター、 モルモット、ゥサギ等の動物に投与して得ることができる力 好ましくは、マウス又はラ ット細胞由来のハイプリドーマにより産生されたモノクローナル抗 GITR抗体であるこ とが好ましい。
[0019] また、抗 GITR抗体は、遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクター で形質転換した宿主に産生されたものであってもよい。
[0020] 抗 GITR抗体の作製方法の一例として、ハイプリドーマによる抗 GITR抗体作製方 法を下記に説明する。
ノ、イブリドーマは、モノクローナル抗 GITR抗体を産生するものが好ましい。当該ハ イブリドーマは、 GITR蛋白質を抗原として使用し、通常の免疫方法に従って免疫細 胞を得、得られた免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 さらに、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニン グして作製される。
[0021] より具体的には、モノクローナル抗 GITR抗体を作製するには下記の (i)から (V)に 説明する。
(i)免疫細胞の採取
まず、抗 GITR抗体を作製するための抗原として使用する GITR蛋白質を、 GenBa nk番号（NM 021985、 NM 009400)に開示された GITR遺伝子 Zアミノ酸配 列を発現することによって得る。 GITR蛋白質をコードする遺伝子配列を公知の発現 ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後 (Jun Shimizu et al . , Nature Immunol. , 3 (2) , 135—42, 2002)、その宿主細胞中又は培養上 清中から目的の GITR蛋白質を公知の方法で精製する。
GITR蛋白質の由来は、特に限定されないが、ヒト、ィヌ、ネコ、ノ、ムスター、モルモ ット、ゥサギ、ャギ、マウス、ラット等ゲッ歯類動物由来の GITR蛋白質が好ましぐマウ ス GITR蛋白質又はラット GITR蛋白質がより好ましい。
[0022] なお、天然の GITR蛋白質を精製して用いることもできる。
また、 GITR蛋白質の断片である部分ペプチドは、 GITR蛋白質のアミノ酸配列に 基づく化学合成、また GITR遺伝子の一部の発現ベクターへの組込み、さらに天然 の GITR蛋白質を蛋白質分解酵素による分解等によって得ることができる。部分ぺプ チドとして用 、る GITR蛋白質のアミノ酸配列の部分及び大きさは限られな!/、。
[0023] 次に、この精製された GITR蛋白質を抗原として抗 GITR抗体の作製に用いる動物 に免疫する。免疫方法としては、公知の方法に従って行われる。例えば、一般的方 法として、 GITR蛋白質の抗原をホ乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行 われる。
具体的には、 GITR蛋白質の抗原を PBS (Phosphate— Buffered Saline)や生 理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに、通常のアジュバント、例えばフロイント 完全アジュバントを適量混合し、乳化後、ホ乳動物に 4〜21日毎に数回投与する。
[0024] 抗 GITR抗体の作製に用いる動物に GITR蛋白質の抗原を投与後、血清中に抗 G ITR抗体レベルが上昇し、免疫されたのを確認した後に、当該動物から免疫細胞を 採取する。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
[0025] 抗 GITR抗体の作製に用いる動物は、特に限定されるものではないが、細胞融合 に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一般的にはゲッ歯 類の動物、例えば、マウス、ラット、ノ、ムスター、モルモット或いはトリ、ゥサギ、サル等 が使用される。
[0026] また、 GITR蛋白質抗原を抗 GITR抗体の作製に用いる動物に投与して免疫する 際には、当該抗原に適当な担体と結合して使用することもできる。特に分子量の小さ い部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペット へモシァニン等の担体蛋白質と結合させて免疫することが望まし 、。
[0027] また、上記の他に、抗 GITR抗体は、 CD25+CD4+T細胞にある GITR蛋白質を抗 原として使用し、得ることも可能である。 CD25+CD4+T細胞の取得方法は、 Takah ashi, T et al. , Int. Immunol. 10, 1969— 80 (1998)【こ記載されて! /、る。
[0028] (ii)細胞融合
前記採取された免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方 法、例えば、ケーラーとミルスティン等の方法（Kohler. G. and Milstein, C. 、 Me thods Enzymol. (1981) 73, 3— 46)等に準じて行うこと力 Sできる。
[0029] 前記採取された免疫細胞と融合される他方の親細胞として、ホ乳動物のミエローマ 細胞を用いる。このミエローマ細胞としては、例えば、 P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Im mnol. (1979) 123, 1548— 1550)、 P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in M icrobiology and Immunology (1978) 81, 1 - 7) , NS - l (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511— 519)、 MPC— l l (Margulies . D. H. et al. , Cell(1976) 8, 405-415) , SP2/0 (Shulman, M. et al. , Nature (1978) 276, 269— 270)、 FO (de St. Groth, S. F. et al. , J. Immu nol. Methods (1980) 35, 1— 21)、 S 194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1 978) 148, 313- 323) , R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277, 131 133)等が挙げられる。
[0030] より具体的には、前記採取された免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、例え ば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤とし ては、例えばポリエチレングリコール (PEG)、センダイウィルス (HVJ)等が使用され、 さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使 用することちでさる。
[0031] 細胞融合の際、前記採取された免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に 設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を 1〜10倍とする のが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞 株の増殖に好適な RPMI1640培養液、 MEM培養液、その他、この種の細胞培養 に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清 (FCS)等の血清 補液を併用することもできる。
[0032] 前記採取された免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し 、予め 37°C程度に加温した PEG溶液 (例えば平均分子量 1000〜6000程度）を通 常 30〜60% (w/v)の濃度で添加して混合することによって細胞融合させて目的と する融合細胞（以下、ハイプリドーマという。）を形成する。続いて、当該ハイプリドー マに適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより ノ、イブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
[0033] このようにして得られたノヽイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば HAT培養液
(ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液)で培養することにより、選 択される。上記 HAT培養液での培養は、目的とするハイプリドーマ以外の細胞 (非 融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間)継続する。
[0034] なお、前記 GITR蛋白質を認識する抗 GITR抗体は、国際公開公報 WO 03/10 4453に記載された方法を用いて産生してもょ 、。
[0035] (iii)ハイプリドーマのスクリーニング
ハイプリドーマ以外の細胞 (非融合細胞）が死滅後、ついで、通常の限界希釈法を 実施し、目的とする抗 GITR抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニング及び単一 クロー-ングを行う。
抗 GITR抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クロー-ングは、 公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレ ン等でできたビーズや市販の 96ゥエルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を 結合させ、ノ、イブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識二次 抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が 含まれるかどうか決定できる。抗 GITR抗体を産生するハイプリドーマを限界希釈法 等によりクローユングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用 いればよい。
[0036] このようにして作製されたモノクローナルな抗 GITR抗体を産生するノ、イブリドーマ は、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保 存することが可能である。
[0037] (iv)抗 GITR抗体の産生
前記ノ、イブリドーマ力 モノクローナル抗 GITR抗体を産生する方法として、上記で 得られたハイプリドーマを通常の方法に従 ヽ培養し、その培養上清から抗 GITR抗体 を採取する方法、又は上記で得られたハイプリドーマをこれと適合性があるホ乳動物 に投与して増殖させ、その腹水として抗 GITR抗体を得る方法等が挙げられる。前者 の方法は、高純度の抗 GITR抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗 G ITR抗体の大量生産に適して!/、る。
[0038] また、上記で得られたハイプリドーマ力 抗 GITR抗体の発現する遺伝子をクロー- ングし、適当な発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技 術を用いてモノクローナルな抗 GITR抗体を産生させることができる。（例えば、 Vand amme, A. M. et al. , Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767— 775, 1990参照
) o
[0039] 具体的には、 GITR蛋白質に対する抗 GITR抗体を産生するハイプリドーマから、 抗 GITR抗体の可変（V)領域をコードする mRNAを単離する。この mRNAの単離は 、公知の方法、例えば、グァ-ジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al. , Biochemi stry(1979) 18, 5294— 5299)、 AGPC法（Chomczynski, P. et al. , Anal. B iochem. (1987) 162, 156— 159)等により行って全 RNAを調製し、 mRNA Pur ification Kit (Pharmacia製）等を使用して目的の mRNAを調製する。また、 Quic kPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製）を用いることにより mRNAを直 接調製することもできる。
[0040] 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗 GITR抗体 V領域の cDNAを合成する 。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First— strand cDNA Sy nthesis Kit (生化学工業社製)等を用いて行う。また、 cDNAの合成及び増幅を行 うには、 5，— Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製）及び PCRを用いた 5， — RACE法（Frohman, M. A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 8 5, 8998— 9002、 Belyavsky, A. et al. , Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2 919- 2932)等を使用することができる。 [0041] 得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、ベクター DNAと連結する。 さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所 望の組換えベクターを調製する。そして、目的とする DNAの塩基配列を公知の方法 、例えば、ジデォキシヌクレオチドチェインターミネーシヨン法等により確認する。 目的とするそれぞれの抗体の V領域をコードする DNAを得たのち、これを、所望の 抗体定常領域 (C領域)をコードする DNAを含有する発現ベクターへ組み込む。
[0042] さらに、抗 GITR抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、ェンハンサー、プロモータ 一の制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込み、この発現ベクターにより、宿 主細胞を形質転換し、抗 GITR抗体を発現させて産生してもょ ヽ。
このとき、抗 GITR抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖 (H鎖)又は軽鎖 (L鎖)をコード する DNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよ いし、或いは H鎖及び L鎖をコードする DNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿 主細胞を形質転換させてもよ!、 (WO 94Z11523号公報参照)。
[0043] また、上記宿主細胞以外に、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば 、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質 (ャギ )8カゼイン等)をコードす る遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。
抗 GITR抗体を発現する遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA断片をャギ の胚へ注入し、この胚を雌のャギへ導入する。胚を受容したャギから生まれるトランス ジェニックャギ又はその子孫が産生する乳汁カも抗 GITR抗体を得る。また、トランス ジェニックャギカも産生される抗 GITR抗体を含む乳汁量を増カロさせるために、適宜 ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい（Ebert, K. M. et al. , Bio/T echnology (1994) 12, 699— 702)。
[0044] 本発明で使用される抗 GITR抗体の製造のための宿主細胞は、任意の発現系、例 えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば 榭立されたホ乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞及び酵母細胞等の動物細胞 等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。 好ましくは、ホ乳類細胞、例えば CHO、 COS,ミエローマ、 BHK、 Vero、 HeLa細 胞が挙げられる。 [0045] 次に、形質転換された宿主細胞を in vitro又は in vivoで培養して目的とする抗 GITR抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養 液として、 DMEM、 MEM、 RPMI1640、 IMDMを使用することができ、牛胎児血 清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。
[0046] (V)産生された抗 GITR抗体の分離、精製
上記の産生された抗 GITR抗体を、通常の蛋白質の分離、精製法により、細胞や 宿主動物から分離、精製する。
蛋白質の分離、精製法として、例えば、ァフィユティーカラムクロマトグラフィー、ィォ ン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（GPC)、限外濾過 膜、塩析、透析等の適宜選択、組み合わせが挙げられる (Antibodies A Laborat ory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Haroor Laboratory , 1988)。このとき、抗 GITR抗体の検出は、抗原エライザ法、 UV検出等を用いるこ とがでさる。
抗 GITR抗体を特異的に分離、精製することができるァフィユティーカラムクロマトグ ラフィ一が好ましぐァフィユティーカラムクロマトグラフィーとして、例えば、プロテイン Aカラムとして、 Hyper D、 POROS、 Sepharose F. F. (Pharmacia製）等が挙 げられる。
[0047] (2)所望の抗原に対する抗体の作製
本発明において、 GITRァゴニストの投与等により免疫動物の免疫寛容を抑制し、 所望の抗原を当該免疫動物に投与する。
なお、所望の抗原を免疫動物に投与し、 GITRァゴニストの投与等により免疫動物 の免疫寛容を抑制して、当該抗原に対する抗体を作製してもよい。
このことによって、免疫寛容を抑制した免疫動物が所望の抗原に感作されて、所望 の抗原に対する抗体を作製することができる。
なお、 GITRァゴニスト投与との抗原を投与することが好ましぐそれぞれを順次交 互に繰り返し投与する操作がより好ましぐそれぞれインターノ レをおいて投与する 操作がさらに好ましい。
また、繰り返し投与する操作の回数、インターバル (投与間隔)及び全投与期間は、 例えば、マウスやラットでは、繰り返し投与する操作の回数は 2回以上が好ましぐ 3 回〜 8回がより好ましぐこのときの投与間隔は、 3日以上間隔が好ましぐ 5日〜 9日 間隔がより好ましぐ全投与期間は、 3週間以上が好ましぐ 5週間以上がより好ましく 、 7週間〜 11週間がさらに好ましい。
[0048] 本発明における所望の抗原は、いかなるペプチド又は蛋白質でもよい。好ましくは 、免疫動物で免疫寛容が成立するペプチド又は蛋白質であり、免疫動物の体内、特 に血球系 ·血管系に存在 (由来)するペプチド又は蛋白質と高 、相同性を有する抗 原であることがより好ましい。免疫動物に存在するペプチド又は蛋白質のアミノ酸配 列と高!ヽ相同性を有する抗原は免疫寛容が成立して!/ヽるため当該抗原を投与しても 抗体が産生されにくいためである。例えばケモカイン受容体等の GPCR等が挙げら れる。さらに GPCRとして、 Edgl抗原が挙げられる。
ここで、本発明において高い相同性とは、通常アミノ酸配列において 70%以上の 相同性、好ましくは 90%以上の相同性、さらに 95%以上の相同性である。この相同 性の決定は、 Wilbur, W. J.及び Lipman D. J.が記載したアルゴリズムによる（Wi lbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983) 80, 726 — 730)。
[0049] 本発明における血球系 ·血管系において存在の多いペプチド又は蛋白質とは、次 のようなものを意味する。血球系については B細胞又はマクロファージ、榭状細胞等 に発現されて 、るペプチド又は蛋白質が挙げられ、血管系につ 、ては内皮細胞等 に発現されているペプチド又は蛋白質が挙げられる。具体的には、ケモカイン受容 体等の GPCR並びに細胞接着因子が挙げられる。
[0050] 所望の抗原の調製及び当該抗原に対する抗体の作製方法は、前記（1) GITRァゴ 二ストの作製方法に記載の「GITR蛋白質」を「所望の蛋白質 (所望の抗原とも 、う）」 、「抗 GITR抗体」を「当該抗原に対する抗体」に置き換えた方法に準じて行うことが できる。
[0051] また、前記抗原に対する抗体を産生する感作動物の脾臓等の免疫細胞を用いて 作製したノ、イブリドーマで抗原に対する抗体を産生させ、上述のモノクローナル抗体 産生方法により抗原に対するモノクローナル抗体を作製してもよい。 なお、所望の抗原を免疫寛容が破られた (又は阻害された)免疫動物に投与して得 られた所望の抗原に対する抗体を分離、精製するには、上記のァフィユティーカラム クロマトグラフィー等を用いて行うことができる。
[0052] 以上のことにより、生体で免疫寛容が成立しやすい既知又は新規のペプチドゃ蛋 白質の抗原に対する抗体を効率よく作製することができる。また、既知又は新規のぺ プチドゃ蛋白質の作用 ·生体内分布及び蛋白質相互作用を解明するツールを効率 良く提供するば力りでなぐ新規治療薬の開発も可能にすることができる。
実施例
[0053] 以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によ り限定されるものではない。
[0054] <実施例 1 >
[Edglの抗原の調製：（1) Edgl— Flag発現バキュロウィルス（BV)の作製] ヒト Edgl遺伝子を発現する BVは、 pBlueBac— TOPO cloning kit (Invitroge n社製)を用いて C末端に Flagタグが挿入されるようにデザインした。
具体的にはプライマー pEdgl—F (配列番号 1)とプライマー C— FLAG (配列番号 2)を用 、て pBlueBac - His - Edg 1を铸型に用 、て PCRで増幅したヒト Edg 1遺伝 子（GenBank番号NM—001400)をクロー-ングして、pBlueBac expression k itのマニュアルに従って組換え BVを作製した。
[0055] <実施例 2>
[Edglの抗原の調製：（2)精製 EdglFlagの調製]
精製 Edgl抗原は、 EdglFlag発現 BV感染細胞の膜画分を調製し、さらにァフィ- ティーカラムクロマトにて精製して免疫用の感作抗原とした。
具体的には、 EdglFlag発現 BVを感染モイ 5にて 2xl06 cellsZmLの細胞密度 の Sf9細胞に感染させて 27°Cにて 3日間培養したものを 1500rpmの低速遠心により 細胞と培養上清を分離した。細胞は一度 PBSで洗浄した後、必要時まで 80°Cの フリーザーにて凍結保存した。
[0056] 2Lから 3Lの感染細胞に相当する細胞の沈殿を材料にして膜画分の調製を行った 。膜画分は 500mLの培養あたり 10mLの sonication buffer (20mM Tris— HC1 (pH7. 4) /10mM MgCl /ImM EDTA, 0. 25M sucrose/2mM DTT,
2
protease inhibitor Complete Mini, EDTA— free) )をカロえて Branson社製 の超音波破砕装置にて細胞を破砕した。 10, 000xG、 30分の遠心操作の後の上清 を 100, 000xGで一時間遠心して得られた沈殿を TrisZ (NH ) SO /Glycerol
4 2 4
buffer (20mM Tris— HCl (pH7. 4) /100mM (NH ) SO /10% Glycerol)
4 2 4
に Complete Mini protease inhibitor 'EDTA— free (ロシュダイァグノスティッ タス社製）に懸濁し、 18ゲージ、 25ゲージの注射針の順で数回通すことで均一な懸 濁液を作製した。
[0057] DC protein assay (BioRad社製）にて BSAをスタンダードにして蛋白定量を行 い、蛋白濃度が 20mgZmLとなるように TrisZ(NH ) SO /Glycerol bufferで
4 2 4
希釈し、 2% Cymal-6/CHAPSO (l : 3 w/w) in Tris/ (NH ) SO /Gl
4 2 4 ycerol bufferを等量カ卩えて 4°Cにてー晚回転させながら撹拌した。 100, 000xG にて一時間遠心した上清を回収してこれに anti— FLAG M2 agarose affinity gel (Sigma A— 2220)をカ卩えてさらにー晚回転させながら撹拌した。これを BioRa dェコノカラムに詰めた後に wash buffer (0. 5% Cymal— 6/CHAPSO, 20m M Tris— HCl (pH7. 4) /100mM (NH ) SO /10% Glycerolに Complete
4 2 4
Mini protease inhibitor 'EDTA— freeをカ卩えたもので洗浄した後、 100 g/ mL FLAG peptide (Sigma F- 3290) /0. 5% Cymal— 6/CHAPSO, 20 mM Tris-HCl (pH7. 4) /100mM (NH ) SO /10% Glycerolに Complet
4 2 4
e Mini protease inhibitor'EDTA— freeをカ卩えたもので 0. 5mLづっ溶出した 。 12% SDS— PAGEゲルにて分離し、 anti— FLAG抗体を用いた WBによって E DGlFlagの含有量が多い分画を PBS/0. 5% octylglucosideに対して透析し、 所望の抗原として免疫に供した。
[0058] <実施例 3 >
[Edg 1の抗原の調製：（ 3) Edg lFlagの BVの調製]
BVの調製は、以下のようにして行った。
感染 MOI (multiplicity of infection) 5で EdglFlagBVを感染した Sf9細胞は 感染 3日目に回収し、 1500rpmで 15分遠心操作を行い、培養上清を得た。さらに得 られた培養上清を 30, OOOxGで 2時間 Beckman HP— 25にて遠心操作を行い、 BVを沈殿として回収した。 PBSをカ卩えて 4°Cでー晚静置して均一に懸濁された状態 になったら 1500xGで 15分間遠心操作を行い、細胞の残渣を沈殿として除き、上清 部分をさらに 45, OOOxGで 30分間遠心操作を行って PBSZlmM EDTAに溶力 して免疫用の BV標品とした。 BS Aをスタンダードとして DC protein assay kit (B io Rad社製）により蛋白定量を行い、免疫に用いる抗原量を計算した。
[0059] <実施例 4>
[抗 Edglモノクローナル抗体の作製：（1)免疫：マウス免疫 A群]
gp64トランスジエニックマウスを用いてマウスの免疫を行った。
マウス免疫 A群 (3匹数)は、抗原免疫と抗 GITR抗体の投与とを 1週間間隔で交互 に実施する方法で行った。このときの全投与期間は、 9週間で、繰り返し回数は 5回 であった。一定間隔ごとに下記の実施例 6の抗血清の評価を行った。
初回免疫（7週齢、平均体重 50g)は、 FCA (フロイント 'コンプリート 'アジュバント） と lOOngの百日咳毒素とともに精製 EdglFlag抗原 (抗原） 100 Lを腹腔に投与し て免疫した。抗 GITR抗体投与の際には 100 /z gを尾静脈より投与した。また感作抗 原の免疫は、二回目以降は皮下に EdglFlag BVを 0. 25mg、腹腔に精製 EdglF lag抗原 50 μ Lを FICA (フロイント 'インコンプリート 'アジュバント） 50 μ Lと共に免疫 した。最終免疫は、 EdglFlag BV 0. 125mgを皮下より免疫し、精製 EdglFlag 抗原 25 μ Lを腹腔に免疫した。
[0060] <実施例 5 >
[抗 Edglモノクローナル抗体の作製：（1)免疫：マウス免疫 B群]
実施例 5は、実施例 4と同様の手順で、マウス免疫 B群（3匹）に感作抗原免疫と抗 GITR抗体投与を毎週実施し、感作抗原は抗 GITR抗体投与から 3日後に免疫する 方法でマウスの免疫を行った。このときの全投与期間は 5週間で、繰り返し回数は 5 回であった。 5回免疫後の 6週間後に 6回目の免疫を行い最終免疫とした。
[0061] <比較例 1 >
抗 GITR抗体を投与せず、実施例 4と同様の手順で、マウス免疫コントロール群（3 匹）に感作抗原免疫と抗 GITR抗体の投与なしの通常の免疫方法でマウス免疫を行 つた。このときの全投与期間は、初回から 5回免疫までに 5週間、その 6週間後に最 終免疫し、投与回数は合計 6回であった。
[0062] <実施例 6 >
[抗 Edglモノクローナル抗体の作製：（2)抗血清の評価]
マウス免疫 A群（実施例 4)、マウス免疫 B群（実施例 5)、マウス免疫コントロール群 ( 比較例 1)の免疫マウスの抗血清の評価は、精製 EdglFlag抗原を用いたウェスタン ブロットと EdglZCHO細胞と vectorZCHO細胞を用いた FACS、精製 EdglFlag 抗原での ELISAで行った。 EdglZCHO細胞はマウスの Edgl遺伝子の N末端に F lagタグ力 末端に HAタグが付加された遺伝子を発現する細胞である（文献 TAK AYUKI KOHNO et al. The FASEB Journal. 2002 ; 16 : 983— 992)。 F ACSPBS/lmM EDTA処理することで培養ディッシュから剥離させた細胞を FA CS buffer ( 1 %BSA/PBS/0. 1 % NaN3)に懸濁して細胞が 50 L中に 100 , 000個ずつ入るように 96well plate (Falcon353910)に分注し、そこにマウス免 疫各群のマウス抗血清を 1 L加えて反応をみた。 4°Cで一時間反応させた後に、 15 OOrpmで 5分間遠心操作を行い、細胞を沈殿させた後に上清を除き、 200 μ L· FA CS bufferをカ卩えて懸濁後に 1500rpmで 5分間遠心して細胞を洗浄した。再び上 清を除いた後に 100倍に F ACS bufferで希釈した FITC AffiniPure F (ab ' ) 2
Frag Goat Anti— Mouse IgG, F (ab ) 2 specific (jacKson Immuno Re search社)を 4°Cで 30分間反応させた。
[0063] 上記と同様にして洗浄操作を行った後に 100 /z L FACS bufferに懸濁して FA CSCalibur HTS (Beckton Dickinson社）を用いて FACS解析を行った。ウェス タンプロット（WB)解析では、 12% SDS— PAGEゲルを用いて分離した精製 Edgl Flag抗原と 100倍、 1000倍に希釈した抗血清と反応させてバンドの検出を行った。
[0064] <実施例 7 >
[抗 Edglモノクローナル抗体の作製：（3)ハイプリドーマの作製]
マウスの脾臓を摘出し、ミエローマ細胞との細胞融合を実施した。マウス免疫 A群の マウス No. 3075及び No. 3083の脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞 NS— 1とを、 ケーラーとミルスティンの方法（Koheler. G and Milstein. C. ； Methods Enzy mol. , 1981, 73, 3— 46)を用いて細胞融合させた。すなわち、前記脾臓細胞と N S—1を細胞数 10 : 1の割合で混合し、 400xG10で分間遠心した後、培養上清を除 去し、細胞ペレットに 50% (wZv)ポリエチレングリコール（PEG) 1500 (ロッシュダイ ァグノステイタス社）（PEG)を添加してよく混合することによって、融合細胞を形成さ せた。続 、て、 15% FBS (Sigma社）添加 RPMI1640 (Sigma社） 10mLを逐次加 える事によって融合反応をストップさせ、 400xGで 10分間遠心して PEGを含む培養 上清を除去した。ノ、イブリドーマを含むペレットに、前記の培養液を逐次加えて細胞 を縣濁し、 0. 5xl07cells/mLとなるよう調製し、 96穴培養プレートに 100 Lずつ まき込んだ。ハイプリドーマは HAT培養液 (ICN社)で選択培養を行い、細胞融合後 8日目には、融合細胞以外の細胞は死滅し、融合細胞が複数の良好なコロニーを形 成していることが確認された。この 8日目の培養上清をサンプリングし、スクリーニング を実施した。
[0065] ノ、イブリドーマを含むペレットに、前記の培養液を逐次カ卩えて細胞を縣濁し、 0. 5x 107cells/mLとなるよう調製し、 96穴培養プレートに 100 Lずつまき込んだ。ハイ プリドーマは HAT培養液 (ICN社)で選択培養を行い、細胞融合後 8日目には、融 合細胞以外の細胞は死滅し、融合細胞が複数の良好なコロニーを形成して 、ること が確認された。この 8日目の培養上清をサンプリングし、スクリーニングを実施した。
[0066] <比較例 2 >
マウス免疫 A群の脾臓に代えて比較例 1のマウス免疫コントロール群の NO. 3083 を実施例 7と同様の手順で、ミエローマ細胞との細胞融合を実施した。
[0067] <実施例 8 >
[抗 Edglモノクローナル抗体の作製：（4)スクリーニング]
ハイプリドーマのスクリーニングは BV— ELISA、 FACS、精製抗原の ELISA, FM ATにより進めた。 BV— ELISAは前述の調製法に調製した BVを 4 /z gZwellで 96 well plateにコーティングしてハイプリドーマの上清 10 μ Lと振とうして 1時間反応さ せ、 30, 000倍に希釈した HRP rabbit anti— mouse IgG (H+L) (Jackson I mmunoResearch社)反応させて TMB (Sigma社）を基質にして吸光度 A450を測 定した。 精製 EdglFlagとの反応性とコントロールにおいた GPCRFlagの反応性を比較し、 A450の測定値の比が 1. 5以上のものと測定値の差の大きい上位 10個を二次スクリ 一二ングに進めた。
[0068] さらに、精製 EdglFlag抗原を用いた WB解析で反応性を示し、 Edgl発現 CHO細 胞（EdglZCHO)とコントロールの CHO細胞 (vectorZCHO)を用いて F ACS解 祈で median値の比が 2以上を示した B6011, B6012を限界希釈法によりクロー- ングを行った（表 1)。
[0069] 限界希釈法によりモノクローンィ匕したハイプリドーマの培養上清を使って、 WB解析 と FMAT解析で反応性の判定を行った。
WB解析では、精製 EdglFlag抗原を 2% SDS—ポリアクリルアミドゲルを用いて 分離後、 10倍希釈したハイプリドーマの上清と反応させた（図 1)。
FMAT解析では、 His— Edgl, His— Edg3発現 BVを感染させた Sf9細胞を用い て 8200CDS (ABI社）で解析を行った（表 2)。
[0070] [表 1]
B V- E L I S Aの評価
Figure imgf000019_0001
WB解析の欄は、精製 Edgl Flag精製品を 1 2% SDS-PAGEで分離した
後に、 PVDF膜にトランスファ一したものを各抗体と反応させ、精製 Edgl Flag
を抗 FLAG抗体で反応させたときに見られるパンドと同じ位置に検出された
ものを「+Jで示した。
FACS解析の欄は、シグナルの Mean (平均値)を示し、値が大きいほど反応
性がよいことを示し、比の値が高いほど特異性が高いことを示す。 表 2]
WB、 FMAT及び FACS解析の評価
B601 1 A
B601 1 B
B601 1 C
B601 2A
Figure imgf000020_0001
レ一ン番号： WB解析の際のレーンの番号である。
クローン： Π jはシングルクローン、「2」は 2クローンの混在、「PC」はクロ一ニング前の混合物を示す。
WB解析：図 1の矢印「Edg1 Fjで見られるパンドの強さを Γ+」Γ++」Γ+ + +_|の順で示した。
FACS解析: Mean, Geo eanは、それぞれシグナルの平均値とシグナルのピークを積算した平均値を示し、 二れらの値カ いことは抗体の反応性が高いことを示す。 実施例 1〜8及び比較例 1〜2の結果を図 1、図 2、表 1及び 2に示す。
マウス免疫 A群のマウスにおいて EdglFlag抗原に相当する大きさのバンドを染色 できることを明らかにした。すなわち、抗 EdglFlag抗体を得ることができた。
図 2が示すように両者は 94%と 、つた高!、相同性を示す GPCRである。このことか ら、相同性が高く免疫寛容が成立しやすい抗原（比較例 1のような Edgl抗原）であつ ても、当該免疫マウス (gp64トランスジヱニックマウス）に一定間隔をおいて交互に GI TRァゴニスト及び当該抗原を投与して当該抗原に対する抗体 (抗 Edgl抗体)を得る ことができることを明らかにした。
また、表 2【こ示すレーン番号 19, 37, 40, 46ίま、 His— EdgUこ反応し、 His-Edg 3【こ反応しな!ヽ、クローン B6011A, B6011B, B6011C, B6012Aを得た。
このことから、マウス免疫 A群のマウス No. 3075及び No. 3083の脾臓細胞を用い て、 Edgl抗原に対する抗体をモノクローナルに産生するノ、イブリドーマを得ることが できた。
以上のことより、感作動物に抗 GITR抗体 (GITRァゴニスト）を投与して免疫寛容を 阻害し、通常であれば免疫寛容が成立しやす 、ために抗体が産生されにく 、Egdl 抗原を当該感作動物に投与することによって、抗 Edgl抗体を作製することができる ことを明らかにした。また、当該感作動物の細胞からハイプリドーマを形成でき、モノク ローナルな抗 Edgl抗体を効率よく産生することができることを明らかにした。

Claims

請求の範囲
[1] GITRァゴニストを免疫動物に投与して当該免疫動物生体内の免疫寛容を抑制し 、当該免疫動物に抗原を投与することを特徴とする、当該抗原に対する抗体の作製 方法。
[2] 前記 GITRァゴ-ストが、 GITRァゴ-スト活性を有する抗 GITR抗体である、請求 項 1に記載の抗体の作製方法。
[3] 前記抗原が、前記免疫動物で免疫寛容が成立しやすいペプチド又は蛋白質であ る請求項 1又は 2に記載の抗体の作製方法。
[4] 前記免疫動物に前記抗原を投与後、前記免疫動物の免疫細胞を用いて作製した ノ、イブリドーマで当該感作抗原に対する抗体を産生する、請求項 1〜3のいずれか 一項に記載の抗体の作製方法。
[5] 前記 GITRァゴニスト活性を有する抗 GITR抗体を投与し次 ヽで前記抗原を投与 する操作を一定間隔で繰り返し 2回以上行う、請求項 1〜4のいずれか一項に記載の 抗体の作成方法。
[6] 前記抗原が、前記免疫動物に存在するペプチド又は蛋白質と高い相同性を有する ものである、請求項 1〜5のいずれか一項に記載の抗体の作製方法。
[7] 前記抗原が、血球系 ·血管系において多く存在するペプチド又は蛋白質である、請 求項 1〜6のいずれか一項に記載の抗体の作製方法。
[8] 前記ペプチド又は蛋白質が、細胞接着因子、 GPCR又はそれらの断片である、請 求項 7に記載の抗体の作製方法。
[9] 前記 GPCRがケモカイン受容体である、請求項 7に記載の抗体の作製方法。
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