JP2010252743A - 免疫寛容機構の解除を用いる抗体の製造方法及び自己免疫疾患モデル動物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】制御性T細胞を除去した少なくともT細胞を含む細胞を、内在性T細胞を有さない非ヒト動物に移入し、該非ヒト動物に抗原を投与して該非ヒト動物に抗体を産生させることを含む、抗体の製造方法。
【選択図】なし
Description
(1) 制御性T細胞を除去した少なくともT細胞を含む細胞を、内在性T細胞を有さない非ヒト動物に移入し、該非ヒト動物に抗原を投与して該非ヒト動物に抗体を産生させることを含む、抗体の製造方法。
(2) 制御性T細胞がCD25陽性細胞である、(1)に記載の方法。
(3) 制御性T細胞を除去した少なくともT細胞を含む細胞が、脾臓細胞から制御性T細胞を除去した細胞である、(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 非ヒト動物がげっ歯類である、(1)から(3)の何れかに記載の方法。
(5) 非ヒト動物がマウスである、(1)から(4)の何れかに記載の方法。
(6) 抗原が、該非ヒト動物で免疫寛容が成立しやすいペプチド又は蛋白質である、(1)から(5)の何れかに記載の方法。
(7) 抗原が、該非ヒト動物に存在するペプチド又は蛋白質と高い相同性を有するものである、(1)から(6)の何れかに記載の方法。
(8) 抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、(1)から(7)の何れかに記載の方法。
(9) 前記非ヒト動物に前記抗原を投与後、前記非ヒト動物の免疫細胞を用いて作製したハイブリドーマで当該抗原に対する抗体を産生する、(1)から(7)の何れかに記載の方法。
(10) 制御性T細胞を除去した少なくともT細胞を含む細胞を、内在性T細胞を有さない非ヒト動物に移入し、該非ヒト動物に抗原を投与して該非ヒト動物に自己免疫反応を生じさせることを含む、自己免疫疾患モデル動物の製造方法。
(11) 制御性T細胞がCD25陽性細胞である、(10)に記載の方法。
(12) 制御性T細胞を除去した少なくともT細胞を含む細胞が、脾臓細胞から制御性T細胞を除去した細胞である、(10)又は(11)に記載の方法。
(13) 非ヒト動物がげっ歯類である、(10)から(12)の何れかに記載の方法。
(14) 非ヒト動物がマウスである、(10)から(13)の何れかに記載の方法。
(15) 抗原が、該非ヒト動物で免疫寛容が成立しやすいペプチド又は蛋白質である、(10)から(14)の何れかに記載の方法。
(16) 抗原が、該非ヒト動物に存在するペプチド又は蛋白質と高い相同性を有するものである、(10)から(15)の何れかに記載の方法。
(17) 自己免疫疾患モデル動物が甲状腺炎および/又は胃炎を発症している、(10)から(16)の何れかに記載の方法。
末梢性免疫寛容を司る制御性T細胞はCD4陽性CD25陽性のフェノタイプを示す。正常マウス脾臓細胞よりCD25陽性細胞を除去し、内在性T細胞を持たないヌードマウスに移植すると、種々の臓器に対する自己免疫反応が惹起される。(Sakaguchi et al., J. Immunol. 155, 1151-1164, 1995)本発明ではこのシステムを抗体作成に応用し、外来性に免疫した自己抗原(又は自己抗原様抗原)に対して抗体を産生させることを目的とした。具体的には、CD25陽性細胞を除去したマウス脾臓細胞を移植したヌードマウスに自己抗原蛋白(マウスサイログロブリン)を免疫した。これらのマウスは、血中に抗マウスサイログロブリン抗体を産生し、更にサイログロブリン発現臓器である甲状腺への顕著な細胞浸潤がみられた。すなわち甲状腺にたいする自己免疫反応が惹起されていた。この技術は自己抗原と類似性の高い抗原に対する抗体作成に有効であるとともに、自己免疫疾患モデル動物の効率よい作成にも有用であることが示された。
内在性T細胞を有さない非ヒト動物としては、抗原を免疫するための免疫動物として使用できるものであれば特に限定されるものではないが、好ましくはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、或いはトリ、ウサギ、サル等が使用される。内在性T細胞を有さないマウスとしては、ヌードマウスを使用することができる(Nehls et al., Nature 372: 103-107, 1994.)。また、内在性T細胞を有さないラットとしては、ヌードラットを使用することができる。
本発明においては、制御性T細胞を除去した少なくともT細胞を含む細胞を、内在性T細胞を有さない非ヒト動物に移入し、所望の抗原を当該非ヒト動物(免疫動物)に投与する。なお、所望の抗原を非ヒト動物に投与し、制御性T細胞を除去した少なくともT細胞を含む細胞を非ヒト動物に移入して、当該抗原に対する抗体を作製してもよい。上記により、免疫寛容を抑制した非ヒト免疫動物が所望の抗原に感作されて、所望の抗原に対する抗体を作製することができる。
抗原に対する抗体の作製方法について説明する。本発明で製造される抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。
所望の抗原に対する抗体の製造の場合と同様に、制御性T細胞を除去した少なくともT細胞を含む細胞を、内在性T細胞を有さない非ヒト動物に移入し、該非ヒト動物に自己(様)抗原を投与することによって、該非ヒト動物に自己免疫反応を生じさせることができる。このような非ヒト動物は、自己免疫疾患モデル動物として有用である。自己免疫反応の結果として、甲状腺炎および/又は胃炎を発症する場合があり、本発明の自己免疫疾患モデル動物としては、このような甲状腺炎および/又は胃炎を発症しているものを挙げることが出来る。また、自己免疫疾患モデル動物の製造の際に用いることができる抗原としては、以下のものを挙げることができ、表1に示す抗原を投与することにより、抗原に対応する自己免疫疾患モデル動物を得ることができる。
(1)制御性T細胞(以下T reg)除去マウスの作製方法
BALB/c マウス(日本クレア社製)から脾臓を摘出し、氷冷したRPMI1640(シグマ社製), 1%牛胎児血清(以下FBS)添加培地中でほぐし、メッシュで濾過して組織残査を除去後、遠心(1300回転5分間,4℃)で細胞を回収した。細胞ペレットに氷冷した溶血剤(シグマ社製)を加えてよく懸濁し、溶血剤の9倍容のRPMI1640, 1%FBS溶液を加えて溶血反応を停止させた。遠心(1300回転5分間,4℃)で溶血剤を含む上清を除去した。細胞ペレットに、RPMI1640, 1%FBS溶液を加えよく懸濁後再度遠心し、上清を除去、細胞を回収した。細胞ペレットに氷冷したPBS 2mM EDTA 1%FBS溶液(以下MACS buffer)を加えてよく懸濁し、細胞数をカウントし、細胞未処理時のフローサイトメトリー解析用パイロットサンプルを取り分けた(FACSサンプル−1)。遠心(1300回転5分間,4℃)で上清を除去して細胞を回収し、MACS bufferで1×108 cells/mLとなるように再懸濁し、細胞 懸濁液(A)とした。
自己抗原として、マウスサイログロブリンをマウス甲状腺から抽出、調製した(Zhou et al, International Journal of Food Microbiology 103(2005)97-104)。マウス甲状腺(フナコシ株式会社製)100個を氷冷しながら解凍し、氷冷したPBS(プロテアーゼインヒビターカクテル;ロッシュ社製を添加したもの)2mLに縣濁した。氷上でホモジナイザーで破砕したのち、超音波破砕を10秒間10回行ない、超遠心(100,000g,60分間, 4℃)で上清を回収し、沈殿(組織残査)を除去した。ミリポアフィルター濾過の後、Hi load 16/60 superdex 200pgカラム(GEヘルスケア社製)にアプライし、ゲル濾過精製を行なった。回収したフラクションをSDS-PAGE解析し、マウスサイログロブリンが高純度に精製されていることを確認した(図2)。
マウスサイログロブリンの免疫は、通常の免疫方法で2回おこなった。免疫群として、下記の5群を設定し、各々マウス3匹ずつ免疫を行なった。
群1) T reg 除去脾臓細胞移入群に、初回免疫時にフロイント完全アジュバント(DIFCO社製)と混合したマウスサイログロブリン抗原を40ug、2回目免疫時にフロイント不完全アジュバント(DIFCO社製)と混合した同抗原を40ug、皮下投与した群。
群2) T reg 除去脾臓細胞移入群に、初回免疫時に百日咳毒素アジュバント(List Biological Laboratories社製)と混合したマウスサイログロブリン抗原を100ug、2回目免疫時に同抗原を40ug、腹腔内投与した群。
群3) T reg 除去処理を行なっていない脾臓細胞移入群に、群1と同様の免疫を行なった群 (群1の陰性コントロール)。
群4) T reg 除去処理を行なっていない脾臓細胞移入群に、群2と同様の免疫を行なった群 (群2の陰性コントロール)。
群5) T reg 除去脾臓細胞移入群に、免疫を行なわず、同環境でほぼ同期間飼育した群(群1,2の、免疫を行なわない陰性コントロール)
免疫開始日から群1),2),5)については84日目まで、群3),4)については91日目まで 1週間毎に採血を行い、抗サイログロブリン抗体価をELISA法で評価した。
マウスサイログロブリン精製抗原を96穴ELISA用プレート(Greiner社製)に固相化し、40%ブロックエース(以下BA;大日本住友ファーマ社製)/Tris buffered saline(以下TBS) pH7.5でブロッキング後、血清サンプルを316倍希釈から3倍希釈列で4系列調製して室温1時間反応させた。2次抗体として西洋ワサビperoxidase標識(以下HRP標識)抗マウスIgG抗体(Jackson ImmunoResearch社製)を室温で1時間反応させ、TMB試薬(ScyTek Laboratories社製)で室温30分発色後、反応停止液(ScyTek Laboratories社製)を添加して反応停止させ、450nmの吸光値(以下A450値)を測定した。血清の1000倍希釈濃度時のA450値を各々の抗体価と定め、経時的にプロットした(図3a〜d、図4)。
群2)と同条件のマウスサイログロブリン免疫マウスを用いて、常法(Kohler & Milstein, Nature 256(1975),495-497)に従って細胞融合を行なった。すなわち、免疫マウスより脾臓細胞を採取し、マウスミエローマ細胞NS-1と10:1の細胞数比率で混合し、50% PEG(ロッシュ社製)で細胞融合を行なった。融合細胞を96穴プレートに播種し、HAT選択培地で10日間培養を行ない、良好なハイブリドーマ細胞のコロニー形成を確認した。前述の、抗サイログロブリン抗体価評価用ELISA法を用いて、96穴培養プレートの培養上清中の抗体価を評価した(表2)。
免疫マウスの採血終了後、群1)〜群5)のマウス各々について、甲状腺および胃を摘出し、20%ホルマリン中和緩衝液(和光純薬社製)を用いて浸潤固定した。各々のホルマリン固定組織サンプルについて、パラフィン包埋後薄切し、組織染色用標本(以下パラフィン切片)を作製した。パラフィン切片は脱パラフィン処理後、常法に従いヘマトキシリンエオジン染色(以下HE染色)を行い、リンパ球浸潤(炎症反応)が観られるかどうかについて、病理学的観察を行なった(表3、図5a〜d、図6a〜d、図7a〜d)。
(1)マウスサイログロブリン免疫による血中抗体価の上昇確認(実施例1)
T reg 除去脾臓細胞移入マウスにマウスサイログロブリンの免疫を行なった群においては、群1)群2)いずれにおいても3/3匹で抗体価上昇が確認され、初回免疫後50日目でプラトーに達した(図3a、b)。一方、T reg 除去を行なわない脾臓細胞を移入したマウスにマウスサイログロブリンの免疫を行なった群においては、群3)では2/3匹、群4)では3/3匹でいずれも抗体価は全く上昇しなかった(図3c,d)。群3)では1/3匹について抗体価が上昇したが、群1)の抗体価上昇と比較すると上昇の程度が低く、かつ群1)では、抗体価が50日目でプラトーに達した後、84日後まで維持されたが、群3)では50日目をピークに低下したので、一過性の弱い反応に過ぎないと考えられた。また、T reg 除去脾臓細胞移入マウスにマウスサイログロブリンの免疫を行なわなかった群(群5)においては、3/3匹で抗体価は全く上昇しなかった(図4)。以上により、T reg除去脾臓細胞移入マウス群に、自己抗原であるサイログロブリンを外来性に免疫することで、有意に抗体産生が認められたといえる。
ハイブリドーマのコロニー形成が観られた480ウェルについて、培養上清中の抗マウスサイログロブリン抗体価をELISA法で評価した結果、ELISA系の感度以下のA450値しか示さなかったウェルの、平均+5SDをカットオフ値と定め、それ以上を陽性とした場合、陽性10ウェルを得た(陽性率2.08%)。これは、実用に応用できるレベルである。以上により、本免疫法により自己抗原に対して抗体産生ハイブリドーマを得ることが可能であり、モノクローナル抗体を作製可能であることが証明された(表2)。
T reg 除去脾臓細胞移入マウスにマウスサイログロブリンの免疫を行なった群においては、群1)群2)いずれにおいても各々3匹中全例で甲状腺と胃にリンパ球の浸潤を認め、甲状腺炎様と胃炎様の所見が観察された(表3、図5a〜d)。Sakaguchi et al.Journal of Immunology, 155(1995)1151-1164、及びKuniyasu et al, International Immunology,12(2000)1145-1155においては、T reg 除去脾臓細胞移入マウスでは脾臓細胞移入後約3ヶ月で(外来性に自己抗原の免疫を行なわなくとも)、100%自己免疫性の胃炎を発症すると記載されているが、本実験でも群1),2),および5) (T reg除去脾臓細胞を移入した群)では細胞移入の約3ヶ月後に100%胃炎を発症した。一方、甲状腺炎については、Sakaguchi et al.Journal of Immunology, 155(1995)1151-1164、及びKuniyasu et al, International Immunology,12(2000)1145-1155では各々23/38例(60.5%), 14/33例(42,4%)で発症が認められている。本実験においても、T reg 除去脾臓細胞移入マウスに外来性にマウスサイログロブリンを免疫しない群(群5)においては、細胞移入の約3ヶ月後に、1/3例(33.3%)で甲状腺様の所見が観察された(表3、図7a〜d)。これは、Sakaguchi et al.Journal of Immunology, 155(1995)1151-1164、及びKuniyasu et al, International Immunology,12(2000)1145-1155の結果をほぼ再現したものとなった。一方、群1)群2)においては、外来性にマウスサイログロブリンを免疫することによって、合計6/6例(100%)で甲状腺炎様の所見が観られ、外来性の免疫を行なわなかった群に対して、高率に発症が観られた。
Claims (17)
- 制御性T細胞を除去した少なくともT細胞を含む細胞を、内在性T細胞を有さない非ヒト動物に移入し、該非ヒト動物に抗原を投与して該非ヒト動物に抗体を産生させることを含む、抗体の製造方法。
- 制御性T細胞がCD25陽性細胞である、請求項1に記載の方法。
- 制御性T細胞を除去した少なくともT細胞を含む細胞が、脾臓細胞から制御性T細胞を除去した細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
- 非ヒト動物がげっ歯類である、請求項1から3の何れかに記載の方法。
- 非ヒト動物がマウスである、請求項1から4の何れかに記載の方法。
- 抗原が、該非ヒト動物で免疫寛容が成立しやすいペプチド又は蛋白質である、請求項1から5の何れかに記載の方法。
- 抗原が、該非ヒト動物に存在するペプチド又は蛋白質と高い相同性を有するものである、請求項1から6の何れかに記載の方法。
- 抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項1から7の何れかに記載の方法。
- 前記非ヒト動物に前記抗原を投与後、前記非ヒト動物の免疫細胞を用いて作製したハイブリドーマで当該抗原に対する抗体を産生する、請求項1から7の何れかに記載の方法。
- 制御性T細胞を除去した少なくともT細胞を含む細胞を、内在性T細胞を有さない非ヒト動物に移入し、該非ヒト動物に抗原を投与して該非ヒト動物に自己免疫反応を生じさせることを含む、自己免疫疾患モデル動物の製造方法。
- 制御性T細胞がCD25陽性細胞である、請求項10に記載の方法。
- 制御性T細胞を除去した少なくともT細胞を含む細胞が、脾臓細胞から制御性T細胞を除去した細胞である、請求項10又は11に記載の方法。
- 非ヒト動物がげっ歯類である、請求項10から12の何れかに記載の方法。
- 非ヒト動物がマウスである、請求項10から13の何れかに記載の方法。
- 抗原が、該非ヒト動物で免疫寛容が成立しやすいペプチド又は蛋白質である、請求項10から14の何れかに記載の方法。
- 抗原が、該非ヒト動物に存在するペプチド又は蛋白質と高い相同性を有するものである、請求項10から15の何れかに記載の方法。
- 自己免疫疾患モデル動物が甲状腺炎および/又は胃炎を発症している、請求項10から16の何れかに記載の方法。
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JPN6013057436; 分子リウマチ,Vol.3,No.3(2006)p.199-203 * |
JPN6013057440; Jpn.J.Clin.Immunol.,Vol.28,No.5(2005)p.291-299 * |
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