JP6900051B2 - Claudin 5抗体、及びその抗体を含有する医薬 - Google Patents
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Description
項1. Claudin 5タンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープ領域を認識する、抗体.
項2. 前記エピトープ領域が、Claudin 5タンパク質の、第1細胞外ループC末端側内の領域、第2細胞外ループ内の領域、並びに第1細胞外ループ及び第2細胞外ループから形成される立体構造からなる群より選択される少なくとも1種である、項1に記載の抗体. 項3. 前記エピトープ領域が、Claudin 5タンパク質の第2細胞外ループ内の領域である、項1又は2に記載の抗体.
項4. 前記エピトープ領域が、配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質においてN末端から151番目のアミノ酸、又は他種のClaudin 5タンパク質において該アミノ酸に対応するアミノ酸を含む領域である、項3に記載の抗体.
項5. 配列番号99で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質点変異体S151Tに対する結合性が、配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin 5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項3又は4に記載の抗体.
項6. 前記エピトープ領域が、Claudin 5タンパク質の第1細胞外ループ及び第2細胞外ループから形成される立体構造である、項1又は2に記載の抗体.
項7. Claudin 5タンパク質以外のClaudinファミリータンパク質に対する結合性が、Claudin 5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、項1〜6のいずれかに記載の抗体.
項8. 下記のいずれかの抗体A〜Iからなる群より選択される、項1〜7のいずれかに記載の抗体:
(A)
配列番号1で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号3で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号7で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体A;
(B)
配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号10で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号11で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号13で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号14で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号15で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体B;
(C)
配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体C;
(D)
配列番号25で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体D;
(E)
配列番号33で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号35で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号37で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号39で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体E;
(F)
配列番号41で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号42で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号43で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号45で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号47で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体F;
(G)
配列番号49で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号50で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号51で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号53で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号54で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号55で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体G;
(H)
配列番号57で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号58で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号59で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号61で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号62で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号63で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体H;並びに
(I)
配列番号65で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号66で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号67で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号69で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号70で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号71で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体I.
項9. モノクローナル抗体である、項1〜8のいずれかに記載の抗体.
項10. 項1〜9のいずれかに記載の抗体をコードする、ポリヌクレオチド.
項11. 項10に記載のポリヌクレオチドを含有する、細胞.
項12. 項1〜9のいずれかに記載の抗体と薬物との複合体.
項13. 項1〜9のいずれかに記載の抗体、及び項12に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、医薬.
項14A. 血液脳関門制御用である、項13に記載の医薬.
項14B. 脳血管内皮細胞層バリア機能制御用である、項13に記載の医薬.
項14C. 血液脳関門の薬物透過促進用である、項13に記載の医薬.
項14A1. 血液脳関門制御における使用のための、項1〜9のいずれかに記載の抗体、及び項12に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種.
項14B1. 脳血管内皮細胞層バリア機能制御における使用のための、項1〜9のいずれかに記載の抗体、及び項12に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種.
項14C1. 血液脳関門の薬物透過促進における使用のための、項1〜9のいずれかに記載の抗体、及び項12に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種.
項14A2. 血液脳関門制御用医薬の製造のための、項1〜9のいずれかに記載の抗体、及び項12に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種の使用.
項14B2. 脳血管内皮細胞層バリア機能制御用医薬の製造のための、項1〜9のいずれかに記載の抗体、及び項12に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種の使用.
項14C2. 血液脳関門の薬物透過促進用医薬の製造のための、項1〜9のいずれかに記載の抗体、及び項12に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種の使用.
項14A3. 項1〜9のいずれかに記載の抗体、及び項12に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を患者に投与することを含む、血液脳関門制御方法.
項14B3. 項1〜9のいずれかに記載の抗体、及び項12に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を患者に投与することを含む、脳血管内皮細胞層バリア機能制御方法.
項14C3. 項1〜9のいずれかに記載の抗体、及び項12に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を患者に投与することを含む、血液脳関門の薬物透過促進方法.
項15. 項1〜9のいずれかに記載の抗体、及び項12に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、試薬.
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
本発明は、一実施形態として、Claudin 5タンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープ領域を認識する、抗体(本明細書において、「本発明の抗体」、「Claudin 5細胞外ドメイン抗体」などと示すこともある。)に関する。以下、これについて説明する。
(a)配列番号73及び90〜92のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
(b)配列番号73及び90〜92のいずれかに示されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ密着結合形成能を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
(b’)配列番号73及び90〜92のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つイノシトール リン酸結合加水分解活性を有するタンパク質
が挙げられる。
配列番号1で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号3で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号7で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体A。
配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号10で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号11で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号13で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号14で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号15で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体B。
配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体C。
配列番号25で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体D。
配列番号33で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号35で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号37で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号39で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体E。
配列番号41で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号42で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号43で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号45で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号47で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体F。
配列番号49で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号50で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号51で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号53で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号54で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号55で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体G。
配列番号57で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号58で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号59で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号61で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号62で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号63で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体H。
配列番号65で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号66で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び
配列番号67で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに/或いは
配列番号69で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号70で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
配列番号71で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体I。
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、直鎖状のポリヌクレオチドであってもよいし、環状のポリヌクレオチド(ベクターなど)であってもよい。
本発明は、一実施形態として、本発明の抗体と薬物との複合体(本明細書において、「本発明の複合体」と示すこともある。)に関する。以下、これについて説明する。
本発明は、一実施形態として、本発明の抗体、及び本発明の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、医薬(本明細書において、「本発明の医薬」と示すこともある。)に関する。
本発明は、一実施形態として、本発明の抗体、及び本発明の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、試薬(本明細書において、「本発明の試薬」と示すこともある。)、より詳細には、Claudin 5を検出などするための試薬に関する。ここで、「試薬」には、Claudin 5を検出などすることにより検査、検出、診断など行うための「検査薬」も包含される。
抗体の作製に用いる免疫抗原(プロテオリポソーム)を、以下の通り調製した。
pEU-E01ベクター(CellFree Sciences社製)に、野生型ヒトClaudin 5タンパク質(配列番号73)のコード配列(配列番号74)からなるDNA断片、ヒト・マウス−キメラClaudin 5タンパク質(配列番号75)のコード配列(配列番号76)からなるDNA断片、又は細胞外ドメインリバーシブルClaudin 5タンパク質(配列番号77)のコード配列(配列番号78)からなるDNA断片をコードするDNA断片を、Gateway法又はGibson Assembly法を用いて挿入して、鋳型プラスミドを得た。
無細胞系に添加するリポソームは、卵黄由来ホスファチジルコリン(EggPC、和光純薬工業社製)にMPLA (Avanti社製)を添加した混合脂質を用いて調製した。具体的には以下のようにして調製した。
タンパク質合成キット(WEPRO7240 expression kit、CellFree Science社製)を用いて、プロテオリポソームを調製した。具体的には以下の様に行った。
参考例1で得られた免疫抗原(ヒト・マウス−キメラClaudin 5タンパク質、又は細胞外ドメインリバーシブルClaudin 5タンパク質のプロテオリポソーム)を用いて、モノクローナル抗体を作製した。具体的には以下の様に行った。
参考例1で得られたプロテオリポソームを、タンパク質濃度が40 μg/mLトなるように希釈した。得られた希釈液500 μLを、BXSBマウス(雄性、6週齢)(清水実験材料社製)に腹腔内投与した。その後、2週間おきに、投与を計2〜3回行った。
(1)動物、細胞:免疫したBXSB系マウス及びその脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞(P3U1細胞)を使用する。
(4-1)脾臓懸濁液の調製:最終免疫から3日後に、イソフルラン麻酔下で開腹して脾臓を取り出し、冷RPMI培地(血清は含まない)が入ったディッシュに移した。脾臓を細切りにした後、セルストレーナー(100 μm、Becton Dickinson社製)を用いて、冷RPMI培地中に脾臓細胞を懸濁させた。脾臓細胞懸濁液にRPMI培地を加え、冷却遠心機を用いて遠心(300 g、5分間)により洗浄した。次に、細胞ペレットに溶血剤を5 mL加えて、5分間氷上でインキュベートした。30 mLのRPMI培地を加えて、遠心により洗浄した。最後に、セルストレイナー(70 μm)を用いて、脾臓細胞懸濁液から完全に組織片を取り除いた。
pCX4purベクター(大阪バイオサイエンス研究所製)に、野生型ヒトClaudin 5タンパク質のコード配列からなるDNA断片を挿入して、レトロウイルス作製用ベクターを得た。パッケージング細胞(Phoenix A細胞)を12ウェルプレート(Becton Dickinson社製)の各ウェルに0.5×105個ずつ播種し、24時間培養した。その後、X-treme GENE HP DNA(Roche Diagnosis社製)3 μLを用いて、pCL amphoベクター0.5 μg及びレトロウイルス作製用ベクター0.5 μgをphoenix A細胞へトランスフェクションした。24時間後に培地交換を行い、更に24時間培養した。レトロウイルスを含む培養上清を回収し、これを0.45 μmのフィルターで濾過することで夾雑物を除き、そこへ8 μg/mLとなるようにポリブレン(SigmaAldrich社製)を加えた。得られた溶液を用いて、ヒト繊維肉腫由来細胞(HT-1080細胞)を24時間培養した。その後、細胞を、10 cmディッシュ(コーニング社製)中、5 μg/mLのピューロマイシンを含む10%FBS添加DMEMを用いて2日培養し、未感染細胞を除去した。
10 cmディッシュに、実施例1-3で得られたスクリーニング用細胞又はmock細胞(Claudinを発現しないレトロウイルス感染させたHT-1080細胞)を播種し、翌日、細胞を回収した。得られた細胞1.0×105個に対して、実施例1-2で得られたスクリーニング対象の培養上清100 μLを1次抗体として添加し、4℃で1時間反応させた。細胞を0.2% BSA-TBSを用いて3回洗浄した後、2次抗体溶液(FITC conjugated goat anti-mouse IgG + IgM in 1% BSA-PBS(1:400))100 μLと混合し、4℃で1時間反応させた。細胞を0.2% BSA-TBSを用いて洗浄した後、FACS解析(FACS caliber、BD Bioscience社製)を行った。横軸を蛍光シグナル、縦軸を細胞数としたヒストグラムにおいて、mock細胞に比べて、ピークが右側(蛍光シグナルが強い側)にシフトした場合に、処理に用いた培養上清のウェルにポジティブクローン(抗Claudin 5抗体産生細胞)が存在すると判定した。
クローニングされたハイブリドーマを、予めddY系マウス脾細胞の支持層を形成させた24ウェルプレートに移し、インキュベーター内で培養した。細胞が増殖し始めた後、培養液全量を、9 mLの10%FBS添加RPMI培地を入れた組織培養用25 cm3フラスコに移し、培養を継続した。更なる増殖を確認した後、培養液全量を、40 mLの10%FBS添加RPMI培地を入れた組織培養用75 cm3フラスコに移し、培養を継続した。
(1)動物:Balb/c nu/nu系マウスを使用した。
(5-1)試薬の調製:
・Starting buffer: 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0 20 mMリン酸水素二ナトリウム溶液(5.36 g/L)と20 mMリン酸二水素ナトリウム(2.76 g/L)を61:39の割合で混合する。
・Elution buffer:100 mM glycine HCl, pH 2.7 グリシン7.507 gを950 mLのミリQ水に溶かし、HClでpHを2.7に調整後、全量を1000 mLにメスアップする。
・Neutralize buffer:1.0 M tris HCl, pH 9.0 2.0 Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(242 g/L)50 mLに対し塩酸を加えpHを9.0に調整し、全量が100mLになるように、ミリQ水でメスアップした。
・Elution (non-specifically bound protein) buffer: 3 M NaCl 塩化ナトリウム17.5 gを100 mLのミリQ水に溶かす。
腹水に対しその三倍量のStarting bufferを加え、20分間静置した後、遠心分離(3000 rpm, 30分間)、及び0.8μmのメンブランスフィルターを通すことにより、不溶物を除去した。得られたサンプルを、Starting Bufferで十分に平衡化されたプロテインGカラム(0.7×5 cm)にロードした。サンプル液が完全に流出した後、30 mLのStarting bufferでカラムを洗浄した。Elution buffer 10 mLをカラムに通し、抗体を溶出させた。溶出液は、フラクションコレクターを用いて50滴ずつ分取した。この際、フラクションコレクターの各フラクションには、予め50μLのNeutralize bufferを加えておいた。得られた抗体画分を、4℃の条件下、PBS中で透析(Slide A Lyzer 20 kMWCO)した。以下、精製されたモノクローナル抗体の名称は、上記ハイブリドーマと同じとする(例えば、ハイブリドーマ2B12から得られた抗体は、「抗体2B12」又は単に「2B12」と表記する。)。
<実施例2-1.抗体のクラスの決定>
(1)使用細胞:実施例1でクローニングしたハイブリドーマ。
実施例1でクローニングしたハイブリドーマのゲノム情報より、抗体のアミノ酸配列を決定した。各抗体における、重鎖可変領域内の各領域(CDR1~3及びFR1~4)のアミノ酸配列を表Yに、軽鎖可変領域内の各領域(CDR1~3及びFR1~4)のアミノ酸配列を表Zに示す。表Y及び表Z中、アミノ酸は一文字表記で示し、各配列は最上段左側がN末端側であり、括弧内の数字はその配列の配列番号を示し、「全体」は重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の全体の配列(N末側からFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されてなる配列)を示す。
実施例1-3で得られたヒトClaudin 5タンパク質発現細胞と、各抗体(1次抗体として)を用いて、実施例1-4と同様にしてFACS解析を行った。得られたデータから、FACS解析で得られたMFIをY軸とした飽和結合曲線を描き、50%飽和結合濃度を求めることによってKd値を算出した。各抗体のKd値を表Pに示す。
実施例1-3と同様にして、pCX4purベクターに、野生型ヒトClaudin 1タンパク質(配列番号79)のコード配列、野生型ヒトClaudin 2タンパク質(配列番号80)のコード配列、野生型ヒトClaudin 3タンパク質(配列番号81)のコード配列、野生型ヒトClaudin 4タンパク質(配列番号82)のコード配列、野生型ヒトClaudin 6タンパク質(配列番号83)のコード配列、野生型ヒトClaudin 7タンパク質(配列番号84)のコード配列、野生型ヒトClaudin 9タンパク質(配列番号85)のコード配列、野生型マウスClaudin 1タンパク質(配列番号86)のコード配列、野生型マウスClaudin 2タンパク質(配列番号87)のコード配列、野生型マウスClaudin 3タンパク質(配列番号88)のコード配列、野生型マウスClaudin 4タンパク質(配列番号89)のコード配列、又は野生型マウスClaudin 5タンパク質(配列番号90)のコード配列からなるDNA断片を挿入してレトロウイルス作製用ベクターを得て、これらと実施例1-3で作製したレトロウイルス作製用ベクターとを用いて、各種Claudinタンパク質発現細胞を作製した。該細胞と、各抗体(抗体濃度10μg/mL、1次抗体として)を用いて、実施例1-4と同様にしてFACS解析を行った。横軸を蛍光シグナル、縦軸を細胞数としたヒストグラムを図4に示す。
実施例1-3と同様にして、pCX4purベクターに、野生型ラットClaudin 5タンパク質(配列番号91)のコード配列、又は野生型サルClaudin 5タンパク質(配列番号92)のコード配列からなるDNA断片を挿入してレトロウイルス作製用ベクターを得て、これらと実施例1-3及び3で作製したレトロウイルス作製用ベクターとを用いて、各種Claudinタンパク質発現細胞を作製した。該細胞と、各抗体(抗体濃度10 μg/mL、1次抗体として)を用いて、実施例1-4と同様にしてFACS解析を行った。横軸を蛍光シグナル、縦軸を細胞数としたヒストグラムを図5に示す。なお、図6に、各生物種のClaudin 5タンパク質のアミノ酸配列比較図を示す。
実施例1-3と同様にして、pCX4purベクターに、野生型ヒトClaudin 5タンパク質と野生型ヒトClaudin 5タンパク質とのキメラタンパク質(1-1-5:ヒトClaudin 5タンパク質において第1細胞外ループがヒトClaudin 1タンパク質の配列に置換されてなるタンパク質(配列番号93)、1-5-5:ヒトClaudin 5タンパク質において第1細胞外ループのN末端側約半分がヒトClaudin 1タンパク質の配列に置換されてなるタンパク質(配列番号94)、5-1-5:ヒトClaudin 5タンパク質において第1細胞外ループのC末端側約半分がヒトClaudin 1タンパク質の配列に置換されてなるタンパク質(配列番号95)、5-5-1:ヒトClaudin 5タンパク質において第2細胞外ループがヒトClaudin 1タンパク質の配列に置換されてなるタンパク質(配列番号96))のコード配列からなるDNA断片を挿入してレトロウイルス作製用ベクターを得て、これらと実施例1-3で作製したレトロウイルス作製用ベクターとを用いて、各種Claudinタンパク質発現細胞を作製した。該細胞と、各抗体(抗体濃度10 μg/mL、1次抗体として)を用いて、実施例1-4と同様にしてFACS解析を行った。横軸を蛍光シグナル、縦軸を細胞数としたヒストグラムを図7に示す。図8に、各キメラタンパク質のアミノ酸配列比較図を示す。
実施例1-3と同様にして、pCX4purベクターに、野生型ヒトClaudin 5タンパク質の点変異体(D68E:ヒトClaudin 5タンパク質においてN末端から68番目のアミノ酸(アスパラギン酸)がグルタミン酸(マウスClaudin 5タンパク質における対応位置のアミノ酸)に変異してなるタンパク質(配列番号97)、T75A:ヒトClaudin 5タンパク質においてN末端から75番目のアミノ酸(トレオニン)がアラニン(マウスClaudin 5タンパク質における対応位置のアミノ酸)に変異してなるタンパク質(配列番号98)、S151T:ヒトClaudin 5タンパク質においてN末端から151番目のアミノ酸(セリン)がトレオニン(マウスClaudin 5タンパク質における対応位置のアミノ酸)に変異してなるタンパク質(配列番号99))のコード配列からなるDNA断片を挿入してレトロウイルス作製用ベクターを得て、これらと実施例1-3及び3で作製したレトロウイルス作製用ベクターとを用いて、各種Claudinタンパク質発現細胞を作製した。該細胞と、各抗体(抗体濃度10μg/mL、1次抗体として)を用いて、実施例1-4と同様にしてFACS解析を行った。横軸を蛍光シグナル、縦軸を細胞数としたヒストグラムを図9に示す。
実施例1-3で得られたヒトClaudin 5タンパク質発現細胞又はmock細胞からライセートを調製し、該ライセートを還元条件下のSDS-PAGEにより分離した。1次抗体として実施例1で得られた各抗体(抗体濃度10μg/mL)を用いて、定法に従ってウェスタンブロッティングを行った。1次抗体としては、ポジティブコントロールとしてClaudin 5のC末端を認識する市販のモノクローナル抗体(4C3C2)、及びローディングコントロールとしてβアクチン抗体も用いた。結果を図10に示す。
底面がポリエチレンテレフタレート製の透過膜(孔径0.4μm、1.6×106pores/cm2)である単層培養用インサート(BD Falcon社製、カタログ番号:353095)を24ウェルプレートの各ウェルにセットし、該膜上でヒト皮膚微小血管内皮細胞(Lonza社製、カタログ番号:CC-2543)を培養し、該膜上に内皮細胞の単層状シートを形成させた。培地に、実施例1で得られた各抗体、又はコントロールIgG若しくはIgMの溶液を10μL添加した。添加後、経皮電気抵抗値の経時変化を、経皮電気抵抗測定装置(cellZscope、nanoAnalytics社製)を用いて測定した。結果を図11に示す。
血液脳関門を模倣した培養物(サル型BBBキット、ファーマコセル社製)を用いて、バリア機能制御活性を評価した。該培養物は、底面がポリエチレンテレフタレート製の透過膜(孔径3.0 μm、1.6×106pores/cm2)であるインサートが培養ウェルにセットされた構造を有しており、インサート底面の上側にサル脳毛細血管内皮細胞の単層状シートが形成されており、該底面の下側にラットペリサイトの細胞シートが形成されており、且つ培養ウェルの底面上にラットアストロサイトの細胞シートが形成されている。
実施例9で用いた培養物を用いた。該培養物のインサート側(血管側)の培地に、実施例1で得られた各抗体、C-CPE mt5(ウェルシュ菌エンテロトキシンのC末断片の変異体:ポジティブコントロール)、コントロールIgGの溶液、又は抗体の希釈に用いた液を30μL添加した。添加9時間後、あらかじめ900 μLの培地を入れておいた24ウェルプレート(Greiner社製)(洗浄用プレート)にインサートを移し、インサート側の培地の交換を1度行った。その後、インサート側の培地を吸引し、10 μg/mLのフルオロセインナトリウム(和光純薬社製)を含む培地200 μLを添加し、あらかじめHIENAI plate warmer(コスモバイオ社製)上で 900 μLの培地を入れておいた24ウェルプレート(Greiner社製)(測定用プレート)にインサートを移した。測定用プレートに移してから30分経過したインサートは順次洗浄用プレートに移した。その後、測定用プレート上(脳側)の培地中の蛍光強度をTriSTAR LB 941(Berthold Technologies)により測定した。見かけ上の透過係数(Papp)は、次式により算出した;Papp (cm/s) = (脳側の培地量×脳側に透過したフルオロセインナトリウムの濃度)/(インサートの透過膜の表面積×フルオロセインナトリウムの血管側への添加濃度×実験時間)。結果を図13に示す。
カニクイザルを用いて、抗体の血液脳関門制御活性を評価した。具体的には以下の様にして行った。
<カニクイザルへの抗体と蛍光色素の投与>
浜松ファーマリサーチ(静岡)に外部委託して実施した。実験開始1日目、8日目、15日目、22日目にカニクイザル(3年齢、オス)(イブバイオサイエンス、和歌山)の静脈に実施例1で得られた各抗体(1日目:mouse IgG(8 mg/kg)、8日目:2B12(1 mg/kg)、15日目:2B12(3 mg/kg)、22日目:2B12(8 mg/kg))を投与した。投与翌日にケタミン麻酔下で、蛍光色素フルオレセインナトリウム(20 mg/kg)を静脈投与した。フルオレセインナトリウム投与直前、投与10、30、60、120分後に、脳脊髄液と静脈血を採取した。
<脳脊髄液中の蛍光色素の測定>
採取した脳脊髄液中の蛍光分子量を蛍光プレートリーダー(TriSTAR LB 941)により測定した。結果を図14に示す。
<静脈血(血漿)中の毒性マーカーの測定>
採取した血漿中の肝毒性マーカー(AST、ALT)、および肝・腎毒性マーカー(BUN)濃度を測定キット(テストワコー(和光純薬))を用いて測定した。結果を表Qに示す。
Claudin-5抗体を8mg/kgで投与30分後に、脳脊髄液における蛍光色素の増加が見られた。同量のコントロール抗体投与条件では、この増加が見られなかった。また、蛍光色素が増加した条件において、血液中の肝・腎毒性マーカーの大きな変化は見られなかった。本結果から、Claudin-5抗体は、顕著な毒性なしに、低分子化合物のサル血液脳関門通過を促進することが示された。
Claims (11)
- Claudin5タンパク質の細胞外ドメイン内の領域がエピトープであり、且つClaudin5タンパク質以外のClaudinファミリータンパク質に対する結合性が、Claudin5タンパク質に対する結合性の1/5以下であり、
下記のいずれかの抗体A及びBからなる群より選択される、抗体:
(A)
配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び
配列番号3で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号5で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
配列番号6で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び
配列番号7で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体A;
(B)
配列番号9で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
配列番号10で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び
配列番号11で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号13で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
配列番号14で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び
配列番号15で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3
を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体B。 - 前記エピトープが、Claudin5タンパク質の第2細胞外ループ内の領域である、請求項1に記載の抗体。
- 前記エピトープが、配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin5タンパク質においてN末端から151番目のアミノ酸、又は他のClaudin5タンパク質において該アミノ酸に対応するアミノ酸を含む領域である、請求項2に記載の抗体。
- 配列番号99で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin5タンパク質点変異体S151Tに対する結合性が、配列番号73で示されるアミノ酸配列からなるヒトClaudin5タンパク質に対する結合性の1/5以下である、請求項2又は3に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の抗体をコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項6に記載のポリヌクレオチドを含有する、細胞。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の抗体と薬物との複合体。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の抗体、及び請求項8に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、医薬。
- 血液脳関門制御用である、請求項9に記載の医薬。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の抗体、及び請求項8に記載の複合体からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、試薬。
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