CN104379741B

CN104379741B - 抗人cd69抗体及其用于医疗目的的用途

Info

Publication number: CN104379741B
Application number: CN201380021553.9A
Authority: CN
Inventors: 古城周久; 宫越阳; 加藤静惠; 对比地久美子; 速水友纪; 中村美纪子; 中山俊宪; 岩村千秋
Original assignee: Chiba University NUC; Genefrontier Corp
Current assignee: Chiba University NUC; Genefrontier Corp
Priority date: 2012-04-23
Filing date: 2013-04-23
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2033-04-23
Also published as: JPWO2013161814A1; EP2843051A1; CA2871417A1; CN104379741A; US20200199235A1; EP2843051A4; EP2843051B1; WO2013161814A1; US20150118237A1; AU2013253581A1; AU2013253581B2; CA2871417C; US10865247B2; ZA201408566B; JP6286757B2; US20190233521A1

Abstract

本发明提供抗体，其能够特异性结合人CD69，具有预防过敏性炎症的活性，并且具有与小鼠CD69的交叉反应性。本发明还提供具有对人CD69的高结合亲和力并具有预防过敏性炎症的活性的抗体。本发明的抗体的每一种均可以是人抗体。

Description

抗人CD69抗体及其用于医疗目的的用途

技术领域

本发明涉及抗人CD69抗体及其药物用途。

背景技术

CD69是属于C型凝集素家族的II型跨膜蛋白。由于CD69的表达在T细胞和B细胞的刺激后几个小时之内增加，所以它被广泛用作早期活化标记分子以作为淋巴细胞活化的指标(非专利文献1)。此外，在胸腺中分化过程中在选择下的T细胞中也观察到表达(非专利文献2和3)。尽管假定CD69具有作为加强来自抗原受体的信号转导的共同受体的功能，但细节是未知的。其配体至今尚未鉴定。它在血小板中组成型表达，并且在活化的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等中也观察到表达。因此，假定其在血小板中的功能表达和局部炎症反应中发挥作用。此外，已经阐明，嗜中性粒细胞上的CD69在关节炎的发作中发挥重要作用(非专利文献4)。此外，已经报道，CD69控制过敏性气道炎症，并且针对小鼠CD69的抗体抑制过敏性气道炎症(非专利文献5)。还已经报道，香烟烟雾诱导的COPD和博来霉素诱导的肺纤维化(lung fibrogenesis)在CD69缺陷的小鼠中得到衰减(非专利文献6和7)。因此，预期应用针对CD69的抗体以预防或治疗此类过敏性疾病和炎性疾病。然而，由于CD69的配体是未知的，所以没有可用的用于有效评价针对人CD69的抗体的体外药理学作用的方法。此外，由于现有针对人CD69的抗体不与非人CD69交叉反应，所以对于现有抗体的体内药理学作用的评价实质上是不可能的，并且甚至这些抗体是否得到有用的药理学作用也是不清楚的。如上所述，由于不存在用于评价抗人CD69抗体的药理学作用的令人满意的方法，所以适用于预防或治疗过敏性疾病和炎性疾病的抗人CD69抗体的开发延迟落后很多。

噬菌体展示方法是已经通过在功能肽或蛋白和编码其的DNA之间以噬菌体颗粒的形式形成一一对应而实现体外高速选择的展示技术之一。这种噬菌体展示方法已经被应用于抗体选择，并且通过该方法获得的抗体已经被开发作为药物(非专利文献8)。此外，已经建立了通过组合人人工抗体文库和噬菌体展示方法而获得特异性抗体的方法，而此类方法已经由多个公司实施，如MorphoSys的HuCAL （人组合抗体文库(Human CombinatorialAntibody Library)）所证明。

[文献列表]

[非专利文献]

非专利文献1: Testi, R. 等人 Immunol. Today 15: 479-483, 1994。

非专利文献2: Yamashita, I. 等人 Int. Immunol. 5: 1139-1150, 1993。

非专利文献3: Nakayama, T. 等人 J. Immunol. 168: 87-94, 2002。

非专利文献4: Murata, K. 等人 Int. Immunol. 15: 987-992, 2003。

非专利文献5: Miki-Hosokawa, T. 等人 J. Immunol. 183: 8203-8215, 2009。

非专利文献6: Tsuyusaki, J. 等人 J. Recept. Signal Transduct. Res. 31:434-439, 2011。

非专利文献7: Yamauchi, K. 等人 Respir. Res. 12: 131, 2011。

非专利文献8: Rothe, C. 等人 J. Mol. Biol. 376: 1182-1200, 2008。

发明概述

本发明待解决的问题

本发明的一个目标是提供适用于预防或治疗过敏性疾病和炎性疾病的抗人CD69抗体。

解决问题的方法

为了解决上述问题，本发明人首先产生结合人CD69和小鼠CD69两者的抗CD69抗体。此外，他们深入研究了体内评价抗人CD69抗体的药理学作用的方法。作为结果，他们已经成功地通过在用特定抗原免疫的CD69缺陷小鼠的Th2细胞中强制表达人CD69并将Th2细胞返回至小鼠的体内而在小鼠中再现过敏反应，这是由表达人CD69的Th2细胞介导的。他们已经通过HuCAL产生了多种抗人CD69抗体，并通过使用上述小鼠评价对过敏反应的效果。作为结果，他们已经发现了具有优异的过敏抑制效果和炎症抑制效果的抗人CD69抗体。此外，他们已经通过修饰获得的抗体的轻链CDR3而改进了人CD69的亲和力，并成功地加强了过敏抑制效果和炎症抑制效果，同时维持了与小鼠CD69的交叉反应性。基于上述发现，他们已经完成了本发明。

因此，本发明涉及以下内容。

[1] 特异性结合人CD69的抗体，其具有抑制过敏性炎症的活性，并且具有与小鼠CD69的交叉反应性。

[2] [1]的抗体，其在包含SEQ ID NO:33显示的氨基酸序列的表位处结合人CD69。

[3] [1]的抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，其中

(1) 所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:7中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:8中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 9、19或20中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:11中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列的CDR3，或

(2) 所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:7中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:8中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 9、19或20中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:11中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列的CDR3，

除了在选自SEQ ID NO:7 – 9、19和20中显示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至3个氨基酸，和/或

在选自SEQ ID NO:10 - 12中显示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至3个氨基酸。

[4] [3]的抗体，其中

(1') 所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 23、27或28中显示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO: 24显示的氨基酸序列。

[5] 特异性结合人CD69的抗体，其具有抑制过敏性炎症的活性，并在包含SEQ IDNO:59或78显示的氨基酸序列的表位处结合人CD69。

[6] 特异性结合人CD69的抗体，其具有抑制过敏性炎症的活性，并且包含轻链可变区和重链可变区，其中

(3) 所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:2中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 3中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:5中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:6中显示的氨基酸序列的CDR3；

(4) 所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 15中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:16中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:17中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:18中显示的氨基酸序列的CDR3；

(5) 所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:2中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 3中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:5中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:6中显示的氨基酸序列的CDR3，

除了在选自SEQ ID NO:1至3中显示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至3个氨基酸，和/或

在选自SEQ ID NO:4至6中显示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至3个氨基酸；或

(6) 所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 15中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:16中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:17中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:18中显示的氨基酸序列的CDR3，

除了在选自SEQ ID NO:13至15中显示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至3个氨基酸，和/或

在选自SEQ ID NO:16至18中显示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至3个氨基酸。

[7] [6]的抗体，其中

(3') 所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 21中显示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO: 22显示的氨基酸序列；或

(4') 所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 25中显示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO: 26显示的氨基酸序列。

[8] [1] - [7]中任一项的抗体，其关于与人CD69的结合亲和力具有不大于5x10^-8M的K_D值。

[9] [1] - [8]中任一项的抗体，其是人抗体。

[10] 药物组合物，其包含[1] - [9]中任一项的抗体。

[11] 用于过敏性疾病或炎性疾病的预防剂或治疗剂，其包含[1] - [9]中任一项的抗体。

[12] 多核苷酸，其编码[1] - [9]中任一项的抗体。

[13] 载体，其包含[12]的多核苷酸。

[14] 转化体，其包含[13]的载体。

[15] 非人哺乳动物，其包含用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳动物的转移的Th2细胞，其中所述Th2细胞表达人CD69。

[16] [15]的非人哺乳动物，其中所述非人哺乳动物是小鼠。

[17] [1] - [9]中任一项的抗体，其用于预防或治疗过敏性疾病或炎性疾病。

[18] 用于哺乳动物中预防或治疗过敏性疾病或炎性疾病的方法，其包括将有效量的[1] - [9]中任一项的抗体施用于所述哺乳动物。

[19] [1] - [9]中任一项的抗体用于生产预防或治疗过敏性疾病或炎性疾病的药剂的用途。

发明效果

根据本发明，提供了适用于预防或治疗过敏性疾病和炎性疾病的抗人CD69抗体。此外，根据本发明，可提供允许体内评价抗人CD69抗体的药理学作用的动物模型。

附图简述

图1显示通过细胞染色评价与人CD69和小鼠CD69的结合。

图2显示通过流式细胞术分析人CD69表达。

图3显示各种抗人CD69抗体对肺泡白细胞浸润的效果。

图4通过流式细胞术证实各种抗人CD69抗体与小鼠CD69和人CD69的交叉反应性。

图5显示各种抗人CD69抗体针对肺泡白细胞浸润的效果。

图6显示小鼠CD69(上部序列)和人CD69(下部序列)的氨基酸序列的比对。

实施方案的描述

本发明提供具有对人CD69特异性结合活性和抑制过敏性炎症的活性的抗体。

CD69是已知的II型膜蛋白，并且其氨基酸序列和其cDNA序列也是已知的。人CD69的代表性氨基酸序列显示于SEQ ID NO:30，人CD69的代表性cDNA序列显示于SEQ ID NO:29，小鼠CD69的代表性氨基酸序列显示于SEQ ID NO:32，且小鼠CD69的代表性cDNA序列显示于SEQ ID NO:31。

本发明的抗体具有对人CD69的胞外结构域的特异性结合活性。人CD69的胞外结构域对应于SEQ ID NO:30显示的氨基酸序列中62-199的区域，且小鼠CD69的胞外结构域对应于SEQ ID NO:32显示的氨基酸序列中62-199的区域。

“人CD69”意指CD69的氨基酸序列或核酸序列具有与人中天然表达的CD69的氨基酸序列或核苷酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列或核酸序列。“实质上相同”意指目标氨基酸序列或核酸序列与人中天然表达的具体CD69的氨基酸序列或核酸序列具有70％或更高(优选80％或更高，更优选90％或更高，进一步优选95％或更高，最优选99％或更高)同一性，并且具有具体人CD69的功能。除了人以外的生物物种，除了CD69以外的蛋白，其基因和片段也以相同方式进行解释。

抗体与抗原X的“特异性结合”意指在抗原-抗体反应中抗体与抗原X的结合亲和力的K_D值不大于1x10^-7 M。

在本说明书中，关于本发明的抗体与人CD69的结合亲和力的K_D值根据Immunoassays (OXFORD UNIVERSITY PRESS, 2000)中描述的原理使用斯卡恰特作图法（scatchard plot method）进行计算。将抗体与各种浓度的抗原(人CD69的胞外结构域)在室温下孵育2小时，直到平衡，并且通过ELISA方法测量孵育溶液中存在的游离抗体的量。基于每个平衡样品中游离抗体量的变化测定结合常数和解离常数(K_D值)。平衡反应过程中的抗体浓度为0.015 μg/ml，并且用于测量游离抗体的量的ELISA板用以1 μg/ml的抗原固定。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体与人CD69的结合亲和力的K_D值不大于5×10^-8 M。

本发明的抗体具有抑制过敏性炎症的活性。过敏性炎症是指特征在于目标组织中单核细胞的选择性积累的炎症，其与过敏反应关联发生。单核细胞涵盖Th2细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞。抗体是否具有抑制过敏性炎症的活性可以通过评价其是否抑制通过将下述本发明的非人哺乳动物暴露于抗原诱导的过敏性反应(例如，白细胞浸润)来证实。

在本说明书中，“抗体”被用作涵盖全长抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链的抗体。“抗体”是指含有通过二硫键连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L) 的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文中简称为V_H)和重链恒定区构成。重链恒定区由C_H1、C_H2和C_H3的3个结构域构成。每条轻链由轻链可变区(本文中简称为V_L)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由单一结构域C_L构成。V_H和V_L区被进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的具有更高可变性的区域，其含有分散在其中的被称为框架区(FR)的更高保守区域。每个V_H和V_L由3个CDR和4个FR构成，它们以下列顺序排列，即，从氨基末端至羧基末端的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和常规补体系统的第一组分(C1q))的结合。

在本说明书中，抗体的“抗原结合部分”被用来指抗体的保留特异性结合抗原(例如，人CD69)的能力的一个或多个片段。已经阐明，抗体的抗原结合功能由全长抗体的片段行使。术语抗体的“抗原结合部分”中包括的结合片段的实例包括(i) Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域构成的单价片段，(ii) F(ab')₂片段，含有由铰链区中的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段，(iii) Fab'片段，具有铰链区部分的固有Fab (参见FUNDAMENTALIMMUNOLOGY, Paul ed., 3. sup. rd ed. 1993)，(iv) 由V_H和C_H1结构域构成的Fd片段，(v) 由抗体的单一臂中的V_L和V_H结构域构成的Fv片段，(vi) 由V_H结构域构成的dAb片段(Ward等人, (1989) Nature 341:544-546)，(vii) 分离的互补决定区(CDR)，以及(viii)作为含有单一可变结构域和两个恒定区的重链可变区的纳米抗体。尽管作为Fv片段的两个结构域的V_L和V_H由不同基因编码，但它们可以通过重组技术通过合成接头连接以产生来自它们的单一蛋白链，其中，在该链中，V_L和V_H区彼此配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988) Science 242:423-426；和Huston等人, (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也涵盖在抗体的“抗原结合部分”中。此类抗体片段由本领域普通技术人员通过已知的常规技术获得，并且以与未修饰抗体相同的方式筛选可用性。

本发明的抗体优选是单克隆抗体。“单克隆抗体”是指单一分子组成（singlemolecule composition）的抗体分子的制备物。单克隆抗体组成显示对被称为表位的抗原特定部分的单一结合特异性和亲和力。

本发明的抗体优选是人抗体。“人抗体”是指在框架区和CDR区两者中具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，当抗体含有恒定区时，恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。在本说明书中，“人抗体”也甚至涵盖包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基的实施方案(例如，通过在体外随机或位点定向诱变或在体内体细胞突变引入的突变)。然而，在本说明书中，“人抗体”的术语并不意在包括其中源自除了人以外的动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列融合在人框架序列上的抗体。

在本说明书中，人抗体涵盖“重构的人抗体”。重构的人抗体是指其中在第二人受体抗体中使用第一人供体抗体中含有的至少一个CDR而不是第二人受体抗体的CDR的修饰的抗体。优选地，取代所有6个CDR。更优选地，使用第一人供体抗体的整个抗原结合区(例如，Fv、Fab或F(ab')2)代替第二人受体抗体中的对应区域。更优选地，将第一人供体抗体的Fab区可操作地连接至第二人受体抗体的适当的恒定区，以形成全长抗体。

重构的人抗体可以通过公开于，例如，EP125023、WO96/02576、非专利文献8等中的常规基因重组技术来产生。具体地，例如，经设计以连接供体人抗体中期望的CDR和受体人抗体中期望的框架区(FR)的DNA序列通过PCR方法使用作为引物的经产生以具有与CDR和FR两者的末端区域重叠的区域的几个寡核苷酸来合成(参见WO98/13388中描述的方法)。将获得的DNA连接至编码人抗体恒定区或人抗体恒定区突变体的DNA，将其并入表达载体中，并将载体引入宿主以允许产生，由此可以获得重构的人抗体(参见EP125023、WO96/02576)。

此外，在本说明书中，人抗体涵盖“人工人抗体”。人工人抗体可以通过公开于，例如，非专利文献8等中的常规基因重组技术来产生。

本发明的抗体还包括其中融合上述抗体和其他肽或蛋白的融合蛋白。融合蛋白的产生方法包括：连接编码本发明的抗体的多核苷酸和编码其他肽或多肽的多核苷酸以匹配框架，将其引入表达载体，并允许其在宿主中表达，并可以使用本领域普通技术人员已知的技术。作为待与本发明的抗体融合的其他肽，可以使用已知的肽，诸如FLAG (Hopp, T.P.等人, BioTechnology (1988) 6, 1204-1210)、由6个His(组氨酸)残基组成的6×His、10×His、人c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、T7-标签、HSV-标签、E-标签、SV40T抗原片段、lck标签、α-微管蛋白片段、B-标签、蛋白C片段等。待与本发明的抗体融合的其他多肽的实例包括GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、HA(流感血凝素)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)等。将商购的编码此类肽或多肽的多核苷酸与编码本发明的抗体的多核苷酸融合，并且表达由此制备的融合多核苷酸，从而可以制备融合多肽。

本发明的抗体可以是与各种分子结合的缀合抗体，所述分子例如，聚合物物质，诸如聚乙二醇(PEG)，透明质酸等，放射性物质，荧光物质，发光物质，酶，毒素等。此类缀合抗体可以通过化学修饰获得的抗体而获得。本领域中已经建立了抗体的修饰方法(例如，US5057313、US5156840)。

本发明的抗体优选是分离的或纯化的。“分离的或纯化的”意指去除除了目标组分以外的组分的操作已被应用于天然存在的状态。本发明的分离或纯化的抗体的纯度(本发明的抗体的重量与总蛋白的重量的比率)通常为50％或更高，优选70％或更高，更优选90％或更高，最优选95％或更高(例如，基本上100％)。

在一个实施方案中，本发明的抗体具有与小鼠CD69(优选小鼠CD69的胞外结构域)的交叉反应性。“交叉反应性”意指特异性结合人CD69的抗体也通过抗原-抗体反应结合小鼠CD69(优选小鼠CD69的胞外结构域)。具有与小鼠CD69的交叉反应性的本发明的抗体的优异之处在于它可以甚至在不表达人CD69的小鼠中评价效力。

在一个优选的实施方案中，具有与小鼠CD69的交叉反应性的本发明的抗体在含有SEQ ID NO:33显示的氨基酸序列(YNCPG)的表位处结合人CD69。含有SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列的表位包括，例如，由SEQ ID NO:30中显示的氨基酸序列的连续部分序列组成的表位，其含有SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸长度。作为含有SEQ ID NO:33显示的氨基酸序列的表位，具体地，可以提到由SEQ ID NO:35显示的氨基酸序列组成的表位，和由SEQ ID NO:36显示的氨基酸序列组成的表位。

作为具有与小鼠CD69的交叉反应性的本发明的抗体，可以提到以下(1)和(2)中描述的抗体：

(1) 包含轻链可变区和重链可变区的抗体，

其中所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:7中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:8中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 9、19或20中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:11中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列的CDR3；和

(2) 包含轻链可变区和重链可变区的抗体，

其中所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:7中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:8中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 9、19或20中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:11中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列的CDR3，

在选自SEQ ID NO:10 – 12中显示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至3个氨基酸。

上述(1)或(2)中描述的抗体可以在以下表位处结合人CD69：包含SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列的表位(优选地，由SEQ ID NO:30中显示的氨基酸序列的连续部分序列组成的表位，其含有SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸长度；更优选地，由SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36显示的氨基酸序列组成的表位)。

在一个实施方案中，本发明的抗体在由SEQ ID NO:59显示的氨基酸序列组成的表位处结合人CD69。

在一个实施方案中，本发明的抗体在含有SEQ ID NO:78显示的氨基酸序列(YAGREE)的表位处结合人CD69。含有SEQ ID NO:78中显示的氨基酸序列的表位包括，例如，由SEQ ID NO:30中显示的氨基酸序列的连续部分序列组成的表位，其含有SEQ ID NO:78中显示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸长度。作为含有SEQ ID NO:78显示的氨基酸序列的表位，具体地，可以提到由SEQ ID NO:57显示的氨基酸序列组成的表位，由SEQ IDNO:58显示的氨基酸序列组成的表位，和由SEQ ID NO:59显示的氨基酸序列组成的表位。

作为其他本发明的抗体，可以提到以下(3)-(6)中描述的抗体：

(3) 包含轻链可变区和重链可变区的抗体，

其中所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:2中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 3中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:5中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:6中显示的氨基酸序列的CDR3；

(4) 包含轻链可变区和重链可变区的抗体，

其中所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 15中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:16中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:17中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:18中显示的氨基酸序列的CDR3；

(5) 包含轻链可变区和重链可变区的抗体，

其中所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:2中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 3中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:5中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:6中显示的氨基酸序列的CDR3，

在选自SEQ ID NO:4至6中显示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至3个氨基酸；和

(6) 包含轻链可变区和重链可变区的抗体，

其中所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 15中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:16中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQID NO:17中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:18中显示的氨基酸序列的CDR3，

上述(3)或(5)中描述的抗体在由SEQ ID NO:59显示的氨基酸序列组成的表位处结合人CD69。

上述(4)或(6)中描述的抗体可以在以下表位处结合人CD69：由SEQ ID NO:78中显示的氨基酸序列组成的表位(优选地，由SEQ ID NO:30中显示的氨基酸序列的连续部分序列组成的表位，其含有SEQ ID NO:78中显示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸长度；更优选地，由SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59显示的氨基酸序列组成的表位)。

(1)中描述的抗体关于与人CD69的结合亲和力的K_D值优选不大于3x10^-8 M。当轻链可变区中的CDR3具有SEQ ID NO:19显示的氨基酸序列时，所述抗体关于与人CD69的结合亲和力的K_D值为优选不大于1x10^-8 M，更优选不大于5x10^-9 M，进一步优选不大于2x10^-9 M。当轻链可变区中的CDR3具有SEQ ID NO:20显示的氨基酸序列时，所述抗体关于与人CD69的结合亲和力的K_D值为优选不大于1x10^-8 M，更优选不大于5x10^-9 M，进一步优选不大于3x10^-9M。

(2)中描述的抗体关于与人CD69的结合亲和力的K_D值优选不大于3x10^-8 M。

当(2)中描述的抗体是包含轻链可变区和重链可变区的抗体，其中

所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:7中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:8中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 19中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:11中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列的CDR3，

除了在选自SEQ ID NO:7、8和19中显示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至3个氨基酸，和/或

在选自SEQ ID NO:10至12的至少一条氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至3个氨基酸，

所述抗体关于与人CD69的结合亲和力的K_D值为优选不大于1x10^-8 M，更优选不大于5x10^-9 M，进一步优选不大于2x10^-9 M。

所述轻链可变区含有包含SEQ ID NO:7中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ IDNO:8中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO: 20中显示的氨基酸序列的CDR3，并且所述重链可变区含有包含SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO:11中显示的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列的CDR3，

除了在选自SEQ ID NO:7、8和20中显示的氨基酸序列的至少一条氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至3个氨基酸，和/或

在选自氨基酸序列SEQ ID NO:10 – 12的至少一条氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1至3个氨基酸，关于所述抗体与人CD69的结合亲和力的K_D值为优选不大于1x10^-8M，更优选不大于5x10^-9 M，进一步优选不大于3x10^-9 M。

(3)或(5)中描述的抗体关于与人CD69的结合亲和力的K_D值优选不大于5x10^-8 M。

(4)或(6)中描述的抗体关于与人CD69的结合亲和力的K_D值优选不大于8x10^-9 M。

在(2)、(5)和(6)的实施方案中，待取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸数目没有特别限制，只要所述抗体特异性结合人CD69，并且具有抑制过敏性炎症的活性。它优选为每一个CDR序列2个氨基酸以内，更优选一个氨基酸。其中取代、缺失、插入和/或添加氨基酸的CDR序列的数目没有特别限制，只要所述抗体特异性结合人CD69，并且具有抑制过敏性炎症的活性。它优选为每一个轻链可变区2以内，更优选为一，并且优选为每一个重链可变区2以内，更优选为1。可以在轻链可变区和重链可变区两者或它们的任一者中进行氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加。

在(2)、(5)和(6)的实施方案中，优选仅在轻链可变区中CDR3的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1 - 3(优选1或2，更优选1)个氨基酸。

在(2)的实施方案中，当在轻链可变区中CDR3的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1 - 3个氨基酸时，优选维持CDR3的氨基酸序列的第2个的丝氨酸和第3个的酪氨酸。CDR3的氨基酸序列的第一个氨基酸是在谷氨酰胺和甘氨酸之间可相互取代的。CDR3的氨基酸序列的第4个氨基酸是在天冬氨酸和苏氨酸之间可相互取代的。CDR3的氨基酸序列的第5个氨基酸是在丝氨酸和苏氨酸之间可相互取代的。

用于用其他期望的氨基酸取代一个或多个氨基酸残基的方法的实例包括定点诱变法(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, 和Nakagawa, M. (1995) Anoligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directedmutagenesis. Gene 152, 271-275; Zoller, MJ, 和Smith, M. (1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW,Kramer, B, Pflugfelder, M, 和Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approachto oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12,9441-9456; Kramer W, 和Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed constructionof mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492)。使用这些方法，抗体中期望的氨基酸可以被其他目标氨基酸取代。此外，使用文库技术诸如框架改组(Mol Immunol.2007Apr; 44(11):3049-60)和CDR修复(US2006 /0122377)等，框架或CDR中的氨基酸也可以被其他适当的氨基酸取代。

在本发明的抗体中，作为待连接至CDR的抗体的框架区(FR)，选择使得CDR形成良好抗原结合位点的框架。尽管待用于本发明的抗体的FR没有特别限制并且可以使用任何FR，但优选使用人抗体的FR。作为人抗体的FR，可以使用具有天然序列的FR，或者可以根据需要取代、缺失、插入和/或添加等具有天然序列的框架区中的一个或多个氨基酸，从而使得CDR将形成适当的抗原结合位点。例如，可以通过测量和评价具有含取代的氨基酸的FR的抗体与抗原的结合活性来选择具有期望特性的突变体FR序列(Sato, K.等人, CancerRes.(1993)53, 851-856)。

在(1)和(2)的抗体中，人抗体的Vl3的FR(Kabat数据库)优选用于轻链，并且人抗体的VH3的FR(Kabat数据库)优选用于重链。

在(3)和(5)的抗体中，人抗体的Vk1的FR(Kabat数据库)优选用于轻链，并且人抗体的VH1B的FR(Kabat数据库)优选用于重链。

在(4)和(6)的抗体中，人抗体的Vk3的FR(Kabat数据库)优选用于轻链，并且人抗体的VH3的FR(Kabat数据库)优选用于重链。

用于本发明的抗体的恒定区没有特别限制，并且可以使用任何恒定区。用于本发明的抗体的恒定区的优选实例包括人抗体的恒定区(源自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM等的恒定区)。例如，Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε可用于H链中，并且Cκ、Cλ可用于L链中。

在(1)和(2)的抗体中，人抗体的Cλ的恒定区优选用于轻链，并且人抗体的Cγ4的恒定区优选用于重链。

在(3)和(5)的抗体中，人抗体的Cκ的恒定区优选用于轻链，并且人抗体的Cγ4的恒定区优选用于重链。

在(4)和(6)的抗体中，人抗体的Cκ的恒定区优选用于轻链，并且人抗体的Cγ4的恒定区优选用于重链。

优选地，本发明的抗体包括以下：

(1') 包含轻链可变区和重链可变区的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ IDNO: 23、27或28中显示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO: 24中显示的氨基酸序列；

(3') 包含轻链可变区和重链可变区的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ IDNO: 21中显示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO: 22中显示的氨基酸序列；和

(4') 包含轻链可变区和重链可变区的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ IDNO: 25中显示的氨基酸序列，并且所述重链可变区包含SEQ ID NO: 26中显示的氨基酸序列。

分别地，上述(1')的抗体对应于上述(1)的抗体的优选实施方案，上述(3')的抗体对应于上述(3)的抗体的优选实施方案，并且上述(4')的抗体对应于上述(4)的抗体的优选实施方案。

上述(1')中描述的抗体可以在以下表位处结合人CD69：包含SEQ ID NO:33显示的氨基酸序列的表位(优选地，由SEQ ID NO:30中显示的氨基酸序列的连续部分序列组成的表位，其含有SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸长度；更优选地，由SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36显示的氨基酸序列组成的表位)。

上述(3')中描述的抗体可以在由SEQ ID NO:59显示的氨基酸序列组成的表位处结合人CD69。

上述(4')中描述的抗体可以在以下表位处结合人CD69：包含SEQ ID NO:78显示的氨基酸序列的表位(优选地，由SEQ ID NO:30中显示的氨基酸序列的连续部分序列组成的表位，其含有SEQ ID NO:78中显示的氨基酸序列，且具有12或更少的氨基酸长度；更优选地，由SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59显示的氨基酸序列组成的表位)。

本发明提供了含有编码上述本发明的抗体的核苷酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸可以是DNA或RNA，或DNA/ RNA嵌合体。所述多核苷酸可以是双链或单链的。当所述多核苷酸是双链的时，它可以是双链DNA、双链RNA或DNA:RNA杂合体。

本发明的多核苷酸涵盖含有编码本发明的抗体的重链可变区和轻链可变区两者的核苷酸序列的多核苷酸，和含有编码本发明的抗体的重链可变区的核苷酸序列的多核苷酸和含有编码本发明的抗体的轻链可变区的核苷酸序列的多核苷酸的组合。

本发明的多核苷酸可以基于本发明的抗体的氨基酸序列的信息、已知序列信息和本说明书中序列表中描述的序列信息并且通过利用已知的基因重组技术容易地制备。例如，合适的引物基于序列信息设计，编码构成本发明的抗体的元件的DNA通过PCR反应扩增，DNA片段通过适当的酶诸如连接酶等连接，由此可以产生本发明的多核苷酸。或者，编码每个元件的多核苷酸可以基于本发明的抗体的氨基酸序列的信息通过多核苷酸合成仪进行合成。

获得的编码本发明的抗体的多核苷酸可以，根据目的，直接使用，或者当期望时用限制性酶消化或添加接头后使用。所述多核苷酸可以具有ATG作为5'末端侧上的翻译起始密码子，并且可以具有TAA、TGA或TAG作为3'末端侧上的翻译终止密码子。这些翻译起始密码子和翻译终止密码子可以使用合适的合成的DNA适配体进行添加。

本发明的多核苷酸优选是分离的或纯化的。本发明的分离或纯化的多核苷酸具有通常50％或更高，优选70％或更高，更优选90％或更高，最优选95％或更高(例如，基本上100％)的纯度(本发明的多核苷酸的重量与总多核苷酸重量的比率)。

本发明提供了包含上述本发明的多核苷酸的载体。本发明的载体涵盖包含含有编码本发明的抗体的重链可变区和轻链可变区两者的核苷酸序列的多核苷酸的载体，和包含含有编码本发明的抗体的重链可变区的核苷酸序列的多核苷酸的载体和包含含有编码本发明的抗体的轻链可变区的核苷酸序列的多核苷酸的载体的组合。所述载体优选是分离的或纯化的。所述载体的实例包括表达载体、克隆载体等，其可以根据对象来选择。优选地，所述载体是表达载体。表达载体可以表达本发明的抗体。表达载体可以通过将本发明的多核苷酸可操作地连接至合适的表达载体中启动子的下游来产生。载体的种类包括，例如，质粒载体、病毒载体等，其可以根据待使用的宿主适当地选择。

作为宿主，使用属埃希氏菌属（Escherichia）(大肠杆菌(Escherichia coli)等)、属芽孢杆菌属(Bacillus)(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等)、酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等)、昆虫细胞(源自甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)的幼虫的建立的细胞系(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞；Sfcell )等)、昆虫(家蚕(Bombyx mori)的幼虫等)、哺乳动物细胞(大鼠神经细胞，猴细胞(COS-7等)、中国仓鼠细胞(CHO细胞等)等)等。

哺乳动物的实例包括，但不限于，实验动物，诸如啮齿类动物，诸如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等，兔等，家畜动物诸如猪、牛、山羊、马、绵羊、貂等，伴侣动物，诸如狗、猫等，灵长类动物诸如人、猴、食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(Macaca mulatta)、狨猴、猩猩、黑猩猩等，等。

质粒载体的实例包括源自大肠杆菌的质粒载体(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)，源自枯草芽孢杆菌的质粒载体(例如，pUB110、pTP5、pC194)，源自酵母的质粒载体(例如，pSH19、pSH15)等，其可以根据待使用的宿主种类和使用对象适当地选择。

病毒载体的种类可以根据待使用的宿主种类和使用对象适当地选择。例如，当昆虫细胞被用作宿主时，可以使用杆状病毒载体等。当哺乳动物细胞被用作宿主时，可以使用逆转录病毒载体，诸如莫洛尼鼠白血病病毒载体、慢病毒载体、辛德毕斯病毒载体等、腺病毒载体、疱疹病毒载体、腺伴随病毒载体、细小病毒载体、痘苗病毒载体、仙台病毒载体等。

启动子可以根据待使用的宿主种类进行选择，并且可以选择能够在宿主中起始转录的启动子。例如，当宿主是属埃希氏菌属时，trp启动子、lac启动子、T7启动子等是优选的。当宿主是属芽孢杆菌属时，SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等是优选的。当宿主是酵母时，PHO5启动子、PGK启动子等是优选的。当宿主是昆虫细胞时，多角体蛋白启动子、P10启动子等是优选的。当宿主是哺乳动物细胞时，亚基因组(26S)启动子、CMV启动子、SRα启动子等是优选的。

本发明的载体可以含有用于抗体分泌的信号序列。作为当抗体产生于大肠杆菌的周质中时抗体分泌的信号序列，可以使用pelB信号序列为(Lei, S. P.等人J. Bacteriol.(1987) 169, 4379)。

当期望时，本发明的载体可以各自以可操作方式含有增强子、剪接信号、多聚腺苷酸附加信号、选择标记、SV40复制原点(以下有时简称为SV40ori)等。选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(以下有时简称为dhfr)基因[甲氨蝶呤(MTX)抗性]、氨苄青霉素抗性基因(有时简称为Amp^r)、新霉素抗性基因(有时简称为Neo^r，G418抗性)等。

通过经由本身已知的基因转移方法(例如，脂质体转染法、磷酸钙法、显微注射法、原生质体(proplast)融合法、电穿孔法、DEAE葡聚糖法、通过基因枪(Gene Gun)的基因转移法等)将上述本发明的载体引入上述宿主，可以产生具有引入其中的载体的转化体(本发明的转化体)。当表达载体被用作待引入的载体时，转化体可以表达本发明的抗体。本发明的转化体可用于产生本发明的抗体等。

本发明的抗体可以通过经由本身已知的方法根据宿主的种类培养本发明的转化体，并从培养物中分离本发明的抗体来制备。当宿主是属埃希氏菌属时，将转化体在通常约15-43℃在适当的培养基诸如LB培养基、M9培养基等中培养约3-24小时。当宿主是属芽孢杆菌属时，将转化体在通常约30-40℃在适当的培养基中培养约6-24小时。当宿主是酵母时，将转化体在通常约20℃-35℃在适当的培养基诸如Burkholder氏培养基等中培养约24-72小时。当宿主是昆虫细胞或昆虫时，将转化体在通常约27℃在适当的培养基诸如用约10％牛血清添加的Grace氏昆虫培养基等中培养约3–5天。当宿主是动物细胞时，将转化体在通常约30℃-40℃在适当的培养基诸如用约10％牛血清添加的MEM培养基等中培养约15–60小时。在任何培养中，必要时可以进行通气和搅拌。

至于通过基因工程的抗体生产方法，例如，可以提及Co, M. S. 等人, J.Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. 和Horwitz, A. H., Methods Enzymol.(1989) 178, 476-496; Pluckthun, A.和Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178,497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. 等人, Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E.和Walker, B. W., TrendsBiotechnol. (1991) 9, 132-137等。

从培养物分离和纯化本发明的抗体不以任何方式限制，并且可以采用通常用于抗体纯化的分离和纯化方法。例如，抗体可以通过适当地选择和组合层析柱、滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、透析、重结晶等分离和纯化。

层析的实例包括亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等 (Strategies for Protein Purification and Characterization: A LaboratoryCourse Manual. Ed Daniel R. Marshak 等人, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1996)。这些层析可以通过使用液相层析，例如，液相层析诸如HPLC、FPLC等进行。待用于亲和层析的柱的实例包括蛋白A柱和蛋白G柱。例如，作为使用蛋白A的柱，可以提到Hyper D、POROS、Sepharose FF(由GE Amersham Biosciences制造)等。本发明还涵盖通过这些纯化方法高度纯化的抗体。

此外，本发明提供了含有上述本发明的抗体作为有效成分的药物组合物。本发明的药物组合物也可用于预防或治疗涉及人CD69的过敏性疾病和炎性疾病。即，本发明还提供了用于过敏性疾病或炎性疾病的预防剂或治疗剂，其含有上述抗体作为有效成分。过敏性疾病的实例包括，但不限于，过敏性哮喘、过敏性鼻炎、花粉症、特应性皮炎、荨麻疹、食物过敏、过敏性结膜炎等。炎性疾病的实例包括，但不限于，慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、支气管炎、间质性肺炎、肺纤维化、肺水肿、成人呼吸窘迫综合征、类风湿性关节炎、脓毒性休克、溃疡性结肠炎、克罗恩病、再灌注损伤、慢性肾小球肾炎、内毒素休克、骨关节炎、多发性硬化症等。上述过敏性疾病或炎性疾病优选是呼吸器官(肺、支气管、气道等)中的过敏性疾病或炎性疾病。呼吸器官(肺、支气管、气道等)中过敏性疾病的实例包括，但不限于，过敏性哮喘等。呼吸器官(肺、支气管、气道等)中炎性疾病的实例包括，但不限于，慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、支气管炎、间质性肺炎、肺纤维化、肺水肿、成人呼吸窘迫综合征等。

当本发明的抗体被“包含作为有效成分”时，意指本发明的抗体被包含作为至少一种有效成分，并且不限制其含量。本发明的药物组合物可以含有其他一种或多种有效成分连同本发明的抗体。

本发明的抗体可以根据常规方法(例如，Remington's Pharmaceutical Science,最新版, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A)进行配制。此外，如果需要，它可以含有药学上可接受的载体和/或添加剂。例如，它可以含有表面活性剂(PEG、Tween等)、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、着色剂、调味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂(磷酸盐、柠檬酸盐、其他有机酸等)、螯合剂(EDTA等)、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、矫味剂等。不限于这些，本发明的药物组合物可以适当地含有其他常规载体。具体实例包括轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯乙缩醛二乙基氨基乙酸酯(polyvinylacetaldiethylaminoacetate)、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。它也可以含有其他低分子量多肽、血清白蛋白、明胶和蛋白，诸如免疫球蛋白等，以及氨基酸。当配制用于注射的水溶液时，将本发明的抗体溶解于，例如，含有盐水、葡萄糖或其他助剂的等渗溶液中。助剂的实例包括D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、和氯化钠，并且可以与合适的增溶剂，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子表面活性剂(聚山梨醇酯80、HCO-50)等组合使用。

在必要时，也可以将多肽包括在微胶囊(由羟甲基纤维素、明胶、聚[甲基丙烯酸甲酯]等制成的微胶囊)中，或配制作为胶体药物递送系统(脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊等) (参见Remington's Pharmaceutical Science 第16版 &, Oslo Ed.(1980)等)。此外，配制药物作为缓释的药物的方法也是已知的，并且适用于多肽(Langer等人, J. Biomed. Mater. Res. (1981)15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982)12:98-105; 美国专利号 3,773,919; EP-A-58,481; Sidman 等人, Biopolymers (1983)22: 547-56; EP号 133,988)。此外，也可以通过将透明质酸酶添加至本药剂或与本药剂掺合以增加待皮下施用的液体量(例如，WO 2004/078140等)。

药物组合物中本发明的抗体的含量为，例如，整个药物组合物的约0.01 - 100wt%，优选0.1 - 99.9 wt%。

尽管本发明的药物组合物可以口服和肠胃外施用，但其优选肠胃外施用。具体地，通过注射或经皮施用将其施用于患者。作为注射的剂型的实例，可以通过静脉内注射、肌内注射、皮下注射等全身或局部施用。也可以通过局部注射、特别是肌内注射将其施用于治疗部位或其附近。经皮施用的剂型的实例包括软膏、凝胶、乳膏、膏药、贴剂等，其可以全身或局部施用。此外，施用方法可以根据患者的年龄和症状适当地选择。剂量可以选自，例如，作为本发明的抗体的0.5 mg–2.5 mg/kg体重的范围。然而，本发明的药物组合物不受这些剂量的限制。

本发明提供了可用于分析人CD69在过敏性疾病、炎性疾病等中的功能的非人哺乳动物。具体地，本发明提供了包含用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳动物的转移的Th2细胞的非人哺乳动物，其表达人CD69。

非人哺乳动物的实例包括实验动物诸如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔等，家畜动物诸如猪、牛、山羊、马、绵羊等，宠物诸如狗、猫等，灵长类动物诸如猴、猩猩、黑猩猩等。非人哺乳动物优选为小鼠。

Th2细胞来源的CD69缺陷的非人哺乳动物的基因型对于本发明的非人哺乳动物的动物物种可以是免疫学自身的(即同系的)或免疫学非自身的(即，同种异体或异种异体的)。由于转移的Th2细胞被长期植入体内，所以它优选免疫学自身的。

是CD69缺陷的是指其中防止CD69基因本质具有的正常功能的足够操作的状态。其实例包括CD69基因的表达完全不存在，表达水平降低(其中CD69基因本质具有的正常功能不能充分表现)，CD69基因产物的功能的完全丧失，和CD69基因产物的功能降低(其中CD69基因本质具有的正常功能不能表现)。

CD69缺陷的非人哺乳动物优选是伴随基因组DNA的修饰的动物，即，转基因动物。CD69缺陷的非人哺乳动物可以是CD69基因缺陷的杂合子，或CD69基因缺陷的纯合子，优选CD69基因缺陷的纯合子。

CD69缺陷的非人哺乳动物可以通过以下获得，例如，用诱导CD69基因的同源重组的靶向载体转染ES细胞以制备引入有CD69基因的等位基因之一缺陷的ES细胞，从获得的ES细胞制备源自其的引入有CD69基因的等位基因之一缺陷的子代动物，并且杂交子代动物。对于CD69缺陷小鼠的产生，可以提及，例如，Murata, K. 等人 2003. Int. Immunol. 15:987-992。

抗原的类型没有特别限制，只要其具有对CD69缺陷的非人哺乳动物的抗原性，并且可以选择期望的抗原。抗原的实例包括具有对CD69缺陷的非人哺乳动物的抗原性的蛋白、肽、脂质、糖链等。

CD69缺陷的非人哺乳动物可以通过以足以用于免疫CD69缺陷的非人哺乳动物的量注射抗原来用抗原进行免疫。例如，以1–3周内一次的频率用抗原免疫CD69缺陷的非人哺乳动物，总共2–6次。对于免疫，可以将抗原连同佐剂施用于CD69缺陷的非人哺乳动物。尽管佐剂没有特别限制，只要它可以增强免疫原性，但可以提到，例如，氢氧化铝、匙孔

血蓝蛋白、葡聚糖、BCG、磷酸铝、TLR配体(例如，脂多糖(LPS)，CpG)等。氢氧化铝等优选用于有效诱导Th2细胞。

Th2细胞是指通过抗原刺激从幼稚CD4T细胞分化且主要产生IL-4的CD4T细胞。

Th2细胞可以通过以下获得，例如，从用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳动物脾脏或外周血中分离CD4T细胞，并且在抗原、抗原递呈细胞、IL-2和IL-4存在的情况下培养CD4T细胞。也可以使用固定的抗TCR抗体或抗CD3抗体来替代抗原。可以通过组合使用固定的抗CD28抗体来更有效地诱导Th2细胞。

获得的细胞是否是Th2细胞可以通过用抗原刺激获得的细胞，并通过流式细胞术评价其相比于IFN-γ是否主要产生IL-4来证实。

为了实现在CD69缺陷的非人哺乳动物的Th2细胞中人CD69的表达，通常，用能够在非人哺乳动物的Th2细胞中表达人CD69的表达载体转染CD69缺陷的非人哺乳动物的Th2细胞。作为载体，可以提到质粒载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。当使用逆转录病毒载体时，可以将转基因容易地整合至染色体中，并且可以稳定地持续人CD69的表达，甚至当Th2细胞增殖时。因此，逆转录病毒载体优选用于本发明中。对于通过逆转录病毒基因转移至Th2细胞中的细节，参见，例如，Kimura, M. 等人2001. Immunity 15: 275-287。

Th2细胞中人CD69的表达可以通过流式细胞术使用抗人CD69抗体来证实。

可以将表达人CD69的用特定抗原免疫的CD69缺陷的非人哺乳动物的Th2细胞通过将Th2细胞静脉内或腹膜内注射至受体非人哺乳动物而转移至受体非人哺乳动物中。待转移的Th2细胞的数目没有特别限制，只要在受体非人哺乳动物中可以观察到转移的Th2细胞对所述抗原的应答反应。当受体非人哺乳动物是小鼠时，例如，优选转移1,000,000 – 3,000,000个Th2细胞。

转移的Th2细胞通过用特定抗原刺激而活化，以产生大量IL-4。因此，当本发明的非人哺乳动物暴露于所述抗原时，由表达人CD69的Th2细胞介导的过敏性反应和与其相关的炎症反应发生。本发明还提供了此类非人哺乳动物过敏模型。使用本发明的非人哺乳动物，可以很容易地在体内分析人CD69在过敏性反应和炎症反应中的作用。此外，可以在非人哺乳动物中进行抗人CD69抗体对过敏性疾病和炎性疾病的效力评价。

本说明书中引用的所有参考文献，包括出版物、专利文献等，单独地且明确地通过引用并入本文，至其全部内容已明确地在本文公开的程度。

实施例

本发明在下面通过参照实施例更详细地进行解释，所述实施例不应当被解释为限制性的。实施例中的各种基因操作遵循Molecular cloning第三版(Cold Spring HarborLab.Press, 2001)中描述的方法。

[实施例1]

抗原和抗体的产生

(1) 人CD69重组蛋白的产生

由于人CD69经由半胱氨酸68形成同源二聚体，所以将编码含有半胱氨酸68的胞外区(氨基酸序列；62-199)的cDNA (NM_001781)插入用于大肠杆菌周质表达的载体。将预先制备的大肠杆菌TG1F(-)菌株的感受态细胞(Z-感受态大肠杆菌转化缓冲组(Transformation Buffer Set)：由ZYMO RESEARCH制造)用该表达载体转化，并且在37℃在含有氯霉素(终浓度34 μg/mL)的LB琼脂平板上培养过夜。将该大肠杆菌细胞接种在2×YT培养基中，并在37℃培养3-5小时(OD600=0.5-0.8)。添加IPTG(终浓度0.1 mM)，并将混合物在25℃培养过夜。通过离心收集培养的大肠杆菌细胞，并用裂解缓冲液(200 mM硼酸盐，160mM NaCl，2 mM EDTA，1 mg/ml溶菌酶，pH8.0)裂解，并离心裂解物以得到可溶性级分。从该可溶性级分，根据Strep-Tactin柱(由IBA制造)的标准方法纯化人CD69同源二聚体蛋白。此外，通过SDS-PAGE证实纯化的人CD69重组蛋白的纯度不小于95％，并且通过使用BCA蛋白测定试剂盒(由PIERCE制造)测定蛋白浓度。

(2) 人CD69重组蛋白的生物素化

根据EZ-Link NHS-PEO₄-Biotin (Thermo Scientific)的标准方案将纯化的人CD69重组蛋白生物素化，并且通过使用BCA蛋白测定试剂盒(由PIERCE制造)测定浓度。

(3) 通过噬菌体展示方法选择人CD69特异性抗体克隆

在4℃将生物素化的人CD69重组蛋白固定在链霉抗生物素蛋白包被的磁珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1磁珠，由Invitrogen制造，100 μl)上1小时，并且用1ml PBST (含有0.05% Tween 20的PBS)洗涤5次。使用用于人抗体噬菌体文库的HuCAL GOLD(由MorphoSys制造)，根据WO 2007/042309、WO 2006/122797等中描述的方法进行抗体选择。将人CD69-固定的珠添加至该噬菌体文库以结合抗原特异性抗体。将磁珠回收并洗涤数次，并将噬菌体从磁珠洗脱下来。用洗脱的噬菌体感染大肠杆菌细胞，并在37℃培养过夜。从噬菌体感染的大肠杆菌细胞拯救噬菌体的操作遵循一般方法(Molecular cloning 第三版 Cold Spring Harbor Lab.Press, 2001)。将上述选择轮次重复几次，以浓缩展示对于抗原特异性的抗体的噬菌体。

(4) 通过ELISA筛选抗原特异性抗体

将浓缩操作后获得的Fab基因的合并物亚克隆到大肠杆菌表达载体中。根据WO2006/122797等中描述的方法，表达Fab抗体，并通过ELISA方法筛选抗原特异性抗体。根据Strep-Tactin柱(由IBA制造)的标准方法从大肠杆菌裂解物的可溶性级分纯化Fab抗体。此外，通过SDS-PAGE证实纯化的抗体的纯度，并且通过使用BCA蛋白测定试剂盒(由PIERCE制造)测定浓度。

(5) 通过细胞染色评价筛选抗体克隆

通过人CD69和小鼠CD69过表达细胞的细胞染色进一步评价纯化的ELISA阳性的Fab抗体克隆的抗原反应性。作为抗原，使用在使用FreeStyle MAX试剂(由Invitrogen制造)通过标准方法用人CD69或小鼠CD69表达载体转染后48小时用4% PFA固定的CHO-S细胞。用50 μg/ml纯化的Fab抗体作为用于染色的一抗，将细胞在室温下孵育1小时，并且用PBS洗涤3次。用500倍稀释的Alexa555标记的抗人IgG(由Invitrogen制造)作为二抗，将细胞在室温下孵育1小时，并且用PBS洗涤3次。在荧光显微镜(IX71，由OLYMPUS制造)下观察这些细胞，并且评价染色存在与否。作为结果，证实160-c76克隆结合人CD69 (hCD69)和小鼠CD69(mCD69)两者(图1)，并且160-c7和160-c103仅结合人CD69，并且最终获得总共3个克隆作为特异性结合细胞表面上的天然形式人CD69的抗人CD69抗体克隆。

(6) 抗人CD69抗体克隆的碱基序列的分析

培养获得的三个大肠杆菌克隆(160-c7、160-c76和160-c103)，并且将质粒回收(QIAprep Spin微量制备试剂盒：由QIAGEN制造)，并用于碱基序列分析。表1显示各个克隆的CDR (互补决定区)的氨基酸序列。

(7) 抗人CD69抗体克隆的IgG抗体的产生

将获得的3个克隆的Fab抗体基因亚克隆以构建IgG表达载体(重链的恒定区是IgG4)。根据Lipofectamine (由Invitrogen制造)的标准方法用这些表达载体转染HEK293T细胞，并回收培养72小时后的培养上清液。作为培养基，使用用10% Ultra Low IgG FBS(由Invitrogen制造)补充的DMEM (Sigma)。从培养上清液，使用rProteinA SepharoseFast Flow (由GE healthcare制造)的标准方法纯化IgG抗体。通过SDS-PAGE证实纯化后的蛋白显示单一条带，并且通过使用BCA蛋白测定试剂盒(由PIERCE制造)测定浓度。

[实施例2]

抗人CD69抗体对肺泡内单核细胞浸润的影响

使用通过将BALB/c小鼠或对BALB/c回交不少于10次的CD69缺陷(CD69KO)小鼠(Murata, K. 等人2003. Int. Immunol. 15: 987-992)与DO11.10转基因小鼠杂交而获得的小鼠。通过AutoMACS分选仪(Miltenyi Biotec)将这些小鼠的脾脏CD4T细胞纯化至>98%的纯度。在Th2条件(IL-2 10 u/ml, IL-4 100U/ml)下在用固定的抗TCR和抗CD28单克隆抗体刺激的情况下培养分离的CD4T细胞。培养开始后两天，且通过含有人CD69 (hCD69)基因的逆转录病毒载体引入人CD69基因。引入人CD69基因的方法遵循先前描述的方法(Kimura,M.等人 2001.Immunity 15:275-287)。培养开始后五天，将培养的细胞回收，并且通过流式细胞术证实人CD69的表达(图2)。所述细胞的50.2％是人CD69阳性的。

将通过上述培养获得的过表达人CD69 (hCD69)的CD69 KO小鼠Th2细胞或野生型BALB/c小鼠Th2细胞的3,000,000个细胞静脉内注射入野生型BALB/c小鼠(第0天)。细胞转移后，在第1天和第3天，使用超声波喷雾器(NE-U07；由Omron制造)使小鼠经由气道通过吸入气溶胶化的盐水中的1% OVA溶液持续30分钟而暴露于过敏原攻击。

在第1天，在OVA吸入前2小时，以100 μg/小鼠的剂量腹膜内注射以下抗体：

对照抗体(抗“TSLYKKAG”肽，IgG4，自主开发)

小鼠抗人CD69单克隆抗体(由BioLegend制造的FN50)

160-c7

160-c76

160-c103。

在第5天，根据前述报道，进行支气管肺泡灌洗(BAL) (Kamata, T. 等人, 2003,J.Clin.Invest.111:109-119)。收集所有支气管肺泡灌洗液，并计数150 μl分级液体中的细胞。通过Cytospin 4 (由Thermo Fisher Scientific制造)将活BAL细胞(100,000个细胞)细胞离心至载玻片上，并用May-GruenwaldGiemsa溶液(由Merck制造)染色。在每个载玻片上计数500个白细胞，并使用形态学标准鉴定细胞类型。计算每种细胞类型的百分比。

结果显示在图3中。抗-hCD69抗体抑制单核细胞的肺泡内浸润，特别是嗜酸性粒细胞的浸润，这是由OVA吸入引起的。

[实施例3]

高亲和力抗人CD69抗体的选择

通过将突变引入实施例1中选择的抗体的轻链CDR3尝试选择对人CD69具有更高亲和力的抗体。具体地，采用Prassler J, Steidl S, Urlinger S. Immunotherapy. 2009Jul; 1(4):571-83.和Hillig RC, Urlinger S, Fanghanel J, Brocks B, Haenel C,Stark Y, Sulzle D, Svergun DI, Baesler S, Malawski G, Moosmayer D, Menrad A,Schirner M, Licha K. J Mol Biol. 2008 Mar 14; 377(1):206-19中描述的方法。将抗体选择轮次重复两次，检查获得的抗体克隆的轻链CDR3的碱基序列，并鉴定具有新型序列的抗体克隆。将它们在大肠杆菌中表达，并通过使用裂解物针对抗原进行ELISA，并且通过夹心ELISA同时测量裂解物中抗体的量。从针对抗原的ELISA的吸光度和抗体量计算每个克隆的相对特异性结合活性，并选择高亲和力克隆。此外，制备具有高亲和力的前10个克隆的IgG，并测量K_D值。

以与实施例1中相同的方式，将Fab抗体基因亚克隆以构建IgG表达载体(重链的恒定区是IgG4)。通过Lipofectamine (由Invitrogen制造)用表达载体转染HEK293T细胞，培养72小时，并从回收的培养上清液中纯化IgG抗体。

通过斯卡恰特图计算制备的IgG克隆对人CD69的亲和力。具体地，根据Immunoassays (OXFORD UNIVERSITY PRESS, 2000)中描述的原理计算它。将抗体与各种浓度的抗原在室温下孵育2小时，直到其达到平衡，并且通过ELISA方法测量孵育液中存在的游离抗体的量。基于每个平衡样品中游离抗体量的变化测定结合常数和解离常数(K_D值)。平衡反应中抗体的浓度设定为0.015 μg/ml，并且将以1 μg/ml的抗原固定的ELISA板用于游离抗体量的测量。

作为结果，从除了轻链CDR3以外与160-c76具有相同CDRs的克隆选择结合人CD69同时保持与小鼠CD69的交叉反应性的多个高亲和力克隆。表2显示轻链CDR3的氨基酸序列和对于人CD69显示特别高亲和力的两个克隆234-61和234-83的亲和力。这两个克隆对于人CD69的亲和力增加至除了轻链CDR3以外具有相同序列的160-c76克隆的亲和力的9倍或更高。

[实施例4]

与小鼠CD69的交叉反应性

如下评价与小鼠CD69的反应性。从野生型小鼠和CD69 KO小鼠(两者均为Balb/c)分离脾细胞，并用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激4小时，以诱导细胞表面上CD69的表达。将每种抗人CD69抗体(160-c76、234-61和234-83) (1 μg)添加至1x10⁶个脾细胞，并将混合物在冰上孵育30 min。洗涤细胞，添加抗人IgG-Alexa488 (x200稀释的)作为二级抗体，并将混合物在冰上孵育20 min。洗涤细胞后，通过流式细胞术(FACS Calibur：由Becton, Dickinson制造)评价用每种抗人CD69抗体染色的强度。作为阳性对照，使用仓鼠抗小鼠CD69单克隆抗体(H1.2F3)-FITC (由Becton, Dickinson制造)。

另一方面，通过使用健康受试者的外周血单核细胞(PBMC)(通过用PMA刺激4小时诱导其在细胞表面上表达CD69)以与对于小鼠CD69相同的方式评价与人CD69的反应性。作为阳性对照，使用小鼠抗人CD69单克隆抗体(FN50) (由BioLegend制造)。

作为结果，所有160-c76、234-61和234-83克隆都结合活化的小鼠脾细胞和活化的人外周血单核细胞，并且观察与小鼠CD69(mCD69)和人CD69(hCD69)两者的交叉反应 (图4)。与160-c76相比，234-61对小鼠CD69的染色强度弱。另一方面，234-83强烈结合小鼠CD69。

[实施例5]

抗人CD69抗体对肺泡内单核浸润的影响

根据与实施例2中类似的方案评价以下抗人CD69抗体对肺泡内单核浸润的影响。

对照抗体(抗“TSLYKKAG”肽，IgG4，自主开发)

小鼠抗人CD69单克隆抗体(由BioLegend制造的FN50)

160-c76

234-61

234-83。

用4 mg氢氧化铝凝胶(alum)中250 μg OVA (来自Sigma-Aldrich的母鸡卵白蛋白)腹膜内免疫对BALB/c回交不少于10次的CD69缺陷(CD69 KO)小鼠。使用CD4+T细胞分离试剂盒(由Miltenyi Biotec制造)和AutoMACS分选仪(由Miltenyi Biotec制造)将OVA-免疫的CD69缺陷小鼠的脾CD4T细胞纯化至>98%的纯度。在Th2条件下在用固定的抗TCR和抗CD28 mAbs刺激的情况下培养分离的CD4T细胞。培养开始后两天，通过含有人CD69 (hCD69)基因的逆转录病毒载体引入hCD69基因。培养开始后五天，将培养的细胞回收，并且通过流式细胞术证实hCD69的表达。所述细胞的58.7%是hCD69阳性的。

将通过上述培养获得的过表达hCD69的CD69 KO小鼠Th2细胞或野生型BALB/c小鼠Th2细胞的3,000,000个细胞静脉内注射入野生型BALB/c小鼠(第0天)。细胞转移后，在第1天和第3天，使用超声波喷雾器(NE-U07；由Omron制造)使小鼠经由气道通过吸入气溶胶化的盐水中的1% OVA溶液持续30分钟而暴露于过敏原攻击。

在第1天，在OVA吸入前2小时，以100 μg/小鼠的剂量腹膜内注射评价目标抗体。在第4天，根据前述报道，进行支气管肺泡灌洗(BAL) (Kamata, T. 等人, 2003, J. Clin.Invest.111:109-119)。收集所有支气管肺泡灌洗液，并计数150 μl分级液体中的细胞。通过Cytospin 4 (由Thermo Fisher Scientific制造)将活BAL细胞(100,000个细胞)离心至载玻片上，并用May-GruenwaldGiemsa溶液(由Merck制造)染色。在每个载玻片上计数500个白细胞，并使用形态学标准鉴定细胞类型。计算每种细胞类型的百分比。

结果显示在图5中。所有评价的抗hCD69抗体都抑制OVA吸入引起的白细胞(嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)的肺泡内浸润。白细胞浸润抑制能力为FN50<160-c76<234-61<234-83，由此证实亲和力改进对白细胞浸润抑制能力的增强。

[实施例6]

表位的鉴定

使用其上固定人CD69的部分肽的肽阵列，进行抗人CD69抗体234-83、160-c7和160-c103的表位作图（epitope mapping）。具体地，如下表中显示，对于覆盖人CD69(60-199)的细胞外结构域的序列产生由具有12个氨基酸残基的残基数目和3个氨基酸残基的偏移(offset)的肽组成的肽阵列(PepSpots，由JPT制造)。根据JPT的手册将肽阵列和抗人CD69抗体反应。使用用HRP (过氧化物酶标记试剂盒- NH2，由Dojindo制造) 标记的抗人CD69抗体。

作为结果，234-83特异性结合上述肽#2和#3，特别强烈结合肽#3。结果表明，234-83的表位含有SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列(YNCPG)，这对于肽#2和肽#3，且对于人CD69和小鼠CD69是常见的(图6)。

160-c7特异性结合上述肽#26。结果显示，160-c7在由SEQ ID NO:59中显示的氨基酸序列组成的表位处结合人CD69。

160-c103特异性结合上述肽#24、#25和#26。结果表明，160-c103的表位含有SEQID NO:78中显示的氨基酸序列(YAGREE)，这对于肽#24、#25和#26是常见的。

工业实用性

本申请基于在日本提交的专利申请号 2012-098243 (申请日：2012年4月23日)，其内容完全并入本文。

Claims

1.特异性结合人CD69的抗体，其具有抑制过敏性炎症的活性，并且具有与小鼠CD69的交叉反应性，所述抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中

所述轻链可变区含有由SEQ ID NO:7中显示的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQ ID NO:8中显示的氨基酸序列组成的CDR2，和由SEQ ID NO: 9、19或20中显示的氨基酸序列组成的CDR3，并且所述重链可变区含有由SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQID NO:11中显示的氨基酸序列组成的CDR2，和由SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列组成的CDR3。

2.根据权利要求1的抗体，其中

所述轻链可变区由SEQ ID NO: 23、27或28中显示的氨基酸序列组成，并且所述重链可变区由SEQ ID NO: 24显示的氨基酸序列组成。

3.根据权利要求1或2的抗体，其关于与人CD69的结合亲和力具有不大于5x10^-8 M的K_D值。

4.根据权利要求1或2的抗体，其是人抗体。

5.药物组合物，其包含根据权利要求1-4中任一项的抗体。

6.用于过敏性疾病或炎性疾病的预防剂或治疗剂，其包含根据权利要求1-4中任一项的抗体。

7.多核苷酸，其编码根据权利要求1-4中任一项的抗体。

8.载体，其包含根据权利要求7的多核苷酸。

9.转化体，其包含根据权利要求8的载体。

10.根据权利要求1-4中任一项的抗体用于生产预防或治疗过敏性疾病或炎性疾病的药剂的用途。