ES2244270A1 - Nueva estrategia de regulacion inmune fundamentada en la molecula inducible durante la activacion leucocitaria cd69. - Google Patents
Nueva estrategia de regulacion inmune fundamentada en la molecula inducible durante la activacion leucocitaria cd69.Info
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Abstract
Nueva estrategia de regulación inmune fundamentada en la molécula inducible durante la activación leucocitaria DC69. La presente invención se refiere a la utilización de una cantidad efectiva de un antagonista de CD69 seleccionado del grupo: una molécula de anticuerpo humanizada anti-CD69, una molécula de anticuerpo humana anti-CD69 , una molécula de anticuerpo quimérica anti-CD69 y una molécula de anticuerpo desinmunizada anti-CD69 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un sujeto que necesite o pueda beneficiarse de una respuesta inmune aumentada.
Description
Nueva estrategia de regulación inmune
fundamentada en la molécula inducible durante la activación
leucocitaria CD69.
La presente memoria descriptiva se refiere a una
solicitud de Patente de Invención, correspondiente a una nueva
estrategia de regulación inmune fundamenta en la molécula inducible
durante la activación leucocitaria CD69, se basa, en parte, en el
descubrimiento de que la modulación de CD69 se puede usar para
modular la respuesta inmune de un sujeto y así tratar una variedad
de desórdenes de origen inmune. Los antagonistas y eliminadores de
CD69 son útiles, como se describe más tarde.
De acuerdo con esto, en un aspecto la invención
caracteriza métodos de tratamiento de un sujeto, por ejemplo un
sujeto que tiene un desorden caracterizado por una respuesta inmune
no deseada. El desorden se puede caracterizar por una respuesta
inmune que es aumentada respecto a lo que normalmente se ve en un
sujeto. Ejemplos de tales desórdenes se indican aquí e incluyen
desórdenes inflamatorios agudos o crónicos, y desórdenes inmunes,
por ejemplo desórdenes autoinmunes. El método incluye administrar
una cantidad efectiva de un eliminador de células que expresan CD69
al sujeto.
Ejemplos de eliminadores de CD69 incluyen
aquellos descritos aquí, pero no están limitados a, moléculas de
anticuerpo que se unan a CD69 y eliminen células que expresan CD69,
por ejemplo un anticuerpo anti-CD69 humano análogo
al anticuerpo anti-CD69 de ratón 2.3 o cualquier
anticuerpo anti-CD69 de la bibliografía que pueda
actuar como eliminador de células que expresan CD69 (o una molécula
de anticuerpo basada en él, por ejemplo, un fragmento del
anticuerpo o un anticuerpo quimera, humanizado o desinmunogénico),
una molécula de anticuerpo que se una al epítopo al que se une tal
anticuerpo, una molécula de anticuerpo que compita por la unión con
tal anticuerpo, o una molécula de anticuerpo identificada por algún
método descrito aquí. En un ejemplo, un anticuerpo anti CD69
eliminador puede reclutar una célula inmune (por ejemplo, vía un
receptor de Fc o por reclutamiento del sistema de complemento) e
inactivar o lisar la célula diana, por ejemplo, la célula que
expresa CD69. En otro ejemplo, el eliminador puede activar la vía
clásica del complemento que lleva a la eliminación de la célula
diana, por ejemplo, la célula que expresa CD69. En otro ejemplo, el
eliminador es un anticuerpo anti-CD69 que está
unido a un agente terapéutico, por ejemplo, una proteína, droga o
isótopo, que puede inactivar o destruir la célula diana, por
ejemplo la célula que expresa CD69.
En algunos ejemplos, el sujeto tiene una
enfermedad inflamatoria, por ejemplo, una enfermedad inflamatoria
aguda o crónica. Ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no
se limitan a : daño agudo de pulmón, síndrome de distress
respiratorio agudo, artritis (por ejemplo AIC), asma, bronquitis,
fibrosis quística, encefalomielitis, hepatitis (por ejemplo
hepatitis viral crónica), enfermedad inflamatoria intestinal,
esclerosis múltiple, daño por reperfusión (por ejemplo miocárdica),
nefritis, pancreatitis, psoriasis, oclusión arterial (por ejemplo
de retina), accidente cerebro vascular, lupus eritematoso
sistémico, trasplante (por ejemplo rechazo del trasplante por el
huésped, por ejemplo, tejido trasplantado tal como células madre
hematopoiéticas o un órgano, por ejemplo, un riñón, o respuesta
contra el huésped provocada por el trasplante, por ejemplo,
enfermedad del injerto contra el huésped), daño inducido por luz
ultravioleta, y/o vasculitis. La enfermedad inflamatoria puede ser
aguda o crónica, y es mediada preferiblemente por leucocitos. En
algunos ejemplos, la enfermedad inflamatoria se asocia con la
inflamación crónica, por ejemplo la enfermedad inflamatoria
intestinal, tal como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa,
psoriasis, sarcoidosis y artritis reumatoide.
En un ejemplo preferido, el método incluye
administrar un eliminador de células que expresan CD69 en
combinación con un segundo agente terapéutico, por ejemplo un
agente terapéutico o un agente para tratar la inflamación. El
segundo agente puede ser un anticuerpo o un agente diferente.
El sujeto puede ser un mamífero, por ejemplo un
primate, preferiblemente un primate superior, por ejemplo un
humano.
En algunos ejemplos, el eliminador de células
que expresan CD69 puede ser administrado al sujeto sistémicamente
(por ejemplo, oralmente, parenteralmente, subcutáneamente,
intravenosa, por vía rectal, intramuscularmente,
intraperitonealmente, intranasalmente, por vía transdérmica, o por
inhalación o por administración intracavitaria), tópicamente, o
por aplicación a las membranas mucosas, tales como la nariz, la
garganta o los bronquios.
En un ejemplo preferido, el eliminador de CD69
se administra de manera repetida. Por ejemplo, el eliminador de
CD69 se puede administrar 2, 4, 6 ó más veces. La administración
puede ser repetida hasta que la mejora en la condición del sujeto se
vea o se espere. La administración puede ser a una frecuencia de
una cada 5 a 7 días, 14 a 30 ó 30 a 60 días. La administración de
otros compuestos puede ser más frecuente. Por ejemplo, una pequeña
molécula puede administrarse una, dos, tres, cuatro o más veces al
día.
En otro aspecto, la invención caracteriza
métodos de tratamiento de un sujeto, por ejemplo, un sujeto que
necesite o un sujeto que podría beneficiarse de, una respuesta
inmune aumentada. El sujeto puede tener un desorden caracterizado
por una respuesta inmune disminuida, por ejemplo, una respuesta
inmune que está reducida comparado con lo que se ve en la ausencia
de dicho desorden, por ejemplo el sujeto podría tener una
inmunodeficiencia. En otros ejemplos, el sujeto no tiene una
respuesta inmune disminuida o comprometida, pero se beneficiaría de
una respuesta inmune aumentada. Por ejemplo, el sujeto podría tener
un desorden caracterizado por células o tejidos no deseados, o
caracterizado por una proliferación celular anormal, tal como
sucede en el cáncer. El método puede ser también usado para
aumentar la respuesta inmune en un sujeto, por ejemplo una
respuesta inmune a un antígeno (por ejemplo una vacuna). El método
incluye la administración de un antagonista de CD69 al sujeto.
Ejemplos de antagonistas de CD69 incluyen, pero
no se limitan a, antisentido de CD69, RNAi para interferir con el
mensajero para CD69, una molécula de anticuerpo antagonista para
anti-CD69, y otros compuestos identificados por
algún método descrito aquí, por ejemplo, compuestos que
interaccionan con CD69 y disminuyen la expresión de
TGF-\beta por una célula, pequeñas moléculas que
se unan a CD69 y antagonicen su actividad, y moléculas de
anticuerpo anti-CD69 antagonistas. Ejemplos de
pequeñas moléculas incluyen, pero no se limitan a, péptidos,
peptidomiméticos (por ejemplo peptoides), aminoácidos, análogos de
aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos,
nucleótidos, análogos de nucleótidos, compuestos orgánicos e
inorgánicos (incluyendo compuestos heteroorgánicos y
organometálicos) con peso molecular menor de unos 5000 g/mol, y
sales, ésteres y otras formas aceptables farmacológicamente de
tales compuestos. Ejemplos de otros antagonistas de CD69 incluyen,
pero no se limitan a: antagonistas del receptor de CD69 (CD69R),
polipéptidos, péptidos, peptidomiméticos, formas solubles de CD69R,
proteínas de fusión antagonistas de CD69R, por ejemplo, proteínas
de fusión de antagonistas de CD69R con proteínas del suero (por
ejemplo proteínas de fusión de CD69R con inmunoglobulinas, o de
CD69R con albúmina de suero humana) o otras formas de proteínas de
fusión antagonistas de CD69R diseñadas para aumentar la vida media
en el suero y/o la multivalencia.
Ejemplos de moléculas de anticuerpo antagonistas
de anti-CD69 incluyen, pero no se limitan a,
moléculas de anticuerpo que unen CD69 e interfieren con la unión de
CD69 y un polipéptido que se une a CD69, por ejemplo, un
anticuerpo anti-CD69 humano, por ejemplo, un
anticuerpo anti-CD69 humano análogo al anticuerpo
anti-CD69 de ratón 2.2 o a cualquier anticuerpo
anti-CD69 conocido en la bibliografía que pueda
actuar como antagonista (o una molécula de anticuerpo basada en el,
p.e, un fragmento de anticuerpo, o un anticuerpo quimera, humanizado
o desinmunogénico) o una molécula de anticuerpo que se une al
epítopo unido por tal anticuerpo, o una molécula que compita por la
unión con tal anticuerpo, o una molécula de anticuerpo que se una o
interfiera con la unión de otro anticuerpo o ligando a uno o más de
los residuos de aminoácidos Glu 140, Asp171, Glu 180, Glu 185, Glu
187, Phe 175, Met 184, Leu 190, Glu 185 y Lys188 del CD69
humano.
En algunos ejemplos, el sujeto tiene una
enfermedad caracterizada por la proliferación no deseada de células
malignas o no malignas, por ejemplo cáncer. Ejemplos de cáncer
incluyen, pero no se limitan a, cáncer de tracto biliar, cáncer de
cerebro, cáncer de mama, cáncer cervical, coriocarcinoma, cáncer de
colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico,
neoplasias intraepiteliales, leucemias, linfomas, cáncer de hígado,
cáncer de pulmón (por ejemplo de células pequeñas y de células no
pequeñas), melanoma, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer de ovario,
cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de recto, sarcomas,
cáncer de piel, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, y cáncer
renal, así como otros carcinomas y sarcomas. En un ejemplo
preferido, el cáncer es un tumor que no expresa CD69.
En un ejemplo preferido, el método incluye la
administración de un antagonista de CD69 en combinación con un
agente secundario, por ejemplo, con uno o más agentes terapéuticos,
por ejemplo, un agente terapéutico o agente para el tratamiento de
la proliferación celular no deseada. El segundo agente puede ser
un anticuerpo o no. Los agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo,
uno o más agentes quimioterápicos, radioisótopos, o citotoxinas.
Ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen el taxol, la
citocalasina B, la gramicidina D, la mitomicina, el etopóxido, el
tenopóxido, la vincristina, la vinblastina, la colchicina, el
busulfan, el cisplatino, la doxorubicina, la claunorubicina, la
dihidroxi-antracin-diona, la
mitoxantrona, la mitamicina, el clorambucilo, la gencitabina, la
actinomicina, la procaína, la tetracaína, la lidocaína, el
propanolol, la puromicina, los maitansinoidses y análogos u
homólogos de estos. Agentes terapéuticos adicionales incluyen, pero
no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo metotrexato,
6-mercaptopurina, 6-tioguanina,
citarabina, 5-fluorouracil decarbacina), agentes
alquilantes (por ejemplo, mecloretamina,
tioepa-clorambucilo, CC-1065,
melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida,
busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y
cis-diclorodiamina-platino (II)
(DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo daunorubicina (antes
daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (por ejemplo,
dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y
antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (p.e,
vincristina, vinblastina, taxol y maitansinoides). Los
radioisótopos pueden incluir emisores alfa, beta y/o gamma. Ejemplos
de radioisótopos son: ^{212}Bi, ^{213}Bi, ^{131}I, ^{211}At,
^{186}Re, ^{90}Y y ^{117}Lu. El antagonista de CD69 se puede
administrar antes, durante o tras el tratamiento con el otro agente
terapéutico.
En un ejemplo, el sujeto tiene una
inmunodeficiencia, por ejemplo, síndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA), una inmunodeficiencia hereditaria, o una
inmunodeficiencia causada por la exposición a un agente ambiental o
medicinal (por ejemplo, un agente quimioterápico o un tratamiento
de radiación).
En otro ejemplo, el sujeto tiene un desorden
hiperproliferativo no patológico, por ejemplo, fibrosis. El desorden
fibrótico puede asociarse con uno o más de: traumatismo, cirugía,
infección, polución ambiental, alcohol, tabaco y otras toxinas. El
desorden puede asociarse con, por ejemplo, uno o más de:
reparación de heridas hipertrófica (por ejemplo, cicatrices
hipertróficas y queloides), fibrosis renal (proliferación de
células mesangiales), fibrosis de hígado (proliferación de células
estelares del hígado). Ejemplos de desórdenes fibróticos incluyen:
queloides, quemaduras, cicatrices hipertróficas u otros desórdenes
de la piel (por ejemplo, esclerodermia local o sistémica, por
ejemplo, esclerosis sistémica con esclerodermia), cirrosis
hepática, fibrosis renal (p.e, relacionada con diabetes o
hipertensión), adhesiones quirúrgicas (p.e, tras cirugía
gastrointestinal o adhesiones de neocirugía), trasplantes
vasculares, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis inducida por
radiación, fibrosis relacionada con el asbesto (p.e, pulmón marrón
o negro), fibrosis asociada con hepatitis viral, degeneración
macular, retinopatía vitreal y retinal, y fibrosis asociada con
síndrome respiratorio agudo. La fibrosis puede ser de tipo agudo o
crónico. Ejemplos de fibrosis aguda incluyen: heridas accidentales,
infecciones, cirugía, quemaduras, fibrosis inducida por radiación y
fibrosis inducida por quimioterapia. La fibrosis crónica se puede
asociar con, por ejemplo, infecciones virales, diabetes e
hipertensión.
El sujeto puede ser un mamífero, por ejemplo un
primate, preferiblemente un primate superior, por ejemplo un
humano.
En algunos ejemplos, el antagonista de CD69
puede ser administrado al sujeto sistémicamente (por ejemplo,
oralmente, parenteralmente, subcutáneamente, intravenosa, por vía
rectal, intramuscularmente, intraperitonealmente, intranasalmente,
por vía transdérmica, o por inhalación o por administración
intracavitaria), tópicamente, o por aplicación a las membranas
mucosas, tales como la nariz, la garganta o los bronquios.
En un ejemplo preferido, el antagonista de CD69
se administra de manera repetida. Por ejemplo, el antagonista de
CD69 se puede administrar 2, 4, 6 ó más veces. La administración
puede ser repetida hasta que la mejora en la condición del sujeto
se vea o se espere. La administración puede ser a una frecuencia de
una cada 5 a 7 días, 14 a 30 ó 30 a 60 días. La administración de
otros compuestos puede ser más frecuente. Por ejemplo, una pequeña
molécula puede administrarse una, dos, tres, cuatro o más veces al
día.
En otro aspecto, la invención caracteriza
métodos de potenciación de la respuesta inmune a un antígeno, por
ejemplo una vacuna. El método incluye la administración a un sujeto
de un antígeno por ejemplo, una vacuna, y/o un DNA que codifique
para un antígeno, y un antagonista de CD69, para de esta forma
potenciar la respuesta inmune al antígeno por parte del sujeto.
Ejemplos de antagonistas de CD69 incluyen
aquellos descritos aquí.
En algunos ejemplos, el antagonista de CD69 es
una molécula de anticuerpo anti-CD69, por ejemplo,
un anticuerpo anti-CD69 antagonista descrito
aquí.
Ejemplos de vacunas pueden incluir, vacunas de
cáncer (por ejemplo, vacunas frente al melanoma, sarcoma, cáncer de
pulmón, cáncer de próstata, cáncer colorectal, cáncer pancreático,
o cáncer de hígado), vacunas frente al HIV, vacunas frente a la
hepatitis (por ejemplo, tipo A, B, o C), vacunas frente a la
malaria, vacunas frente al herpes, vacunas frente al papiloma (por
ejemplo, HPV-6, 11, 16, 18, 31, 33 y/o 45), vacunas
frente a la gripe y vacunas frente a la viruela.
El antagonista de CD69 se puede administrar al
sujeto, antes, durante o tras la administración del antígeno y/o
ácido nucleico que codifique para el antígeno.
En otro aspecto, la invención caracteriza
métodos de tratamiento o prevención de un cáncer que exprese CD69
en un sujeto. El método incluye la administración de un eliminador
de CD69 al sujeto.
Ejemplos de cánceres que expresan CD69 incluyen:
linfomas (por ejemplo, linfomas de células T (por ejemplo, linfoma
cutáneo de células T (Berti et al., 1991. J. Invest.
Dermatol.96:718-23); linfomas de células T
periféricas (Dorfman et al. 2002, Hum. Pathol.
33:330-4)), linfomas de células B, linfomas no
Hodgkin (por ejemplo, linfomas de Hodgkin T ó B (Erlanson et
al., 1998. Eur. J. Haematol. 60:125-32)),
leucemia linfática (por ejemplo, leucemia linfática crónica T ó B
(Damle et al. 2002, Blood 99:4087-93), y
otros tumores de origen hematopoyético (Tassone et al. 1996.
Tissue Antigens 48:65-8).
Ejemplos de eliminadores de CD69 incluyen
aquellos descritos aquí, pero no se limitan a ellos, tales como
moléculas de anticuerpo que se unen a CD69 y eliminan células que
expresan CD69, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD69
humano análogo al anticuerpo anti-CD69 de ratón 2.3
o cualquier anticuerpo anti-CD69 humano conocido en
la bibliografía que pueda actuar como eliminador de las células que
expresan CD69 (o una molécula de anticuerpo basada en él, por
ejemplo, un fragmento de anticuerpo, o un anticuerpo quimérico,
humanizado o desinmunogénico), una molécula de anticuerpo que se
une al epítopo unido por tal anticuerpo, una molécula de anticuerpo
que compita por la unión con tal anticuerpo, o una molécula de
anticuerpo identificada por un método descrito aquí. En un ejemplo,
una molécula de anticuerpo eliminador anti-CD69
puede reclutar una célula inmune (p.e, por vía de un receptor Fc o
por reclutamiento del sistema de complemento) e inactivar o
destruir la célula diana, por ejemplo, la célula que expresa CD69.
En otro ejemplo, el anticuerpo eliminador anti-CD69
puede activar la vía clásica de complemento, llevando a la lisis
de la célula diana (por ejemplo, la célula que expresa CD69). En
otro ejemplo, el eliminador es una molécula de anticuerpo
anti-CD69 acoplada a un agente terapéutico, por
ejemplo, una proteína, droga o isótopo, que pueden inactivar o
destruir la célula diana, por ejemplo, la célula que expresa
CD69.
En un ejemplo preferido, el método incluye la
administración de un eliminador de células que expresan CD69 en
combinación con un agente secundario, por ejemplo, con uno o más
agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente terapéutico o agente
para el tratamiento de la proliferación celular no deseada. El
segundo agente puede ser un anticuerpo o no. Los agentes
terapéuticos incluyen, por ejemplo, uno o más agentes
quimioterápicos, radioisótopos, o citotoxinas. Ejemplos de agentes
quimioterápicos incluyen el taxol, la citocalasina B, la
gramicidina D, la mitomicina, el etopóxido, el tenopóxido, la
vincristina, la vinblastina, la colchicina, el busulfan, el
cisplatino, la doxorubicina, la claunorubicina, la
dihidroxi-antracin-diona, la
mitoxantrona, la mitamicina, el clorambucilo, la gencitabina, la
actinomicina, la procaína, la tetracaína, la lidocaína, el
propanolol, la puromicina, los maitansinoidses y análogos u
homólogos de estos. Agentes terapéuticos adicionales incluyen, pero
no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo metotrexato,
6-mercaptopurina, 6-tioguanina,
citarabina, 5-fluorouracil decarbacina), agentes
alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepaclorambucilo,
CC-1065, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina
(CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina,
mitomicina C, y
cis-diclorodiamina-platino (II)
(DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo daunorubicina (antes
daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (por ejemplo,
dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y
antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (p.e,
vincristina, vinblastina, taxol y maitansinoides). Los
radioisótopos pueden incluir emisores alfa, beta y/o gamma. Ejemplos
de radioisótopos son: ^{212}Bi, ^{213}Bi, ^{131}I, ^{211}At,
^{186}Re, ^{90}Y y ^{117}Lu. El eliminador de CD69 se puede
administrar antes, durante o tras el tratamiento con el otro agente
terapéutico.
El sujeto puede ser un mamífero, por ejemplo un
primate, preferiblemente un primate superior, por ejemplo un
humano.
En algunos ejemplos, el eliminador de células
que expresan CD69 puede ser administrado al sujeto sistémicamente
(por ejemplo, oralmente, parenteralmente, subcutáneamente,
intravenosa, por vía rectal, intramuscularmente,
intraperitonealmente, intranasalmente, por vía transdérmica, o por
inhalación o por administración intracavitaria), tópicamente, o
por aplicación a las membranas mucosas, tales como la nariz, la
garganta o los bronquios.
En un ejemplo preferido, el eliminador de CD69
se administra de manera repetida. Por ejemplo, el eliminador de
CD69 se puede administrar 2, 4, 6 ó más veces. La administración
puede ser repetida hasta que la mejora en la condición del sujeto se
vea o se espere. La administración puede ser a una frecuencia de
una cada 5 a 7 días, 14 a 30 ó 30 a 60 días. La administración de
otros compuestos puede ser más frecuente. Por ejemplo, una pequeña
molécula puede administrarse una, dos, tres, cuatro o más veces al
día.
En otro aspecto, la invención caracteriza un
método para la identificación de compuestos que modulen CD69, por
ejemplo, antagonistas de CD69 o eliminadores de células que
expresan CD69, para de esta manera modular una respuesta inmune. El
método incluye: contactar una célula que expresa CD69 con un
compuesto (por ejemplo, un compuesto que interacciona con, por
ejemplo, se une a, CD69) y determinar el efecto del compuesto en la
expresión o actividad de CD69. Segundo, una vez que el CD69R se
identifique, se puede comenzar una búsqueda convencional de alta
resolución usando formas solubles de CD69 y CD69R para identificar
sondas, y entonces analizar para el agonismo/antagonismo.
En un ejemplo preferido, el método incluye:
contacto de CD69 o una forma soluble de CD69, por ejemplo, un
polipéptido de CD69 que carece de la región transmembrana y/o
citoplásmica, con un compuesto, y evaluar la capacidad del
compuesto para interaccionar con, unirse a, CD69 o la forma soluble
de CD69.
Un compuesto que aumenta la expresión de CD69
y/o la actividad puede identificarse como un compuesto que reduce
la respuesta inmune. En un ejemplo preferido, la actividad de CD69
que es aumentada es la expresión de TGF-\beta. En
un ejemplo, un compuesto puede ser evaluado para la capacidad para
aumentar la expresión de CD69 y/o la actividad, por métodos
conocidos, incluyendo la evaluación de la expresión de CD69 y/o la
actividad de la célula, por ejemplo, la expresión de
TGF-\beta, en la ausencia y presencia del
compuesto. Preferiblemente, el compuesto interacciona con, se une
a, CD69. Posibles compuestos incluyen, por ejemplo, pequeñas
moléculas, por ejemplo, pequeñas moléculas descritas aquí,
péptidos, proteínas de fusión, por ejemplo, proteínas de fusión de
CD69R como las descritas aquí, moléculas de anticuerpo y moléculas
de ácidos nucleicos. Las moléculas de anticuerpo que aumentan la
actividad de CD69 incluyen, pero no se limitan a, moléculas de
anticuerpo, o intracuerpos que interaccionan con, por ejemplo, se
unen a, CD69 y resultan en un cambio en la interacción, por
ejemplo, la actividad de unión de CD69 a una pareja de unión (por
ejemplo, el anticuerpo, intracuerpo, o fragmento de estos puede
afectar la conformación de un epítopo de CD69 resultando así en
interacción aumentada, p.e, unión, por una pareja de unión a CD69,
al epítopo), un anticuerpo que se una a CD69 y aumente el
agrupamiento de CD69 (por ejemplo, una IgM que se una a CD69),
entre otros. En algunos ejemplos, el ensayo basado en células que
mide la actividad de CD69, por ejemplo, expresión aumentada de
TGF-\beta y/o la formación aumentada de dímeros
de CD69 y/o la señalización por aumento de calcio intracelular y/o
el aumento de actividad MAPK.
En un ejemplo, un compuesto que aumenta la
expresión de CD69 y/o aumenta una actividad de CD69, por ejemplo,
la expresión de TGF-\beta, de la célula es
seleccionado, por ejemplo, seleccionado para una mayor búsqueda,
por ejemplo por la administración del compuesto a un sujeto, por
ejemplo, una modelo animal, por ejemplo, un modelo animal para una
enfermedad inflamatoria (por ejemplo, enfermedad inflamatoria
aguda o crónica), y/o un modelo animal para un desorden inmune, por
ejemplo, un desorden autoinmune. Un ejemplo de un modelo animal para
una enfermedad inflamatoria incluye un modelo de ratón para la
artritis inducida por colágeno (AIC).
Un compuesto que reduce la expresión de CD69 y/o
la actividad puede identificarse como un compuesto que aumenta la
respuesta inmune. En un ejemplo preferido, la actividad de CD69 que
decrece es la expresión de TGF-\beta
y/o la inhibición de la formación del dímero de CD69. En un ejemplo, un compuesto puede ser evaluado en su capacidad para disminuir la expresión y/o la actividad celular de CD69, por ejemplo, expresión de TGF-\beta, en ausencia o presencia del compuesto. Preferiblemente, el compuesto interacciona con, por ejemplo, se une a CD69. Posibles compuestos incluyen, por ejemplo, pequeñas moléculas (por ejemplo, pequeñas moléculas descritas aquí), péptidos, polipéptidos de fusión (por ejemplo, la proteína de fusión de CD69R descritas aquí), moléculas de anticuerpo y moléculas de ácido nucleico. Ejemplos de moléculas de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, moléculas de anticuerpo o intracuerpos que se unen a CD69 e interfieren con la unión de CD69 y un polipéptido de unión a CD69, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD69 humano, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD69 humano análogo al anticuerpo anti-CD69 2.2. o cualquier anti-CD69 humano descrito que pueda actuar como antagonista (o moléculas de anticuerpo basadas en él), una molécula de anticuerpo que se una al epítopo al que se unen tales anticuerpos, una molécula de anticuerpo que compita con la unión de tales anticuerpos, una molécula de anticuerpo que se una o interfiera con la unión de otro anticuerpo o ligando a uno o más de uno de los residuos aminoácidos Glu 140, Asp171, Glu 180, Glu 185, Glu 187, Phe 175, Met 184, Leu 190, Glu 185 y Lys188 del CD69 humano, u otra molécula de anticuerpo descrita aquí. En algunos ejemplos, el ensayo basado en células mide una actividad de CD69, por ejemplo, expresión de TGF-\beta disminuida, activación disminuida de MAPK, menor señalización de Ca^{2+} y/o formación de dímeros de CD69 reducida. Los compuestos que disminuyen la expresión de TGF-\beta y/o la formación de dímeros por CD69 pueden seleccionarse como antagonistas de CD69.
y/o la inhibición de la formación del dímero de CD69. En un ejemplo, un compuesto puede ser evaluado en su capacidad para disminuir la expresión y/o la actividad celular de CD69, por ejemplo, expresión de TGF-\beta, en ausencia o presencia del compuesto. Preferiblemente, el compuesto interacciona con, por ejemplo, se une a CD69. Posibles compuestos incluyen, por ejemplo, pequeñas moléculas (por ejemplo, pequeñas moléculas descritas aquí), péptidos, polipéptidos de fusión (por ejemplo, la proteína de fusión de CD69R descritas aquí), moléculas de anticuerpo y moléculas de ácido nucleico. Ejemplos de moléculas de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, moléculas de anticuerpo o intracuerpos que se unen a CD69 e interfieren con la unión de CD69 y un polipéptido de unión a CD69, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD69 humano, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD69 humano análogo al anticuerpo anti-CD69 2.2. o cualquier anti-CD69 humano descrito que pueda actuar como antagonista (o moléculas de anticuerpo basadas en él), una molécula de anticuerpo que se una al epítopo al que se unen tales anticuerpos, una molécula de anticuerpo que compita con la unión de tales anticuerpos, una molécula de anticuerpo que se una o interfiera con la unión de otro anticuerpo o ligando a uno o más de uno de los residuos aminoácidos Glu 140, Asp171, Glu 180, Glu 185, Glu 187, Phe 175, Met 184, Leu 190, Glu 185 y Lys188 del CD69 humano, u otra molécula de anticuerpo descrita aquí. En algunos ejemplos, el ensayo basado en células mide una actividad de CD69, por ejemplo, expresión de TGF-\beta disminuida, activación disminuida de MAPK, menor señalización de Ca^{2+} y/o formación de dímeros de CD69 reducida. Los compuestos que disminuyen la expresión de TGF-\beta y/o la formación de dímeros por CD69 pueden seleccionarse como antagonistas de CD69.
En otros ejemplos, el ensayo basado en células
mide la modulación, por ejemplo, una disminución, de la expresión
de CD69. Por ejemplo, la expresión de un polipéptido de CD69 o la
expresión de un ácido nucleico (por ejemplo, mRNA o cDNA) para
CD69, en la presencia de un compuesto puede ser evaluada y
comparada a la expresión de CD69 en la célula antes de la
administración del compuesto. Una disminución en el nivel de
expresión es cualquier disminución estadísticamente significativa
en los niveles de expresión de CD69.
En un ejemplo, un compuesto que inhiba la
expresión de CD69 y/o la actividad de CD69, por ejemplo, la
expresión de TGF-\beta, de la célula, es
seleccionado, por ejemplo, seleccionado para una mayor búsqueda,
por ejemplo, por administración del compuesto a un sujeto, por
ejemplo, en un modelo animal, por ejemplo, en un modelo animal de
proliferación celular no deseada (por ejemplo, un modelo animal
para cáncer), un modelo animal para inmunodeficiencia, y/o un
modelo animal para medir la eficacia de una vacuna.
En otro aspecto, la invención caracteriza un
método de identificar un compuesto que module la respuesta inmune.
El método incluye: la búsqueda de un compuesto que interaccione
con, por ejemplo, se una a, CD69 o un ácido nucleico que codifique
para CD69 (por ejemplo, la región reguladora del gen de CD69), y
determinar el efecto del compuesto en la expresión y/o la actividad
de CD69, por ejemplo, la expresión de TGF-\beta
y/o la formación de dímeros por CD69.
En un ejemplo, la interacción entre el compuesto
y CD69 se evalúa in vitro, por ejemplo, usando un
polipéptido aislado de CD69, por ejemplo, una forma soluble de
CD69, por ejemplo, una forma soluble de CD69 descrita aquí. El
polipéptido de CD69 y/o el compuesto puede estar en solución (por
ejemplo, una micela) o unido a un soporte sólido, p.e, una columna,
microsfera, pocillo o placa o a un chip (por ejemplo, un
microarray). En algunos ejemplos, el método se repite una o
más veces como esa, por ejemplo, una librería de compuestos a
probar puede ser evaluada.
En otro ejemplo, la interacción entre el
compuesto y CD69 es evaluada usando un ensayo basado en
células.
En un ejemplo preferido, un compuesto que
interacciona con, por ejemplo, se une a CD69, se une con una célula
que expresa CD69 para determinar el efecto del compuesto en la
expresión y/o actividad de CD69.
En un ejemplo, el método incluye la
identificación de un compuesto que interacciona con CD69 y aumenta
la expresión y/o actividad de CD69, por ejemplo, aumenta la
expresión de TGF-\beta aumenta la activación de
MAPK, aumenta la señalización de Ca^{2+} y/o la formación de
dímeros por CD69, para así identificar al compuesto como un
candidato para disminuir la respuesta inmune. En un ejemplo
preferido, la actividad de CD69 que aumenta es la inducción de la
expresión de TGF-\beta. En un ejemplo, un
compuesto puede ser evaluado para la capacidad de aumentar la
expresión de CD69 y/o su actividad, por métodos conocidos,
incluyendo la evaluación de la expresión de CD69 y/o la actividad
CD69 en la célula, por ejemplo, la expresión de
TGF-\beta en presencia o ausencia del compuesto.
Posibles compuestos incluyen, por ejemplo, pequeñas moléculas
orgánicas (por ejemplo, pequeñas moléculas orgánicas descritas
aquí), péptidos, péptidos de fusión (por ejemplo, una proteína de
fusión de CD69R, por ejemplo, como la descrita aquí), moléculas de
anticuerpo y moléculas de ácido nucléico. Los anticuerpos que
aumentan la actividad de CD69 incluyen, pero no se limitan a
moléculas de anticuerpo o intracuerpos que interaccionan con, por
ejemplo, se unen a CD69 y resultan en un cambio en la interacción,
por ejemplo, la actividad de unión, de una pareja de unión a CD69
(por ejemplo, la molécula de anticuerpo o intracuerpo puede afectar
la conformación de un epítopo de CD69, resultando en una
interacción aumentada, por ejemplo, unión, por una pareja de unión
a CD69 a dicho epítopo), un anticuerpo que se una a CD69 y aumente
el agrupamiento de CD69 (por ejemplo, una IgM que se una a
CD69).
En un ejemplo, el método incluye la
identificación de un compuesto que interacciona con CD69 y
disminuye la expresión de CD69 y/o la actividad de CD69, por
ejemplo, disminuye la expresión de TGF-\beta la
activación de MAPK, la señalización por Ca^{2+} y/o la formación
de dímeros de CD69, para así identificar el compuesto como un
candidato para aumentar la respuesta inmune. En un ejemplo
preferido, la actividad de CD69 que es reducida es la expresión de
TGF-\beta y/o la formación del dímero de CD69. En
un ejemplo, un compuesto puede ser evaluado en su capacidad para
disminuir la expresión y/o la actividad celular de CD69, por
ejemplo, expresión de TGF-\beta, en ausencia o
presencia del compuesto. Preferiblemente, el compuesto interacciona
con, por ejemplo, se une a CD69. Posibles compuestos incluyen, por
ejemplo, pequeñas moléculas (por ejemplo, pequeñas moléculas
descritas aquí), péptidos, polipéptidos de fusión (por ejemplo, la
proteína de fusión de CD69R descritas aquí), moléculas de
anticuerpo y moléculas de ácido nucleico. Ejemplos de moléculas de
anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, moléculas de anticuerpo
o intracuerpos que se unen a CD69 e interfieren con la unión de
CD69 y un polipéptido de unión a CD69, por ejemplo, un anticuerpo
anti-CD69 humano, por ejemplo, un anticuerpo
anti-CD69 humano análogo al anticuerpo
anti-CD69 2.2. o cualquier
anti-CD69 humano descrito que pueda actuar como
antagonista (o moléculas de anticuerpo basadas en él), una molécula
de anticuerpo que se una al epítopo al que se unen tales
anticuerpos, una molécula de anticuerpo que compita con la unión de
tales anticuerpos, una molécula de anticuerpo que se una o
interfiera con la unión de otro anticuerpo o ligando a uno o más de
uno de los residuos aminoácidos Glu 140, Asp171, Glu 180, Glu 185,
Glu 187, Phe 175, Met 184, Leu 190, Glu 185 y Lys 188 del CD69
humano, u otra molécula de anticuerpo descrita aquí. En algunos
ejemplos, el ensayo basado en células mide una actividad de CD69,
por ejemplo, expresión de TGF-\beta disminuida,
activación disminuida de MAPK, menor señalización de Ca^{2+} y/o
formación de dímeros de CD69 reducida. Los compuestos que
disminuyen la expresión de TGF-\beta y/o la
formación de dímeros por CD69 pueden seleccionarse como
antagonistas de CD69.
En otros ejemplos, el ensayo basado en células
mide la modulación, por ejemplo, una disminución, de la expresión
de CD69. Por ejemplo, la expresión de un polipéptido de CD69 o la
expresión de un ácido nucleico (por ejemplo, mRNA o cDNA) para
CD69, en la presencia de un compuesto puede ser evaluada y
comparada a la expresión de CD69 en la célula antes de la
administración del compuesto. Una disminución en el nivel de
expresión es cualquier disminución estadísticamente significativa
en los niveles de expresión de CD69.
En un ejemplo, un compuesto que inhiba la
expresión de CD69 y/o la actividad de CD69, por ejemplo, la
expresión de TGF-\beta, de la célula, es
seleccionado, por ejemplo, seleccionado para una mayor búsqueda,
por ejemplo, por administración del compuesto a un sujeto, por
ejemplo, en un modelo animal, por ejemplo, en un modelo animal de
proliferación celular no deseada (por ejemplo, un modelo animal
para cáncer), un modelo animal para inmunodeficiencia, y/o un
modelo animal para medir la eficacia de una vacuna.
En otro aspecto, la invención caracteriza un
método de identificación de un compuesto que modula la respuesta
inmune. Este método incluye: proveer con un compuesto que module la
expresión de CD69 y/o su actividad, y administrar el compuesto a un
sujeto, por ejemplo, un modelo animal.
En un ejemplo, el compuesto aumenta la expresión
de CD69 y/o aumenta una actividad de CD69, por ejemplo, la
expresión de TGF-\beta, y/o aumenta la formación
de dímeros, y el compuesto es administrado a un sujeto, por
ejemplo, un modelo animal, por ejemplo, un modelo animal para una
enfermedad inflamatoria (por ejemplo, enfermedad inflamatoria aguda
o crónica), y/o un modelo animal para un desorden inmune, por
ejemplo, un desorden autoinmune. Un ejemplo de un modelo animal
para una enfermedad inflamatoria incluye un modelo de ratón para la
artritis inducida por colágeno (AIC).
En otro ejemplo, el compuesto es un compuesto
que disminuye la expresión y/o la actividad de CD69, por ejemplo,
reduce la expresión de TGF-\beta, de la célula
y/o la formación de dímeros, y el compuesto es administrado a un
sujeto, por ejemplo, en un modelo animal, por ejemplo, en un modelo
animal de proliferación celular no deseada (por ejemplo, un modelo
animal para cáncer), un modelo animal para inmunodeficiencia, y/o
un modelo animal para medir la eficacia de una vacuna, y compuestos
que reduzcan uno o más síntomas del desorden se seleccionan.
El compuesto puede ser un compuesto identificado
por un método descrito aquí o pueden ser otros compuestos que se
sabe que interaccionan con CD69.
En otro aspecto, la invención caracteriza, un
método de hacer una decisión, por ejemplo, una decisión médica o
financiera. El método incluye: generar o recibir datos o
información en el tratamiento de un sujeto para un desorden
descrito aquí; y usar los datos o información para tomar la
decisión, por ejemplo, seleccionar entre un primer resultado y un
segundo resultado.
En un ejemplo preferido, los datos proceden de
la respuesta a la administración de un, antagonista, o eliminador
de CD69.
En un ejemplo preferido, la decisión se hace
comparando los datos con un estándar de referencia y tomando la
decisión basada en la relación de los datos con la referencia. Por
ejemplo, los datos pueden ser un valor u otro término para la
respuesta de un sujeto, y si el valor u otro término tiene una
relación preseleccionada con el estándar de referencia, por
ejemplo, si el valor o término de los datos es mayor que el
estándar de referencia, se selecciona un primer resultado, y si los
datos son menores que un estándar de referencia, se selecciona un
segundo resultado. Un resultado puede producirse dándose o no un
servicio o tratamiento, o pagando o no por todo o parte del
servicio o tratamiento.
En un ejemplo preferido, el primer resultado
sugiere o da un primer curso de tratamiento médico, por ejemplo,
cualquiera de los tratamientos descritos aquí, por ejemplo, una
administración adicional de un, antagonista o eliminador de CD69, y
el segundo curso sugiere que el tratamiento no debe ser dado.
En un ejemplo preferido, el primer resultado
incluye o resulta en la autorización o transferencia de fondos para
el pago de un servicio o tratamiento dado al sujeto y el segundo
resultado incluye o resulta en el rechazo al pago por un servicio o
tratamiento dado al sujeto. Por ejemplo, una entidad, por ejemplo,
un hospital, entidad del gobierno, o compañía de seguros u otra
entidad que pague por o reembolse costes médicos, puede usar el
resultado de un método descrito aquí para determinar si un grupo,
por ejemplo, un grupo diferente al sujeto paciente, pagará por los
servicios o tratamiento dados al paciente. Por ejemplo, una
primera entidad, por ejemplo, una compañía de seguros, puede usar
el resultado para determinar si provee con la financiación a, o en
representación de, un paciente, por ejemplo, si reembolsará a un
tercer grupo, por ejemplo, un vendedor de productos o servicios, un
hospital, médico, u otro profesional de la salud, por un servicio
o tratamiento dado a un paciente. Por ejemplo, una primera entidad,
por ejemplo, una compañía, de seguros, puede usar el resultado de
un método descrito aquí para determinar si continúa, detiene, o
enrola a un individuo en un plan de seguros o programa, por
ejemplo, un programa o plan de seguros de salud o de seguros de
vida.
En otro aspecto, la invención caracteriza un
método para proveer con una base de datos, por ejemplo, una base de
datos útil para establecer un valor de referencia referido aquí o
para otros uno o más sujetos en evaluación. El método incluye:
generar o recibir datos, por ejemplo, respuesta a la administración
de un antagonista o eliminador de CD69 en el tratamiento de un
desorden, por ejemplo, un desorden descrito aquí; e introducir los
datos en la base de datos.
En un ejemplo preferido, uno o más de, un
indicador (por ejemplo, un valor) para el estado de la enfermedad
de un paciente y un identificador del paciente son introducidos en
la base de datos.
En un ejemplo preferido, la base de datos
incluye una pluralidad de entradas, cada una de las cuales incluye
uno o más de: datos (datos sobre la respuesta a la administración
de antagonistas o eliminadores de CD69 en el tratamiento de un
desorden, por ejemplo, un desorden descrito aquí); un indicador
para el estado de la enfermedad de un paciente y un identificador
del paciente.
En otro aspecto, la invención caracteriza un
método para la evaluación de un paciente que incluye: comparación
de datos de los pacientes (datos sobre la respuesta de la
administración de un, antagonista y eliminador de CD69 en el
tratamiento de un desorden, por ejemplo, un desorden descrito
aquí), con datos de una base de datos descrita aquí.
En otro aspecto, la invención caracteriza un
método para construir un estándar de referencia que incluye:
inclusión de datos procedentes de una base de datos descrita aquí
en el estándar. Por ejemplo, se pueden tomar valores de la base de
datos, realizar operaciones matemáticas con ellos y usar el
resultado como una referencia para alcanzar un estándar de
referencia, por ejemplo, tomando la media de una pluralidad de
valores seleccionados de la base de datos y usar la media como el
estándar.
En otro aspecto, la invención caracteriza un
método de potenciar la producción de un anticuerpo frente a un
antígeno. El método incluye la administración del antígeno al
animal; y la administración de un antagonista de CD69 al
animal.
El animal puede ser, por ejemplo, un mamífero,
por ejemplo, un ratón, rata, cabra, oveja, cerdo, vaca o
caballo.
En un ejemplo, el antígeno es homólogo al
animal, por ejemplo, el antígeno es de la misma especie que la
especie del animal al que es administrado, por ejemplo el antígeno
es un antígeno murino administrado a ratón. En otro ejemplo, el
antígeno es heterólogo, por ejemplo, el antígeno es de una especie
diferente a la especie del animal al que es administrado, por
ejemplo, el antígeno es un antígeno humano administrado a un
ratón.
En otro ejemplo, el método incluye además el
aislamiento de una célula inmune del animal, por ejemplo, para
producir anticuerpos monoclonales.
La invención se basa, en parte, en el
descubrimiento de que la modulación de CD69 desempeña un papel en
la reactividad inmune. Este efecto puede ser mediado a través de la
regulación de la síntesis de TGF-\beta1. Nos
hemos centrado en dos modelos diferentes de enfermedad en ratones
para estudiar el papel de CD69 en la regulación de la respuesta
inmunitaria. En primer lugar, la artritis inducida por colágeno
(AIC) es un modelo experimental de enfermedad inflamatoria de las
articulaciones, especialmente artritis reumatoide (AR) (Feldmann
et al., 1996). La AIC permite el estudio de los procesos de
autoinmunidad y se puede ampliar a otras enfermedades en las que la
respuesta autoinmune está exacerbada. Se ha encontrado que CD69
desempeña un papel inhibidor a través de la regulación de
TGF-\beta en el modelo de AIC. En segundo lugar,
los modelos tumorales constituyen la estrategia opuesta, donde la
meta consiste en la potenciación de la respuesta inmunitaria para
suprimir los tumores y metástasis. Por lo tanto, este modelo
constituye un sistema experimental para probar posibles terapias
que se pueden extender a enfermedades infecciosas y síndromes de
inmunodeficiencia para restablecer una respuesta inmunitaria
eficaz. El posible empleo de CD69 en este contexto también se ha
analizado en modelos de tumores y metástasis inducidas en ratón. Se
ha encontrado que los anticuerpos monoclonales específicos frente a
CD69 dan una terapia efectiva en ratones con tumores
MHC-I negativos inmunocompetentes (wt) e
inmuno-comprometidos (SCID&RAG1^{-/-}). La
elucidación del papel de CD69 como un modulador negativo de la
reactividad inmune, da un nueva e interesante aproximación a la
terapia del cáncer, la inflamación crónica, y otras enfermedades
mediadas por el sistema inmune (inmunodeficiencias, enfermedades
autoinmunes, trasplantes alogénicos, y otras como estas) por la
modulación de CD69. Además, y dado que CD69 se expresa
selectivamente en leucocitos activados que infiltran tejidos
inflamados o tumores, la estimulación farmacológica de la síntesis
de TGF-\beta1 a través de CD69 puede localizarse
en los tejidos diana, evitándose por tanto las consecuencias
negativas del incremento sistémico de TGF-\beta1.
Por otra parte, CD69 es un marcador adecuado para la identificación
de los leucocitos tisulares activados. La eliminación de estas
subpoblaciones mediante reactivos específicos de CD69 puede inhibir
la respuesta inmunitaria e inflamatoria. Por lo tanto, el
antagonismo de CD69 por ejemplo, inhibiendo la secreción de
TGF-\beta, puede permitir una respuesta inmune
local potenciada gracias al incremento en el reclutamiento y
supervivencia de células inmunitarias (lo que sería adecuado para
incrementar la respuesta a vacunas, terapia de inmunodeficiencias,
etc.).
La descripción de moléculas inmunoreguladoras
que posibilitan una activación o inhibición local y selectiva de la
síntesis de TGF-\beta es, por tanto, una nueva
aproximación al tratamiento de las enfermedades mediadas por el
sistema inmune. Además, CD69 puede usarse como marcador específico
de la población leucocitaria que está activamente produciendo
citoquinas pro-inflamatorias en los sitios de
inflamación. La eliminación de esta población a través de la
manipulación de CD69, permitiría el control de los efectores que se
derivan o son controlados por ellos. Estas nuevas posibles
aproximaciones a través del receptor de leucocitos inducible CD69
se incluyen en esta invención/patente.
Esta invención tiene su aplicación dentro del
sector farmacológico para su aplicación en el sector sanitario.
El tratamiento farmacológico de las enfermedades
inmunitarias es un campo de intenso estudio, incluyéndose en esta
categoría las enfermedades autoinmunes, que afectan aproximadamente
al 5% de la población mundial (O'Shea
et al., 2002), rechazo de trasplantes, alergia, ateroesclerosis, enfermedades infecciosas y procesos tumorales que son una causa mayoritaria de mortalidad en países industrializados. Por tanto, la regulación de la respuesta inmune es crucial en el tratamiento de las causas más importantes de muerte y morbidez en nuestra sociedad.
et al., 2002), rechazo de trasplantes, alergia, ateroesclerosis, enfermedades infecciosas y procesos tumorales que son una causa mayoritaria de mortalidad en países industrializados. Por tanto, la regulación de la respuesta inmune es crucial en el tratamiento de las causas más importantes de muerte y morbidez en nuestra sociedad.
CD69 es una molécula que se expresa rápida y
transitoriamente durante la activación de los leucocitos tras un
desafío inmune (Cebrián et al., 1988; Hara et al.,
1986; Testi et al., 1994). CD69 se expresa en todos los
linajes hematopoyéticos excepto eritrocitos, y aunque se detecta
in vivo en algunos subtipos de linfocitos T y B en tejidos
linfoides periféricos (Sánchez-Mateos et
al., 1989), su expresión es mucho más intensa y persistente en
infiltrados leucocitarios de diversas enfermedades inflamatorias
crónicas como artritis reumatoide y hepatitis viral crónica
(García-Monzón
et al., 1990; Laffón et al., 1991), en los leucocitos responsables del rechazo de trasplantes (Mampaso et al., 1993), los leucocitos involucrados en la respuesta alérgica (Hartnell et al., 1993), células inmunitarias en las lesiones ateroescleróticas (Caspar-Bauguil et al., 1998), linfocitos que infiltran tumores (Coventry et al., 1996) o durante infecciones persistentes (Zajac et al., 1998). Existen evidencias de que CD69 está involucrado en la activación de células derivadas de la médula ósea (Cebrián et al., 1988; Testi et al., 1994). No obstante, el desarrollo hematopoyético y la maduración de los linfocitos T son casi normales en ratones deficientes para CD69 en condiciones fisiológicas (Lauzurica et al., 2000). Las enfermedades autoinmunitarias se caracterizan por la activación anormal y persistente de los leucocitos que contribuye a la patogénesis de la enfermedad. Está bien establecido que las citocinas desempeñan un papel esencial en la patogenia de las enfermedades autoinmunes (Falcone y Sarvetnick, 1999). Por lo tanto, la eliminación de estas citocinas es la estrategia de referencia en los nuevos tratamientos de las enfermedades autoinmunes. Por ejemplo, el factor de necrosis tumoral (TNF) parece situarse como el primer eslabón de la cascada inflamatoria, y la terapia contra el TNF se ha empleado eficazmente en el tratamiento de la artritis reumatoide (AR) (Feldmann, 2002). Además, otras citocinas tienen un efecto antiinflamatorio. En este contexto, la administración de TGF-\beta1 tiene un efecto beneficioso en algunas enfermedades autoinmunes (Prud'homme and Piccirillo, 2000), inhibiendo la producción de citocinas proinflamatorias en artritis (Kuruvilla et al., 1991), encefalomielitis alérgica (Chen et al., 1994), colitis (Powrie et al., 1996) y diabetes autoinmune (Piccirillo et al., 1998).
et al., 1990; Laffón et al., 1991), en los leucocitos responsables del rechazo de trasplantes (Mampaso et al., 1993), los leucocitos involucrados en la respuesta alérgica (Hartnell et al., 1993), células inmunitarias en las lesiones ateroescleróticas (Caspar-Bauguil et al., 1998), linfocitos que infiltran tumores (Coventry et al., 1996) o durante infecciones persistentes (Zajac et al., 1998). Existen evidencias de que CD69 está involucrado en la activación de células derivadas de la médula ósea (Cebrián et al., 1988; Testi et al., 1994). No obstante, el desarrollo hematopoyético y la maduración de los linfocitos T son casi normales en ratones deficientes para CD69 en condiciones fisiológicas (Lauzurica et al., 2000). Las enfermedades autoinmunitarias se caracterizan por la activación anormal y persistente de los leucocitos que contribuye a la patogénesis de la enfermedad. Está bien establecido que las citocinas desempeñan un papel esencial en la patogenia de las enfermedades autoinmunes (Falcone y Sarvetnick, 1999). Por lo tanto, la eliminación de estas citocinas es la estrategia de referencia en los nuevos tratamientos de las enfermedades autoinmunes. Por ejemplo, el factor de necrosis tumoral (TNF) parece situarse como el primer eslabón de la cascada inflamatoria, y la terapia contra el TNF se ha empleado eficazmente en el tratamiento de la artritis reumatoide (AR) (Feldmann, 2002). Además, otras citocinas tienen un efecto antiinflamatorio. En este contexto, la administración de TGF-\beta1 tiene un efecto beneficioso en algunas enfermedades autoinmunes (Prud'homme and Piccirillo, 2000), inhibiendo la producción de citocinas proinflamatorias en artritis (Kuruvilla et al., 1991), encefalomielitis alérgica (Chen et al., 1994), colitis (Powrie et al., 1996) y diabetes autoinmune (Piccirillo et al., 1998).
La respuesta inmune contra los tumores se
comporta como "un eficaz sistema supresor de tumores
extrínseco", que implica la acción combinada de mecanismos
humorales y celulares (Dighe, 1994; Kaplan, 1998; Shankaran, 2001;
Smyth y Godfrey, 2000; Smyth et al., 2000; Van den Broek,
1996). La acción de las citocinas, dirigida, al menos en parte, a
regular la inmunogenicidad de las células tumorales, es crucial
para la función supresora de tumores del sistema inmune.
Las células de tumores avanzados y las
metástasis inhiben la expresión de las moléculas de clase I del
MHC, lo que las convierte en dianas susceptibles de ser destruidas
por las células NK. Además, las células NK secretan citocinas, como
TGF-\gamma e IFN-\gamma, que
estimulan la diferenciación de las células T CD4^{+} a células
efectoras Th1 cooperadoras o "helper". En este sentido, el
IFN-\gamma ayuda a prevenir la formación de
tumores, ya que los ratones deficientes para esta citocina
desarrollan enfermedades neoplásicas espontáneas (Dighe, 1994;
Kaplan, 1998). Además, el TGF-\beta desempeña un
papel inmunosupresor, inhibiendo por tanto la respuesta inmunitaria
antitumoral mediante la regulación de la producción de citocinas
proinflamatorias (Letterio y Roberts, 1998), lo que es dependiente
del estadio celular y las citocinas presentes en el microentorno
celular. El TGF-\beta se ha implicado en la
modulación de los mecanismos efectores antitumorales por la
alteración de la activación, proliferación y citotoxicidad de las
células inmunes, macrófagos, células NK y linfocitos T (Gorelik y
Flavell, 2000; Kehrl et al., 1986). Se ha descrito
recientemente que el bloqueo de la señalización inducida por
TGF-\beta aumenta la eficacia de la inmunidad
antitumoral, ya que facilita la expansión de los linfocitos T
CD8^{+} específicos contra el tumor (Gorelik y Flavell, 2001).
Hay otras citocinas involucradas en la regulación del reclutamiento,
proliferación, diferenciación y supervivencia de las células
efectoras antitumorales. La quimiocina MCP-1, que
es producida por muchos tipos celulares, activa el reclutamiento
celular y los ratones deficientes para MCP-1
presentan deficiencias en las respuestas dependientes de
linfocitos T (Allavena et al., 1994; Carr et al.,
1994; Gu et al., 1997). Por lo tanto, las citocinas
desempeñan papeles esenciales en la inducción de la inmunidad
antitumoral, y el bloqueo de las mismas puede constituir una
terapia eficaz en distintos modelos humanos y murinos (Gill,
1995).
El efecto fibrogénico y otros efectos negativos
del TGF-\beta puede limitar su empleo
inmunoterapéutico en humanos (Border y Ruoshlati, 1992). El
TGF-\beta está involucrado en diversas
condiciones patológicas y su empleo sistémico tiene un riesgo
oncogénico, que puede explicar el elevado número de tumores
observados en pacientes tratados con ciclosporina A (CsA), que es un
fármaco que incrementa la producción sistémica de
TGF-\beta (Hojo et al., 1999). Por lo
tanto, la regulación localizada del TGF-\beta
puede resultar un tratamiento eficaz de las enfermedades
inflamatorias crónicas, evitando las consecuencias negativas y los
efectos secundarios del incremento generalizado de la expresión de
esta citocina.
En esta patente se demuestra el papel inhibidor
de CD69 en las reacciones inmunes, empleando un modelo experimental
de artritis murina inducida por colágeno (AIC). Los ratones
deficientes para CD69 desarrollan una AIC exacerbada, con
incremento de las respuestas inmunitarias T y B contra colágeno de
tipo II (CII). Los ratones CD69^{-/-} muestran una síntesis local
deficiente de TGF-\beta que puede ser responsable
de este efecto, ya que el papel protector del
TGF-\beta en el desarrollo de enfermedades
autoinmunes se ha demostrado previamente. En este sentido, la
inyección local de un anticuerpo neutralizante contra
TGF-\beta en ratones normales en los que se ha
inducido AIC también incrementa la gravedad de la misma. Además, la
activación de CD69 induce la producción de
TGF-\beta en linfocitos T activados, células
sinoviales de ratón o células mononucleadas de sinovios de
artropatías crónicas humanas, que expresan CD69.
También se demuestra el papel inhibidor de CD69
in vivo mediante el análisis de la susceptibilidad de los
ratones deficientes para CD69 a la inducción de tumores. Los
ratones deficientes en CD69 en los que se han desarrollado tumores
exhibieron una fuerte regresión del crecimiento tumoral y aumento
de la supervivencia comparado con ratones normales. Esta potente
respuesta antitumoral correlaciona con una producción deficiente de
TGF-\beta, un incremento en los niveles de
citocinas inflamatorias y la quimiocina MCP-1, y
está asociado con un aumento en el reclutamiento de linfocitos
efectores y disminución de la apoptosis celular. Esta resistencia
frente al crecimiento tumoral depende de los linfocitos T y las
células NK, y persiste en ratones inmunodeficientes CD69^{-/-}
RAG1^{-/-}. En consonancia con estos resultados, el bloqueo del
TGF-\beta en ratones control aumenta la respuesta
antitumoral, estableciendo una relación directa entre la
disminución de la síntesis de TGF-P encontrada en
los ratones CD69^{-/-} y la mejora en la respuesta antitumoral.
Por otra parte, la activación de CD69 induce la activación de la
quinasa ERK y la producción de TGF-\beta por los
linfocitos T. El bloqueo farmacológico de ERK mediante el inhibidor
PD98059 inhibe la producción de TGF-\beta,
demostrando la importancia de la señalización mediada por CD69 en la regulación del TGF-\beta.
demostrando la importancia de la señalización mediada por CD69 en la regulación del TGF-\beta.
En esta patente también se demuestra que el
tratamiento in vivo de ratones normales e inmunodeficientes
(cepas SCID y RAG-negativa) con el anticuerpo
antagonista de CD69 2.2 aumenta la respuesta antitumoral. Por lo
tanto, demostramos que el tratamiento in vivo con
anticuerpos anti-CD69 es una nueva aproximación
para la potenciación de la respuesta inmunitaria en la manipulación
de la inmunidad tumoral que se puede ampliar a enfermedades
infecciosas y síndromes de inmunodeficiencias para recuperar la
respuesta inmunitaria. El tratamiento in vivo con anticuerpos
anti-CD69 causa diferentes efectos dependiendo del
anticuerpo: el antagonista 2.2 aumenta la respuesta inmunitaria
incrementando la gravedad de la AIC y el rechazo tumoral, mientras
que el deplecionante 2.3 elimina los leucocitos efectores activados
CD69^{+}, lo que causa una atenuación de la AIC. Además, se puede
emplear este reactivo en la eliminación directa de tumores que sean
CD69^{+}.
El papel de CD69 como un modulador negativo de
la respuesta inmunitaria introduce la posibilidad de emplear esta
molécula como diana en la terapia de la inflamación crónica y otras
enfermedades inmunitarias. Dado que CD69 se expresa exclusivamente
en leucocitos activados que infiltran tejidos inflamados, la
estimulación farmacológica de la síntesis de
TGF-\beta a través de CD69 puede tener un efecto
local, evitando, por tanto, los efectos negativos del incremento
sistémico de TGF-\beta.
La patente presentada contiene procedimientos
para la modulación de la respuesta inmune a través del empleo de
CD69 como diana mediante diversos protocolos.
Una meta específica consiste en la modulación de
la respuesta inmunitaria a través de CD69 usando sustancias que
inhiben o bloquean la señalización a través de CD69, incluyendo
aquéllas que inhiben la expresión de la molécula, y que se
identifican como antagonistas de CD69. El tercer objetivo es la
regulación inmunitaria a través de la erradicación de las células
que expresan CD69, empleando sustancias que eliminan dichas
células, y que se identifican como eliminadores de CD69.
Otros objetivos específicos de esta patente
están constituidos por los métodos para descubrir, identificar o
evaluar sustancias que antagonistas o eliminadores de CD69. Estos
métodos incluyen medida del calcio intracelular, activación de
MAPK, producción de TGF-\beta, inducción de
mediadores de apoptosis y lisis celular. Algunas de estas
sustancias se identifican específicamente, como los anticuerpos
contra CD69 o sustancias directa o indirectamente derivadas de los
mismos. También es un objetivo de esta patente la identificación de
ligando/s putativo/s de CD69 mediante el empleo de cromatografía de
afinidad usando como sustrato construcciones relacionadas con CD69,
así como la determinación del carácter antagonista o eliminador de
dichos ligandos.
Otro punto específico de esta patente es el
empleo de sustancias que pueden modular la respuesta inmunitaria
directa o indirectamente a través de CD69 en el tratamiento de
enfermedades inmunes. Como se muestra en los ejemplos, los procesos
autoinmunes o tumorales están influidos por la presencia o ausencia
de CD69, y el tratamiento con sustancias que actúan a través de
dicho receptor. Estos resultados se pueden generalizar para
englobar a otras enfermedades inmunes, como:
- \bullet
- Enfermedades autoinmunes, incluyendo artritis reumatoide y otros tipos de artritis o artropatías crónicas o agudas con componente inmunitario, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia, síndrome de Sjögren, diabetes autoinmune, tiroiditis, y otras enfermedades inmunitarias específicas de tejido, como soriasis. También se contemplan en este grupo diversas enfermedades neurológicas, como la esclerosis múltiple, miastenia gravis, etc., y gastrointestinales, como son la enfermedad de Crohn, colitis, síndrome celíaco, hepatitis y otras enfermedades mediadas por el sistema inmune.
- \bullet
- Enfermedades cardiovasculares, incluyendo ateroesclerosis, cardiomiopatías, fiebres reumáticas, endocarditis, vasculitis, y otras enfermedades cardiovasculares con componente inmune.
- \bullet
- Enfermedades respiratorias, como enfisema, infecciones de las vías aéreas, y otras.
- \bullet
- Procesos alérgicos y reacciones de hipersensibilidad (tipos I, II, III y IV), incluyendo asma, rinitis, y otras reacciones de este tipo con componente inmunitario.
- \bullet
- Trasplante o rechazo de injertos, que comprende trasplante de órganos, injertos de tejido, y transfusiones sanguíneas. También se incluye la enfermedad de injerto vs. huésped durante el trasplante de médula ósea.
- \bullet
- Enfermedades oncológicas, como leucemia, desórdenes linfoproliferativos, tumores sólidos y todos los tipos de cáncer.
- \bullet
- Enfermedades infecciosas, incluyendo aquéllas producidas por bacterias, virus, hongos o parásitos, shock séptico, y otras reacciones inmunopatológicas a agentes infecciosos.
- \bullet
- Enfermedades de inmunodeficiencia congénita y adquiridas, y síndromes de inmunodepresión por radioterapia y quimioterapia.
- \bullet
- Procesos degenerativos como neurodegeneración, que impliquen a células inmunocompetentes, como la microglía.
- \bullet
- Administración, control de antígeno, empleada para manipular la naturaleza de la respuesta antigenoespecífica.
- \bullet
- Terapia génica.
- \bullet
- Algunos procesos mediados por el sistema inmune pueden potenciarse por la manipulación de CD69, como la inmunosupresión, que se puede aplicar en varios contextos, incluyendo los previamente indicados, o inmunoactivadores que pueden emplearse en vacunación, así como la inmunidad de protección por inyección de DNA codificante para antígenos microbianos o tumorales, u otros procesos para el tratamiento de enfermedades mediadas por el sistema inmune, incluyendo las indicadas anteriormente.
Dado que el TGF-\beta y otros
mediadores de la señalización por CD69 tienen un efecto
pleiotrópico, todas las enfermedades sugeridas previamente pueden
dar cuenta del efecto descrito para CD69 en la regulación
inmunitaria, y los objetivos específicos no se limitan a las
siguientes predicciones, que están basadas en los ejemplos
indicados a continuación: la aproximación empleando antagonistas
seguiría un camino opuesto, siendo utilizada en el tratamiento de
enfermedades o procesos que requieren de la potenciación del
sistema inmune, como el rechazo de tumores, el tratamiento de
infecciones, o su prevención mediante vacunación. La estrategia de
eliminación erradicaría las células CD69^{+}, que son aquéllas
activadas localmente en respuesta a estimulación antigénica y
median la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, la consecuencia
esperada sería la mejora de las enfermedades asociadas con la
exacerbación de la respuesta inmune, como las enfermedades
autoinmunes, el rechazo de trasplantes y otras de la lista
anterior.
Como se usa aquí, "CD69", también conocida
como proteína de "activación muy temprana", "molécula de
inducción de activación" y "gp34/28", se refiere al CD69 de
mamífero, preferiblemente a la proteína de CD69 humana. De acuerdo,
el término "CD69 humano" se refiere a un polipéptido que tiene
o es homólogo a (por ejemplo, al menos sobre un 85%, 90%, 95%
idéntico a) una secuencia de aminoácidos mostrada previamente, o
que es codificada por: (a) una secuencia de ácido nucleico que
codifique para CD69 humano (por ejemplo, una secuencia de ácido
nucleico que codifique para CD69 humano según; (b) una secuencia de
ácido nucleico degenerada a una secuencia de CD69 humano natural;
(c) un ácido nucleico de secuencia homóloga a (por ejemplo, al
menos sobre un 85%, 90%, 95% idéntico a) la secuencia de ácido
nucleico para CD69 natural; o (d) una secuencia de ácido nucleico
que hibride con alguno de las secuencias de ácido nucleico
indicadas con anterioridad bajo condiciones astringentes, por
ejemplo, condiciones altamente astringentes. Un CD69 preferido es
una variante o alelo natural de CD69.
Una "molécula de anticuerpo
anti-CD69" es una molécula de anticuerpo que
interacciona (p.e, se une a) CD69, preferiblemente a la proteína de
CD69 humano. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo
anti-CD69 se unen al dominio extracelular de CD69
(por ejemplo, un epítopo de CD69 localizado fuera de la célula).
Ejemplos de anticuerpos monoclonales frente a CD69 humano incluyen,
pero no se limitan a una molécula de anticuerpo
anti-CD69 humano análoga al anticuerpo
anti-CD69 de ratón 2.2, una molécula de anticuerpo
anti-CD69 humano análoga al anticuerpo
anti-CD69 de ratón 2.3 o un anticuerpo
anti-CD69 humano conocido en la bibliografía, que
pueda actuar como, antagonista o eliminador de CD69 o moléculas de
anticuerpo que tienen epítopos que solapen con el epítopo de tal
anticuerpo, o que compitan con tal anticuerpo para la unión.
Ejemplos de anticuerpos anti-CD69 humano conocidos
en la bibliografía incluyen: TP1/8, TP1/22, TP 1/28, TP 1/33, TP
1/55 (como se describe, por ejemplo, en [Cebrian, 1988]); CH/4,
CH/1, CH/2, FAB/1 (como se describe p.e. en
Sánchez-Mateos, 1991; L78, MLR3, FN61, FN50 (como
se describe, por ejemplo, en Schwarting, R. et al. (Eds)
Leukocyte Typing IV, Springer-Verlag, New York,
1989, p. 428); MLR3 (como se describe, p.e., en Corte, 1981);
EA-1; Leu 23 (como se describe, p.e., en Lanier,
1988); y C1.18, E16.5 (como se describe, p.e, en Gerosa, 1991).
Ejemplos de moléculas de anticuerpo que se pueden usar en la
invención incluyen pero no se limitan a: una molécula de anticuerpo
que interacciona con, por ejemplo, se une a, un epítopo que incluye
uno o más residuos de la región cuello de un polipéptido de CD69
(por ejemplo, uno o más residuos del 62-84 del CD69
humano); una molécula de anticuerpo que interacciona con, por
ejemplo, se une a uno o más residuos del dominio NK (o dominio de
reconocimiento de carbohidratos, CRD) de un polipéptido de CD69
(por ejemplo, uno o más residuos de los residuos 82 a 199 del CD69
humano); una molécula de anticuerpo que interacciona con, por
ejemplo, se une a, un epítopo que incluye uno o más residuos del
dominio intracelular de un polipéptido de CD69 (por ejemplo, uno o
más residuos de 1-40 del CD69 humano); una molécula
de anticuerpo que interacciona con, por ejemplo, se une a un
epítopo, al que cuando se une modula, por ejemplo, aumenta o
reduce, la interacción de las regiones de CD69 citoplásmico y/o
transmembrana con un efector, cuya actividad puede determinarse por
los métodos descritos aquí (por ejemplo, producción de
TGF-\beta, activación de MAPK, o señalización por
Ca^{2+}); una molécula de anticuerpo que interacciona con, por
ejemplo, se une a, un epítopo (por ejemplo, un epítopo
conformacional o lineal), el cual se modula cuando el anticuerpo
está unido, por ejemplo, aumenta o reduce la formación de dímeros
de CD69 (por ejemplo, un epítopo que incluye el residuo Cys68 del
CD69 humano o un residuo localizado cerca de la Cys68); una
molécula de anticuerpo que puede modular la unión de un ligando de
CD69, por ejemplo, un anticuerpo que puede inhibir por ejemplo,
inhibir competitivamente, o potenciar la unión de un ligando a
CD69; una molécula de anticuerpo que interacciona con, por ejemplo,
se une a, o que puede inhibir o potenciar la unión de un ligando a
uno o más residuos de aminoácidos Glu 140, Asp171, Glu 180, Glu
185, Glu 187, Phe 175, Met 184, Leu 190, Glu 185 y Lys188 del CD69
humano.
En un ejemplo, la molécula de anticuerpo
anti-CD69 se une a todo o parte del epítopo de un
anticuerpo descrito aquí, por ejemplo, un anticuerpo
anti-CD69 humano conocido en la bibliografía puede
actuar como, un antagonista o un eliminador, o un anticuerpo
anti-CD69 humano análogo a un anticuerpo
anti-CD69 de ratón, por ejemplo, anticuerpo 2.2,
2.3, o H1.2F3 (descrito, por ejemplo, en Esplugues et al.).
El anticuerpo anti-CD69 se puede unir a uno o más
residuos de los epítopos descritos en o competir por la unión a un
anticuerpo que se une a uno de los epítopos descritos. La molécula
de anticuerpo anti-CD69 puede inhibir, por ejemplo,
inhibir competitivamente, la unión de un anticuerpo descrito aquí,
por ejemplo, un anticuerpo anti-CD69 humano
conocido en la bibliografía como los aquí descritos frente al CD69
humano. Una molécula de anticuerpo anti-CD69 puede
unirse a un epítopo, por ejemplo, un epítopo conformacional o
lineal, de manera que cuando interaccionen se prevenga la unión de
uno de los anticuerpos descritos aquí, por ejemplo, un anticuerpo
anti-CD69 humano conocido en la bibliografía como
los aquí descritos frente a CD69 humano. El epítopo puede estar muy
próximo o funcionalmente asociado, por ejemplo, un epítopo
solapante o adyacente en secuencia lineal o conformacionalmente, a
uno de los reconocidos por un anticuerpo descrito aquí, por
ejemplo, un anticuerpo anti-CD69 humano conocido en
la bibliografía como los aquí descritos frente al CD69 humano.
En un ejemplo preferido, la interacción, por
ejemplo, la unión, entre una molécula de anticuerpo
anti-CD69 y CD69 ocurre con alta afinidad (por
ejemplo, constante de afinidad de al menos 3x10^{7} M^{-1},
preferiblemente, entre 3x10^{8} M^{-1} y 3x10^{10}, o sobre
3x10^{9} M^{-1}) y especificidad. Preferiblemente, la molécula
de anticuerpo anti-CD69 modula la respuesta inmune,
por ejemplo, actúa como un, antagonista o eliminador de CD69.
Como se usa aquí, "unión específica" se
refiere a la propiedad del agente de unión, preferiblemente el
anticuerpo, a: (1) unirse a CD69, por ejemplo, una proteína de CD69
humano, con una afinidad de al menos 1x10^{7} M^{-1}, y (2)
preferentemente unirse a CD69, por ejemplo, la proteína de CD69
humano, con una afinidad que es al menos dos veces, 50 veces, 100
veces, 1000 veces, o mayor que su afinidad de unión a un antígeno
no específico (p.e, BSA, caseína) distinto a CD69.
Como puede verse en el presente invento, muchos
tipos de moléculas de anticuerpo anti-CD69, por
ejemplo, anticuerpos, o fragmentos de ellos que se unan al
antígeno, son útiles en los métodos de esta invención. Las
moléculas de anticuerpo pueden ser de varios isotipos, incluyendo:
IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2(por ejemplo, IgG2a, IgG2b),
IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgD, o IgE. Una molécula de
anticuerpo preferida es un isotipo IgG. Las moléculas de
anticuerpo pueden ser de longitud completa (p.e, un anticuerpo IgG1
o IgG4) o pueden incluir sólo un fragmento de unión al antígeno
(por ejemplo, un Fab, F (ab')_{2}, Fv o una cadena sencilla de un
fragmento Fv). El anticuerpo es preferiblemente una molécula de
anticuerpo diseñada, por ejemplo, un anticuerpo humanizado.
Los anticuerpos, u otros agentes descritos aquí,
pueden ser evaluados por su capacidad para actuar como antagonistas
o eliminadores de CD69.
Un anticuerpo eliminador de CD69 es uno que,
tras administración a un animal, sólo o conjugado a una toxina,
reduce el número absoluto de células CD69+, por ejemplo, células
tumorales CD69+, por ejemplo, leucocitos CD69+ presentes en
infiltrados inflamatorios crónicos. Usualmente, actuará a través de
la lisis directa de estas células (en contraste con, por ejemplo,
una retención transitoria de células en un compartimento orgánico,
tal como la médula ósea o el hígado).
Un anticuerpo anti-CD69
antagonista es uno que, tras administración al animal, induce a las
células CD69+ a disminuir su producción de la citoquina
TGF-\beta, por ejemplo, por el bloqueo de la
señalización endógena inducida por la unión de CD69 a uno o más de
sus ligandos naturales o receptores; por ejemplo, por el bloqueo de
la interacción de CD69 con sus ligandos naturales o receptores.
Varios métodos in vitro se pueden usar,
por ejemplo, en conjunción con los ensayos in vivo en el
animal completo, para evaluar la capacidad de candidatos para su
actividad como deplecionantes o antagonistas. Un ensayo in
vitro puede no ser indicativo de su actividad in vivo en
todos los casos, pero puede ser útil en estrategias de
búsqueda.
Un anticuerpo eliminador de CD69 in vitro
es un anticuerpo que, tras la incubación con células CD69+, reduce
el número absoluto de tales células. Esto puede realizarse a través
de la lisis directa, por ejemplo, vía mecanismos dependientes de
complemento, de receptor Fc o de toxinas conjugadas. Así, un
eliminador de CD69 puede lisar células que expresen CD69 en
ensayos de muerte in vitro. El isotipo del anticuerpo puede
desempeñar un papel importante en la posible función como
eliminador, vía un mecanismo basado en complemento. Si un
anticuerpo es capaz de unirse a complemento, se comportará
probablemente como un eliminador. La mayoría de anticuerpos
naturales tienen una gran afinidad por complemento y serán así
eliminadores. Esto es menos probable en el caso de la IgG1 de ratón
y la IgG4 humana, que tienen baja afinidad por complemento. Además,
los anticuerpos pueden ser diseñados para reducir o aumentar su
afinidad por complemento. Un anticuerpo anti-CD69 de
ratón (generado en ratón u otra especie) puede matar células de
ratón que expresan CD69 in vitro en presencia de
complemento. Células diana útiles para probar tales anticuerpos
incluyen, por ejemplo, las leucemias murinas, e.g., el timoma
murino EL-4.
Un anticuerpo generado en ratón u otra especie frente a CD69 humano que sea eliminador, puede matar células humanas que expresan CD69, por ejemplo, linfocitos T de fluido sinovial de artritis reumatoide que expresan CD69, leucemias que expresan CD69, o transfectantes estables de CD69, por ejemplo, células de la leucemia linfoblástica Jurkat transfectadas establemente para expresar CD69. Este anticuerpo no matará (o lo hará a un nivel mucho menor) células control que no expresan CD69, por ejemplo, la línea parental Jurkat no transfectada, que no expresa CD69. Así, la capacidad de un anticuerpo para funcionar como eliminador puede ser ensayada in vitro por su capacidad para lisar células diana CD69+ y células control CD69-. Un candidato para eliminador, lisará las células CD69+ pero no las CD69- control (o las lisará significativamente menos). En un ejemplo, la lisis celular puede monitorizarse en un ensayo en que las células diana (y control) se marcan con ^{51}Cr y se incuban con el anticuerpo en presencia de complemento de conejo, típicamente 2 h a 37ºC. Tras ello se recupera el sobrenadante y el nivel de lisis celular se evalúa por la cantidad de ^{51}Cr liberada al sobrenadante. El nivel de lisis es indicado por la liberación de ^{51}Cr por las células lisadas.
Un anticuerpo generado en ratón u otra especie frente a CD69 humano que sea eliminador, puede matar células humanas que expresan CD69, por ejemplo, linfocitos T de fluido sinovial de artritis reumatoide que expresan CD69, leucemias que expresan CD69, o transfectantes estables de CD69, por ejemplo, células de la leucemia linfoblástica Jurkat transfectadas establemente para expresar CD69. Este anticuerpo no matará (o lo hará a un nivel mucho menor) células control que no expresan CD69, por ejemplo, la línea parental Jurkat no transfectada, que no expresa CD69. Así, la capacidad de un anticuerpo para funcionar como eliminador puede ser ensayada in vitro por su capacidad para lisar células diana CD69+ y células control CD69-. Un candidato para eliminador, lisará las células CD69+ pero no las CD69- control (o las lisará significativamente menos). En un ejemplo, la lisis celular puede monitorizarse en un ensayo en que las células diana (y control) se marcan con ^{51}Cr y se incuban con el anticuerpo en presencia de complemento de conejo, típicamente 2 h a 37ºC. Tras ello se recupera el sobrenadante y el nivel de lisis celular se evalúa por la cantidad de ^{51}Cr liberada al sobrenadante. El nivel de lisis es indicado por la liberación de ^{51}Cr por las células lisadas.
Un anticuerpo anti-CD69
antagonista in vitro es el que, tras incubación con células
CD69+, disminuye su producción de la citoquina
TGF-\beta, por ejemplo, por bloqueo de la
señalización endógena inducida por la unión de CD69 a uno o más de
sus ligandos naturales o receptores, presentes en el sistema de
cultivo in vitro. Así, uno puede realizar una búsqueda de
antagonistas in vitro incubando un candidato antagonista con
una célula CD69+ y evaluando su efecto en la producción de
TGF-\beta, por ejemplo, comparado con una célula
control, por ejemplo, una célula CD69-. Un anticuerpo
anti-CD69 de ratón puede ser evaluado en su
capacidad para comportarse como un antagonista in vitro
analizando su capacidad para inhibir o reducir la producción de
TGF-\beta por esplenocitos activados con
concanavalina A, que son CD69+. Un anticuerpo
anti-CD69 humano puede ser evaluado por su
capacidad para mediar la producción de TGF-\beta
por células Jurkat transfectadas establemente con CD69. Un
antagonista inhibirá la producción de
TGF-\beta
por estas células, pero no en una línea control, preferiblemente la línea parental Jurkat que no expresa CD69. Un antagonista no debería actuar como eliminador.
por estas células, pero no en una línea control, preferiblemente la línea parental Jurkat que no expresa CD69. Un antagonista no debería actuar como eliminador.
Además, un antagonista puede tener una o más de
las siguientes propiedades:
1) Bloquear la unión de CD69 puro a su receptor
o ligando purificados, o a preparaciones parcialmente purificadas
de fracciones de membrana de células que respondan a CD69, por
ejemplo, que expresen un CD69R, o a células enteras que respondan a
CD69, por ejemplo, que expresen un CD69R;
2) Bloquear la unión de una célula CD69+ al
CD69R purificado;
3) Bloquear la unión de una célula CD69+ a una
célula que exprese el CD69R (por ejemplo, células que respondan a
CD69) o a preparaciones parcialmente purificadas de tales
fracciones de membrana de células que respondan a CD69, por
ejemplo, que expresen un CD69R. Por ejemplo, el candidato
antagonista bloquearía la unión de una molécula ligando de CD69 a
un transfectante estable de CD69 humano de las células Jurkat (pero
no a la línea parental
CD69-);
CD69-);
4) Bloquear la unión de un anticuerpo monoclonal
agonista a una célula CD69+ y así inhibir la producción de
TGF-\beta por el anticuerpo agonista.
Como se usa aquí, el término molécula de
anticuerpo, se refiere a una molécula que incluye un número
suficiente de regiones determinantes de complementariedad (CDRs),
preferiblemente 6, presentadas en una disposición que permite la
unión de las CDRs al antígeno conocido. Así, el término incluye
anticuerpos completos (incluyendo los anticuerpos naturales y los
diseñados por Biología Molecular), y fragmentos de unión al
antígeno de anticuerpos naturales o diseñados. El término incluye
varios tipos de anticuerpos o moléculas de anticuerpo, incluyendo
los monoespecíficos, monoclonales, recombinantes, humanos, no
humanos, por ejemplo, murinos. También se incluyen anticuerpos de
cadena sencilla, intracuerpos y anticuerpos bivalentes. También se
incluyen moléculas de anticuerpo quiméricas, con un CDR distinto
injertado, humanizados, desinmunogénicos, así como otras que hayan
sido diseñadas para reducir la inmunogenicidad, por ejemplo,
aquellos con CDRs derivados de una fuente no humana, por ejemplo,
de un animal no humano como el ratón, y/o derivados de la
generación parcial o totalmente al azar de secuencias, por ejemplo,
usando un método de selección en fagos. Tales fragmentos no humanos
pueden ser insertados en moléculas humanas, humanizadas, o en otras
disposiciones que las hagan menos antigénicas cuando se administren
a un
humano.
humano.
Así, una molécula de anticuerpo puede tener:
CDRs de una fuente no humana, por ejemplo, de un anticuerpo no
humano, por ejemplo, de una inmunoglobulina de ratón u otra
inmunoglobulina no humana, de una secuencia consenso, o de una
secuencia generada por selección de fagos, o cualquier otro método
para generar diversidad; y teniendo una disposición que es menos
antigénica en una estructura humana que no humana, por ejemplo, en
el caso de CDRs de una inmunoglobulina no humana, menos antigénico
que la estructura no humana de la cual los CDRs no humanos se
tomaron. La estructura de la inmunoglobulina puede, por ejemplo,
ser humana, no humana humanizada, por ejemplo, un ratón, estructura
modificada para reducir la antigenicidad en humanos, o una
estructura sintética, por ejemplo, una secuencia consenso o de un
método de generación de diversidad in vitro.
Las moléculas de anticuerpo preferidas pueden
incluir al menos una, y preferiblemente dos, regiones variables de
la cadena pesada (VH) o sus fragmentos de unión al antígeno, y al
menos una o preferiblemente dos regiones variables de la cadena
ligera (VL) o sus fragmentos de unión al antígeno. Las regiones VH
y VL se subdividen en regiones de hipervariabilidad, llamadas
"regiones determinantes de complementariedad" (CDR),
interespaciadas con regiones que son más conservadas, llamadas
"regiones estructurales" (FR). La extensión de las regiones
estructurales y los CDRs se ha definido de forma precisa (ver, por
ejemplo, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins
of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of
Health and Human Services, NIH Publication No.
91-3242, y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol.
Biol. 196:901-917). Preferiblemente, cada VH y VL
de una molécula de anticuerpo se compone de tres CDRs y cuatro FRs,
dispuestos desde el amino-terminal al
carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1,
FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Los CDRs y FRs pueden proceder de
diferente origen.
La cadena VH o VL de una molécula de anticuerpo
puede incluir todo o parte de una región constante de la cadena
ligera o pesada. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo es un
tetrámero de dos cadenas pesadas y dos ligeras de inmunoglobulinas,
donde las cadenas pesadas y ligeras se interconectan por, por
ejemplo, puentes disulfuro. La región constante de la cadena pesada
se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. La región constante de
la cadena ligera se compone de un dominio, CL. La región variable
de las cadenas pesadas y ligeras contiene un dominio de unión que
interacciona con el antígeno. Las regiones constantes de los
anticuerpos median típicamente la unión de la molécula de
anticuerpo a tejidos del huésped o factores, incluyendo varios
tipos celulares del sistema inmune (por ejemplo, células
efectoras) y el primer componente (C1q) de la vía clásica del
sistema de complemento. Las moléculas de anticuerpo pueden incluir
IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como todos sus subtipos), donde las
cadenas ligeras pueden ser del tipo kappa o lambda.
Como se discute arriba, los "fragmentos de
unión al antígeno" de una molécula de anticuerpo están dentro
del término molécula de anticuerpo. Un fragmento de unión al
antígeno, como se usa aquí, puede referirse a una porción de un
anticuerpo que se une específicamente a CD69 (por ejemplo, CD69
humano). Ejemplos de fragmentos de unión incluyen (i) un fragmento
Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH,
CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')_{2}, fragmento
bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente
disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd, que consiste
en los dominios VH y CHI; (iv) un fragmento Fv, que consiste en
los dominios VL y VH de un brazo sencillo de un anticuerpo, (v) un
fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature
341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi)
una o más CDRs aisladas con suficiente estructura para unirse
específicamente, por ejemplo, una porción de unión al antígeno de
una región variable.
Los fragmentos de anticuerpo pueden también
producirse por métodos químicos, por ejemplo, por rotura de un
anticuerpo intacto con una proteasa, tal como la pepsina o la
papaína, u, opcionalmente, tratando el producto digerido con un
agente reductor. Alternativamente, se pueden producir fragmentos
útiles usando células del huésped transformadas con genes
truncados de las cadenas pesadas y/o ligeras.
Una porción de unión al antígeno de una región
variable de la cadena ligera y una porción de unión al antígeno de
una región variable de la cadena pesada, por ejemplo, los dos
dominios del fragmento Fv, VL y VH, pueden ser unidos, usando
métodos recombinantes, por una unión sintética que les permita
constituir una cadena sencilla de proteína en que el par de
regiones VL y VH forme moléculas monovalentes (conocidas como Fv de
cadena sencilla (scFv); ver, por ejemplo, Bird et al. (1988)
Science 242:423-426; y Huston et al.
(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena sencilla
son también incluidos dentro del término "fragmento de unión al
antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se
obtienen usando técnicas convencionales conocidas, y los fragmentos
son estudiados para su utilidad de la misma manera que los
anticuerpos intactos.
El término "anticuerpo o molécula de
anticuerpo monoespecífica" se refiere a un anticuerpo o molécula
de anticuerpo que muestra una sola especificidad de unión y
afinidad por una diana particular, por ejemplo, un epítopo. Este
término incluye un "anticuerpo monoclonal" o una
"composición de anticuerpo monoclonal".
El término de anticuerpo o molécula de
anticuerpo "recombinante", como se emplea aquí, se refiere a
anticuerpos o moléculas de anticuerpo que se preparan, expresan,
crean o aíslan usando métodos recombinantes, tales como moléculas
de anticuerpo expresadas usando un vector de expresión recombinante
transfectado en una célula hué3sped, moléculas de anticuerpo
aisladas de un recombinante, una librería de anticuerpo
combinatoria, moléculas de anticuerpo aisladas de un animal (por
ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina
humana o moléculas de anticuerpo preparadas, expresadas, creadas o
aisladas por cualquier otro medio que suponga la combinación de
secuencias génicas de inmunoglobulinas humanas con otras secuencias
de DNA. Tales moléculas de anticuerpo recombinantes incluyen
moléculas de anticuerpo humanizadas, con CDR injertado, quiméricas,
deinmunizadas, generadas in vitro (por ejemplo, por
selección de fagos), y pueden incluir opcionalmente regiones
constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulinas de la
línea germinal humana.
Los anticuerpos monoclonales, quiméricos y
humanizados, que han sido modificados por, por ejemplo,
destrucción, adición, o sustitución de otras porciones del
anticuerpo, por ejemplo, la región constante, están también dentro
del ámbito de la invención. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser
modificado como sigue: (i) por destrucción de la región constante;
(ii) por sustitución de la región constante con otra región
constante, por ejemplo, una región constante que aumente la vida
media, estabilidad o afinidad del anticuerpo, o una región
constante de otra especie o clase de anticuerpo; o (iii) por la
modificación de uno o más aminoácidos de la región constante para
alterar, por ejemplo, el número de sitios de glicosilación, la
función de la célula efectora, la unión a receptores Fc (FcR), la
fijación de complemento, el transporte a través de la placenta,
entre otros.
En un ejemplo, la región constante del
anticuerpo puede ser reemplazada por otra región constante de, por
ejemplo, una especie diferente. Este reemplazamiento puede ser
realizado usando técnicas de Biología Molecular. Por ejemplo, el
ácido nucleico que codifica la región VL o VH de un anticuerpo
puede ser convertido a un gen de cadena pesada o ligera de
longitud completa, respectivamente, por la unión operativa de los
ácidos nucleicos que codifican para VH o VL a otros ácidos
nucleicos que codifiquen las regiones constantes de las cadenas
pesadas o ligeras. Las secuencias de los genes de las regiones
constantes de las cadenas pesadas y ligeras humanas se conocen.
Preferiblemente, la región constante es humana, pero la región
constante de otras especies, por ejemplo, roedores (por ejemplo,
ratón o rata), primate, camello, conejo, pueden usarse también. Las
regiones constantes de estas especies son conocidas (ver por
ejemplo, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins
of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of
Health and Human Services, NIH Publication No.
91-3242).
Los métodos para la alteración de la región
constante de un anticuerpo se conocen. Los anticuerpos con función
alterada, por ejemplo, afinidad alterada por un ligando efector,
tal como el FcR en una célula ó el componente C1q del complemento
pueden ser producidos por reemplazamiento de al menos un residuo
aminoácido en la porción constante del anticuerpo con un residuo
distinto (ver, por ejemplo, EP 388,151 A1, US 5,624,821 y US
5,648,260, cuyos contenidos son incorporados aquí por referencia).
Tipos similares de alteraciones se han descrito, de manera que si
se aplican a inmunoglobulinas murinas o de otras especies,
reducirían o eliminarían estas funciones.
Inmunógenos útiles para la generación de
moléculas de anticuerpo anti-CD69 incluyen células
que expresan CD69, preparaciones de membrana de células que
expresan CD69, micelas o vesículas con CD69, CD69 o fragmentos de
CD69, por ejemplo, CD69 aislado o purificado, por ejemplo, CD69
humano, por ejemplo, CD69 bioquímicamente aislado o una porción del
mismo, o CD69 o alguno de sus fragmentos producidos de manera
recombinante, por ejemplo, el dominio extracelular o intracelular
de CD69; o cualquier proteína de fusión conteniendo alguno de estos
fragmentos de CD69. El antígeno es preferiblemente un antígeno
humano. El CD69 soluble se puede obtener, por ejemplo, por
producción recombinante de CD69 soluble (por ejemplo, un
polipéptido de CD69 que carece de todo o parte de los dominios
transmembrana y/o intracelular de CD69) o por lisis de una célula
que expresa CD69. Técnicas para la generación de anticuerpos
anti-CD69 se describen en
Sánchez-Mateos et al. (1991) Eur. J.
Immunol. 21:2317-2325, cuyo contenido es
expresamente incorporado por referencia.
Los fragmentos de CD69 que incluyen los residuos
62-84 o porciones de ellos de SEQ ID NO:2, pueden
ser usados para hacer anticuerpos frente a las regiones cuello de
la proteína de CD69, por ejemplo, los fragmentos pueden usarse como
inmunógenos o usarse para caracterizar la especificidad de un
anticuerpo. De manera similar, fragmentos de CD69, incluyendo los
residuos 82 a 199, o porciones de ellos de SEQ ID NO:2 pueden
usarse para generar un anticuerpo contra el dominio NK de la
proteína de CD69; fragmentos de CD69 que incluyen los residuos 62 a
199 o porciones de ellos de SEQ ID NO:2 pueden usarse para hacer un
anticuerpo frente a la región extracelular de la proteína de CD69;
fragmentos de CD69 que incluyen residuos de sobre 1 a 40 de SEQ ID
NO:2 pueden usarse para hacer un anticuerpo frente a una región
intracelular de la proteína CD69.
Moléculas de anticuerpo reactivas con, o
específicas para, cualquier región o dominio de CD69,
particularmente una región o dominio extracelular de CD69, pueden
hacerse y examinarse para su adecuación para el uso en la
invención.
Anticuerpos que sólo se unen a la proteína
nativa de CD69, sólo a la desnaturalizada o proteína de cualquier
forma no nativa, o que se unen a ambas formas, están dentro de la
invención. Anticuerpos con epítopos lineales o conformacionales
están dentro de la invención. Epítopos conformacionales pueden a
veces ser identificados con anticuerpos que se unen a proteína de
CD69 nativa pero no a la forma desnaturalizada.
Como se describe abajo con más detalle, las
moléculas de anticuerpo (preferentemente, anticuerpos monoclonales
de distintos organismos, por ejemplo, roedores, ovejas, humanos),
contra CD69 pueden ser producidos usando métodos reconocidos en el
campo. Una vez que el anticuerpo se obtiene, puede ser examinado
para su adecuación para el uso en la invención, por ejemplo,
determinando si el anticuerpo se comporta como antagonista o
eliminador.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser
producidos por una variedad de técnicas, incluyendo metodología
convencional para la generación de anticuerpos monoclonales, por
ejemplo, la técnica de hibiridación celular somática estándar de
Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). Ver generalmente,
Harlow, E. and Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY. Aunque los procedimientos de hibridación celular
somática son preferidos, en principio, otras técnicas para producir
anticuerpos monoclonales pueden emplearse, por ejemplo,
transformación viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema
animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La
producción de hibridomas en ratón es un procedimiento bien
establecido. Los protocolos de inmunización y las técnicas para el
aislamiento de los esplenocitos inmunizados por fusión son
conocidos. Las parejas de fusión (por ejemplo, células de mieloma
murino) y los procedimientos de fusión son también conocidos.
Un anticuerpo puede obtenerse de un origen no
humano y las regiones variables, y en particular las CDRs, pueden
secuenciarse y usarse para hacer moléculas de anticuerpo, por
ejemplo, anticuerpos humanizados, útiles en la invención. La
localización de los CDRs y residuos estructurales debe determinarse
(ver, por ejemplo, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences
of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.
Department of Health and Human Services, NIH Publication No.
91-3242, y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol.
Biol. 196:901-917, que se incorporan aquí por
referencia).
Un anticuerpo o una cadena de inmunoglobulina
pueden ser humanizados por métodos conocidos. Una vez que se
obtienen los anticuerpos murinos, las regiones variables pueden
secuenciarse. La localización de los CDRs y los residuos
estructurales determinarse (ver Kabat, E.A., et al. (1991)
Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth
Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH
Publication No. 91-3242, y Chothia, C. et
al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, que se
incorporan aquí por referencia). Las regiones variables de las
cadenas pesadas y ligeras pueden, opcionalmente, ligarse a sus
regiones constantes correspondientes.
Los anticuerpos de ratón
anti-CD69 pueden ser secuenciados usando técnicas
conocidas.
Moléculas de anticuerpo o inmunoglobulinas
humanizadas o con el CDR insertado pueden ser producidas por
sustitución o inserción del CDR, donde uno, dos o todos los CDRs de
una cadena de inmunoglobulina pueden ser reemplazados. Ver, por
ejemplo, U.S. Patent 5,225,539; Jones et al. 1986
Nature 321:552-525; Verhoeyan et al.
1988 Science 239:1534; Beidler et al. 1988 J.
Immunol. 141:4053-4060; Winter US 5,225,539,
cuyos contenidos son aquí expresamente incorporados por
referencia.
Winter describe un método de inserción del CDR
que puede ser usado para preparar anticuerpos humanizados en la
presente invención (UK Patent Application GB 2188638A, presentada
en el 26 de Marzo de 1987; Winter US 5,225,539), cuyos contenidos
son expresamente incorporados por referencia. Todos los CDRs de un
anticuerpo humano particular pueden ser reemplazados por al menos
una porción de un CDR no humano o sólo algunos de los CDRs pueden
ser reemplazados con CDRs no humanos. Sólo es necesario reemplazar
el número de CDRs requerido para la unión del anticuerpo humanizado
al antígeno predeterminado.
Los anticuerpos humanizados pueden ser generados
por el reemplazamiento de las secuencias de la región variable Fv
que no están directamente implicadas en la unión de antígeno, con
secuencias equivalentes de las regiones variables Fv humanas.
Métodos generales para la generación de anticuerpos humanizados se
indican en Morrison, S. L., 1985, Science
229:1202-1207, por Oi et al., 1986,
BioTechniques 4:214, y por Queen et al. US 5,585,089,
US 5,693,761 y US 5,693,762, cuyos contenidos son incorporados aquí
por referencia). Estos métodos incluyen el aislamiento,
manipulación, y la expresión de secuencias de ácidos nucleicos que
codifican para todo o parte de las regiones variables Fv de las
inmunoglobulinas de al menos una cadena pesada o ligera. El origen
de tales ácidos nucleicos es conocido y, por ejemplo, puede
obtenerse de un hibridoma que produce un anticuerpo contra una
diana predeterminada, como se describe arriba. El DNA recombinante
que codifica para el anticuerpo humanido o un fragmento de él,
puede entonces ser clonado en un vector de expresión apropiado.
Los anticuerpos humanizados en los cuales se han
sustituido, destruido o añadido aminoácidos específicos, están así
dentro de esta invención. En particular, anticuerpos humanizados
preferidos tienen sustituciones de aminoácidos en la región
estructural, de manera que mejoran la unión al antígeno. Por
ejemplo, una serie de residuos estructurales aceptores
seleccionados de la cadena de inmunoglobulina humanizada pueden ser
reemplazados por los correspondientes aminoácidos donadores. Las
localizaciones preferidas de las sustituciones incluyen residuos de
aminoácidos adyacente al CDR, o que son capaces de interaccionar
con un CDR (ver, por ejemplo, US 5,585,089). Los criterios para
seleccionar aminoácidos del donante se describen en US 5,585,089,
por ejemplo, columnas 12-16 de US 5,585,089, cuyos
contenidos se incorporan aquí por referencia. La estructura
aceptora puede ser una secuencia o secuencia consenso de una
estructura de anticuerpo humano maduro. Como se usa aquí, el
término "secuencia consenso" se refiere a la secuencia formada
de la mayoría de los aminoácidos (o nucleótidos) más frecuentes que
se encuentran en una familia de secuencias relacionadas (ver, por
ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft,
Weinheim, Germany 1987). En una familia de proteínas, cada posición
de la secuencia consenso es ocupada por el aminoácido más frecuente
en dicha posición en la familia. Si dos aminoácidos se presentan
en dicha posición con igual frecuencia, cualquiera de ellos se
puede incluir en la secuencia consenso. Una "estructura
consenso" se refiere a la región estructural en la secuencia
consenso de la inmunoglobulina.
Otras técnicas para humanizar cadenas de
inmunoglobulinas, incluyendo anticuerpos, son descritas en
Padlan
et al. EP 519596 A1, publicado el 23 de diciembre de 1992.
et al. EP 519596 A1, publicado el 23 de diciembre de 1992.
La molécula de anticuerpo
anti-CD69 se puede modificar también de otra manera
para disminuir su inmunogenicidad, por ejemplo, por deleción
específica de los epítopos reconocidos por la célula T humana o
"deinmunización" por los métodos descritos en WO 98/52976 and
WO 00/34317, cuyos contenidos son específicamente incorporados aquí
por la referencia.
En algunos ejemplos, la molécula de anticuerpo
anti-CD69 incluye una región variable de cadena
pesada o ligera que tiene uno, dos, o preferiblemente, tres CDRs
sustancialmente idénticos al CDR de la región variable de una
cadena ligera o pesada anti-CD69 no humana,
respectivamente. En un ejemplo preferido, el anticuerpo modificado
o el fragmento de unión al antígeno de éste incluye todas las seis
CDRs del mismo anti-CD69 no humano, por ejemplo,
cualquier molécula de anticuerpo anti-CD69 humano
usada en la bibliografía, por ejemplo, el panel de moléculas de
anticuerpo anti-CD69 humano descrito en
[Sánchez-Mateos, 1991 #126].
La cadena ligera o pesada de las
inmunoglobulinas del anticuerpo modificado anti-CD69
o su fragmento de unión al antígeno pueden incluir además una
secuencia de la estructura variable de la cadena ligera o pesada,
procedente de la estructura variable de la cadena ligera o pesada
presente en un anticuerpo humano o no-humano, por
ejemplo, un roedor.
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos
contra proteínas humanas pueden ser generados usando ratones
transgénicos con los genes de la inmunoglobulina humana, más que en
el sistema de ratón. Tales ratones transgénicos pueden incluir
ratones que lleven una porción de los genes de la cadena pesada y
ligera de las inmunoglobulinas humanas. Por ejemplo, en el ratón
HuMAb®, de Medarex y GenMab, los genes de ratón para generar
anticuerpos están inactivados y reemplazados por muchas de las
secuencias clave para genes de anticuerpos humanos sin recombinar
que codifican para las cadenas pesada y ligera. Otro ratón
disponible es el XenoMouse®, de Abgenix, que tiene aproximadamente
el 80% de los genes de la cadena pesada de anticuerpo humana y una
cantidad significativa de los genes de la cadena ligera humana.
Otros ratones transgénicos están disponibles para generar
anticuerpos humanos que contengan regiones completas de los genes
constantes y variables encontrados en el correspondiente loci de la
inmunoglobulina natural humana. Estos ratones, también referidos
como ratones Kirin TC^{TM} son de Medarex. Los ratones Kirin
TC^{TM} son "transcromosómicos", que quiere decir que los
genes de ratón para crear anticuerpos se han inactivado y
reemplazado por los cromosomas humanos que contienen todos los genes
humanos para la generación de anticuerpos, incluyendo todas las
clases de cadenas pesadas que codifican para todos los isotipos
(IgG1-4, IgA1-2, IgD, IgM and IgE).
También de Medarex, es el ratón KM®, una cepa que resulta del cruce
de los ratones HuMAb y Kirin-TC, de manera que
combina sus características. El KM, como el ratón Kirin TC,
retiene la capacidad de producir toda clase de isotipos humanos.
Los esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados con el
antígeno de interés se usan para producir hibridomas que secretan
mAbs humanos con afinidades específicas para epítopos de una
proteína humana (ver, por ejemplo, Wood et al. International
Application WO 91/00906, Kucherlapati et al. PCT
publication WO 91/10741; Lonberg et al. International
Application WO 92/03918; Kay et al. International
Application 92/03917; Lonberg, N. et al. 1994 Nature
368:856-859; Green, L.L. et al. 1994
Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. et
al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year
Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. 1993
PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al. 1991
Eur J Immunol 21:1323-1326).
Los anticuerpos quiméricos, incluyendo las
cadenas de inmunoglobulinas quiméricas, pueden ser producidas por
técnicas de DNA recombinante conocidas. Por ejemplo, un gen que
codifica para la región constante Fc de una molécula de anticuerpo
monoclonal de un ratón (u otra especie) se digiere con una enzima
de restricción para quitar la región que codifica para el Fc de
ratón, y la porción equivalente del gen que codifica para la región
constante Fc humana es sustituida (ver Robinson et al.,
International Patent Publication PCT/US86/02269; Akira, et
al., European Patent Application 184,187; Taniguchi, M.,
European Patent Application 171,496; Morrison et al.,
European Patent Application 173,494; Neuberger et al.,
International Application WO 86/01533; Cabilly et al. U.S.
Patent No. 4,816,567; Cabilly et al., European Patent
Application 125,023; Setter et al. (1988 Science
240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS
84:3439-3443; Liu et al., 1987, J.
Immunol. 139:3521-3526; Sun et al.
(1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et
al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood
et al. (1985) Nature 314:446-449; and
Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst.
80:1553-1559).
También dentro del término se incluyen especies
generadas in vitro, donde todo o parte de las CDRs, se
generan por una selección no inmune, por ejemplo, una muestra de
fagos in vitro, chip de proteína, o cualquier otro método en
el que las secuencias candidatas puedan ser medidas en su
capacidad para unir el antígeno. Por ejemplo, los métodos de
visualización combinatoria de anticuerpos, se han desarrollado para
identificar y aislar fragmentos de anticuerpo que tienen una
especificidad particular por un antígeno, y pueden ser usados para
producir una molécula de anticuerpo.
Una vez mostrados en un sistema de visualización
(por ejemplo, un fago filamentoso), la librería de anticuerpos es
escrutada con el antígeno, o un fragmento peptídico de éste, para
identificar y aislar los grupos que expresen un anticuerpo con
especificidad por este antígeno. El ácido nucleico que codifica
para este anticuerpo seleccionado puede ser recuperado del sistema
de visualización (por ejemplo, del genoma del fago) y subclonado en
otros vectores de expresión por técnicas estándar de DNA
recombinante.
Anticuerpos específicos con altas afinidades por
una proteína de superficie se pueden generar de acuerdo con métodos
conocidos, por ejemplo, métodos que impliquen la búsqueda en
librerías (Ladner, R.C., et al., U.S. Patent 5,233,409;
Ladner, R.C., et al., U.S. Patent 5,403,484). Además, los
métodos de estas librerías pueden ser usados en búsquedas para
obtener determinantes de unión que son miméticos a los
determinantes estructurales de los anticuerpos.
Una región de unión al antígeno puede obtenerse
también por búsqueda en varios tipos de librerías combinatorias con
una actividad de unión deseada, y para identificar las especies
activas, por métodos que se han descrito.
En un ejemplo, una librería de péptidos
diferentes se expresa por una población de grupos de visualización
para formar una librería de visualización de péptidos. Idealmente,
los grupos de visualización comprenden un sistema que permite el
muestreo de gran cantidad de librerías de péptidos distintos, una
separación rápida tras cada ronda de separación por afinidad, y un
fácil aislamiento del gen que codifica para el péptido de los
grupos purificados. Las librerías de análisis de péptidos pueden
ser en por ejemplo, organismos procariotas o virus, que pueden
amplificarse rápidamente, son relativamente fáciles de manipular, y
pueden permitir la creación de un gran número de clones. Grupos de
visualización preferidos incluyen, por ejemplo, bacterias
vegetativas, esporas bacterianas, y, preferiblemente, virus
bacterianos (especialmente virus de DNA). Sin embargo, la presente
invención contempla también el uso de células eucarióticas,
incluyendo levaduras y sus esporas, como grupos de visualización
potenciales.
Las moléculas de anticuerpo
anti-CD69 útiles en la presente invención pueden
ser anticuerpos recombinantes producidos en las células
hospedonadoras transformadas, por ejemplo, con DNA codificante para
las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo deseado. Las
moléculas de anticuerpo recombinante pueden producirse por técnicas
conocidas de ingeniería molecular. Por ejemplo, anticuerpos
recombinantes se pueden producir clonando una secuencia de
nucleótidos, por ejemplo, una secuencia de cDNA o DNA genómico, que
codifique para las cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulina
del anticuerpo deseado de una célula de hibridoma que produce un
anticuerpo útil en esta invención. La secuencia de nucleótido que
codifica para estos polipéptidos es entonces insertada en vectores
de expresión, de manera que ambos genes son unidos operativamente
a sus propias secuencias de control transcripcional y traduccional.
El vector de expresión y las secuencias control de expresión son
elegidas por ser compatibles con la célula huésped usada.
Típicamente, ambos genes son insertados en el mismo vector de
expresión. Pueden usarse células huésped procarióticas o
eucarióticas.
La expresión en células huésped eucarióticas se
prefiere porque tales células son más adecuadas que las
procarióticas para el adecuado ensamblaje y secreción de un
anticuerpo correctamente plegado e inmunológicamente activo. Sin
embargo, cualquier anticuerpo producido que sea inactivo debido a
un inadecuado plegamiento puede ser renaturalizado de acuerdo a
métodos conocidos (Kim and Baldwin, "Specific Intermediates in the
Folding Reactions of Small Proteins and the Mechanism of Protein
Folding", Ann. Rev. Biochem. 51, pp.
459-89 (1982)). Es posible que las células huésped
produzcan porciones de anticuerpos intactos, tales como dímeros de
cadenas ligeras o pesadas, que son también homólogos de
anticuerpos, de acuerdo a la presente invención.
Se entenderá que las variaciones en el
procedimiento indicado arriba son útiles en la presente invención.
Por ejemplo, se puede desear transformar una célula huésped con DNA
que codifique para ó la cadena ligera ó la pesada (pero no ambas)
de un anticuerpo. La tecnología recombinante del DNA puede también
utilizarse para quitar algo o todo el DNA que codifique para cada
una o ambas cadenas pesada y ligera, que no son necesarias para la
unión de CD69, por ejemplo, la región constante puede ser
modificada por, por ejemplo, la eliminación de aminoácidos
específicos. Las moléculas expresadas de tales moléculas de DNA
truncadas son útiles en los métodos de esta invención. Además,
pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena
pesada y una ligera son anticuerpos anti-CD69 y
otra cadena pesada y ligera sean específicos para un antígeno
distinto de CD69 u otro epítopo de CD69.
Las moléculas de anticuerpo de la invención
pueden conjugarse, de manera covalente o no covalente, con otras
estructuras, por ejemplo, agentes terapéuticos o señales, por
ejemplo, toxinas (por ejemplo, proteínas, (por ejemplo, difteria o
ricina) o toxinas químicas), isótopos terapéuticos, u otras
estructuras terapéuticas.
De acuerdo con esto, una molécula de anticuerpo
anti-CD69 puede ser derivatizada o unida a otra
molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Los
anticuerpos y las porciones de anticuerpo de la invención incluyen
formas derivatizadas o modificadas de cualquier forma de los
anticuerpos aquí descritos, incluyendo las moléculas de
inmunoadhesión. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo
de la invención pueden ser unidos funcionalmente (por unión
química, fusión genética, asociación no covalente o de otra forma)
a una o más entidades moleculares, tales como otro anticuerpo, (por
ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente
detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una
proteína o péptido que puedan mediar la asociación de un anticuerpo
o una porción de anticuerpo con otra molécula (tal como la región
principal de la estreptavidina o una cola de
polihistidina).
polihistidina).
Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce
por entrecruzamiento de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de
diferentes tipos, por ejemplo, para crear anticuerpos
biespecíficos).
Agentes entrecruzantes adecuados son aquellos
que son heterobifuncionales, teniendo dos grupos reactivos
distintos separados por un espaciador apropiado (por ejemplo,
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida
ester) u homobifuncionales (por ejemplo, disuccinimidil suberato).
Tales enlaces están disponibles por Pierce Chemical Company,
Rockford, IL.
Agentes detectables útiles con los que un
anticuerpo o porción del mismo de la invención pueden ser
derivatizados (o marcados) para incluir componentes fluorescentes,
varias enzimas, grupos prostéticos, materiales luminiscentes o
bioluminiscentes, átomos de metal con emisión de fluorescencia, por
ejemplo, europio (Eu), y otros lantánidos, y materiales
radiactivos (descritos abajo). Ejemplos de agentes detectables por
fluorescencia incluyen la fluoresceína, isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, cloruro de
5-dimetilamina-1-naftalenesulfonilo,
ficoeritrina, y otros del mismo tipo. Un anticuerpo puede ser
también derivatizado con enzimas detectables, tales como la
fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano, la -galactosidasa, la
acetil-colin-esterasa, la glucosa
oxidasa y otras del mismo tipo. Cuando un anticuerpo se derivatiza
con una enzima detectable, se detecta por la adición de reactivos
que la enzima usa como sustratos para generar un producto de
reacción detectable. Por ejemplo, cuando el agente detectable de la
peroxidasa de rábano está presente, la adición de peróxido de
hidrógeno y diaminobenzidina lleva a un producto de reacción
coloreado que es detectable. Un anticuerpo puede ser también
derivatizado con un grupo prostético (por ejemplo,
estreptavidina/biotina y avidina/biotina). Por ejemplo, un
anticuerpo puede ser derivatizado con biotina y detectado a través
de la medida indirecta de la unión de la avidina o la
estreptavidina. Ejemplos de materiales de adecuada fluorescencia
incluyen la umbeliferona, la fluoresceína, el isotiocianato de
fluoresceína, la rodamina, la diclorotriazinilamina fluoresceína,
el cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material
luminiscente es el luminol; y ejemplos de materiales
bioluminiscentes son la luciferasa, luciferina y aecuorina. Un
anticuerpo anti-CD69 o un fragmento de él que se
una al antígeno puede ser conjugado a otra entidad molecular,
típicamente una marca o un agente o estructura terapéutica (por
ejemplo, citotóxica o citostática).
Una citotoxina o agente citotóxico incluye
cualquier agente que es destructivo para las células con que
interacciona. Ejemplos son el taxol, la citocalasina B, la
gramicidina D, el bromuro de etidio, la emetina, la mitomicina, el
etopóxido, el tenopóxido, la vincristina, la vinblastina, la
colchicina, la doxorubicina, la daunorubicina, la
dihidroxi-antracin-diona, la
mitoxantrona, la mitramicina, la actinomicina D, la
1-dehidrotestosterona, los glucocorticoides, la
procaína, la tetracaína, la lidocaína, el propanolol, la
puromicina, los maitansinoides, por ejemplo, maitansinol (ver US
Patent No. 5,208,020), CC-1065 (ver US Patent Nos.
5,475,092, 5,585,499, 5,846,545) y análogos u homólogos de estos.
Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a,
antimetabolitos, (por ejemplo, metotrexato,
6-mercaptopurina, 6-tioguanina,
citarabina, 5-fluorouracil decarbacina), agentes
alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo,
CC-1065, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina
(CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptotocina,
mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II)
(DDP) cisplatino); antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (antes
daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (por ejemplo,
dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina, y
antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (por
ejemplo, vincristina, vinblastina, taxol y maitansinoides).
Un anticuerpo anti-CD69 o un
fragmento de unión al antígeno de éste puede conjugarse a otra
entidad molecular, por ejemplo, una estructura que module la
inmunogenicidad y/o la vida media. En un ejemplo, la entidad
molecular es polietilen glicol (PEG) o derivados de éste. La
PEGilación es un método de conjugación química que puede reducir la
inmunogenicidad potencial y/o extender la vida media. Varios
métodos de PEGilación de un anticuerpo se conocen. Ver, por
ejemplo, Bhandra et al. (2002) Pharmazie
57(1):5-29.
Se define un reactivo de unión a CD69 como un
agente que interacciona (se une) con CD69, preferiblemente de origen
humano. La interacción ocurre preferentemente con alta afinidad
(con una constante de unión de al menos 10^{7} M^{-1},
preferiblemente entre 10^{8} y 10^{10} M^{-1}) y
especificidad. Los reactivos de unión a CD69 pueden ser
antagonistas o eliminadores (deplecionantes). Como ejemplos de
reactivos de unión a CD69 se pueden citar anticuerpos contra CD69
(como los reseñados anteriormente), así como moléculas de pequeño
tamaño molecular o peptidomiméticos.
En esta invención se incluyen agentes miméticos
de CD69, de gran utilidad. Estos agentes, entre los que se incluyen
péptidos, compuestos semipeptídicos o no peptídicos (como moléculas
orgánicas de pequeño tamaño molecular), son inhibidores de la
actividad CD69.
En una encarnación óptima, el agente es parte de
una librería combinatorial, por ejemplo una colección de péptidos o
moléculas orgánicas, o parte de una librería de productos
naturales. En estas circunstancias, un grupo de compuestos de test
puede incluir 10, 10^{2}, 10^{3}, 10^{4}, 10^{5}, 10^{6},
10^{7} o 10^{8} compuestos, que comparten características
estructurales o funcionales.
En su forma actual, esta invención incluye
librerías de agentes de unión a CD69. La génesis de librerías
combinatoriales está bien caracterizada en la literatura y se ha
revisado exhaustivamente (por ejemplo, ver: E.M. Gordon et
al., J. Med. Chem. (1994) 37:1385-1401;
DeWitt, S. H.; Czarnik, A. W. Acc. Chem. Res. (1996) 29:114;
Armstrong, R. W.; Combs, A. P.; Tempest, P. A.; Brown, S.
D.; Keating, T. A. Acc. Chem. Res. (1996) 29:123; Ellman, J.
A. Acc. Chem. Res. (1996) 29:132; Gordon, E. M.; Gallop, M.
A.; Patel, D. V. Acc. Chem. Res. (1996) 29:144; Lowe, G.
Chem. Soc. Rev. (1995) 309, Blondelle et al.
Trends Anal. Chem. (1995) 14:83; Chen et al. J.
Am. Chem. Soc. (1994) 116:2661; Patentes U.S. 5,359,115,
5,362,899, y 5,288,514; PCT Publication No. WO92/10092, WO93/09668,
WO91/07087, WO93/20242, WO94/08051).
Las librerías de compuestos de esta invención
pueden prepararse de acuerdo a diferentes métodos, algunos de los
cuales han sido previamente caracterizados. Por ejemplo, una
estrategia denominada de división puede implementarse de la
siguiente manera: se colocan microsferas de sustrato polimérico
funcionalizado en diferentes recipientes de reacción; existe una
gran variedad de sustratos poliméricos adecuados para la síntesis
peptídica en fase sólida, y algunos están disponibles comercialmente
(como ejemplos, ver M. Bodansky "Principies of Peptide
Synthesis", 2ª edición (1993), Springer-Verlag,
Berlin). Se añade a cada alícuota de microsferas una solución
conteniendo un aminoácido activado, y las reacciones se llevan a
cabo, resultando en una serie de aminoácidos inmovilizados, cada
uno en un recipiente de reacción. Las alícuotas de microsferas
derivatizadas se lavan y se reúnen ("recombinación"), y este
conjunto se divide nuevamente, colocando cada alícuota en un nuevo
recipiente de reacción, añadiéndose un nuevo aminoácido activado a
cada alícuota. Este ciclo se repite hasta que se consiguen péptidos
de la longitud deseada. Los aminoácidos añadidos en cada ciclo se
seleccionan aleatoriamente, o bien se pueden seleccionar para
obtener una librería "dirigida", es decir, en la que ciertas
partes del inhibidor se seleccionan por un método no aleatorio, por
ejemplo, para seleccionar inhibidores con homología o similitud
estructural con un péptido conocido capaz de interaccionar con un
anticuerpo, como por ejemplo el sitio de unión de antígeno de
anticuerpos anti-idiotípicos. Así se puede obtener
una amplia variedad de compuestos peptídicos, peptidomiméticos no
peptídicos.
Esta estrategia de división produce una librería
de péptidos, algunos de ellos inhibidores, que pueden utilizarse
para preparar una librería de compuestos de ensayo de la invención.
En otro ejemplo ilustrativo, se genera una librería de diversómeros
de acuerdo con el método de Hobbs DeWitt et al. (Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A 90:6909 (1993)). Otros métodos de
síntesis, como el de la "bolsita de té" de Houghten (ver
Houghten et al., Nature 354:84-86
(1991) pueden emplearse para generar librerías de compuestos de la
invención sujeto.
Posteriormente se pueden realizar
screenings (barridos), para determinar qué miembros de la
librería poseen una actividad deseable, y si así es, identificar
el principio activo. Se han descrito métodos de análisis
combinatorial de screening de librerías (ver Gordon et
al., J Med. Chem., supra). Las librerías de compuestos
solubles se pueden identificar por cromatografía de afinidad con un
receptor apropiado para aislar ligandos para el receptor, seguida
por la identificación de los ligandos aislados por técnicas
convencionales, como espectrometría de masas, RMN y similares. Los
compuestos inmovilizados pueden identificarse poniéndolos en
contacto con un receptor soluble, preferiblemente acoplado a un
marcador (fluoróforos, enzimas colorimétricas, radioisótopos,
compuestos luminiscentes y similares) que pueden ser detectados
indicando unión al ligando. Alternativamente, los compuestos
inmovilizados pueden ser liberados selectivamente, permitiéndose su
difusión a través de una membrana para interaccionar con un
receptor. Se describen ejemplos representativos para el
screening de las librerías de la invención.
Así, se puede probar la interacción de los
compuestos de esta invención con el polipéptido CD69 ensayando la
capacidad de cada compuesto para interaccionar con el mismo, por
ejemplo, incubando el compuesto investigado con CD69 y un lisado en
un recipiente de reacción adecuado, como una placa estándar de 96
pocillos. En esta situación, la actividad de cada compuesto
individual puede ser determinada, empleándose como control un
pocillo o pocillos sin el compuesto ensayado. Tras la incubación, la
actividad de cada compuesto puede determinarse en cada pocillo. Por
tanto, pueden determinarse las actividades de una pluralidad de
compuestos en paralelo.
Así se puede determinar simultáneamente la unión
de grandes cantidades de compuestos diferentes. Por ejemplo, los
compuestos se pueden sintetizar en microsferas de resina sólida
siguiendo un patrón "una microsfera-un
compuesto"; los compuestos se pueden inmovilizar en la resina a
través de un puente fotolábil. Posteriormente, las esferas (100,000
o más) pueden combinarse en células de levadura y pulverizadas en
forma de "nano-gotas", de tal manera que cada
gota incluya una única esfera (y por lo tanto un compuesto). La
exposición de las nano-gotas a la luz UV resulta en
la liberación de los compuestos de las gotas, lo que resulta en un
método que permite el screening rápido de librerías de gran
tamaño.
Las librerías combinatoriales de compuestos
pueden sintetizarse con "etiquetas" que codifican la identidad
de cada miembro de la librería (ver W.C. Still et al.,
Patentes U.S. No. 5,565,324 and Publicación PCT No. WO 94/08051 y WO
95/28640). En general, este método incluye el uso de marcadores
inertes, pero fácilmente detectables, que se unen al soporte sólido
o a los compuestos. Cuando se encuentra un compuesto activo (por
una de las técnicas descritas anteriormente), la identidad de dicho
compuesto se determina por la identificación de la etiqueta que le
acompaña. Este método de marcaje permite la síntesis de grandes
librerías de compuestos que pueden identificarse incluso a niveles
muy bajos. Tal esquema de marcaje puede ser útil (por ejemplo, en
el sistema de screening de "nano-gota"),
para identificar compuestos liberados de las microsferas.
Las librerías de compuestos han de contener al
menos 30 compuestos, y es preferible que contengan de 100 a 500,
aunque no deben exceder de 10^{7}-10^{9}.
Esta invención proporciona métodos (también
referidos como ensayos de screening) para identificar
moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos (por
ejemplo, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, peptoides,
moléculas de pequeño tamaño molecular u otras drogas) que se unen a
la proteína CD69 o a los ácidos nucleicos codificantes para la
misma y tienen un efecto estimulador o inhibidor en, por ejemplo,
la expresión o la actividad de CD69. Los compuestos identificados
de esta forma pueden usarse para modular la actividad de los
productos génicos diana (genes de CD69) en un protocolo
terapéutico, para elaborar su función biológica o para identificar
compuestos que bloqueen las interacciones normales del gen
diana.
Así, esta invención incluye ensayos para
identificar compuestos candidatos que sean sustratos de la proteína
o polipéptido CD69, o una porción biológicamente activa de la
misma. Por otra parte, esta invención incluye ensayos para el
screening de compuestos candidatos o que puedan unirse o
modular una actividad de la proteína o polipéptido CD69, o una
porción biológicamente activa de la misma, por ejemplo, moduladores
de la señalización por CD69.
Se pueden utilizar ensayos de actividad de la
proteína CD69 en la presencia de inhibidores para determinar la
naturaleza de la actividad señalizadora. El ensayo puede incluir
controles adicionales y pasos para asegurar que la actividad
observada proviene del polipéptido CD69, por ejemplo, muestras
control, como muestras producidas a partir de células transformadas
con un vector control en vez de un vector que sobreexpre el DNA de
CD69. La actividad puede también observarse en fracciones
cromatográficas para determinar, por ejemplo, si la actividad
observada y el polipéptido CD69 copurifican. Se han descrito
ensayos y condiciones adicionales, ver Yamaoka et al. (1998)
J Biol Chem 273:11895-11901, y
Thien-Khai et al. (1997) J Biol Chem
272:31315-31320.
Los compuestos ensayados en la presente
invención pueden obtenerse empleando cualquiera de los numerosos
métodos de obtención de librerías combinatoriales descritos en la
literatura, incluyendo: librerías biológicas; librerías de
peptoides (librerías de moléculas que tienen funcionalidad
peptídica, pero con un esqueleto no peptídico que es resistente a
la degradación enzimática pero que, no obstante, permanece
bioactivo; ver Zuckermann, R.N. et al. (1994) J. Med.
Chem. 37:2678-85); librerías de fase sólida o en
solución manipulables espacialmente de forma paralela; librerías
sintéticas que requieren convolución; el método
"una-esfera un-compuesto"; y
librerías sintéticas empleando selección por cromatografía de
afinidad. Las aproximaciones biológicas y de peptoides están
limitadas a librerías peptídicas, mientras que las otras cuatro
aproximaciones se pueden aplicar a librerías de péptidos, de
oligómeros no peptídicos o de moléculas de pequeño tamaño molecular
(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).
Se pueden encontrar ejemplos de métodos para la
génesis de librerías moleculares en la literatura, por ejemplo en:
DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem.
37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell
et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell
et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; y
Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233.
Las librerías de compuestos se pueden presentar
en solución (ver Houghten (1992) Biotechniques
13:412-421), o en microsferas (Lam (1991)
Nature 354:82-84), biochips (Fodor (1993)
Nature 364:555-556), bacterias (Ladner,
Patentes U.S. No. 5,223,409), esporas (Ladner Patentes U.S. No.
5,223,409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad
Sci USA 89:1865-1869) o en fagos (Scott and
Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin
(1990) Science 249:404-406; Cwirla et
al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.
87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol.
222:301-310; Ladner supra.).
Se define un ensayo como aquella prueba basada
en células en la que una célula que expresa la proteína CD69 o una
porción biológicamente activa de la misma se pone en contacto con
un compuesto y se determina la capacidad del mismo para modular la
actividad de CD69. La determinación de la capacidad del compuesto
ensayado para modular la actividad de CD69 se puede realizar
monitorizando, por ejemplo, la percepción de estímulos ambientales,
como por ejemplo, un ligando de CD69, o de mensajeros biológicos,
como el TGF-\beta. La célula puede ser de
mamífero, por ejemplo, humana.
También se puede evaluar la capacidad del
compuesto para modular la unión de CD69 al mismo o a otro
compuesto, por ejemplo, un sustrato de CD69. Esto puede conseguirse
acoplando el compuesto a un radioisótopo (por ejemplo, sustrato) o
un "marcaje" enzimático, de tal forma que la unión del
compuesto a CD69 puede detectarse a través del marcaje, en un
complejo. Alternativamente, CD69 puede acoplarse a un radioisótopo
o "etiqueta" enzimática para monitorizar la capacidad de un
compuesto para modular la unión de CD69 a un sustrato de CD69 en un
complejo. Por ejemplo, los compuestos (pueden ser sustratos de
CD69) pueden marcarse con ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C ó ^{3}H,
tanto directa como indirectamente, y detectarse el radioisótopo por
contaje directo de radioemisión o por contaje de centelleo.
Alternativamente, los compuestos pueden marcarse enzimáticamente
con, por ejemplo, peroxidasa, fosfatasa alcalina o luciferasa,
detectando el marcaje enzimático mediante la determinación de la
conversión de un sustrato apropiado a producto.
La capacidad de un compuesto (por ejemplo, un
sustrato de CD69) de interaccionar con CD69, con o sin el marcaje
de cualquiera de los interactuantes también puede evaluarse. Por
ejemplo, se puede emplear un microfisiómetro para detectar la
interacción de un compuesto con CD69 sin el marcaje de ninguna de
las partes (McConnell, H. M. et al. (1992) Science
257:1906-1912). Empleado en este contexto, un
microfisiómetro (por ejemplo, Cytosensor) es un instrumento
analítico que mide la velocidad con la que la célula acidifica su
entorno empleando un sensor potenciométrico estimulado por la luz
(light-addresable potentiometric sensor,
LAPS). Los cambios en esta velocidad de acidificación se pueden
emplear como indicación de la interacción entre un compuesto y
CD69.
También se incluye un ensayo en el que no se
emplean células en el que la proteína CD69 o una porción
biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un
compuesto, evaluándose su capacidad de unión a la misma. En estos
ensayos, las porciones biológicamente activas de la proteína CD69
empleadas preferentemente incluyen fragmentos que participan en
interacciones con moléculas diferentes de CD69, por ejemplo,
fragmentos con altas probabilidades de superficie.
Las formas solubles o asociadas a la membrana de
proteínas aisladas (CD69 o porciones biológicamente activas de la
misma) pueden ser empleadas en los ensayos libres de células
incluidos en esta invención. Cuando se empleen formas asociadas a
la membrana de la proteína, es aconsejable emplear un agente
solubilizador, como detergentes no iónicos como
n-octilglucósido n-dodecilglucósido,
n-dodecilmaltósido,
octanoil-N-metilglucamida,
decanoil-N-metilglucamida, Triton®
X-100, Triton® X-114, Thesit®,
Isotridecipoli(éter de etilenglicol)n, sulfonato de
3-[(3-colamidopropil)dimetilamminio]-1-propano
(CHAPS), sulfonato de
3-[(3-colamidopropil)dimetilamminio]-2-hidroxi-1-propano
(CHAPSO), o sulfonato de
N-dodecil=N,N-dimetil-3-ammonio-l-propano.
Los ensayos sin células implican la preparación
de una mezcla de reacción con la proteína diana y el compuesto
ensayado en condiciones tales y durante el tiempo suficiente para
permitir la interacción y unión de los dos componentes, formando un
complejo que puede ser eliminado y/o detectado.
También se puede detectar la interacción entre
dos moléculas empleando técnicas como la transferencia de energía
fluorescente (Fluorescence Energy Transfer, FET) (ver, por ejemplo,
Lakowicz et al., Patentes U.S. No. 5,631,169;
Stavrianopoulos, et al., Patentes U.S. No. 4,868,103). Se
selecciona un marcaje fluorescente en la primera molécula
(donadora), de tal forma que la energía fluorescente emitida por la
marca será absorbida por un segundo marcador fluorescente presente
en la segunda molécula (aceptara), que emite a su vez fluorescencia
al excitarse mediante la energía absorbida. Alternativamente, la
proteína donadora puede simplemente utilizar la energía fluorescente
natural de los residuos de triptófano. Se escogen marcadores
fluorescentes de distinta longitud de onda de emisión, de tal forma
que la emisión del donador pueda ser identificada inequívocamente
de la del aceptor. Dado que la eficiencia de la transferencia de
energía fluorescente depende de la distancia que separa a las
moléculas, la relación espacial entre las mismas puede evaluarse. En
una situación en la que se produzca unión entre las moléculas, la
emisión fluorescente del aceptor ha de ser máxima. Así, la FET
debida a la unión de dos moléculas puede ser medida a través de
técnicas de detección de fluorescencia estándar (como un
fluorímetro).
La detección de la unión de CD69 a una molécula
diana puede realizarse también empleando análisis de interacciones
biomoleculares (Biomolecular Interaction Analysis, BIA) (ver
Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem.
63:2338-2345 and Szabo et al. (1995)
Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). La
resonancia de superficie de plasmón (surface plasmon resonance,
SPR) o "BIA" detecta interacciones bioespecíficas en
tiempo real, sin marcaje de ninguna de las moléculas participantes
(por ejemplo, BIAcore). Los cambios en la masa de la superficie de
interacción (indicación de una interacción) causan alteraciones en
el índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el
fenómeno de SRP), lo que resulta en una señal detectable que puede
emplearse como indicador de una reacción en tiempo real entre
moléculas biológicas.
Por otra parte, el producto génico diana o el
compuesto investigado se puede anclar en una fase sólida, y puede
detectarse al final de la reacción. Preferiblemente, se ancla el
producto génico diana y el compuesto investigado (que no está
inmovilizado) se puede marcar, bien directa bien indirectamente con
marcadores detectables como los que se han descrito
previamente.
Puede ser de interés el inmovilizar la proteína
CD69, un anticuerpo contra CD69 o su molécula diana para facilitar
la separación de formas complejadas de no complejadas de una o
ambas proteínas, así como para facilitar la automatización del
ensayo. La unión de los compuestos ensayados a CD69, o la unión de
esta con una molécula diana en la presencia o ausencia del
compuesto ensayado puede realizarse en cualquier recipiente
adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de tales recipientes
incluyen placas multipocillo, tubos de ensayo o de microcentrífuga.
En una encarnación de estos ejemplos, se puede emplear una proteína
de fusión que permite la unión de la molécula a una matriz. Por
ejemplo, se pueden adsorber proteínas de fusión del tipo
glutation-S-transferasa/CD69 o
glutation-S-transferasa/proteína
diana a microsferas de sefarosa con glutation (Sigma Chemical, St.
Louis, MO), o a placas multipocillo derivatizadas con glutation,
que se combinan con el compuesto investigado o CD69 y la proteína
diana no adsorbida o CD69, incubándose dicha mezcla en condiciones
favorables para la formación de complejos (incluyendo condiciones
fisiológicas de fuerza iónica y pH). Después de la incubación, la
matriz se lava para eliminar componentes no ligados y la formación
de complejos se determina directa o indirectamente como se ha
descrito anteriormente, o bien los complejos pueden disociarse de
la matriz y el nivel de unión o actividad de CD69 se puede
determinar por técnicas convencionales.
Otras técnicas para inmovilizar CD69 o una
molécula diana en matrices incluye la conjugación de biotina y
estreptavidina. La proteína CD69 biotinilada u otras moléculas
diana pueden prepararse a partir de biotina-NHS
(N-hidroxi-succinimida) empleando
técnicas descritas en la literatura (por ejemplo, kit de
biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizadas en
placas de 96 pocillos recubierta con estreptavidina.
Para realizar este ensayo, el componente no
inmovilizado se añade sobre la superficie que se ha recubierto con
el componente anclado. Tras acabar la reacción, se eliminan los
componentes en exceso (lavado), en condiciones en las que se
garantiza el mantenimiento de los complejos inmovilizados. La
detección de los mismos se puede realizar de diferentes maneras:
cuando el componente no inmovilizado está previamente marcado, la
detección del marcaje anclado en la superficie indica la formación
de complejos. Cuando el componente no inmovilizado no está marcado,
se puede utilizar un marcaje indirecto para detectar complejos
inmovilizados, por ejemplo, empleando un anticuerpo marcado
específico del componente inmovilizado (el anticuerpo, a su vez,
puede estar marcado directa o indirectamente, en este último caso,
empleando un anticuerpo anti-Ig marcado).
Este ensayo se realiza empleando anticuerpos
reactivos contra la proteína CD69 o una molécula diana, pero que no
interfieren con la unión de CD69 a su molécula diana. Tales
anticuerpos pueden derivatizarse en pocillos, y la diana no ligada,
o bien CD69, puede ser capturado en los pocillos por conjugación
con anticuerpos. Como métodos para detectar estos complejos, se
pueden citar la inmunodetección de complejos, empleando anticuerpos
reactivos contra CD69, o la molécula diana, así como ensayos
enzimáticos basados en la detección de una actividad enzimática
asociada con CD69 o su diana.
Alternativamente, los ensayos sin células pueden
realizarse en fase líquida. En tales ensayos, los productos de
reacción se separan de los compuestos no reactivos por técnicas
convencionales que incluyen: centrifugación diferencial (ver Rivas,
G., y Minton, A.P., (1993) Trends Biochem Sci
18:284-7); cromatografía (de exclusión molecular,
de intercambio iónico); electroforesis (ver Ausubel, F. et
al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999,
J. Wiley: New York.); e inmunoprecipitación (ver Ausubel, F. et
al., eds. (1999) Current Protocols in Molecular Biology,
J. Wiley: New York). Tales técnicas son habituales en cualquier
laboratorio (Heegaard, N.H., (1998) J Mol Recognit
11:141-8; Hage, D.S., y Tweed, S.A. (1997) J
Chromatogr B Biomed Sci Appl. 699:499-525).
También puede utilizarse FET para detectar unión sin purificar los
complejos.
Preferentemente, este ensayo incluye el contacto
de la molécula CD69 o una parte biológicamente activa de la misma
con un compuesto conocido que se une a CD69 formando un complejo, y
añadiendo un segundo compuesto del que se determina su capacidad
para unirse, preferentemente, a CD69 o a una parte biológicamente
activa de la misma, o bien se mide su actividad moduladora de la
actividad de una molécula diana, empleándose como referencia un
compuesto conocido.
Los productos génicos diana de esta invención
pueden, in vivo, interaccionar con una o más macromoléculas
celulares o extracelulares, como proteínas, que, a efectos de
discusión, se denominarán "ligandos". Aquellos compuestos que
bloquean estas interacciones pueden ser útiles en la regulación de
la actividad de los productos génicos diana. Tales compuestos
incluyen, pero no están limitados a: moléculas como anticuerpos,
péptidos y moléculas de pequeño tamaño molecular. Los productos
génicos diana de preferencia son los genes de CD69 identificados
aquí. Un aspecto alternativo de esta invención incluye métodos para
determinar la capacidad del compuesto estudiado de modular la
actividad de la proteína CD69 a través de la modulación de una
molécula activada por la misma, por ejemplo, la actividad de una
molécula efectora sobre una molécula diana, o la unión de un
efector a una diana apropiada. El ensayo de referencia en este caso
es la determinación de la actividad TGF-\beta.
Para identificar compuestos que interfieren con
la interacción entre los productos génicos diana y sus ligandos
celulares o extracelulares, se prepara una mezcla de reacción
conteniendo el producto génico diana y su ligando, en condiciones
adecuadas y durante tiempo suficiente para la formación de
complejos. Para ensayar un agente inhibidor, la mezcla de reacción
se incuba en presencia o ausencia del mismo, pudiendo estar
presente en la mezcla de reacción desde el primer momento o
añadirse un tiempo después de la incubación del gen diana y su
ligando celular o extracelular. Las mezclas de reacción control se
incuban en ausencia del compuesto o con un placebo. Se detecta
entonces la formación de complejos entre el gen diana y el ligando.
La formación de complejos en la reacción control pero no en el
caso en que la reacción incluye el compuesto ensayado indica que el
compuesto interfiere con la interacción del gen diana y el ligando.
Además, se puede comparar la formación de complejos en la mezcla
de reacción que contiene el compuesto ensayado y el producto normal
del gen diana con la formación de complejos en la mezcla de
reacción que contiene el compuesto ensayado y productos mutantes
del gen diana, lo que es importante en aquellos casos en los que es
deseable identificar los compuestos que interrumpen las
interacciones de los genes diana mutantes pero no los normales.
Estos ensayos se pueden realizar en formatos
homogéneos o heterogéneos, que incluyen el anclaje de bien el gen
diana o bien el ligando a una fase sólida, y la detección de los
complejos anclados en fase sólida al final de la reacción. En
ensayos homogéneos, la reacción se realiza en fase líquida al
completo. Tanto en una como en otra situación, el orden de adición
de los reactivos se puede variar para obtener diferente
información sobre los complejos objetivo del ensayo. Por ejemplo,
los compuestos ensayados que interfieren con la interacción entre
los productos diana y sus ligandos, por ejemplo por competición,
pueden identificarse realizando la reacción en presencia de las
sustancias ensayadas. Alternativamente, los compuestos ensayados que
deshacen los complejos preformados, por ejemplo, compuestos con
altas constantes de unión que desplazan a uno de los componentes
del complejo, pueden ensayarse añadiendo el compuesto ensayado a la
mezcla de reacción después de que los complejos se hayan formado.
Los formatos de ensayo se describen brevemente a continuación.
En un sistema de ensayo heterogéneo, o bien el
producto génico diana, o bien el ligando celular o extracelular se
ancla en una fase sólida (por ejemplo, placas de titulación),
mientras que el reactivo no anclado se marca directa o
indirectamente. El reactivo anclado puede inmovilizarse mediante
uniones covalentes o no covalentes. Alternativamente, se puede
emplear un anticuerpo específico para el reactivo, que actúe de
puente entre el sustrato y el reactivo para su unión a la fase
sólida.
Para realizar el ensayo, el ligando del reactivo
inmovilizado se aplica sobre la superficie de reacción en presencia
o ausencia del compuesto ensayado. Tras la finalización de la
reacción, se lavan los reactivos que no han reaccionado en
condiciones tales que los complejos formados permanezcan
inmovilizados sobre la superficie. Cuando el reactivo no
inmovilizado está marcado previamente, la detección del marcaje
inmovilizado en la superficie indica la formación de complejos.
Cuando el reactivo no inmovilizado no está marcado, se puede
emplear un marcaje indirecto para la detección de los complejos en
la superficie de reacción, por ejemplo, empleando un anticuerpo
específico para el reactivo no inmovilizado marcado (que puede, a
su vez, estar marcado directa o indirectamente, en este caso
mediante un anticuerpo anti-Ig). Dependiendo del
orden de adición de los componentes de la reacción, los compuestos
ensayados pueden agruparse en aquellos que inhiben la formación de
complejos o aquellos que deshacen los complejos previamente
formados.
Alternativamente, la reacción puede realizarse
en fase líquida, en presencia o ausencia del compuesto ensayado,
separando los productos de reacción de los reactivos no
reaccionados, detectándose posteriormente los complejos mediante,
por ejemplo, el uso de anticuerpos específicos para uno de los
componentes de unión inmovilizados para anclar cualquier complejo
formado en solución, y un anticuerpo marcado específico para el
otro ligando para detectar complejos anclados. Nuevamente, y
dependiendo del orden de adición de los reactivos a la fase
líquida, pueden distinguirse entre compuestos que inhiben la
formación de complejos y aquéllos que deshacen los complejos
formados previamente.
Constituyendo una alternativa a lo presentado
anteriormente, se pueden emplear ensayos homogéneos. Por ejemplo,
se pueden preparar complejos preformados del producto génico diana
y sus ligandos celulares o intracelulares, en los que uno u otro
están marcados, pero la señal generada por el marcaje está
apantallada por la formación del complejo (Patentes U.S. nº
4,109,496, que utiliza esta aproximación para inmunoensayos). La
adición de una sustancia que compite y desplaza a uno de los
componentes del complejo preformado resultará en un incremento de
la señal. De esta forma se pueden identificar sustancias que
bloquean la interacción del producto génico diana y sus
ligandos.
La proteína CD69 puede emplearse como cebo en
ensayos de doble o triple híbrido (ver, por ejemplo, Patentes U.S.
No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell
72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol.
Chem. 268:12046-12054; Bartel et al.
(1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi
et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; y
Brent W094/10300) para identificar otras proteínas que se unen o
interaccionan con CD69 (CD69 binding proteins o
CD69-bp), y que se involucran en la actividad
de CD69 (por ejemplo, expresión de TGF- ). Tales
CD69-bp pueden ser activadoras o inhibidoras de la
señalización por CD69 o sus dianas, como por ejemplo, elementos
activados por la señalización inducida por CD69.
El sistema de doble híbrido se basa en la
naturaleza modular de la mayor parte de los factores de
transcripción, que consisten en dominios independientes de unión a
DNA y de activación. Brevemente, el ensayo utiliza dos
construcciones de DNA diferentes. Una de ellas codifica para CD69
fusionado al dominio de unión a DNA de un factor de transcripción
conocido (por ejemplo, GAL-4). En la otra
construcción se incluye una secuencia de DNA procedente de una
genoteca, que codifica para una proteína no identificada
("presa" o "muestra"), fusionada a un gen que codifica
para el dominio de activación del factor de transcripción conocido
(alternativamente, se puede fusionar CD69 al dominio de
activación). Si el "cebo" y la "presa" son capaces de
interaccionar in vivo formando un complejo dependiente de
CD69, los dominios de unión a DNA y activación del factor de
transcripción quedan muy cercanos, lo que permite la transcripción
de un gen reportero (por ejemplo, lacZ), que está asociado
operacionalmente a un sitio regulador de la transcripción sensible
al factor. La expresión del reportero se puede detectar y las
colonias celulares que contienen el factor de transcripción
funcional se emplean para obtener el gen clonado, que codifica para
la proteína que interacciona con CD69.
Otro aspecto incluye la identificación de
moduladores de la expresión de CD69. Por ejemplo, una mezcla con o
sin células se incuba con un compuesto candidato y se evalúa la
expresión del m-RNA o la proteína CD69 en relación
a la expresión de los mismos en ausencia del compuesto. Cuando la
expresión de m-RNA o proteína es mayor en presencia
del compuesto estudiado, este se identifica como un estimulador de
la expresión del m-RNA o la proteína CD69 (es
decir, agonista de CD69). En cambio, cuando la expresión de
m-RNA o proteína es menor (estadísticamente
significativa) en presencia del compuesto estudiado que en su
ausencia, éste se identifica como un inhibidor de la expresión del
m-RNA o la proteína CD69 (es decir, antagonista de
CD69). El nivel de expresión de m-RNA o proteína
CD69 puede determinarse mediante métodos conocidos para la
determinación de los niveles de m-RNA o
proteína.
En otro apartado, esta invención contempla la
combinación de dos o más de los ensayos aquí descritos. Por
ejemplo, un agente modulador puede identificarse empleando un
ensayo celular sin células, y la capacidad del mismo para modular
la actividad de CD69 puede confirmarse in vivo en modelos
animales como, por ejemplo, de cáncer.
Esta invención también incluye nuevos agentes
identificados por los ensayos de screening descritos
anteriormente. De acuerdo con esto, se encuentra dentro de la
utilización de esta invención el posterior empleo de un agente
identificado como se ha descrito aquí (por ejemplo, un agente
modulador de CD69, una molécula de ácido nucleico antisentido de
CD69, un anticuerpo específico contra CD69, o cualquier otro
ligando de CD69) en un modelo animal apropiado para determinar la
eficacia, toxicidad, efectos secundarios o mecanismo de acción de
un tratamiento con tales agentes. Más aún, se pueden usar nuevos
reactivos identificados por los ensayos de screening
descritos anteriormente para tratamientos como los que se describen
aquí.
El término sustancialmente idéntico u homólogo
se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que
contiene un número suficiente de aminoácidos o nucleótidos
idénticos o equivalentes (es decir, con cadenas laterales
semejantes, sustituciones de aminoácidos conservados, etc) a una
segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos, tal que la primera
y la segunda secuencia tienen actividades similares. En el caso de
anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y
al menos un 50% de la afinidad demostrada para el primero.
Los cálculos de homología entre dos secuencias
se pueden llevar a cabo como sigue: las secuencias se alinean para
realizar una comparación óptima (es posible introducir espacios
vacíos ("gaps") en una o ambas secuencias para un
alineamiento óptimo, y las secuencias no homólogas pueden
descartarse). De forma ideal, la longitud de una secuencia de
referencia alineada para comparación de secuencia es al menos un
30% de la secuencia total, aunque es tanto mejor cuanto mayor es el
porcentaje. Así, se comparan los residuos aminoacídicos o los
nucleótidos de ambas cadenas en posiciones correspondientes. Cuando
existe una coincidencia exacta para ambas secuencias en una
posición determinada, entonces ambas secuencias son idénticas en
dicha posición (se emplean indistintamente los términos
"identidad" y "homología"). El porcentaje de identidad
entre dos secuencias es función del número de posiciones idénticas
encontradas en ambas secuencias, teniendo en cuenta el número de
gaps cuya introducción se requiere para un alineamiento
óptimo, así como la longitud de los mismos.
La comparación de secuencias y la determinación
del porcentaje de homología entre dos secuencias puede realizarse
empleando algoritmos matemáticos. Idóneamente, se emplea el
algoritmo de Needleman y Wunch (Needleman y Wunsch (1970), J.
Mol. Biol. 48:444-453), que se ha implementado
en el programa GAP del paquete de software GCG, empleando bien una
matriz Blossum 62, bien una PAM250 y un "gap weight" de
16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4 y una "length weight" de 1,
2, 3, 4, 5 ó 6. Otra forma idónea de calcular el porcentaje de
homología es emplear el programa GAP del software GCG, empleando
una matriz NWSgapdna.CMP y un "gap weight" de 40, 50,
60, 70 u 80 y una "length weight" de 1, 2, 3, 4, 5, ó
6. El grupo de parámetros de referencia (que debería emplearse si
el investigador no está seguro de los parámetros que deben
aplicarse para determinar si una molécula está dentro de la
limitación de homología de la invención) está constituido una
matriz Blossum 62 con una penalización de gap de 12, una
extensión de la penalización de gap de 4 y una penalización
de "frameshift gap" de 5.
Tal y como se emplea en este texto, el término
"hibrida en condiciones de baja, media, alta o muy alta
estringencia", describe las condiciones de hibridación y lavado.
Se pueden encontrar guías para la realización de reacciones de
hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. En esta
cita se describen métodos en solución acuosa o no acuosa que pueden
ser empleadas. Las condiciones específicas de hibridación que se
refieren aquí son las siguientes: 1) baja estringencia,
cloruro/citrato sódico (CCS) 6\times a 45ºC, seguido por dos
lavados en 0.2\times CCS, 0.1% SDS a al menos 50ºC (la
temperatura de los lavados puede incrementarse a 55ºC); 2)
estringencia media, 6\times CCS a 45ºC seguido por al menos un
lavado en 0.2\times CCS, 0.1% SDS a 60ºC; 3) estringencia alta,
6\times CCS a 45ºC seguido por al menos un lavado en 0.2\times
CCS, 0.1% SDS a 65ºC, o preferiblemente 4) muy alta estringencia,
0.5M fosfato sódico, 7% SDS a 65ºC, seguido de dos lavados en
0.2\times CCS, 0.1% SDS a 65ºC, siendo la condición (4) la de
referencia a no ser que se especifique lo contrario.
Se entiende que los polipéptidos de unión de
esta invención pueden tener sustituciones adicionales conservativas
o no esenciales, que no tienen un efecto sustancial en la
funcionalidad de los polipéptidos. Se puede determinar si una
sustitución en concreto será tolerable (no afectará adversamente a
las propiedades biológicas deseadas, como la actividad de unión) de
acuerdo con lo descrito por Bowie et al. (1990)
Science 247:1306-1310. Una "sustitución de
aminoácido conservada" se define como aquella en la que un
residuo es reemplazado por otro que posee una cadena lateral
similar, lo que está bien establecido en la literatura. Las
familias de aminoácidos con cadenas laterales semejantes son:
cadenas laterales básicas (lisina, arginina, histidina), ácidas
(ácidos aspártico y glutámico), cadenas laterales no cargadas pero
polares (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina,
tirosina, cisteína), no polares (alanina, valina, leucina,
isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas
laterales \beta-ramificadas (treonina, valina,
isoleucina) y aromáticas (tirosina, fenilalanina, triptófano,
histidina).
Un residuo "no esencial" se define como
aquel que puede ser alterado con respecto a la forma salvaje
("wild type") del reactivo de unión (anticuerpo u
otros), sin inhibir, o mejor aún, sin alterar sustancialmente la
actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido
"esencial" es aquel que resulta en dichos cambios.
Por otra parte, la presente invención incluye
compuestos (farmacológicamente aceptables), que incluyen un
reactivo de unión a CD69 (anticuerpo anti-CD69),
como se describe aquí, formulado conjuntamente con un adyuvante
(carrier) adecuado.
En la categoría de adyuvantes farmacológicamente
aceptables se incluyen todos las soluciones, medios de dispersión,
recubrimientos, reactivos antibacterianos y antifúngicos, reactivos
isotónicos y de retardo de la absorción y similares que son
compatibles fisiológicamente. El adyuvante ha de ser adecuado para
su administración intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o
epidérmica (por inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de
administración, el principio activo (el reactivo de unión a CD69),
puede recubrirse en un material que lo proteja de la acción de los
ácidos u otras condiciones naturales que pudieran inactivarlo.
Una "sal farmacológicamente aceptable" se
refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del
compuesto del que se parte, y que no causa ningún efecto
toxicológico no deseado (ver Berge, S.M., et al. (1977)
J. Pharm. Sci. 66:1-19). Entre tales sales
se incluyen sales de adición de ácido o de base. Entre las de
adición de ácido se incluyen aquellas derivadas de ácidos
inorgánicos no tóxicos, como hidroclorhídrico, nítrico, fosfórico,
sulfúrico, hidrobromhídrico, hidroyodhídrico, fosfórico y
similares, así como ácidos orgánicos no tóxicos, como ácidos
alifáticos mono- y dicarboxílicos, alcanoicos
fenil-sustituidos, hidroxialcanoicos, aromáticos,
sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de
adición de bases incluyen aquellas derivadas de metales alcalinos y
alcalinotérreos, como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares,
así como de aminas orgánicas no tóxicas, como
N-N'-dibenciletilendiamina,
N-metilglucamina, cloroprocaína, colina,
dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.
La composición puede presentarse en diversos
formatos, que incluyen, por ejemplo, formas de administración
sólida, semisólida y líquida, como soluciones líquidas (inyectables
o por infusión), dispersiones o suspensiones, tabletas, pastillas,
polvos, liposomas y supositorios. El formato de referencia depende
del modo de administración y la aplicación terapéutica, aunque las
más típicas son en forma de soluciones inyectables o de infusión,
con composición similar a la utilizada para la inmunización pasiva
de humanos con otros anticuerpos. El modo de administración de
referencia es parenteral (intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal,
intramuscular), en forma óptima, por infusión o inyección
intravenosa (por ejemplo, con inyección sin aguja). Otra forma
óptima es por administración intramuscular o subcutánea.
Las frases "administración parenteral" o
"administrada parenteralmente" designan, en este contexto, a
modos de administración diferentes de la administración enteral o
tópica, usualmente por inyección y que incluye, sin limitaciones,
inyección o infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial,
intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca,
intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea,
subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide,
intraespinal, epidural o intraesternal.
Las composiciones terapéuticas deben ser
estériles y estables durante la fabricación y almacenamiento, y
puede formularse en solución, microemulsión, dispersión, liposomas,
y otras estructuras ordenadas adecuadas para la preparación de
altas concentraciones de compuestos. Se pueden preparar soluciones
inyectables estériles incorporando el principio activo (anticuerpo
o una parte del mismo) en una cantidad adecuada en un disolvente
adecuado con uno o más de los ingredientes enumerados
anteriormente, seguidos por filtración en condiciones de
esterilidad. En el caso de polvos para la preparación de soluciones
inyectables estériles, los métodos de referencia son el secado a
vacío y el secado-congelado, de los que se obtiene
un polvo del principio activo además de cualquier otro ingrediente
adicional presente en la solución de partida. Se puede mantener un
grado de fluidez adecuado empleando recubrimientos como lecitina,
manteniendo el tamaño de partícula en el caso de dispersiones y
mediante el empleo de surfactantes. La absorción prolongada de las
composiciones inyectables se puede lograr incluyendo un compuesto
que retarde la absorción, tales como una sal monoesteárica o
gelatina.
Los agentes de unión a CD69 pueden administrarse
a través de una gran variedad de métodos descritos en la
literatura, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la ruta
de administración de referencia es la inyección o infusión
intravenosa. Como es lógico, la ruta de administración puede variar
dependiendo de la consecución de los resultados deseados. En
ciertas situaciones, el compuesto puede prepararse junto con un
adyuvante que impida la liberación rápida del compuesto, como
formulaciones de liberación controlada que incluyen implantes,
parches transdérmicos y sistemas de liberación microencapsulados.
Se pueden emplear polímeros biodegradables y biocompatibles, como
acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico,
colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Se encuentran
muchos ejemplos de tales formulaciones en la literatura
(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,
J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).
En algunos casos se pueden administrar
compuestos farmacéuticos de agentes de unión a CD69, solos o en
combinación con otros agentes, tópicamente o mediante parches
transdérmicos. En los casos en los que el agente de unión es una
molécula de pequeño tamaño molecular se puede administrar
oralmente. Además, los compuestos se pueden administrar
parenteralmente, especialmente para el tratamiento de la artritis,
artritis psoriática, y para la inyección directa en lesiones de la
piel. La terapia parenteral es típicamente intradérmica,
intraarticular, intramuscular o intravenosa. Los agentes de unión a
CD69 se pueden aplicar directamente junto con un adyuvante en forma
de crema o aceite, o en forma de aerosol, así como oralmente.
Los compuestos terapéuticos pueden administrarse
mediante equipos médicos descritos en la literatura. Por
ejemplo, un compuesto terapéutico de esta invención puede administrarse mediante un sistema de inyección hipodérmica sin aguja, como los descritos en las Patentes U.S. Nos. 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, o 4,596,556. Otros implantes y módulos útiles en la presente invención incluyen: Patente U.S.
No. 4,487,603, que incluye una bomba implantable de microinfusión para administrar medicación a velocidad controlada; Patente U.S. No. 4,486,194, que incluye un instrumento terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; Patente U.S. No. 4,447,233, que contempla una bomba de infusión de medicamentos a una velocidad de infusión precisa; Patente U.S. No. 4,447,224, que describe un aparato implantable de infusión de flujo variable para administración continua; Patente U.S. No. 4,439,196, que describe una sistema osmótico de administración de medicamentos con compartimentos multi-cámara; y Patente U.S. No. 4,475,196, que incluye un sistema de administración de medicamentos osmótico. Estas patentes se incluyen como referencia. Muchos otros implantes y sistemas de administración se han descrito en la literatura.
ejemplo, un compuesto terapéutico de esta invención puede administrarse mediante un sistema de inyección hipodérmica sin aguja, como los descritos en las Patentes U.S. Nos. 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, o 4,596,556. Otros implantes y módulos útiles en la presente invención incluyen: Patente U.S.
No. 4,487,603, que incluye una bomba implantable de microinfusión para administrar medicación a velocidad controlada; Patente U.S. No. 4,486,194, que incluye un instrumento terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; Patente U.S. No. 4,447,233, que contempla una bomba de infusión de medicamentos a una velocidad de infusión precisa; Patente U.S. No. 4,447,224, que describe un aparato implantable de infusión de flujo variable para administración continua; Patente U.S. No. 4,439,196, que describe una sistema osmótico de administración de medicamentos con compartimentos multi-cámara; y Patente U.S. No. 4,475,196, que incluye un sistema de administración de medicamentos osmótico. Estas patentes se incluyen como referencia. Muchos otros implantes y sistemas de administración se han descrito en la literatura.
Los regímenes de administración se ajustan para
optimizar la respuesta deseada (terapéutica u otras). Por ejemplo,
se puede administrar un bolus único, o dosis divididas en el
tiempo, o se puede incrementar o reducir la dosis de acuerdo con
las exigencias de la situación terapéutica. La formulación de
compuestos parenterales en forma dosificada es especialmente
conveniente para facilitar la administración y conferir uniformidad
en la administración. La unidad de dosis, como se describe aquí,
se refiere a unidades físicamente discretas en dosis unitarias para
el tratamiento de los sujetos; cada unidad contiene una cantidad
predeterminada del compuesto activo calculada para producir el
efecto terapéutico deseado en asociación con el adyuvante
farmacéutico requerido. La especificación de la unidad de dosis de
esta invención está dictada por y es directamente dependiente de:
a) Las características únicas del principio activo y el efecto
terapéutico particular que se desea alcanzar, y b) Las limitaciones
inherentes descritas para componer un principio activo para el
tratamiento de sensibilidad en individuos.
Un rango ejemplar y no limitante de cantidad de
anticuerpo o una porción del mismo terapéutica o profilácticamente
efectivo está entre 0.1 y 20 mg/kg, preferiblemente entre
1-10 mg/kg. El anticuerpo anti-CD69
se administra por infusión intravenosa a, al menos, 10 mg/min,
preferiblemente menos que o igual a 5mg/min para alcanzar una dosis
de entre 1 a 100 mg/m^{2}, preferiblemente entre 5 y 50
mg/m^{2}, más óptimamente, entre 7 y 25 mg/m^{2}, sobre 10
mg/m^{2}. Hay que resaltar que las dosis pueden variar con el
tipo o severidad de la condición terapéutica. Es de entender que,
para una situación particular, es necesario ajustar regímenes de
dosificación específicos a lo largo del tiempo para adaptarse a las
necesidades individuales y al juicio profesional de la persona que
administra o supervisa la utilización de los compuestos, y que los
rangos de dosificación explicitados anteriormente se emplean
exclusivamente como ejemplo y no están encaminados a limitar el
rango o práctica de los compuestos reivindicados.
Los compuestos farmacéuticos de esta invención
pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una
"cantidad profilácticamente efectiva" de un reactivo de unión.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad efectiva, aplicada en dosis y durante períodos de tiempo
requeridos para alcanzar el resultado terapéutico deseado. Una
cantidad terapéuticamente efectiva de un reactivo de unión a CD69
puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la
enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, así como de la
capacidad del anticuerpo o una porción del mismo de inducir una
respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente
efectiva se define también como aquélla en la que cualquier efecto
tóxico o negativo del reactivo de unión a CD69 es sobrepasado por
el efecto terapéutico beneficioso. Una "dosis terapéuticamente
efectiva" inhibe, preferiblemente, un parámetro cuantificable en
relación con sujetos no tratados. La capacidad del compuesto para
inhibir un parámetro cuantificable puede medirse en un modelo
animal de predicción de su eficacia en humanos. Alternativamente,
esta propiedad de un compuesto puede evaluarse examinando la
capacidad inhibitoria del compuesto, por ejemplo, en inhibición
in vitro, en ensayos descritos en la literatura. Una
"cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a la cantidad
efectiva, en dosis adecuadas y durante un período de tiempo
determinado, requerida para alcanzar un resultado profiláctico
deseable. Típicamente, y dado que una dosis profiláctica se emplea
en individuos en estadios tempranos de enfermedad, o incluso antes,
la cantidad profilácticamente efectiva debe ser menor que la
cantidad terapéuticamente efectiva.
Los antagonistas y eliminadores de CD69 aquí
descritos o identificados por métodos aquí descritos pueden ser
utilizados para tratar a un sujeto que tiene un desorden
caracterizado por una respuesta inmune aumentada o disminuida. Por
ejemplo, los antagonistas de CD69 pueden emplearse para tratar a un
sujeto que tenga un desorden caracterizado por una respuesta
inmunitaria disminuida. Tales desórdenes incluyen aquéllos
caracterizados por procesos de proliferación celular no deseados,
como el cáncer, o una inmunodeficiencia. Los métodos incluyen la
administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un
antagonista de CD69 a un sujeto con un síndrome como el descrito
anteriormente. También se puede prevenir la aparición de dichos
desórdenes mediante la administración de una cantidad
profilácticamente activa de un antagonista de CD69.
Por tanto, en algunos aspectos, los antagonistas
de CD69 pueden usarse para tratar o prevenir procesos de
proliferación celular no deseados como el cáncer, mediante la
inhibición del crecimiento o la eliminación directa de la célula
hiperproliferativa. El antagonista de CD69 puede disminuir la
expresión y/o actividad de CD69, potenciando por tanto la inmunidad
frente a tumores del sujeto. Parece haberse demostrado que el
antagonismo de CD69 inhibe la síntesis de
TGF-\beta. Dado que el TGF-\beta
puede actuar como inmunosupresor, la inhibición de la producción
de TGF-\beta permite que las células inmunes
continúen inhibiendo el crecimiento o la proliferación de las
células hiperproliferativas. Tal y como se emplea en el texto, la
expresión "inhibir el crecimiento o proliferación" de una
célula hiperproliferativa (célula neoplásica), se refiere al
retardo, interrupción, bloqueo o detención de su crecimiento y
capacidad metastásica, y no indica necesariamente una eliminación
total del crecimiento neoplásico. El empleo del término "inducir
la muerte" de la célula hiperproliferativa (neoplásica), define
la eliminación parcial o completa de dichas células, y no
necesariamente la eliminación total del crecimiento neoplásico.
Los términos "inducir", "inhibir",
"potenciar", "elevar", "incrementar",
"disminuir" y otros similares, que denotan diferencias
cuantitativas entre dos estados, se refieren a, al menos,
diferencias estadísticamente significativas con respecto a las
células sin tratamiento. Tales términos se emplean aquí para
referirse, por ejemplo, a velocidades de proliferación celular.
Los términos "cáncer",
"hiperproliferativo" y "neoplásico" designan a aquellas
células con capacidad de crecimiento autónomo. Como ejemplo de
estas células, se pueden citar a aquéllas que se encuentran en un
estado o condición anormal caracterizado por un crecimiento celular
y proliferación muy rápido. Las situaciones hiperproliferativas o
neoplásicas pueden clasificarse en patológicas (caracterizando o
constituyendo una enfermedad) y no patológicas (desviadas del
comportamiento normal, pero no asociadas a un estado de
enfermedad). Este término incluye todos los tipos de crecimientos
cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos en metástasis o células
malignas transformadas, tejidos u órganos, sin tener en cuenta el
tipo histopatológico o el nivel de invasión. Las células
"patológicamente hiperproliferativas" aparecen en estados de
enfermedad caracterizados por el crecimiento de tumores malignos.
Por otra parte, como ejemplos de células hiperproliferativas no
patológicas, se pueden citar a las células involucradas en la
reparación de heridas.
Por tanto, desde cierto punto de vista, un
antagonista de CD69 puede emplearse para tratar o prevenir
desórdenes caracterizados por procesos de hiperproliferación no
patológicos, como por ejemplo, desórdenes fibróticos. El desorden
puede asociarse con uno o más de: traumatismo, cirugía, infección,
polución ambiental, tabaco, alcohol u otras toxinas. El desorden
se puede asociar con, por ejemplo, uno de los siguientes:
reparación hipereficiente de heridas (por ejemplo, cicatrices
hipertróficas, queloides), fibrosis renal (proliferación de células
mesangiales), ó fibrosis hepática (proliferación de células
estrelladas hepáticas). Ejemplos de desórdenes fibróticos incluyen:
queloides, quemaduras, cicatrices hipertróficas u otros desórdenes
de la piel (por ejemplo, esclerodermia local o sistémica, por
ejemplo, esclerosis sistémica con esclerodermia), cirrosis
hepática, fibrosis renal (por ejemplo, relacionada con diabetes o
hipertensión), adhesiones quirúrgicas (por ejemplo, tras cirugía
gastrointestinal o adhesiones de neocirugía), trasplantes
vasculares, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis inducida por
radiación, fibrosis relacionada con el asbesto (por ejemplo, pulmón
marrón o negro), fibrosis asociada con hepatitis viral,
degeneración macular, retinopatía vitreal y retinal, y fibrosis
asociada con síndrome respiratorio agudo. La fibrosis puede ser de
tipo agudo o crónico. Ejemplos de fibrosis aguda incluyen: heridas
accidentales, infecciones, cirugía, quemaduras, fibrosis inducida
por radiación y fibrosis inducida por quimioterapia. La fibrosis
crónica se puede asociar con, por ejemplo, infecciones virales,
diabetes e hipertensión.
Los términos "cáncer" o "neoplasma"
designan procesos de malignización de diferentes sistemas de
órganos, como los que afectan a los pulmones, mamas, glándula
tiroides, tractos gastrointestinal y
genito-urinario, así como adenocarcinomas que
incluyen síndromes malignos como la mayoría de los cánceres de
colon, carcinomas de células renales, cáncer de próstata y/o
tumores testiculares, carcinomas de pulmón de células grandes,
cáncer de intestino delgado y de esófago.
El término "carcinoma" está reconocido en la
literatura y se refiere a malignizaciones de tejido epitelial o
endocrino, incluyendo carcinomas del sistema respiratorio,
gastrointestinal, genitourinario, testicular, de mama, de próstata,
del sistema endocrino y melanomas. Algunos ejemplos son aquellos
que se forman a partir del tejido de cérvix, pulmón, próstata,
mama, cabeza y cuello de útero, colon y ovarios. En la definición
del término, se incluyen los carcinosarcomas, como aquéllos que
están compuestos por tejido carcinomatoso y sarcomatoso. Un
"adenocarcinorma" se refiere a un carcinoma derivado de tejido
glandular o en el cual las células tumorales forman estructuras
glandulares de morfología reconocible. El término "sarcoma"
está contemplado en la literatura y se refiere a tumores malignos
derivados de tejido mesenquimal.
Algunos ejemplos de desórdenes proliferativos
y/o de diferenciación incluyen el cáncer (por ejemplo, carcinomas,
sarcomas, desórdenes metastásicos o desórdenes neoplásicos
hematopoyéticos, como leucemias). Un tumor metastásico puede surgir
a partir de una multitud de tipos de tumor primario, incluyendo,
pero no limitándose a, aquellos de próstata, colon, pulmón, mama e
hígado.
Otros ejemplos de cáncer o situaciones
neoplásicas incluyen a los siguientes tipos de desórdenes y a los
citados anteriormente, pero no se citan todos los existentes:
fibrosarcoma, miosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma
osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma,
linfangiosarcoma, linfangioendotelio-sarcoma,
sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma,
rabdomiosarcoma, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer rectal,
cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer
uterino, cáncer de cabeza y cuello de útero, cáncer de piel,
tumores cerebrales, carcinoma de células escamosas, carcinoma de
glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar,
cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico,
carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del tracto
biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de
Wilm, cáncer de cérvix, cáncer testicular, carcinoma de pulmón de
células pequeñas, carcinoma de pulmón de células grandes,
carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma,
meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma,
hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma,
melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, o
sarcoma de Kaposi.
Existen ejemplos adicionales de desórdenes
proliferativos, que incluyen desórdenes hematopoyéticos
neoplásicos. En este contexto, el término "desórdenes neoplásicos
hematopoyéticos" designan enfermedades que implican a células
hiperplásicas/neoplásicas de origen hematopoyético. Un desorden
hematopoyético de estas características puede surgir a partir de
linajes mieloides, linfoides o eritroides, o precursores de los
mismos. Habitualmente, estas enfermedades surgen como leucemias
poco diferenciadas, como por ejemplo, la leucemia eritroblástica o
megacarioblástica aguda. Otros ejemplos adicionales incluyen, pero
no están limitados a: leucemia promieloide aguda (acute
promyeloid leukemia, APML), leucemia mieloblástica aguda
(acute myelogenous leukemia, AML) y leucemia mieloblástica
crónica (chronic myelogenous leukemia, CML, revisada en
Vaickus, L. (1991) Crit Rev. in Oncol./Hemotol.
11:267-97); los tumores linfoides incluyen, pero no
están limitadas a, leucemia linfoblástica aguda (acute
lymphoblastic leukemia, ALL) que incluye ALL de linajes
B y T, leucemia linfocítica crónica (chronic lymphocytic
leukemia, CLL), leucemia prolinfocítica (prolymphocytic
leukemia, PLL), leucemia de células peludas (hairy cell
leukemia, HLL) y la macroglobulinemia de Waldenstrom. Otras
formas de linfoma maligno incluyen, pero no están limitadas a:
linfomas no-Hodgkin y sus variantes, linfomas de
linfocitos T periféricos, leucemia/linfoma de linfocitos T adultos
(adult T cell leukemia/lymphoma, ATL), linfomas de células T
cutáneas (cutaneous T-cell lymphoma, CTCL),
leucemia de linfocitos grandes granulares (large granular
lymphocytic leukemia, LGF), enfermedades de Hodgkin y de
Reed-Sternberg.
Los antagonistas de CD69 pueden administrarse en
combinación con uno o más agentes terapéuticos, como aquellos
indicados en el tratamiento o prevención de procesos proliferativos
no deseados. Estos agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo, uno
o más agentes quimioterapéuticos, radioisótopos y/o citotoxinas.
Como ejemplos de agentes quimioterapéuticos se pueden citar taxol,
citocalasina B, gramicidina D, mitomicina, etopósido, tenopósido,
vincristina, vinblastina, colchicina, busulfan, cisplatina,
doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona,
mitoxantrona, mitramicina, clorambucil, gencitabina, actinomicina,
procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina,
maytansinoides y análogos u homólogos de los anteriores. Otros
agentes terapéuticos incluyen, pero no están limitados a:
antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato,
6-mercaptopurina, 6-tioguanina,
citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes
alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil,
CC-1065, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina
(CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina,
mitomicina C, y cis-diclorodiaminoplatino (II)
(DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina
(anteriormente denominada daunomicina) y doxorrubicina),
antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente denominada
actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y
agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina, vinblastina, taxol
y maytansinoides). Los radioisótopos pueden ser emisores alfa, beta
y/o gamma, y como ejemplos, pueden incluirse los siguientes:
^{212}Bi, ^{213}Bi, ^{131}I, ^{211}At, ^{186}Re, ^{90}Y
y ^{117}Lu. El antagonista de CD69 y los agentes terapéuticos
pueden ser administrados simultánea o secuencialmente. Además, los
antagonistas de CD69 pueden administrarse conjuntamente con otras
modalidades de tratamiento del cáncer, como cirugía para eliminar
una parte o todo el tejido canceroso o el órgano que lo
contiene.
Tal y como se emplean aquí, los términos
"agente citotóxico", "agente anticanceroso" o "agente
antitumoral" se emplean indistintamente y se refieren a agentes
que tienen la propiedad de inhibir el crecimiento o proliferación
(por ejemplo, un agente citostático), o bien de inducir la muerte
de las células hiperproliferativas. Preferentemente, el agente
citotóxico inhibe el desarrollo o la progresión de los neoplasmas,
particularmente tumores sólidos, tumores de tejido blando, lesiones
metastásicas, linfomas o leucemias.
Una "cantidad terapéuticamente activa" de un
agente, solo o en combinación con un agente citotóxico, se refiere
a la cantidad de tales agentes en combinación efectiva en la
inhibición del crecimiento o proliferación, o en la inducción de
muerte de las células hiperproliferativas, en administración única
o múltiple a un sujeto (un paciente). Tal inhibición del
crecimiento o muerte celular puede reflejarse en la prolongación de
la supervivencia de un sujeto (paciente), más allá de lo esperado
en la ausencia de tal tratamiento, o cualquier mejora en la
prognosis del sujeto con respecto a la ausencia de tal
tratamiento.
Una "cantidad profilácticamente activa" de
un agente, solo o en combinación con un agente citotóxico, se
refiere a la cantidad de tales agentes en combinación efectiva en
la prevención o retardo de la aparición de procesos de recurrencia
de un desorden, por ejemplo, un desorden neoplásico.
Cuando se administra a pacientes en tratamiento
contra el cáncer, el antagonista de CD69 puede administrarse en
cócteles que contengan otros agentes
anti-cancerosos, y también pueden administrarse en
cócteles destinados a tratar los efectos secundarios de la terapia
de irradiación, como anti-eméticos, protectores
contra la radiación, etc.
Los eliminadores de las células que expresan
CD69 pueden emplearse para tratar a un sujeto que sufre un desorden
caracterizado por una respuesta inmune incrementada o exacerbada.
Tales desórdenes incluyen desórdenes crónicos inflamatorios y
desórdenes inmunes, como enfermedades autoinmunes. Los métodos
incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente
efectiva de un eliminador de células CD69^{+} a un sujeto que
padezca un desorden caracterizado por una respuesta inmunitaria
incrementada.
Algunas enfermedades inflamatorias pueden ser
tratadas empleando esta invención, entre las que se pueden citar:
lesión pulmonar aguda, síndrome agudo de estrés respiratorio,
artritis (por ejemplo, CIA), asma, bronquitis, fibrosis cistica,
hepatitis, enfermedad inflamatoria de asas intestinales, esclerosis
múltiple, lesión de reperfusión (por ejemplo, de miocardio),
nefritis, pancreatitis, psoriasis, oclusión de arterias (e.g.,
retinal), apoplejía, lupus eritematoso sistémico, trasplantes, daño
inducido por luz ultravioleta, y/o vasculitis. La enfermedad
inflamatoria puede ser crónica o aguda, y preferentemente mediada
por leucocitos (ver revisiones de Weissmann et al., Ann.
N.Y. Acad. Sci. 389:11-24, 1982; Janoff, A.,
Annu. Rev. Med. 36:207-216, 1985; Hart et
al., J. Rheumatol. 16:1184-1191, 1989;
Doring, Am. J. Respir. Crit. Care Med.
150:S114-S117, 1994; Demling, Annu. Rev. Med.
46:193-202, 1995). Las enfermedades con síntomas de
inflamación crónica incluyen, pero no se limitan a: inflamación de
asas intestinales, como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa,
psoriasis, sarcoidosis y artritis reumatoide.
Los antagonistas de CD69 descritos aquí o
identificados por alguno de los métodos descritos aquí pueden
emplearse para incrementar la respuesta inmune a un antígeno, por
ejemplo una vacuna, o un ácido nucleico que codifica para antígeno.
Estos métodos incluyen la administración de un antígeno (vacuna) o
un DNA que codifica para un antígeno y un antagonista de CD69,
para incrementar la respuesta inmunitaria al antígeno por parte del
sujeto.
Ejemplos de vacunas pueden incluir, vacunas
frente al cáncer, vacunas frente al HIV, vacunas frente a la
hepatitis, o a la malaria, o al herpes, o al papiloma, o a la
gripe, o la viruela. Se han desarrollado varias vacunas frente al
cáncer que podrían administrarse con un antagonista de CD69
descrito aquí. Ejemplos de tales vacunas de cáncer incluyen, pero
no se limitan a, vacunas de células tumorales autólogas; vacunas de
células tumorales alogénicas; gangliósidos (por ejemplo, para
melanoma o sarcoma); CEA (por ejemplo, para cáncer colorectal, u
otros tumores gastrointestinales, cáncer de páncreas o de mama);
PSA (por ejemplo, para cáncer de próstata); MART-1
100, tirosinasa (por ejemplo, para melanoma); p53 (para varios
tumores que expresen p53); alfa-fetoproteína (AFP)
(por ejemplo, para cánceres de hígado, tales como los
hepatomas).
El antagonista de CD69 puede administrarse al
sujeto antes, al mismo tiempo o posteriormente a la administración
del antígeno.
La dosis puede determinarse según el antígeno
usado. Además, la posología y el adyuvante usado, si se utiliza
alguno, puede determinarse por métodos conocidos en la
bibliografía.
Para complementar la descripción que se está
realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las
características de la invención, se acompaña a la presente memoria
descriptiva, como parte integrante de la misma, un juego de planos
en el cual con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha
representado lo siguiente:
La figura número 1.- Desarrollo exacerbado de
AIC en ratones deficientes para CD69. a, Comparación de
ratones control tratados con adyuvante completo de Freund (CFA) con
imágenes representativas de los casos más severos de AIC en ratones
CD69^{+/+} y CD69^{-/-} (paneles centrales y a la derecha,
respectivamente). b, incidencia de la artritis (expresada
como porcentaje de ratones enfermos), y gravedad de la
sintomatología clínica en ratones CD69^{+/+} (\ding{108}),
CD69^{+/-} (\ding{115}), y CD69^{-/-} (\ding{110}),
evaluada como se describe en el apartado de Métodos. Los resultados
representan la media aritmética \pm desviación estándar (d.e.) de
tres experimentos independientes (18 ratones/grupo/experimento). *
P<0.01 vs. CD69^{+/+} (test t de Student).
c, evaluación de la inflamación, daño en cartílagos,
formación de pannus articular y erosión ósea en las patas
delanteras de ratones CD69^{+/+} (barra blanca) y CD69^{-/-}
(barra negra), como se describe en la sección Métodos. Los
resultados corresponden a la media aritmética \pm d.e. del
porcentaje de articulaciones circunscritas a cada grupo de
severidad en tres experimentos independientes (8
ratones/grupo/experimento).
* P<0.01 vs. CD69^{+/+} (test U de Mann-Whitney). d, secciones representativas de la histopatología de las patas completas de ratones control (CFA, panel izquierdo, 100\times), y ratones CD69^{+/+} (panel central, 100\times) y CD69^{-/-} (panel derecho, 60\times) inmunizados con CII. Las cabezas de flecha señalan las erosiones en cartílago y hueso, y las flechas completas los infiltrados de leucocitos y el pannus.
* P<0.01 vs. CD69^{+/+} (test U de Mann-Whitney). d, secciones representativas de la histopatología de las patas completas de ratones control (CFA, panel izquierdo, 100\times), y ratones CD69^{+/+} (panel central, 100\times) y CD69^{-/-} (panel derecho, 60\times) inmunizados con CII. Las cabezas de flecha señalan las erosiones en cartílago y hueso, y las flechas completas los infiltrados de leucocitos y el pannus.
La figura número 2.- Aumento de la respuesta
inmune específica contra CII en ratones CD69^{-/-} a,
comparación del mayor tamaño de los bazos de los ratones
CD69^{-/-} respecto a los ratones CD69^{+/+}. Barra
horizontal=1 cm. b, peso de los bazos y número de células
(media aritmética \pm d.e.) de ratones control (tratados con CFA)
y CD69^{+/+} (\boxempty) y CD69^{-/-} (\ding{110})
inmunizados con CII (AIC). * P<0.01, comparado con
ratones control inmunizados (test t de Student). c,
proliferación de células de bazo (Sp) y nódulo linfoide (LN) de
ratones CD69^{+/+} (\boxempty) y CD69^{-/-} (\ding{110})
inmunizados con CII, estimulados con distintas concentraciones de
CII inactivado (eje x). Los datos reflejan la media aritmética
\pm d.e. de incorporación de ^{3}H-TdR en tres
experimentos independientes. *, P<0.01 vs. CD69^{+/+}
(test U de Mann-Whitney). d, incremento de
los isotipos dependientes de la respuesta Th1 específicos contra
CII en ratones CD69^{-/-}. Niveles de anticuerpos IgG1 e IgG2b
(dilución 1/20000 del suero), IgG2c e IgG3 (dilución 1/5000), IgM e
IgA (dilución 1/200) en sueros de ratones control (CFA) o
CD69^{+/+} (\boxempty) y CD69^{-/-} (\ding{110})
inmunizados con CII en el momento del sacrificio (día 50). Los datos
corresponden a la media aritmética d.e. de las unidades de
absorbancia a 495 nm en tres experimentos independientes (10
ratones/grupo/experimento). * P<0.01 vs. CD69+/+ (test
t de
Student).
Student).
La figura número 3.- Perfil local de citocinas en
ratones CD69^{-/-} inmunizados con CII. a, análisis del
mRNA de las patas traseras de ratones CD69^{+/+} (\boxempty) y
CD69^{-/-} (\ding{110}). Cada carril corresponde al
homogeneizado de mRNA de 6 ratones por grupo, y cada barra
representa experimentos similares (6 ratones/grupo/experimento).
Los resultados se expresan en unidades arbitrarias de densitometría
tomando como referencia la expresión de L-32 en
cada muestra (media aritmética \pm d.e. de cuatro experimentos
independientes). * P<0.01 vs. CD69^{+/+}(test U
de Mann-Whitney). b, Análisis cuantitativo
de RT-PCR en tiempo real de los mRNA de las patas
traseras de ratones CD69^{+/+} (\boxempty) y CD69^{-/-}
(\ding{110}). Cada barra representa la media aritmética \pm
d.e. de 12 ratones por grupo en dos experimentos independientes.
Los resultados para cada citocina están normalizados con respecto a
la expresión de GAPDH en cada muestra. * P<0.01 vs.
anticuerpo control (test U de Mann-Whitney).
c, Niveles de TGF-\beta1 total y activo,
IL-1\beta, TNF-\alpha y RANTES
en lavados sinoviales de ratones CD69^{+/+} (\boxempty) y
CD69^{-/-} (\ding{110}) en los que se ha inducido AIC. Los
datos corresponden a la media aritmética \pm d.e. de tres
experimentos independientes (6 ratones/grupo/experimento). *
P<0.01 vs. CD69^{+/+} (test U de
Mann-Whitney). d, análisis cuantitativo de
RT-PCR en tiempo real de los mRNA de subgrupos
purificados de células sinoviales de ratones CD69^{+/+}
(\boxempty) y CD69^{-/-} (\ding{110}). Cada barra representa
la media aritmética \pm d.e. de 12 ratones por grupo en dos
experimentos independientes. Los resultados para cada citocina
están normalizados con respecto a la expresión de GAPDH en cada
muestra. * P<0.01 vs. anticuerpo control (test U de
Mann-
Whitney).
Whitney).
La figura número 4.- Efecto de un anticuerpo
bloqueante del TGF-\beta en ratones control y
deficientes para CD69. a, panel izquierdo: Los ratones
CD69^{+/+} se trataron con el anticuerpo bloqueante
anti-TGF-\beta (\ding{110}), un
control de isotipo IgG1 (\ding{115}) o adyuvante (\ding{108})
desde el día 21 (segunda inmunización con CII) hasta el momento de
medida. La inflamación de la pata se midió con un calibrador de
precisión y se expresa como los mm de inflamación con respecto al
día 21. Los resultados se representan como la media aritmética
\pm d.e. de 12 ratones por grupo en dos experimentos
independientes. Panel derecho: análisis cuantitativo de
RT-PCR en tiempo real de los mRNA de la patas de
los ratones tratados con un control de isotipo (barra blanca) o con
anti-TGF-\beta (barra negra).
Cada barra representa la media aritmética \pm d.e. de 12 ratones
por grupo en dos experimentos independientes. Los resultados para
cada citocina están normalizados con respecto a la expresión de
GAPDH en cada muestra. * P<0.01 vs. anticuerpo control
(test U de Mann-Whitney). b, se trataron a
los ratones CD69^{-/-} como se ha indicado en a y se determinó
la inflamación de la pata (panel izquierdo) y el mRNA (panel
derecho) como se ha descrito previamente.
La figura número 5.- La activación de CD69
induce secreción de TGF-\beta en leucocitos
humanos y de ratón. a, se estudió la expresión de CD69
(línea gruesa, panel izquierdo) en esplenocitos estimulados con
concanavalina-A. También se representa un control
de isotipo (línea fina, panel izquierdo). Los esplenocitos se
purificaron en distintos subgrupos y se trataron con un anticuerpo
contra CD69 de ratón (barra negra) o un control de isotipo (barra
blanca), incubándose posteriormente con un entrecruzador. Se
determinaron los niveles totales y activos de
TGF-\beta (paneles a la derecha). b, se
determinó la expresión de CD11b y CD69 {panel central), o controles
de isotipo (panel izquierdo) en células sinoviales de ratón, que
posteriormente se trataron como en a y se determinaron los niveles
totales y activos de TGF-\beta (paneles a la
derecha). c, se estudió la expresión de CD69 (línea gruesa,
panel izquierdo) en leucocitos sinoviales humanos. También se
representa un control de isotipo (línea fina, panel izquierdo).
Estas células se trataron con un anticuerpo contra CD69 (TP 1/8)
(\ding{110}) o un control de isotipo (\boxempty) en la
presencia (XL) o ausencia de un anticuerpo secundario
entrecruzador, y se determinaron los niveles de
TGF-\beta total y activo. Los resultados
mostrados en a, b y c se expresan como la media aritmética \pm
d.e. de cuatro experimentos independientes. * P<0.01 vs.
anticuerpo control (test U de Mann-Whitney).
La figura número 6.- Tratamiento in vivo
de la AIC con anticuerpos contra CD69. Se trataron ratones de la
cepa DBA1 (susceptible a la AIC) con el anticuerpo
anti-CD69 2.2 (IgG1) (a) a días 20 y 28
(\ding{115}),o (b) a días 32 y 40 (\ding{116}), ó (a,
b) con un control de isotipo (\ding{110}). Se trataron
ratones DBA1 con el anticuerpo anti-CD69 2.3
(IgG2a) (c) a días 20 y 28 (\ding{115}), ó (d) a
días 32 y 40 (\ding{116}), ó (c, d) con un control de
isotipo (\ding{110}). La inflamación de la pata, medida con un
calibre de precisión, se expresa como los mm de inflamación con
respecto al día 20. Los resultados mostrados se expresan como la
media aritmética \pm d.e. de 12 patas por grupo. *
P<0.01 tratamiento vs. anticuerpo control (test U de
Mann-Whitney).
La figura número 7 - Actividad antitumoral
aumentada en los ratones CD69^{-/-}. Se inyectaron 10^{4}
células tumorales RMA-S (A) o RMA (C)
intraperitonealmente. Se estimó el crecimiento tumoral mediante
monitorización diaria del peso corporal y el desarrollo de líquido
ascítico. Se observaron resultados similares cuando se inyectaron
subcutáneamente (B) 10^{5} células RMA-S (A, n=9;
B, n=6; C, n=9). (D) Se eliminaron las células NK y linfocitos T
de los ratones CD69^{-/-} antes de la inoculación intraperitoneal
de 10^{4} células RMA-S. El tratamiento de
eliminación de células NK se llevó a cabo por inyección de
diluyente control o 100 \mul/inyección de un antisuero
anti-Asialo GM1 a días -1 (antes de la inyección de
las células tumorales) y a días +2 y +4 tras la inoculación de las
células tumorales (n=7). El tratamiento de eliminación de los
linfocitos T se llevó a cabo por inyección de un control de isotipo
o 100 \mul/inyección de un anticuerpo anti-CD4
(GK1.5) a días -1 (antes de la inyección de las células tumorales)
y a días +2 y +4 tras la inoculación de las células tumorales
(n=7). Se muestran resultados representativos de dos experimentos
independientes. Los símbolos huecos corresponden a ratones control
CD69^{+/+} y los símbolos rellenos a ratones CD69^{-/-}. (E)
Fotografías de los pulmones de ratones control y CD69^{-/-} dos
semanas tras la administración de 10^{4} células
RM-1 por vía intravenosa (parte superior). Se
muestra un ratón representativo de 10 por grupo. Se determinó el
número de metástasis pulmonares y cada símbolo representa un ratón
individual. Los símbolos huecos corresponden a ratones control
CD69^{+/+} y los símbolos rellenos a ratones CD69^{-/-}. Se
muestran resultados correspondientes a dos experimentos
independientes.
La figura número 8.- Respuesta antitumoral
exacerbada en ratones RAG-deficientes. Se inocularon
intraperitonealmente 10^{6} células RMA-S. Tras
72h, se examinaron las células peritoneales sin fraccionar de
ratones CD69^{+/+} y CD69^{-/-} -RAG2^{-/-} (A, B). (A)
Perfiles de citometría de flujo (análisis de tamaño vs.
complejidad). Se muestra un ratón representativo de 10/grupo. (B)
Perfiles de comparación obtenidos mediante un contador de células
Coulter Multisizer. Los resultados mostrados corresponden a dos
experimentos independientes (n=8).
La figura número 9 - Aumento en la citotoxicidad
y el reclutamiento linfocitario en los ratones CD69^{-/-}. Se
inocularon intraperitonealmente 10^{4} células
RMA-S (A) o RM-1 (B). Tras 72h, se
examinaron las células peritoneales sin fraccionar de ratones
CD69^{+/+} y CD69^{-/-} (A, B) y se valoró la citotoxicidad con
respecto a células diana YAC. Se emplearon dos animales por grupo
experimental (media aritmética \pm d.e). Los resultados
representan tres experimentos realizados de manera idéntica. Los
símbolos huecos corresponden a células NK purificadas de ratones
control CD69^{+/+} y los símbolos rellenos a ratones
CD69^{-/-}. (C, D, E) Acumulación esplénica y peritoneal de
linfocitos en ratones CD69^{-/-} en respuesta a células
tumorales. Se inocularon 10^{5} células RM-1 o
tan solo PBS (n=7/grupo). Se recogieron los lavados peritoneales
tras 3 o 6 días, y se determinaron los números totales de
leucocitos (\times10^{-6}). (C) Se analizaron las células
recogidas de los lavados en un contador de células Coulter
Multisizer, y se compararon los perfiles a los tiempos indicados
tras la inoculación del tumor Perfiles de comparación obtenidos
mediante un contador de células Coulter Multisizer. Los resultados
mostrados corresponden a tres experimentos independientes en los
que se emplearon 2/2, 2/2 y 4/4, ratones control (línea
discontinua) /ratones CD69^{-/-} (línea continua). (D)
Comparación del mayor tamaño de los bazos de los ratones
CD69^{-/-} y control (8 semanas de edad) tres días después de la
inoculación intraperitoneal de 105 células RM-1. Se
muestran bazos representativos de diversos experimentos
independientes.
independientes.
La figura número 10.- Atenuación de la muerte
celular espontánea en los linfocitos de los ratones CD69^{-/-}.
Las células peritoneales de ratones sin tratamiento (A) se pusieron
en cultivo en medio y se determinó la supervivencia celular por
tinción con yoduro de propidio (IP). Los datos representan el
porcentaje de células IP^{+} (media aritmética \pm d.e.). (B,
C) Análisis de la actividad caspasa-3 intracelular
de células de bazo (B) y NK purificadas (C) de ratones CD69^{+/+}
(panel izquierdo) y CD69^{-/-} (panel derecho) tras tres días
post-inoculación de 10^{5} células
RM-1. La activación de caspasa-3 se
determinó mediante el empleo del sustrato fluorogénico
PhiPhiLux-G1D2. Se representa la tinción de
PhiPhiLux en FL-1 vs. tamaño celular. Los datos
corresponden a un experimento (n=6).
La figura número 11.- Expresión de citocinas en
ratones CD69^{-/-}. (A) Niveles relativos de mRNA de citocinas y
quimiocinas en células peritoneales tras tres días
post-inoculación intraperitoneal de 10^{5} células
RM-1. Los resultados se expresan en unidades
arbitrarias de densitometría normalizadas con respecto a la
expresión de GAPDH o L32 en cada muestra. Se emplearon cinco
animales por grupo experimental, y los resultados corresponden a
cuatro experimentos independientes. (B) Niveles de la quimiocina
MCP-1 en células peritoneales procedentes de
ratones control y CD69^{-/-} tratados con tioglicolato, y
estimuladas con LPS. Los datos corresponden a la media aritmética
\pm d.e. (n=4/grupo) de un experimento representativo de tres
realizados. * P<0.004.
La figura número 12.- Aumento de la respuesta
antitumoral en ratones normales por bloqueo del
TGF-\beta. Perfil de supervivencia de ratones
control y CD69^{-/-} a los que se han inyectado 10^{4} células
RMA-S (día 0) y se han tratado con el anticuerpo
anti-TGF-\beta 1D11 (500
\mug/inoculación) o PBS a días -3, -1 (antes de la inoculación de
las células tumorales), y +1, manteniéndose el tratamiento una vez
a la semana tras la inoculación del tumor (n=4). Los resultados
corresponden a dos experimentos independientes.
La figura número 13.- La activación de CD69
induce TGF-\beta1. Se sembraron células T
CD3^{+} sin estimular sobre anti-CD3 inmovilizado
placas de 96 pocillos. (A) Expresión de CD69 tras la activación con
anti-CD3 durante 24h, determinada por citometría de
flujo mediante un anticuerpo contra CD69 de ratón conjugado con
FITC (línea gruesa). La línea punteada corresponde al control de
isotipo. (B) Se trataron linfocitos T purificados de ratón
resuspendidos en medio sin suero durante 72h con el anticuerpo
anti-CD69 2.2 o un control de isotipo (IgG1) y un
suero de cabra contra IgG de ratón (entrecruzador). Donde se
indica, se trataron las células con el inhibidor PD98059.
Posteriormente, se determinó la secreción de
TGF-\beta por ELISA. Los datos representan la
media aritmética \pm d.e. de pocillos por duplicado y tres
experimentos independientes. (C) Se determinó la mortalidad celular
mediante tinción con azul tripano tras 48 h de cultivo. Los datos
representan la media aritmética \pm d.e. de pocillos por
triplicado. (D) Activación de Erk-1 y
Erk-2 por CD69. Se trataron a 4ºC linfocitos T de
ratón preactivados con anti-CD3 con un anticuerpo
anti-CD69 o un control de isotipo y se lisaron tras
5, 10, 15, 25 y 60 min de incubación a 37ºC con un anticuerpo
entrecruzador. Los lisados se sometieron a PAGE/SDS, se
transfirieron a papel de nitrocelulosa y se realizaron experimentos
de Western blot con un anticuerpo policlonal que reconoce
Erk-1 y Erk-2 fosforilados (panel
superior). Panel inferior, niveles totales de Erk determinados por
Western blot con un anticuerpo monoclonal contra Erk. La posición
relativa de Erk-1 y Erk-2 se denota
mediante flechas. También se recogen los niveles relativos de
fosforilación de Erk-1 y Erk-2 con
respecto a los niveles totales de Erk en unidades arbitrarias de
densitometría. Se muestran ratones CD69^{+/+} (\boxempty)
y
CD69^{-/-} (\ding{110}).
CD69^{-/-} (\ding{110}).
La figura número 14.- Actividad terapéutica
antitumoral de los anticuerpos contra CD69 en ratones normales y
deficientes para RAG. Perfiles de supervivencia de ratones control
y SCID tratados con anticuerpos contra CD69 o controles de isotipo.
Se inocularon intraperitonealmente 10^{4} células
RMA-S en ratones control o 10^{6} células en
ratones SCID. Se trataron los ratones como se ha indicado
anteriormente con anti-CD69 o control de isotipo y
se observó a diario el crecimiento de tumores (hasta 20 semanas
post-inoculación) mediante la monitorización del
peso corporal y el desarrollo de líquido ascítico (n=9; n=6; n=9).
Los resultados corresponden a dos experimentos
indepen-
dientes.
dientes.
La figura número 15.- Los anticuerpos contra
CD69 afectan a la fase temprana del crecimiento de tumores en el
peritoneo. Se examinaron las células peritoneales de ratones
control (A) o RAG1^{-/-} tres días después de la inyección
intraperitoneal de 10^{6} células RMA-S. Los
ratones se trataron un día antes de la inoculación de las células
tumorales con 500 \mug/ratón de un anticuerpo contra CD69 (línea
sólida) o un control de isotipo (línea discontinua). Las células
recogidas del lavado peritoneal se analizaron mediante un contador
de células Coulter Multisizer y se compararon los perfiles
obtenidos (n=8/grupo). Los datos corresponden a dos experimentos
independientes.
La figura número 16.- Secuencia de aminoácidos
(SEQ ID NO:2) de CD69 humano y secuencia del ácido nucleico (SEQ ID
NO:1) que codifica para CD69 humano.
La figura número 17.- Respuesta de anticuerpos a
DNP-KLH en ratones WT y deficientes para CD69. Se
inmunizó con 100 \mug de DNP-KLH por ratón a días
0 (inmunización primaria) y día 21 (inmunización secundaria) s.c.
en la base de la cola o i.p., usando o Alum o CFA como adyuvantes.
Los ratones se sangraron a día 7 (a), y a día 28 (b).
(a) niveles de IgM en la inmunización primaria (dilución de
suero 1:2000). (b) niveles de IgM (1:2000),
IgG1(1:20000), IgG2c (1:10000), IgG2b (1:10000), e IgG3
(1:10000) en la inmunización secundaria. Los resultados se expresan
como la media aritmética \pm d.e. de 4 ratones/grupo/experimento
analizados en dos experimentos independientes. *, P<0.01
respecto al mismo tratamiento en ratones WT (test de la U de
Mann-Whitney).
La nueva estrategia de regulación inmune
fundamentada en la molécula inducible durante la activación
leucocitaria CD69 que se preconiza, describe la exacerbación de la
AIC en ratones CD69^{-/-}, que correlaciona con respuestas T y B
incrementadas contra el colágeno de tipo II, elevación de algunos
mediadores inflamatorios y disminución de la síntesis localizada
de TGF-\beta1. El bloqueo local del
TGF-\beta agrava la AIC en ratones control pero
no CD69^{-/-}, mientras que la activación in vitro de CD69
induce la producción de TGF-\beta1. También se
describe en esta patente el aumento de la respuesta antitumoral
dependiente de células NK en ratones deficientes para CD69. La
deficiencia en CD69 resulta en una mayor protección y rechazo de
células tumorales MHC-I comparando con ratones
control. Esta potente respuesta antitumoral es dependiente del
microambiente tumoral en el huésped, correlacionando con una
disminución en la producción de TGF-\beta, un
incremento en los perfiles de citocinas inflamatorias y la
quimiocina MCP-1, y se asocia a un incremento del
reclutamiento de células linfoides efectoras y disminución de la
apoptosis. Este incremento en la actividad antitumoral es
dependiente de células NK y linfocitos T y persiste en ratones
inmunodeficientes CD69^{-/-}, RAG-negativos. Más
aún, el tratamiento in vivo con anticuerpos
anti-TGF-\beta induce la
potenciación de la respuesta antitumoral. Por otra parte, la
activación de CD69 induce la fosforilación de ERK y la producción
de TGF-\beta en linfocitos T, producción que se
inhibe por el tratamiento de los linfocitos T con un inhibidor
específico de MEK1, una quinasa que fosforila y activa ERK, lo que
constituye un nexo entre la señalización por CD69 y la producción
de TGF-\beta. También se presentan evidencias de
que el tratamiento in vivo con el anticuerpo antagonista
contra CD69 2.2 mejora la respuesta antitumoral en ratones normales
e inmunodeficientes de cepas SCID y RAG-negativas
inducidas con tumores negativos para MHC de clase I.
Estos resultados indican que CD69 es un
regulador negativo de la reactividad inmunitaria a través de la
síntesis de TGF-\beta. El tratamiento in
vivo con anticuerpos anti-CD69 depende del
anticuerpo empleado. El antagonista 2.2 potencia la respuesta
inmune, aumentando la gravedad de la AIC pero incrementando también
la eficiencia del rechazo tumoral, mientras que el eliminador 2.3
erradica los leucocitos efectores, mejorando los parámetros
clínicos de la AIC. Además, este anticuerpo puede eliminar
directamente los tumores CD69^{+}.
Los siguientes ejemplos ilustran la patente
propuesta y no han de considerarse como una limitación de los
hallazgos incluidos en este informe:
Para explorar el papel de CD69 en un modelos de
artritis crónica autoinmune, se han comparado la incidencia y
gravedad de la AIC inducida por inmunización intradérmica de CII en
CFA en ratones de la cepa B6 (en los que este protocolo induce una
artritis moderada (Campbell et al., 2000)), empleando
animales control (CD69^{+/+}) y CD69^{-/-} (Lauzurica et
al., 2000). Los ratones desarrollaron una forma exacerbada de
AIC, mostrando una marcada hinchazón de la pata, articulaciones del
tobillo e interdigitantes, mostrado en la figura 1 con referencia
(a), y un aumento en la gravedad e incidencia comparado con ratones
control, fig. 1 (b). Los heterocigotos CD69^{+/-}, que expresan
niveles intermedios de CD69 (Lauzurica et al., 2000),
mostraban agravamiento de la AIC, pero sensiblemente menor que los
homocigotos CD69^{-/-}, fig. 1 (b). De acuerdo con lo anterior,
se observó un porcentaje mayor de articulaciones con un nivel
clínico severo en los ratones CD69^{-/-} con respecto a los
ratones control, fig. 1 (c). Las articulaciones de los ratones
CD69^{-/-} mostraban una mayor incidencia de infiltrados de
células inflamatorias, con pannus extendiéndose desde las zonas
marginales al cartílago y a través de la médula del hueso
subcondral, figura 1 (c) y (d). En estadios más tardíos, se observó
destrucción del cartílago articular y el hueso, con pérdida de la
normal morfología de la articulación. Por lo tanto, estos
resultados demuestran una clara correlación inversa entre la
gravedad de la AIC y la expresión de CD69, sugiriendo un papel
inhibidor in vivo para CD69 en el desarrollo de la AIC.
Estos resultados sugieren que el CII induce una
respuesta inmunitaria exacerbada en los ratones deficientes en
CD69. De acuerdo con esto, el bazo de los ratones CD69^{-/-} en
los que se ha inducido AIC eran de mayor tamaño que los ratones
control de 12 semanas de edad, fig. 2 (a) y (b). El incremento del
peso de los bazos correlaciona con un aumento en el número de
células, fig. 2 (b), aunque las proporciones de linfocitos T y B,
así como de linfocitos CD4^{+} y CD8^{+} no difieren
significativamente de los ratones control (datos no mostrados).
Para determinar la capacidad de activación de los linfocitos, se
analizó la respuesta linfoproliferativa en respuesta a CII en
linfocitos del bazo o de nódulos linfoides. Los linfocitos de los
ratones CD69^{-/-} mostraron mayores niveles de proliferación de
manera dependiente de dosis cuando se comparan con los ratones
control, fig. 2 (c). Por otra parte, la concentración sérica de
anticuerpos contra CII y su caracterización isotípica reveló
mayores niveles del isotipo IgG2c, dependientes de la respuesta
Th1, y que es el equivalente en la cepa de ratones B6 a las IgG2a e
IgG2b, fig. 2 (d). También se demostró un incremento significativo
de IgG3, lo que indica una hiperrespuesta de los linfocitos B de
los ratones CD69^{-/-}. Estos resultados sugieren la potenciación
de la reactividad inmune tanto T como B en los ratones deficientes
para CD69.
El proceso inflamatorio y el desarrollo de la
artritis involucra a un amplio abanico de citocinas (Feldmann et
al., 1996; O'Shea et al., 2002). Por lo tanto, se
investigó el efecto de la deficiencia en CD69 en el perfil de
citocinas expresadas en las articulaciones de los ratones que
padecen AIC. Empleando ensayos de protección frente a actividad
RNasa, se demostró que la deficiencia en CD69 produce un incremento
en la expresión de algunos mediadores inflamatorios como
IL-1\beta RANTES, MIP-1\alpha y
MIP-1\beta, fig. 3 (a). No obstante, la
diferencia más significativa es la reducción de los niveles de la
citocina antiinflamatoria TGF-\beta1 en los
ratones CD69^{-/-}, fig. 3 (a). El análisis cuantitativo de
RT-PCR en tiempo real de los mRNA de las patas
traseras de los ratones demostró la reducción en el mRNA de
TGF-\beta1 presente en las articulaciones
inflamadas y el incremento en IL-1\beta y RANTES,
Fig. 3 (b). El análisis posterior de los niveles de
TGF-\beta y otras citocinas en los lavados del
tejido articular demostró que tanto los niveles totales de
TGF-\beta como la fracción activada de esta
citocina se hallan disminuidos en los ratones deficientes para
CD69, fig. 3 (c), en contraste con los niveles sistémicos de la
misma, en los que no se observó diferencias (datos no mostrados).
Por otra parte, se observó un incremento local de citocinas
proinflamatorias como IL-1\beta y RANTES en las
articulaciones afectadas, mientras que los niveles de
TNF-\alpha no mostraban diferencias
significativas, fig. 3 (c). Dado que el TGF-\beta
protege en modelos de AIC (Kuruvilla et al., 1991), estos
resultados sugieren que la deficiencia en la producción de
TGF-\beta1 puede originar el incremento en la
respuesta inflamatoria observada en los ratones CD69^{-/-} a
través de la elevación de la producción de IL-1 y
diversas quimiocinas.
Posteriormente, se investigaron las poblaciones
celulares responsables del perfil de expresión de citocinas
observado en los ratones CD69^{-/-}. La purificación de las
poblaciones sinoviales demostraron que estas células son en su
mayor parte macrófagos CD11b^{+} (66.3 \pm 29.4%), con algunas
células CD3^{+} (9.6 \pm 5.3%), y células no leucocitarias
CD45^{-} (24.1 \pm 14.8%). Se aislaron estas tres poblaciones, y
se demostró que tanto las poblaciones CDl1b^{+} como CD3^{+}
contribuyeron a la disminución local del TGF-\beta
en los ratones deficientes para CD69. No obstante, se demostró que
la subpoblación CD11b^{+} causaba el posterior incremento de la
respuesta proinflamatoria mediada por la
IL-1\beta, fig. 3 (d), lo que le confiere un papel
crucial en la perpetuación de la sinovitis.
Para establecer un nexo causal entre los niveles
de TGF-\beta y la gravedad de la AIC, se inyectó
localmente en las patas de los ratones con AIC un anticuerpo
bloqueante contra TGF-\beta (Dasch et al.,
1989). El bloqueo del
TGF-\beta indujo un aumento significativo en la inflamación de la pata comparado con un control de isotipo o el diluyente, fig. 4 (a). El análisis del mRNA de la articulación por RT-PCR cuantitativa demostró una inducción significativa de IL-1\beta y RANTES, pero no de TNF-\alpha o IL-18, fig. 4 (a). Estos resultados demuestran que el bloqueo del TGF-\beta en los ratones control con AIC resultan en un fenotipo similar al observado en los ratones CD69^{-/-}. Sin embargo, la inyección local del anticuerpo contra TGF-\beta en los ratones deficientes en CD69 con AIC no incrementó la inflamación de la pata, fig. 4 (b), y el análisis de mRNA no demostró ninguna modificación apreciable en los niveles de las citocinas proinflamatorias estudiadas. Estos hallazgos revelan que el bloqueo del TGF-\beta y la deficiencia de CD69 no cooperan para agravar la AIC, sugiriendo su interdependencia.
TGF-\beta indujo un aumento significativo en la inflamación de la pata comparado con un control de isotipo o el diluyente, fig. 4 (a). El análisis del mRNA de la articulación por RT-PCR cuantitativa demostró una inducción significativa de IL-1\beta y RANTES, pero no de TNF-\alpha o IL-18, fig. 4 (a). Estos resultados demuestran que el bloqueo del TGF-\beta en los ratones control con AIC resultan en un fenotipo similar al observado en los ratones CD69^{-/-}. Sin embargo, la inyección local del anticuerpo contra TGF-\beta en los ratones deficientes en CD69 con AIC no incrementó la inflamación de la pata, fig. 4 (b), y el análisis de mRNA no demostró ninguna modificación apreciable en los niveles de las citocinas proinflamatorias estudiadas. Estos hallazgos revelan que el bloqueo del TGF-\beta y la deficiencia de CD69 no cooperan para agravar la AIC, sugiriendo su interdependencia.
Para analizar el posible papel modulador de CD69
en la síntesis de TGF-\beta1, se investigó la
secreción de dicha citocina en esplenocitos de ratón estimulados
con Con-A. El entrecruzamiento de CD69 indujo un
marcado incremento en los niveles de TGF-\beta
total y activo en diferentes subgrupos de leucocitos, fig. 5 (a),
así como en células de infiltrado sinovial de ratón, la mayoría de
las cuales eran CD11b^{+} CD69^{+}, fig. 5 (b). En cambio, no
se detectaron cambios en la expresión de
TNF-\alpha, RANTES o IL-1\beta
tras la activación de CD69 (datos no mostrados).
Para investigar la posible extensión de estos
resultados a los humanos, se analizó la expresión de
TGF-\beta1 en células mononucleares CD69^{+}
procedentes de las articulaciones de pacientes con enfermedades
inflamatorias, fig. 5 (c). El anticuerpo TP1/8
anti-CD69 entrecruzado (pero no soluble) indujo la
expresión de TGF-\beta sin otro coestímulo, fig.
5 (c), mientras que no se observaron diferencias en otras
citocinas, como TNF-\alpha o IL-6
(datos no mostrados). En estos ensayos, el incremento en
TGF-\beta activo correlacionaba con el incremento
en los niveles totales de la citocina, fig. 5. Estos resultados
demuestran que, tanto en humanos como ratones, existe un nexo
directo entre la activación de CD69 y la expresión de
TGF-\beta1, lo que podría explicar los niveles
aumentados de TGF-\beta1 observados en los
ratones CD69^{+/+} comparados con los CD69^{-/-}, lo que
sugiere que CD69, un receptor inducido durante la activación, es
capaz de modular la respuesta inmunológica y la reacción
inflamatoria a través de la secreción directa de
TGF-\beta1 en el foco inflamatorio.
El efecto del tratamiento in vivo con
anti-CD69 se ha analizado empleando dos anticuerpos
diferentes contra CD69 en el modelo de AIC en ratones DBA1. El
anticuerpo anti-CD69 2.2 (IgG1) funciona como
bloqueante en ausencia de entrecruzador (datos no mostrados). El
tratamiento temprano (días 20 y 28) potenció, efectivamente, la
respuesta inmunitaria contra CII, lo que resultó en el agravamiento
de la AIC, de manera similar a los ratones deficientes para CD69,
fig. 6 (a). El tratamiento administrado los días 32 y 40 también
incrementaron significativamente la inflamación de la pata, fig. 6
(a). En cambio, el anticuerpo anti-CD69 2.3 (IgG2a)
elimina las células que expresan CD69 tanto in vitro como
in vivo (datos no mostrados). El tratamiento temprano a días
20 y 28 evitó la inflamación de la pata, mientras que el
tratamiento a días 32 y 40 no produjo ninguna mejora apreciable.
Por lo tanto, el tratamiento preventivo con este anticuerpo
eliminador es más efectivo, aunque se requiere un estudio más
profundo para determinar las dosis y el protocolo de administración
más eficiente.
Para evaluar el posible papel de CD69 in
vivo en la respuesta antitumoral, se inyectaron
intraperitonealmente células tumorales RMA-S en
ratones control y CD69^{-/-}, y se analizó la progresión tumoral,
fig. 7 (A). Tras la inyección de 10^{4} células
RMA-S, todos los ratones control desarrollaron
tumores a las cinco semanas, con un incremento significativo del
peso corporal observable a los 15 días, mientras que tan sólo un
20% de los ratones CD69^{-/-} desarrollaron tumores, lo que se
verificó hasta 7 semanas post-inoculación, fig. 7
(A). Se obtuvieron resultados semejantes cuando se inyectaron
10^{5} células RMA-S subcutáneamente, fig. 7 (B),
lo que demuestra que las diferencias observadas no se deben al
lugar de inoculación. En cambio, se observaron diferencias muy
sutiles en la progresión de tumores derivados de la línea celular
RMA (H-2^{+}) entre ratones control y CD69^{-/-}
fig. 7 (C), y datos no mostrados, sugiriendo que los linfocitos
citotóxicos (CTL) CD8^{+} desempeñan un papel accesorio en la
potenciación de la respuesta antitumoral observada en los ratones
CD69^{-/-}.
Estudios previos han demostrado que el
crecimiento de los tumores RMA-S se controlan in
vivo mediante las células NK en ratones normales (Smyth et
al., 1998). Para investigar la implicación de las células NK en
el desarrollo de tumores RMA-S en ratones
deficientes para CD69, se eliminaron estas células antes de la
inducción del tumor mediante el tratamiento con un antisuero contra
Asialo-GM1. Se inoculó este antisuero los días -1
(antes de la inducción del tumor), +2 y +4, empleándose el
diluyente como control. Como se espera, se observó crecimiento
tumoral en todos los animales en los que se había eliminado la
población NK, pero en ninguno de los control, fig. 7 (B). Los
ratones tratados con el
anti-Asialo-GM1 desarrollaron
tumores en los 10 primeros días post-inoculación,
datos comparables con la inducción tumoral más temprana, observada
en ratones C57BL/6 deficientes para perforina (Smyth y Johnstone,
2000; Smyth et al., 1998). La eliminación de los linfocitos
CD4^{+} en los ratones CD69^{-/-} aumentó el desarrollo
tumoral, pero de forma menos acusada que en ratones sin células NK,
fig. 7 (D). Estos resultados indican que, aunque las células NK
son muy importantes en el rechazo de tumores RMA-S
en ratones deficientes para CD69, los linfocitos T también
desempeñan un papel en este proceso. De acuerdo con el papel
relevante de las células T en la supresión de tumores en ratones
CD69^{-/-} se observó un control mayor en el sobrecrecimiento de
las células RMA tras tres días de inoculación (datos no
mostrados).
La potenciación de la actividad antitumoral
observada en los ratones CD69^{-/-} no se restringía a las
células RMA-S, ya que también se observó en el caso
de inoculación de las células RM-1, un carcinoma de
próstata singénico de C57BL/6
(MHC-I^{-}CD69^{-}). Se observó un descenso en
el número de metástasis tumorales en los ratones deficientes para
CD69 cuando se inyectaron 10^{4} células RM1 por vía intravenosa,
mientras que los ratones control mostraron un elevado número de
metástasis pulmonares, fig. 7 (E).
Para analizar la contribución de la inmunidad
natural a la potenciación de la respuesta antitumoral observada en
los ratones deficientes en CD69, se inyectaron intraperitonealmente
células RMA-S en ratones CD69^{-/-}
RAG-deficientes y CD69^{+/+}
RAG-deficientes, fig. 8. Las células tumorales se
sobrecrecieron en prácticamente todos los ratones
RAG-deficientes en respuesta a 10^{6} celular
RMA-S, mientras que los CD69^{-/-}
RAG-deficientes controlaron el crecimiento tumoral
casi completamente, fig. 8 (A) y (B).
Se investigó si el rechazo tumoral estaba
asociado con un incremento en la función de las células NK
determinándose la actividad lítica in vitro de las células
peritoneales de ratones CD69^{-/-} y control estimulados con
células RMA-S, empleándose como diana la línea
tumoral YAC-1, susceptible a NK. Se demostró que
las células peritoneales sin fraccionar procedentes de los ratones
CD69^{-/-} eran más eficaces destruyendo a las células
YAC-1 que aquéllas procedentes de ratones control
(Fig. 9A), demostrándose una correlación entre la respuesta NK
in vivo y la citotoxicidad NK in vitro en los ratones
CD69^{-/-}. Se obtuvieron resultados semejantes inoculando a los
ratones con celular RM-1, fig. 9 (B). A
continuación, se cuantificaron los linfocitos T y las células
peritoneales procedentes de ratones inoculados con células
RMA-S, RM-1 o sin inocular. Se
estableció la población NK peritoneal como positiva para los
anticuerpos DX5 y 2B4 por citometría de flujo. Como se demuestra en
la Fig. 9C y en la tabla 1, se encontró un modesto incremento en el
número total de células peritoneales en ratones CD69^{-/-}
comparados con ratones control, lo que parecía deberse a un
incremento en el número y proporción de los linfocitos,
específicamente células NK y linfocitos T CD3^{+} (Tabla IA).
Cuando se emplearon células RM-1, el número total
de células reclutadas al peritoneo era significativamente mayor en
los ratones CD69^{-/-}, fig. 9D, Tabla IA. Esto refleja un
incremento de casi tres veces en los números de células NK y
linfocitos T CD3^{+} (Fig. 9, Tabla I). En cambio, el número de
linfocitos CD5^{+}B220^{+} B-1 y
CD5^{+}B220^{+} B-2 era similar en los ratones
CD69^{-/-} y control, tanto en condiciones basales como tras el
desafío con células RM-1 (datos no mostrados).
También se detectó un modesto incremento en los niveles de
monocitos y granulocitos del peritoneo de los ratones CD69^{-/-},
fig. 9 (A). Además, la reducción en el reclutamiento celular
observado en ratones control en el día 6
post-inoculación de las células tumorales no se
observó en los ratones CD69^{-/-} fig. 8 (C). Estos datos
demuestran la existencia de una correlación entre el número de
células NK y linfocitos T CD3^{+} en el peritoneo de los ratones
CD69^{-/-} y la actividad antitumoral. Por tanto, CD69 parece
regular el número de células NK y linfocitos T CD3^{+} reclutados
al sitio de formación del tumor.
El bazo es un órgano linfoide fuertemente
influenciado por la inflamación peritoneal. De acuerdo con esto,
los bazos de los ratones CD69^{-/-} son mucho más grandes
comparando con ratones control, fig. 9ª (D). El recuento de células
esplénicas confirmó estos resultados, pero el análisis por
citometría de flujo de las distintas subpoblaciones demostró la
existencia de proporciones similares de linfocitos B220^{+},
CD3^{+} y DX5^{+}. Todo lo anteriormente expuesto sugiere un
papel para CD69 como regulador de la acumulación linfocitaria en
los sitios de inflamación.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La expansión y eliminación de las células
activadas se lleva a cabo mediante mecanismos homeostáticos en la
circulación periférica (Krammer, 2000). Para investigar el
mecanismo por el cual se observa acumulación linfocitaria en el
bazo y peritoneo de los ratones CD69^{-/-}, se analizó la
supervivencia de los linajes linfoides en estos ratones. Cuando se
investigó la viabilidad celular in vitro, se observó un
incremento en la supervivencia celular en los ratones CD69^{-/-}
fig. 10 (A). Se observó una diferencia significativa del 19% de
disminución (p<0.02) de apoptosis espontánea, determinada por
contenido de DNA en ensayos de ciclo celular (24 h), de los
linfocitos del bazo de ratones CD69^{-/-} en los que se han
inyectado células RM-1 (23.36 \pm 1.73%, n=9) con
respecto a ratones control igualmente inoculados (28.89 \pm
1.18%, n=9). El empleo de un ensayo de actividad
caspasa-3 confirmó un descenso significativo
(p<0.0001) en la apoptosis espontánea (48 h) de los linfocitos
del bazo de ratones CD69^{-/-} inoculados con células
RM-1 (25.46 \pm 0.5%, n=6) vs. ratones control
(44.56 \pm 1.3%, n=6), fig. 10 (B), diferencias que se
reprodujeron (p<0.0001) empleando células NK purificadas
(DX5+CD3-) de ratones CD69^{-/-} (35.26 \pm 1.6%, n=4) y
control (45 \pm 1.8%, n=4). Por tanto, parece que las diferencias
en la supervivencia linfocitaria puede contribuir al incremento en
el tamaño de los bazos y celularidad observable en el peritoneo de
los ratones CD69^{-/-}.
La respuesta antitumoral está controlada por un
amplio abanico de factores de crecimiento y citocinas, y la
expresión alterada de los mismos puede tener un enorme impacto en
las respuestas inmunitarias. Por lo tanto, se ha analizado si la
potenciación de la respuesta antitumoral de los ratones
CD69^{-/-} está influenciada por diferencias en los niveles de
citocinas y/o quimiocinas, lo que se estudió mediante experimentos
de protección de RNasa. El análisis del mRNA de las células
peritoneales de ratones CD69^{-/-} en los que se ha inoculado
células RM-1 mostró una variación en los niveles de
la citocina TGF-\beta con respecto al control.
Las células peritoneales de los ratones CD69^{-/-} producían
menos transcritos de TGF-\beta1, - \beta2 y -
\beta3 que las células procedentes de ratones normales. Las
disminuciones observadas en cuatro experimentos independientes
oscilaban entre un 33 \pm 5% para TGF-\beta1
hasta un 74 \pm 19% para el TGF-\beta3. La
disminución del TGF-\beta2 era dependiente del
sexo de los animales, variando de un 20% en machos hasta un 110% en
hembras. El análisis de otras citocinas reveló un aumento de los
niveles de IL-12p35 (32-68%),
IL-1\alpha (27-64%),
IL-1\beta (32% en los machos, 294% en las hembras)
y MCP-1 (133%) en los ratones CD69^{-/-}
comparados con los ratones control, fig. 11. No se observaron
cambios significativos en los perfiles de expresión de
LT-\beta, IFN-\gamma, MIF,
IL-1R\alpha, IL-18, eotaxina,
MIP-1\alpha, MIP-1\beta e
IP-10, fig. 11 y datos no mostrados. Por tanto,
estos resultados sugieren que las células inmunes de los ratones
CD69^{-/-} poseen un perfil anormal de expresión de citocinas, con
síntesis defectiva de factores inmunosupresores y elevada producción
de citocinas proinflamatorias y la quimiocina
MCP-1. Se llevó a cabo un análisis más exhaustivo
de la expresión de MCP-1, midiendo la secreción de
dicha quimiocina por parte de las células peritoneales estimulados
con LPS de ratones inducidos con tioglicolato. Como se muestra en
la Fig. 11 (B), los niveles de MCP-1 producidos por
las células peritoneales de los ratones CD69^{-/-} eran casi tres
veces mayores que los niveles de los ratones control. Estos
cambios pueden dar cuenta de la potenciación de la respuesta inmune
y el enriquecimiento en linfocitos T y células NK observados en los
ratones CD69^{-/-}.
Para examinar si la disminución en los niveles
de TGF-\beta puede corresponder con el incremento
en la respuesta antitumoral observada en los ratones CD69^{-/-},
se trataron ratones control con un anticuerpo monoclonal bloqueante
del TGF-\beta. Dicho bloqueo previno el
desarrollo de tumores comparado con el empleo de un anticuerpo
control o el diluyente, fig. 12. Estos resultados indican que el
bloqueo del TGF-\beta en ratones en los que se
han inoculado células tumorales da lugar a un fenotipo similar al
observado en los ratones CD69^{-/-}.
Se examinó si la señalización por CD69 está
implicada en la expresión del TGF-\beta en
linfocitos T. La estimulación de células T purificadas de bazos de
ratones B6 con un anticuerpo contra CD3 indujo una alta expresión
de CD69, fig. 13 (A), cuyo entrecruzamiento resultó en una
inducción de la producción de TGF-\beta, fig. 13
(B). Este efecto no se observaba empleando un control de isotipo, lo
que indica que el entrecruzamiento de CD3 no induce la secreción de
TGF-\beta, como se ha descrito previamente (Chen
et al, 2001). La cuantificación de las células viables y no
viables a las 48 h, fig. 13 (C) demostró una disminución en la
supervivencia linfocitaria, lo que correlaciona con mayores niveles
de TGF-\beta.
La estimulación de CD69 en líneas celulares
maduras transfectadas induce la fosforilación de la quinasa
regulada por señales extracelulares (ERK) (Zingoni et al.,
2000). Para determinar las cascadas de señalización de CD69 que
regulan la expresión del TGF-\beta se analizó la
activación de ERK. El entrecruzamiento de CD69 indujo la activación
de ERK-1 y ERK-2 en linfocitos T
estimulados con anti-CD3, fig. 13 (D). La
activación de ERK se detectaba a los 5 min, siendo máxima a los 15
min. Además, se observó una reducción significativa en la expresión
de TGF-\beta inducida por CD69 cuando las células
se pretrataban con el inhibidor de MEK1, PD98059, fig. 13 (B),
indicando que la activación de ERK es importante para la
producción de TGF-\beta inducida por CD69. Estos
resultados establecen un nexo causal entre la señalización por
CD69 y la producción de TGF-\beta vía activación
de ERK, y sugiere que CD69 desempeña un papel fundamental en la
homeostasis linfocitaria.
Se seleccionaron diferentes anticuerpos murinos
contra CD69 para examinar el papel de esta molécula en terapia
tumoral de ratones en los que se han inducido tumores con células
RMA-S. La inoculación intraperitoneal de 10^{5}
células RMA-S singénicas MHC-I^{-}
en ratones C57BL/6 causó un 100% de mortalidad de vida al
desarrollo de tumores letales, fig. 14. Cuando se trataron varias
veces a estos animales con el anticuerpo anti-CD69
2.2, antes y después de la inoculación de las células tumorales, un
80% de los ratones sobrevivieron sin evidencias de desarrollo
tumoral, fig. 14, tendencia que también se observó cuando se trató
a estos animales con una sola dosis del anticuerpo (Fig. 14, y
datos no mostrados). De igual manera, el tratamiento de ratones
SCID con el mismo anticuerpo también inhibió el crecimiento de
tumores inducidos por RMA-S, lo que indica que
algunos de los efectos antitumorales persisten en ausencia de
linfocitos T o B.
Por otra parte, los ratones tratados con
anti-CD69 fueron capaces de eliminar a las células
de la línea RM-1, observándose un número muy
pequeño de metástasis pulmonares en dichos ratones (1.25 \pm
0.9), mientras que los ratones tratados con un control de isotipo
eran incapaces de limitar el desarrollo de metástasis pulmonar
inducido por estas células, observándose una media de 21.5 \pm
5.5 metástasis tras 14 días desde la inyección intravenosa de
10^{4} células RM-1.
El efecto in vivo del tratamiento con
anticuerpos anti-CD69 en el crecimiento tumoral se
examinó ex vivo en células peritoneales extraídas 3 días
después de la inoculación intraperitoneal de 2 \times 10^{6}
células RMA-S. El análisis de las células
peritoneales de ratones tratados con el anticuerpo 2.2 o un control
de isotipo demostró que el tratamiento con el anticuerpo inhibía la
proliferación de las células tumorales en el peritoneo (3 \times
10^{6} en ratones tratados con el anticuerpo vs. 20 \times
10^{6} células en el control de isotipo). Se observaron
diferencias similares cuando se analizaron las células peritoneales
de ratones RAG^{1-/-} tratados con el anticuerpo
anti-CD69; se detectó un crecimiento exacerbado de
las células RMA-S en los ratones control, pero no
se hallaron estas células en un 75% de los ratones tratados con
anti-CD69, fig. 14. Por tanto, la eliminación de
los tumores inducida por CD69 ocurre durante la respuesta
inmunitaria temprana, y es eficaz en ausencia de linfocitos T y
B.
Para determinar el efecto de CD69 en la
respuesta de anticuerpos, se inyectó DNP-KLH en
ratones WT y deficientes para CD69. Varios adyuvantes distintos
(CFA o Alum) y distintas rutas de inmunización (i.p. o s.c. en la
base de la cola) se ensayaron. Además, el protocolo de
administración de DNP-KLH descrito en (Lauzurica
et al. (2000) Blood 95:2312-2320) se
ha revisado. La dosis de antígeno se aumentó a 100 g/inyección y la
segunda inyección fue a día 21, para permitir el adecuado
desarrollo de la reacción del centro germinal. Los resultados de
estos experimentos se muestran en la fig. 17. En la primera
inmunización con DNP-KLH, los niveles más altos de
la respuesta IgM se obtuvieron con la administración i.p. del
antígeno, pero la mayor diferencia (p=0.019) se obtuvo en la
administración s.c. de CFA-DNP-KLH,
fig. 17 (a). El nivel de subtipos de IgG fue bajo (medido a dilución
de suero 1:2000), como corresponde a la respuesta primaria y no
reveló cambios significativos entre los ratones WT y deficientes
para CD69 (no mostrado).
En la inmunización secundaria con
DNP-KLH, la administración i.p. fue la más efectiva
en la inducción de IgM, sin mostrar diferencias significativas,
fig. 17 (b). Los niveles de isotipos IgG fueron altos (los
resultados se muestran a una dilución de suero de 1:10000-
1:20000). Las diferencias más relevantes se encontraron para la
respuesta IgG2c a CFA-DNP-KLH
independientemente de la ruta de administración, aunque la vía i.p.
fue más efectiva fig. 17 (b). También aumentaron la IgG2b e IgG3 en
respuesta a CFA-DNP-KLH
administrado i.p., fig. 17 (b).
Respecto al adyuvante, se encontraron sólo
diferencias significativas cuando se uso CFA. Estos resultados
sugieren que adyuvantes que promuevan las respuestas Th1, tales
como CFA, permiten detectar la respuesta Th1 exacerbada en los
ratones deficientes para CD69 más fácilmente que un adyuvante
empleado para aumentar las respuestas Th2, como la Alum.
También la ruta de administración muestra
distintos resultados, puesto que la administración i.p. de
DNP-KLH rindió respuestas de anticuerpos más
efectivas que la inmunización s.c. Además, la naturaleza del
antígeno puede desempeñar un papel diferente en la respuesta
inmune, puesto que el DNP-KLH es un antígeno
externo, y el colágeno tipo II, promueve una reacción contra un
autoantígeno. En conclusión, se han hallado similitudes
significativas entre este sistema de inmunización y la inmunización
secundaria con colágeno tipo II (Fig. 2d), que es los aumentos
significativos de los isotipos específicos IgG2c, IgG2b, e IgG3 en
los ratones deficientes para CD69.
Animales. Los ratones se cruzaron y
mantuvieron de acuerdo con protocolos de seguridad animal en el
Centro Nacional de Biotecnología (Madrid, Spain). Todos los
experimentos se realizaron en la cepa C57BL/6, expecto los
experimentos de desarrollo tumoral en RAG2^{-/-}, que se
realizaron en animales de la cepa BALB/c. Tanto los ratones control
como los CD69^{-/-} tenían de 6 a 12 semanas en el momento de
realización de los experimentos. Como control se emplearon ratones
compañeros de jaula o animales de exactamente la misma edad cuyos
progenitores eran compañeros de jaula. Los ratones RAG1^{-/-} y
RAG2^{-/-} se compraron a Jackson Labs (Bar Harbor, Maine, USA).
Para la generación de los ratones doblemente deficientes en RAG2 y
CD69, se comprobó el estado del locus RAG a través la
ausencia de células T CD3^{+} por citometría de flujo. El
genotipaje del locus CD69 se realizó mediante la reacción en cadena
de la polimerasa como se ha descrito previamente (Lauzurica et
al., 2000).
Inducción y valoración de AIC. Se preparó
el CFA disolviendo 100 \mug de M. tuberculosis inactivado
por calor (cepa H37Ra; Difco, Detroit, Michigan, USA) en 20 ml de
IFA (Adyuvante Incompleto de Freund). El CII (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, Missouri, USA) se disolvió a una concentración de 2
mg/ml en 10 mM de ácido acético y se mezcló en una proporción 1:1
con CFA. La emulsión resultante se inyectó en la base de la cola
de los animales y se repitió el tratamiento a día 21 como se ha
descrito previamente (Campbell et al., 2000; Campbell et
al., 2001). Se empleó el mismo protocolo con la cepa de ratones
DBA1 (Harlan, Madison, Wisconsin, USA), empleando CFA en el que se
había disuelto 1 mg/ml de M. tuberculosis inactivado por
calor. Los animales control se trataron con CFA sin CII. Se
monitorizó la gravedad de la artritis por examen directo de las
patas con un calibre digital de acuerdo con la siguiente escala:
grado 0, sin inflamación detectable; 1, ligero enrojecimiento y
eritema; 2, inflamación pronunciada; 3, rigidez articular. Se midió
cada pata por separado, obteniéndose una puntuación máxima de 12
por cada animal.
Tras el sacrificio, se seleccionaron
aleatoriamente las patas, se fijaron, descalcificaron y embebieron
en parafina. Posteriormente, se tiñeron las secciones (5 mm de
espesor) con hematoxilina y eosina, y se cuantificaron de acuerdo
con el siguiente baremo: 0, ausencia de inflamación; 1, ligero
engrosamiento de la zona de células sinoviales y/o presencia de
algunas células inflamatorias en la periferia; 2, engrosamiento de
los límites de la zona sinovial, infiltración de la zona
subperiférica y erosiones localizadas en el cartílago; 3, infiltrado
en el espacio sinovial, pannus, destrucción del cartílago y erosión
ósea.
Bloqueo del TGF-\beta. El anticuerpo
bloqueante contra TGF-R 1D11.16.8 (hibridoma de
ratón, isotipo IgG1, adquirido en la ATCC, Manassas, Virginia,
USA), y descrito previamente (Dasch et al., 1989) se preparó
a 2 mg/ml. El tratamiento de los animales se realizó mediante la
inyección subcutánea de 25 l de PBS conteniendo el anticuerpo, un
control de isotipo o nada, aplicándose cada 2 días desde la segunda
inyección de CII (día 21), monitorizándose la inflamación
diariamente. Por otra parte, el efecto del bloqueo de
TGF-\beta en la inducción de tumores se realizó
por administración de 0.5 mg del mismo anticuerpo contra
TGF-\beta, inoculado los días -3, -1, y +1 y una
vez por semana a partir de esto, tomando como referencia (día 0)
el día de inoculación de las células tumorales.
Ensayos de proliferación. Se cultivaron
las células extraídas de los nódulos linfáticos y el bazo (2
\times 10^{5}) en 200 ml de medio RPMI1640 suplementado con 50
\muM 2-mercaptoetanol y 10% de suero bovino de
ternera, y en presencia de una concentración de 0 a 50 \mug/ml de
CII desnaturalizado (100ºC, 10 min) durante 60 h. Se añadió después
1 \muCi/pocillo de ^{3}H-TdR (Amersham, Little
Chanfot, England) y se mantuvo otras 12 h, antes de su recolección
en filtros de fibra de vidrio para la determinación de la
incorporación metabólica de ^{3}H-TdR.
Detección de anticuerpos contra CII. Se
realizaron experimentos de ELISA para la detección de anticuerpos
contra CII como se ha descrito previamente (Campbell et al.,
1998). Se emplearon secundarios conjugados con HRP específicos de
los isotipos IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgM (Southern
Biotechnology, Birmingham, Alabama, USA) e IgA (Sigma).
Aislamiento de células sinoviales. Las células
sinoviales de ratón se aislaron mediante protocolos adaptados de la
extracción del mismo tipo celular en humanos (Butler et al.,
1997), y el posterior fraccionamiento de los subtipos de células se
realizó mediante el empleo de microesferas magnéticas (Miltenyi
Biotec, Bergisch, Alemania) y anticuerpos específicos conjugados con
biotina (BD-Pharmingen), lo que resultó en
poblaciones de alrededor de un 98% de pureza.
Ensayos de protección de RNasa (RPA) y
análisis por RT-PCR cuantitativa en tiempo real.
Se homogeneizaron las articulaciones en un Polytron® (Kinematica,
Littau, Suiza) y se purificó el RNA total empleando Ultraspec RNA
(Biotecx, Houston, Texas, USA). En los ensayos de tumores, se
extrajo el RNA de células sinoviales sin fraccionar. Se realizaron
los ensayos de protección de actividad RNasa en
2.5-5 \mug de RNA empleando el sistema de RPA
Riboquant Multiprobe (Pharmingen, San Diego, California, USA). Para
la RT-PCR, se transcribieron 2 \mug de RNA
tratado con DnasaI con la enzima RT MuLV (Roche Diagnostics Ltd.,
Lewes, Reino Unido). La PCR en tiempo real se realizó en un
sistema termociclador rápido Lightcycler (Roche) empleando
cebadores pertenecientes a diferentes exones que generaron
productos de alrededor de 200 pb.
Anticuerpos anti CD69. Se generaron
anticuerpos específicos mediante la fusión de células de mieloma de
la línea NS-1 con esplenocitos de ratones
CD69^{-/-} (Lauzurica et al., 2000), previamente
inmunizados con células pre-B de ratón que
expresaban CD69. Se purificaron dichos anticuerpos y se emplearon
en experimentos de producción de citocinas in vitro.
Tratamiento in vivo con
anti-CD69. Para la evaluación del efecto del
tratamiento con anti-CD69 en la AIC, se inocularon
ratones con 300 \mug de los anticuerpos anti-CD69
de ratón 2.2 (IgG1) o 2.3 (IgG2a), como tratamiento preventivo
(días 20 y 28) o terapeútico (días 32 y 40) y se monitorizó la
inflamación de las extremidades. Como control se isotipo se
emplearon los anticuerpos 2.8 (IgG1) y 2.22 (IgG2a). Para el
tratamiento de tumores, se inyectaron intraperitonealmente 500
\mug de anticuerpo 2.2 (días +4, +8, +12) o 100 \mug de 2.3
(-1, +2, +4, +8). En los ratones SCID se inyectaron 500 \mug del
anticuerpo 2.2 (días -1 y +6), y en los RAG1^{-/-} se inyectaron
500 \mug de 2.2 el mismo día de la inoculación de las células
tumorales. La inoculación de los anticuerpos fue por vía
intraperitoneal en todos los casos.
Determinación de la producción de citocinas
en AIC. Para determinar los niveles de citocinas en los lavados
de tejido articular, se sacrificaron ratones (día 50), se
extrajeron las patelas con el sinovio adyacente de las
articulaciones de las rodillas de acuerdo con protocolos estándar
(Lubberts et al., 2000), y se incubaron durante 1 h a
temperatura ambiente en 200 \mul de medio de cultivo RPMI1640 con
0.1% BSA. Posteriormente se determinaron en los sobrenadantes de
cultivo los niveles de TGF-\beta1 activo y total
(Emax ImmunoAssay System; Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA),
IL-1\beta, TNF-\alpha y RANTES
(OptEIA ELISA Sets; BD-Pharmingen). Para la
producción in vitro de citocinas, se incubaron esplenocitos
de ratón (pre-estimulados con 5 \mug/ml de
Con-A (Sigma) durante 16 h y purificados como se ha
descrito previamente) con 10 \mug/ml de anti-CD69
(clon 2.2) o con un control de isotipo (IgG1) y 20 mug/ml de
suero de cabra contra IgG de ratón, específico contra el fragmento
Fc (F(ab')_{2}, Jackson Immunoresearch, West Grove,
Pennsylvania, USA). Tras 24 h de cultivo, se determinaron los
niveles de TGF-\beta1 activo y total,
IL-1\beta, TNF-\alpha y RANTES.
Finalmente, se determinaron los niveles de
TGF-\beta1 en leucocitos (1 \times 10^{6})
obtenidos de las articulaciones de pacientes de enfermedades
inflamatorias de las articulaciones (RA, artritis reactiva o
espondilitis anquilosante) y tratados durante 24 h con el
anticuerpo contra CD69 humano TP1/8 o con un control de isotipo,
en presencia o ausencia de entrecruzador.
Medida de la producción de
TGF-\beta y MCP-1 por ELISA
durante la respuesta antitumoral. Se realizaron dichas medidas
en linfocitos T CD3^{+} purificados a partir de suspensiones de
nódulos linfoides y bazos de ratones de las cepas C57BL/6 o BALB/c.
Los linfocitos T CD3^{+} se aislaron mediante selección por
incubación con un anticuerpo contra MAC-1 seguida
por dos pasos de adhesión a 4ºC a placas de petri tapizadas con un
anticuerpo de conejo contra IgG de ratón (DAKO, Glostrup,
Dinamarca). La pureza media de este protocolo se situó en >95%,
determinada por citometría de flujo. Posteriormente, se
resuspendieron los linfocitos en 200 \mul/punto de medio Stem
Span (Stem Cell Technologies Inc., Vancouver, BC, Canadá) sin
suero, y se estimularon con anti-CD3 (1 \mug/ml)
inmovilizado en placas de plástico de 96 pocillos. Se añadió el
anticuerpo anti-CD69 (clon 2.2, IgG1, \kappa, 20
\mug/ml) o un control de isotipo. Para entrecruzar, se emplearon
20 \mug/ml del fragmento F(ab')2 de un anticuerpo generado
en cabra contra IgG de ratón específico del fragmento Fc (Jackson
Immunoresearch). El inhibidor de MEK1 PD98059 (Calbiochem, LaJolla,
California, USA) se empleó a una concentración 20 \muM y se
añadió 1 h antes que el anticuerpo. Tras 72 h de incubación a 37ºC
y 5% CO_{2}, se tomaron los sobrenadantes y se determinaron los
niveles de TGF-\beta como se ha descrito
previamente. Para la medida de MCP-1, se inyectó 1
ml de tioglicolato (3% p/v, Sigma) intraperitonealmente en ratones
control y CD69^{-/-}. Los ratones fueron sacrificados a las 72 h
y se recuperó el infiltrado leucocitario del peritoneo mediante
lavado peritoneal con 5 ml de medio RPMI1640 + 2% suero de ternera
a 4ºC. Posteriormente, se sembraron las células (2 \times
10^{6}) en 1 ml de medio completo en placas de 24 pocillos y se
estimularon con LPS (1 \mug/m1). Se tomaron los sobrenadantes y
se midió la producción de MCP-1 como se ha descrito
previamente.
Cultivos celulares. Las líneas celulares
empleadas en este estudio fueron: RM1, carcinoma de próstata
(H-2^{b}), cedida por el Dr. T. Thompson, Baylor
College of Medicine, Houston, Texas, USA), YAC-1
(H-2ª) y RMA (H-2^{b}), linfomas,
RMA-S, linfoma mutado derivado de la línea murina
inducida por el virus de Rauscher, y que es deficiente para la
carga peptídica del MHC de clase I, y 300.19, línea
pre-B murina. Todas ellas se mantuvieron a 37ºC con
una atmósfera del 5% de CO_{2} en medio RPMI1640 suplementado con
10% de suero de ternera inactivado por calor, 2 mM
L-glutamina, 100 U/ml penicilina y 100 \mug/ml
estreptomicina (Gibco-Life Sciences, Gaithersburg,
Maryland, USA).
Control tumoral in vivo . Las
células tumorales (RMA, RMA-S o
RM-1 en 200 \mu1 de PBS) se inyectaron subcutánea
o intraperitonealmente en ratones control o CD69^{-/-} sin
tratamiento previo o deplecionados de anticuerpos, como se ha
indicado previamente. En experimentos de eliminación de la
población NK, se inyectaron intraperitonealmente 100 \mul de
anti-Asialo-GM1 (suero de conejo,
Wako Chemicals, Richmond, Virginia, USA) 1 día antes de la
inoculación de los tumores y en días +2 y +4. En experimentos de
eliminación de los linfocitos CD4+, se inocularon 100 ml de
anticuerpo GK1.5 (anti-CD4) o un control de isotipo
a días -1, +2 y +4 respecto a la inducción de tumores. Se monitorizó
la evolución de los tumores mediante pesaje diario de los animales
(desarrollo de líquido ascítico). Por motivos éticos, se
sacrificaron los animales cuando el peso corporal se había
incrementado en un 25%, lo que correspondía inequívocamente a un
crecimiento tumoral irreversible.
Metástasis pulmonar de las células
RM-1. Se inyectaron 10^{4} células RM1 (en
100 \mul de PBS) en la vena de la cola de ratones control y
CD69^{-/-}. Transcurridos 14 días, los animales se sacrificaron,
se extrajeron los pulmones, se fijaron en 4% de paraformaldehído
en PBS y se cuantificaron las metástasis pulmonares mediante un
microscopio de disección.
Citometría de flujo. Se preincubaron las
células (10^{6}) procedentes de exudado peritoneal o del bazo con
una solución bloqueante (PBS conteniendo suero de ternera y de
conejo inactivados por calor al 5% y 15% respectivamente, 0.02%
azida sódica y anticuerpo 2.4G2), que evita la unión de los
anticuerpos a los receptores Fc\gamma. Posteriormente, las células
se incubaron durante 30 min a 4ºC con anticuerpos conjugados con
FITC o PE, o bien anticuerpos biotinilados seguidos de
estreptavidina-FITC o -PE (Southern Biotech). Se
emplearon los siguientes anticuerpos: anti-DX5
(DX5), -2B4 (2B4), -CD3 (145-2C11), -B220/CD45
(RA3-6B2), -CD4 (GK1.5), -CD8 (53.6.7), -CD5
(53-7.3), -CD11b (M1/70) y -CD69 (H1.2F3), todos
ellos de Pharmingen. Finalmente, se lavaron las células con PBS
frío y se analizaron en un citómetro de flujo FACScalibur (Becton
Dickinson, Mountain View, California, USA), analizando 10^{4}
células mediante software CellQuest® (Becton Dickinson). El número
de células recogidas en el peritoneo se determinó mediante un
sistema Coulter Multisizer II (Beckton Coulter, Fullertone,
California, USA).
Obtención de células NK. Se realizó
mediante empleo del sistema CELLection Biotin Binder kit (Dynal,
Oslo, Noruega) junto con el anticuerpo biotinilado
anti-DX5 de acuerdo con las especificaciones del
fabricante. Brevemente, se incubaron las células (1 h a 37ºC) sobre
placas de cultivo de poliestireno (Becton Dickinson). Las células
no adheridas se incubaron durante 15 min a 4ºC con un anticuerpo
biotinilado (DX5), se lavaron 2 veces y se capturaron las células
recubiertas de anticuerpo con microesferas CELLection (1 \times
10^{7} microesferas por cada 1 \times 10^{6} células). La
pureza obtenida fue siempre >95%. Las células NK se mantuvieron
en medio completo (20% FCS) suplementado con 1000 UI/ml de
rIL-2 humana (72 h).
Ensayo de liberación de ^{51}Cr. La
actividad citotóxica directa de las células NK se determinó
mediante experimentos estándar de liberación de ^{51}Cr. En todos
los experimentos se mezclaron 5 \times 10^{3} células diana
YAC-1 marcadas con Na_{2}^{51}CrO_{4} con
células efectoras a las proporciones indicadas (4 h, 37ºC). La
liberación espontánea de ^{51}Cr se determinó incubando las
células diana con medio sin células; la máxima liberación se
determinó incubando las células con 2.5% Tritón
X-100. El porcentaje de lisis específica se calculó
como:
% lisis
específica = [(cpm muestra - cpm espontánea) / (cpm máxima - cpm
espontánea)] \times
100.
Todos los experimentos se realizaron por
triplicado, y la liberación espontánea de Cr fue siempre <
10%.
Ensayos de muerte celular. Los
esplenocitos (4 \times 10^{6}/ml) de ratones inoculados con
células RM-1 (3 días con 10^{5} células) se
cultivaron en placas de 24 pocillos (Costar, Cambridge,
Massachussets, USA), y se determinó la viabilidad celular 24 h
después de iniciarse el cultivo. Se monitorizó el ciclo celular,
se tiñeron las células con yoduro de propidio (IP), y se determinó
la apoptosis por citometría de flujo en un citómetro Coulter XL
(Beckman Coulter). Los datos se expresan como la media aritmética
\pm d.e. (n=9). La actividad caspasa-3 se
determinó a las 48 h de inicio del cultivo por incubación con el
sustrato PhiPhiLux-GID2 (OncoImmunin, College Park,
Maryland, USA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El
análisis por citometría de flujo se realizó inmediatamente después
de los 60 min de incubación. Las células peritoneales (1 \times
10^{6}) de ratones control fueron cultivadas en placas de 24
pocillos y se determinó su viabilidad por tinción con IP. Las
células IP^{+} se consideraron apoptóticas.
Western blot. Se aislaron linfocitos T de
ratones C57BL/6 con anti-CD3 (5 \mug/ml)
inmovilizado en plástico (37ºC, 12 h). Las células se recogieron,
se lavaron 2 veces y se cultivaron 4 h en medio sin suero.
Posteriormente se añadió un anticuerpo contra CD69 (IgG1) o un
control de isotipo a 10 \mug/ml, y se incubaron 30 min a 4ºC en
hielo. A continuación se lavaron las células 2 veces y se añadió un
anticuerpo entrecruzador (generado en cabra contra IgG de ratón,
específico del fragmento Fc, F(ab')_{2},20 \mug/ml). La
reacción se detuvo a los tiempos indicados añadiendo PBS frío, tras
lo cual las células se centrifugaron y lisaron en tampón de lisis
frío (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS p/v, 10%
glicerol, 50 mM DTT, 0.01% azul de bromofenol p/v) suplementado con
inhibidores de proteasas y fosfatasas. Tras centrifugar los lisados
(13000 \times g, 20 min, 4ºC), los sobrenadantes se separaron en
geles de poliacrilamida del 12%, se transfirieron a membrana PVDF
(BioRad, Hércules, California, USA), y se realizaron experimentos
de Western blot con los anticuerpos indicados. El anticuerpo
policlonal anti-fosfo-ERK 1/2 era de
Calbiochem. Se eliminó la señal del blot y se reincubó con un
anticuerpo monoclonal contra ERK 1/2 (Zymed Lab. Inc., San
Francisco, California, USA). Se emplearon secundarios conjugados
con peroxidasa (HRP) y se revelaron las bandas por ECL.
Análisis de viabilidad celular. Se
incubaron los linfocitos T en las mismas condiciones que para
producción de TGF-\beta. La viabilidad celular se
determinó a las 24 y 48 h de cultivo mediante tinción con azul
tripán.
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negatively regulated by CD94 / NKG2-A inhibitory
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Claims (25)
1. Utilización de una cantidad efectiva de un
antagonista de CD69 seleccionado del grupo: una molécula de
anticuerpo humanizada anti-CD69, una molécula de
anticuerpo humana anti-CD69, una molécula de
anticuerpo quimérica anti-CD69 y una molécula de
anticuerpo deinmunizada anti-CD69 para la
fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un sujeto
que necesite o pueda beneficiarse de una respuesta inmune
aumentada.
2. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizada porque dicho desorden se caracteriza por
una respuesta inmune disminuida.
3. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizada porque dicho desorden se basa en tejido o
células no deseados o caracterizados por una proliferación no
deseada de células.
4. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizada porque dicho desorden es cáncer.
5. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizada porque dicho desorden es fibrosis.
6. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizada porque dicho desorden es una
inmunodeficiencia.
7. Utilización de acuerdo con la reivindicación
6, caracterizada porque dicha inmunodeficiencia se
selecciona del grupo: desórdenes de inmunodeficiencia heredada,
desórdenes de inmunodeficiencia congénita, síndrome de
inmunosupresión asociado con radioterapia, y síndrome de
inmunosupresión asociado con quimioterapia.
8. Utilización de un antígeno y/o de un DNA que
codifica para un antígeno, y un antagonista de CD69 seleccionado de
entre una molécula de anticuerpo humanizada
anti-CD69, una molécula de anticuerpo humana
anti-CD69, una molécula de anticuerpo quimérica
anti-CD69 y una molécula de anticuerpo deinmunizada
anti-CD69, para la fabricación de un medicamento
destinado a potenciar la respuesta inmune de dicho antígeno en un
sujeto.
9. Utilización de acuerdo con la reivindicación
8, caracterizada porque dicho antígeno está incluido en una
vacuna.
10. Utilización de una cantidad efectiva de un
anticuerpo eliminador anti-CD69 que se selecciona
del grupo de una molécula de anticuerpo humanizada
anti-CD69, una molécula de anticuerpo humana
anti-CD69, una molécula de anticuerpo quimérica
anti-CD69 y una molécula de anticuerpo deinmunizada
anti-CD69 para la fabricación de un medicamento
destinado al tratamiento de una enfermedad o condición asociada con
una respuesta inmune no deseada en un sujeto.
11. Utilización de acuerdo con la reivindicación
10 caracterizada porque dicho desorden es un desorden
inflamatorio agudo o crónico, o una enfermedad inmune.
12. Utilización de acuerdo con la reivindicación
10, caracterizada porque dicho desorden es una enfermedad
autoinmune.
13. Utilización de acuerdo con la reivindicación
10 caracterizada porque dicho desorden se selecciona del
grupo que consiste en: artritis reumatoide, lupus eritematoso
sistémico, esclerodermia, síndrome de Sjögren, diabetes autoinmune,
tiroiditis, y otras enfermedades inmunes
órgano-específicas, incluyendo la psoriasis.
14. Utilización de acuerdo con la reivindicación
10 caracterizada porque dicho desorden es de tipo
neurológico, gastrointestinal, cardiovascular o respiratorio.
15. Utilización de acuerdo con la reivindicación
14 caracterizada porque dicho desorden es un desorden de
tipo neurológico que se selecciona del siguiente grupo: esclerosis
múltiple, miastenia grave, y otras enfermedades inmunes
neurológicas.
16. Utilización de acuerdo con la reivindicación
14 caracterizada porque dicho desorden es un desorden
gastrointestinal seleccionado del grupo: enfermedad de Crohn,
colitis, enfermedad celíaca, y hepatitis.
17. Utilización de acuerdo con la reivindicación
14 caracterizada porque dicho desorden es un desorden de
tipo respiratorio seleccionado del grupo: enfisema, infecciones de
las vías respiratorias.
18. Utilización de acuerdo con la reivindicación
14 caracterizada porque dicho desorden es un desorden de
tipo cardiovascular seleccionado del grupo: aterosclerosis,
cardiomiopatía, fiebre reumática, endocarditis, vasculitis, y otras
enfermedades cardiológicas de naturaleza inmune.
19. Utilización de acuerdo con la reivindicación
10 caracterizada porque dicho desorden es un proceso
alérgico o una reacción de hipersensibilidad (tipos I, II, III, y
IV), incluyendo asma, rinitis, y otras reacciones de
hipersensibilidad mediadas por el sistema inmune.
20. Utilización de acuerdo con la reivindicación
10 caracterizada porque dicho desorden es el rechazo de un
trasplante o injerto.
21. Utilización de acuerdo con la reivindicación
10 caracterizada por el hecho de que dicho desorden o
condición es: daño de pulmón agudo, síndrome de distress
respiratorio agudo, artritis (p.e., CIA), bronquitis, fibrosis
cística, enfermedad inflamatoria intestinal, daño por reperfusión,
nefritis, pancreatitis, oclusión arterial, accidente
cerebro-vascular, daño inducido por luz
ultravioleta, vasculitis, y sarcoidosis.
22. Utilización de una cantidad efectiva de una
molécula de anticuerpo eliminador anti-CD69
seleccionado de entre una molécula de anticuerpo humanizada
anti-CD69, una molécula de anticuerpo humana
anti-CD69, una molécula de anticuerpo quimérica
anti-CD69 y una molécula de anticuerpo deinmunizada
anti-CD69, para la fabricación de un medicamento
destinado al tratamiento del cáncer que expresa CD69 en un
sujeto.
23. Utilización de acuerdo con la reivindicación
22 caracterizada porque el cáncer que expresa CD69 es un
linfoma y el linfoma se selecciona de entre un linfoma de células T
(incluyendo linfomas T periféricos, leucemia/linfoma de células T
del adulto, linfoma cutáneo de células T, leucemia de linfocitos
grandes granulares), un linfoma de células B, un linfoma de
Hodgkin y un linfoma de Hodgkin y sus variantes.
24. Utilización de acuerdo con la reivindicación
22 caracterizada porque el cáncer que expresa CD69 es una
leucemia linfática y la leucemia linfática se selecciona de entre
leucemias agudas poco diferenciadas, p.e., leucemia aguda
megacarioblástica; desórdenes mieloides, incluyendo, pero sin
limitarse a, leucemia aguda promieloide, leucemia aguda mieloide y
leucemia mielogénica crónica; tumores linfoides, incluyendo pero
sin limitarse a, leucemia linfoblástica aguda, que incluye las del
linaje B y T, leucemia linfática crónica, leucemia
pro-linfocítica, leucemia de células peludas y
macroglobulina de Waldenstrom.
25. Utilización de acuerdo con la reivindicación
22 caracterizada porque el cáncer que expresa CD69 es un
tumor no hematopoyético que expresa CD69 de manera ectópica.
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