TWI596112B - 抗-cxcr3抗體 - Google Patents

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Description

抗-CXCR3抗體
本申請案根據35 U.S.C.§ 119主張於2012年1月20日提出申請之美國臨時申請案第61/588,936號之優先權的益處,其以整體引用方式併入本文中。
本發明係關於抗體及使用抗體治療與CXCR3信號傳導相關之病症(例如1型糖尿病(I型糖尿病;T1D))之方法。
糖尿病之特徵在於因缺乏胰島素作用所致之慢性高血糖症以及各種特徵性代謝異常。糖尿病可廣義地分為I型及II型。T1D之特徵在於損失蘭格爾罕氏島(Langerhans' islet)之胰腺β細胞,而II型糖尿病之特徵在於胰島素分泌及胰島素敏感性二者降低(胰島素抵抗)。在美國,糖尿病之盛行率係群體之約2%至4%,其中I型糖尿病(亦稱作胰島素依賴性或IDDM)佔所有病例之約7%至10%。
I型糖尿病之特徵在於無法產生足量胰島素以維持葡萄糖穩態。人們相信此病症係由自體免疫介導之對胰腺β細胞之破壞引起。與I型糖尿病相關之自體免疫性涉及B與T自體反應性淋巴球二者之參與。實際上,高達98% I型糖尿病患者具有抗一或多種其自身β細胞抗原及異源性胰島細胞胞質抗原(ICA)之抗體,該等自身β細胞抗原包括胰島素、麩胺酸去羧酶(GAD)、胰島素瘤抗原-2及胰島素瘤抗原-2b(IA-2及IA-2β)。儘管可能並非總是起決定性作用,但一或多種自體抗體之含量通常與β細胞破壞相關。Irvine等人,Diabetes,26:138-47 (1997);Riley等人,N.Engl.J.Med.,323:1167-72(1990)。因此,自體抗體可用作發生自體免疫糖尿病之指示物且可與代謝變化一起預測在T1D患者之親屬中產生糖尿病之風險。
I型糖尿病之發生可由自體反應性T細胞介導,如藉由在T1D診斷時獲得之組織生檢切片所證明,該等組織生檢切片顯示受經活化T細胞浸潤之胰島。Bottazzo等人,N.Engl.J.Med.,313:353-60(1985);Hanninen等人,J.Clin.Invest.,90:1901-10(1992);Itoh等人,J.Clin.Invest.,92:2313-22(1993);Imagawa等人,Diabetes,50:1269-73(2001)。
趨化因子(C-X-C基序)受體3(CXCR3)(亦稱作G蛋白偶合受體9(GPR9)、CD183、IP-10受體及Mig受體)係在自體反應性T細胞上表現之趨化因子受體,其與一系列生理過程及相關病症(例如T1D)相關。CXCR3幾乎不存在於初始T細胞中,但在經抗原活化後上調且因應其一級配體(CXCL9、CXCL10及CXCL11)將經活化細胞募集至組織發炎位點。已顯示,在T1D之小鼠模型(Christen等人,The Journal of Immunology,2003,171:6838-6845;Morimoto等人,J Immunol 2004;173;7017-7024;Sarkar等人,Diabetes.2012年2月;61(2):436-46)中及在患有胰島炎之T1D患者之胰島(Uno等人,2010;Roep等人,Clinical and Experimental Immunology,2003,159:338-343;Sarkar等人,Diabetes.2012年2月;61(2):436-46)中,β細胞主要表現CXCL10,CXCL9之含量較低。另外,已顯示,在T1D小鼠模型中及在1型糖尿病患者胰腺試樣中,已浸潤胰腺之T細胞表現CXCR3(Christen等人,The Journal of Immunology,2003,171:6838-6845;Van Halteren等人,Diabetologia 48:75-82(2005);Uno等人,2010;Roep等人,Clinical and Experimental Immunology,2003,159:338-343;Sarkar等人,Diabetes.2012年2月;61(2):436-46)。此外, CXCR3缺陷剔除小鼠顯示發作顯著延遲及T1D發病率降低(Frigerio等人,Nature Medicine 8:1414-1420(2002)),而CXCL10在轉基因小鼠胰島中過表現促進T細胞浸潤並加速T1D發作(Rhode等人,J.Immunol.175(6):3516-24(2005))。已顯示,藉由抗體治療中和CXCL10具有保護性(Christen等人,The Journal of Immunology,2003,171:6838-6845)。
已在人類中鑑別CXCR3有三種亞型,表示為A、B及Alt(Lasagni等人,J.Exp.Med.2003 197:1537;Ehlert等人,J.Immunol.2004;173;6234-6240)。CXCR3-A結合至CXC趨化因子CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)及CXCL11(I-TAC);CXCR3-B亦結合至該等靶標,且亦結合CXCL4;CXCR3-Alt似乎與CXCL11相互作用。儘管選擇式剪接產生CXCR3之若干蛋白亞型,但CXCR3-A係活體內主要形式,此乃因CXCR3-B及CXCR3-Alt在蛋白層面上之表現量遠遠更低。Lasagni等人,J.Exp.Med.2003 197:1537;Ehlert等人,J.Immunol.2004;173;6234-6240。
尚未證明使用CXCR3之小分子抑制劑破壞CXCR3途徑之努力完全有效。Christen等人,Clin Exp.Immunol.165:318-328(2011)。因此,研究集中於主要在糖尿病發作前破壞CXCL10之抗體及其他方法。Morimoto等人,J.Immun.173:7017-7024(2004);Oikawa等人,Rev.Diabet.Stud.7:209-224(2010)。
鑒於與CXCR3有關之T1D及其他病症之盛行,業內需要靶向CXCR3信號傳導之其他方法,以(例如)治療患者之諸如T1D等病症或降低其進展。
本文揭示能夠結合至CXCR3之抗體及其使用方法。在一些實施例中,該等抗體可用於藉由靶向CXCR3途徑來預防、治療個體之T 1D或降低其早期進展。該等抗體及方法至少部分地依賴於以下令人驚訝 之結果:針對CXCR3之中和抗體在疾病發作前投與時可預防NOD小鼠之T1D之發作,或在NOD小鼠之T1D之新發階段投與時可逆轉疾病進程。此外,中和CXCR3活性並不與患者免疫系統之正常運行顯著受損相關,藉此降低抗體療法之不合意副效應。
因此,在一個態樣中,本文揭示能夠中和CXCR3活性之抗體及抗原結合片段。在某些實施例中,CXCR3中和抗體之特徵可在於能夠結合至選自SEQ ID NO:1之殘基1-58、1-16或1-37之肽。在一些實施例中,抗體包含全部或部分命名為Cl 12、Cl 135、Cl 82、Cl 53及/或Cl 4之抗體純系(Cl)。在某些實施例中,提供抗體Cl 12、Cl 135、Cl 82、Cl 53及/或Cl 4之變體,包括所揭示抗體之CDR-移植、人類化、回復突變及完全人類變體。在特定實施例中,抗體包含本文所揭示純系Cl 12、Cl 135、Cl 82、Cl 53及/或Cl 4或純系4、12、53、82及135之任一變體之一或多個互補決定區(CDR),例如,一或多個重鏈CDR1、CDR2及CDR3及/或一或多個輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中,來自Cl 12、Cl 135、Cl 82、Cl 53及/或Cl 4之抗體或其嵌合及人類化形式與抗CXCR3純系5H7、7H5、V44D7、1C6及/或49801相比展現某些有益性質。例如,本文所揭示抗體與抗hCXCR3純系5H7、7H5、V44D7、1C6及49801相比可展現增加之結合親和力。例如,該抗體可相對於抗CXCR3抗體(例如1C6)展現1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更大之親和力(或其間之任何值),例如,如藉由表面電漿共振(例如,使用BIACORETM分析)所量測。亦預測本文所揭示人類化抗體與小鼠抗hCXCR3純系5H7、7H5、V44D7、1C6及49801相比在免疫原性方面有所降低。另外,本文所揭示純系4.7-4.11之重鏈已經最佳化以去除58位及59位之去醯胺位點(使用IMGT編號)且藉此相對於初始小鼠抗hCXCR3重鏈可變域(VH)CDR2序列增強穩定性。
在另一態樣中,本發明藉由投與有效量之CXCR3中和抗體提供 在個體T1D發作前進行預防之方法以及治療新發作T1D或減少其進展之方法。在特定實施例中,個體係哺乳動物,例如,人類。
在某些實施例中,在臨床診斷後6個月內藉由本文所揭示方法治療患有新發作T1D之個體。在其他實施例中,在臨床診斷後超過6個月治療個體,其中該個體保留至少約0.2 nmol/L之殘餘空腹積分血清C肽濃度。
在一些實施例中,個體之特徵可在於在外源性胰島素不存在下高於120 mg/dL之升高空腹血糖濃度或在C肽刺激期間約0.033 nmol/L×min至1.0 nmol/L×min之異常低之空腹積分血清C肽濃度。在特定實施例中,CXCR3中和抗體係以約0.03-3.7 mg/kg/劑量之劑量投與。在一些實施例中,向個體投與至少一劑量抗體。在某些實施例中,向個體投與重複劑量之抗體(例如,至少每年一次、每季一次、每兩月一次、每月一次、每兩週一次、每週一次或每天一次)。在其他實施例中,上述方法可進一步包含在投與CXCR3中和抗體同時或依序(之前或之後)投與免疫抑制劑及/或β細胞刺激劑之步驟。
在各實施例中,投與本文所揭示抗CXCR3抗體以治療特徵在於異常CXCR3表現之病況。在一些實施例中,投與抗CXCR3抗體以治療可自CXCR3活性下調及/或中和受益之任何病況。在一些實施例中,投與本文所揭示抗CXCR3抗體以治療T1D。
本發明之其他實施例及優點將在下文說明中部分地加以陳述,且根據本說明將部分地顯而易見,或者可藉由實踐本發明而知曉。將藉助隨附申請專利範圍中特別指出之要素及組合實現並達成本發明之實施例及優點。
應瞭解,上文一般說明及下文詳細說明二者僅具有實例性及闡釋性,且並非限制所主張之本發明。
併入本說明書中並構成本說明書之一部分的附圖闡釋本發明之 一個(若干個)實施例,且與本說明一起用於解釋本發明原理。
圖1顯示來自6週齡雌性NOD小鼠(第一列)、10週齡雌性NOD小鼠(第二列)及新發作糖尿病雌性NOD小鼠(第三列)之胰腺切片中之胰島素(左面板)、CXCL10(中面板)及CD3(右面板)之表現。
圖2係對來自患有新發作糖尿病之雌性NOD小鼠之胰腺之T細胞之CXCR3表現的流式細胞術分析。鑑別CD4+及CD8+ T細胞且針對CXCR3表現進行染色,如藉由底部兩個圖中之實線所顯示。同種型對照染色係在相同的兩個圖中由陰影曲線來顯示。
圖3顯示對於於10週齡開始用PBS、抗CXCR3及對照IgG治療之動物而言,在糖尿病發作前無糖尿病雌性NOD小鼠隨時間之百分比。兩次獨立研究之結果示於圖3A及3B中。
圖4顯示來自於10週齡開始用抗CXCR3抗體預防性治療且針對胰島素(左面板)或CD3/Foxp3(中面板及右面板)染色之26週齡無糖尿病雌性NOD小鼠之胰腺切片。右面板係中面板中所示切片之放大率增加之影像。
圖5顯示在認為小鼠患有糖尿病後3-4天內開始用PBS、抗CXCR3抗體、對照IgG及鼠類抗胸腺細胞球蛋白(鼠類抗胸腺細胞免疫球蛋白,mATG)抗體治療之雌性NOD小鼠每天之早上血糖值。各線代表個別小鼠。箭頭指示提供治療之時間。
圖6A係顯示來自用PBS、抗CXCR3抗體、對照IgG及mATG抗體治療之雌性NOD小鼠之CD4+(左圖)及CD8+(右圖)之T細胞百分比的條形圖。在治療進程期間在第五次注射測試物件後自小鼠收穫胰腺且自年齡匹配之經mATG治療之小鼠收穫胰腺。圖6B係來自用PBS、對照抗體或抗CXCR3抗體治療之小鼠胰腺之CD4+ T細胞之CD44表現(縱軸)對CD62L表現(橫軸)的繪圖。G1及G2分別係指經設門高CD44/低 CD62L及低CD44/低CD62L T細胞。圖6C顯示與用同種型對照抗體染色且針對淋巴球設門之細胞之CXCR3表現相比,G1及G2中之CD4+ T細胞之CXCR3表現。
圖7顯示來自用對照IgG(左面板)、抗CXCR3抗體(中面板)及mATG(右面板)治療且針對胰島素(頂列)或CD3/Foxp3(底列)染色之雌性NOD小鼠之胰腺切片。
圖8A-D係年齡匹配無糖尿病雌性NOD小鼠(圖8A)、用PBS治療之糖尿病NOD小鼠(圖8B)、在抗CXCR3抗體治療後疾病緩解之NOD小鼠(圖8C)及用對照IgG抗體治療之糖尿病NOD小鼠(圖8D)在葡萄糖篩查後血糖含量之曲線圖。在初始糖尿病診斷及研究募集後100天對小鼠實施葡萄糖篩查。各線代表個別動物之數據。
圖9A-B顯示對於接受自用PBS、抗CXCR3、對照IgG或mATG抗體治療之雌性NOD小鼠分離之經彙集供體CD4+及CD8+ T細胞之NOD.Scid接受者而言,無糖尿病小鼠隨時間之百分比。T細胞係在用PBS或對照IgG治療後約80-90天自糖尿病雌性NOD小鼠分離,或在用抗CXCR3或mATG抗體治療後約80-90天自疾病緩解之雌性NOD小鼠分離。兩次獨立研究之結果示於圖9A及9B中。
圖10A顯示如圖9中所示自用PBS、抗CXCR3、對照IgG或mATG抗體治療之雌性NOD小鼠分離之CD4+及CD8+供體T細胞之百分比(左面板)。各治療組之CD4+及CD8+ T細胞供體彙集物中之效應及中央記憶細胞的百分比示於圖10A之右面板中。圖10B顯示供體T細胞彙集物中藉由CD4及CD25之表現或藉由CD4、CD25及Foxp3之表現所鑑別之調節性T細胞之百分比。圖10C顯示供體T細胞彙集物中亦表現CXCR3之CD8+(左面板)及CD4+(右面板)之百分比。
圖11A-B顯示在將來自供體OVA特異性TCR轉基因小鼠之T細胞授受性轉移至保持未經治療或用抗CXCR3抗體或對照IgG治療之RIP- OVA接受者小鼠中後,無糖尿病小鼠隨時間之百分比。兩次研究之結果示於圖11A及11B中。
圖12A顯示在授受性轉移至RIP-OVA接受者小鼠中之前藉由流式細胞術所分析供體T細胞之CXCR3表現(實線曲線)。用同種型對照抗體染色示於陰影曲線中。圖12B顯示在授受性轉移後第2天、第4天、第7天、第9天及第15天用抗CXCR3或對照IgG抗體治療之接受者小鼠之血液、脾及胰腺淋巴結中供體細胞的百分比。圖12C顯示在授受性轉移後用抗CXCR3或對照IgG抗體治療之接受者小鼠之血液、脾及胰腺淋巴結中增殖性供體細胞的百分比。圖12D顯示在授受性轉移後用抗CXCR3或對照IgG抗體治療之接受者小鼠之血液、脾及胰腺淋巴結中CXCR3+供體細胞的百分比。
圖13顯示來自保持未經治療且針對胰島素(左上)或CD3(右上)染色或用抗CXCR3抗體治療且針對胰島素(左下)或CD3(右下)染色之RIP-OVA接受者小鼠之胰腺切片。在授受性轉移供體T細胞後60天收穫胰腺。
圖14A-C顯示由純系Cl 4、12、53、82及135介導之對CXCR3介導之向CXCL11之趨化性的抑制程度。數據顯示為在趨化性分析中遷移之細胞之平均相對螢光單位(RFU)。圖14D顯示抗體純系Cl 4、12、53及135將鈣動員抑制50%所需之抗體濃度。
圖15A-C顯示由純系Cl 4、12、53、82及135介導之對CXCR3介導之向CXCL9(圖15A)、CXCL10(圖15B)及CXCL11(圖15C)之趨化性的抑制程度。數據顯示為在趨化性分析中遷移之細胞之平均相對螢光單位(RFU)。
圖16顯示抗體與表現各種不同趨化因子受體之細胞結合的直方圖。各直方圖中結合抗體之濃度沿橫軸增加。
圖17A顯示純系4.0(經標記「親本」)及某些人類化變體(經標記 VH1-3及7-11及VK 1-3)之重鏈(VH)及輕鏈(VK)可變域之比對。圖17B顯示純系12.0(經標記「親本」)及某些人類化變體(經標記VH1-3及VK 1-3)之重鏈(VH)及輕鏈(VK)可變域之比對。圖17C顯示純系53.0(經標記「親本」)及某些人類化變體(經標記VH1-6及VK 1-9)之重鏈(VH)及輕鏈(VK)可變域之比對。圖17D顯示純系82.0(經標記「親本」)及某些人類化變體(經標記VH1-3及VK 1-3)之重鏈(VH)及輕鏈(VK)可變域之比對。圖17E顯示純系135.0(經標記「親本」)及某些人類化變體(經標記VH1-3及VK 1-3)之重鏈(VH)及輕鏈(VK)可變域之比對。圖17F顯示純系4.0(經標記「親本」)及某些4D人類化變體(經標記VH4-6及VK4-7)之重鏈(VH)及輕鏈(VK)可變域之比對。圖17G顯示純系53.0(經標記「親本」)及某些4D人類化變體(經標記VH7-10及VK10-13)之重鏈(VH)及輕鏈(VK)可變域之比對。圖17A-G中各比對中之底部序列代表最接近之人類種系序列。黑框指示CDR域,陰影殘基之序列與對應種系殘基(圖17A-E)或對應親本殘基(圖17F-G)有所不同,使用IMGT編號及CDR劃界。圖17H顯示純系4.0、12.0、82.0及135以及抗體純系5H7及7H5之重鏈(VH)及輕鏈(VK)可變域之比對。黑框指示CDR域,陰影殘基之序列與比對中之先前序列有所不同,使用IMGT編號。
圖18顯示抗體純系4、12、53、82及135之最小表位殘基之邊界。對於結合活性至關重要之殘基指示為X。
圖19係顯示嵌合純系4、12、53、82及135以及人類化變體Hu1、Hu2、Hu3在人類CXCR3轉染300.19細胞中之抗體結合的直方圖。抗體係以5 μg/ml(黑線)、0.5 μg/ml(深灰線)或0.1 μg/ml(黑虛線)或5 μg/ml單獨之二級抗體(填滿灰色之直方圖)投與,且將數據繪製為細胞數(橫軸)對最大螢光百分比之曲線。
圖20A-C顯示在10 μg/ml純系4、12、53、82及135或商業純系 1C6之嵌合(Chim)或人類化(Hu1、Hu2或Hu3)抗體變體存在或不存在下,對人類CXCR3轉染細胞向CXCL9(圖20A)、CXCL10(圖20B)及CXCL11(圖20C)遷移之抑制百分比(縱軸)。
圖21係顯示純系4、12、53、82及135以及商業純系1C6之嵌合(Chim)及人類化(Hu1、Hu2或Hu3)抗體變體抑制人類CXCR3-Gqi4qi4轉染CHO細胞中之鈣動員之能力的曲線圖。繪製抗體濃度(橫軸)對最大抑制百分比(縱軸)之曲線。
圖22A-D顯示抗CXCR3抗體治療對NOD-scid IL2rγ無效(NSG)小鼠中CD3+/CD4+ T細胞(圖22A)、CD3+/CD8+ T細胞(圖22B)、CXCR3+/CD3+/CD4+ T細胞(圖22C)及CXCR3+/CD3+/CD8+ T細胞(圖22D)之百分比之效應。HuIgG1指示人類IgG1(Herceptin),純系4、12、53、82及135係指嵌合抗體純系。
圖23A繪示純系12.0之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖23B繪示純系12.1之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖23C繪示純系12.2之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖23D繪示純系12.3之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。
圖24A繪示純系135.0之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖24B繪示純系135.1之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖24C繪示純系135.2之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖24D繪示純系135.3之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。
圖25A繪示純系4.0之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖25B繪示純系4.1之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖25C繪示純系4.2之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖25D繪示純系4.3之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖25E繪示純系4.4之重鏈之胺基酸序列。圖25F繪示純系4.5之重鏈之胺基酸序列。圖25G繪示純系4.6之重鏈之胺基酸序列。圖25H繪示純系4.7之重鏈之胺基酸序列。圖25I繪示純系4.8之重鏈之胺基酸序列。圖25J繪示純系4.9之重鏈之胺基酸序列。圖25K繪示純系4.10之重鏈之胺基酸 序列。圖25L繪示純系4.11之重鏈之胺基酸序列。圖25M繪示純系4.4之輕鏈之胺基酸序列。圖25N繪示純系4.5之輕鏈之胺基酸序列。圖250繪示純系4.6之輕鏈之胺基酸序列。圖25P繪示純系4.7之輕鏈之胺基酸序列。
圖26A繪示純系53.0之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖26B繪示純系53.1之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖26C繪示純系53.2之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖26D繪示純系53.3之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖26E繪示純系53.4之重鏈之胺基酸序列。圖26F繪示純系53.5之重鏈之胺基酸序列。圖26G繪示純系53.6之重鏈之胺基酸序列。圖26H繪示純系53.4之輕鏈之胺基酸序列。圖26I繪示純系53.5之輕鏈之胺基酸序列。圖26J繪示純系53.6之輕鏈之胺基酸序列。圖26K繪示純系53.7之輕鏈之胺基酸序列。圖26L繪示純系53.8之輕鏈之胺基酸序列。圖26M繪示純系53.9之輕鏈之胺基酸序列。圖26N繪示純系53.7之重鏈之胺基酸序列。圖260繪示純系53.8之重鏈之胺基酸序列。圖26P繪示純系53.9之重鏈之胺基酸序列。圖26Q繪示純系53.10之重鏈之胺基酸序列。圖26R繪示純系53.10之輕鏈之胺基酸序列。圖26S繪示純系53.11之輕鏈之胺基酸序列。圖26T繪示純系53.12之輕鏈之胺基酸序列。圖26U繪示純系53.13之輕鏈之胺基酸序列。
圖27A繪示純系82.0之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖27B繪示純系82.1之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖27C繪示純系82.2之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。圖27D繪示純系82.3之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。
圖28A-P顯示純系12.0-12.3之重鏈及純系12.0-12.3之輕鏈、純系135.0-135.3之重鏈及純系135.0-135.3之輕鏈、純系4.0-4.11之重鏈及純系4.0-4.7之輕鏈、純系53.0-53.6之重鏈及純系53.0-53.9之輕鏈以及純系82.0-82.3之重鏈及純系82.0-82.3之輕鏈之核酸序列。
實例性實施例
現在將詳細地參照本發明之某些實例性實施例,本發明之某些實例在附圖中予以闡釋。
CXCR3
CXCR3(MIM:300574,人類GeneID:2833,趨化因子(C-X-C基序)受體3;亦稱作CD182、CD183、CKR-L2、CMKAR3、GPR9、IP10-R、Mig-R、MigR、G蛋白偶合受體9、IP-10受體、IP10受體、Mig受體、趨化因子(C-X-C)受體3、干擾素誘導型蛋白10受體)係幾乎不存在於初始T細胞中,但在經抗原活化後上調且因應其一級配體(CXCL9(人類GeneID:4283)、CXCL10(人類GeneID:3627)及CXCL11(人類GeneID:6373))將該等細胞募集至組織發炎位點之趨化因子受體。蘭格爾罕氏島中之β細胞表現CXCL9及CXCL10(Frigerio等人,Nature Medicine 8:1414-1420(2002)且已浸潤胰腺之T細胞表現CXCR3(Christen等人,The Journal of Immunology,2003,171:6838-6845;Van Halteren等人,Diabetologia 48:75-82(2005);Uno等人,2010;Roep等人,Clinical and Experimental Immunology,2003,159:338-343;Tanaka等人,Diabetes 58:2285-2291(2009);Sarkar等人,Diabetes.2012年2月;61(2):436-46)。
CXCR3在多種有機體中表現,包括(例如)人類、小鼠、大鼠、奶牛、黑猩猩、獼猴、狗、蛙、鴨嘴獸、豬及斑馬魚。表1列示多種有機體之CXCR3之美國國家生物技術資訊中心(U.S.National Center for Biotechnology Information)(NCBI)GeneID及蛋白參照序列。SEQ ID NO:1係全長人類CXCR3序列(剪接變體A)。剪接變體B之肽序列係藉由參照序列NP_001136269.1提供。人類CXCR3剪接變體A之預測胞外域闡述於Colvin等人,Mol.Cell.Bio.,26:5838-49(2006)中且包括SEQ ID NO:1之殘基1-58、1-16、111-126、190-223、278-301,如下 文所示。
SEQ ID NO:1 NP_001495人類CXCR3,亞型A
CXCR3及CXCL10在人類T1D患者中表現。Uno等人,Endocrine J.57:991-996(2010);Roep等人,Clin.and Exp.Immun.159:338-343(2009);Tanaka等人,Diabetes 58:2285-2291(2009)。在該等患者中,CXCL10在胰島中產生胰島素之其餘β細胞中表現。CXCR3在包圍胰島之侵襲性T細胞中表現。已在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠(糖尿病小鼠模型)中再現類似表現模式。Morimoto等人,J.Immun.173:7017-7024(2004);Li等人,World J Gastroenterol.11(30):4750-4752(2005);Sarkar等人,Diabetes.2012年2月;61(2):436-46)。
CXCR3亦在存在於某些類型之發炎組織中之T細胞中表現,而CXCL9、CXCL10及CXCL11經常係由發炎性病灶中之局部細胞產生。因此,在一些實施例中,揭示破壞CXCR3以治療T1D之療法。
抗體
本文所用術語「抗體」係指包含抗原結合位點之任何多肽,而不管來源、物種起源、產生方法及/或特徵,且涵蓋免疫球蛋白或其抗原結合部分或片段。作為非限制性實例,術語「抗體」包括人類、猩猩、小鼠、大鼠、山羊、綿羊及雞抗體。該術語包括(但不限於)多株、單株、單特異性、多特異性、非特異性、人類化、完全人類、駱駝化、單鏈、嵌合、合成、重組、雜交、突變、回復突變及CDR-移植抗體。出於本發明目的,除非另有說明,否則其亦包括抗體片段, 例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、VHH(亦稱作奈米抗體(nanobody))及保留抗原結合功能之其他抗體片段,包括雙特異性或多特異性抗體。術語「抗體」亦係指並非基於免疫球蛋白之抗原結合分子。例如,業內已知非免疫球蛋白支架包括小調節免疫醫藥(例如,參見美國專利申請公開案第20080181892號及第20080227958號,分別於2008年7月31日及2008年9月18日公開)、四聯蛋白(tetranectin)、纖連蛋白(fibronectin)域(例如,AdNectin,參見美國專利申請公開案第2007/0082365號,於2007年4月12日公開)、蛋白A、脂質運載蛋白(lipocalin)(例如,參見美國專利第7,118,915號)、錨蛋白重複序列及硫氧還蛋白。
術語「抗原結合域」係指抗體分子之包含特異性結合至一部分或全部抗原或與其互補之區域之部分。倘若抗原較大,則抗體僅可結合至抗原之特定部分。在某些實施例中,CXCR3抗體或抗原結合片段包含至少一個抗原結合域。在一些實施例中,抗體或片段具有多特異性且包含兩個或更多個(例如,2個、3個、4個、5個或更多個)抗原結合域,以使得抗體或片段能夠於相同或不同表位結合兩個或更多個CXCR3分子或能夠以高親和力結合至CXCR3及至少一個其他抗原。抗體之抗原結合部分可包含抗體之一或多個保留特異性結合至抗原之能力之片段。該等片段可包含來自親本抗體或來自親本抗體變體之重鏈及/或輕鏈可變區。
「表位」或「抗原決定簇」係抗原分子之負責與抗體之抗原結合域特異性相互作用的部分。抗原結合域可由一或多個抗體可變域提供。抗原結合域可包含至少一個抗體輕鏈可變區(VL)及至少一個抗體重鏈可變區(VH)。抗原結合域亦可包含僅VH區或僅VL區。例如,來自駱駝及美洲駝(駱駝科(Camelidae,camelid))之抗體包括獨特種類之抗體,其僅係由重鏈形成且不含輕鏈。此等抗體之抗原結合位點係一 個單域,稱作VHH。該等抗體已稱為「駱駝化抗體」或「奈米抗體」。例如,參見美國專利第5,800,988號及第6,005,079號及國際申請公開案第WO 94/04678號及第WO 94/25591號,其以引用方式併入。
本文所揭示抗CXCR3抗體可藉由業內已知任何適宜方法產生。例如,抗體可包含多株抗體或單株抗體。製備多株抗體之方法為熟習此項技術者已知(Harlow等人,Antibodies:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版(1988))。可使用包含CXCR3多肽、其片段(例如,一或多個胞外域、或N端58個胺基酸或N端37個胺基酸、或N端20個胺基酸、或N端16個胺基酸等)、融合蛋白或其變體之免疫原產生抗CXCR3抗體。
免疫原可由產生或過度產生CXCR3之細胞產生,該細胞可為天然細胞、天然突變細胞或遺傳改造細胞。端視多肽之性質(例如,疏水性百分比、親水性百分比、穩定性、淨電荷、等電點等)而定,免疫原可經修飾或偶聯以改變其免疫原性。例如,CXCR3或其一部分可偶聯至載劑。接合可包括藉由用活性化學官能團衍生或經由基於融合蛋白之方法或熟習此項技術者已知之其他方法達成之化學接合。載劑及/或其他免疫原性改良蛋白之實例包括(但不限於)KLH、卵白蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑及混合T輔助肽。
各種佐劑亦可與CXCR3免疫原一起用於增加免疫反應。佐劑之實例包括(但不限於)弗氏佐劑(Freund's adjuvant)(完全及不完全)、礦物油、凝膠、明礬(氫氧化鋁)、表面活性物質(例如溶血卵磷脂)、普洛尼克多元醇(pluronic polyol)、多價陰離子、肽、油乳液、鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)(KLH)、二硝基酚及人類佐劑,例如BCG(卡芥苗(Bacille Calmette-Guerin))及短小棒狀桿菌 (Corynebacterium parvum)。可用佐劑之其他實例包括MPL-TDM佐劑(單磷醯基脂質A,合成海藻糖二棒狀黴菌酸酯(trehalose dicorynomycolate))。免疫方案為業內所熟知且可藉由在所選動物宿主中誘發免疫反應之任何方法實施。因此,不同投與途徑可根據設計選擇在不同時間段內使用。
例如,可將如本文所例示之免疫原投與各種宿主動物(包括(但不限於)兔、小鼠、駱駝科動物、大鼠等),以誘導產生含有對CXCR3具有特異性之多株抗體之血清。投與免疫原可涉及一或多次注射免疫劑及視情況佐劑。在一些實施例中,藉由多次皮下或腹膜內注射或經肌內或經靜脈內將免疫原(具有或不具有佐劑)注射至哺乳動物。在一些實施例中,在獲得適宜多株製劑後,可藉由已知分離技術(例如親和力層析、淘選、吸收等)分離特定抗體,以使得可獲得個別抗體物種。在一些實施例中,使個別抗體物種經受進一步研究,例如,定序以獲得一或多個CDR之胺基酸序列。
在一些實施例中,CXCR3抗體係單株。單株抗體包括源自表現該抗體之單一真核、噬菌體或原核純系之任何抗體。單株抗體可經由(例如)傳統雜交瘤技術(Kohler及Milstein,Nature 256:495-499(1975)及美國專利第4,376,110號,其以引用方式併入本文中)、重組DNA方法(美國專利第4,816,567號,其以引用方式併入本文中)或噬菌體展示技術使用抗體文庫(Clackson等人,Nature 352:624-628(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991))製備。關於各種其他抗體產生技術,參見Antibodies:A Laboratory Manual,編輯Harlow等人,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。可用於產生單株抗體之方法之其他實例包括(但不限於)人類B細胞雜交瘤技術(Kosbor等人,Immunology Today 4:72(1983);及Cole等人,Proc Natl Acad Sci USA 80:2026(1983))及EBV-雜交瘤技術(Cole等人,Manoclonal Antibodies and Cancer Therapy,第77-96頁,Alan R.Liss(1985))。此等抗體可屬於任何免疫球蛋白類別(包括IgG、IgM、IgE、IgA及IgD)及其任何亞類或變體。可在活體外或在活體內培育產生本發明mAb之雜交瘤。
在一些實施例中,可使用包含CXCR3多肽、其片段(例如,一或多個胞外域、或N端58個胺基酸、或N端37個胺基酸、或N端20個胺基酸、或N端16個胺基酸等)、融合蛋白或其變體之免疫原對宿主動物(例如,兔、小鼠、駱駝科動物、大鼠等)實施免疫以生成產生單株抗體之雜交瘤。產生或能夠產生特異性結合至CXCR3之抗體之淋巴球可自經免疫宿主採集並使用適宜融合劑(例如聚乙二醇)與骨髓瘤細胞融合,以形成雜交瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,第59-103頁(1986))。
可生成產生單株抗體之多個雜交瘤且可選擇展現有益性質或顯示治療潛力(例如,藉由阻止CXCR3配體與其受體結合)者。所選抗體可經進一步修飾以獲得或增強有益性質,例如在活體內具有增強之穩定性。例如,在鑑別出產生具有期望特異性、親和力及/或活性之抗體的雜交瘤細胞後,可使用稀釋程序對該等純系實施亞選殖並藉由標準方法使其生長(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986,第59-103頁)。適宜培養基包括(例如)杜貝克氏改良鷹氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(D-MEM)或RPMI-1640培養基。另外,可使雜交瘤細胞在動物體內作為腫瘤生長。可分析亞純系之特異性、親和力及/或活性,且展現最有益性質之亞純系可經選擇用於進一步表徵。
業內存在產生單株抗體之多種替代方法,其任一者皆可用於產生本文所揭示抗CXCR3抗體。例如,單株抗體可藉由重組DNA方法(例如美國專利第4,816,567號中所述者,其以整體引用方式併入)製備。
編碼單株抗體之DNA可使用習用程序分離並定序(例如,藉由使用能夠結合至編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈或來自人類、人類化或其他抗體之鏈之基因的寡糖探針)(Innis等人,PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Academic(1990);及Sanger等人,Proc Natl Acad Sci USA 74:5463(1977))。雜交瘤細胞可用作此類DNA之來源。分離後,可將DNA置於表現載體中,將該等表現載體轉染至原本不產生免疫球蛋白之宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)細胞、NSO細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中,以在重組宿主細胞中實現單株抗體之合成。亦可藉由(例如)以下方式修飾DNA:用人類重鏈及輕鏈恆定結構域之編碼序列取代同源鼠類序列(美國專利第4,816,567號;Morrison等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81:6851(1984))或將非免疫球蛋白多肽之全部或部分編碼序列共價接合至免疫球蛋白編碼序列。在一些實施例中,非免疫球蛋白多肽可取代抗體之恆定域,或可取代抗體之一個CXCR3組合位點之可變域,以產生嵌合二價抗體。
在一些實施例中,本文所述抗體可經修飾以產生CDR移植及/或以其他方式人類化之抗體。CDR移植係人類化形式,但亦可使用業內已知其他人類化技術。CDR移植程序為熟習此項技術者已知且可基於CDR編號命名,包括IMGT(THE INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM®,Montpellier,France)、Kabat、Chothia及經修改Chothia編號方案。例如,參見imgt.org(匯總IMGT連續編號系統之用途,該系統考慮並組合框架區及互補決定區之定義、來自X射線繞射研究之結構數據及對超變環之表徵,以提供對來自全部物種之全部IG及TR V區之獨特編號);Abhinandan及Martin,Mol Immunol.,45:3832-9(2008);亦參見Abhinandan及Martin,J.Mol.Biol.,369(3):852-62(2007)(闡述評價嵌合抗體之「人類性」之方法); Retter等人,Nucleic Acids Res.33(數據庫期號):D671-4(2005)(闡述可變域基因之VBASE2數據庫);以及Johnson及Wu,Int.Immunol.10(12):1801-5(1998)(闡述CDRH3之長度之分佈)。
例如,使用IMGT編號系統,保守胺基酸總是具有相同位置。亦對框架區保守位置之疏水胺基酸進行編號,以允許比較位於不同序列中之相同位置之框架胺基酸(及密碼子)而無需序列比對。在另一實例中,Kabat編號系統如下,CDR-H1於約第31個胺基酸(即,第一個半胱胺酸殘基後約9個殘基)開始,包括約5-7個胺基酸,且於下一酪胺酸殘基結束。CDR-H2於CDR-H1結束後第十五個殘基開始,包括約16-19個胺基酸,且於下一精胺酸或離胺酸殘基結束。CDR-H3於CDR-H2結束後約第三十三個胺基酸殘基開始;包括3-25個胺基酸;且於序列W-G-X-G結束,其中X係任何胺基酸。CDR-L1於約第24個殘基(即,在半胱胺酸殘基後)開始;包括約10-17個殘基;且於下一酪胺酸殘基結束。CDR-L2於CDR-L1結束後約第十六個殘基開始且包括約7個殘基。CDR-L3於CDR-L2結束後約第三十三個殘基開始;包括約7-11個殘基且於序列F-G-X-G結束,其中X係任何胺基酸。含有該等CDR中至少一者之抗體可用於本發明方法中。
CDR-移植抗體可包含來自人類抗體之重鏈及輕鏈可變區序列,其中用來自供體抗體(例如來自下文所述結合CXCR3之鼠類抗體)之CDR序列替代VH及/或VL之一或多個CDR區。來自任何人類抗體之框架序列可用作CDR移植用模板。然而,在此一框架上進行直鏈CDR替代可導致對抗原之結合親和力之一些損失。人類抗體與原始抗體(例如鼠類抗體)之同源性愈高,組合供體CDR與人類框架將在CDR中引入可降低親和力之畸變之可能性愈低。因此,在一些實施例中,本發明之CDR-移植CXCR3抗體包含與供體鼠類CXCR3中和抗體之可變區框架具有至少65%序列一致性的人類可變框架。產生此等抗體之方法 為業內已知(參見EP 239,400;PCT公開案第WO 91/09967號;及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號),且包括鑲飾(veneering)或表面重修(resurfacing)(EP 592,106;EP 519,596;Padlan(1991)Mol.Immunol.28(4/5):489-498;Studnicka等人(1994)Prot.Engineer.7(6):805-814;及Roguska等人(1994)Proc.Acad.Sci.USA 91:969-973)、鏈改組(美國專利第5,565,352號)及抗個體基因型抗體。
在一些實施例中,本文所述抗體可經人類化。「人類化抗體」係以下抗體分子:結合期望抗原,具有一或多個來自非人類物種之CDR,且具有來自人類免疫球蛋白分子之框架區及/或恆定域。已知人類Ig序列揭示於(例如)www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi;www.atcc.org/phage/hdb.html;www.sciquest.com/;www.abcam.com/;www.antibodyresource.com/onlinecomp.html;Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)中。可使用經引入人類序列降低免疫原性或降低、增強或修改結合、親和力、結合速率、離解速率、親合力、特異性、半衰期或如業內已知任何其他適宜特徵。抗體可使用業內已知多種技術人類化,該等技術係例如(但不限於)闡述於以下文獻中者:Jones等人(1986)Nature 321:522;Verhoeyen等人,(1988)Science 239:1534;Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296;Chothia及Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901;Carter等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285;Presta等人(1993)J.Immunol.151:2623;美國專利第5,589,205號、第565,332號、第6,180,370號、第6,632,927號、第7,241,877號、第7,244,615號、第7,244,832號、第7,262,0505號;及美國專利公開案第2004/0236078號(於2004年4月30日提出申請),該等文獻以整體引用方式併入本文中。
在某些實施例中,人類化或CDR-移植抗體中之框架殘基可用來 自CDR供體抗體之對應殘基取代,例如用來自抗小鼠CXCR3中和抗體之框架殘基取代,以改變(例如改良)抗原結合。參見Queen等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 86:10029-33(1989年12月)。該等框架取代係藉由業內熟知方法鑑別,例如,藉由對CDR與框架殘基之相互作用建模,以鑑別對於抗原結合及序列比較較為重要之框架殘基,以鑑別特定位置之不尋常框架殘基。例如,參見美國專利第5,585,089;及Riechmann等人,(1988)Nature 332:323,該等文獻以整體引用方式併入本文中。三維免疫球蛋白模型通常可獲得並為熟習此項技術者所熟悉。可使用闡釋並展示所選候選免疫球蛋白序列之可能的三維構象結構的電腦程式。檢察該等展示內容允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能行使中之可能作用,即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式,可自一致序列及引入序列選擇框架殘基並組合以達成期望抗體特徵,例如對CXCR3之親和力增加。
抗體可經人類化或CDR-移植,且可使用業內已知之多種技術鑑別來自CDR-供體之可用於改良抗原結合之框架殘基,該等技術係例如(但不限於)闡述於以下文獻中者:Jones等人(1986)Nature 321:522;Verhoeyen等人(1988)Science 239:1534;Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296;Chothia及Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901;Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285;Presta等人(1993)J.Immunol.151:2623;及美國專利第5,565,332號、第5,723,323號、第5,976,862號、第5,824,514號、第5,817,483號、第5,814,476號、第5,763,192號、第5,723,323號、第5,766,886號、第5,714,352號、第6,204,023號、第6,180,370號、第5,693,762號、第5,530,101號、第5,585,089號、第5,225,539號及第4,816,567。在一些實施例中,使用4D人類化來製備本發明抗體變體(例如,製備純系4之4D人類化變體,包含重鏈4.4-4.6之任一者及輕鏈4.4-4.7之任一者)。關於 用於4D人類化中之方法,參見WO 2009/032661(其以整體引用方式併入本文中),例如,[0037]-[0044]段。簡言之,4D人類化可包含:a)構建欲人類化之可變域之3D模型;b)使用該可變域之3D模型之分子動力學模擬鑑別該域中之撓性殘基;c)藉由比較3D模型之分子動力學軌跡與49個人類種系之分子動力學軌跡來鑑別最接近之人類種系;及d)使並非CDR之一部分之撓性殘基突變成其人類種系對應部分(如步驟c中所鑑別)。
在一些實施例中,經CDR移植及/或以其他方式人類化之抗體可包含純系4、12、53、82及135之CDR移植及/或人類化變體。例如,可將來自純系4、12、53、82及135中任一者之對應重鏈區及輕鏈區(例如,純系4重鏈及純系4輕鏈)接合至人類恆定域以形成嵌合抗體。嵌合抗體可藉由將一或多個框架或CDR胺基酸改變成對應人類殘基來進一步人類化。同樣,在一些實施例中,可將來自純系4、12、53、82及135中任一者或來自純系4、12、53、82及135之任一變體之六個重鏈及輕鏈CDR區(例如,純系4重鏈CDR1、CDR2及CDR3,以及純系4輕鏈CDR1、CDR2及CDR3)亞選殖至人類框架及/或恆定域中以形成人類化抗體。人類化可包括使用人類可變域,不包括CDR之胺基酸及/或任何游標位(Vernier position)殘基。人類化抗體亦可在位於CDR之4個胺基酸內之殘基處及/或使用(例如)基於IMGT之建模鑑別為原始抗體序列與人類序列之間「極為不同」之位置處包括其他回復突變變化。可在框架或CDR區中引入其他突變以增強抗體之穩定性或治療有效性,例如藉由引入突變以去除純系4 VH CDR2之58位及59位(IMGT編號)之去醯胺位點。
例如,本文所揭示抗體、嵌合抗體及人類化抗體可包含六個來自純系4、12、53、82及135中任一者及其嵌合或人類化變體之CDR及/或重鏈及輕鏈可變域。例如,能夠結合CXCR3之抗體或片段可包含 三個來自重鏈4.0-4.11、重鏈12.0-12.3、重鏈53.0-53.10、重鏈82.0-82.3及重鏈135.0-135.3中任一者之CDR。類似地,抗體或片段可包含三個來自輕鏈4.0-4.7、輕鏈12.0-12.3、輕鏈53.0-53.13、輕鏈82.0-82.3及輕鏈135.0-135.3中任一者之CDR。在一些實施例中,重鏈及輕鏈CDR係來自相同純系,但可來自該純系之不同變體(例如,三個來自重鏈4.1之CDR,其與三個來自輕鏈4.2之CDR配對)。重鏈及輕鏈4.0、12.0、82.0及135.0係指小鼠抗體純系及嵌合抗體中之可變域(其中該等抗體包含小鼠可變域及人類框架區)。其餘重鏈及輕鏈係指表11中所示人類化鏈。
在一些實施例中,能夠結合CXCR3之抗體或片段可包含重鏈4.0-4.11、重鏈12.0-12.3、重鏈53.0-53.10、重鏈82.0-82.3及重鏈135.0-135.3中之任一者。類似地,抗體或片段可包含輕鏈4.0-4.7、輕鏈12.0-12.3、輕鏈53.0-53.13、輕鏈82.0-82.3及輕鏈135.0-135.3中之任一者。
在一些實施例中,重鏈及輕鏈經選擇以使得三個來自特定純系之重鏈之CDR(例如,來自純系4重鏈之CDR)與三個來自該純系之任一輕鏈之CDR(例如,來自純系4輕鏈之CDR)配對。在一些實施例中,重鏈及輕鏈經選擇以使得來自特定純系之重鏈(例如,純系4重鏈)與該純系之任一輕鏈(例如,純系4輕鏈)配對。
在一些實施例中,三個來自重鏈可變域4.0-4.11中任一者之CDR可與三個來自輕鏈可變域4.0-4.7中任一者之CDR配對;三個來自重鏈可變域12.0-12.3中任一者之CDR可與三個來自輕鏈可變域12.0-12.3中任一者之CDR配對;三個來自重鏈可變域53.0-53.10中任一者之CDR可與三個來自輕鏈可變域53.0-53.13中任一者之CDR配對;三個來自重鏈可變域82.0-82.3中任一者之CDR可與三個來自輕鏈可變域82.0-82.3中任一者之CDR配對;或三個來自重鏈可變域135.0-135.3中任一 者之CDR可與三個來自輕鏈可變域135.0-135.3中任一者之CDR配對。
在一些實施例中,重鏈可變域4.0-4.11中之任一者可與輕鏈可變域4.0-4.7中之任一者配對,重鏈可變域12.0-12.3中之任一者可與輕鏈可變域12.0-12.3中之任一者配對,重鏈可變域53.0-53.10中之任一者可與輕鏈可變域53.0-53.13中之任一者配對,重鏈可變域82.0-82.3中之任一者可與輕鏈可變域82.0-82.3中之任一者配對,或重鏈可變域135.0-135.3中之任一者可與輕鏈可變域135.0-135.3中之任一者配對。
某些重鏈及輕鏈可變域之比對示於圖17中。在一些實施例中,本文所揭示抗體可包含如表2中所示經配對重鏈及輕鏈可變域(Ch=嵌合,Hu=人類化,VH=重鏈,VK=輕鏈)。例如,表2中之第一條目指示包含重鏈4.0及輕鏈4.0之純系4變體。第二條目指示包含重鏈4.1及輕鏈4.1之純系4變體。亦向包含所示重鏈及輕鏈序列之各抗體指配表2之第二欄中之抗體標記符。例如,向表中之第一條目(包含重鏈4.0及輕鏈4.0)指配抗體標識符4Ch,而向表中之第二抗體(包含重鏈4.1及輕鏈4.1)指配標識符4Hu1。
術語「特異性相互作用」或「特異性結合」或諸如此類意指兩個分子形成在生理條件下相對穩定之複合物。特異性結合之特徵在於高親和力及低至中等能力。非特異性結合通常具有低親和力與中至高能力。通常,當親和力常數Ka高於106M-1或較佳高於108M-1時,認為結合具有特異性。在一些實施例中,抗體、其變體及片段以至少106M-1、107M-1、108M-1、109M-1或更高之締合常數結合其抗原。在一些實施例中,抗體、其變體及片段以至少表7A-B、8-10及/或12中任一者中所示之結合動力學結合CXCR3。若需要,可藉由改變結合條件降低非特異性結合而不會實質上影響特異性結合。此等條件為業內已知,且熟習此項技術者使用常規技術可選擇合適條件。通常按照以下方面定義條件:抗體濃度、溶液離子強度、溫度、結合允許時間、封阻分子(例如血清白蛋白及乳酪蛋白)之濃度。
本文揭示在一些實施例中可中和CXCR3之抗CXCR3抗體。「CXCR3中和抗體」結合至CXCR3並封阻受體之活性,例如因CXCR3配體與CXCR3結合所產生之典型生理及遺傳反應。中和活性可為完全(100%中和)或部分,例如,約10、20、30、40、50、60、 70、80、90、95(或其間之任何百分比)或更高中和,且將取決於熟習此項技術者已知之各種因素,例如抗體濃度、親和力及表位,以及用於評估中和活性之特定分析。CXCR3中和抗體之中和活性可藉由分析以量測(例如)配體結合、GTP結合、鈣動員、細胞趨化性及/或受體內在化之抑制來顯示。諸多用於測定中和抗體且尤其CXCR3中和抗體之活性之分析為熟習此項技術者已知且可容易地適於驗證特定抗體具有中和性。
例如,在一些實施例中,用於本發明方法中之抗體之中和活性可藉由趨化性分析評價,實質上如關於由純系49801產生且由R&D Systems®出售之抗體(目錄編號為MAB160)之包裝插頁中所述。中和劑量-50(ND50)定義為以特定rhI-TAC濃度在反應細胞系中產生細胞表面CXCR3介導rhI-TAC反應之一半最大抑制所需抗體之濃度。為量測抗體阻斷rhI-TAC誘導之hCXCR3轉染BaF/3細胞之趨化性之能力,將7 ng/mL rhI-TAC添加至96孔趨化性室(NeuroProbe,Cabin John,MD)之下區室中。然後使用無PVP聚碳酸酯過濾器(5 μ孔徑)組裝趨化性室。將抗體連續稀釋液(例如,0.001 μg/mL至10000 μg/mL)及0.25×106個細胞/孔添加至室之頂孔中。在37℃下於5% CO2加濕培育器中培育3小時後,拆卸該室,且將遷移經過至下室之細胞轉移至工作板並使用(例如)刃天青螢光進行量化。
Colvin等人,Mol.Cell.Bio.,26:5838-49(2006)闡述可在某些實施例中用於測定用於本發明中之中和CXCR3抗體之中和活性的其他分析。簡言之,可使用300-19細胞,即在功能上表現CXCR4之鼠類前B細胞白血病細胞系。在轉染後,此細胞系可在功能上表現其他趨化因子受體,例如,人類CXCR3(例如,參見美國專利申請公開案第2010/0061983號之第201-209段,其以引用方式併入)。可使表現人類CXCR3之300-19細胞在含有10%胎牛血清(FBS)之完全RPMI培養基上 生長。為評估在候選中和CXCR3抗體存在下CXCR3配體與CXCR3之結合,將400,000個CXCR3/300-19細胞於150 μL總體積之結合緩衝液(0.5% BSA、5 mM MgCl2、1 mM CaCl2、50 mM HEPES,pH 7.4)中置於96孔組織培養板中。可將總共0.04 nM經125I標記CXCL10(New England Nuclear,Boston,MA)或CXCL11(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)及5×106 nM至500 nM未經標記CXCL10或CXCL11(Peprotech,Rocky Hill,NJ)添加至細胞中且在室溫下在振盪的同時培育90 min。將細胞轉移至於0.3%聚伸乙基亞胺中預浸漬之96孔過濾板(Millipore,Billerica,MA)上且用200 μl補充有0.5 M NaCl之結合緩衝液洗滌三次。將板乾燥,且在添加閃爍流體後在Wallac Microbeta閃爍計數器(Perkin-Elmer Life Sciences,Boston,MA)中量測放射性。可以與CXCL10及11類似之方式評價CXCL9之結合。
在某些實施例中,本文所揭示抗體可防止或降低鈣流入CXCR3表現細胞中。在一些實施例中,可在諸如CXCR3/300-19細胞等細胞中檢測到鈣流動。將約5×106個細胞懸浮於2 ml具有1% BSA之RPMI培養基中。添加十五微克Fura-2(Molecular Probes,Eugene,OR)且將細胞在37℃下培育20 min。在PBS中將細胞洗滌兩次且再懸浮於2 ml鈣流動緩衝液(145 mM NaCl、4 mM KCl、1 mM NaHPO4、1.8 mM CaCl2、25 mM HEPES、0.8 mM MgCl2及22 mM葡萄糖)中。在37℃下在DeltaRAM螢光計(Photon Technology International,Lawrenceville,NJ)中量測螢光讀數。在添加趨化因子(例如,CXCL9、10或11)之前及之後,將胞內鈣濃度記錄為因應在340 nm及380 nm下依序刺激在510 nm下發射之刺激螢光強度,且表示為340 nm下之螢光對380 nm下之螢光之相對比率。
在某些實施例中,CXCR3中和可藉由量測受體內在化之降低來評估。在一些實施例中,受體內在化分析可藉由在37℃下將約2.5× 105個細胞(例如CXCR3/300-19細胞)在具有1% BSA與不同濃度之CXCL10、CXCL11或CXCL9之RPMI培養基中培育30min來實施。然後可用冰冷螢光活化細胞分選物緩衝液洗滌細胞且隨後使用PE偶聯CXCR3抗體分析CXCR3之表面表現。
用於評價中和活性之其他分析揭示於(例如)美國專利第7,405,275號之實例2-4中,該等實例以引用方式併入。
如藉由任一上述分析所評價,在某些實施例中,中和CXCR3抗體之ND50可為約0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、50μg/mL或100μg/mL。在特定實施例中,ND50可為0.5-12μg/mL,且在更特定實施例中,為1-6μg/mL。
本文所揭示經分離CXCR3抗體可包括結合CXCR3之特異性表位者。例如,用於本發明中之抗體可結合包含選自SEQ ID NO:1之殘基1-58、1-16或1-37之序列之全部或部分(例如,至少5個、6個、8個、10個、12個、14個、15個、16個、18個或20個殘基之片段)的肽。在一些實施例中,本文所揭示抗體包括結合圖18中所鑑別一或多個表位者。在一些實施例中,抗CXCR3抗體可包含結合至包含SDHQVLNDAE(SEQ ID NO:71)之CXCR3表位的抗體。在一些實施例中,表位包含SDHQVLND(SEQ ID NO:72)、DHQVLND(SEQ ID NO:73)及/或VLNDAE(SEQ ID NO:74)。在某些實施例中,表位包含序列VLND(SEQ ID NO:75)。在一些實施例中,表位包含XDXXVXNDXX(SEQ ID NO:76),其中X指示任何胺基酸。在一些實施例中,表位包含XDXXVXND(SEQ ID NO:77)、DXXVXND(SEQ ID NO:78)及/或VXNDXX(SEQ ID NO:79),其中X指示任何胺基酸。在某些實施例中,表位包含序列VXND(SEQ ID NO:80),其中X指示任何胺基酸。
抗CXCR3抗體可對來自不同物種之CXCR3序列具有泛特異性(pan-specific)或對來自特定物種或特定同種型之CXCR3之CXCR3序列具有選擇性。在特定實施例中,CXCR3抗體對所投與之個體物種具有特異性。因此,在一些實施例中,CXCR3抗體可對人類CXCR3序列具有特異性(例如,能夠結合包含與上文所列示SEQ ID NO:1之任一子序列同源之序列之肽)。同源序列將由熟習此項技術者藉由諸如蛋白序列比對(例如,BLASTp、ClustalW等)等手段容易地鑑別。在特定實施例中,用於本發明中之抗體結合至包含序列在序列之整個長度或至少10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個或70個殘基(或其間之任何值)之窗口內與SEQ ID NO:1至少90%、95%或99%(或其間之任何百分比)類似或一致的肽。在一些實施例中,抗體能夠結合至與上述一個表位至少80%、85%、90%、95%或99%(或其間之任何百分比)類似或一致之表位(亦參見圖18)。
本文所揭示特定抗體包括(例如)抗體純系(Cl)12、Cl 135、Cl 82、Cl 53及Cl 4,以及其嵌合及人類化變體。
在一些實施例中,本文所揭示抗體相對於業內已知抗體展現某些經改良性質,該等業內已知抗體包括抗體5H7及7H5(揭示於例如美國專利第7,405,275號中;該等抗體之CDR揭示於表1及2及參照序列表中,其以引用方式併入)、V44D7(闡述於國際公開案WO 2008/094942中)、1C6(闡述於美國專利第7,407,655號中;其中表位定位闡述於實例8及9中,其以引用方式併入)及49801,由R&D Systems以目錄編號MAB160出售。
在一些實施例中,本文所揭示抗體純系(純系4、12、53、82及135及其嵌合及人類化對應部分)相對於已知抗體5H7、7H5、V44D7、1C6及49801展現某些令人驚訝之益處。例如,本文所揭示純 系與抗hCXCR3純系5H7、7H5、V44D7、1C6及49801相比展現增加之結合親和力。人類化純系本文所揭示與小鼠抗hCXCR3純系5H7、7H5、V44D7、1C6及49801相比亦可具有降低之免疫原性。另外,本文所揭示抗體(例如包含純系4.7-4.11之重鏈者)已藉由於58位及59位(使用IMGT編號)進行修飾經最佳化以去除去醯胺位點,以增強穩定性。在一些實施例中,本文所揭示抗體保留CXCR3中和活性。
在某些實施例中,本文所揭示抗體或片段可包含與抗體Cl 12、Cl 135、Cl 82、Cl 53及Cl 4中之任一者或該等純系之嵌合或人類化變體中之VH及/或VL CDR序列約80%至約100%(例如,約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致(例如,與Cl 12中之六個CDR或與Cl 12.1中之六個CDR等80-100%一致)的VH及/或VL CDR序列。在一些實施例中,抗體或片段可包含相對於抗體Cl 12、Cl 135、Cl 82、Cl 53及Cl 4中任一者中之VH及/或VL CDR序列含有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸取代(包括添加、缺失及取代,例如保守取代)的VH及VL CDR序列。
本文所用術語「百分比(%)序列一致性」或「同源性」定義為在對序列進行比對及引入缺口(若需要)以達成最大百分比序列一致性且不包括保守核酸取代後,候選序列中與參照序列中之胺基酸殘基或核苷酸一致之胺基酸殘基或核苷酸之百分比。比較用序列之最佳比對可以手工方式並藉助業內已知局部同源性算法或藉助使用該等算法之電腦程式(例如,BLAST P)產生。
在一些實施例中,本文所揭示經分離CXCR3抗體或抗原結合片段包含VH胺基酸序列,該VH胺基酸序列包含與重鏈4.0-4.11、重鏈12.0-12.3、重鏈53.0-53.10、重鏈82.0-82.3及重鏈135.0-135.3中任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或其間之任何百分比)一致性。在某些實施例中, 抗體或片段包含在重鏈4.0-4.11、重鏈12.0-12.3、重鏈53.0-53.10、重鏈82.0-82.3及重鏈135.0-135.3中之SEQ任一者之胺基酸序列中具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個突變(包括添加、缺失及取代,例如保守取代)的VH胺基酸序列。如本文所用,「保守取代」係指用不實質上改變抗體或片段之化學、物理及/或功能性質(例如,抗體或片段保留相同電荷、結構、極性、疏水性/親水性及/或保持功能,例如識別、結合CXCR3及/或中和其活性之能力)之第二胺基酸替代第一胺基酸。
在某些實施例中,本文所揭示經分離CXCR3抗體或抗原結合片段包含VL胺基酸序列,該VL胺基酸序列包含與輕鏈4.0-4.7、輕鏈12.0-12.3、輕鏈53.0-53.13、輕鏈82.0-82.3及輕鏈135.0-135.3中任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%(或其間之任何百分比)一致性。在各實施例中,抗體或片段包含在輕鏈4.0-4.7、輕鏈12.0-12.3、輕鏈53.0-53.13、輕鏈82.0-82.3及輕鏈135.0-135.3中之任一者之胺基酸序列中具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個突變(包括添加、缺失及取代,例如保守取代)的VL胺基酸序列。
在某些實施例中,本文所揭示經分離CXCR3抗體或抗原結合片段包含重鏈可變域,該重鏈可變域包含與重鏈4.0-4.11、重鏈12.0-12.3、重鏈53.0-53.10、重鏈82.0-82.3及重鏈135.0-135.3中任一者之胺基酸序列具有至少80%一致性;且包含輕鏈可變域,該輕鏈可變域包含與輕鏈4.0-4.7、輕鏈12.0-12.3、輕鏈53.0-53.13、輕鏈82.0-82.3及輕鏈135.0-135.3中任一者之胺基酸序列具有至少80%一致性。在一些實施例中,重鏈及輕鏈經選擇以使得來自特定純系之重鏈(例如,純系4重鏈)與該純系之任一輕鏈(例如,純系4輕鏈)配對。在一些實施例中,重鏈及輕鏈經如表2中所示配對。在其他實施例中,包含所揭示 VH及/或VL序列之抗體或片段保留中和CXCR3活性之能力。
在一些實施例中,本文所揭示抗體係Cl 12、135、82、53及/或4之人類化變體。在其他實施例中,抗體係完全人類。在某些實施例中,抗體係選自純系12、135、82、53及4之抗體之人類化或完全人類衍生物。在一些實施例中,抗體之親和力常數係至少108 M-1(例如,至少108 M-1、至少109 M-1、至少1010 M-1或至少1011 M-1、或其間之任何值)。在一些實施例中,抗體能夠結合至全部CXCR3亞型。在某些實施例中,抗體能夠結合至CXCR3之A與B亞型二者。在一些實施例中,抗體不結合CXCR3之B亞型。
在一些實施例中,經分離CXCR3抗體或抗原結合片段包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3,該VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3包含與來自純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體之任一者之VH及VL CDR序列約90%至約100%(例如,約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在一些實施例中,經分離CXCR3抗體或抗原結合片段包含VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3,該VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3包含與來自純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之VH及VL CDR序列一致或相對於該等序列包含1個、2個、3個、4個或5個胺基酸殘基突變(包括添加、缺失及取代,例如保守取代)之胺基酸序列。
在一些實施例中,抗CXCR3抗體或片段包含具有三個CDR(重鏈CDR1、CDR2及CDR3)之重鏈及具有三個CDR(輕鏈CDR1、CDR2及CDR3)之輕鏈。在一些實施例中,VH CDR1相對於純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之VH CDR1序列具有1 個、2個或3個胺基酸突變。在一些實施例中,VH CDR2相對於純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之VH CDR2序列具有1個、2個或3個胺基酸突變。在一些實施例中,VH CDR3相對於純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之VH CDR3序列具有1個、2個或3個胺基酸突變。在一些實施例中,VL CDR1相對於純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之VL CDR1序列具有1個、2個或3個胺基酸突變。在一些實施例中,VL CDR2相對於純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之VL CDR2序列具有1個或2個胺基酸突變。在一些實施例中,VL CDR3相對於純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之VL CDR3序列具有1個、2個或3個胺基酸突變。在某些實施例中,重鏈及輕鏈CDR 1、CD2及CDR3係來自純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之CDR,或相對於選自抗體純系或其嵌合/人類化變體中任一者中所述CDR包含1-3個胺基酸突變。在一些實施例中,突變係在圖17A-H中之比對中所示突出顯示位置處。在一些實施例中,突變係在來自純系4.0-4.11中任一者之VH CDR2中之58位及59位中之一或多者處。
在一些實施例中,抗CXCR3抗體或片段包含重鏈及輕鏈。在一些實施例中,重鏈與重鏈4.0-4.11、重鏈12.0-12.3、重鏈53.0-53.10、重鏈82.0-82.3及重鏈135.0-135.3中之任一者至少約90%一致(例如,至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致或其間之任何百分比),或相對於重鏈4.0-4.11、重鏈12.0-12.3、重鏈53.0-53.10、重鏈82.0-82.3及重鏈135.0-135.3中之任一者具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基:酸突變。在一些實施例中,輕鏈與輕鏈4.0-4.7、輕鏈12.0-12.3、輕鏈53.0-53.13、輕鏈82.0-82.3及輕鏈135.0-135.3中之任一者至少約90%一致(例如,至 少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致或其間之任何百分比),或相對於輕鏈4.0-4.11、輕鏈12.0-12.3、輕鏈53.0-53.10、輕鏈82.0-82.3及輕鏈135.0-135.3中之任一者具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸突變。在一些實施例中,重鏈與重鏈4.0-4.11、重鏈12.0-12.3、重鏈53.0-53.10、重鏈82.0-82.3及重鏈135.0-135.3中任一者至少約90%一致(例如,至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致或其間之任何百分比)或相對於重鏈4.0-4.11、重鏈12.0-12.3、重鏈53.0-53.10、重鏈82.0-82.3及重鏈135.0-135.3中任一者具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸突變,及/或輕鏈與輕鏈4.0-4.7、輕鏈12.0-12.3、輕鏈53.0-53.13、輕鏈82.0-82.3及輕鏈135.0-135.3中任一者至少約90%一致(例如,至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致或其間之任何百分比)或相對於輕鏈4.0-4.7、輕鏈12.0-12.3、輕鏈53.0-53.13、輕鏈82.0-82.3及輕鏈135.0-135.3中任一者具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸突變。在一些實施例中,突變係在圖17A-H中之比對中所示位置處。
在某些實施例中,包含上文所揭示VH及/或VL CDR序列之經分離CXCR3抗體或抗原結合片段保留CXCR3中和活性。
在各實施例中,CXCR3抗體或片段之重鏈及輕鏈可變域可包含至少一個框架區(例如,FR1、FR2、FR3及FR4中之至少一者)。將重鏈之框架區命名為VH FR,而本文將輕鏈之框架區命名為VL FR。在某些實施例中,框架區可含有取代、插入或其他改變。在某些實施例中,該等改變可使抗體之結合親和力改良或最佳化。可經修飾之框架區殘基之非限制性實例包括直接非共價結合CXCR3、與CDR之構象相互作用或實現該構象及/或參與VL-VH界面者。
在某些實施例中,CXCR3抗體或片段之重鏈(VH)可包含FR1、FR2、FR3及/或FR4,該等FR1、FR2、FR3及/或FR4之胺基酸序列與純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者內之對應VH框架區約80%至約100%一致(例如,80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或其間之任何百分比)。在某些實施例中,CXCR3抗體或片段可包含至少一個VH FR(FR1、FR2、FR3及/或FR4),該VH FR之胺基酸序列與純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者內之對應VH FR區一致或相對於純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者具有1個、2個、3個、4個或5個胺基酸突變(包括添加、缺失及取代,例如保守取代)。
在某些實施例中,CXCR3抗體或片段之輕鏈(VL)可包含FR1、FR2、FR3及/或FR4,該等FR1、FR2、FR3及/或FR4之胺基酸序列與純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者內之對應VL框架區約80%至約100%一致(例如,80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或其間之任何百分比)。在某些實施例中,CXCR3抗體或片段可包含至少一個VL FR(FR1、FR2、FR3及/或FR4),該VL FR之胺基酸序列與純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者內之對應VL FR區一致或相對於純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者具有1個、2個、3個、4個或5個胺基酸突變(包括添加、缺失及取代,例如保守取代)。
在某些實施例中,CXCR3抗體或片段包含VH FR區(FR1、FR2、FR3及/或FR4),該等VH FR區之胺基酸序列與純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者內之對應VH FR區一致或相對於純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者內之對 應VH FR區包含1個、2個、3個、4個或5個胺基酸突變;且包含VL FR區(FR1、FR2、FR3及/或FR4),該等VL FR區之胺基酸序列與純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者內之對應VL FR一致或相對於純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者內之對應VL FR包含1個、2個、3個、4個或5個胺基酸突變。在某些實施例中,CXCR3抗體或片段包含胺基酸序列與純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之對應VH FR區約80-100%一致之VH FR區(FR1、FR2、FR3及/或FR4),且包含胺基酸序列與純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者內之對應VL FR約80-100%一致之VL FR區(FR1、FR2、FR3及/或FR4)。
本文所揭示CDR及FR區可以多種組合加以組合,此乃因對於給定抗體,各CDR及FR區可獨立地選擇並與任一其他CDR或FR區組合。在某些實施例中,VH及/或VL CDR及FR序列可以任一組合存在於保留中和CXCR3活性之能力之抗體或片段中。
本文所揭示抗體及片段可包含一或多個不實質上改變本文所述胺基酸序列之胺基酸序列。實質上相同之胺基酸序列包括包含保守胺基酸取代以及不損害抗體或片段中和CXCR3活性之能力之胺基酸缺失及/或插入之序列。
本文所揭示抗體及片段可進一步偶聯至一或多個其他分子。例如,偶聯物可包含直接或經由連接體接合至一或多種治療劑、增溶劑、穩定劑、免疫抑制劑、受體及其片段、抗原結合肽及/或其他配體靶向部分之抗體。在一些實施例中,治療劑係可用於治療T1D及/或與CXCR3相關之其他病症之藥劑。在一些實施例中,抗體或片段係偶聯至β細胞刺激劑或胰島素。
核苷酸序列
除上文所述胺基酸序列外,在某些實施例中,本文亦揭示對應於彼等胺基酸序列之核苷酸序列。在一些實施例中,核苷酸序列編碼能夠中和CXCR3活性之抗體或片段。在某些實施例中,核苷酸序列可用於製備在細胞中表現(例如,在哺乳動物細胞中表現)抗CXCR3抗體之表現載體。
在某些實施例中,本文亦揭示實質上與編碼本文所揭示胺基酸序列之多核苷酸一致之多核苷酸。實質上一致之序列可為多態序列,即,群體中之替代序列或等位基因。實質上一致之序列亦可包含誘變序列,包括包含沉默突變之序列。突變可包含改變一或多個核苷酸殘基變化、缺失一或多個核苷酸殘基或插入一或多個其他核苷酸殘基。實質上一致之序列亦可因核苷酸密碼子之簡併性而包含編碼本文所揭示胺基酸序列中之任何給定胺基酸位置之相同胺基酸的不同核苷酸序列。在實質上一致之序列內亦包括編碼保留中和CXCR3之能力之抗體之一或多條鏈的序列。
在某些實施例中,本文亦揭示在高度嚴格或較低嚴格性雜交條件下與編碼CXCR3中和抗體或片段之多核苷酸雜交之多核苷酸。本文所用術語「嚴格性」係指經實施以評估兩個核酸間之同源性程度之雜交實驗的實驗條件(例如,溫度及鹽濃度);嚴格性愈高,兩個核酸間之同源性百分比愈高。本文所用片語「雜交」或其語法變化形式係指第一核酸分子在低、中等或高嚴格性條件下或在核酸合成條件下與第二核酸分子之結合。雜交可包括其中第一核酸分子結合至第二核酸分子且其中第一及第二核酸分子互補之情形。
嚴格雜交條件包括(但不限於)在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45℃下與過濾器結合DNA雜交,之後在0.2×SSC/0.1% SDS中在約50-65℃下洗滌一或多次。其他嚴格條件包括在6×SSC中在約45℃下與過濾器結合DNA雜交,之後在0.1×SSC/0.2% SDS中在約65℃下洗滌一 或多次。具有已知嚴格性之其他雜交條件為熟習此項技術者所熟悉且包括在本文中。
在某些實施例中,本文所揭示核酸可編碼能夠中和CXCR3活性之抗體或片段中之一或多條鏈之胺基酸序列,或該核酸可在嚴格條件下與編碼抗體或片段中之一或多條鏈之胺基酸序列之核酸雜交。
在某些實施例中,本文揭示包含以下核苷酸序列之多核苷酸序列:編碼CXCR3中和抗體或片段之VH域之胺基酸序列,且與編碼純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之重鏈之核苷酸序列至少約80-100%(例如,約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致(或其間之任何百分比)。在某些實施例中,多核苷酸序列可包含相對於編碼純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之重鏈之核苷酸序列具有0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個突變(包括添加、缺失及取代,例如保守取代)之核苷酸序列。
在某些實施例中,本文揭示包含以下核苷酸序列之多核苷酸序列:編碼CXCR3中和抗體或片段之VL域之胺基酸序列,且與編碼純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之輕鏈之核苷酸序列至少約80-100%(例如,約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致(或其間之任何百分比)。在某些實施例中,多核苷酸序列可包含相對於編碼純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之輕鏈之核苷酸序列具有0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個突變(包括添加、缺失及取代,例如保守取代)之核苷酸序列。
在特定實施例中,本文揭示包含以下核苷酸序列之多核苷酸序列:與VH胺基酸序列至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致(或其間之任何百分 比)且與VL胺基酸序列至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致(或其間之任何百分比),其中該等核苷酸序列編碼來自純系12、135、82、53及4以及其嵌合及人類化變體中任一者之重鏈及輕鏈胺基酸序列。
所揭示多核苷酸可藉由業內已知任何方法獲得。例如,若已知抗體之核苷酸序列,則可自化學合成寡核苷酸組裝編碼抗體之多核苷酸。此將涉及(例如)合成含有編碼抗體之序列之部分的重疊寡核苷酸,使彼等寡核苷酸退火並將其連接,及隨後藉由PCR擴增經連接寡核苷酸。所揭示多核苷酸亦可自任何其他適宜核酸來源產生,該來源係例如抗體cDNA文庫,或自表現抗體之任何組織或細胞(例如,自經選擇以表現抗體之雜交瘤細胞)分離之cDNA文庫。
在一些實施例中,可將任一所揭示多核苷酸納入表現載體中。適於在各種人類及動物細胞類型中表現之載體為業內已知。在一些實施例中,提供包含載體之宿主細胞。適宜宿主細胞包括(例如)CHO、COS、SF9及/或其他人類或非人類細胞系。在一些實施例中,宿主細胞在培養基中培養時,在載體上瞬時或穩定表現核酸,藉此提供產生本文所揭示抗體或片段之方法。
醫藥組合物
醫藥組合物可包含任一本文所揭示抗體或其片段。亦揭示包含編碼抗體或其片段之核酸之醫藥組合物,該等核酸係(例如)用於基因療法應用及/或用於在宿主細胞(例如,CHO、COS、SF9及/或其他人類或非人類細胞系)中瞬時或穩定表現以產生蛋白或其片段。
本文所揭示醫藥組合物可包含醫藥上可接受之載劑及/或至少一種添加劑,例如溶劑、填充劑、膨脹劑、崩解劑、緩衝劑或穩定劑。標準醫藥調配技術為熟習此項技術者所熟知(例如,參見2005 Physicians’Desk Reference ®,Thomson Healthcare:Montvale,NJ, 2004;Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,Gennado等人編輯,Lippincott Williams & Wilkins:Philadelphia,PA,2000)。適宜醫藥添加劑包括(例如)甘露醇、澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及諸如此類。在某些實施例中,醫藥組合物亦可含有pH緩衝試劑及潤濕劑或乳化劑(例如,磷酸鹽緩衝鹽水、注射用無菌鹽水等)。在其他實施例中,組合物可含有防腐劑或其他穩定劑。
在一些實施例中,包含任一本文所揭示之抗體或其片段、或編碼抗體或片段之核酸的醫藥組合物可進一步包含以下中之一或多者:甘露醇、聚山梨醇酯80、七水磷酸氫二鈉及一水磷酸二氫鈉。在另一實施例中,醫藥組合物可含有10 mM組胺酸(pH 6.5)與至多2%甘胺酸、至多2%甘露醇及至多0.01%聚山梨醇酯80。
醫藥組合物之調配可端視預定投與途徑及其他參數而變化(例如,參見Rowe等人,Handbook of Pharmaceutical Excipients,第4版,APhA Publications,2003)。在一些實施例中,醫藥組合物可為凍乾餅或粉末。凍乾組合物可經重構以供藉由靜脈內注射投與,例如利用無菌注射水(USP)投與。在其他實施例中,組合物可為無菌、非致熱溶液。
本文所述醫藥組合物可包含本文所揭示抗體或其片段、或編碼抗體或片段之核酸作為唯一活性化合物,或該醫藥組合物可包含與另一化合物、組合物或生物材料之組合。例如,醫藥組合物亦可包含一或多種可用於治療與CXCR3相關之疾病或病症(例如T1D)之小分子或其他藥劑。在一些實施例中,醫藥組合物可包含β細胞刺激劑、胰島素及/或產生胰島素之細胞。在一些實施例中,醫藥組合物亦可包含一或多種免疫抑制劑、mTOR抑制劑或自噬抑制劑。免疫抑制劑之實 例包括雷帕黴素(rapamycin)及萬科(velcade)。雷帕黴素亦為mTOR抑制劑。
投與及給藥
在一些實施例中,提供治療罹患與CXCR3相關之疾病或病症之患者的方法,其包含向該患者投與一或多種本文所揭示之抗CXCR3抗體及/或其片段。在一些實施例中,抗體或片段能夠中和CXCR3。在一些實施例中,疾病或病症係發炎性病症。在一些實施例中,病症係T1D。在一些實施例中,投與包含抗體或片段之組合物(例如,醫藥組合物)預防、治療與CXCR3相關之疾病或病症、降低其嚴重程度及/或以其他方式改善其症狀。在一些實施例中,抗體或片段係以足以預防、治療與CXCR3相關之疾病或病症、降低其嚴重程度及/或以其他方式改善其症狀之劑量及頻率投與。
在某些實施例中,提供用於製造用以治療疾病或病症之藥劑的組合物,其中該藥劑包含任一本文所揭示抗體或其片段。例如,抗體或片段可包含三個來自重鏈可變域4.0-4.11中任一者之CDR,該等CDR與三個來自輕鏈可變域4.0-4.7中任一者之CDR配對;三個來自重鏈可變域12.0-12.3中任一者之CDR,其與三個來自輕鏈可變域12.0-12.3中任一者之CDR配對;三個來自重鏈可變域53.0-53.10中任一者之CDR,其與三個來自輕鏈可變域53.0-53.13中任一者之CDR配對;三個來自重鏈可變域82.0-82.3中任一者之CDR,其與三個來自輕鏈可變域82.0-82.3中任一者之CDR配對;或三個來自重鏈可變域135.0-135.3中任一者之CDR,其與三個來自輕鏈可變域135.0-.135.3中任一者之CDR配對。
在一些實施例中,藥劑中之抗體或片段可包含與輕鏈可變域4.0-4.7中任一者配對之重鏈可變域4.0-4.11中之任一者、與輕鏈可變域12.0-12.3中任一者配對之重鏈可變域12.0-12.3中之任一者、與輕鏈可 變域53.0-53.13中任一者配對之重鏈可變域53.0-53.10中之任一者、與輕鏈可變域82.0-82.3中任一者配對之重鏈可變域82.0-82.3中之任一者或與輕鏈可變域135.0-135.3中任一者配對之重鏈可變域135.0-135.3中之任一者。
用於本文所揭示方法中之CXCR3抗體之劑量將基於熟習此項技術者所熟悉之諸多參數而變化,該等參數係例如患者生理機能(大小或表面積、體積、年齡及代謝)及疾病狀態,以及藥理學參數,例如遞送機制、調配及任何同時或依序療法。「有效量」之CXCR3抗體可產生期望活體內效應,例如以下中之一或多者:維持或降低之HA1bc(血紅素A1c)濃度(小於約7%,例如,小於7.5%、7.4%、7.3%、7.2%、7.1%、7.0%、6.9%、6.8%、6.7%、6.6%或6.5%或其間之任何百分比)、增強之內源性胰島素產生及/或循環胰島素濃度、維持或增加之空腹C肽濃度、改良之葡萄糖耐量、在外源性胰島素不存在下降低之空腹血糖濃度、外源性胰島素使用之降低、β細胞發炎之降低及/或增加之β細胞群體及/或生長。亦可使用針對CXCR3抑制之直接細胞分析,例如降低血液中CXCR3+細胞(包括但不限於T細胞)、抑制CXCR3配體結合、GTP結合、鈣流入及/或動員、細胞趨化性及/或受體內在化。
在某些實施例中,有效量之CXCR3抗體使任一上述活體內參數相對於對照改良約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%(或其間之任何百分比)或1倍、2倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或100倍(或其間之任何倍數)或更大。在某些實施例中,改良之特徵可在於在外源性胰島素不存在下空腹血糖濃度降至低於100 mg/dL、110 mg/dL、120 mg/dL、130 mg/dL、140 mg/dL、150 mg/dL、160 mg/dL、180 mg/dL、200 mg/dL、220 mg/dL、240 mg/dL、250 mg/dL、300 mg/dL或350 mg/dL (或其間之任何值)。在某些實施例中,改良之特徵可在於基底血清C肽濃度增至超過0.2 nmol/L、0.3 nmol/L、0.4 nmol/L、0.5 nmol/L、0.6 nmol/L、0.8 nmol/L或1.0 nmol/L(或其間之任何值)。在一些實施例中,改良之特徵可在於在C肽篩查(口服葡萄糖後耐量測試)期間空腹積分血清C肽濃度增至大於約0.03 nmol/L×min、0.033 nmol/L×min、0.04 nmol/L×min、0.05 nmol/L×min、0.06 nmol/L×min、0.07 nmol/L×min、0.08 nmol/L×min、0.09 nmol/L×min、0.1 nmol/L×min、0.2 nmol/L×min、0.4 nmol/L×min、0.5 nmol/L×min、0.6 nmol/L×min、0.8 nmol/L×min或1.0 nmol/L×min(或其間之任何值)。在某些實施例中,CXCR3抗體之有效劑量可藉由相對於對照個體將胰腺中CD4+及/或CD8+細胞之濃度降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%(或其間之任何百分比)或至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍(或其間之任何值)來進一步表徵。
在各實施例中,抗體之有效劑量亦經選擇以為投與人類個體之安全劑量。在某些實施例中,抗CXCR3抗體之安全劑量可表徵為使個體中之T細胞或T細胞活性(CXCR3活性除外)(例如,如由個體血液中之T細胞濃度或活性所量測)無實質性總空乏者。在特定實施例中,「T細胞或T細胞活性無實質性總空乏」意指用CXCR3中和抗體治療之個體中CD4+及/或CD8+細胞之濃度及/或活性(CXCR3活性除外)相對於用安慰劑治療之對照個體及/或相對於治療個體在治療前降低40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%(或其間之任何百分比)或更小。在一些實施例中,安全劑量之特徵進一步在於一或多種選自T regs、B細胞、骨髓細胞、樹突狀細胞及/或顆粒球之細胞類型之濃度相對於對照個體降低40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%(或其間之任何百分比)或更小。
在活體外趨化性分析中ND50為約1-6 μg/mL之抗體對於個體(例如 人類)之實例性非限制性劑量包括約0.03 mg/kg/劑量、0.06 mg/kg/劑量、0.12 mg/kg/劑量、0.24 mg/kg/劑量、0.5 mg/kg/劑量、1.0 mg/kg/劑量、1.5 mg/kg/劑量、2.0 mg/kg/劑量、2.5 mg/kg/劑量、3.0 mg/kg/劑量、3.5 mg/kg/劑量或3.7 mg/kg/劑量(或其間之任何值)。在某些實施例中,抗體可在約0.03-3.7 mg/kg/劑量、0.15-0.7 mg/kg/劑量或0.25-0.5 mg/kg/劑量範圍內投與。
抗CXCR3抗體可以單次投與或在不同時段內以重複投與(例如每天一次、每週一次、每兩週一次、每月一次、每兩月一次、每季一次或每年一次)來投與。因此,在基於上述劑量範圍之非限制性實例中,患者可在治療方案進程內接受0.16-18 mg/kg近似總劑量之CXCR3抗體。
抗CXCR3抗體可藉由熟習此項技術者已知之任何適宜手段投與,包括(例如)經靜脈內、經腹膜內、經鼻、經眼、經口、非經腸、皮下或經皮。在特定實施例中,可向個體之胰腺或靠近胰腺或胰腺之特定區(例如胰腺之胰島細胞)直接投與抗體。
可利用業內已知之轉化因素將在一種動物中達成之有效劑量轉化用於另一動物,包括人類。例如,參見Reagan-Shaw等人,FASEB J.22:659-61(2008);Schein等人,Clin.Pharmacol.Ther.11:3-40(1970);及Freireich等人,Cancer Chemother.Reports 50(4):219-244(1966)。例如,基於動物給藥之人類等效給藥(HED)(mg/kg)可表示為以下方程:HED(mg/kg)=動物劑量(mg/kg)×(Km動物/Km人類),其中Km=體重/表面積(kg/m2)。
基於上述方程之實例性轉化因素示於下表中。上文提供用於人類之實例性劑量可基於該等係數或熟習此項技術者已知之其他手段經調節用於其他物種或其他人類患者。
個體
欲藉由本發明所提供方法治療之個體可包括人類或動物,例如家畜、馴養動物及野生動物。在一些實施例中,動物係鳥類、牛科動物、犬科動物、鯨類動物、馬科動物、貓科動物、羊、魚類/魚、豬科動物、靈長類動物、齧齒類動物或有蹄類動物。個體可處於任何發育階段,包括成人、青年、胎兒或胚胎。在特定實施例中,患者係哺乳動物,且在更特定實施例中,為人類。
在各實施例中,可預防地或在與異常CXCR3活性相關之任何病況或破壞CXCR3信號傳導可在治療上有益之任何病況發作後治療個體。在一些實施例中,可預防地或在T1D發作後治療個體。在一些實施例中,可在T1D發作前使用本文所提供方法預防地治療個體,或可使用本文所提供方法治療患有新發作T1D之個體。
「患有新發作T1D之個體」係不管在臨床診斷出糖尿病時個體年齡有多大,自胰腺之β細胞產生胰島素之能力已降低但仍可檢測的任何個體(例如,包括成人、青年、胎兒或胚胎個體)。在某些實施例中,患有新發作T1D之個體將較佳在最早臨床診斷出T1D後約六個月內(例如,在約1天、1週、2週、3週、4週、5週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或其間之任何時間內)接受治療。在其他實施例中,個體可在最早臨床診斷出T1D後超過六個月接受治療,其中 個體保留大於或等於約0.2 nmol/L(例如,至少約0.2 nmol/L、0.3 nmol/L、0.4 nmol/L、0.5 nmol/L、0.6 nmol/L、0.8 nmol/L或1.0 nmol/L)之最低但可量測之基底血清C肽濃度。在一些實施例中,治療包含投與一或多次包含一或多種本文所揭示抗體之劑量。在一些實施例中,抗體係CXCR3中和抗體。
在一些實施例中,患有新發作T1D之個體在C肽刺激期間保留以下空腹積分血清C肽濃度:至少約0.03 nmol/L×min、0.033 nmol/L×min、0.04 nmol/L×min、0.05 nmol/L×min、0.06 nmol/L×min、0.07 nmol/L×min、0.08 nmol/L×min、0.09 nmol/L×min、0.1 nmol/L×min、0.2 nmol/L×min、0.4 nmol/L×min、0.5 nmol/L×min、0.6 nmol/L×min、0.8 nmol/L×min或1.0 nmol/L×min,例如,約0.03 nmol/L×min至1.0 nmol/L×min或0.033 nmol/L×min至1.0 nmol/L×min。在特定實施例中,個體在C肽刺激期間具有0.033 nmol/L×min至1.0 nmol/L×min之空腹積分血清C肽濃度。在某些實施例中,C肽刺激係口服葡萄糖後測試且可包含在投與10.0-13.9 mmol/L葡萄糖後經60-150分鐘量測積分血清C肽濃度。參見Keymeulen等人,Diabetologia 53:614-623(2010)。在更特定實施例中,個體之可量測口服葡萄糖後耐量測試積分血清C肽濃度增加係小於0.8 nmol/L×min、0.7 nmol/L×min、0.6 nmol/L×min、0.54 nmol/L×min、0.5 nmol/L×min、0.4 nmol/L×min、0.3 nmol/L×min、0.2 nmol/L×min或0.1 nmol/L×min。在更特定實施例中,個體之口服葡萄糖後耐量測試積分血清C肽濃度之增加係0.54 nmol/L×min或更小。C肽對應於胰島素前體肽之殘基57-87(人類參照序列NP_000198),其中殘基90-110及25-54分別對應於胰島素之A及B鏈。
在一些實施例中,患有新發作T1D之個體在外源性胰島素不存在下具有以下升高之空腹血糖濃度:大於約100 mg/dL、110 mg/dL、 120 mg/dL、130 mg/dL、140 mg/dL、150 mg/dL、160 mg/dL、180 mg/dL、200 mg/dL、220 mg/dL、240 mg/dL、250 mg/dL、300 mg/dL、350 mg/dL(或其間之任何值)或更大。在某些實施例中,個體可具有如上文所述升高之空腹血糖濃度以及如上文所述降低之空腹積分血清C肽濃度二者。
在某些實施例中,在診斷出新發作T1D後不久藉由本文所揭示方法治療個體。在更特定實施例中,在臨床診斷出新發作T1D後1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天、或1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週或10週、或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或12個月(或其間之任何時間)內首先藉由本發明方法治療個體。在更具體實施例中,在臨床診斷出新發作T1D後6個月內首先藉由本發明方法治療個體。在其他實施例中,於臨床診斷後之任何時間點藉由本文所揭示方法治療患有T1D之個體,其中該個體保留至少約0.2 nmol/L之殘餘血清C肽濃度。
其他方法
在某些實施例中,本文所提供方法可包含可與投與本文所揭示抗CXCR3抗體同時或依序(之後或之後)投與之其他治療。例如,在一些實施例中,揭示包含向個體投與免疫抑制劑以及抗CXCR3抗體之其他步驟之方法。免疫抑制劑可包括(但不限於)以下中之一或多者:硫唑嘌呤(Azathioprine)(移護寧(Imuran))、β干擾素1a、β干擾素1b、巴利昔單抗(basiliximab)、皮質類固醇、環孢菌素(Cyclosporine)(新體睦(Sandimmune))、環磷醯胺、苯丁酸氮芥、達珠單抗(daclizumab)、去氧精胍啉(deoxyspergualin)、依那西普(Etanercept)、乙酸格拉替雷(glatiramer acetate)、英夫利昔單抗(infliximab)、來氟米特(leflunomide)、巰嘌呤(6-MP)、甲胺喋呤(methotrexate)、米托蒽醌 (mitoxantrone)、莫羅單抗-CD3(Muromonab-CD3)、黴酚酸酯(Mycophenolate)(MFM或CellCept)、那他珠單抗(natalizumab)、阿那白滯素(anakinra)、卡那奴單抗(canakinumab)、利妥昔單抗(rituximab)、貝利木單抗(belimumab)、阿巴他塞(abatacept)、阿地介白素(aldesleukin)、潑尼松(prednisone)、雷帕黴素、西羅莫司(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)及優特克單抗(Ustekinumab)。
在一些實施例中,本文所揭示方法,除投與抗CXCR3抗體外,可包含向個體投與β細胞刺激劑之步驟。投與β細胞刺激劑之步驟可與投與抗CXCR3抗體同時或依序(之後或之後)。實例性β細胞刺激劑包括(但不限於)以下中之一或多者:經移植之β細胞(自體、同種異體或異體同質(syngenic))、經移植之產生胰島素之細胞(同種異體或異體同質)、DDP4(人類蛋白參考序列NP_001926.2)抑制劑、TM4SF20肽(人類蛋白參考序列NP_079071)、TMEM27肽(人類蛋白參考序列NP_065716)、毒蜥肽(exendin 1)或GLP-1(人類蛋白參考序列NP_002045)類似物、gp130及EGF受體配體,以及美國專利申請公開案第20100130476號之第8-11段中所揭示者。在本發明方法中β細胞刺激劑可與免疫抑制劑同時或依序(之前或之後)投與。在某些實施例中,β細胞刺激劑、產生胰島素之細胞及/或免疫抑制劑可藉由植入一種能將β細胞刺激劑、產生胰島素之細胞及/或免疫抑制劑遞送至靶組織或器官之裝置投與。
本文亦揭示檢測及/或定量CXCR3及/或表現CXCR3之細胞(例如CXCR3+ T細胞)之方法。在一些實施例中,該等方法包含使用一或多種本文所揭示之抗CXCR3抗體來檢測及/或定量CXCR3及/或表現CXCR3之細胞。例如,可將一或多種抗體添加至患者試樣(例如血樣)中並使用可檢測標記(例如偶聯至可檢測信號之二級抗體,例如螢光二級檢測抗體)檢測。例如,可使用FACS分選來定量在一級及螢光二 級抗體結合後試樣中CXCR3表現細胞之濃度。
在一些實施例中,診斷方法可用於診斷CXCR3病症或CXCR3相關病症(例如,糖尿病,T1D)。例如,可藉由檢測患者試樣中CXCR3之存在或不存在或藉由比較試樣中CXCR3之濃度與一或多種參照標準物中之濃度來診斷病症,其中與標準物中之濃度之偏差指示病症之存在。
在各實施例中,亦提供包含至少一種抗CXCR3抗體或片段之套組。該等套組可用於各種研究、診斷及治療目的。例如,套組可用於藉由向個體投與含於套組內之抗CXCR3抗體或片段來檢測CXCR3+ T細胞,或治療I型糖尿病。出於分離及純化目的,套組可含有與珠粒(例如,瓊脂糖珠粒)偶合之抗體或片段。在某些實施例中,套組亦包含關於使用抗CXCR3抗體或片段用於期望研究、診斷及/或治療目的之說明書。
在本申請案中,除非另有明確說明,否則使用單數包括複數。此外,在本申請案中,除非另有說明,否則使用「或」意指「及/或」。此外,使用術語「包括(including)」以及其他形式(例如「includes」及「included」)不具有限制性。本文所述任何範圍應理解為包括端點及介於端點間之全部值。
本文所用各部分標題僅出於組織目的,且不應理解為限制所述標的物。本申請案中所引用全部文獻或文獻之部分,包括但不限於專利、專利申請案、文章、書籍及論文,皆出於任何目的以整體引用方式明確地併入本文中。在以引用方式併入之出版物及專利或專利申請案與含於本說明書中之本發明相矛盾之程度下,本說明書將代替任何矛盾材料。
與本申請案中所揭示參照基因序列相關之全部資訊,例如GeneID或登錄號,包括(例如)基因組基因座、基因組序列、功能注 解、等位基因變體及參照mRNA(包括例如外顯子邊界)及蛋白序列(例如保守域結構),皆以整體引用方式併入本文中。
實例
以下實例用於闡釋本發明,且決不限制本發明。
實例1:材料及方法
免疫原之產生. 用編碼全長人類CXCR3之DNA轉化CHO細胞並在細胞表面(「r-CXCR3-CHO細胞」)上表現CXCR3。獲得用於轉化細胞之CXCR3序列並將CXCR3開放閱讀框置於表現載體pcDNA3.1neo_DEST中,且隨後轉染至300-19細胞(Immunogen)中。藉由C端半胱胺酸將CXCR3胞外域(EC域)之N端肽片段(具有胺基酸序列MVLEVSDHQVLNDAEVAALLENFSSSYDYGENESDSC(SEQ ID NO:81))偶聯至KLH,且用作免疫原。使表現CXCR3之細胞維持於37℃在5% CO2下在補充有10%經透析胎牛血清(FBS)(Invitrogen)之RPMI(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中。藉由用補充有5mM EDTA之磷酸鹽緩衝(無Ca/Mg)鹽水(CMF-PBS)替代上述培養基且在該緩衝液中收穫細胞來準備注射用細胞。藉由以500×g離心約5分鐘使所收穫細胞沈澱,藉由將沈澱物再懸浮於CMF-PBS中且如前所述離心洗滌一次,計數,並藉由將細胞沈澱物再懸浮於CMF-PBS中調節至適於注射之體積(例如5×106個細胞,存於0.2ml中)。
抗體製備. 使用人類CXCR3之N端37個胺基酸來產生抗人類CXCR3之小鼠單株雜交瘤,且選擇五種抗體純系(4、12、53、82及135)進行進一步表徵。人類CXCR3之37個胺基酸N端與小鼠CXCR3中之配對區65%同源且含有對於CXCL9、CXCL10及CXCL11結合至關重要之殘基。用表現CXCR3或CXCR3之胞外肽之細胞對約6-8週齡BALB/c小鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)實施免疫。在第0天用與佐劑(TiterMax Gold,Sigma Aldrich,編號T2685-1ML)混 合之KLH偶聯肽之1:1乳液經皮下(SC)對一組小鼠實施初免,以2-3週間隔用肽對佐劑之1:1乳液經SC或用存於無佐劑之PBS中之細胞經腹膜內(IP)強化3-5次,且在處死前連續兩天用存於PBS中之肽及/或細胞(全部不含佐劑)經由IP強化。以2-3週間隔經IP對另一組小鼠實施3-5次初免且在處死前連續兩天用存於PBS中之細胞經由IP強化。對於兩組小鼠而言,各注射在約100 μl體積中含有約2×10^6個細胞。
在最後一次注射後次日,處死小鼠並移出脾且將其置於約10 ml存於培養皿中之無血清DMEM(Gibco)中。使用50%(w/w)PEG基於Kohler及Milstein(Nature,256:495-7,(1975))之方法將Sp2\O小鼠骨髓瘤細胞(ATCC CRL-1581)與來自經免疫小鼠之脾細胞融合。在程序結束時,將細胞再懸浮於50 ml ClonaCell-Hy雜交瘤回收培養基(StemCell Technologies)中,轉移至T75 cm2燒瓶中且在37℃下培育16-24 hr。在此培育後,收穫細胞並將其添加至100 ml ClonaCell-HY甲基纖維素選擇培養基(StemCell Technologies)中。然後將此混合物等分至十個100 mm2組織培養皿中且培育10-14天。將純系雜交瘤自甲基纖維素轉移至液體培養基中且使其在96多孔板中生長用於分析,以鑑別對CXCR3具有特異性之單株抗體。
除非另有說明,否則該等實例中所提及抗體變體(例如Hu4.1)係指含有相同編號之重鏈變體及輕鏈變體之抗體(例如,Hu4.1將含有重鏈4.1及輕鏈4.1)。所有提及之抗體與表2中所示抗體編號及VH/VK鏈配對一致。
動物. 雌性NOD/LtJ小鼠係購自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)且維持在無病原體條件下。藉由於10週齡開始進行每週兩次尾靜脈穿刺使用ACCU-CHEK®微型Plus血糖計(Roche,Indianapolis,IN)針對糖尿症篩選小鼠。當連續三天量測血糖高於250 mg/dL時,認為小鼠患有糖尿病。在治療開始後最少100天觀察小鼠。全部動物實驗皆 經內部(in-house)IACUC批準。
抗體注射. 對於預防研究而言,於10週齡開始每週一次用100 μg抗體經腹膜內(i.p.)注射糖尿病前期NOD小鼠,保持6週。對於逆轉研究而言,在認為小鼠患有糖尿病後1週內將動物隨機募集於治療組中,每天量測血糖兩次,讀數間隔至少六小時,且在研究持續時間內藉由腹膜內注射向血糖高於250 mg/dL之小鼠投與胰島素。認為治療組中連續30天維持胰島素獨立性之小鼠已逆轉。第五次治療與第六次治療之間收穫五隻來自各組之小鼠且收穫淋巴器官、血液、骨髓及胰腺以供細胞分析。在研究結束時,收穫胰腺且經處理以供組織學及免疫組織化學分析。抗小鼠CXCR3抗體純系CXCR3-173(Uppaluri等人,2008)及倉鼠IgG對照抗體係購自BioLegend(San Diego,CA)。
FACS分析. 製備脾、腹股溝淋巴結、胰腺淋巴結及骨髓之單細胞懸浮液。將胰腺剪成小塊並在2 mg/ml膠原酶D(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)中在37℃下培育30分鐘,經由70微米細胞濾器(BD Biosciences,San Jose,CA)過濾,且使用密度梯度離心自胰腺組織分離淋巴球。用以下物質將細胞染色:APC標記抗小鼠CD25、FITC標記抗小鼠CD4及PE標記抗小鼠Foxp3(eBiosciences,San Diego,CA),其用於調節性T細胞(T reg);PerCP標記抗小鼠CD8α、PE標記抗小鼠CD44、APC標記抗小鼠CD62L及PeCy7標記抗小鼠CXCR3,其用於活化/記憶T細胞;及FITC標記抗小鼠CD94、PerCP標記抗小鼠CD4、APC標記抗小鼠B220、PeCy7標記抗小鼠CD11c、太平洋藍(Pacific blue)標記抗小鼠CD11b及PE標記抗小鼠NKp46,其用於B細胞、骨髓細胞、樹突狀細胞、NK細胞及NKT細胞。在冰上用抗小鼠CD16/32封阻20 min後在4℃下將細胞培育30 min。對於T reg染色劑而言,實施表面染色,將細胞洗滌,固定且在Cytofix/Perm緩衝液(eBiosciences)中進行透化處理,然後在冰上用抗小鼠Foxp3抗體染色30 min。在染 色後,將細胞洗滌兩次,固定於多聚甲醛中且捕獲於LSRII細胞儀上,並使用Flow Jo軟體(Treestar,Ashland,OR)分析數據。除非另有說明,否則全部抗體皆係購自BD Biosciences。
趨化性分析. 在帶有5 μm膜之transwell可滲透載體之24孔板(Costar)中實施趨化性分析。將CXCR3轉染之300.19細胞以1×106個細胞於2.5%熱不活化胎牛血清之RPM1640中(0.2 ml總體積)置於transwell插入物中。單獨或補充有重組趨化因子300 ng/ml CXCL9(MIG)、100 ng/ml CXCL10(IP-10)或100 ng/ml CXCL11(I-TAC)之培養基置於下區室(0.6 ml)中且將含有細胞之transwell插入物加載至下區室中。在5% CO2加濕培育器中在37℃下將板培育4-5小時。在培育時期後,移出transwell插入物並彙集下區室中之全部培養基且藉由以1200 RPM離心5 min使細胞沈澱。抽出培養基,且在37℃下用鈣黃綠素AM(最終為10 μg/ml)將細胞染色30分鐘。使細胞沈澱並洗滌,添加培養基(0.1 ml),且將懸浮液轉移至96孔黑壁透明底板中。以1200 RPM對板實施脈衝處理以使細胞沉降,且於Flexstation上在490/520 nm下量測螢光。全部條件皆係以一式三份測試。所得數據皆表示為遷移細胞之平均相對螢光單位(RFU)。參見圖14A-C及圖15A-C。
對於利用CXCR3封阻進行之趨化性分析而言,在用於趨化性分析之前,在37℃下用不同量之封阻抗體或對照IgG將CXCR3轉染300.19細胞預處理20-30分鐘。在分析培育期間並未洗淨抗體,而是一直存在。
使用FLIPR進行鈣動員分析. 於80%鋪滿時藉由用PBS+2 mM EDTA處理來收穫表現hCXCR3之人類胚腎293(HEK)細胞。將細胞以1×106個細胞/mL之密度懸浮於無血清HEK-SFM培養基中。將15 μL(15,000個細胞)懸浮液分配至384孔板之各孔中。在室溫下藉由添加15 μL經重構FLIPR鈣4染料對細胞實施30分鐘染料加載。將抗人類 CXCR3抗體純系及同種型對照在HBSS+20 mM HEPES+1% BSA中連續稀釋(3倍)以產生10種測試濃度/純系。在相同板上以-式兩份(n=2)測試各測試濃度。將15 μL測試濃度添加至各孔中之細胞中且在室溫下將板培育1小時。將代表誘發胞內鈣動員之EC80之固定濃度之CXCL11(R & D Systems)於FLIPR上添加至各孔中並隨時間監測螢光變化。將各孔之最大反應正規化為基線且在平均後使用GraphPad Prism將數據擬合至四參數方程並測定各純系之IC50。參見圖14D及圖21。
Biacore親和力分析. Biacore表面準備. 使用Biacore T100動力學/親和力分析計算小鼠α-人類CXCR3雜交瘤抗體純系4、12、53、82及135與人類CXCR3肽之結合親和力。用兔抗小鼠-Fc(RAM-Fc)捕獲抗體(GE編號BR-1008-38)使用標準胺偶合程式固定Biacore CM5系列S感測器晶片(GE編號BR-1006-68)。使用0.1 M N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)與0.4 M N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)之1:1混合物活化晶片之羧甲基葡聚糖表面,以使表面結合捕獲抗體上之反應性胺基。在抗體固定後,使用1 M乙醇胺鹽酸鹽/NaOH(pH 8.5)淬滅反應性感測器晶片表面。固定在一個流動小室上產生8,000 RU RAM-Fc捕獲抗體。在數據分析期間使用另一空白流動小室作為之參照扣減用表面。
Biacore分析條件. 將Biacore T100儀器試樣室溫度及分析溫度分別設定為4℃及25℃。在HBS-EP+運行緩衝液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.05% P20表面活性劑、3 mM EDTA,pH 7.4)中將小鼠抗hCXCR3抗體稀釋至500 nM,並使用三十秒注射以10 μl/min加以捕獲。該等條件可穩定捕獲約1,200 RU所測試各小鼠抗hCXCR3純系。在HBS-EP+中將hCXCR3肽稀釋至200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM及0 nM濃度。對於各分析循環而言,以50 μl/min流速經五分 鐘注射肽以量測締合,隨後在HBS-EP+中以50 μl/min流速洗滌十分鐘以量測解離。以50 μl/min經三分鐘使用10 mM甘胺酸-HCl pH 1.7在分析循環之間使捕獲表面(RAM-Fc)再生。在Biacore T100動力學評估軟體v2.0(GE Healthcare)中實施分析。利用參照流動小室及0 nM濃度扣減(雙參照扣減)將感測圖擬合至1:1結合模型。
Biacore全受體分析. 利用桿狀病毒載體在昆蟲Sf9細胞中表現具有C端6×His及HPC4標籤之全長人類CXCR3受體蛋白。然後經由Ni-NTA及HPC4親和力純化來純化受體蛋白。將最終產物緩衝液交換至10 mM HEPES、300 mM NaCl、0.5%正十二烷基β-D-吡喃麥芽糖苷及5%甘油中。經由Ni-螯合在NTA晶片上捕獲受體蛋白且藉由胺偶合使用0.1 M N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)與0.4 M N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)之1:1混合物之1:10稀釋混合物使其進一步穩定。藉由注射20 nM hCXCL10及hCXCL11配體測試經穩定受體表面之配體結合活性。對於動力學分析而言,在HBS-EP+中將人類CXCR3配體(hCXCL9、hCXCL10及hCXCL11)稀釋至20 nM、10 nM、5 nM、2.5 nM、1.25 nM、0.6125 nM、0.3125 nM及0 nM濃度。在HBS-EP+中將抗CXCR3抗體稀釋至80 nM、40 nM、20 nM、10 nM、5 nM、2.5 nM、1.25 nM及0 nM濃度。以50 μl/min流速經五分鐘注射分析物以量測締合,且然後在HBS-EP+中以50 μl/min流速洗滌十分鐘以量測解離。以50 μl/min經1分鐘使用10 mM甘胺酸-HCl pH 1.7在分析循環之間使受體表面再生。在Biacore T100動力學評估軟體v2.0(GE Healthcare)中實施分析。利用參照流動小室及0 nM濃度扣減(雙參照扣減)將感測圖擬合至1:1結合模型。
葡萄糖耐量測試. 在葡萄糖篩查前晚上,監測非空腹血糖且停止糖尿病動物之胰島素治療。使小鼠禁食12小時,隨後以2 mg/g體重經腹膜內注射D-葡萄糖(20%;Sigma)。在注射前及注射後15分鐘、30分 鐘、60分鐘及120分鐘量測血糖。
實例2:NOD小鼠之表徵
針對胰島素、CXCL10及T細胞標記物CD3將來自6至10週齡糖尿病前期雌性NOD小鼠及新發作糖尿病雌性NOD小鼠之包埋於石蠟中的代表性胰腺切片染色。圖1. 檢測NOD小鼠之胰腺中由浸潤細胞包圍之胰島內之CXCL10表現(圖1之中行中之箭頭)。年齡較大糖尿病前期及新發作糖尿病小鼠中T細胞對胰島之浸潤顯著增加(圖1,右行)且胰島內之胰島素產生降低(圖1,左行)。
為進一步評估NOD小鼠之胰腺中是否存在CXCR3+ T細胞,對自患有新發作糖尿病之雌性NOD小鼠收穫之胰腺組織實施流式細胞術分析。圖2. 對CD4+/TCR+及CD8+/TCR+ T細胞評估CXCR3表現。用同種型對照抗體染色表示為陰影曲線。對自若干小鼠收穫之經彙集胰腺組織之單一細胞懸浮液實施流式細胞術。數據指示,在NOD小鼠之胰腺中存在CXCR3+細胞毒性及輔助T細胞。
實例3:用抗CXCR3抗體預防性治療NOD小鼠
於10週齡開始每週一次用100 μg倉鼠抗小鼠CXCR3抗體(純系CXCR3-173,購自BioLegend,San Diego,CA)或用對照倉鼠IgG或PBS治療糖尿病前期雌性NOD小鼠,保持六週。每週兩次監測血糖且在展現連續三次血糖讀數高於250 mg/dL後,認為動物患有糖尿病並將其無痛處死。圖3顯示各治療組隨時間產生糖尿病之小鼠之百分比。各線代表十隻小鼠/組之組合結果。顯示兩次獨立研究之結果(圖3A及3B)。該等曲線圖闡釋,用抗CXCR3抗體進行預防性治療防止糖尿病前期雌性NOD小鼠發生糖尿病。
為進一步評估預防性抗CXCR3抗體投與之效應,針對胰島素(圖4,左面板)、CD3及Foxp3(圖4,中面板及右面板)將來自用抗CXCR3抗體治療之雌性NOD小鼠之代表性胰腺切片染色。圖4中之右側面板 係中面板中所示切片之放大率增加之影像。於研究期結束(26週齡)時自小鼠收穫胰腺組織。圖4顯示,在用抗CXCR3抗體治療之NOD小鼠中存在胰島素陽性胰島,而大多數T細胞包圍胰島且尚未侵襲其中。
實例4:NOD小鼠之新發作糖尿病之逆轉
認為連續三次血糖讀數高於250 mg/dL之雌性小鼠患有糖尿病並將其隨機募集於治療組中。在募集後一週內開始治療。每週一次用PBS、抗小鼠CXCR3抗體(100 μg,經腹膜內投與,純系CXCR3-173)或對照IgG(100 μg,腹膜內投與)治療小鼠,保持六週,或於第0天及第4天用鼠類抗胸腺細胞球蛋白(mATG;500 μg,腹膜內投與)治療小鼠。在募集後,於早上及下午(二者間隔至少六小時)量測血糖,且藉由腹膜內注射將胰島素僅投與血糖高於250 mg/dL之小鼠。顯示個別小鼠每天之早上血糖值(圖5)。自用8-10隻小鼠/組/研究進行之四次獨立逆轉研究彙集數據。數據顯示,在用抗CXCR3抗體治療後逆轉NOD小鼠之新發作糖尿病。
為評估用抗CXCR3抗體治療之小鼠之胰腺中T細胞亞群之變化,彙集來自四隻小鼠/治療組(經PBS、抗小鼠CXCR3、對照IgG或mATG治療之小鼠)之胰腺之單細胞懸浮液,針對T細胞染色且藉由流式細胞術分析。在PBS、抗小鼠CXCR3或對照IgG之第五次治療劑量後數天且自年齡匹配mATG-治療小鼠收穫胰腺組織。CD4+及CD8+ T細胞在懸浮液中之百分比中示於圖6A中。圖6B顯示來自用PBS(左)、對照IgG(中)及抗小鼠CXCR3抗體(右)治療之小鼠之胰腺中CD4+ T細胞之CD44及CD62L的表現。指示各治療組在門1(G1;CD44hiCD62Llo)中之細胞之百分比(PBS為67.3%,對照IgG為67.1%,且抗CXCR3治療為30.4%)。圖6C係與用同種型對照抗體染色且針對淋巴球設門之細胞相比,CD4+ T細胞在如圖6B中所界定之門1(G1)或門2(G2)中之CXCR3表現的曲線圖。
為評估在用抗CXCR3治療逆轉之NOD小鼠中是否存在胰島素陽性胰島,自用對照IgG(左面板)、抗小鼠CXCR3抗體(中面板)或鼠類ATG(右面板)治療之雌性NOD小鼠製備石蠟包埋胰腺切片,且針對胰島素染色(頂列)或針對CD3及Foxp3共染色(底列)。參見圖7。於研究結束(在募集後約100天)時自小鼠收穫胰腺組織。經染色切片顯示,在用抗CXCR3治療逆轉之NOD小鼠中存在胰島素陽性胰島,且T細胞包圍胰島,但很少侵襲胰島。
為評估對葡萄糖篩查之反應,實施葡萄糖耐量測試。圖8. 使年齡匹配雌性無糖尿病NOD小鼠(圖8A)、已用PBS治療之糖尿病NOD小鼠(圖8B)、用抗小鼠CXCR3治療逆轉之糖尿病NOD小鼠(圖8C)及已用IgG治療之糖尿病NOD小鼠(圖8D)禁食過夜且藉由腹膜內注射葡萄糖進行篩查。在篩查前(時間0)及在所示時間篩查後量測血糖。顯示4-5只小鼠/治療組之代表性數據。數據闡釋,抗CXCR3抗體治療改良募集後100天空腹葡萄糖耐量。
實例5:T細胞之授受性轉移
為評估來自用抗CXCR3抗體(純系CXCR3-173)治療且展現疾病緩解之NOD小鼠之T細胞在接受者動物中誘導糖尿病之能力,藉由靜脈內注射將所分離CD4+及CD8+ T細胞授受性轉移至接受者NOD.scid(非肥胖型糖尿病-重症聯合免疫缺陷)小鼠中。圖9顯示在授受性轉移所分離CD4+及CD8+ T細胞後無糖尿病小鼠隨時間之百分比,該等T細胞係來自用PBS或對照IgG治療之糖尿病小鼠或在用鼠類ATG或抗小鼠CXCR3抗體治療後疾病緩解之小鼠。自募集後80-90天自不同治療組中之雌性NOD小鼠收穫之脾、胰腺淋巴結及腹股溝淋巴結分離CD4+及CD8+ T細胞。彙集CD4+及CD8+ T細胞且將總共8百萬個細胞授受性轉移至NOD.Scid接受者中,並藉由每兩週量測血糖一次來監測糖尿病之發生。圖9中之各線代表來自五隻小鼠/組之組合數據。顯 示兩次代表性研究(圖9A及9B)。來自抗CXCR3抗體治療小鼠之所分離T細胞展現疾病轉移延遲。
進一步表徵所分離供體T細胞。圖10A顯示如前一段落中所述自用PBS、抗小鼠CXCR3抗體、對照IgG或鼠類ATG治療之小鼠分離之供體T細胞中總CD4+及CD8+ T細胞之百分比(左面板)。圖10A之右面板顯示各供體細胞懸浮液中T細胞亞群中為CD4+(上面板)及CD8+(下面板)之效應及中央記憶T細胞之百分比,如藉由CD44及CD62L之表現所界定。將所分離彙集CD4+及CD8+ T細胞在轉移前針對CD44及CD62L表現進行染色,捕獲於流式細胞儀上並分析。亦對所分離供體T細胞彙集物中之調節性T細胞之百分比進行評估。圖10B顯示各治療組之調節性T細胞之百分比,如藉由CD4及CD25表現或藉由CD4、CD25及胞內Foxp3表現所界定。圖10C顯示供體細胞中亦表現CXCR3之CD8+(左面板)及CD4+(右面板)T細胞之百分比。數據顯示,來自用抗CXCR3抗體治療逆轉之小鼠之供體細胞中CXCR3+ T細胞之百分比有所降低。
使用1型糖尿病之RIP-OVA模型評估在授受性轉移OT-1 CD8+供體T細胞後CXCR3治療之有效性。RIP-OVA小鼠係轉基因小鼠,其中已將由大鼠胰島素啟動子(RIP)驅使之編碼卵白蛋白蛋白(OVA)之轉基因引入小鼠基因組中且使胰島β細胞中膜形式之卵白蛋白表現。小鼠之背景品系係C57BL/6且RIP-OVA小鼠不會自發地產生糖尿病。RIP-OVA小鼠亦稱為C57BL/6-Tg(Ins2-TFRC/OVA)296Wehi/WehiJ,係購自Jackson Laboratory。該等小鼠在授受性轉移購自Jackson Laboratory之OT-1 TCR(T細胞受體)轉基因小鼠(Kurts等人,J Exp Med 184:923-930)之卵白蛋白特異性CD8+ T細胞後產生糖尿病。OT-1小鼠含有小鼠TCRa-V2及TCRb-V5基因之轉基因插入物(Hogquist等人,Cell 76:17-27)。在MHCI H2Kb蛋白之背景下,轉基因TCR識別卵白蛋白殘 基。OT-1小鼠中大於95%之CD8+ T細胞表現轉基因TCR且識別卵白蛋白肽並由其活化。
圖11顯示在將OT-1 CD8+ T細胞授受性轉移至RIP-OVA接受者小鼠中後,無糖尿病小鼠隨時間之百分比,該等小鼠在轉移OT-1 CD8+ T細胞後隨後保持未經治療,用抗小鼠CXCR3抗體治療,或用對照IgG治療。在授受性轉移後1天(研究1及研究2)或7天(研究2)開始治療(100 μg,經腹膜內)且每週給予兩次,持續3週。各線代表五隻小鼠/組之組合數據。兩次研究之結果示於圖11A及11B中。數據顯示,抗CXCR3抗體治療保護RIP-OVA模型中小鼠免於產生糖尿病。
圖12提供表徵在將OT-1 T細胞授受性轉移至RIP-OVA接受者小鼠中後不同治療之有效性的其他數據。圖12A顯示在授受性轉移至RIP-OVA接受者中之前藉由流式細胞術所分析供體T細胞之CXCR3表現。用同種型對照抗體染色係由陰影曲線代表。圖12B顯示在將OT-1 T細胞授受性轉移至用抗小鼠CXCR3抗體或對照IgG治療之RIP-OVA接受者小鼠中後在所示時間下血液、脾及胰腺淋巴結(pLN)中供體細胞之百分比。在T細胞轉移後一天開始抗體治療(100 μg,經腹膜內)且每週給予兩次,持續兩週。各點代表一隻個別小鼠之數據。圖12C指示在授受性轉移後在所示時間下用抗小鼠CXCR3抗體或對照IgG治療之RIP-OVA接受者小鼠中之血液、脾及胰腺淋巴結(pLN)中因應自體抗原(OVA)刺激而增殖之供體細胞數。在OT-1 T細胞轉移後一天開始抗體治療(100 μg,經腹膜內)且每週給予兩次,持續兩週。各點代表一隻個別小鼠之數據。圖12D顯示在將OT-1 T細胞授受性轉移至用抗小鼠CXCR3抗體或對照IgG治療之RIP-OVA接受者小鼠中後在所示時間下血液、脾及胰腺淋巴結(pLN)中CXCR3表現供體細胞之百分比。在OT-1 T細胞轉移後一天開始抗體治療(100 μg,經腹膜內)且每週給予兩次,持續兩週。各點代表一隻個別小鼠之數據。用抗 CXCR3抗體治療使RIP-OVA小鼠中CXCR3+ T細胞之百分比降低。
圖13顯示保持未經治療且針對胰島素(圖13A)或CD3(圖13B)染色或用抗小鼠CXCR3抗體治療且針對胰島素(圖13C)或CD3(圖13D)染色之RIP-OVA接受者小鼠的代表性石蠟包埋胰腺切片。在OT-1 T細胞轉移後一天開始抗CXCR3治療(100 μg,經腹膜內)且每週給予兩次,持續3週。在研究結束(T細胞轉移後約60天)時收穫胰腺組織。切片顯示用抗小鼠CXCR3抗體治療之RIP-OVA小鼠中缺乏T細胞浸潤。
實例6:抗人類CXCR3抗體純系之評估
使用上文材料及方法部分(實例1)中所述之方法評估抗人類CXCR3抗體純系Cl 4、12、53、82及135對CXCR3趨化性及鈣動員之效應。對於趨化性分析而言,在添加至趨化性分析中之前,在單獨或具有如圖14A-C中所示不同濃度之抗體之培養基中預培育人類CXCR3轉染300.19細胞。圖14A-C顯示,純系Cl 4、12、53、82及135抑制CXCR3介導之向CXCL 11之趨化性。圖14中之純系2與純系4一致。
對於鈣流動分析而言,在添加至FLIPR中之前根據上文材料及方法部分(實例1)中所述之方法在不同濃度之抗體中預培育人類CXCR3轉染HEK細胞。各抗體將鈣動員抑制50%所需之抗體濃度示於圖14D中。圖14D顯示,純系Cl 4、12、53及135抑制CXCR3介導之向CXCL11之鈣動員。
為進一步評價純系4、12、53、82及135對趨化性之效應,在添加至趨化性分析中之前在單獨或具有50 μg/ml抗體之培養基中預培育hCXCR3轉染300.19細胞,且評價向CXCL9(圖15A)、CXCL10(圖15B)及CXCL11(圖15C)之遷移。數據顯示,純系4、12、53、82及135抑制向CXCL10及CXCL11之遷移且部分地抑制向CXCL9之遷移。
為評估純系4、12、53、82及135之特異性,分析抗體與其他趨化因子受體之結合。用人類CXCR1、CXCR5、CXCR2、CXCR4或 CCR5轉染300.19細胞且藉由與抗人類CXCR3抗體純系一起培育、之後進行二級抗體染色及流式細胞術來分析抗體結合。單獨投與二級抗體用作陰性對照。用人類CXCR3轉染之300.19細胞用作純系染色之陽性對照。圖16顯示抗體與表現不同趨化因子受體之細胞結合之直方圖,顯示純系4、12、53、82及135不結合其他趨化因子受體且對CXCR3具有特異性。
在趨化因子受體結合分析中採用標準流式細胞術程序。簡言之,藉由維耳新處理(Versene treatment)收穫細胞系且將各細胞系分成七個試樣。在冰上與一種一級抗體(5 μg/ml)一起培育各試樣,之後用FITC偶聯二級抗體染色以檢測經結合一級抗體。作為陰性對照,單獨用二級抗體將細胞染色(無一級抗體培育)。一級抗體係抗人類CXCR3抗體純系或抗人類CXCR3對照抗體純系1C6。在染色後,將細胞捕獲於流式細胞儀上並使用FlowJo軟體分析數據。圖16中之各線代表用一種一級抗體及二級抗體或單獨用二級抗體染色之細胞之個別試樣。
使用Biacore分析根據上述方法(實例1)分析純系4、12、53、82及135之親和力(Ka)及離解速率(Kd)。結果匯總於下表4中。
實例7:表位定位
使用來自CXCR3 N端胞外域之截短生物素化人類CXCR3肽(16個胺基酸N端片段)測定純系4、12、53、82及135之表位。產生一系列丙 胺酸取代片段(參見下表5,丙胺酸取代,粗體)且將其生物素化。藉由Octet®(ForteBio,Menlo Park,CA)及BiacoreTM(GE Healthcare)分析評估表位定位。
對於Octet分析而言,將肽再懸浮於80% DMSO中且在PBS中稀釋至10 μg/ml。在PBS中將抗體純系4、12、53、82、135及商業純系1C6(BD Biosciences)稀釋至120 nM。在Octet QK系統(ForteBio)上以96孔板模式(300 μl/孔)實施動力學分析。各分析板包括N端生物素化全長WT hCXCR3 ECD肽(Abgent)作為陽性對照,以及PBS緩衝液空白用於參照扣減。將Octet抗生蛋白鏈菌素生物感測器(ForteBio)於PBS中預浸漬至少五分鐘,隨後運行分析。對於基線而言,首先將生物感測器浸入PBS中不振盪保持五分鐘。對於所有其餘步驟而言,振盪速度係1000 rpm。將生物感測器浸於肽溶液中保持五分鐘以加載肽。實施在PBS中保持五分鐘之另一基線步驟。然後將生物感測器浸於抗體溶液中保持十分鐘以量測締合。最後,將生物感測器轉移至PBS中保持十五分鐘以達成解離。使用Octet Data Analysis v7.0分析感測圖。將結合活性表示為各抗體與WT全長hCXCR3肽相比之最大反應量之百分比。
在表位熱圖中記錄相對反應量。對野生型hCXCR3 ECD肽之最大感測圖反應在4-8 nm範圍內。各純系篩選具有獨特表位。所測試突變體皆未完全消除純系1C6之結合。10位纈胺酸殘基及13位天冬胺酸在所有所篩選抗體之結合中起作用。抗體12及1C6具有最N端表位,其中5位纈胺酸突變影響二者之活性。抗體82具有最C端表位,且結合活性降低於9位麩醯胺酸開始。基於該等數據,各抗體之XCR3序列上之胺基酸表位邊界如下:Cl 4:胺基酸7-13;Cl 12:胺基酸5-13;Cl 53:胺基酸7-13;Cl 82:胺基酸9-15;Cl 135:胺基酸7-13;及純系1C6:胺基酸5-13。
對於Biacore分析而言,在HBS-EP+運行緩衝液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005%聚山梨醇酯20)中將肽稀釋至10ng/ml。使用Biacore T100TM,以5μl/min之速率將肽注射於CM5-SA(GE編號BR-1005-31)晶片上直至每流動小室獲得20反應單位(RU)穩定捕獲為止。各晶片上之流動小室1保持空白用於參照扣減。在各晶片之一個流動小室上包括野生型37個AA之hCXCR3肽作為陽性對照。在HBS-EP+將小鼠抗hCXCR3抗體4、12、53、82及135稀釋至50nM、25nM、12.5nM、6.25nM及3.125nM。對於各循環而言,以50μl/min之流速將抗體注射三分鐘以量測締合,之後以50μl/min將緩衝液注射三分鐘以量測解離。在循環之間使用10mM甘胺酸-HCl pH 2.0以50μl/min保持六十秒使肽表面再生。將感測圖擬合至1:1結合模型且在BiaEvaluation v2.0.1中使用雙參照扣減進行分析並將其捕獲於抗生蛋白鏈菌素生物感測器上。典型反應量在0-500RU範圍內,且測定「強」、「中度」及「弱」結合反應之截止值。記錄相對反應量以產生表位圖。將離解速率分級,且亦記錄產生快Kd值(大於0.001s-1)之肽。
所有抗體皆結合至野生型hCXCR3且在hCXCR3序列之前16個AA內。純系4、12、53、82及135之結合數據示於表6中,且顯示各抗體純系結合活性所需最小表位之邊界的對應圖示於圖18中,其中重要殘基以X標記。所有抗體表位皆定位於人類CXCR3序列殘基6-15內,即參與CXCL10及CXCL11結合之區。藉由在CXCR3肽片段中之給定位置處進行丙胺酸取代後檢測結合反應降低來測定表位內之胺基酸。純系53及135具有最類似表位。純系4及12具有最N端表位(結合強度影響於五位纈胺酸開始)。純系82具有最C端表位,其中結合活性降低於9位麩醯胺酸開始。除82外之每一純系需要CXCR3中之7位天冬胺酸。CXCR3中之十位纈胺酸及十三位天冬胺酸二者在所有純系之結合中皆起作用。五種純系之小鼠、嵌合及人類化形式間之表位沒有差異。
圖例
+++ 強結合反應(>300 RU)
++ 中等結合反應(150-300 RU)
+ 弱結合反應(10-150 RU)
- 無結合(<10 RU)
*快離解速率(Kd>0.001),但較強結合反應(>10 RU)
實例8:抗人類CXCR3純系之人類化
產生五種抗CXCR3純系(純系4、12、53、82及135)中每一者之四種變體(嵌合、人類化1(Hu1)、Hu2及Hu3)。20。所有嵌合變體皆係藉由「彙集物表現」產生用於活體內動物模型研究。用含有嵌合CXCR3抗體純系4、12、53、82及135之重鏈及輕鏈之表現載體將適於懸浮培養之CHO-DXB11細胞(Urlaub及Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.,77:4216-20,(1980))電穿孔。該等表現載體亦含有用於選擇穩定CHO轉染子之二氫葉酸還原酶基因。在選擇100 nM甲胺喋呤後,使用經穩定轉染CHO彙集物在具有OptiCHO培養基之振盪燒瓶中完成生物產生運行。使用標準蛋白A層析自條件化培養基純化重組嵌合抗體。將Hu1純系CDR移植至人類框架區上且進行完全人類化,不包括小鼠CDR之胺基酸及任何游標位殘基。Hu2純系係「經擴增CDR」純系,且具有在位於小鼠CDR之四個胺基酸內之殘基處具有自Hu1序列之回復突變變化。Hu3純系在位於使用基於IMGT之建模鑑別為在小鼠與人類之間「極不類似」之位置處包括自Hu2序列之其他回復突變。在CHO-NRC細胞中瞬時表現二十個總變體且經純化用於活體外分析。
針對純系4及53實施其他人類化。重鏈4.7-4.11包括超出CDR範圍之其他人類化回復突變,以及修飾以去除VH CDR2中58位及59位(IMGT編號)之去醯胺位點,以試圖改良純系穩定性。特定而言,用諸多替代殘基替代VH 4.2中之去醯胺位點。純系VH 53.4-53.6及VL 53.4-53.9包括超出CDR範圍之其他人類化回復突變,特定而言以試圖使鏈較類似於VH 4.1及VL 4.1。
實例9:全受體結合動力學
使用Octet®及BiacoreTM利用完整CXCR3肽評估二十種抗CXCR3 變體之結合動力學。如前文所述實施Octet分析。對於Biacore分析而言,將三種經管柱步驟純化之人類野生型CXCR3肽經C端His及HPC4標記且經由鎳螯合及胺偶合捕獲於NTA晶片上。使用中等RU(約1200 RU)晶片用於較佳數據品質且使二價結合效應最小化。將0-80 nM抗體試樣注射於受體上。使用感測圖利用用於較佳曲線擬合之局部Rmax擬合實施標準BiacoreTM評估分析。評估四種變體(嵌合(Ch)及人類化(Hu)1-3)與五種純系(4、12、53、82及135)之結合曲線。出於比較目的,亦評估人類CXCR3配體CXCL9、CXCL10及CXCL11以及小鼠CXCL11(mCXCL11)之結合動力學。結果示於下表7A(藉由KD分級)及7B(藉由Kd分級)中。藉由KD及Kd所確定最高四種變體突出顯示於表中。當藉由離解速率(Kd)將人類化抗hCXCR3 mAb變體分級時,多數變體顯示離解速率比最有效人類CXCR3配體hCXCL11慢至少1個數位。
如表7A中所示,藉由KD所確定最高四種變體係嵌合純系4(快結合速率、低離解速率)、Hu 3純系4(快結合速率、低離解速率)、Hu 3純系82(快結合速率、平均離解速率)及嵌合純系53(平均結合速率、低離解速率)。
在CXCR3表現細胞中進一步評估抗體結合。使人類CXCR3轉染300.19細胞與經純化人類化抗hCXCR3抗體變體Hu1、Hu2、Hu3及嵌 合抗體接觸。如圖19中所示,對於各純系4、12、53、82及135而言,使用5 μg/ml(黑線)、0.5 μg/ml(深灰線)或0.1 μg/ml(黑虛線)或5 μg/ml單獨之二級抗體(填滿灰色之直方圖)。在冰上用未經標記抗體純系將細胞染色30 min,之後用PBS-1%FBS洗滌兩次且使用FITC偶聯抗人類IgG1特異性二級抗體藉由在冰上在黑暗中培育30 min來檢測結合抗體。將試樣洗滌兩次,固定於2%多聚甲醛PBS溶液中,儲存於黑暗中4℃下且捕獲於流式細胞儀上。針對活細胞設門之CXCR3陽性之直方圖示於圖19中。
實例10:與抗體1C6比較
使用Biacore全受體分析方法比較抗hCXCR3 mAb純系1C6(Becton,Dickinson目錄編號為557183,相同純系報導於美國專利第6,184,358號中)與小鼠抗hCXCR3 mAb純系4及其人類化變體Hu2及Hu3。純系4展現約為2倍之親和力(KD)。人類化變體展現進一步改良之親和力(Hu2與Hu3變體二者具有約為4倍之親和力)。表8列示純系1C6以及純系4及其人類化變體Hu2及Hu3之結合動力學及親和力。
實例11:功能分析
評估二十種變體抗體之功能效應。評估抗體對因應CXCL9、CXCL10及CXCL11之細胞趨化性之效應且藉由FLIPR®鈣分析評估其對鈣動員之抑制效應。
在10 μg/ml純系4、12、53、82及135之人類化抗人類CXCR3抗體 變體存在或不存在下評估人類CXCR3-轉染300.19細胞向CXCR3配體CXCL9、CXCL10及CXCL11之趨化性。在37℃下用10 μg/ml人類化抗人類CXCR3抗體變體或商業抗體1C6預處理經轉染細胞20 min。將具有抗體之細胞轉移至5微米transwell中且將插入物置於分別含有100 ng/ml或300 ng/ml重組小鼠CXCL10及CXCL11或CXCL9之接收孔中。在37℃、5% CO2下將趨化性板培育4 hr。移出transwell插入物且將遷移至接收孔中之細胞轉移至U底96孔板中,使其沈澱並再懸浮於鈣黃綠素AM染料中。在37℃、5% CO2下將細胞培育30 min,洗滌一次,轉移至黑色/透明板中且立即在FlexStation上在490/520 nm下讀數。數據表示為趨化性抑制%。圖20提供顯示五種純系中每一者之不同變體抑制向CXCL9、CXCL10及CXCL11之趨化性之能力的代表性數據。
為評估對胞內鈣動員之抑制,在不同濃度之抗CXCR3抗體變體或陽性對照抗體1C6存在或不存在下因應CXCL10量測人類CXCR3-Gqi4qi4轉染CHO細胞中之鈣流動。將細胞接種(12,000個/孔)於384-黑板中且使其黏附過夜。第二天,用鈣敏感性染料Fluo-4NW染料將細胞加載40 min,之後添加抗體並在37℃下培育。添加抗體且將其培育20 min,之後以CXCL10之預定EC80濃度添加CXCR3配體重組人類CXCL10。使用電子多通道吸管手工實施染料添加,但抗體及激動劑添加係在FLIPR Tetra®上自動進行且在添加CXCL10後立即在470-495 nm下讀取板。一式兩份運行試樣且將各抗體濃度下之平均抑制%(±標準偏差)製成圖表。純系4 Hu1不抑制鈣動員且在該等實驗中用作陰性對照。圖21顯示五種純系中每一者之不同變體抑制鈣動員之能力且比較其與商業純系1C6。在鈣動員分析中抗體抗CXCL10之代表性IC50值(M)示於下表9中。
表9中之(*)指示,1C6抗體並非嵌合抗體,而是抗人類CXCR3之完全小鼠IgG1抗體。
如表10中所示,結合動力學數據(參見實例9)與功能分析結果充分相關。基於結合動力學數據及功能分析結果,選擇純系4及53用於進一步評估及4D人類化。
實例12:4D人類化
抗hCXCR3抗體純系之4D人類化係如WO 2009/032661(例如,[0037]-[0044]段)中所述進行。簡言之,4D人類化包含:a)構建欲人類化之可變域之3D模型;b)使用該可變域之3D模型之分子動力學模擬鑑別該域中之撓性殘基;c)藉由比較3D模型之分子動力學軌跡與49個人類種系之分子動力學軌跡(而非比較抗體序列,如在傳統人類化中所進行)來鑑別最接近之人類種系;及d)使並非CDR之一部分之撓性殘 基突變成其人類種系對應部分(在步驟c中鑑別)。使用此方法設計重鏈4.4-4.6及輕鏈4.4-4.7。特定而言,設計初始4D人類化構築體(VH 4.4及VL 4.4)且隨後設計對重鏈及輕鏈之其他修飾(VH 4.5-4.6及VL 4.5-4.7)以引入穩定且抗聚集之突變並消除其他不期望之基序。亦使用類似方法來設計4D人類化構築體VH 53.7-53.10及VL 53.10-53.13。
表11指示用於製備純系4、12、53、82及135之重鏈及輕鏈變體(包括人類化及4D人類化鏈(VH=重鏈;VK=輕鏈))之人類化策略(及其他修飾,若適用)。
藉由Biacore全受體分析評估純系4(4Hu6、4Hu7、4Hu8、4Hu9、4Hu10)之若干4D變體以評估結合動力學及CXCR3親和力,並與純系4嵌合抗體比較。如表2中所示,純系4Hu6含有重鏈4.4及輕鏈4.4。純系4Hu7含有重鏈4.4及輕鏈4.7。純系4Hu8含有重鏈4.5及輕鏈4.5。純系4Hu9含有重鏈4.5及輕鏈4.6。且純系4Hu10含有重鏈4.6及輕鏈4.4。
如表12中所示,當比較純系4之4D建模變體與嵌合變體(4Ch)時,五種變體中之四種顯示經改良親和力(KD)。然而,4D變體4Hu10顯示降低接近1個數量級之親和力。
實例13:NSG-PBL小鼠模型
在第0天用2E7新鮮一級人類聚蔗糖分離之周邊血單核細胞(PBMC)注射NOD-scid IL2rγ無效(NSG)小鼠。在整個研究中在細胞轉移後第3天開始每週用5 mg/kg抗人類CXCR3嵌合抗體或對照人類IgG1(Herceptin)治療動物(n=8只/組)兩次。對起始後第14天獲取之血液進行處理用於流式細胞術且使用標準程序用針對人類CD45(hCD45)、人類CD3(hCD3)、人類CD4(hCD4)、人類CD8(hCD8)及人類CXCR3之抗體染色。針對hCD45+細胞對淋巴球門中之細胞設門,之後針對 hCD3+細胞設門。評估hCD45+hCD3+ T細胞之hCD4及hCD8表現並測定人類CD4+CD45+CD3+ T細胞及人類CD8+C45+CD3+ T細胞之百分比。測定表現CXCR3之人類CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之百分比。圖22中之各點代表單一小鼠,其中代表性數據係自三次實驗顯示。數據顯示,在異種GvHD(移植物抗宿主病)之NSG-PBL小鼠模型中進行抗CXCR3抗體治療可調節CXCR3表現T細胞,且揭示五種純系間之功能差異。
表12顯示患有異種GvHD之NSG-PBL小鼠在用嵌合抗人類CXCR3候選抗體治療後之中值存活。
*,p=0.043;**p=0.016;***p=0.010,抗CXCR3抗體治療對huIgG1治療,使用對數秩測試。
上述實例意欲闡釋且決不限制本發明。藉由考量本說明書及實踐本文所揭示之裝置及方法,熟習此項技術者將明瞭所揭示裝置及方法之其他實施例。
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<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 40
<210> 41
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 41
<210> 42
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 42
<210> 43
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 43
<210> 44
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 44
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 45
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 46
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 47
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
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<220>
<221> 來源
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<400> 50
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 51
<210> 52
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 52
<210> 53
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 53
<210> 54
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 55
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 56
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 57
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<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 58
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<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
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<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 60
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
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<210> 62
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 62
<210> 63
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 63
<210> 64
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 64
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 65
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 66
<210> 67
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 67
<210> 68
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 68
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
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<210> 70
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 70
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 73
<210> 74
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 75
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(10)
<223> Any amino acid
<400> 76
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(4)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Any amino acid
<400> 77
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(3)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Any amino acid
<400> 78
<210> 79
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(6)
<223> Any amino acid
<400> 79
<210> 80
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Any amino acid
<400> 80
<210> 81
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 81
<210> 82
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 6xHis tag"
<400> 82
<210> 83
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 83
<210> 84
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 84
<210> 85
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 85
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 86
<210> 87
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 87
<210> 88
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 88
<210> 89
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 89
<210> 90
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 90
<210> 91
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 91
<210> 92
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 92
<210> 93
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 93
<210> 94
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 94
<210> 95
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 95
<210> 96
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 96
<210> 97
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 97
<210> 98
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 98
<210> 99
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 99
<210> 100
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 100
<210> 101
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 101
<210> 102
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 102
<210> 103
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 103
<210> 104
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 104
<210> 105
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 105
<210> 106
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 106
<210> 107
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 107
<210> 108
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 108
<210> 109
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 109
<210> 110
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 110
<210> 111
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 111
<210> 112
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 112
<210> 113
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 113
<210> 114
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<220>
<221> 來源
<223> N-term biotin"
<400> 114
<210> 115
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 115
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 116
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 117
<210> 118
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 118
<210> 119
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 119
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 120
<210> 121
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 121
<210> 122
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 122
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 123
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 124
<210> 125
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 125
<210> 126
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 多肽"
<400> 126
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 127
<210> 128
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> 人工序列描述:合成 肽"
<400> 128
<210> 129
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
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Claims (19)

  1. 一種能夠結合至CXCR3之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包含六個互補決定區(CDR):重鏈可變區(VH)CDR1、VH CDR2及VH CDR3,輕鏈可變區(VL)CDR1、VL CDR2及VL CDR3,其中:VH CDR1係GFTFTSYA(SEQ ID NO:368);VH CDR2係ISHGGTYT(SEQ ID NO:370);VH CDR3係ARHPIYSGNYQGYFDY(SEQ ID NO:372);VL CDR1係SGVNY(SEQ ID NO:375);VL CDR2係FTS(SEQ ID NO:377);及VL CDR3係QQFTSSPYT(SEQ ID NO:379)。
  2. 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段係嵌合的抗體或抗原結合片段、經CDR移植的、經突變的、經突變以去除一或多個去醯胺位點的、人類的、經人類化的、經人類化及回復突變的、合成的或重組的抗體或抗原結合片段。
  3. 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段能夠結合至包含選自以下所組成群之肽之多肽:a)包含SEQ ID NO:1之殘基1至58之肽;b)包含SEQ ID NO:1之殘基1至16之肽;及c)包含SEQ ID NO:1之殘基1至37之肽。
  4. 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段能夠結合至包含選自以下所組成群之肽之多肽:a)包含胺基酸序列SDHQVLNDAE(SEQ ID NO:71)之肽;b)包含胺基酸序列SDHQVLND(SEQ ID NO:72)之肽;c)包含胺基酸序列DHQVLND(SEQ ID NO:73)之肽; d)包含胺基酸序列VLNDAE(SEQ ID NO:74)之肽;e)包含胺基酸序列VLND(SEQ ID NO:75)之肽;f)包含胺基酸序列XDXXVXNDXX(SEQ ID NO:76)之肽;g)包含胺基酸序列XDXXVXND(SEQ ID NO:77)之肽;h)包含胺基酸序列DXXVXND(SEQ ID NO:78)之肽;i)包含胺基酸序列VXNDXX(SEQ ID NO:79)之肽;及j)包含胺基酸序列VXND(SEQ ID NO:80)之肽,其中X指示任何胺基酸。
  5. 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其包含重鏈可變區及輕鏈可變區,其中:該重鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO:38、40、42、44、46至48及63至66所組成群之序列至少約85%、90%、95%或99%一致之序列;及該輕鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO:39、41、43、45、49至54及67至70所組成群之序列至少約85%、90%、95%或99%一致之序列。
  6. 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO:38、40、42、44、46至48及63至66所組成群之序列;及該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO:39、41、43、45、49至54及67至70所組成群之序列。
  7. 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包含選自由以下所組成群之重鏈及輕鏈可變區組合:SEQ ID NOs:38及39;SEQ ID NOs:40及41;SEQ ID NOs:42及43;SEQ ID NOs:44及45;SEQ ID NOs:40及43;SEQ ID NOs: 42及41;SEQ ID NOs:42及49;SEQ ID NOs:42及50;SEQ ID NOs:42及51;SEQ ID NOs:42及52;SEQ ID NOs:42及53;SEQ ID NOs:42及54;SEQ ID NOs:46及43;SEQ ID NOs:47及43;SEQ ID NOs:48及43;SEQ ID NOs:40及49;SEQ ID NOs:40及51;SEQ ID NOs:48及49;SEQ ID NOs:48及51;SEQ ID NOs:63及67;及SEQ ID NOs:63及68。
  8. 如請求項1之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段能夠以約1x108M-1至約1x1011M-1之親和力常數優先結合至CXCR3。
  9. 一種經分離之核酸,其編碼如請求項1至8中任一項之抗體或抗原結合片段之胺基酸序列。
  10. 一種產生如請求項1至8中任一項之抗體或抗原結合片段之方法,其包含在適於產生該抗體或片段之條件下在培養基中培養包含如請求項9核酸之宿主細胞。
  11. 一種如請求項1至8中任一項之抗體或抗原結合片段之用途,其係用於製備預防、治療新發作1型糖尿病(T1D)或減少其進展之藥物。
  12. 如請求項11之用途,其中該抗體或抗原結合片段係以約0.03mg/kg/劑量至3.7mg/kg/劑量之劑量投與。
  13. 如請求項11之用途,其中該抗體或抗原結合片段係以約0.16mg/kg至18mg/kg之全部投與之總劑量投與。
  14. 如請求項11之用途,其中該抗體或抗原結合片段係投與至患有新發作T1D且具有大於或等於約0.2nmol/L之基底血清C肽濃度及/或在C肽刺激期間具有介於約0.033nmol/L×min與1.0nmol/L×min之間之空腹積分血清C肽濃度之人類個體。
  15. 一種偶聯物(conjugate),其包含如請求項1至8中任一項之抗體或抗原結合片段及至少一種其他劑,其中該其他劑係治療劑、增溶劑、穩定劑、免疫抑制劑、受體或抗原結合肽。
  16. 一種醫藥組合物,其包含如請求項1至8中任一項之抗體或抗原結合片段或如請求項9之核酸及醫藥上可接受之載劑。
  17. 如請求項16之醫藥組合物,其中該組合物進一步包含至少一種其他治療劑。
  18. 如請求項16之醫藥組合物,其中該組合物進一步包含至少一種其他治療劑,其中該至少一種其他治療劑係選自由β細胞刺激劑、胰島素及產生胰島素之細胞所組成之群。
  19. 一種檢測測試試樣中CXCR3之存在或濃度之活體外方法,其包含使該測試試樣與如請求項1至8中任一項之抗體或抗原結合片段及可檢測標記接觸,其中CXCR3之存在或濃度與該可檢測標記產生之信號直接或間接相關。
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