CN111133007A - 与胞外酶结合的重链抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了与胞外酶结合的人重链抗体诸如UniAbsTM以及此类重链抗体和多特异性重链抗体的组合，其靶向胞外酶上的非重叠表位，包括协同组合。还包括制备此类抗体的方法、包括包含此类抗体的药物组合物在内的组合物以及涉及治疗与胞外酶的表达相关的疾病或疾患的方法。

Description

与胞外酶结合的重链抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月13日提交的美国临时专利申请序列第62/558,147号的提交日期的优先权权益，所述申请的公开内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及与胞外酶结合的人重链抗体(例如，UniAbTM)。本发明还涉及重链抗体与多特异性重链抗体的组合，其靶向胞外酶上的非重叠表位，包括此类抗体的协同组合。本发明具体地涉及抗CD38重链抗体，靶向CD38上的非重叠表位的抗CD38重链抗体、具有对CD38上的不止一个非重叠表位的结合特异性的多特异性重链抗CD38抗体的组合(包括协同组合)以及制备此类抗体的方法，包含此类抗体的组合物(包括药物组合物)及其各种用途。
发明背景
胞外酶
胞外酶是其催化位点位于细胞外区室的膜外侧的膜蛋白。这些细胞表面蛋白促进许多功能，并存在于多种细胞(诸如免疫细胞、内皮细胞和神经元组织细胞)上。胞外酶可以是核苷酸酶、环化酶、ADP-核糖基转移酶、肽酶、蛋白酶和氧化酶，并且包括但不限于以下分子：CD10、CD13、CD26、CD38、CD39、CD73、CD156b、CD156c、CD157、CD203、VAP1、ART2和MT1-MMP。
CD38，也称为ADP-核糖基环化酶/环状ADP-核糖水解酶1，是具有胞外酶活性的单通道II型跨膜蛋白。使用NAD(P)作为底物，其催化几种产物的形成：环状ADP-核糖(cADPR)；ADP-核糖(ADPR)；烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)；烟酸(NA)；ADP-核糖-2’-磷酸(ADPRP)(参见，例如，H.C.Lee，Mol.Med.，2006，12：317-323)。
CD38主要在免疫细胞(包括浆细胞、活化的效应T细胞、抗原呈递细胞、肺中的平滑肌细胞、多发性骨髓瘤(MM)细胞、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病细胞、T细胞淋巴瘤细胞、乳腺癌细胞、髓源性抑制细胞、调节性B细胞和调节性T细胞)上表达。免疫细胞上的CD38与内皮细胞和其它细胞谱系表达的CD31/PECAM-1相互作用。这种相互作用促进白细胞增殖、迁移、T细胞活化和单核细胞来源的DC成熟。
与CD38结合的抗体描述于例如Deckert等，Clin.Cancer Res.，2014，20(17)：4574-83和美国专利第8,153,765号、第8,263,746号、第8,362,211号、第8,926,969号、第9,187,565号、第9,193,799号、第9,249,226号和第9,676,869号中。
达雷木单抗，一种人CD38的特异抗体，已于2015年获准用于人的多发性骨髓瘤治疗(综述于Shallis等，Cancer Immunol.Immunother.，2017，66(6)：697-703)。另一种针对CD38的抗体伊沙妥昔单抗(Isatuximab)(SAR650984)正处于多发性骨髓瘤治疗的临床试验中。(参见，例如Deckert等，Clin Cencer Res，2014，20(17)：4574-83；Martin等，Blood，2015，126：509，Martin等，Blood，2017，129：3294-3303)。这些抗体诱导强大的补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和肿瘤细胞的间接凋亡。伊沙妥昔单抗还阻断CD38的环化酶和水解酶酶促活性，并诱导肿瘤细胞直接凋亡。
抗体对蛋白质的变构调节的实例是人生长激素、整联蛋白和β半乳糖苷酶(L.P.Roguin及L.A.Retegui，2003，Scand.J.Immunol.58(4)：387-394)。这些实例显示了靶向不同表位的单一抗体对配体-受体相互作用的调节。靶向单个分子上的两个表位的双特异性抗体的实例是针对c-MET或肝细胞生长因子受体(HGFR)的(DaSilva，J.，Abstract 34：A MET x MET bispecific antibody that induces receptor degradation potentlyinhibits the growth of MET-addicted tumor xenografts.2017年AACR年会；2017年4月1-5日；Washington，DC)。
重链抗体
在常规IgG抗体中，重链和轻链的缔合部分由轻链恒定区和重链CH1恒定区之间的疏水相互作用导致。在重链框架2(FR2)和框架4(FR4)区域中存在另外的残基，其也对重链与轻链之间的这种疏水相互作用作出贡献。
然而，已知骆驼科动物(包括骆驼、单峰驼和美洲驼的胼足亚目)的血清含有仅由成对的H链(仅有重链的抗体或
Figure BDA0002411905020000031
)组成的主要类型的抗体。骆驼科(单峰驼(Camelus dromedarius)、双峰驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lamaguanaco)、美洲羊驼(Lama alpaca)和骆马(Lama vicugna))的
Figure BDA0002411905020000032
具有独特的结构，其由单个可变结构域(VHH)、铰链区和两个恒定结构域(CH2和CH3)组成，它们与经典抗体的CH2和CH3结构域高度同源。这些
Figure BDA0002411905020000033
缺乏恒定区(CH1)的第一结构域，所述第一结构域存在于基因组中，但在mRNA加工过程中被剪接掉。缺少CH1结构域解释了
Figure BDA0002411905020000034
中不存在轻链，因为该结构域是轻链恒定结构域的锚定位置。此类
Figure BDA0002411905020000035
天然进化以通过来自常规抗体的3个CDR或其片段赋予抗原结合特异性和高亲和力(Muyldermans，2001；J Biotechnol 74：277-302；Revets等，2005；Expert Opin Biol Ther 5：111-124)。软骨鱼，诸如鲨鱼，也进化出独特类型的免疫球蛋白(称为IgNAR)，其缺乏轻多肽链并且完全由重链组成。可通过分子工程化操纵IgNAR分子以产生单个重链多肽(vNAR)的可变结构域(Nuttall等，Eur.J.Biochem.270，3543-3554(2003)；Nuttall等，Function andBioinformatics 55，187-197(2004)；Dooley等，Molecular Immunology 40，25-33(2003))。
在20世纪60年代确定了缺乏轻链的仅有重链的抗体结合抗原的能力(Jaton等(1968)Biochemistry，7,4185-4195)。与轻链物理分离的重链免疫球蛋白相对于四聚体抗体保留了80％的抗原结合活性。Sitia等，(1990)Cell，60，781-790证明从重排的小鼠μ基因中去除CH1结构域导致在哺乳动物细胞培养物中产生缺乏轻链的仅有重链的抗体。产生的抗体保留VH结合特异性和效应子功能。
通过免疫接种可针对多种抗原产生具有高特异性和亲和力的重链抗体(van derLinden，R.H.等，Biochim.Biophys.Acta.1431，37-46(1999))，并且可容易地克隆VHH部分以及使其在酵母中表达(Frenken，L.G.J.等，J.Biotechnol.78，11-21(2000))。它们的表达水平、溶解度和稳定性显著高于经典F(ab)或Fv片段的那些(Ghahroudi，M.A.等FEBSLett.414，521-526(1997))。
其中λ(兰姆达)轻(L)链基因座和/或λ及κ(卡帕)L链基因座已被功能性沉默的小鼠以及由此类小鼠产生的抗体描述于美国专利第7,541,513号和第8,367,888号中。例如，在WO2006008548；美国申请公开第20100122358号；Nguyen等，2003，Immunology；109(1)，93-101；Brüggemann等，Crit.Rev.Immunol.；2006，26(5)：377-90；和Zou等，2007，J ExpMed；204(13)：3271-3283中报道了在小鼠和大鼠中重组产生仅有重链的抗体。在Geurts等，2009，Science，325(5939)：433中描述了经由锌指核酸酶的胚胎显微注射产生敲除大鼠。在美国专利第8,883,150号和第9,365,655号中描述了可溶性仅有重链的抗体和包含产生此类抗体的异源重链基因座的转基因啮齿动物。包含单结构域抗体作为结合(靶向)结构域的CAR-T结构描述于例如Iri-Sofla等，2011，Experimental Cell Research 317：2630-2641和Jamnani等，2014，Biochim Biophys Acta，1840：378-386中。
发明内容
本发明至少部分地基于以下发现：具有对胞外酶上非重叠表位的结合亲和力的重链抗体(包括但不限于UniAbsTM)相对于单独地与相同表位结合的抗体具有改善的特性。
在一个方面，本发明涉及包含两种或更多种与同一胞外酶上的非重叠表位结合的重链抗体的组合的组合物。
在一个方面，胞外酶选自由以下组成的组：CD10、CD13、CD26、CD38、CD39、CD73、CD156b、CD156c、CD157、CD203、VAP1、ART2和MT1-MMP。
在另一个实施方案中，胞外酶为CD38、CD39或CD73，优选为CD38。
在另一外的实施方案中，重链抗体是UniAbTM。
在又一另外的实施方案中，两种或更多种重链抗体包含选自由以下组成的组的重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO：1-60、99-149、175-218、247-308和323-391。
在另一个实施方案中，重链可变区氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1、99、175、247和323。
在另一个实施方案中，重链可变区氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：99、175和323。
在又一另外的实施方案中，本文的组合物包含第一重链抗体和第二重链抗体的组合，其中
(a)第一抗体包含SEQ ID NO：394的CDR1序列、SEQ ID NO：413的CDR2序列和SEQID NO：431的CDR3序列，以及
(b)第二抗体包含SEQ ID NO：219的CDR1序列、SEQ ID NO：83的CDR2序列和SEQ IDNO：240的CDR3序列。
在另外的实施方案中，第一抗体包含SEQ ID NO：323的重链可变区氨基酸序列，第二抗体包含SEQ ID NO：175的重链可变区氨基酸序列。
在又一另外的实施方案中，第一抗体和第二抗体是IgG1。
在一个实施方案中，第一抗体和第二抗体的组合是协同的。
在一个特定的实施方案中，本文的组合物包含UniAbsTM 309021和309265的组合。
在另一个实施方案中，本文的组合物包含第一重链抗体和第二重链抗体的组合，其中第一抗体包含SEQ ID NO：394的CDR1序列、SEQ ID NO：413的CDR2序列和SEQ ID NO：431的CDR3序列，并且第二抗体包含SEQ ID NO：151的CDR1序列、SEQ ID NO：163的CDR2序列和SEQ ID NO：172的CDR3序列。
在又一另外的实施方案中，第一抗体包含SEQ ID NO：323的重链可变区氨基酸序列，第二抗体包含99的重链可变区氨基酸序列，其中第一抗体和第二抗体可以例如是IgG1或IgG4，并且可以是协同的。
在一个特定的实施方案中，组合物包含UniAbsTM 309021和309407的组合。
在另一个特定的实施方案中，组合物包含选自由309021、309407和309265组成的组的UniAbTM。
在另外的方面，本发明涉及对胞外酶上的至少两个非重叠表位具有结合特异性的多特异性重链抗体。
在一个实施方案中，所述胞外酶选自由以下组成的组：CD10、CD13、CD26、CD38、CD39、CD73、CD156b、CD156c、CD157、CD203、VAP1、ART2和MT1-MMP。
在各种实施方案中，胞外酶是CD38、CD39或CD73，优选为CD38。
在一个实施方案中，多特异性抗体包含与CD38上非重叠表位结合的两个或更多个重链可变区氨基酸序列，其选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1-60、99-149、175-218、247-308和323-391。
在第二实施方案中，多特异性抗体是双特异性的。
在第三实施方案中，多特异性抗体是二价的。
在第四实施方案中，多特异性抗体是四价的。
在另外的实施方案中，多特异性抗体是双特异性的，其包含(a)第一重链可变区，其包含SEQ ID NO：394的CDR1序列、SEQ ID NO：413的CDR2序列和SEQ ID NO：431的CDR3序列，以及(b)第二重链可变区，其包含SEQ ID NO：219的CDR1序列、SEQ ID NO：83的CDR2序列和SEQ ID NO：240的CDR3序列，其中抗体可以是二价或四价的。
在又一另外的实施方案中，多特异性抗体包含SEQ ID NO：SEQ ID NO：323的第一重链可变区序列和SEQ ID NO：175的第二重链可变区序列，其中该抗体可以是二价或四价的。
在一个实施方案中，具有列出的CDR/可变区序列的本文的多特异性抗体是IgG1。
在另一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性的，其包含(a)第一重链可变区，其包含SEQ ID NO：394的CDR1序列、SEQ ID NO：413的CDR2序列和SEQ ID NO：431的CDR3序列，以及(b)第二重链可变区，其包含SEQ ID NO：151的CDR1序列、SEQ ID NO：163的CDR2序列和SEQ ID NO：172的CDR3序列，其中抗体可以是二价或四价的。
在又一另外的实施方案中，多特异性抗体包含SEQ ID NO：SEQ ID NO：323的第一重链可变区序列和SEQ ID NO：99的第二重链可变区序列，并且可以是二价或四价的。
在一个实施方案中，具有列出的CDR/可变区序列的本文的多特异性抗体是IgG1或IgG4。
在另一个实施方案中，多特异性抗体是UniAbTM。
在又一另外的实施方案中，多特异性抗体包含UniAbsTM 309021、309265和309407中的一种或多种的结合特异性。
在另外的实施方案中，多特异性抗体包含UniAbsTM 309021和309265的结合特异性。
在又一另外的实施方案中，多特异性抗体包含UniAbsTM 309021和309407的结合特异性。
在另外的方面，本发明涉及CAR-T，其包含本文中的多特异性抗体中的一种或多种的重链可变区序列。
在又一另外的方面，本发明涉及包含本文中的组合物或多特异性抗体或CAR-T的药物组合物。
在又一另外的方面，本发明涉及用于治疗特征在于胞外酶的表达的疾病或疾患的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文中的药物组合物。
在不同的方面，本发明涉及用于治疗特征在于CD38、CD39或CD73的表达的疾病或疾患，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的与CD38、CD39或CD73上的两个或更多个非重叠表位结合的多特异性重链抗体。
在一个实施方案中，所述疾病或疾患的特征在于CD38的表达，并且可以例如选自由以下组成的组：血液恶性肿瘤、特征在于气道高响应性的疾患以及特征在于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)下降的年龄相关和代谢功能障碍。
在一个实施方案中，血液恶性肿瘤选自由以下组成的组：多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和dT-细胞ALL。本发明的CD38重链抗体和药物组合物还可用于治疗哮喘以及特征在于气道高响应性的其它疾患和特征在于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)下降的年龄相关和代谢功能障碍，以及优选地为MM。
在另外的实施方案中，在本文的治疗方法中使用的多特异性抗体包含抗体309021、309265和309407中的两种或更多种的重链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在又一另外的实施方案中，在本文的治疗方法中使用的多特异性抗体包含UniAbsTM 309021、309265和309407中的两种或更多种的重链可变区序列；或UniAbsTM309201和309265或309021和309407的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；或UniAbsTM 309201和309265或309021和309407的重链可变区序列。
在另一个实施方案中，本文的治疗方法还包括施用一种或多种另外的剂以治疗MM。
在一个实施方案中，另外的剂选自由以下组成的组：达雷木单抗、伊沙妥昔单抗、依洛珠单抗和对MM的治疗有效的化学治疗剂，其中，所述化学治疗剂可以例如是来那度胺、地塞米松或硼替佐米，诸如来那度胺和地塞米松或硼替佐米和地塞米松。
在一个优选实施方案中，对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性二价重链抗体包含对第一CD38表位具有结合亲和力的第一多肽(所述第一多肽包含重链抗体的抗原结合结构域(其包含SEQ ID NO：150的CDR1序列、SEQ ID NO：92的CDR2序列和SEQ ID NO：168的CDR3序列)、铰链区的至少一部分以及包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域)和对第二CD38表位具有结合亲和力的第二多肽(所述第二多肽包含重链抗体的抗原结合结构域(其包含SEQ ID NO：393的CDR1序列、SEQ ID NO：412的CDR2序列和SEQID NO：424的CDR3序列)、铰链区的至少一部分、包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域)，以及第一多肽的CH2结构域与第二个多肽的CH2结构域之间的不对称界面和作为人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区或沉默的人IgG4 Fc区的Fc区。
在一个优选实施方案中，对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性四价重链抗体包含两条相同的多肽，每条多肽包含对第一CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的第一抗原结合结构域(其包含SEQ ID NO：150的CDR1序列、SEQ ID NO：92的CDR2序列和SEQ ID NO：168的CDR3序列)、对第二CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的第二抗原结合结构域(其包含SEQ ID NO：393的CDR1序列、SEQ ID NO：412的CDR2序列和SEQID NO：424的CDR3序列)、铰链区的至少一部分、包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域以及作为人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区或沉默的人IgG4 Fc区的Fc区。
在一个优选实施方案中，对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性四价重链抗体包含第一重链多肽和第二重链多肽，其中第一重链多肽包含两个对第一个CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域(每个抗原结合结构域包含SEQ ID NO：150的CDR1序列、SEQ ID NO：92的CDR2序列和SEQ ID NO：168的CDR3序列)、铰链区的至少一部分和包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域，以及第一多肽的CH2结构域和第二多肽的CH2结构域之间的不对称界面，并且其中第二重链多肽包含两个对第二CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域(每个抗原结合结构域包含SEQ ID NO：393的CDR1序列、SEQ ID NO：412的CDR2序列和SEQ ID NO：424的CDR3序列)、铰链区的至少一部分和包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域、第一多肽的CH2结构域与第二多肽的CH2结构域之间的不对称界面，以及作为人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区或沉默的人IgG4 Fc区的Fc区。
附图说明
图1显示家族1的抗CD38 UniAbTM可变结构域氨基酸序列。
图2显示家族1的抗CD38 UniAbTM抗体的独特CDR序列。
图3显示家族1的抗CD38 UniAbTM抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列。
图4显示家族1的抗CD38 UniAbTM抗体的生物活性。
图5显示家族3的抗CD38 UniAbTM可变结构域氨基酸序列。
图6显示家族3的抗CD38 UniAbTM抗体的独特CDR序列。
图7显示家族3的抗CD38 UniAbTM抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列。
图8显示家族3的抗CD38 UniAbTM抗体的生物活性。
图9显示家族4的抗CD38 UniAbTM可变结构域氨基酸序列。
图10显示家族4的抗CD38 UniAbTM抗体的独特CDR序列。
图11显示家族4的抗CD38 UniAbTM抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列。
图12显示家族4的抗CD38 UniAbTM抗体的生物活性。
图13显示家族7的抗CD38 UniAbTM可变结构域氨基酸序列。
图14显示家族7的抗CD38 UniAbTM抗体的独特CDR序列。
图15显示家族7的抗CD38 UniAbTM抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列。
图16显示家族7的抗CD38 UniAbTM抗体的生物活性。
图17显示家族9的抗CD38 UniAbTM可变结构域氨基酸序列。
图18显示家族9的抗CD38 UniAbTM抗体的独特CDR序列。
图19显示家族9的抗CD38 UniAbTM抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列。
图20显示家族9的抗CD38 UniAbTM抗体的生物活性。
图21是两种四价双特异性重链抗体和一种二价双特异性重链抗体的示意图。图a中显示了对称的抗体结构，图b和c中显示了不对称抗体，使用旋钮入孔(knob-into-hole)技术表达所述抗体。结合CD38上的非重叠表位结合的VH结构域以不同的填充阴影显示。
图22用CD38抗原免疫的UniRatsTM的血清滴度。在标准固相抗原ELISA分析中，所有免疫动物均具有显著的与人和食蟹猴(cyno)CD38蛋白的血清活性。
图23显示代表五个独特的重链CDR3序列家族的UniAbsTM表现出多种功能行为，其中每个家族表现出一组独特的特征。从五个CDR3序列家族(克隆ID号308936、309021、309246、309407和309265)中的每一个中选择单个前导VH序列来进行IgG1 UniAbTM形式的其它功能筛选。在一些测定中，将达雷木单抗和伊沙妥昔单抗用作参考对照。表征每种UniAbTM的与人和cyno CD38蛋白的结合以及与表达人或cyno CD38的细胞的结合。另外，在适当的测定条件下，评估了UniAbsTM抑制CD38的天然环化酶(酶)活性的能力以及刺激针对表达CD38的哺乳动物细胞的间接凋亡、直接凋亡、ADCC和CDC的能力。
图24显示与不同浓度的达雷木单抗混合的UniAbTM 309407(浓度为12.5nM)的不同组合的CDC。UniDabTM 309407本身不通过CDC裂解Ramos细胞。与UniAbTM 309407混合的达雷木单抗比单独的达雷木单抗更有效。UniAbTM 309407在人IgG4背景下也增强了达雷木单抗的CDC活性。IgG4不结合补体。这表明UniAbTM 309407与CD38的结合可调节结合非重叠表位的抗体的CDC活性。
图25显示UniAbsTM与包含UniAbTM ID309021和ID309407的VH结构域的四价双特异性UniAbTM的组合的补体固定。这两种UniAbsTM及其VH结构域结合CD38上的2个非重叠表位。在单个四价抗体(309021_309407_2XGSlink)中组合这两种CD38结合剂产生牢固的补体固定并杀伤肿瘤细胞。与达雷木单抗相比，UniAbsTM和四价双特异性UniAbTM的混合物诱导对Ramos细胞的更有效的CDC。单独的UniAbsTM不诱导CDC。
图26显示二价和四价UniAbsTM对CD38的环化酶活性的酶抑制作用。结合CD38上的两个非重叠表位的四价双特异性UniAbTM强效地抑制环化酶活性。二价单特异性UniAbsTM不抑制环化酶活性。抗BCMA UniAbTM用作阴性对照。
图27显示抗体之间与CD38结合的竞争。基于达雷木单抗和伊沙妥昔单抗阻断UniAbTM与CD38+细胞结合的能力，来自五个序列家族的UniAbsTM分为两个广泛的竞争组。为了鉴定具有与达雷木单抗和伊沙妥昔单抗的表位部分或完全重叠的表位的UniAbsTM，使用流式细胞术测量通过用达雷木单抗或伊沙妥昔单抗预处理Ramos细胞所阻断的UniAbTM结合的百分比。阻断百分比的增加表明两种抗体具有重叠表位的可能性更高。在该组中，家族F01、F04、F07和F09均显示至少一定水平的由达雷木单抗和伊沙妥昔单抗两者产生的阻断，表明可能与重叠表位结合(将它们置于竞争组1中)。相反地，F03UniAbTM(309407)结合不会被利用达雷木单抗或伊沙妥昔单抗的预处理阻断，这表明其很可能结合不同的表位(将其置于竞争组2中)。
图28显示对Ramos细胞的CDC活性。滴定UniAbTM 309021并将其与固定浓度的不同UniAbsTM混合(参见图例)。IgG1和IgG4形式的UniAbsTM 309407显示与UniAbTM 309021的协同作用。IgG1形式的UniAbTM 309265显示与UniAbTM 309021的协同作用。所有其它UniAbTM与UniAbTM 309021没有协同作用。
图29显示包含克隆ID321986和克隆ID321663的VH结构域的四价双特异性UniAbs与这两种相同的UniAbs的二价单特异性混合物的混合物相比的对Ramos细胞的CDC介导的活性。
图30显示包含克隆ID 321986和克隆ID 321663的VH结构域的四价双特异性UniAbs对Ramos细胞的直接肿瘤细胞凋亡作用。
优选实施方案的详述
除非另有说明，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力范围内。此类技术在诸如以下文献中进行了充分解释：“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第二版(Sambrook等，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait，编辑，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney，编辑，1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press，Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等，编辑，1987以及定期更新)；“PCR：The Polymerase Chain Reaction”，(Mullis等，编辑，1994)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”(Perbal Bernard V.，1988)；“PhageDisplay：A Laboratory Manual”(Barbas等，2001)；Harlow，Lane和Harlow，UsingAntibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol No.I，Cold Spring HarborLaboratory(1998)；和Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory；(1988)。
在提供数值范围的情况下，应理解的是，该范围的上限和下限之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一，除非本文另外清楚地规定)以及所述范围内的任意其它所述或居间的数值都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该较小的范围内，并且也包括在本发明中，服从于所述范围内的任何特别排除的限值。当所述范围包括上下限值之一或两者时，排除那些所包括的界限之一或两者的范围也包括在本发明中。
除非另有说明，否则本文的抗体残基根据Kabat编号系统(例如，Kabat等，Sequences of Immunological Interest.第五版Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))编号。
在以下描述中，列出了许多具体细节以提供对本发明的更充分的理解。但是，本领域技术人员显而易见的是在没有一个或多个这些具体细节的前提下也可实施本发明。在其它情况下，并没有对本领域技术人员熟知的特征和熟知的程序进行描述，以避免使本发明不清楚。
贯穿本公开内容引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用整体并入本文。
I.定义
“包含”是指组合物/方法/试剂盒中需要所列举的元素，但可以包括其它元素以形成权利要求范围内的组合物/方法/试剂盒等。
“基本上由……组成”是指针对特定材料或步骤所描述的组合物或方法的范围的限制，其不会实质上影响本发明的一种或多种基本和新颖的特征。
“由……组成”是指从组合物、方法或试剂盒中排除权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且特别地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、单体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、仅有重链的抗体、三链抗体、单链Fv、纳米抗体等，并且还包括抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性即可(Miller等(2003)Jour.of Immunology 170：4854-4861)。抗体可以是鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或源自其它物种的抗体。
术语抗体可以指这些多肽(即包含免疫特异性地结合目标抗原或靶标或其部分的抗原结合部位的多肽)中的任一种的全长重链、全长轻链、完整免疫球蛋白分子或免疫活性部分，此类靶标包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文公开的免疫球蛋白可属于免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类，包括具有改变的Fc部分，提供减弱或增强的效应细胞活性的工程化亚类。免疫球蛋白可源自任何物种。在一个方面，免疫球蛋白主要是人来源的。
本文的抗体残基是根据Kabat编号系统和EU编号系统编号的。当提及可变结构域中的残基(大致为重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等，Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。当提到免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”引(例如，Kabat等(同上)中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，否则对抗体可变结构域中的残基编号的提及是指通过Kabat编号系统进行的残基编号。除非本文另有说明，否则对抗体恒定结构域中的残基编号的提及是指通过EU编号系统进行的残基编号。
如本文中所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能的天然发生的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原部位的。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如与抗体结合使用的术语“可变的”是指抗体可变结构域的某些部分在抗体之间在序列上广泛不同并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，变异性不是均匀地分布在抗体的可变结构域中。其集中在轻链和重链可变区中称为高变区的三个区段中。可变结构域的更高保守部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含通过三个高变区连接的四个FR(主要采用β-折叠构型)，所述高变区形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自重链可变结构域中的“高变环”残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)的那些残基；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
本文显示了示例性CDR指定，然而本领域技术人员将理解，CDR的许多定义通常在使用中，包括Kabat定义(参见“Zhao等A germline knowledge based computationalapproach for determining antibody complementarity determining regions.”MolImmunol.2010；47：694-700)，其基于序列可变性并且是最常用的。Chothia定义基于结构环区域的位置(Chothia等，“Conformations of immunoglobulin hypervariable regions.”Nature.1989；342：877-883)。感兴趣的备选CDR定义包括但不限于以下所公开的那些：Honegger，“Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains：anautomatic modeling and analysis tool.”J Mol Biol.2001；309：657-670；Ofran等“Automated identification of complementarity determining regions(CDRs)revealspeculiar characteristics of CDRs and B cell epitopes.”J Immunol.2008；181：6230-6235；Almagro“Identification of differences in the specificity-determining residues of antibodies that recognize antigens of different size：implications for the rational design of antibody repertoires.”JMolRecognit.2004；17：132-143；以及Padlan等“Identification of specificity-determining residues in antibodies.”Faseb J.1995；9：133-139.，所述文献中的每一篇明确地通过引用并入本文。
术语“仅有重链的抗体”和“重链抗体”可互换使用并且在最广泛的意义上，是指缺乏常规抗体轻链的抗体。该术语具体包括但不限于在不存在CH1结构域的情况下包含VH抗原结合结构域以及CH2和CH3恒定结构域的同二聚体抗体此类抗体的功能性(抗原结合)变体、可溶性VH变体、Ig-NAR(其包含一个可变结构域(V-NAR)的同二聚体和五个C样恒定结构域(C-NAR)及其功能片段)；和可溶性单结构域抗体(sUniDabsTM)。在一个实施方案中，仅有重链的抗体由可变区抗原结合结构域组成，所述可变区抗原结合结构域由框架1、CDR1、框架2、CDR2、框架3、CDR3和框架4组成。在另一个实施方案中，仅有重链的抗体由抗原结合结构域、至少部分铰链区以及CH2和CH3结构域组成。在另一个实施方案中，仅有重链的抗体由抗原结合结构域、至少部分铰链区和CH2结构域组成。在另外的实施方案中，仅有重链的抗体由抗原结合结构域、至少部分铰链区和CH3结构域组成。其中CH2和/或CH3结构域被截短的仅有重链的抗体也包括在本文中。在另外的实施方案中，重链由抗原结合结构域和至少一个CH(CH1、CH2、CH3或CH4)结构域组成，但没有铰链区。仅有重链的抗体可呈二聚体形式，其中两条重链通过二硫键键合，否则彼此共价或非共价连接。仅有重链的抗体可以属于IgG亚类，但属于其它亚类的抗体，诸如IgM、IgA、IgD和IgE亚类，也包括在本文中。在特定的实施方案中，重链抗体属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，特别是IgG1亚型。在一个实施方案中，重链抗体属于IgG4亚型，其中一个或多个CH结构域被修饰以改变抗体的效应子功能。在一个实施方案中，重链抗体属于IgG1亚型，其中一个或多个CH结构域被修饰以改变抗体的效应子功能。本文进一步描述了改变效应子功能的CH结构域的修饰。
在一个实施方案中，本文的仅有重链的抗体用作嵌合抗原受体(CAR)的结合(靶向)结构域。该定义具体包括由人免疫球蛋白转基因大鼠(UniRatTM)产生的仅有人重链的抗体(称为UniAbTM)。UniAbTM的可变区(VH)被称为UniDabsTM，是可与Fc或血清白蛋白连接以用于开发具有多特异性、增强的效价和延长的半衰期的新型治疗剂的通用构件块。由于同二聚体UniAbsTM缺少轻链并因而缺乏VL结构域，因此抗原被一个单一结构域(即重链抗体的重链的可变结构域(VH))识别。
如本文中所用，“完整抗体链”是包含全长可变区和全长恒定区(Fc)的抗体。完整的“常规”抗体包含完整轻链和完整重链，以及分泌的IgG的轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、铰链、CH2和CH3。其它同种型，诸如IgM或IgA，可具有不同的CH结构域。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一种或多种“效应子功能”，其是指可归因于抗体的Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用和细胞表面受体的下调。恒定区变体包括改变效应子谱、与Fc受体的结合等的那些变体。
取决于其重链的Fc(恒定结构域)的氨基酸序列，可将抗体和各种抗原结合蛋白作为不同的类别提供。重链Fc区分为五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些类别中的几种类别可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别的抗体的Fc恒定结构域可分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。Ig形式包括铰链修饰或无铰链形式(Roux等(1998)J.Immunol.161：4083-4090；Lund等(2000)Eur.J.Biochem.267：7246-7256；US 2005/0048572；US 2004/0229310)。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可将来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链指定为两种类型(称为κ和λ)之一。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。效应子功能的非限制性实例包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；ADCP；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调等。此类效应子功能通常需要Fc区与受体(例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB1、FcγRIIB2、FcγRIIIA、FcγRIIIB受体以及低亲和力FcRn受体)相互作用，并且可使用本领域已知的各种测定法进行评估。“死亡的”或“沉默的”Fc是已经突变以保留例如关于延长血清半衰期的活性但不激活高亲和力Fc受体的Fc。
“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括，例如天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区，以及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含与天然序列Fc区相异在于至少一个氨基酸修饰，优选一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如，约1至约10个氨基酸取代，优选约1至约5个氨基酸取代。本文的变体Fc区优选与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，最优选与其具有至少约90％的同源性，更优选与其具有至少约95％的同源性。
变体Fc序列可在CH2区中包括3个氨基酸取代，以减少在EU索引位置234、235和237处的FcγRI置取结合(参见Duncan等，(1988)Nature 332∶563)。在EU索引位置330和331处的补体C1q结合位点中的两个氨基酸取代减少了补体固定(参见Tao等J.Exp.Med.178：661(1993)以及Canfield和Morrison，J.Exp.Med.173：1483(1991))。将位置233-236处的IgG2残基和位置327、330和331处的IgG4残基取代至人IgG1中会大大降低ADCC和CDC(参见，例如Armour KL.等，1999 Eur J Immunol.29(8)：2613-24；以及Shields RL.等，2001.J BiolChem.276(9)：6591-604)。人IgG1氨基酸序列(UniProtKB No.P01857)在本文中以SEQ IDNO：43提供。人IgG4氨基酸序列(UniProtKB No.P01861)在本文中以SEQ ID NO：44提供。沉默的IgG1描述于例如Boesch，A.W.等，“Highly parallel characterization of IgG Fcbinding interactions.”MAbs，2014.6(4)：第915-27页(其公开内容通过引用整体并入本文)中。
其它Fc变体也是可能的，包括但不限于其中能够删除形成二硫键的Fc变体，或者其中在天然Fc的N末端消除某些氨基酸残基或向其添加甲硫氨酸残基的Fc变体。因此，在一些实施方案中，抗体的一个或多个Fc部分可在铰链区包含一个或多个突变以消除二硫键。在又一另外的实施方案中，可以完全去除Fc的铰链区。在又一另外的实施方案中，抗体可包含Fc变体。
另外，可构建Fc变体以通过取代(突变)、删除或添加氨基酸残基(以实现补体结合或Fc受体结合)来去除或基本上降低效应子功能。例如但不限于，缺失可发生在补体结合位点，诸如C1q结合位点。国际专利公开号WO 97/34631和WO 96/32478中公开了用于制备免疫球蛋白Fc片段的此类序列衍生物的技术。另外，可通过磷酸化、硫酸化、酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等来修饰Fc结构域。
Fc可呈以下形式：具有天然糖链，与天然形式相比具有增加的糖链或与天然形式相比具有减少的糖链，或者可呈无糖基化或去糖基化的形式。糖链的增加、减少、去除或其它修饰可通过本领域常用的方法(诸如化学方法、酶促方法)或通过在基因工程化的生产性细胞系中表达其来实现。此类细胞系可包括天然表达糖基化酶的微生物(例如巴斯德毕赤酵母)和哺乳动物细胞系(例如CHO细胞)。另外，可工程改造微生物或细胞以表达糖基化酶，或可使其不能表达糖基化酶(参见，例如Hamilton等，Science，313：1441(2006)；Kanda等，J.Biotechnology，130：300(2007)；Kitagawa等，J.Biol.Chem.，269(27)：17872(1994)；Ujita-Lee等，J.Biol.Chem.，264(23)：13848(1989)；Imai-Nishiya等，BMC Biotechnology7：84(2007)；和WO 07/055916)。作为工程化以具有改变的唾液酸化活性的细胞的一个实例，已将α-2，6-唾液酸转移酶1基因工程化到中国仓鼠卵巢细胞和sf9细胞中。这些工程化细胞表达的抗体因此被外源基因产物唾液酸化。用于获得与多种天然分子相比具有改变量的糖残基的Fc分子的另外的方法包括例如使用凝集素亲和色谱法(参见，例如，WO 07/117505)，将所述多种分子分为糖基化和非糖基化级分。已经显示特定糖基化部分的存在改变了免疫球蛋白的功能。例如，从Fc分子中除去糖链会导致与第一补体成分C1的C1q部分的结合亲和力急剧下降，以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)减弱或丧失，因此不会在体内诱导不必要的免疫反应。其它重要修饰包括唾液酸化和岩藻糖基化：唾液酸在IgG中的存在与抗炎活性相关(参见，例如，Kaneko等，Science 313：760(2006))，而从IgG前导物中去除岩藻糖导致增强的ADCC知性(参见，例如，Shoj-Hosaka等，J.Biochem.，140：777(2006))。
在替代实施方案中，本发明的抗体可具有例如通过增强其与FcγRIIIA的结合能力和增强ADCC活性而具有增强的效应子功能的Fc序列。例如，在Fc的Asn-297处附接至N-连接的聚糖的岩藻糖在空间上阻碍了Fc与FcγRIIIA的相互作用，通过糖工程改造除去岩藻糖可增强与FcγRIIIA的结合，这将转化成与野生型IgG1对照相比超过50倍的ADCC。通过IgG1的Fc部分中的氨基酸突变，蛋白质工程已经产生了增强Fc与FcγRIIIA结合的亲和力的多种变体。值得注意的是，三重丙氨酸突变体S298A/E333A/K334A表现出与FcγRIIIA的结合和ADCC功能增强了2倍。S239D/I332E(2X)和S239D/I332E/A330L(3X)变体与FcγRIIIA的结合亲和力显著增强，并在体外和体力增强了ADCC能力。通过酵母展示鉴定的其它Fc变体在小鼠异种移植模型中也显示出与FcγRIIIA的结合改善和肿瘤细胞杀伤增强。参见，例如，Liu等(2014)JBC 289(6)：3571-90，其通过引用明确地并入本文。
术语“含Fc区的抗体”是指包含Fc区的抗体。可以例如在抗体纯化期间或通过重组改造编码抗体的核酸来去除Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，根据本发明的具有Fc区的抗体可包含具有或不具有K447的抗体。
如本文中所用，术语“CD38”或涉及具有胞外酶活性的单通道II型跨膜蛋白，也称为ADP-核糖基环化酶/环状ADP-核糖水解酶1。术语“CD38”酶包括任何人和非人动物物种的CD38蛋白，尤其包括人CD38以及非人哺乳动物的CD38。
如本文中所用，术语“人CD38”语包括人CD38(UniProt P28907)的任何变体、同种型和物种同源物，无论其来源或制备方式如何。因此，“人CD38”其包括细胞天然表达的人CD38和在用人CD38基因转染的细胞上表达的CD38。
术语“仅有重链的抗CD38抗体”、“仅CD38重链的抗体”、“抗CD38重链抗体”和“CD38重链抗体”在本文中可互换使用，是指如上文所定义的与CD38(包括如上文所定义的人CD38)免疫特异性结合的仅有重链的抗体。该定义包括但不限于如上文所定义的由转基因动物(诸如表达人免疫球蛋白的转基因大鼠或转基因小鼠，包括产生人抗CD38 UniAbTM抗体的UniRatsTM)产生的人重链抗体。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列以及必要时引入空位(实现最大序列同一性百分比)并且不将任何保守取代当作序列同一性的一部分后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的比对可以以在本领域技术人员的能力内的各种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性百分比值。
“分离的”抗体是已从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选实施方案中，抗体将被纯化至(1)如通过Lowry方法所测定的至少大于95重量％的抗体，最优选大于99重量％的抗体，(2)至足以获得通过使用旋转杯测序仪测定的N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至使用考马斯蓝染色或优选银染色在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE测定的均一性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种成分将不存在。然而，通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
本发明的抗体包括多特异性抗体。多特异性抗体具有不止一种结合特异性。术语“多特异性”具体地包括“双特异性”和“三特异性”，以及高级独立特异性结合亲和力，诸如高级多表位特异性，以及四价抗体和抗体片段。“多特异性”抗体具体地包括包含不同结合实体的组合的抗体以及包含不止一种相同结合实体的抗体。术语“多特异性抗体”、仅有重链的多特异性抗体”、“多特异性重链抗体”和“多特异性UniAbTM”在本文中以最广义使用，并涵盖具有不止一种结合特异性的所有抗体。本发明的多特异性重链抗CD38抗体具体地包括与CD38蛋白诸如人CD38上的不止一种非重叠表位免疫特异性结合的抗体。
“表位”是单个抗体分子所结合的抗原分子表面上的部位。通常，抗原具有几个或许多不同的表位并与许多不同的抗体反应。该术语具体地包括线性表位和构象表位。
“表位作图”是鉴定抗体在其靶抗原上的结合部位或表位的过程。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中连续的氨基酸序列形成。构象表位由在蛋白质序列中是不连续的，但在蛋白质折叠成其三维结构时聚集在一起的氨基酸形成。
“多表位特异性”是指与相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位特异性结合的能力。如上所述，本发明具体地包括具有多表位特异性的抗CD38重链抗体，即与CD38蛋白诸如人CD38上的两个或更多个非重叠表位结合的抗CD38重链抗体。术语抗原的“一个或多个非重叠表位”或“一个或多个非竞争性表位”在本文中定义为指被一对抗原特异性抗体中的一个成员识别但未被另一成员识别的一个或多个表位。识别非重叠表位的成对抗体或多特异性抗体上靶向相同抗原的抗原结合区不竞争与该抗原的结合，并且能够同时结合该抗原。
当两种抗体与参考抗体识别相同或空间上重叠的表位时，所述抗体与参考抗体结合“基本上相同的表位”。用于确定两个表位是否与相同或空间上重叠的表位结合的最广泛使用和快速的方法是竞争测定，其可使用标记的抗原或标记的抗体以所有数量的不同形式配置。通常，将抗原固定在96孔板上，并使用放射性标记物或酶标记物测量未标记的抗体阻断标记的抗体的结合的能力。
如本文中所用，术语“价”是指抗体分子中指定数目的结合部位。
“多价”抗体具有两个或更多个结合部位。因此，术语“二价”、“三价”和“四价”分别指存在两个结合部位、三个结合部位和四个结合部位。因此，根据本发明的双特异性抗体至少是二价的并且可以是三价、四价或另外地多价的。
许多种方法和蛋白质构型是已知的并用于制备双特异性单克隆抗体(BsMAB)、三特异性抗体等。
已通过重组融合两种或更多种抗体的可变结构域，开发了多种产生多价人工抗体的方法。在一些实施方案中，多肽上的第一和第二抗原结合结构域通过多肽接头连接。这种多肽接头的一个非限制性实例是GS接头，其具有四个甘氨酸残基的氨基酸序列，随后是一个丝氨酸残基，并且其中该序列重复n次，其中n是在1至约10的范围内变化的整数，诸如2、3、4、5、6、7、8或9。此类接头的非限制性实例包括GGGGS(SEQ ID NO：433)(n＝1)和GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：434)(n＝2)。还可使用其它合适的接头，并且描述于例如Chen等Adv Drug Deliv Rev.2013年10月15日；65(10)：1357-69(其公开内容通过引用整体并入本文)中。
术语“双特异性三链抗体样分子”或“TCA”在本文中用于指包含三个多肽亚基、基本上由所述三个多肽亚基组成或由所述三个多肽亚基组成的抗体样分子，其中两个亚基包含单克隆抗体的一条重链和一条轻链或包含抗原结合区和至少一个CH结构域的此类抗体链的功能性抗原结合片段组成、基本上由其组成或由其组成。该重链/轻链对对第一抗原具有结合特异性。第三多肽亚基包含仅有重链的抗体、基本上由所述抗体组成或由所述抗体组成，所述抗体包含不存在CH1结构域的包含CH2和/或CH3和/或CH4结构域的Fc部分，以及结合第二抗原的表位或第一抗原的不同表位的抗原结合结构域，其中此类结合结构域源自抗体重链或轻链的可变区或与所述可变区具有序列同一性。此类可变区的部分可由VH和/或VL基因区段、D和JH基因区段或JL基因区段编码。可变区可由重排的VHDJH、VLDJH、VHJL或VLJL基因区段编码。TCA蛋白质利用如上文所定义的仅有重链的抗体。
本文在最广泛的意义上使用术语“嵌合抗原受体”或“CAR”来指工程化受体，其将所需的结合特异性(例如单克隆抗体的抗原结合区或其它配体)移植到跨膜和细胞内信号传导结构域。通常，受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上以产生嵌合抗原受体(CAR)。(J Natl Cancer Inst，2015；108(7)：dvj439；和Jackson等，Nature ReviewsClinical Oncology，2016；13：370-383.)。图5(图B)中显示了与scFv CAR-T构建体(图A)相比较的包含人VH细胞外结合结构域的代表性CAR-T构建体。
术语“人抗体”在本文中用于包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本文的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变。术语“人抗体”具体地包括如上文所定义的由转基因动物诸如转基因大鼠或小鼠产生的具有人重链可变区序列的仅有重链的抗体，特别是由UniRatsTM产生的UniAbsTM。
“嵌合抗体”或“嵌合免疫球蛋白”意指包含来自至少两个不同Ig基因座的氨基酸序列的免疫球蛋白分子，例如包含由人Ig基因座编码的部分和由大鼠Ig基因座编码的部分的转基因抗体。嵌合抗体包括具有非人Fc区或人工Fc区的转基因抗体和人独特型抗体。可从已被工程化以产生此类嵌合抗体的本发明的动物中分离此类免疫球蛋白。
如本文中所用，术语“效应细胞”是指与免疫反应的认知和激活阶段相反的，参与免疫反应的效应阶段的免疫细胞。一些效应细胞表达特定的Fc受体并执行特定的免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞诸如天然杀伤细胞能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。例如，表达FcR的单核细胞和巨噬细胞参与靶细胞的特异性杀伤并将抗原呈递给免疫系统的其它成分，或与呈递抗原的细胞结合。在一些实施方案中，效应细胞可以吞噬靶抗原或靶细胞。
“人效应细胞”是表达诸如T细胞受体或FcR等的受体并执行效应子功能的白细胞。优选地，所述细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞其中NK细胞是优选的。可从其天然来源，例如，从如本文所述的血液或PBMC分离所述效应细胞。
术语“免疫细胞”在本文中以最广义使用，包括但不限于髓样或淋巴样来源的细胞，例如淋巴细胞(诸如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、多形核细胞，诸如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。
抗体“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别在靶细胞上的结合抗体，随后引起靶细胞裂解的细胞介导的反应。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)的第464页上的表3中概述了造血细胞上的FcR表达。为了评估目标分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，诸如美国专利第5,500,362号或第5,821,337号中描述的测定。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选地或另外地，可以例如在动物模型诸如Clynes等PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估目标分子的ADCC活性。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体存在的情况下裂解靶标的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分(C1q)与和同源抗原复合的分子(例如，抗体)的结合而启始。为了评估补体激活，可进行例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述的CDC测定。
“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合部位与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1∶1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持结合。
如本文中所用，“Kd”或“Kd值”是指以动力学模式使用Octet QK384仪(FortebioInc.，Menlo Park，CA)通过生物双层干涉测量法测定的解离常数。例如，向抗小鼠Fc传感器装载小鼠-Fc融合抗原，然后将其浸入含有抗体的孔中以测量浓度依赖性结合率(kon)。在最后步骤中测量抗体解离速率(koff)，其中将传感器浸入仅含有缓冲液的孔中。Kd是koff/kon的比率。(关于进一步的细节参见Concepcion，J等，Comb Chem High ThroughputScreen，12(8)，791-800，2009)。
术语“治疗”、“医治”等在本文中通常用于指获得所需的药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不良作用而言可以是治疗性的。如本文中所用，“治疗”涵盖对哺乳动物疾病的任何治疗，包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即引起疾病的消退。治疗剂可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用。其中治疗稳定或减少患者的不良临床症状的正在进行的疾病的治疗特别令人感兴趣。期望在受累组织中完全丧失功能之前进行此种治疗。主题疗法可以在疾病的症状阶段期间施用，并且在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用。
“治疗有效量”旨在用于赋予受试者治疗益处所必需的活性剂的量。例如，“治疗有效量”是诱发、改善或以其它方式引起与疾病相关的病理症状、疾病进展或生理状况的改善或提高对病症的抗性的量。
在本发明的说明书文中，术语“B细胞肿瘤”或“成熟B细胞肿瘤”包括小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞淋前淋巴细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞肿瘤(诸如浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤)、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、MALT淋巴瘤、淋巴结边缘B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、原发性渗出性淋巴瘤和与AIDS相关的非霍奇金淋巴瘤。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换地用于指就治疗而进行评估和/或被治疗的哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物是人。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患有癌症的个体、患有自身免疫性疾病、具有病原体感染的个体等。受试者可以是人，但也包括其它哺乳动物，特别是可用作人疾病的实验室模型的那些哺乳动物，例如，小鼠、大鼠等。
术语“药物制剂”是指这样的制剂，其形式为允许活性成分的生物活性有效，并且不包含对将向其施用所述制剂的受试者有不可接受的毒性的其它组分。此类制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(媒介物、添加剂)是可以合理地施用于受试者哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的那些。
“无菌”制剂是无菌的或不含或基本上不含所有活的微生物及其孢子。“冷冻”制剂是指温度低于0℃的制剂。
“稳定的”制剂是其中其中的蛋白质在储存后基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。优选地，该制剂在储存后基本上保持其物理和化学稳定性以及其生物活性。通常基于制剂的预期贮存期限来选择贮存期。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的，并且综述于例如Peptide and Protein DrugDelivery，247-301.Vincent Lee编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)以及Jones.A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90)(1993)中。可以在选定的温度下测量稳定性，持续选定的时间段。可以通过多种不同的方式定性和/或定量地评价稳定性，包括评价聚集体形成(例如，使用尺寸排阻色谱法，通过测量浊度和/或通过目测)；通过使用阳离子交换色谱、图像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；比较还原抗体与完整抗体的SDS-PAGE分析；肽图谱(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评价抗体的生物活性或抗原结合功能，等等。不稳定性可能涉及以下的任一种或多种：聚集、脱酰胺(例如，Asn脱酰胺作用)、氧化(例如，Met氧化)、异构化(例如，Asp异构化)、剪切/水解/片段化(例如，铰链区片段化)、琥珀酰亚胺形成、一个或多个未配对的半胱氨酸、N末端延伸、C末端加工、糖基化差异等。
II.详细说明
本发明至少部分基于以下发现：结合胞外酶上非重叠表位的重链抗体的组合协同作用以裂解肿瘤细胞和/或抑制靶胞外酶的酶促活性。类似地，对胞外酶上至少两个非重叠表位具有结合特异性的多特异性例如双特异性重链抗体协同作用以杀伤肿瘤细胞和/或抑制靶胞外酶的酶促活性。
胞外酶
胞外酶是多样性的一组在质膜外部具有催化位点的膜蛋白。许多胞外酶存在于白细胞和内皮细胞上，它们在其中发挥着多种生物作用。除了对于所有胞外酶是共同的细胞外催化活性外，胞外酶是参与类型极不相同的酶促反应的一类多样性分子。不同的胞外酶可调节白细胞与内皮细胞接触的每个步骤，以及随后在组织中的细胞迁移。胞外酶包括但不限于CD38、CD10、CD13、CD26、CD39、CD73、CD156b、CD156c、CD157、CD203、VAP1、ART2和MT1-MMP。
胞外酶CD38属于核苷酸代谢酶家族，其除了循环核苷酸以外还生成控制细胞稳态和代谢的化合物。CD38的催化活性是各种生理过程(包括胰岛素分泌、胰腺腺泡细胞中的毒蕈碱Ca2+信号传导、中性粒细胞趋化作用、树突状细胞运输、氧毒素的分泌)以及饮食诱发的肥胖的发展所必需的。参见，Vaisitti等，Laeukemia，2015，29：356-368以及其中引用的参考文献。CD38在包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)在内的多种恶性肿瘤中表达。CD38已显示鉴定特定侵袭性形式的CLL，并被认为是阴性预后标志物，预示具有这种CLL的侵袭性变体的患者的整体生存期较短。参见，Malavasi等2011，Blood，118：3470-3478以及Vaisitti，2015(同上)。
抗胞外酶重链抗体的制备
本发明的重链抗体可通过本领域已知的方法制备。
在优选实施方案中，本文的重链抗体由其中内源性免疫球蛋白基因被敲除或失能的转基因动物(包括转基因小鼠和大鼠，优选为大鼠)产生。在优选实施方案中，在UniRatTM中产生本文的重链抗体。UniRatTM已使其内源性免疫球蛋白基因沉默，并使用人免疫球蛋白重链易位基因来表达多种天然优化的完全人HCAb库。尽管可使用多种技术将大鼠中的内源性免疫球蛋白基因座敲除或沉默，但在UniRatTM中，将锌指(内切)核酸酶(ZNF)技术用于使内源性大鼠重链J基因座、轻链Cκ因基因座和轻链Cλ因基因座失活。用于显微注射入卵母细胞的ZNF构建体可产生IgH和IgL敲除(KO)品系。关于细节，参见，例如Geurts等，2009，Science 325：433。Ig重链敲除小鼠的表征已由Menoret等，2010，Eur.J.Immunol.40：2932-2941报导。ZNF技术的有利方面在于，通过多达数个kb的缺失而欧珀莱房基因或基因座的非同源末端连接也可提供用于同源整合的靶位点(Cui等，2011，Nat Biotechnol 29：64-67)。UniRatTM中产生的人重链抗体称为UniAbsTM，其可结合不能被常规抗体攻击的表位。它们的高特异性、亲和力和小尺寸使其非常适合单特异性和多特异性应用。
除以UniAbsTM以外，还特别地包括缺少骆驼科动物VHH框架和突变及其功能性VH区的仅有重链的抗体。可以例如在如例如WO2006/008548中描述的包含仅有完全人重链的基因的基因座的转基因大鼠或小鼠中产生这样的仅有重链的抗体，但也可使用其它转基因哺乳动物，诸如兔、豚鼠、大鼠、大鼠和小鼠是优选的。还可通过重组DNA技术，通过在合适的真核或原核宿主(包括大肠杆菌(E.coli)或酵母)表达编码核酸来产生仅有重链的抗体，包括其VHH或VH功能片段。
仅有重链的抗体的结构域组合了抗体和小分子药物的有利方面：可以是单价或多价的；具有低毒性；并且制造具有成本效益。由于它们的体积小，因此这些结构域易于施用，包括口服或局部施用，其特征在于高稳定性，包括胃肠道稳定性；并且其半衰期可根据所需用途或适应症进行调整。另外，可以以具有成本效益的方式制备HCAb的VH和VHH结构域。
在特定实施方案中，包括UniAbsTM在内的本发明的重链抗体在FR4区的第一位置(根据Kabat编号系统的氨基酸位置101)处的天然氨基酸残基被另一个氨基酸残基(其能够破坏在该位置包含所述天然氨基酸残基或与所述天然氨基酸残基缔合的表面暴露的疏水补丁)取代。此类疏水补丁通常包埋在与抗体轻链恒定区的界面中，但在HCAb中暴露于表面，并且至少部分地造成不想要的HCAb的聚集和轻链缔合。取代的氨基酸残基优选为带电荷的，更优选为带正电荷的，诸如赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)或组氨酸(His，H)，优选为精氨酸(R)。在优选实施方案中，源自转基因动物的仅有重链的抗体在位置101处含有Trp至Arg的突变。所得的HCAb优选在生理条件下在无聚集的情况下具有高抗原结合亲和力和溶解性。
在某些实施方案中，抗胞外酶重链抗体结合CD38。在优选实施方案中，仅有重链的抗CD38抗体是UniAbsTM。
作为本发明的一部分，鉴定了具有来自UniRatTM动物的独特CDR3序列的人IgG重链抗CDR3抗体家族(UniAbTM)，其在ELISA(重组CD38细胞外结构域)蛋白和细胞结合测定中结合人CD38。包含五个序列家族(F01、F03、F04、F07和F09)的重链可变区(VH)序列(见图1-20)对人CD38蛋白结合和/或与CD38+细胞结合呈阳性，并且对与不表达CD38的细胞的结合呈阴性。基于达雷木单抗和伊沙妥昔单抗阻断UniAbTM与CD38+细胞结合的能力，来自这5个序列家族的UniAbsTM分为两个广泛的竞争组。结合不同表位的两个或更多个UniAbsTM的组合诱导强效CDC和直接凋亡，其中相同的UniAbsTM本身不诱导这些效应子功能的任一种。与单独的UniAbsTM相比，UniAbsTM的组合还更强效地抑制酶促活性。
本文的抗体家族的成员结合CD38阳性伯基特淋巴瘤细胞系Ramos，并且一些与食蟹猴的CD38蛋白具有交叉反应性。另外，如果需要，可对它们进行工程化以提供与任何动物物种的CD38的交叉反应性。
抗胞外酶重链抗体，包括抗CD38重链抗体，诸如本文的UniAbsTM，可具有对CD38的亲和力，其中Kd为约10-6至约10-11，包括但不限于：约10-6至约10-10、约10-6至约10-9、约10-6至约10-8、约10-8至约10-11、约10-8至约10-10、约10-8至约10-9、约10-9至约10-11、约10-9至约10-10或这些范围内的任何值。可通过用于调节(例如阻断)CD38生物活性的生物评估(包括体外测定、临床前模型和临床试验以及潜在毒性的评估)来确认亲和力选择。
与胞外酶靶上的非重叠表位结合的重链抗体，包括但不限于抗-CD38重链抗体，例如UniAbsTM可通过竞争结合测定(诸如酶联免疫测定(ELISA测定)或流式细胞术竞争性结合测定)进行鉴定。例如，可以利用与靶抗原结合的已知抗体与目标抗体之间的竞争。通过使用这种方法，可以将一组抗体分为与参照抗体竞争的那些抗体和不与参照抗体竞争的那些抗体。非竞争性抗体被鉴定为与不与参照抗体所结合的表位重叠的独特表位结合。通常，将一种抗体固定，抗原被结合，在ELISA测定中测试第二标记的(例如生物素化的)抗体的结合捕获的抗原的能力。这也可使用表面等离离子体共振(SPR)平台(包括ProteOn XPR36(BioRad，Inc)、Biacore 2000和Biacore T200(GE Healthcare Life Sciences))和MX96SPR成像仪(Ibis technologies B.V.)以及在生物层干涉测量平台(诸如Octet Red384和Octet HTX(ForteBio，Pall Inc))上进行。关于更多细节，参见示例和图27。
通常，如果如通过标准技术，诸如通过上述竞争结合测定所测定的，抗体引起参考抗体与靶抗原的结合降低约15-100％，则其与参考抗体“竞争”。在各个实施方案中，相对抑制为至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高。
在一个实施方案中，对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性二价重链抗体包含对第一CD38表位具有结合亲和力的第一多肽(所述第一多肽包含重链抗体的抗原结合结构域(其包含SEQ ID NO：150的CDR1序列、SEQ ID NO：92的CDR2序列和SEQ ID NO：168的CDR3序列)、铰链区的至少一部分以及包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域)和对第二CD38表位具有结合亲和力的第二多肽(所述第二多肽包含重链抗体的抗原结合结构域(其包含SEQ ID NO：393的CDR1序列、SEQ ID NO：412的CDR2序列和SEQ IDNO：424的CDR3序列)、铰链区的至少一部分以及包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域)，以及第一多肽的CH2结构域与第二个多肽的CH2结构域之间的不对称界面。在某些优选实施方案中，该双特异性二价重链抗体包含作为人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区或沉默的人IgG4 Fc区的Fc区。
在一个实施方案中，对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性四价重链抗体包含两条相同的多肽，每条多肽包含对第一CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的第一抗原结合结构域(其包含SEQ ID NO：1 50的CDR1序列、SEQ ID NO：92的CDR2序列和SEQ ID NO：168的CDR3序列)、对第二CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的第二抗原结合结构域(其包含SEQ ID NO：393的CDR1序列、SEQ ID NO：412的CDR2序列和SEQID NO：424的CDR3序列)、铰链区的至少一部分以及包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域。在某些实施方案中，该重链抗体包含作为人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区或沉默的人IgG4 Fc区的Fc区。
在另一个实施方案中，对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性四价重链抗体包含第一重链多肽和第二重链多肽，其中第一重链多肽包含两个对第一个CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域(每个抗原结合结构域包含SEQ ID NO：150的CDR1序列、SEQ ID NO：92的CDR2序列和SEQ ID NO：168的CDR3序列)、铰链区的至少一部分以及包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域，以及第一多肽的CH2结构域与第二多肽的CH2结构域之间的不对称界面，并且其中第二重链多肽包含两个对第二CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域(每个抗原结合结构域包含SEQ ID NO：393的CDR1序列、SEQ ID NO：412的CDR2序列和SEQ ID NO：424的CDR3序列)、铰链区的至少一部分以及包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域、以及第一多肽的CH2结构域与第二多肽的CH2结构域之间的不对称界面。在某些优选实施方案中，该重链抗体包含作为人IgG1Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgGl Fc区或沉默的人IgG4 Fc区的Fc区。
在一些实施方案中，根据本文所述和/或本领域已知的方法，将本文所述的两个或更多个抗原结合结构域组合成单个分子，例如，双特异性四价抗体。在一个实施方案中，本发明的双特异性四价抗体包括克隆ID321986和克隆ID 321663的重链可变区序列。根据本发明实施方案的抗体可具有重链可变区序列沿着结合化合物的每个多肽亚基的任何合适取向(N末端至C末端，或C末端至N末端)。在某些实施方案中，重链可变区序列沿着每个多肽亚基从N末端至C端的取向是：VH 321663、VH321986。在某些实施方案中，重链可变区序列沿着每个多肽亚基从N末端至C末端的取向是：VH 321986、VH321663。根据本发明的一些实施方案的四价抗体包含位于合适位置的接头序列。在一些实施方案中，接头位于每个多肽亚基上的第一VH结构域与第二VH结构域之间。在一些实施方案中，接头位于给定的VH结构域的近端或远端，例如，接头位于VH结构域的C-末端和/或VH结构域的N末端。
药物组合物、用途和治疗方法
本发明的另一方面是提供包含与合适的药学上可接受的载体的混合的一种或多种本发明的抗体的药物组合物。本文中使用的药学上可接受的载体是示例性但不限于佐剂、固体载体、水、缓冲剂或本领域中用于保持治疗组分的其它载体，或其组合。
在一个实施方案中，药物组合物包含两种或更多种与胞外酶例如CD38、CD73或CD39上的非重叠表位结合的仅有重链的抗体。在优选实施方案中，药物组合物包含两种或更多种与胞外酶例如CD38、CD73或CD39的非重叠表位结合的仅有重链的抗体的协同组合。
在另一个实施方案中，药物组合物包含多特异性(包括双特异性)仅有重链的抗体，其对胞外酶例如CD38、CD73或CD39上的两个或更多个非重叠表位具有结合特异性。在优选实施方案中，药物组合物包含多特异性(包括双特异性)仅有重链的抗体，其对胞外酶例如CD38、CD73或CD39上的两个或更多个非重叠表位具有结合特异性，相对于与相同表位结合的任何单特异性抗体，具有改善的特性。
通过将具有所需纯度的蛋白质与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编辑(1980))混合来将根据本发明使用的抗体的药物组合物制备成诸如冻干制剂或水溶液形式以用于储存。可接受的稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂在所使用剂量和浓度下对接受者无毒性，并且包括：诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸的抗氧化剂；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯的对羟基苯甲酸烷基酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白的蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮的亲水性聚合物；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸的氨基酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；诸如EDTA的螯合剂；诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇的糖类；诸如钠的成盐抗衡离子；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)的非离子表面活性剂。
用于肠胃外施用的药物组合物优选是无菌的并且基本上是等渗的，并且是在良好生产规范(GMP)条件下生产的。药物组合物可以以单位剂型(即，单次施用的剂量)提供。制剂取决于所选的施用途径。本文的抗体可以通过静脉内注射或输注或皮下施用。对于注射施用，可将本文的抗体配制在水溶液中，优选配制在生理相容的缓冲液中，以减少注射部位的不适感。溶液可包含如上所讨论的载体、赋形剂或稳定剂。或者，抗体可呈冻干形式，以在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原的水复溶。
例如，在美国专利第9,034,324号中公开了抗CD38抗体制剂。类似的制剂可用于本发明的重链抗体，包括UniAbsTM。皮下抗体制剂描述于例如20160355591和US 20160166689中。
使用方法
与胞外酶上非重叠表位结合的仅有重链的抗体、此类抗体的组合(包括协同组合)、对胞外酶上两个或更多个非重叠表位具有结合特异性的多特异性抗体以及包含此类抗体和抗体组合的药物组合物可用于靶向特征在于靶胞外酶的表达的疾病和疾患。
在各个实施方案中，所述胞外酶选自由以下组成的组：CD10、CD13、CD26、CD38、CD39、CD73、CD156b、CD156c、CD157、CD203、VAP1、ART2和MT1-MMP。
在特定实施方案中，所述胞外酶是CD38、CD73和/或CD39。
CD38是46kDa的II型跨膜糖蛋白，具有短的20-aaN末端胞质尾和长的256-aa细胞外结构域(Malavasi等，Immunol.Today，1994，15：95-97)。由于其在许多血液恶性肿瘤(包括多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(综述于Shallis等Cancer Immunol.Immunother.，2017，66(6)：697-703)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(Vaisitti等Leukemia，2015，29”356-368)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、dT细胞ALL)中高水平表达，因此CD38是治疗血液恶性肿瘤的基于抗体的治疗剂的有希望的靶标。CD38还被认为年龄相关烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)下降中的关键因素，并且有人提出与NAD前体结合的CD38抑制可用作代谢功能障碍和年龄相疾病的潜在疗法(参见，例如，Camacho-Pereira等，CellMetabolism2016，23：1127-1139)。CD38还被描述为参与气道高响应性(哮喘的标志性特征)的发展，并且已被建议作为治疗此类疾病的靶标。
本文的仅有重链的抗CD38抗体、抗体组合、多特异性抗体和药物组合物可用于靶向特征在于CD38的表达或过表达的疾病和疾患，包括但不限于上文所列的疾患和疾病。
在一个方面，本文的CD38重链抗体和药物组合物可用于治疗特征在于CD38的表达的血液恶性肿瘤，包括多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、dT细胞ALL。本发明的CD38重链抗体和药物组合物也可用于治疗哮喘和特征在于气道高响应性的其它疾患以及特征在于烟酰胺胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)下降的年龄相关代谢功能障碍。
MM是B细胞恶性肿瘤，其特征在于骨髓隔室中的异常浆细胞的单克隆扩增和积累。目前治疗MM的疗法经常导致缓解，但几乎所有患者最终都会复发并死亡。有大量证据表明在同种异体造血干细胞移植的背景中存在免疫介导的骨髓瘤细胞消除；然而，这种方法的毒性很高，很少有患者得到治愈。尽管一些单克隆抗体已在临床前研究和早期临床试验中显示出治疗MM的前景，但任何针对MM的单克隆抗体疗法的一致临床疗效尚未得到最终证实。因此非常需要新的疗法，包括针对MM的免疫疗法(参见，例如Shallis等，同上)。
已经描述了CD73用作产生细胞外腺苷的胞外酶，其通过经由腺苷受体信号传导限制抗肿瘤T细胞免疫来促进肿瘤生长。CD73在某些癌症(诸如乳腺癌、结肠癌和前列腺癌)中表达。在鼠肿瘤模型中对于靶向CD73的小分子抑制剂或单克隆抗体的结果表明了靶向CD73疗法(包括免疫疗法)作为单一疗法或与其它抗癌剂(诸如抗PD1和/或抗CTLA-4抗体)组合地控制特征在于CD73的表达的肿瘤生长的潜力具有潜力。参见，例如，B Zhang，CancerRes；2010，70(16)，6407-11；Allard等，Clinical CancerRes，2013，19(20)：5626-5635。
CD39和CD73已被普遍认为在通过腺苷产生来产生免疫抑制性微环境中起着关键作用。在许多上皮和血液恶性肿瘤中均已报道CD39的上调，并且已证明其在慢性淋巴细胞性白血病中的表达与不良预后相关。(Pulte等，2011，Clin Lymphoma Myeloma Leuk.2011；11：367-372；Bastid等，2013，Oncogene，32：1743-1751；Bastid等，2015，Cancer ImmunolRes.，3：254-265)。CD39也在调节性T细胞(Tregs)上高度表达并且是它们的抑制性功能所需的(如通过Tregs在缺乏CD39的小鼠中的受损的抑制性活性所证明的)(Deaglio等，2007，J Exp Med.，204：1257-1265)。已提出，CD39可通过其增强的对Treg、肿瘤相关基质或恶性上皮细胞的酶促活性来帮助推动肿瘤发生，从而导致抗肿瘤T细胞和天然杀伤(NK)细胞的腺苷介导的免疫抑制以及化学疗法对ATP诱导的细胞死亡的中和(Bastid等，2013和2015，同上；Feng等，2011，Neoplasia，13：206-216)。调节免疫抑制性CD39/CD73-腺苷途径被认为是用于癌症疗法的有前景的免疫治疗策略(Sitkovsky等，2014，Cancer Immunol Res.2：598-605)。也参见，Hayes等，Am J Trans Res，2015，7(6)：1181-1188。
关于CD73和CD39外核苷酸酶在T细胞分化中的作用的综述，参见，例如，Bono等，FEBS Letters，2015，589：3454-3460。
用于治疗疾病的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其它药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但也可治疗非人哺乳动物，例如，伴侣动物诸如狗、猫、马等，实验室哺乳动物诸如兔、小鼠、大鼠等等。可以滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
剂量水平可以由普通熟练的临床医生容易地确定，并且可以根据需要进行修改，例如，根据需要修改受试者对疗法的反应。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量根据所治疗的宿主和特定的施用方式而变化。剂量单位形式通常含有约1mg至约500mg活性成分。
在一些实施方案中，所述药剂的治疗剂量可在约0.0001至100mg/kg的宿主体重，更常见地0.01至5mg/kg的宿主体重的范围内。例如，剂量可以是1mg/kg的体重或10mg/kg的体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。通常在多重情况下施用本发明的治疗性实体。单剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。如通过测量患者中治疗性实体的血液水平所指示的，间隔也可以是无规律的。或者，可将本发明的治疗性实体作为持续释放制剂施用，在该情况下需要较低频率的施用。剂量和频率根据患者中多肽的半衰期而变化。
通常，将组合物制备成可注射的，制备为液体溶液或混悬液；也可以制备适于在注射前溶解或悬浮在液体媒介物中的固体形式。本文的药物组合物适合于直接或在固体(例如，冻干的)组合物复溶后静脉内或皮下施用。如上所述，还可以乳化制剂或将其包封在脂质体或微粒(诸如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物)中，以增强佐剂效果。Langer，Science249：1527，1990和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28：97-119，1997。本发明的药剂可以以长效注射剂或植入制剂的形式施用，可以以诸如允许持续或脉冲释放活性成分的方式配制其。通常将药物组合物配制成无菌的、基本上等渗的并且完全遵从美国食品和药物管理局的所有优质生产规范(Good Manufacturing Practice)(GMP)条例。
本文所述的抗体和抗体结构的毒性可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学方法，例如通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)或LD100(对100％群体致死的剂量)来测定。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制对在人中使用无毒的剂量范围。本文所述抗体的剂量优选在包括有效剂量且几乎没有毒性或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可根据所用的剂型和所用的给药途径在此范围内变化。确切的制剂、施用途径和剂量可以由个体医生根据患者的状况选择。
用于施用的组合物通常包含溶解在药学上可接受的载体(优选含水载体)中的抗体或其它消融剂。可以使用各种含水载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常没有不希望的物质。这些组合物可以通过常规的熟知的灭菌技术来灭菌。该组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中活性剂的浓度可以广泛变化，并且将根据所选择的特定施用方式和患者的需要，主要基于流体体积、粘度、体重等来选择(例如，Remington′s Pharmaceutical Science(第15版，1980)和Goodman&Gillman，ThePharmacological Basis of Therapeutics(Hardman等，编辑，1996))。
包括本发明的活性剂及其制剂和使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。所述试剂盒还可含有至少一种另外的试剂，例如，化学治疗药物等。试剂盒通常包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上提供或与试剂盒一起提供或者以其它方式随试剂盒附带的任何书写或记录材料。
现在充分描述了本发明，对于本领域普通技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以进行各种改变和修改。
材料和方法
CD38蛋白结合
在Octet QK-384系统(ForteBio)上进行测定抗原-抗体亲和力的动力学实验。在测定缓冲液(1x PBS，0.1％BSA，0.02％Tween-20，pH 7.2)中水合抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(Forte Bio，部件号：18-5064)，并在100mM甘氨酸pH 1.5中进行预处理。在测定缓冲液中建立基线，持续120秒。然后用浓度为5μg/mL为的UniAbsTM固定AHC生物传感器120秒。在测定缓冲液中建立另一个基线(120秒)。接着，然后将其从250nM开始浸入抗原cyCD38(Sino Biologics-90050-C08H)的7-点、1∶2系列稀释液。分析物柱的最后一个孔仅含有测定缓冲液以测试缓冲液与加载的生物传感器之间的非特异性结合，并用作参考孔。观察缔合600秒，然后观察解离900秒。使用Octet Data Analysis v9.0(ForteBio)进行数据分析。使用标准的1∶1结合模型分析结合动力学。
CD38细胞结合
使用Ramos细胞系(ATCC)通过流式细胞术(Guava easyCyte 8HT，EMD Millipore)评估与CD38阳性细胞的结合。简言之，在4℃下用纯化的UniAbsTM系列稀释液对100,000个靶细胞染色30分钟。孵育后，将细胞用流式细胞术缓冲液(1X PBS，1％BSA，0.1％NaN3)洗涤两次，并用缀合至R-藻红蛋白(PE)的山羊F(ab′)2抗人IgG(Southern Biotech，目录号2042-09)染色以检测细胞结合的抗体。在4℃下孵育20分钟后，将细胞用流式细胞术缓冲液洗涤两次，然后通过流式细胞术测量平均荧光强度(MFI)。使用GraphPad Prism 7计算EC50值。使用具有以下修改的相同方案测定与食蟹猴CD38阳性细胞的结合：靶细胞来自被稳定地转染以表达食蟹猴CD38的细胞外结构域的大鼠C6细胞系(ATCC)，并且在单一浓度(～1.7μg/mL)下测试每种抗体，因此未计算EC50值。
补体依赖性细胞毒性(CDC)
使用CD38阳性Daudi或Ramos细胞系(ATCC)测定了每种抗CD38 UniAbTM的补体依赖性细胞毒性(CDC)。总而言之，在室温下用1μg/mL单一浓度的纯化UniAbTM或一定剂量范围的纯化UniAb对20,000个靶细胞进行调理作用，持续10分钟。孵育后，将人补体血清(Innovative Research，目录号IPLA-CSER)添加至终浓度为17％，或将兔补体血清(Sigma-Aldrich，目录号S7764)添加至终浓度为5％并分别孵育(37℃，8％CO2)3.5小时或30分钟。孵育后，通过添加ATP依赖的发光试剂Cell Titer Glo 2.0(Promega，目录号G9232)对ATP进行间接定量来测量细胞存活力。使用Spectramax i3x读板仪(Molecular Devices)记录发光信号，并通过与用同种型对照抗体处理的细胞进行比较来测定存活力百分比。
抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)
使用基于细胞的ADCC Reporter生物测定法(Promega，目录号G7010)评估抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。简言之，将12,500个CD38阳性Ramos靶细胞(ATCC)添加到96孔板的孔中，并用每种抗CD38 UniAbTM的系列稀释液进行处理。接着，以6∶1的E∶T比率添加表达FcγRIIIa以及荧光素酶报告子(在NFAT应答元件控制下)的报告细胞，并在组织培养孵育箱(37℃，8％CO2)中孵育6小时。在添加Bio-Glo荧光素酶测定底物后，使用Spectramax i3x读板仪(Molecular Devices)测量发光。发光报告信号的增加表明ADCC活性更高。使用GraphPadPrism软件(sigmoidal，4PL curve fit)计算EC50值。
抗体诱导的直接凋亡
使用CD38阳性Ramos细胞(ATCC)分析了通过抗体诱导的直接凋亡产生的细胞毒性。总之，将45,000个靶细胞用2μg/mL纯化的UniAbsTM或一定剂量范围的纯化的UniAbsTM处理48小时(37℃，8％CO2)。孵育后，将细胞用膜联蛋白-V结合缓冲液(BioLegend，目录号422201)洗涤两次，并用膜联蛋白V和7-AAD(BioLegend，目录号640945和420404)染色。然后通过流式细胞术(Guava easyCyte 8HT，EMD Millipore)分析样品，并将活细胞的百分比确定为膜联蛋白V和7AAD阴性群体。
抗体诱导的间接凋亡
为测量通过Fc交联介导的凋亡，用0.4μg/mL的抗CD38 UniAbsTM和1.6μg/mL的纯化的山羊F(ab′)2抗人IgG Fc(Abcam，目录号ab98526)处理CD38阳性Ramos靶细胞(ATCC)。孵育(37℃，8％CO2)24小时后，将细胞洗涤并重悬于膜联蛋白V结合缓冲液(BioLegend，目录号422201)中，并用膜联蛋白V和7-AAD(BioLegend，目录号640945和420404)染色。然后通过流式细胞术(Guava easyCyte 8HT，EMD Millipore)分析样品，并将活细胞的百分比确定为膜联蛋白V和7AAD阴性群体。
CD38酶促活性
为了测量对CD38环化酶活性的抑制，将重组人CD38(Sino Biological，10818-H08H)与50μg/mL的每种纯化的抗CD38 UniAbTM在室温下于环化酶活性缓冲液(50mM MES pH6.5)中孵育15分钟。孵育后，将烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸(Sigma Aldrich，目录号N5131)添加至终浓度为150μM。使用Spectramax i3x读板仪(Molecular Devices)在1小时(例如300nm/em 410nm)时测量荧光分子环状GDP核糖的产生。通过将来自UniAbTM处理的孔的信号与用同种型对照抗体(最大)处理CD38蛋白时观察到的总酶促活性的百分比进行比较来评估环化酶酶抑制。
实施例1：表达仅有重链的抗体的遗传工程化大鼠
构建‘人-大鼠’IgH基因座并组装在若干部分中。这涉及修饰大鼠C区基因并将其连接在人JH下游，随后在上游添加人VH6-D区段区域。然后将具有单独的人VH基因簇的两个BAC[BAC6和BAC3]与称为Georg的编码包含人VH6、所有D、所有JH和经修饰的大鼠Cγ2a/1/2b(ΔCH1)的组装和修饰区域的BAC共注射。
产生携带呈未重排构型的人工重链免疫球蛋白基因座的转基因大鼠。IgG2a(ΔCH1).、IgG1(ΔCH1).、IgG2b(ΔCH1)基因缺乏CH1区段。恒定区基因IgE、IgA和3′增强子包含在Georg BAC中。转基因大鼠的RT-PCR和血清分析(ELISA)揭示了转基因免疫球蛋白基因座的生产性重排和各种同种型的仅有重链的抗体在血清中的表达。将转基因大鼠与先前在美国专利公开号2009/0098134 A1中描述的具有突变的内源重链和轻链基因座的大鼠杂交。对此类动物的分析证明了大鼠免疫球蛋白重链和轻链表达的失活以及具有由人V、D和J基因编码的可变区的重链抗体的高水平表达。转基因大鼠的免疫接种导致产生抗原特异性重链抗体的高滴度血清响应。这些表达具有人VDJ区域的重链抗体的转基因大鼠被称为UniRatsTM。
实施例2：UniRatsTM的免疫接种和血清滴度的测定
利用BCMA的重组细胞外结构域进行免疫接种。
用重组人CD38蛋白免疫接种12只UniRatTM动物(6只HC27，6只HC28)。根据标准方案使用Titermax/铝胶佐剂免疫动物。CD38的重组细胞外结构域购自R&D Systems并将其用无菌盐水稀释并与佐剂合并。将免疫原与Titermax和铝胶佐剂合并。在左腿和右腿中施用利用Titermax中的免疫原的第一免疫接种(初免)。随后的加强免疫在铝胶存在的情况下进行，并且在收获前三天用PBS中的免疫原进行加强。在最终出血时从大鼠收集血清以测定血清滴度。
血清滴度结果
测试了6只动物的血清滴度稀释液针对图22中所显示的免疫原的结合活性。取自所有动物的血清显示出对重组蛋白的反应性，并且不结合对照抗原。
实施例3：基因组装、表达和测序
选择编码在淋巴结细胞中高度表达的仅有重链的抗体的cDNA用于基因组装并克隆到表达载体中。随后，将这些重链序列在HEK细胞中表达为仅有UniAbTM重链的抗体(缺失CH1，无轻链)。
图1、5、9、13和17分别显示了抗CD38 UniAbTM家族1、3、4、7和9的重链可变结构域氨基酸序列。
图2、6、10、14和18分别显示了抗CD38 UniAbTM家族1、3、4、7和9的独特CDR1-3序列。
图3、7、11、15和19分别显示了所列的抗CD38 UniAbTM抗体家族1、3、4、7和9的CDR1-CDR3序列。
实施例4：细胞结合、酶促和CDC活性
图4、8、12、16和20分别显示了所列的抗CD38 UniAbTM抗体家族1、3、4、7和9的Ramos细胞结合、CyCD38C6细胞结合、酶促活性和CDC活性。第一列表示所测试的UniAbTM的克隆ID。第二列表示与Ramos细胞结合的细胞的平均荧光强度(MFI)除以与Ramos一起孵育的对照抗体的背景MFI。第三列表示与用食蟹猴CD38转染的大鼠C6细胞结合的细胞的平均荧光强度(MFI)除以与相同细胞一起孵育的对照抗体的背景MFI。第四列表示在相应的CD38结合UniAbsTM对比对照UniAbTM存在的情况下重组CD38的酶促活性百分比。
实施例5：抗CD38 UniAbsTM的进一步表征
如图23所示，代表5种独特的重链CDR3序列家族的UniAbsTM表现出多种功能行为，其中每个家族均表现出独特的一组特征。从5个CDR3序列家族中的每一个中选择单个前导VH序列来进行IgG1 UniAbTM形式的其它功能筛选。在一些测定中，包含达雷木单抗和伊沙妥昔单抗作为参考对照。表征每种UniAb的与人和cyno CD38蛋白的结合以及与表达人或cynoCD38的细胞的结合。另外，在适当的测定条件下，评估了UniAbsTM抑制CD38的天然环化酶(酶)活性的能力以及刺激针对表达CD38的哺乳动物细胞的间接凋亡、直接凋亡、ADCC和CDC的能力。
图24显示与不同浓度的达雷木单抗混合的UniAbTM 309407(以12.5nM)的不同组合的CDC。UniAbTM 309407本身不通过CDC裂解Ramos细胞。与UniAb 309407混合的达雷木单抗比单独的达雷木单抗更有效。UniAb 309407在人IgG4背景下也增强了达雷木单抗的CDC活性。IgG4不结合补体。这表明UniAb 309407与CD38的结合可调节结合非重叠表位的抗体的CDC活性。
图25显示UniAbsTM与包含ID309021和ID309407的VH结构域的四价双特异性UniAb的组合的补体固定。这两种UniAbsTM及其VH结构域结合CD38上的2个非重叠表位。在单个四价抗体(309021_309407_2XGSlink)中组合这两种CD38结合剂产生稳健的补体固定并杀伤肿瘤细胞。与达雷木单抗相比，UniAbsTM和四价双特异性UniAb的混合物诱导对Ramos细胞的更有效的CDC。单独的UniAbsTM不诱导CDC。
图26显示二价和四价UniAbsTM对CD38的环化酶活性的酶抑制作用。结合CD38上的两个非重叠表位的四价双特异性UniAbTM强效地抑制环化酶活性。二价单特异性UniAbsTM不抑制环化酶活性。抗BCMA UniAbTM用作阴性对照。也参见图21，其为两个四价双特异性重链抗体和一个二价双特异性重链抗体的示意图。
图27显示抗体之间对与CD38结合的竞争。基于达雷木单抗和伊沙妥昔单抗阻断UniAb与CD38+细胞结合的能力，来自五个序列家族的UniAbsTM分为两个广泛的竞争组。为了鉴定具有与达雷木单抗和伊沙妥昔单抗的表位部分或完全重叠的表位的UniAbsTM，使用流式细胞术测量通过用达雷木单抗或伊沙妥昔单抗预处理Ramos细胞所阻断的UniAb结合的百分比。阻断百分比的增加表明两种抗体具有重叠表位的可能性更高。在该组中，家族F01、F04、F07和F09均显示至少一定水平的由达雷木单抗和伊沙妥昔单抗两者产生的阻断，表明可能与重叠表位结合(将它们置于竞争组1中)。相反地，F03UniAb(309407)结合不会被达雷木单抗或伊沙妥昔单抗的预处理阻断，这表明其很可能结合不同的表位(将其置于竞争组2中)。
图28显示Ramos细胞的CDC。滴定UniAbTM 309021并将其与固定浓度的不同UniAbsTM混合(参见图例)。IgG1和IgG4形式的UniAbsTM 309407显示与UniAbTM 309021的协同作用。IgG1形式的UniAbTM 309265显示与UniAb 309021TM的协同作用。所有其它UniAbTM与UniAbTM 309021没有协同作用。
实施例6：CDC介导的细胞死亡
图29显示包含克隆ID321986和克隆ID321663的VH结构域的四价双特异性UniAbsTM与这两种相同的UniAbsTM的二价单特异性混合物的混合物相比的对Ramos细胞的CDC介导的肿瘤细胞死亡。这两个VH结构域结合CD38上的非重叠表位，并且与两个二价单特异性UniAbsTM(321986+321663)的混合物相比，将这些VH结构域组合成单一的四价抗体(321986_321663_2XGSlink和321663_321986_2XGSlink)提高了CDC对肿瘤细胞的杀伤。
图30显示包含克隆ID 321986和克隆ID 321663的VH结构域的四价双特异性UniAbsTM对Ramos细胞的直接肿瘤细胞凋亡。杀伤效力受四价分子内VH结构域的顺序影响。与当克隆ID 321986的VH结构域处于远端(321986_321663_2XGSlink)(即，位于C端附近)时相比，当克隆ID 321663的VH结构域处于远端(321663_321986_2XGSlink)(即，位于靠近N端)时观察到更强效的杀伤。
虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应该理解的是，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。

Claims (57)

1.一种组合物，其包含与相同胞外酶上的非重叠表位结合的两种或更多种重链抗体的组合。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述胞外酶选自由以下组成的组：CD10、CD13、CD26、CD38、CD39、CD73、CD156b、CD156c、CD157、CD203、VAP1、ART2和MT1-MMP。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述胞外酶是CD38、CD39或CD73。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述胞外酶是CD38。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述重链抗体是UniAbTM。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述两种或更多种重链抗体包含选自由以下组成的组的重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO：1-60、99-149、175-218、247-308和323-391。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述重链可变区氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1、99、100175、247、323和325。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述重链可变区氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：99、100、175、323和325。
9.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含第一重链抗体和第二重链抗体的组合，其中
(a)所述第一抗体包含选自由SEQ ID NO：150和394组成的组的CDR1序列、选自由SEQID NO：92和413组成的组的CDR2序列以及选自由SEQ ID NO：168和431组成的组的CDR3序列，以及
(b)所述第二抗体包含选自由SEQ ID NO：219和393组成的组的CDR1序列、选自由SEQID NO：83和412组成的组的CDR2序列以及选自由SEQ ID NO：240和424组成的组的CDR3序列。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述第一抗体包含选自由SEQ ID NO：100和323组成的组的重链可变区氨基酸序列，并且所述第二抗体包含选自由SEQ ID NO：175和325组成的组的重链可变区氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体是IgG1。
12.如权利要求10所述的组合物，其中所述组合是协同的。
13.如权利要求10所述的组合物，所述组合物包含UniAbsTM309021和309265的组合或UniAbsTM321986和321663的组合。
14.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含第一重链抗体和第二重链抗体的组合，其中
(a)所述第一抗体包含SEQ ID NO：394的CDR1序列、SEQ ID NO：413的CDR2序列和SEQID NO：431的CDR3序列，以及
(b)所述第二抗体包含SEQ ID NO：151的CDR1序列、SEQ ID NO：163的CDR2序列和SEQID NO：172的CDR3序列。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述第一抗体包含SEQ ID NO：323的重链可变区氨基酸序列，并且所述第二抗体包含99的重链可变区氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体是IgG1或IgG4。
17.如权利要求15所述的组合物，其中所述组合是协同的。
18.如权利要求15所述的组合物，所述组合物包含UniAbsTM309021和309407的组合。
19.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含选自由309021、309407和309265组成的组的UniAbTM。
20.一种对胞外酶上的至少两个非重叠表位具有结合特异性的多特异性重链抗体。
21.如权利要求20所述的多特异性抗体，其中所述胞外酶选自由以下组成的组：CD10、CD13、CD26、CD38、CD39、CD73、CD156b、CD156c、CD157、CD203、VAP1、ART2和MT1-MMP。
22.如权利要求21所述的多特异性抗体，其中所述胞外酶是CD38、CD39或CD73。
23.如权利要求22所述的多特异性抗体，其中所述胞外酶是CD38。
24.如权利要求23所述的多特异性抗体，所述多特异性抗体包含两种或更多种与选自由以下组成的组的CD38上的非重叠表位结合的重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO：1-60、99-149、175-218、247-308和323-391。
25.如权利要求21-24中任一项所述的多特异性抗体，其是双特异性的。
26.如权利要求25所述的多特异性抗体，其是二价的。
27.如权利要求25所述的多特异性抗体，其是四价的。
28.如权利要求22所述的多特异性抗体，其是双特异性的，其包含(a)第一重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO：150和394组成的组的CDR1序列、选自由SEQ ID NO：92和413组成的组的CDR2序列以及选自由SEQ ID NO：168和431组成的组的CDR3序列，以及(b)第二重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO：219和393组成的组的CDR1、选自由SEQ ID NO：83和412组成的组的CDR2序列和选自由SEQ ID NO：240和424组成的组的CDR3序列。
29.如权利要求28所述的多特异性抗体，所述多特异性抗体包含选自由SEQ ID NO：SEQID NO：100和323组成的组的第一重链可变区序列和选自由SEQ ID NO：175和325组成的组的第二重链可变区序列。
30.如权利要求28或29所述的多特异性抗体，其是二价的。
31.如权利要求28或29所述的多特异性抗体，其是四价的。
32.如权利要求28或29所述的多特异性抗体，其是IgG1。
33.如权利要求22所述的多特异性抗体，其是双特异性的，其包含(a)第一重链可变区，其包含SEQ ID NO：394的CDR1序列、SEQ ID NO：413的CDR2序列和SEQ ID NO：431的CDR3序列，以及(b)第二重链可变区，其包含SEQ ID NO：151的CDR1序列、SEQ ID NO：163的CDR2序列和SEQ ID NO：172的CDR3序列。
34.如权利要求33所述的多特异性抗体，所述多特异性抗体包含SEQ ID NO：SEQ IDNO：323的第一重链可变区序列和SEQ ID NO：99的第二重链可变区序列。
35.如权利要求33或34所述的多特异性抗体，其是二价的。
36.如权利要求33或34所述的多特异性抗体，其是四价的。
37.如权利要求33或34所述的多特异性抗体，其是IgG1或IgG4。
38.如权利要求20-37中任一项所述的多特异性抗体，其是UniAbTM。
39.一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含UniAbsTM309021、309265、309407、321986和321663中的一种或多种的结合特异性。
40.如权利要求39所述的多特异性抗体，所述多特异性抗体包含UniAbsTM 309021、309265和309407的结合特异性。
41.如权利要求39所述的多特异性抗体，所述多特异性抗体包含UniAbsTM 321986和321663的结合特异性。
42.一种CAR-T，所述CAR-T包含如权利要求20-41中任一项所述的多特异性抗体中的一种或多种的重链可变区序列。
43.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-19中任一项所述的组合物、如权利要求20-41中任一项所述的多特异性抗体或如权利要求42所述的CAR-T。
44.一种用于治疗特征在于胞外酶的表达的疾病或疾患的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的如权利要求43所述的药物组合物。
45.一种用于治疗特征在于CD38、CD39或CD73的表达的疾病或疾患的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的与CD38、CD39或CD73上的两个或更多个非重叠表位结合的多特异性重链抗体。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述疾病或疾患的特征在于CD38的表达。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述疾病或疾患选自由以下组成的组：血液恶性肿瘤、特征在于气道高响应性的疾患以及特征在于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)下降的年龄相关和代谢功能障碍。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述血液恶性肿瘤选自包括以下的组：多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和dT-细胞ALL。本发明的CD38重链抗体和药物组合物还可用于治疗哮喘和特征在于气道高响应性的其它疾患以及特征在于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)下降的年龄相关和代谢功能障碍。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述血液恶性肿瘤是MM。
50.如权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体包含选自由以下组成的组的抗体中的两种或更多种的重链CDR1、CDR2和CDR3序列：309021、309265、309407、321986和321663。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述多特异性抗体包含选自由以下组成的组的UniAbsTM中的两种或更多种的重链可变区序列：309021、309265、309407、321986和321663。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述多特异性抗体包含选自由以下组成的组的重链CDR1、CDR2和CDR3序列：UniAbsTM309201和309265；以及309021和309407；以及321986和321663。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述多特异性抗体包含选自由以下组成的组的重链可变区序列：UniAbsTM 309201和309265；以及309021和309407；以及321986和321663。
54.如权利要求49至53中任一项所述的方法，所述方法还包括施用一种或多种其它剂以治疗MM。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述剂选自由以下组成的组：达雷木单抗、伊沙妥昔单抗、依洛珠单抗和在MM的治疗方面有效的化学治疗剂。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述化学治疗剂选自由以下组成的组：来那度胺、地塞米松和硼替佐米。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述化学治疗剂是来那度胺和地塞米松或硼替佐米和地塞米松。
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