CN112955467A - 与cd38结合的重链抗体 - Google Patents

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Abstract

公开了结合化合物，诸如与CD38结合的人重链抗体(例如，UniAbsTM)，以及制备此类结合化合物的方法，包含此类结合化合物的组合物，包括药物组合物，及其各种用途。

Description

与CD38结合的重链抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年10月26日提交的美国临时专利申请序列号62/751,520的提交日期的优先权益，所述申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明涉及结合化合物，诸如与CD38结合的人重链抗体(例如，UniAbsTM)。本发明的方面涉及抗CD38重链抗体，靶向CD38上的非重叠表位的抗CD38重链抗体的组合(包括协同组合)，对CD38上的一种以上的非重叠表位具有结合特异性的多特异性抗CD38重链抗体，以及制备此类结合化合物的方法，包含此类结合化合物的组合物(包括药物组合物)，及其各种用途。
背景技术
CD38胞外酶
CD38胞外酶是一种膜蛋白，其催化位点位于细胞外隔室内的膜外侧。这种细胞表面蛋白有利于许多功能，并存在于多种细胞中，诸如免疫细胞、内皮细胞和神经元组织细胞。
CD38，也称为ADP-核糖基环化酶/环状ADP-核糖水解酶1，是一种具有胞外酶活性的单程II型跨膜蛋白。使用NAD(P)作为底物，它催化若干种产物的形成：环状ADP-核糖(cADPR)；ADP-核糖(ADPR)；烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)；烟酸(NA)；ADP-核糖-2’-磷酸(ADPRP)(参见例如，H.C.Lee,Mol.Med.,2006,12:317-323)。CD38还可以使用烟酰胺单核苷酸(NMN)作为底物并将其转化为烟酰胺和R5P(Liu等人,“Covalent and noncovalentintermediates of an NAD utilizing enzyme,human CD38.”Chem Biol 15(10):1068-78。
CD38主要在免疫细胞上表达，所述免疫细胞包括浆细胞、活化的效应T细胞、抗原呈递细胞、肺平滑肌细胞、多发性骨髓瘤(MM)细胞、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病细胞、T细胞淋巴瘤细胞、乳腺癌细胞、骨髓来源的抑制细胞、B调节细胞和T调节细胞。免疫细胞上的CD38与由内皮细胞和其他细胞谱系表达的CD31/PECAM-1相互作用。这种相互作用促进白细胞增殖、迁移、T细胞活化和单核细胞衍生的DC成熟。
与CD38结合的抗体还描述于，例如，Deckert等人,Clin.Cancer Res.,2014,20(17):4574-83以及美国专利号8,153,765；8,263,746；8,362,211；8,926,969；9,187,565；9,193,799；9,249,226；和9,676,869中。
达雷木单抗(Daratumumab)是一种对人CD38特异性的抗体，已于2015年获准用于人类治疗多发性骨髓瘤(综述于Shallis等人,Cancer Immunol.Immunother.2017,66(6):697-703中)。另一种针对CD38的抗体伊莎妥昔单抗(Isatuximab)(SAR650984)正处于治疗多发性骨髓瘤的临床试验阶段。(参见例如，Deckert等人,Clin Cencer Res,2014,20(17):4574-83；Martin等人,Blood,2015,126:509；Martin等人,Blood,2017,129:3294-3303)。这些抗体诱导有效的补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和肿瘤细胞的间接凋亡。伊莎妥昔单抗还阻断CD38的环化酶和水解酶的酶活性，并诱导肿瘤细胞的直接凋亡。
抗体对蛋白质进行变构调节的实例是人生长激素、整联蛋白和β-半乳糖苷酶(L.P.Roguin和L.A.Retegui,2003,Scand.J.Immunol.58(4):387-394)。这些实施例表明通过靶向不同表位的单一抗体对配体-受体相互作用的调节。靶向单个分子上的两个表位的双特异性抗体的一个实例是针对c-MET或肝细胞生长因子受体(HGFR)的(DaSilva,J.,摘要34:A MET x MET bispecific antibody that induces receptor degradation potentlyinhibits the growth of MET-addicted tumor xenografts.AACR年度会议2017；2017年4月1-5日；Washington,DC)。
重链抗体
在常规IgG抗体中，重链和轻链的缔合部分归因于轻链恒定区与重链的CH1恒定结构域之间的疏水相互作用。重链框架2(FR2)和框架4(FR4)区域中还有其他残基，它们也有助于重链与轻链之间的这种疏水相互作用。
然而，已知的是，骆驼科动物(胼足亚目，包括骆驼、单峰骆驼和美洲驼)的血清含有仅由成对的H链组成的主要抗体类型(仅重链抗体、重链抗体或UniAbsTM)。骆驼科(Camelidae)(单峰骆驼(Camelus dromedarius)、双峰骆驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanaco)、羊驼(Lama alpaca)和小羊驼(Lama vicugna))的UniAbsTM具有由单个可变结构域(VHH)、一个铰链区和两个恒定结构域(CH2和CH3)组成的独特结构，所述恒定结构域与经典抗体的CH2和CH3结构域高度同源。这些UniAbsTM缺少恒定区(CH1)的第一结构域，其存在于基因组中，但在mRNA加工过程中被剪除。CH1结构域的缺失解释了UniAbsTM中轻链的缺失，因为此结构域是轻链的恒定结构域的锚定位置。此类UniAbsTM天然演化以通过来自常规抗体或其片段的三个CDR来赋予抗原结合特异性和高亲和力(Muyldermans,2001；J Biotechnol 74:277-302；Revets等人,2005；Expert Opin BiolTher 5:111-124)。软骨鱼(诸如鲨鱼)也已经演化出一种独特类型的免疫球蛋白，称为IgNAR，它缺少轻多肽链，并且完全由重链组成。IgNAR分子可通过分子工程化进行操纵以产生单个重链多肽的可变结构域(vNAR)(Nuttall等人Eur.J.Biochem.270,3543-3554(2003)；Nuttall等人Function and Bioinformatics 55,187-197(2004)；Dooley等人,Molecular Immunology 40,25-33(2003))。
缺乏轻链的仅重链抗体结合抗原的能力于20世纪60年代确定(Jaton等人(1968)Biochemistry,7,4185-4195)。与轻链物理分离的重链免疫球蛋白相对于四聚体抗体保留了80％的抗原结合活性。Sitia等人(1990)Cell,60,781-790证明，在哺乳动物细胞培养中，从重排的小鼠μ基因中除去CH1结构域导致产生仅重链无轻链的抗体。产生的抗体保留了VH结合特异性和效应子功能。
可通过免疫作用产生针对多种抗原的具有高特异性和亲和力的重链抗体(vander Linden,R.H.,等人Biochim.Biophys.Acta.1431,37-46(1999))，并且VHH部分可容易地在酵母中克隆和表达(Frenken,L.G.J.,等人J.Biotechnol.78,11-21(2000))。它们的表达水平、溶解度和稳定性显著高于经典的F(ab)或Fv片段(Ghahroudi,M.A.等人FEBSLett.414,521-526(1997))。
其中λ轻(L)链基因座和/或λ和κL链基因座已被功能性沉默的小鼠，和由此类小鼠产生的抗体描述于美国专利号7,541,513和8,367,888中。在小鼠和大鼠中重组产生仅重链抗体报道于例如，WO2006008548；美国申请公布号20100122358；Nguyen等人,2003,Immunology；109(1),93-101；Brüggemann等人,Crit.Rev.Immunol.；2006,26(5):377-90；以及Zou等人,2007,J Exp Med；204(13):3271-3283。通过锌指核酸酶的胚胎显微注射产生基因敲除的大鼠描述于Geurts等人,2009,Science,325(5939):433中。可溶性仅重链抗体和包含产生此类抗体的异源重链基因座的转基因啮齿动物描述于美国专利号8,883,150和9,365,655中。包含单结构域抗体作为结合(靶向)结构域的CAR-T结构描述于例如Iri-Sofla等人,2011,Experimental Cell Research 317:2630-2641以及Jamnani等人,2014,Biochim Biophys Acta,1840:378-386.0中
发明内容
本发明的方面包括双特异性结合化合物，其包含对胞外酶上的第一表位具有结合亲和力的第一多肽和对胞外酶上的第二非重叠表位具有结合亲和力的第二多肽。在一些实施方案中，第一多肽包含对第一表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域。在一些实施方案中，第二多肽包含对第二表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域。在一些实施方案中，第一和第二多肽各自包含铰链区的至少一部分。在一些实施方案中，第一和第二多肽各自包含至少一个CH结构域。在一些实施方案中，CH结构域包含CH2和/或CH3和/或CH4结构域。在一些实施方案中，CH结构域包含CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，CH结构域包含CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域。在一些实施方案中，CH结构域包含人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，人IgG1 Fc区是沉默的人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，CH结构域包含人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，人IgG4 Fc区是沉默的人IgG4 Fc区。在一些实施方案中，CH结构域不包含CH1结构域。在一些实施方案中，第一和第二多肽的CH2和/或CH3和/或CH4结构域之间存在不对称界面。
在一些实施方案中，第一多肽包含对第一表位具有结合亲和力的重链抗体的第一抗原结合结构域和对第二表位具有结合亲和力的重链抗体的第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，第二多肽包含对第一表位具有结合亲和力的重链抗体的第一抗原结合结构域和对第二表位具有结合亲和力的重链抗体的第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，第一和第二抗原结合结构域通过多肽接头连接。在一些实施方案中，多肽接头由SEQ ID NO:45的序列组成。
在一些实施方案中，双特异性结合化合物包含第一和第二重链多肽，其各自包含对第一表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域；以及第一和第二轻链多肽，其各自包含对第二表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域。在一些实施方案中，第一和第二轻链多肽各自包含CL结构域。
在一些实施方案中，胞外酶是CD38。
本发明的方面包括与CD38结合并且包含抗原结合结构域的重链抗体，所述抗原结合结构域包含：(i)在SEQ ID NO:1-5中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR1序列；和/或(ii)在SEQ ID NO:6-12中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR2序列；和/或(iii)在SEQ ID NO:13-17中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR3序列。在一些实施方案中，CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人框架中。在一些实施方案中，重链抗体还包含重链恒定区序列，但不存在CH1序列。
在一些实施方案中，重链抗体包含与SEQ ID No:18-28中的任一序列具有至少95％序列同一性的可变区序列。在一些实施方案中，重链抗体包含选自由SEQ ID NO:18-28组成的组的可变区序列。在一些实施方案中，重链抗体是单特异性的。在一些实施方案中，重链抗体是多特异性的。在一些实施方案中，重链抗体是双特异性的。在一些实施方案中，重链抗体对同一CD38蛋白上的两个不同表位具有结合亲和力。在一些实施方案中，两个不同的表位是非重叠表位。在一些实施方案中，重链抗体对效应细胞具有结合亲和力。在一些实施方案中，重链抗体对T细胞抗原具有结合亲和力。在一些实施方案中，重链抗体对CD3具有结合亲和力。在一些实施方案中，重链抗体为CAR-T形式。
本发明的方面包括药物组合物，其包含本文所述的结合化合物或重链抗体。
本发明的方面包括治疗性组合，其包含本文所述的结合化合物或重链抗体和与CD38结合的第二抗体。在一些实施方案中，与CD38结合的第二抗体是伊莎妥昔单抗或达雷木单抗。
本发明的方面包括用于治疗以CD38表达为特征的病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的受试者施用如本文所述的结合化合物或重链抗体、药物组合物和/或治疗性组合。在一些实施方案中，所述病症的特征在于CD38的水解酶酶活性。在一些实施方案中，所述病症是结肠炎。在一些实施方案中，所述病症是多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，所述病症是自身免疫性病症。在一些实施方案中，所述病症是类风湿性关节炎(RA)。在一些实施方案中，所述病症是寻常天疱疮(PV)。在一些实施方案中，所述病症是系统性红斑狼疮(SLE)。在一些实施方案中，所述病症是多发性硬化症(MS)、系统性硬化症或纤维化。在一些实施方案中，所述病症是缺血性损伤。在一些实施方案中，缺血性损伤是缺血性脑损伤、缺血性心脏损伤、缺血性胃肠道损伤或缺血性肾损伤。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用与CD38结合的第二抗体。在一些实施方案中，与CD38结合的第二抗体是伊莎妥昔单抗或达雷木单抗。
这些和其他方面将在本公开的其余部分(包括实施例)中进一步解释。
附图说明
图1，图A-E提供了F11家族中抗CD38结合化合物的CDR序列、可变区序列、V基因和J基因信息、CD38水解酶抑制活性百分比和细胞结合MFI数据。
图2，图A-D，提供了F12家族中抗CD38结合化合物的CDR序列、可变区序列、V基因和J基因信息、CD38水解酶抑制活性百分比和细胞结合MFI数据。
图3，图A-B，提供了F13家族中抗CD38结合化合物的CDR序列、可变区序列、V基因和J基因信息、CD38水解酶抑制活性百分比和细胞结合MFI数据。
图4提供了本申请中另外的氨基酸序列的序列信息。
图5提供了本申请中另外的氨基酸序列的序列信息。
图6示出了描绘所述结合化合物的细胞结合数据随浓度变化的图。
图7示出了描绘所述结合化合物基于细胞的水解酶活性随浓度变化的图。
图8示出了描绘二价UniAbsTM对CD38的水解酶活性的酶抑制的图。
图9示出了由UniAbsTM CD38_F13A或CD38_F13B与伊莎妥昔单抗的混合物对CD38的水解酶活性的酶抑制的图。
图10示出了描绘根据本发明的实施方案的用结合化合物诱导的Daudi细胞的直接细胞毒性的图。
图11示出了根据本发明实施方案的两种二价(图C和D)和两种四价(图A和B)UniAbTM形式的示意图。
图12示出了描绘如图11所述的四价UniAbsTM对CHO细胞上表达的人CD38的水解酶活性的酶抑制的图。
图13示出了描绘UniAb与伊莎妥昔单抗的混合物的抑制的图。
图14示出了描绘UniAb的混合物对CD38的水解酶活性的抑制的图。
图15示出了另一个描绘UniAb的混合物对CD38的水解酶活性的抑制的图。
图16示出了描绘如图11所示的根据本发明的实施方案的两种四价双特异性结合化合物的基于细胞的水解酶活性的图。
图17示出了描绘根据本发明实施方案的各种结合化合物的基于细胞的水解酶活性的图。
图18提供了总结根据本发明实施方案的结合化合物的各种活性的表格形式的数据。
图19，图A和B，分别示出了描绘Daudi和Ramos细胞的细胞内NAD+浓度随结合化合物变化的图。
图20，图A-C，描绘了示出来自T细胞增殖测定和IFNγ产生测定的结果的图。
图21示出了描绘根据本发明的实施方案的各种结合化合物的CD38环化酶活性随结合化合物浓度变化的图。
图22示出了描绘三种不同细胞系中在靶细胞结合活性随结合化合物浓度变化的图。
图23示出了描绘四种不同细胞系中脱靶细胞结合活性随结合化合物浓度变化的图。
图24，图A和B，分别示出了描绘Daudi细胞和Ramos细胞系的细胞存活百分率随结合化合物浓度变化的图。图C提供了表格形式的数据。
具体实施方式
除非另外指出，否则本发明的实施将采用在本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在以下文献中充分解释，诸如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第二版(Sambrook等人,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait,编,1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney,编,1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“CurrentProtocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人,编,1987,及定期更新)；“PCR:ThePolymerase Chain Reaction”,(Mullis等人,编,1994)；“A Practical Guide toMolecular Cloning”(Perbal Bernard V.,1988)；“Phage Display:A LaboratoryManual”(Barbas等人,2001)；Harlow,Lane和Harlow,Using Antibodies:A LaboratoryManual:Portable Protocol No.I,Cold Spring Harbor Laboratory(1998)；以及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory；(1988)。
在提供数值范围时，应该理解在所述范围的上下限之间的每个中间值(除非上下文另外清楚地指出，否则所述中间值达到下限单位的十分之一)和任何其他说明的或在所述说明范围中的中间值涵盖在本发明内。这些较小范围的上下限可独立地包括在较小范围中，并且还涵盖在本发明内，除了任何明确超出所述说明范围之外的限值。当所述说明范围包括所述极限中的一个或两个时，排除那些所包括的极限中的一个或两个的范围也包含于本发明中。
除非另外指出，否则本文的抗体残基根据Kabat编号系统进行编号(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。
在以下描述中，提出了许多具体细节，以提供对本发明的更透彻的了解。然而，对于本领域技术人员将显而易见的是，可在没有这些特定细节的一个或多个的情况下实施本发明。在其他情况下，未描述本领域技术人员众所周知的熟知的特征和程序，以便避免使本发明晦涩难懂。
贯穿本公开所引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均以引用的方式整体并入本文。
I.定义
“包含(comprising)”意指在组合物/方法/试剂盒中需要的所列举的要素，但是在权利要求的范围内，可包括其他要素以形成组合物/方法/试剂盒等。
“基本上由…组成(consisting essentially of)”意指将所述的组合物或方法的范围限制为不会实质性地影响本发明的基本和新颖特征的指定材料或步骤。
“由…组成(consisting of)”意指从组合物、方法或试剂盒中排除权利要求书中未指定的任何要素、步骤或成分。
如本文可互换使用的术语“结合化合物”和“结合组合物”是指对一个或多个结合靶具有结合亲和力的分子实体。根据本发明的实施方案的结合化合物可包括但不限于抗体、抗体的抗原结合结构域、抗体的抗原结合片段、抗体样分子、重链抗体(例如UUniAbsTM)、配体、受体等。
术语“抗体”在本文中以最广泛的意义使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、单体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、仅重链抗体、三链抗体、单链Fv(scFv)、纳米抗体等，并且还包括抗体片段，只要它们展现出所需生物学活性(Miller等人(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的或衍生自其他物种。
术语抗体可以提及全长重链、全长轻链、完整免疫球蛋白分子或这些多肽中任一种的免疫活性部分，即包含免疫特异性地结合所感兴趣的靶标的抗原或其部分的抗原结合位点的多肽，此类靶标包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫性抗体的细胞。本文所公开的免疫球蛋白可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类别的免疫球蛋白分子，包括具有改变的Fc部分的工程化子类别，其提供减小的或增强的效应细胞活性。本发明的抗体的轻链可以是κ轻链(Vκ)或λ轻链(Vλ)。免疫球蛋白可衍生自任何物种。在一方面，免疫球蛋白大部分为人类来源。
本文的抗体残基根据Kabat编号系统和EU编号系统进行编号。当提到可变结构域中的残基(大约是重链的残基1-113)时，通常会使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。当提到免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等人,同上中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文另外说明，否则提起抗体可变结构域中的残基编号意指通过Kabat编号系统进行的残基编号。除非本文另外说明，否则提起抗体恒定结构域中的残基编号意指通过EU编号系统进行的残基编号。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质抗体的群体获得的抗体，即，包含所述群体的各个抗体是相同的，不同之处在于可能以微量存在的可能的天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，是针对单一的抗原位点。另外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。根据本发明的单克隆抗体可通过由Kohler等人(1975)Nature 256:495首次描述的杂交瘤方法制备，并且也可通过重组蛋白产生方法(参见例如，美国专利号4,816,567)制备。
如与抗体结合使用时，术语“可变”是指抗体可变结构域的某些部分在序列上差异非常大，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性在抗体的整个可变结构域中并非均匀分布。在轻链和重链可变结构域中，可变性集中在三个称为高变区(HVR)的区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，它们大多采用β-片层构型，由三个高变区连接，其形成连接β-片层结构的环，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
本文中使用术语“高变区”时是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基，重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基是除了如本文所定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
本文示出了示例性CDR名称，然而本领域技术人员将理解，通常使用多种CDR定义，包括Kabat定义(参见“Zhao等人A germline knowledge based computational approachfor determining antibody complementarity determining regions.”MolImmunol.2010；47:694-700)，其基于序列可变性并且是最常用的。Chothia定义基于结构环区的位置(Chothia等人“Conformations of immunoglobulin hypervariable regions.”Nature.1989；342:877-883)。感兴趣的替代的CDR定义包括但不限于以下所公开的那些：Honegger,“Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains:anautomatic modeling and analysis tool.”J Mol Biol.2001；309:657-670；Ofran等人“Automated identification of complementarity determining regions(CDRs)revealspeculiar characteristics of CDRs and B cell epitopes.”J Immunol.2008；181:6230-6235；Almagro“Identification of differences in the specificity-determining residues of antibodies that recognize antigens of different size:implications for the rational design of antibody repertoires.”J MolRecognit.2004；17:132-143；以及Padlan等人“Identification of specificity-determining residues in antibodies.”Faseb J.1995；9:133-139.，其各自以引用的方式明确并入本文。
术语“仅重链抗体”和“重链抗体”在本文可互换使用，并且在最广泛的意义上是指缺乏常规抗体的轻链的抗体。所述术语具体地包括但不限于包含VH抗原结合结构域以及CH2和CH3恒定结构域但不存在CH1结构域的同型二聚体抗体；此类抗体的功能性(抗原结合)变体、可溶性VH变体、包含一个可变结构域(V-NAR)和五个C样恒定结构域(C-NAR)的同型二聚体的Ig-NAR及其功能性片段；和可溶性单结构域抗体(sUniDabsTM)。在一个实施方案中，仅重链抗体由可变区抗原结合结构域构成，所述可变区抗原结合结构域由框架1、CDR1、框架2、CDR2、框架3、CDR3和框架4构成。在另一个实施方案中，仅重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少部分以及CH2和CH3结构域构成，但不存在CH1结构域。在另一个实施方案中，仅重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少部分和CH2结构域构成。在另一实施方案中，仅重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少部分和CH3结构域构成。其中CH2和/或CH3结构域被截短的仅重链抗体也包括在本文中。在另一实施方案中，重链由抗原结合结构域和至少一个CH(CH1、CH2、CH3或CH4)结构域构成，但不含铰链区。在另一实施方案中，重链由抗原结合结构域、至少一个CH(CH1、CH2、CH3或CH4)结构域和铰链区的至少一部分构成。仅重链抗体可呈二聚体形式，其中两条重链以二硫键键合，或以其他方式彼此共价或非共价连接。仅重链抗体可属于IgG亚类，但属于其他亚类诸如IgM、IgA、IgD和IgE亚类的抗体也包括在本文中。在一个具体实施方案中，重链抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，特别是IgG1或IgG4亚型。在一个实施方案中，重链抗体为IgG4亚型，其中CH结构域中的一个或多个被修饰以改变抗体的效应子功能。在一个实施方案中，重链抗体为IgG1亚型，其中CH结构域中的一个或多个被修饰以改变抗体的效应子功能。本文进一步描述了改变效应子功能的CH结构域的修饰。重链抗体的非限制性实例描述于例如WO2018/039180中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，本文的仅重链抗体用作嵌合抗原受体(CAR)的结合(靶向)结构域。所述定义具体地包括由人免疫球蛋白转基因大鼠(UniRatTM)产生的人仅重链抗体，称为UniAbsTM。UniAbsTM的可变区(VH)被称为UniDabsTM，是可与Fc区或血清白蛋白连接用于开发具有多特异性、增强的效力和延长的半衰期的新型治疗剂的通用构件。由于同型二聚体UniAbsTM缺少轻链，并因此缺少VL结构域，因此抗原被一个单结构域识别，即被重链抗体(VH)的重链的可变结构域(抗原结合结构域)识别。
如本文所用，“完整抗体链”是包含全长可变区和全长恒定区(Fc)的链。完整“常规”抗体包含完整的轻链和完整的重链，以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、铰链、CH2和CH3(针对分泌的IgG)的抗体。其他同种型(诸如IgM或IgA)可具有不同的CH结构域。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一种或多种“效应子功能”，其是指可归因于抗体Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用和细胞表面受体的下调。恒定区变体包括那些改变效应子谱、与Fc受体的结合等的变体。
根据其重链的Fc(恒定结构域)的氨基酸序列，可将抗体和各种抗原结合蛋白以不同类别提供。有五种主要类别的重链Fc区：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的若干种可被进一步分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别的抗体的Fc恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。Ig形式包括铰链修饰或无铰链形式(Roux等人(1998)J.Immunol.161:4083-4090；Lund等人(2000)Eur.J.Biochem.267:7246-7256；US 2005/0048572；US2004/0229310)。基于其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链均可指定为两种类型(称为κ和λ)中的一种。根据本发明的实施方案的抗体可以包含κ轻链序列或λ轻链序列。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。效应子功能的非限制性实例包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；ADCP；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调等。此类效应子功能一般要求Fc区与受体(例如，FcγRI；FcγRIIA；FcγRIIB1；FcγRIIB2；FcγRIIIA；FcγRIIIB受体以及低亲和力FcRn受体)相互作用；并且可使用本领域已知的各种测定法进行评估。“死亡”或“沉默”的Fc是已突变以保留关于例如延长血清半衰期的活性，但不活化高亲和力Fc受体或对Fc受体的亲和力降低的Fc。
“天然序列Fc区”包含与天然存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括，例如，天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区，以及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰(优选一个或多个氨基酸取代)而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。优选地，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中具有约一个至约十个氨基酸取代，并且优选约一个至约五个氨基酸取代。本文中的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，并且最优选与其具有至少约90％同源性，更优选与其具有至少约95％同源性。
变体Fc序列可在CH2区中包含三个氨基酸取代，以降低FcγRI在EU索引位置234、235和237处的结合(参见Duncan等人,(1988)Nature 332:563)。在EU索引位置330和331处的补体C1q结合位点中的两个氨基酸取代降低补体固定(参见Tao等人,J.Exp.Med.178:661(1993)以及Canfield和Morrison,J.ExpMed.173:1483(1991))。在位置233-236处的人IgG1或IgG2残基以及在位置327、330和331处的IgG4残基内的取代大大降低ADCC和CDC(参见，例如，Armour KL.等人.,1999Eur J Immunol.29(8):2613-24；以及Shields RL.等人,2001.JBiol Chem.276(9):6591-604)。人IgG1氨基酸序列(UniProtKB No.P01857)在本文中以SEQID NO:43提供。人IgG4氨基酸序列(UniProtKB No.P01861)在本文中以SEQ ID NO:44提供。沉默的IgG1描述于，例如，Boesch,A.W.,等人,“Highly parallel characterization ofIgG Fc binding interactions.”MAbs,2014.6(4):第915-27页中，其公开内容以的引用方式整体并入本文。
其他Fc变体也是可能的，其包括但不限于其中缺失了能够形成二硫键的区域的Fc变体，或者其中某些氨基酸残基在天然Fc的N-末端被消除的Fc变体，或者向其添加甲硫氨酸残基的Fc变体。因此，在一些实施方案中，结合化合物的一个或多个Fc部分可在铰链区包含一个或多个突变以消除二硫键合。在又一实施方案中，可完全去除Fc的铰链区。在再一实施方案中，结合化合物可包含Fc变体。
此外，可通过取代(突变)、缺失或添加氨基酸残基以实现补体结合或Fc受体结合来构建Fc变体以去除或大幅度降低效应子功能。例如但不限于，缺失可发生在补体结合位点，诸如C1q结合位点。国际专利公布号WO 97/34631和WO 96/32478公开了用于制备此类免疫球蛋白Fc片段的序列衍生物的技术。另外，可通过磷酸化、硫酸化、酰化、糖基化、甲基化、法呢基化、乙酰化、酰胺化等修饰Fc结构域。
Fc可以呈具有天然糖链、与天然形式相比增加的糖链或与天然形式相比减少的糖链的形式，或者可以呈糖基化(aglycosylated)或去糖基化的形式。糖链的增加、减少、去除或其他修饰可以通过本领域常见方法，诸如化学方法、酶方法或通过在遗传工程化生产细胞系中表达所述糖链来实现。此类细胞系可包括天然表达糖基化酶的微生物，例如巴斯德毕赤酵母，以及哺乳动物细胞系，例如CHO细胞。另外，微生物或细胞可以被工程化以表达糖基化酶，或者可以使得不能表达糖基化酶(参见例如Hamilton等人,Science,313:1441(2006)；Kanda等人,J.Biotechnology,130:300(2007)；Kitagawa等人,J.Biol.Chem.，269(27):17872(1994)；Ujita-Lee等人,J.Biol.Chem.，264(23):13848(1989)；Imai-Nishiya等人,BMC Biotechnology 7:84(2007)；以及WO07/055916)。作为工程化为具有改变的唾液酸化活性的细胞的一个实例，α-2,6-唾液酸转移酶1基因已工程化到中国仓鼠卵巢细胞和sf9细胞中。由这些工程化细胞表达的抗体因此被外源基因产物唾液酸化。另一种用于获得具有与多种天然分子相比改变量的糖残基的Fc分子的方法包括例如使用凝集素亲和色谱法将所述多种分子分离成糖基化和非糖基化级分(参见例如WO 07/117505)。特定糖基化部分的存在已显示改变免疫球蛋白的功能。例如，将糖链从Fc分子中去除导致与第一补体组分C1的C1q部分的结合亲和力显著减小以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的减小或损失，从而不会在体内诱导不需要的免疫应答。另外的重要修饰包括唾液酸化和岩藻糖基化：唾液酸在IgG中的存在已与抗炎活性相关(参见例如Kaneko等人,Science 313:760(2006))，而从IgG中去除岩藻糖导致ADCC活性增强(参见例如Shoj-Hosaka等人,J.Biochem.,140:777(2006))。
在替代性实施方案中，本发明的结合化合物可以具有效应子功能增强的Fc序列，例如用过增加其与FcγRIIIA的结合能力以及增加ADCC活性。例如，在Fc的Asn-297处附接到N-连接的聚糖的岩藻糖在空间上阻碍Fc与FcγRIIIA的相互作用，并且通过糖基工程化去除岩藻糖可以增加与FcγRIIIA的结合，这转换成与野生型IgG1对照相比高>50倍的ADCC活性。通过IgG1的Fc部分中的氨基酸突变进行的蛋白质工程化已生成增加Fc与FcγRIIIA的结合亲和力的多种变体。值得注意的是，三丙氨酸突变体S298A/E333A/K334A展现出与FcγRIIIA的结合的2倍增加和ADCC功能。S239D/I332E(2X)和S239D/I332E/A330L(3X)变体具有与FcγRIIIA的结合亲和力的显著增加以及ADCC能力的体外和体内增强。由酵母展示识别的其他Fc变体也在小鼠异种移植模型中显示改进的与FcγRIIIA的结合和增强的肿瘤细胞杀伤。参见例如，Liu等人(2014)JBC 289(6):3571-90，其以引用的方式明确并入本文。
术语“含Fc区抗体”是指包含Fc区的抗体。可例如在抗体纯化期间或通过重组工程化编码抗体的核酸来去除Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，根据本发明的具有Fc区的抗体可包括具有或不具有K447的抗体。
“人源化”形式的非人(例如啮齿动物)抗体(包括单链抗体)是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体(包括单链抗体)。参见例如，Jones等人,(1986)Nature321:522-525；Chothia等人(1989)Nature 342:877；Riechmann等人(1992)J.Mol.Biol.224,487-499；Foote和Winter,(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；Presta等人(1993)J.Immunol.151,2623-2632；Werther等人(1996)J.Immunol.Methods157:4986-4995；以及Presta等人(2001)Thromb.Haemost.85:379-389。对于其他细节，参见美国专利号5,225,539；6,548,640；6,982,321；5,585,089；5,693,761；6,407,213；Jones等人(1986)Nature，321:522-525；以及Riechmann等人(1988)Nature 332:323-329。
本发明的方面包括具有多特异性构型的结合化合物，所述构型包括但不限于双特异性、三特异性等。多种方法和蛋白质构型是已知的并且用于双特异性单克隆抗体(BsMAB)、三特异性抗体等。
本发明的方面包括包含单价或二价构型的仅重链可变区的抗体。如本文所用，在提及仅重链可变区结构域时使用的术语“单价构型”意指仅存在一个仅重链可变区结构域，其具有单个结合位点(参见例如，图11，图D，描绘的分子的右侧)。相反，在提及仅重链可变区结构域时使用的术语“二价构型”意指存在两个仅重链可变区结构域(其各自具有单个结合位点)，并且由接头序列连接(参见例如，图11，图B，描绘的分子的任一侧)。接头序列的非限制性实例在本文中进一步讨论，并且包括但不限于具有各种长度的GS接头序列。当仅重链可变区为二价构型时，两个仅重链可变区结构域中的每一个可以对相同抗原或对不同抗原(例如，对相同蛋白质上的不同表位；对两种不同的蛋白质等)具有结合亲和力。然而，除非另外明确指出，否则被表示为“二价构型”的仅重链可变区应理解为含有两个相同的仅重链可变区结构域，其通过接头序列连接，其中两个相同的仅重链可变区结构域中的每一个对相同靶抗原具有结合亲和力。
通过重组融合两种或更多种抗体的可变结构域已开发了用于产生多价人工抗体的多种方法。在一些实施方案中，多肽上的第一和第二抗原结合结构域通过多肽接头连接。这种多肽接头的一个非限制性实例是GS接头，其具有四个甘氨酸残基之后一个丝氨酸残基的氨基酸序列，并且其中所述序列重复n次，其中n为1至约10的整数，诸如2、3、4、5、6、7、8或9。此类接头的非限制性实例包括GGGGS(SEQ ID NO:29)(n＝1)和GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:45)(n＝2)。其他合适的接头也可以使用并且描述于，例如，Chen等人,Adv Drug DelivRev.2013年10月15日；65(10):1357-69中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
本文使用的术语“双特异性三链抗体样分子”或“TCA”是指包含三个多肽亚基、基本上由三个多肽亚基组成或由三个多肽亚基组成的抗体样分子，其中两个包含单克隆抗体的一条重链和一条轻链或此类抗体链的功能性抗原结合片段(包含抗原结合区和至少一个CH结构域)，基本上由其组成或由其组成。此重链/轻链对对于第一抗原具有结合特异性。在一些实施方案中，TCA在人轻链框架中包含轻链多肽亚基，其包含SEQ ID NO:49的CDR1序列、SEQ ID NO:50的CDR2序列和SEQ ID NO:51的CDR3序列。在一些实施方案中，人轻链框架是人κ(Vκ)或人λ(Vλ)框架。在一些实施方案中，TCA包含轻链多肽亚基，其包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:52的序列具有至少约80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，TCA包含轻链多肽亚基，其包含SEQ ID NO:52的序列。在一些实施方案中，TCA包含轻链多肽亚基，其包含轻链恒定区(CL)。在一些实施方案中，轻链恒定区是人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区。在一些实施方案中，TCA包含轻链多肽亚基，其包含全长轻链，所述全长轻链包含与SEQ ID NO:48的序列具有至少约80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，TCA包含轻链多肽亚基，其包含SEQ IDNO:48的序列。第三多肽亚基包含仅重链抗体，基本上由仅重链抗体组成或由仅重链抗体组成，所述仅重链抗体包括包含CH2和/或CH3和/或CH4结构域但不存在CH1结构域的Fc部分和结合第二抗原的表位或第一抗原的不同表位的抗原结合结构域，其中此类结合结构域衍生自抗体重链或轻链的可变区或与其具有序列同一性。这种可变区的部分可以由VH和/或VL基因区段、D和JH基因区段或JL基因区段编码。可变区可以由重排的VHDJH、VLDJH、VHJL或VLJL基因区段编码。
TCA结合化合物利用“仅重链抗体”或“重链抗体”或“重链多肽”，其如本文所用意指包含重链恒定区CH2和/或CH3和/或CH4但不含CH1结构域的单链抗体。在一个实施方案中，重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少部分以及CH2和CH3结构域构成。在另一个实施方案中，重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少部分以及CH2结构域构成。在另一实施方案中，重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少部分和CH3结构域构成。其中CH2和/或CH3结构域被截短的重链抗体也包括在本文中。在另一实施方案中，重链由抗原结合结构域和至少一个CH(CH1、CH2、CH3或CH4)结构域构成，但不含铰链区。仅重链抗体可呈二聚体形式，其中两条重链以二硫键键合或以其他方式彼此共价或非共价连接，并且仅重链抗体可任选地包括在两个或更多个CH结构域之间的不对称界面以促进多肽链之间的正确配对。重链抗体可属于IgG亚类，但属于其他亚类诸如IgM、IgA、IgD和IgE亚类的抗体也包括在本文中。在一个具体实施方案中，重链抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，特别是IgG1亚型或IgG4亚型。TCA结合化合物的非限制性实例描述于例如WO2017/223111和WO2018/052503中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
重链抗体构成由骆驼科动物(例如骆驼和美洲驼)产生的IgG抗体的约四分之一(Hamers-Casterman C.,等人Nature.363,446-448(1993))。这些抗体由两条重链形成但不含轻链。因此，可变抗原结合部分称为VHH结构域并且代表最小的天然存在的完整抗原结合位点，仅具有约120个氨基酸的长度(Desmyter,A.,等人J.Biol.Chem.276,26285-26290(2001))。可通过免疫作用产生针对多种抗原的具有高特异性和亲和力的重链抗体(vander Linden,R.H.,等人Biochim.Biophys.Acta.1431,37-46(1999))，并且VHH部分可容易地在酵母中克隆和表达(Frenken,L.G.J.,等人J.Biotechnol.78,11-21(2000))。它们的表达水平、溶解度和稳定性显著高于经典的F(ab)或Fv片段(Ghahroudi,M.A.等人FEBSLett.414,521-526(1997))。还已表明，鲨鱼在其称VNAR的抗体中具有单个VH样结构域。(Nuttall等人Eur.J.Biochem.270,3543-3554(2003)；Nuttall等人Function andBioinformatics 55,187-197(2004)；Dooley等人,Molecular Immunology40,25-33(2003))。
如文本所用，术语“界面”用于指包含第一重链恒定区中与第二重链恒定区中一个或多个“接触”氨基酸残基(或其他非氨基酸基团)相互作用的那些“接触”氨基酸残基(或其他非氨基酸基团，例如像碳水化合物基团)的区域。
术语“不对称界面”用于指在两个抗体链诸如第一重链恒定区与第二重链恒定区之间和/或重链恒定区与它的匹配轻链之间形成的界面(如在上文中定义)，其中第一链和第二链中的接触残基在设计上不同，其包含互补接触残基。不对称界面可以通过例如钮/孔相互作用和/或盐桥耦合(电荷交换)和/或本领域中已知的其他技术来创建。
“腔”或“孔”是指至少一个从第二多肽的界面凹入并且因此容纳第一多肽的相邻界面上的相应突起(“钮”)的氨基酸侧链。腔(孔)可存在于原始界面中或可经过化学方式引入(例如通过改变编码界面残基的核酸)。通常，改变编码第二多肽的界面的核酸以编码腔。为了实现这一点，将编码第二多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个“输入”氨基酸残基的DNA替换，所述“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积。应理解，可存在一个以上的原始残基和对应的输入残基。经过替换的原始残基的数目的上限是第二多肽的界面中残基的总数。形成腔的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选地选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)和甘氨酸(G)。最优选的氨基酸残基是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸，最优选丙氨酸。在一个优选实施方案中，形成突起的原始残基具有大的侧链体积，诸如酪氨酸(Y)、精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。不对称界面详细描述于，例如，Xu等人,“Production of bispecific antibodiesin‘knobs-into-holes’using a cell-free expression system”,MAbs.2015,7(1):231-42，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，术语“CD38”是指具有胞外酶活性的单程II型跨膜蛋白，也称为ADP-核糖基环化酶/环状ADP-核糖水解酶1。术语“CD38”包括任何人或非人动物物种的CD38蛋白，并且具体地包括人CD38以及非人哺乳动物的CD38。
如本文所用，术语“人CD38”包括人CD38(UniProt P28907)的任何变体、同工型和物种同源物，无论其来源或制备方式如何。因此，“人CD38”包括细胞天然表达的人CD38和在用人CD38基因转染的细胞上表达的CD38。
术语“抗CD38仅重链抗体”、“CD38仅重链抗体”、“抗CD38重链抗体”和“CD38重链抗体”在本文中可互换使用，是指如上文所定义的与CD38免疫特异性结合的仅重链抗体，包括如上文所定义的人CD38。所述定义包括但不限于由转基因动物产生的人重链抗体，所述转基因动物诸如表达人免疫球蛋白的转基因大鼠或转基因小鼠，包括产生人抗CD38 UniAbTM抗体的UniRatsTM，如上文所定义。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并引入空位(如果需要的话)以实现最大序列同一性百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可通过本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％值。
“分离的”结合化合物(诸如分离的抗体)是已经鉴定并且从其天然环境的组分中分离和/或恢复的结合化合物。其天然环境的污染物组分是会干扰结合化合物的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，结合化合物将被纯化(1)至如通过Lowry方法所测定的大于结合化合物的95重量％，并且最优选大于结合化合物的99重量％，(2)至通过使用旋转杯测序仪足以获得至少15个N末端或内部氨基酸序列的残基的程度，或(3)至在还原或非还原条件下使用考马斯亮蓝或优选银染通过SDS-PAGE达到均一。分离的结合化合物包括重组细胞内的原位结合化合物，因为不会存在结合化合物的天然环境的至少一种组分。然而，分离的结合化合物通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
根据本发明的实施方案的结合化合物包括多特异性结合化合物。多特异性结合化合物具有一种以上的结合特异性。术语“多特异性”具体地包括“双特异性”和“三特异性”，以及更高阶的独立特异性结合亲和力诸如更高阶的多表位特异性，以及四价结合化合物和结合化合物的抗原结合片段(例如，抗体和抗体片段)。“多特异性”结合化合物具体包括包含不同结合实体的组合的抗体以及包含一个以上的相同结合实体的抗体。术语“多特异性抗体”、“多特异性仅重链抗体”、“多特异性重链抗体”和“多特异性UniAbTM”在本文中以最广泛的意义使用，并且覆盖具有一种以上的结合特异性的所有抗体。本发明的多特异性重链抗CD38抗体具体地包括与CD38蛋白(诸如人CD38)上的两个或更多个非重叠表位免疫特异性结合的抗体。
“表位”是抗原分子表面上与结合化合物的抗原结合区结合的位点。一般而言，抗原具有若干或许多不同的表位，并与许多不同的结合化合物(例如，许多不同的抗体)体反应。所述术语具体地包括线性表位和构象表位。
“表位作图”是鉴定抗体在其靶抗原上的结合位点或表位的过程。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中氨基酸的连续序列形成。构象表位由蛋白质序列中不连续的氨基酸形成，但是在蛋白质折叠成其三维结构时会结合在一起。
“多表位特异性”是指与相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位特异性结合的能力。如上所述，本发明具体地包括具有多表位特异性的抗CD38重链抗体，即与CD38蛋白(诸如人CD38)上的两个或更多个非重叠表位结合的抗CD38重链抗体。抗原的术语“非重叠表位”或“非竞争性表位”在本文中被定义为意指被一对抗原特异性抗体中的一个成员识别但不被另一个成员识别的表位。识别非重叠表位的抗体对或多特异性抗体上靶向相同抗原的抗原结合区不竞争与所述抗原的结合，并且能够同时结合所述抗原。
当结合化合物和参考抗体识别相同表位或空间重叠的表位时，结合化合物与参考结合化合物(例如，参考抗体)结合“基本上相同的表位”。用于确定两个表位是结合相同表位还是空间重叠的表位的最广泛使用和最快速的方法是竞争测定，其可使用标记的抗原或标记的抗体以多种不同的形式进行配置。通常，将抗原固定在96孔板上，并使用放射性或酶标记测量未标记抗体阻断标记抗体的结合的能力。
如本文所用，关于结合化合物(例如，抗体)和参考结合化合物(例如，参考抗体)的术语“竞争”意指结合化合物导致参考结合化合物与靶抗原的结合降低约15％-100％，如通过标准技术诸如通过本文所述的竞争结合测定所确定的。
如本文所用，术语“竞争组”是指结合相同靶抗原(或表位)并与竞争组的成员竞争结合靶抗原的两种或更多种结合化合物(例如，第一和第二抗体)。同一竞争组的成员彼此竞争结合靶抗原，但不一定具有相同的功能活性。
如本文所用，术语“价”是指抗体分子或结合化合物中结合位点的具体数量。
“多价”结合化合物具有两个或更多个结合位点。因此，术语“二价”、“三价”和“四价”分别是指存在两个结合位点、三个结合位点和四个结合位点。因此，根据本发明的双特异性抗体是至少二价的，并且可以是三价、四价或其他方式的多价。多种方法和蛋白质构型是已知的，并且用于制备双特异性单克隆抗体(BsMAB)、三特异性抗体等。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”在本文中以最广泛的意义使用，是指工程化受体，其将所需的结合特异性(例如，单克隆抗体或其他配体的抗原结合区)移植到跨膜和细胞内信号传导结构域。通常，所述受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上，以产生嵌合抗原受体(CAR)。(Dai等人,J Natl Cancer Inst,2016；108(7):djv439；以及Jackson等人,Nature Reviews Clinical Oncology,2016；13:370-383.)。
本文使用的术语“人抗体”包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本文中的人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如，由体外随机或定点诱变或者体内体细胞突变引入的突变。术语“人抗体”具体地包括由转基因动物(诸如转基因大鼠或小鼠)产生的具有人重链可变区序列的仅重链抗体，特别是由UniRatsTM产生的UniAbsTM，如上所定义。
“嵌合抗体”或“嵌合免疫球蛋白”意指包含来自至少两种不同Ig基因座的氨基酸序列的免疫球蛋白分子，例如，包含由人Ig基因座编码的部分和由大鼠Ig基因座编码的部分的转基因抗体。嵌合抗体包括具有非人Fc区或人工Fc区和人独特型的转基因抗体。此类免疫球蛋白可从已经被工程化以产生此类嵌合抗体的本发明的动物中分离。
如本文所用，术语“效应细胞”是指参与与免疫反应的认知和活化阶段相反的免疫反应的效应期的免疫细胞。一些效应细胞表达指定的Fc受体并执行指定的免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞诸如自然杀伤细胞能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。例如，表达FcR的单核细胞和巨噬细胞参与靶细胞的特异性杀伤，以及将抗原呈递给免疫系统的其他组分，或与呈递抗原的细胞结合。在一些实施方案中，效应细胞可吞噬靶抗原或靶细胞。
“人效应细胞”是表达诸如T细胞受体或FcR的受体并执行效应子功能的白细胞。优选地，所述细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中优选NK细胞。效应细胞可从其天然来源分离，例如从如本文所述的血液或PBMC中分离。
术语“免疫细胞”在本文中以最广泛的意义使用，包括但不限于骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(诸如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、多形核细胞，诸如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。
抗体“效应子功能”是指可归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并随后引起靶细胞的裂解。用于介导ADCC的主要细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页表3中。为了评估感兴趣的分子的ADCC活性，可进行诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的体外ADCC测定。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可在体内(例如在诸如公开于Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)中的动物模型中)评估感兴趣的分子的ADCC活性。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下分子裂解靶标的能力。补体活化通路由补体系统的第一组分(C1q)与和同源抗原复合的分子(例如抗体)的结合所启动。为了评估补体活化，可进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述。
“结合亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)来表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法来测量。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原并倾向于容易解离，而高亲和力抗体一般快速地结合抗原并倾向于保持结合。
如本文所用，“Kd”或“Kd值”是指通过BioLayer干涉测量法使用Octet QK384仪器(Fortebio Inc.,Menlo Park,CA)在动力学模式下确定的解离常数。例如，向抗小鼠Fc传感器中加载小鼠Fc融合抗原，然后将其浸入含抗体的孔中，以测量浓度依赖性的缔合率(kon)。在最后的步骤中测量抗体解离率(koff)，其中将传感器浸入仅包含缓冲液的孔中。Kd是koff/kon的比率。(更多详细信息参见，Concepcion,J,等人,Comb Chem HighThroughput Screen,12(8),791-800,2009)。
本文使用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等一般意指获得所需的药理作用和/或生理作用。所述作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可为预防性的，并且/或者就部分或完全治愈疾病和/或可归因于所述疾病的副作用而言可为治疗性的。如本文所用，“治疗”覆盖哺乳动物中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可易患疾病但尚未被诊断为患有所述疾病的受试者体内发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)减轻疾病，即引起疾病消退。可在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。对其中治疗使患者的不希望临床症状稳定或减少的正在进行的疾病的治疗是特别感兴趣的。此种治疗希望在受影响的组织功能完全失去之前进行。本发明的疗法可在疾病的症状阶段期间施用，并且在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用。
“治疗有效量”意指赋予受试者治疗益处所必需的活性剂的量。例如，“治疗有效量”是诱导、改善或以其他方式引起与疾病相关的病理症状、疾病进展或生理状况的改善或者改善对病症的抵抗力的量。
在本发明的上下文中，术语“B细胞赘生物”或“成熟B细胞赘生物”包括但不限于所有淋巴白血病和淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、前淋巴细胞性白血病、前体B淋巴母细胞性白血病、毛细胞白血病、小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、多发性骨髓瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞赘生物诸如浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、MALT淋巴瘤、淋巴结边缘B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、原发性渗出性淋巴瘤和与艾滋病相关的非霍奇金淋巴瘤。
如本文所用，术语“结肠炎”广泛地是指以结肠内膜的炎症为特征的病症。如本文所用，“结肠炎”包括自身免疫性结肠炎，其可以由以下引起：炎性肠病、溃疡性结肠炎或克罗恩病；治疗诱导的结肠炎，诸如改道性结肠炎、化学性结肠炎、化疗诱导的结肠炎或由使用一种或多种治疗剂(例如，PD-1/PD-L1、CTLA-4、TIGIT、TIM-3、LAG-3和其他免疫检查点抑制剂)的治疗诱导的结肠炎；血管疾病，诸如缺血性结肠炎；传染性结肠炎，诸如由艰难梭菌(Clostridium difficile)、志贺毒素或寄生虫感染(例如，痢疾变形虫(Entamoebahistolytica))引起的传染性结肠炎；未知来源的结肠炎，例如显微镜下结肠炎、淋巴细胞性结肠炎或胶原性结肠炎；或非典型性结肠炎(即不符合临床上公认的结肠炎类型标准的结肠炎)。
如本文所用，术语“缺血性损伤”是指由流向组织的血流减少引起的任何损伤。缺血性损伤包括但不限于缺血性脑损伤、缺血性心脏损伤、缺血性肾脏损伤、缺血性胃肠道(GI)损伤等。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，是指被评估用于治疗和/或被治疗的哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物为人。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患有癌症的个体和/或患有自身免疫性疾病的个体等。受试者可以是人，但也包括其他哺乳动物，特别是可用作人疾病的实验室模型的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。
术语“药物制剂”是指呈允许活性成分的生物学活性有效的形式的制品，并且其不含有对将向其施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。此类制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(媒介物、添加剂)是可合理地施用于受试者哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的那些赋形剂。
如本文所用，术语“协同作用”和“协同的”是指两种或更多种单独组分(例如，两种或更多种重链抗体)的组合，与分开使用两种或更多种单独组分时所获得的结果相比，它们一起在实现特定结果(例如，水解酶活性的降低)方面更有效。例如，两种或更多种阻断水解酶的重链抗体的协同组合在抑制水解酶活性方面比单独的阻断水解酶的重链抗体中的任一个分开使用时更有效。类似地，协同治疗性组合比构成治疗性组合的两种或更多种单一剂的作用更有效。治疗性组合中两种或更多种单一剂之间协同相互作用的确定可以基于由本领域已知的各种测定获得的结果。可以使用Chou和Talalay组合方法以及用CalcuSyn软件的剂量效应分析来分析这些测定的结果，以便获得组合指数“CI”(Chou and Talalay(1984)Adv.Enzyme Regul.22:27-55)。组合疗法可提供“协同作用”并且证明“协同性”，即当一起使用活性成分时实现的作用大于单独使用所述化合物所产生的作用。当活性成分符合以下条件时可达到协同作用：(1)以组合单位剂量制剂形式共同配制并且同时施用或递送；(2)作为单独的制剂交替地递送；或(3)通过一些其他方案。在以交替疗法递送的情况下，当化合物按顺序地施用或递送(例如通过在分开的注射器中的不同注射)时，可以获得协同作用。通常，在交替疗法期间，有效剂量的每种活性成分按顺序(即，按时间顺序)施用。
“无菌”制剂是无菌的，或者不含或基本上不含所有活的微生物及其孢子。“冷冻”制剂是指温度低于0℃的制剂。
“稳定的”制剂是其中的蛋白质在储存时基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。优选地，所述制剂在储存时基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物学活性。一般基于制剂的预期贮藏期限来选择储存期。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的，并且综述于，例如，Peptide and Protein DrugDelivery,247-301.Vincent Lee编,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)以及Jones.A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90)(1993)中。可在选定的温度下在选定的时间段内测量稳定性。可通过多种不同的方式定性和/或定量地评估稳定性，所述方式包括评估聚集体的形成(例如，使用尺寸排阻色谱、通过测量浊度和/或通过目测)；通过使用阳离子交换色谱、成像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较减少的抗体和完整抗体；肽图谱(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗体的生物学活性或抗原结合功能等。不稳定性可能参与以下中的一种或多种：聚集、脱酰胺作用(例如，Asn脱酰胺作用)、氧化作用(例如，Met氧化作用)、异构化作用(例如，Asp异构化作用)、截断/水解/片段化(例如，铰链区片段化)、琥珀酰亚胺的形成、未配对的半胱氨酸、N末端延伸、C末端加工、糖基化差异等。
II.详述
本发明至少部分地基于以下发现：对胞外酶上的一个或多个表位具有结合特异性的结合化合物，诸如重链抗体，可用于裂解肿瘤细胞和/或抑制靶胞外酶的酶活性。本发明还至少部分地基于以下发现：对胞外酶上的至少两个非重叠表位具有结合特异性的结合化合物或其组合(例如，多特异性，例如双特异性结合化合物)协同作用来裂解肿瘤细胞和/或调节(例如，抑制)靶胞外酶的酶活性。因此，本发明的方面涉及结合化合物，包括但不限于对单个靶标(例如，胞外酶上的单个表位)具有结合特异性的单特异性结合化合物以及对至少两个靶标(例如，胞外酶上的第一和第二表位)具有结合特异性的多特异性(例如，双特异性)结合化合物。本发明的方面还涉及本文所述的结合化合物的治疗性组合，以及制备和使用此类结合化合物的方法。
胞外酶
胞外酶是在质膜外部具有催化位点的多种膜蛋白。在白细胞和内皮细胞上发现了许多外切酶，它们在其中起多种生物学作用。除了所有酶共有的细胞外催化活性外，胞外酶是一类不同的分子，其参与多种不同类型的酶反应。不同的胞外酶可以调节白细胞-内皮细胞接触相互作用的每个步骤，以及随后在组织中的细胞迁移。胞外酶包括但不限于CD38、CD10、CD13、CD26、CD39、CD73、CD156b、CD156c、CD157、CD203、VAP1、ART2和MT1-MMP。
胞外酶CD38属于核苷酸代谢酶的家族，除了再循环核苷酸外，其还产生控制细胞稳态和代谢的化合物。CD38的催化活性是各种生理过程所必需的，这些过程包括胰岛素分泌、胰腺腺泡细胞中毒蕈碱Ca2+信号传导、中性粒细胞趋化性、树突状细胞运输、催产素分泌以及饮食诱导肥胖的发展。参见Vaisitti等人,Laeukemia,2015,29:356-368，以及其中引用的参考文献。CD38具有双功能胞外环化酶以及水解酶活性。CD38在多种恶性肿瘤中表达，包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。已表明CD38可以识别CLL的一种特别侵略性的形式，并且被认为是阴性预后标志物，这预示着具有这种CLL的侵略性变体的患者的总存活期较短。参见，Malavasi等人,2011,Blood,118:3470-3478，以及Vaisitti,2015，同上。
CD38在实体瘤中也表达，在PD1难治性非小细胞肺癌患者(SNCLC)的肿瘤细胞上过表达(Chen等人,Cancer Discov,8(9):1156-75)。CD38可能在其他抵抗免疫检查点阻断的实体瘤中起作用，诸如胰腺肿瘤、肾细胞癌、黑色素瘤、结肠直肠癌等。
抗CD38结合化合物
本发明的方面包括对胞外酶具有结合亲和力的结合化合物，诸如CD38。结合化合物可包括但不限于多种抗体样分子，诸如图11中描绘的那些。在一些实施方案中，结合化合物包括对胞外酶上的特定表位具有结合亲和力的抗体的可变结构域。在一些实施方案中，结合化合物包括对特定表位具有结合亲和力的重链抗体的至少一个抗原结合结构域。在某些实施方案中，结合化合物包括两个或更多个抗原结合结构域，其中一个抗原结合结构域对第一表位具有结合亲和力，而一个抗原结合结构域对第二表位具有结合亲和力。在某些实施方案中，表位是非重叠表位。本文所述的结合化合物提供许多益处，其有助于用作临床治疗剂。结合化合物包括具有一定范围的结合亲和力的成员，从而允许选择具有所需结合亲和力的指定序列。
本发明的方面包括与人CD38结合的重链抗体。抗体包含如本文所定义和如图1-3和5所示的一组CDR序列，并以提供的图1-3中所示的SEQ ID NO:18-28的重链可变区(VH)序列为例。抗体提供许多益处，其有助于用作临床治疗剂。抗体包括具有一定范围的结合亲和力的成员，从而允许选择具有所需结合亲和力的指定序列。
合适的结合化合物可选自本文提供的用于开发和治疗或其他用途的结合化合物，包括但不限于用作双特异性结合化合物(例如，如图11所示)、或三特异性抗体、或CAR-T结构的部分。
对候选蛋白质的亲和力的确定可使用本领域已知的方法进行，诸如Biacore测量。本文所述的结合化合物对CD38的亲和力的Kd可为约10-6至约10-11，包括但不限于：约10-6至约10-10；约10-6至约10-9；约10-6至约10-8；约10-8至约10-11；约10-8至约10-10；约10-8至约10-9；约10-9至约10-11；约10-9至约10-10；或这些范围内的任何值。亲和性选择可通过生物学评估来确认，所述生物学评估用于调节例如阻断CD38的生物学活性诸如水解酶活性，包括体外测定、临床前模型和临床试验以及潜在毒性的评估。
本文所述的抗结合化合物不与食蟹猴(Cynomolgus macaque)的CD38蛋白发生交叉反应，但是如果需要，可被工程化以提供与食蟹猴的CD38蛋白或与任何其他动物物种的CD38的交叉反应性。
本文的CD38特异性结合化合物包含抗原结合结构域，其在人VH框架中包含CDR1、CDR2和CDR3序列。CDR序列可分别位于例如所提供的SEQ ID NO:18-28所示的示例性可变区序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸残基26-35；53-59；和98-117周围的区域中。本领域的普通技术人员将理解，如果选择不同的框架序列，则CDR序列可在不同的位置，尽管一般而言序列的顺序将保持相同。
代表性的CDR1、CDR2和CDR3序列在图1-3和5中示出。
在一些实施方案中，本发明的抗CD38重链抗体包含SEQ ID NO:1-5中任一个的CDR1序列。在一个具体的实施方案中，CDR1序列为SEQ ID NO:1。在一个具体的实施方案中，CDR1序列为SEQ ID NO:3。在一个具体的实施方案中，CDR1序列为SEQ ID NO:4。
在一些实施方案中，本发明的抗CD38重链抗体包含SEQ ID NO:6-12中任一个的CDR2序列。在一个具体的实施方案中，CDR2序列为SEQ ID NO:6。在一个具体的实施方案中，CDR2序列为SEQ ID NO:9。在一个具体的实施方案中，CDR2序列为SEQ ID NO:11。
在一些实施方案中，本发明的抗CD38重链抗体包含SEQ ID NO:13-17中任一个的CDR3序列。在一个具体的实施方案中，CDR3序列为SEQ ID NO:13。在一个具体的实施方案中，CDR3序列为SEQ ID NO:16。在一个具体的实施方案中，CDR3序列为SEQ ID NO:17。
在另一实施方案中，本发明的抗CD38重链抗体包含SEQ ID NO:1的CDR1序列；SEQID NO:6的CDR2序列；和SEQ ID NO:13的CDR3序列。在另一实施方案中，本发明的抗CD38重链抗体包含SEQ ID NO:3的CDR1序列；SEQ ID NO:9的CDR2序列；和SEQ ID NO:16的CDR3序列。在另一实施方案中，本发明的抗CD38重链抗体包含SEQ ID NO:4的CDR1序列；SEQ IDNO:11的CDR2序列；和SEQ ID NO:17的CDR3序列。
在另外的实施方案中，本发明的抗CD38重链抗体包含SEQ ID NO:18-28(图1-3)中的任一重链可变区氨基酸序列。
在再一实施方案中，本发明的抗CD38重链抗体包含SEQ ID NO:18的重链可变区序列。在再一实施方案中，本发明的抗CD38重链抗体包含SEQ ID NO:23的重链可变区序列。在再一实施方案中，本发明的抗CD38重链抗体包含SEQ ID NO:27的重链可变区序列。
在一些实施方案中，本发明的抗CD38重链抗体中的CDR序列相对于SEQ ID NO:1-17(图1-3)或SEQ ID NO:49-51(图5)中任一个的CDR1、CDR2和/或CDR3序列或CDR1、CDR2和CDR3序列的集合包含一个或两个氨基酸取代。在一些实施方案中，本文的重链抗CD38抗体将包含与SEQ ID NO18-28(图1-3所示)或SEQ ID NO:46或47(图5所示)中的任一重链可变区序列具有至少约85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的重链可变区序列。
在一些实施方案中，提供了双特异性或多特异性结合化合物，其可以具有本文讨论的任一构型，包括但不限于：双特异性二价重链抗体，其包含两个通过不对称界面彼此缔合的不同多肽亚基；双特异性四价重链抗体，其包含两个相同的多肽亚基，每个亚基都含有第一和第二抗原结合结构域；双特异性四价重链抗体，其包含两个相同的重链多肽亚基和两个相同的轻链多肽亚基；或双特异性三链抗体样分子，其包含第一重链多肽亚基、第一轻链多肽亚基和第二重链多肽亚基。
在一些实施方案中，双特异性抗体可包含至少一个对CD38具有结合特异性的重链可变区和至少一个对除CD38以外的蛋白质具有结合特异性的重链可变区。在一些实施方案中，双特异性抗体可包含对第一抗原具有结合特异性的重链/轻链对，以及来自仅重链抗体的重链，所述仅重链抗体包含Fc部分，所述Fc部分包含CH2和/或CH3和/或CH4结构域，但不含CH1结构域，以及结合第二抗原的表位或第一抗原的不同表位(例如，CD38蛋白上的第二非重叠表位)的抗原结合结构域。在一个具体的实施方案中，双特异性抗体包含对效应细胞上的抗原(例如，T细胞上的CD3蛋白)具有结合特异性的重链/轻链对，以及来自仅重链抗体的重链，所述仅重链抗体包含对CD38具有结合特异性的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，当本发明的蛋白质是双特异性抗体时，所述抗体的一个臂(一个结合部分)对人CD38具有特异性，而另一个臂可对靶细胞、肿瘤相关抗原、靶向抗原(例如，整联蛋白等)、病原体抗原、检查点蛋白等具有特异性。靶细胞具体地包括癌细胞，包括但不限于来自血液肿瘤(例如，B细胞肿瘤)的细胞，如下所讨论。
双特异性结合化合物的各种形式在本发明的范围内，包括但不限于单链多肽、两链多肽、三链多肽、四链多肽及其倍数。本文的双特异性结合化合物具体地包括与主要在免疫细胞上表达的CD38以及CD3结合的T细胞双特异性抗体(抗CD38 x抗CD3抗体)。此类抗体诱导有效T细胞介导的表达CD38的细胞的杀伤。
在一些实施方案中，结合化合物包含第一和第二多肽，即第一和第二多肽亚基，其中每个多肽包含重链抗体的抗原结合结构域。在一些实施方案中，第一和第二多肽的每一个还包含铰链区或铰链区的至少一部分，其可以促进在第一与第二多肽之间形成至少一个二硫键。在一些实施方案中，第一和第二多肽的每一个还包含至少一个重链恒定区(CH)结构域，诸如CH2结构域和/或CH3结构域和/或CH4结构域。在某些实施方案中，CH结构域缺乏CH1结构域。第一和第二多肽的每一个的抗原结合结构域可以掺入本文所述的任一CDR序列和/或可变区序列，以便赋予结合化合物抗原结合能力。这样，在某些实施方案中，结合化合物中的每个多肽可包含对相同表位或对不同表位(例如，CD38蛋白上的第一和第二非重叠表位)具有结合特异性的抗原结合结构域。
在图11的图C中描绘了根据本发明的实施方案的结合化合物的非限制性实例。在所描绘的实施方案中，结合化合物是双特异性二价的重链抗体，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含重链抗体的抗原结合结构域、铰链区的至少一部分、包含CH2和CH3结构域(但缺乏CH1结构域)的CH结构域，所述第二多肽包含重链抗体的抗原结合结构域、铰链区的至少一部分以及包含CH2和CH3结构域(但缺乏CH1结构域)的CH结构域。所描绘的实施方案包括在第一多肽的CH3结构域与第二多肽的CH3结构域之间的不对称界面，以及在连接第一和第二多肽以形成结合化合物的铰链区中的至少一个二硫键。本文还描述了根据本发明的实施方案的不对称界面。
在一些实施方案中，结合化合物包含第一和第二多肽，即第一和第二多肽亚基，其中每个多肽包含两个抗原结合结构域。在一些实施方案中，第一和第二多肽的每一个还包含铰链区或铰链区的至少一部分，其可以促进在第一与第二多肽之间形成至少一个二硫键。在一些实施方案中，第一和第二多肽的每一个还包含至少一个重链恒定区(CH)结构域，诸如CH2结构域和/或CH3结构域和/或CH4结构域。在某些实施方案中，CH结构域缺乏CH1结构域。第一和第二多肽的每一个的抗原结合结构域可以掺入本文所述的任一CDR序列和/或可变区序列，以便赋予结合化合物抗原结合能力。这样，在某些实施方案中，结合化合物中的每个多肽可包含对相同表位或对不同表位(例如，CD38蛋白上的第一和第二非重叠表位)具有结合特异性的两个抗原结合结构域。
在图11的图B中描绘了根据本发明的实施方案的结合化合物的非限制性实例。在所描绘的实施方案中，结合化合物是双特异性四价结合化合物，其包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含两个抗原结合结构域(一个对第一表位具有结合亲和力，而一个对第二非重叠表位具有结合亲和力)、铰链区的至少一部分、包含CH2和CH3结构域(但缺乏CH1结构域)的CH结构域，所述第二多肽包含两个抗原结合结构域(一个对第一表位具有结合亲和力，而一个对第二非重叠表位具有结合亲和力)、铰链区的至少一部分、包含CH2和CH3结构域(但缺乏CH1结构域)的CH结构域。所描绘的实施方案包括在连接第一和第二多肽以形成结合化合物的铰链区中的至少一个二硫键。
在一些实施方案中，每个多肽上的第一和第二抗原结合结构域通过多肽接头连接。可以连接第一和第二抗原结合结构域的多肽接头的一个非限制性实例是GS接头，诸如具有氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:29的G4S接头。其他合适的接头也可以使用并且描述于，例如，Chen等人,Adv Drug Deliv Rev.2013年10月15日；65(10:1357-69中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，结合化合物包含第一和第二重链多肽，即第一和第二重链多肽亚基，以及第一和第二轻链多肽，即第一和第二轻链多肽亚基。在一些实施方案中，重链多肽的每一个包含重链抗体的抗原结合结构域。在一些实施方案中，重链多肽的每一个还包含铰链区或铰链区的至少一部分，其可以促进在第一与第二重链多肽之间形成至少一个二硫键。在一些实施方案中，第一和第二重链多肽的每一个还包含至少一个重链恒定区(CH)结构域，诸如CH2结构域和/或CH3结构域和/或CH4结构域。在某些实施方案中，CH结构域包含CH1结构域。第一和第二重链多肽的每一个的抗原结合结构域可以掺入本文所述的任一CDR序列和/或可变区序列，以便赋予结合化合物抗原结合能力。
在一些实施方案中，轻链多肽的每一个包含重链抗体的抗原结合结构域。在一些实施方案中，轻链多肽的每一个还包含轻链恒定区(CL)结构域。第一和第二重轻链多肽的每一个的抗原结合结构域可以掺入本文所述的任一CDR序列和/或可变区序列，以便赋予结合化合物抗原结合能力。另外，重链多肽上的CH1结构域和轻链多肽上的CL结构域可各自包含至少一个半胱氨酸残基，其有助于形成将每个轻链多肽连接至重链多肽中的一个的二硫键。
在图11的图A中描绘了根据本发明的实施方案的结合化合物的非限制性实例。在所描绘的实施方案中，结合化合物是双特异性四价结合化合物，其包含两个重链多肽和两个轻链多肽。每个重链多肽包含对第一表位具有结合特异性的抗原结合结构域、CH1结构域、铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域。所描绘的实施方案包括在连接第一和第二重链多肽的铰链区中的至少一个二硫键。每个轻链多肽包含对第二表位具有结合特异性的抗原结合结构域和CL结构域。所描绘的实施方案包括在CL与CH1结构域之间的至少一个二硫键，其将第一和第二重链多肽连接至第一和第二轻链多肽以形成结合化合物。
在图11的图D中描绘了根据本发明的实施方案的结合化合物的非限制性实例。在所描绘的实施方案中，结合化合物是双特异性二价结合化合物，其包含三个多肽(两个重链多肽和一个轻链多肽)。第一重链多肽亚基和轻链多肽亚基一起形成对第一表位具有结合亲和力的结合单元，并且第二重链多肽包含对第二表位具有结合亲和力的仅重链可变区。在一些实施方案中，第二多肽亚基包含单个仅重链可变区结构域(单价构型)。在一些实施方案中，第二多肽亚基包含通过接头连接的两个仅重链可变区(二价构型)。第一重链多肽包含对第一表位具有结合特异性的抗原结合结构域、CH1结构域、铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域。所描绘的实施方案包括在连接第一和第二重链多肽的铰链区中的至少一个二硫键。轻链多肽包含对第一表位具有结合特异性的抗原结合结构域和CL结构域。
在一个优选的实施方案中，对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性结合化合物包含对第一CD38表位具有结合亲和力的第一多肽，其包含重链抗体的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列，铰链区的至少一部分，以及包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域；以及对第二CD38表位具有结合亲和力的第二多肽，其包含重链抗体的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列，铰链区的至少一部分，以及包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域；以及第一多肽的CH3结构域与第二多肽的CH3结构域之间的不对称界面。在某些优选的实施方案中，这种结合化合物包含作为人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1Fc区或沉默的人IgG4 Fc区的Fc区。
在另一个优选的实施方案中，对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性结合化合物包含两个相同的多肽，每个多肽包含对第一CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的第一抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；对第二CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的第二抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ IDNO:16的CDR3序列；铰链区的至少一部分；以及包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域。在某些优选的实施方案中，这种结合化合物包含作为人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区或沉默的人IgG4 Fc区的Fc区。
在另一个优选的实施方案中，对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性结合化合物包含第一和第二重链多肽，每个重链多肽包含对第一CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ IDNO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列，铰链区的至少一部分，以及包含CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域的CH结构域；以及第一和第二轻链多肽，每个轻链多肽包含对第二CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列，以及CL结构域。在某些优选的实施方案中，这种结合化合物包含作为人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区或沉默的人IgG4 Fc区的Fc区。
在另一个优选的实施方案中，对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性结合化合物，所述双特异性结合化合物包含：包含重链可变区的第一多肽亚基，所述重链可变区在人重链框架中包含SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；包含轻链可变区的第二多肽亚基，所述轻链可变区在人轻链框架中包含SEQ ID NO:49的CDR1序列、SEQ ID NO:50的CDR2序列和SEQ ID NO:51的CDR3序列；其中所述第一多肽亚基和第二多肽亚基一起对第一CD38表位具有结合亲和力；以及包含重链抗体的抗原结合结构域的第三多肽亚基，所述抗原结合结构域在人重链框架中包含SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列，呈单价和二价构型；其中所述第三多肽亚基对第二非重叠CD38表位具有结合亲和力。在一些优选的实施方案中，第一多肽亚基还包含CH1结构域、铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域。在一些优选的实施方案中，第三多肽亚基还包含恒定区序列，所述恒定区序列包含铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域，但不存在CH1结构域。在一些优选的实施方案中，人轻链框架是人κ轻链框架或人λ轻链框架。在一些优选的实施方案中，第二多肽亚基还包含CL结构域。在一些优选的实施方案中，双特异性结合化合物包含选自由以下组成的组的Fc区：人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区和沉默的人IgG4 Fc区。在一些优选的实施方案中，双特异性结合化合物包含在第一多肽亚基的CH3结构域与第三多肽亚基的CH3结构域之间的不对称界面。
本发明的方面包括本文所述的两种或更多种结合化合物的组合(例如，治疗性组合)。在一些实施方案中，治疗性组合包括对CD38上的第一表位具有结合特异性的第一结合化合物，以及对CD38上的第二个非重叠表位具有结合特异性的第二结合化合物。根据本发明的实施方案的治疗性组合可包括两种或更多种本文所述的结合化合物，或者可包括一种或多种本文所述的结合化合物，以及一种或多种本领域已知的结合化合物，例如一种或多种与CD38结合的第二抗体。
例如，伊莎妥昔单抗(SAR650984)是临床试验中治疗多发性骨髓瘤的抗体，诱导有效的补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和肿瘤细胞的间接凋亡。伊莎妥昔单抗还阻断CD38的环化酶和水解酶的酶活性，并诱导肿瘤细胞的直接凋亡。本发明的方面包括治疗性组合，其包括一种或多种本文所述的结合化合物以及伊莎妥昔单抗。伊莎妥昔单抗的重链可变区序列在SEQ ID NO:30中提供，并且伊莎妥昔单抗的轻链可变区序列在SEQ ID NO:31中提供。伊莎妥昔单抗描述于，例如，Deckert,J.,等人,“SAR650984,a novel humanized CD38-targeting antibody,demonstrates potent antitumor activity in models of multiple myeloma andother CD38+hematologic malignancies.”Clin Cancer Res,2014.20(17):第4574-83页中，其公开内容以的引用方式整体并入本文。
达雷木单抗是一种对人CD38特异性的抗体，已于2015年获准用于人类治疗多发性骨髓瘤(综述于Shallis等人,Cancer Immunol.Immunother.,2017,66(6):697-703)中。本发明的方面包括治疗性组合，其包括一种或多种本文所述的结合化合物以及达雷木单抗。
在一个优选的实施方案中，治疗性组合包括与CD38结合的重链抗体，所述重链抗体包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:4的CDR1序列、SEQ ID NO:11的CDR2序列和SEQ ID NO:17的CDR3序列；以及与CD38结合的作为第二抗体的伊莎妥昔单抗。
抗胞外酶结合化合物的制备
本发明的结合化合物可通过本领域已知的方法来制备。在一个优选的实施方案中，本文的结合化合物由转基因动物产生，所述转基因动物包括转基因小鼠和大鼠，优选大鼠，其中内源性免疫球蛋白基因被敲除或失能。在一个优选的实施方案中，本文的结合化合物在UniRatTM中产生。UniRatTM沉默了其内源性免疫球蛋白基因，并使用人免疫球蛋白重链易位基因座来表达多种天然优化的完整人重链抗体库。虽然可使用多种技术将大鼠的内源性免疫球蛋白基因座敲除或沉默，但在UniRatTM中，锌指(内切)核酸酶(ZNF)技术用于灭活内源性大鼠重链J基因座、轻链Cκ基因座和轻链Cλ基因座。用于微注射到卵母细胞中的ZNF构建体可产生IgH和IgL敲除(KO)品系。有关细节参见，例如，Geurts等人,2009,Science325:433。Ig重链敲除大鼠的特征已由Menoret等人,2010,Eur.J.Immunol.40:2932-2941报道。ZNF技术的优势在于，通过至多几kb的缺失使基因或基因座沉默的非同源末端连接也可提供同源整合的靶位点(Cui等人,2011,Nat Biotechnol 29:64-67)。UniRatTM中产生的人重链抗体称为UniAbsTM，并且可结合不能被常规抗体攻击的表位。它们的高特异性、亲和力和小尺寸使其非常适合单特异性和多特异性应用。
除UniAbsTM外，本文具体包括的是缺少骆驼科动物VHH框架和突变及其功能性VH区的仅重链抗体。此类仅重链抗体可例如在包含完全人仅重链基因基因座的转基因大鼠或小鼠中产生，例如，如WO2006/008548中所述，但也可使用其他转基因哺乳动物，诸如兔、豚鼠、大鼠，优选大鼠和小鼠。仅重链抗体，包括其VHH或VH功能片段，也可通过重组DNA技术通过在合适的真核或原核宿主中表达编码核酸来产生，所述宿主包括例如哺乳动物细胞(例如CHO细胞)、大肠杆菌或酵母菌。
仅重链抗体的结构域组合了抗体和小分子药物的优势：可以是单价或多价；毒性低并且制造具有成本效益。由于它们的小尺寸，这些结构域易于施用，包括口服或局部施用，其特征在于高度稳定性，包括胃肠道稳定性；并且可根据所需用途或适应症调整其半衰期。另外，重链抗体的VH和VHH结构域可以成本有效的方式制造。
在一个具体的实施方案中，本发明的重链抗体，包括UniAbsTM，在FR4区的第一位置(根据Kabat编号系统的氨基酸位置101)的天然氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代，这能够破坏包含所述位置处的天然氨基酸残基或与其相关的表面暴露的疏水性补丁。此类疏水性补丁正常被掩埋在与抗体轻链恒定区的界面中，但是在重链抗体中变得表面暴露，并且至少部分地负责重链抗体的不希望的聚集和轻链缔合。取代的氨基酸残基优选为带电荷的，并且更优选为带正电荷的，诸如赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)或组氨酸(His，H)，优选为精氨酸(R)。在一个优选的实施方案中，来源于转基因动物的仅重链抗体在位置101处含有Trp至Arg突变。所得的重链抗体优选在没有聚集的生理条件下具有高抗原结合亲和力和溶解度。
在某些实施方案中，结合化合物是与CD38结合的抗胞外酶重链抗体。在一个优选的实施方案中，抗CD38重链抗体是UniAbsTM。
作为本发明的一部分，鉴定了具有来自UniRatTM动物的独特CDR3序列的人IgG重链抗CD38抗体家族(UniAbTM)，其在ELISA(重组CD38胞外结构域)蛋白和细胞结合测定中结合人CD38。包含三个序列家族(F11、F12和F13，参见图1-3和5)的重链可变区(VH)序列对人CD38蛋白结合和/或与CD38+的细胞结合都是阳性的，并且对于与不表达CD38的细胞的结合都是阴性的。基于抑制CD38的水解酶功能的能力，来自这三个序列家族的UniAbsTM分为两个广泛的协同组。
一个协同组包括F11和F12序列家族。F11/F12协同组的成员不与伊莎妥昔单抗协同抑制CD38的水解酶功能，但彼此之间却表现出协同的水解酶抑制。例如，当组合时，F11A和F12A达到的水解酶抑制水平大于F11A或F12A各自可达到的水平(图7)。
另一个协同组包括F13序列家族和伊莎妥昔单抗。仅伊莎妥昔单抗引起CD38水解酶活性的部分抑制(约55％抑制，图9)。仅F13A也引起CD38水解酶活性的部分抑制。当组合时，伊莎妥昔单抗和F13A通过实现水解酶活性的降低大于任一种抗体各自实现的降低，证明了对水解酶活性的协同抑制。F13协同组的一些成员不会自行阻断CD38水解酶活性，但是与伊莎妥昔单抗协同作用。例如，F13B自身不阻断CD38水解酶活性，但是与伊莎妥昔单抗协同抑制CD38水解酶活性高达75％(例如，图9)。
值得注意的是，F12A本身抑制CD38水解酶活性(约50％抑制，图13-14)，但不与伊莎妥昔单抗协同。F12A和伊莎妥昔单抗的组合产生的抑制比仅伊莎妥昔单抗的抑制稍低(仅伊莎妥昔单抗的抑制为约65％，相对伊莎妥昔单抗和F12A的组合的抑制为约58％)。
两个或更多个UniAbsTM的组合与不同的非重叠表位的结合诱导有效的CDC活性和直接凋亡，而同一UniAbsTM单独施用时不会诱导这些效应子功能中的任一个。当单独施用时，与单独的UniAbsTM相比，UniAbsTM的组合也更有效地抑制酶活性。换句话说，在某些实施方案中，本发明的两种不同结合化合物的组合(例如，治疗性组合)导致一种或多种协同结果(例如，协同CDC活性、协同酶促调节活性，例如协同水解酶阻断活性)。
根据本发明的实施方案的结合化合物与CD38阳性伯基特氏淋巴瘤细胞系Ramos结合，并且与食蟹猕猴的CD38蛋白交叉反应。另外，如果需要，它们可以被工程化以提供与任何动物物种的CD38蛋白的交叉反应性。
根据本发明的实施方案的结合化合物对CD38的亲和力的Kd可为约10-6至约10-11，包括但不限于：约10-6至约10-10；约10-6至约10-9；约10-6至约10-8；约10-8至约10-11；约10-8至约10-10；约10-8至约10-9；约10-9至约10-11；约10-9至约10-10；或这些范围内的任何值。亲和性选择可通过生物学评估来确认，所述生物学评估用于调节例如阻断CD38的生物学活性，包括体外测定、临床前模型和临床试验以及潜在毒性的评估。
可通过竞争结合测定，诸如酶联免疫测定(ELISA测定)或流式细胞术竞争结合测定，来鉴定与胞外酶靶标上的两个或更多个非重叠表位结合的根据本发明的实施方案的结合化合物，包括但不限于抗CD38重链抗体，例如UniAbsTM。例如，可使用已知与靶抗原结合的抗体与感兴趣的抗体之间的竞争。通过使用这种方法，可将一组抗体分为与参考抗体竞争的抗体以及不与参考抗体竞争的抗体。将非竞争性抗体鉴定为与不和参考抗体结合的表位重叠的不同表位结合。通常，一种抗体被固定，抗原被结合，并且在ELISA测定中测试第二种标记的(例如，生物素化的)抗体结合被捕获的抗原的能力。也可通过使用表面等离子体共振(SPR)平台(包括ProteOn XPR36(BioRad,Inc)、Biacore 2000和Biacore T200(GEHealthcare Life Sciences)和MX96 SPR成像仪(Ibis technologies B.V.))以及在生物层干涉测量平台(诸如Octet Red384和Octet HTX(ForteBio,Pall Inc))上进行此操作。更多详细信息参见下文的实施例部分。
通常，如通过标准技术，诸如通过本文所述的竞争结合测定所确定的，如果结合化合物引起参考抗体与靶抗原的结合降低约15％-100％，则所述结合化合物(例如，抗体)与参考结合化合物(例如，参考抗体)竞争。在各个实施方案中，相对抑制为至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高。
药物组合物
本发明的另一个方面提供药物组合物，其包含本发明的一种或多种结合化合物与合适的药学上可接受的载剂的混合物。如本文所用的药学上可接受的载剂例如但不限于佐剂、固体载剂、水、缓冲剂、或在本领域中用于支持治疗性组分的其他载剂、或其组合。
在一个实施方案中，药物组合物包含两种或更多种重链抗体，其与胞外酶例如像CD38、CD73或CD39上的非重叠表位结合。在一个优选实施方案中，药物组合物包含两种或更多种重链抗体的协同组合，其与胞外酶例如像CD38、CD73或CD39上的非重叠表位结合。
在另一个实施方案中，药物组合物包含多特异性(包括双特异性)重链抗体，其对胞外酶例如像CD38、CD73或CD39上的两个或更多个非重叠表位具有结合特异性。在一个优选的实施方案中，药物组合物包含多特异性(包括双特异性)重链抗体，其对胞外酶例如CD38、CD73或CD39上的两个或更多个非重叠表位具有结合特异性，相对于与相同表位结合的任一单特异性抗体，具有协同改善的特性。
通过将具有所需纯度的蛋白质与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合来制备根据本发明使用的结合化合物的药物组合物以进行储存(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))，诸如呈冻干制剂或所需溶液的形式。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠离子；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
用于肠胃外施用的药物组合物优选是无菌的并且是基本上等渗的，并且在良好生产规范(GMP)条件下制造。药物组合物可以单位剂型(即单次施用的剂量)提供。制剂取决于选择的施用途径。本文的结合化合物可通过静脉内注射或输注或皮下施用。对于注射施用，可将本文的结合化合物配制成水性溶液，优选配制成生理上相容的缓冲剂，以减少注射部位的不适感。溶液可含有如上所讨论的载剂、赋形剂或稳定剂。可替代地，结合化合物可呈冻干形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如，无菌无热原水)构建。
抗CD38抗体制剂公开于例如美国专利号9,034,324中。相似的制剂可用于本发明的重链抗体，包括UniAbsTM。皮下抗体制剂描述于例如US 20160355591和US 20160166689中。
制品
本发明的方面包括含有本发明的一种或多种结合化合物的制品或“试剂盒”，其可用于治疗本文所述的疾病和病症。在一个实施方案中，试剂盒包括包含如本文所述的抗CD38结合化合物的容器。所述试剂盒还可包括容器上的或与容器相关联的标签或包装插页。术语“包装插页”用于指惯常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书，其含有关于涉及此类治疗性产品的使用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包装等。所述容器可由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。所述容器可容纳对于治疗病状有效的一种或多种如本文所述的抗CD38结合化合物或其制剂，例如，两种或更多种抗CD38结合化合物的组合制剂，并且可具有无菌进入口(例如，容器可以是具有可用皮下注射针刺破的塞子的静脉输液袋或小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗所选病状，诸如癌症或免疫学病症。可替代地或另外地，所述制品还可包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可包含从商业和用户立场出发所期望的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
试剂盒还可包括一种或多种结合化合物以及其组合制剂(如果存在的话)的施用说明。例如，如果试剂盒包括包含第一抗CD38结合化合物的第一药物组合物和包含第二抗CD38结合化合物的第二药物组合物，则试剂盒还可包括向有需要的患者同时、顺序或单独施用所述第一和第二药物组合物的说明。在试剂盒包括两种或更多种组合物的情况下，所述试剂盒可包括用于容纳单独的组合物的容器，诸如分开的瓶子或分开的箔片包装，然而，所述单独的组合物也可容纳在单个的不分开的容器内。试剂盒可包括用于施用单独的组分或用于施用其组合制剂的说明书。
使用方法
本文所述的与胞外酶上的非重叠表位结合的结合化合物，此类结合化合物的组合(包括协同组合)，对胞外酶上的两个或多个非重叠表位具有结合特异性的多特异性抗体，以及包含此类抗体和抗体组合的药物组合物，可用于靶向以靶胞外酶的表达为特征的疾病和病状。
在各个实施方案中，胞外酶选自CD10、CD13、CD26、CD38、CD39、CD73、CD156b、CD156c、CD157、CD203、VAP1、ART2和MT1-MMP。
在一个具体的实施方案中，胞外酶是CD38、CD73和/或CD39。
CD38是一种46-kDa II型跨膜糖蛋白，具有短的20-aa N末端胞质尾和长的256-aa细胞外结构域(Malavasi等人,Immunol.Today,1994,15:95-97)。由于其在许多血液系统恶性肿瘤中的高水平表达，包括多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(综述于Shallis等人,Cancer Immunol.Immunother.,2017,66(6):697-703中)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(Vaisitti等人,Leukemia,2015,29”356-368)、B细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL)、dT细胞ALL，CD38是用于治疗血液系统恶性肿瘤的基于抗体的治疗剂的有希望的靶标。CD38还被认为是年龄相关的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)下降的关键因素，并且有人提出CD38抑制与NAD前体组合可用作代谢功能障碍和年龄相关的疾病的潜在疗法(参见例如，Camacho-Pereira等人,Cell Metabolism2016,23:1127-1139)。CD38还被描述为参与气道高反应性的发展，这是哮喘的标志性特征，并已被建议作为治疗此类病状的靶标。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)代谢在许多炎性病症中起关键作用，包括代谢性疾病和阿尔茨海默病。NAD是生物能过程中的主要辅酶，并且其被若干种酶(包括CD38)的裂解对于许多生物学过程(诸如细胞代谢、炎症反应和细胞死亡)至关重要(Chini等人,TrendsPharmacol Sci,39(4):424-36。
NAD裂解酶CD38促进动物模型中的肠道炎症。CD38是一种多功能胞外酶，其参与NAD+的降解和细胞活化代谢物的产生，诸如二磷酸腺苷核糖(ADPR)和环状ADPR(cADPR)的产生。CD38主要在造血细胞诸如T细胞、B细胞和巨噬细胞上表达。活化和分化后，免疫细胞上调CD38的表达。根据动物研究，似乎T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的免疫反应均受CD38调节。CD38的高水平表达及其相关的胞外酶功能似乎促进了炎性疾病的发展。相反，CD38缺乏症以及随之而来的NAD浓度增加，减少了细胞向发炎部位的募集并减少了促炎细胞因子的产生(Schneider等人,PLos One,10(5):e0126007(2015)；Gerner等人,Gut,06September2017,doi:10.1136/gutjnl-2017-314241；Garcia-Rodriguez等人,Sci Rep,8(1):3357(2018))。在自身免疫模型中，CD38-/-小鼠表现出改善的疾病进展，在胶原诱导的关节炎模型中关节炎症更少，并且在葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎模型中肠道炎症更少(Garcia-Rodriguez等人,Sci Rep,8(1):3357(2018))。所有这些组合的结果支持结肠炎症通过活化CD38导致细胞内NAD水平降低的假说。随后的NAD下降会降低NAD依赖性脱乙酰化酶(sirtuins)的活性，已知所述酶具有抗炎和组织保护作用。
已经表明针对CD38的单克隆抗体在多发性骨髓瘤(MM)的治疗中是高度有效的，但是它们不适合于IBD的治疗。目前，有四种单克隆抗体处于治疗CD38+恶性肿瘤的临床试验中。最先进的药物是达雷木单抗(Janssen Biotech)，其于2015年被FDA批准用于人类使用来治疗MM。MM临床试验中的所有三种抗CD38单克隆抗体均表现出相似的有利安全性和有效性(van de Donk,等人,Blood 2017,blood-2017-06-740944；doi:https://doi.org/10.1182/blood-2017-06-740944)。一种单克隆抗体(TAK-079)处于临床试验中，用于治疗自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎。除浆细胞外，抗CD38单克隆抗体还消耗脾脏和血液中的其他CD38+细胞，包括所有NK细胞以及约50％的单核细胞、T细胞和B细胞。用抗CD38单克隆抗体治疗后，MM患者中的关键调节免疫细胞(诸如Treg细胞和髓样衍生抑制细胞(MDSC))被消耗，并且观察到效应T细胞的扩增(Krejcik,等人,Blood,128(3):384-94(2016))。很有可能，抗肿瘤效应T细胞的扩增有助于抗CD38 mAb在MM中的有效性。但是，在自身免疫性疾病中去除重要的调节免疫细胞可能导致疾病加重。
抑制CD38的酶功能可能是治疗炎性病症的一种安全且有效的方法。已经开发了若干种小分子抑制剂，包括一种具有强效的CD38的抑制剂(Kd-5nM，Haffner等人2015)(Haffner等人,J Med.Chem,58(8):3548-71(2015))。这种化合物在注射后6小时会升高小鼠组织中的NAD水平，这表明对CD38的抑制导致小鼠中的细胞内NAD更高。然而，CD38也在脑中表达并在行为方面起作用，因此此类分子具有显著的毒性风险。与小分子化合物相反，抗体不能穿越血脑屏障，并且与小分子相比，通常具有更优越的靶标特异性，并因此应具有显著更好的安全性。炎性疾病包括多发性硬化症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病等。
根据细胞溶解作用选择临床试验中的抗体，并且这些抗体很难抑制CD38的生物学功能，但是这些功能的调节还可能与癌症疗法有关。Chatterjee等人和Chen等人的最新论文证实CD38-NAD+轴在肺癌和黑色素瘤的临床前模型中很重要。这些研究表明，CD38负调控的高水平NAD+保留了效应T细胞(Teff)功能性。
本文所述的结合化合物，包括仅重链抗CD38抗体、抗体组合、多特异性抗体和本文的药物组合物，可用于靶向以CD38表达或过表达为特征的疾病和病状，包括但不限于上文列出病状和疾病。
一方面，本文的CD38结合化合物和药物组合物可用于治疗以CD38表达为特征的血液系统恶性肿瘤，包括多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL)和T细胞ALL。本发明的CD38结合化合物和药物组合物也可用于治疗哮喘和其他以气道高反应性为特征的病状，以及以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)下降为特征的年龄相关的代谢功能障碍。本发明的CD38结合化合物和药物组合物也可用于治疗结肠炎。
MM是一种B细胞恶性肿瘤，其特征在于异常浆细胞在骨髓腔室中的单克隆扩增和积累。当前对于MM的疗法通常会导致缓解，但是几乎所有患者最终都会复发并死亡。有大量证据表明，在异基因造血干细胞移植的背景下，免疫介导的骨髓瘤细胞被消除；但是，这种方法的毒性很高，并且治愈的患者很少。尽管一些单克隆抗体在临床前研究和早期临床试验中已表现出治疗MM的希望，但尚未最终证明任何单克隆抗体疗法对MM的一致临床疗效。因此，非常需要新的疗法，包括MM的免疫疗法(参见例如，Shallis等人，同上)。
本文的CD38结合化合物和药物组合物还可用于治疗自身免疫性疾病，包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、寻常天疱疮(PV)、系统性红斑狼疮(SLE)、系统性硬化症(系统性硬皮病、弥漫性硬皮病)、纤维化和多发性硬化症(MS)。本文的CD38结合化合物和药物组合物还可用于治疗缺血性损伤，包括但不限于缺血性脑损伤、缺血性心脏损伤、缺血性GI损伤和缺血性肾损伤(例如，急性肾缺血性损伤)。
CD73已被描述为可产生胞外腺苷的胞外酶，其通过限制腺苷受体信号传导的抗肿瘤T细胞免疫来促进肿瘤生长。CD73在某些癌症中表达，诸如乳腺癌、结肠癌和前列腺癌。在鼠肿瘤模型中，靶向CD73的小分子抑制剂或单克隆抗体的结果表明，靶向CD73疗法(包括免疫治疗)有可能以单一疗法或与其他抗癌剂组合来控制以CD73表达为特征的肿瘤生长。
CD39和CD73已被广泛认为是通过产生腺苷产生免疫抑制微环境的关键。在许多上皮和血液系统恶性肿瘤中已经报道了CD39的上调，并且已表明其在慢性淋巴细胞性白血病中的表达与不良预后相关(Pulte等人,2011,Clin Lymphoma Myeloma Leuk.2011；11:367-372；Bastid等人,2013,Oncogene,32:1743-1751；Bastid等人,2015,Cancer ImmunolRes.,3:254-265)。CD39在调节T细胞(Treg)上也是高度表达的，并且需要其抑制功能，如通过CD39无效小鼠中Treg抑制活性减弱所证明的(Deaglio等人,2007,J Exp Med.,204:1257-1265)。有人提出CD39可能通过增强其对Treg、肿瘤相关基质或恶性上皮细胞的酶活性来帮助推动肿瘤发生，从而导致腺苷介导的抗肿瘤T细胞和自然杀伤(NK)细胞的免疫抑制以及通过化疗中和ATP诱导的细胞死亡(Bastid等人,2013和2015，同上；Feng等人,2011,Neoplasia,13:206-216)。有人提出调节免疫抑制性CD39/CD73-腺苷途径是一种有前途的癌症疗法的免疫治疗策略(Sitkovsky等人,2014,Cancer Immunol Res.2:598-605)。还参见Hayes等人,Am J Trans Res,2015,7(6):1181-1188。
对于回顾CD73和CD39胞外核苷酸酶在T细胞分化中的作用，参见例如，Bono等人,FEBS Letters,2015,589:3454-3460。
本发明的组合物用于治疗疾病的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是其他动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但是也可治疗非人哺乳动物，例如伴侣动物诸如狗、猫、马等，实验室哺乳动物诸如兔、小鼠、大鼠等。可调整治疗剂量以优化安全性和疗效。
剂量水平可由普通技术临床医生很容易地确定，并且可根据需要进行修改，例如，根据受试者对治疗的反应的需要进行修改。可与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量根据所治疗的宿主和特定施用模式而变化。剂量单位形式一般含有约1mg至约500mg之间的活性成分。
在一些实施方案中，剂的治疗剂量可在约0.0001至100mg/kg宿主体重、以及更通常0.01至5mg/kg宿主体重的范围内。例如，剂量可为1mg/kg体重或10mg/kg体重，或者在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。本发明的治疗实体通常在多种场合下施用。单个剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者的治疗实体的血液水平所指示。可替代地，本发明的治疗实体可作为持续释放制剂施用，在这种情况下，需要较少的施用频率。剂量和频率根据多肽在患者中的半衰期而变化。
通常，组合物可以可注射的液体溶液或悬浮液制备；也可制备注射前适于液体媒介物的溶液或悬浮液的固体形式。本文的药物组合物适用于直接或在固体(例如，冻干的)组合物重构后进行静脉内或皮下施用。也可将制品乳化或密封在脂质体或微粒(诸如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物)中以增强佐剂的效果，如上所讨论。Langer,Science 249:1527,1990和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119,1997。本发明的剂可以储库注射或植入制品的形式施用，其可以允许活性成分持续释放或脉冲释放的方式配制。药物组合物一般被配制为无菌的、基本上等渗的并且完全符合美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)的所有良好生产规范(GMP)规定。
可通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定本文所述的结合化合物的毒性，例如，通过确定LD50(致死50％群体的剂量)或LD100(致死100％群体的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于人的无毒性的剂量范围。本文所述的结合化合物的剂量优选在循环浓度的范围内，其包括有效剂量且几乎没有或没有毒性。剂量可根据所采用的剂型和所利用的施用途径在此范围内变化。确切的制剂、施用途径和剂量可由各个医生根据患者的病状来选择。
用于施用的组合物通常将包含溶解在药学上可接受的载剂(优选水性载剂)中的本发明的结合化合物。可使用多种水性载剂，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且一般不含不希望的物质。这些组合物可通过常规的熟知的灭菌技术进行灭菌。组合物可含有模拟生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。活性剂在这些制剂中的浓度可广泛地变化，并且将根据所选的特定施用方式和患者的需求主要基于流体体积、粘度、体重等进行选择(例如，Remington's Pharmaceutical Science(第15版,1980)以及Goodman和Gillman,The Pharmacological Basis of Therapeutics(Hardman等人,编,1996))。
包含本发明的活性剂及其制剂和使用说明书的制品或“试剂盒”(如上所述)也在本发明的范围内。试剂盒还可包括至少一种另外的试剂，例如化学治疗药物等。试剂盒通常包括标签，其指示试剂盒的内容物的预期用途。术语“标签”包括任何书写或记录的材料，其在试剂盒上或与试剂盒一起提供或以其他方式随附试剂盒。
现已充分描述了本发明，对于本领域的普通技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下可进行各种改变和修改。
材料和方法
使用以下材料和方法进行下文所述的实施例。
CD38细胞结合
使用稳定表达人CD38的Ramos细胞系(ATCC)或CHO细胞，通过流式细胞仪(GuavaeasyCyte 8HT,EMD Millipore)评估与CD38阳性细胞的结合。简而言之，将100,000个靶细胞用系列稀释的纯化UniAbsTM在4℃下染色30分钟。孵育后，将细胞用流式细胞仪缓冲液(1XPBS，1％BSA，0.1％NaN3)洗涤两次，并用与R-藻红蛋白(PE)缀合的山羊FF(ab’)2抗人IgG(Southern Biotech，目录号2042-09)染色，以检测细胞结合的抗体。在4℃下孵育20分钟后，将细胞用流式细胞仪缓冲液洗涤两次，然后通过流式细胞仪测量平均荧光强度(MFI)。
抗体诱导的直接凋亡
使用CD38阳性Ramos细胞(ATCC)分析了通过抗体诱导的直接凋亡引起的细胞毒性。总之，将45,000个靶细胞用2μg/mL的纯化UniAbsTM处理48小时(37℃，8％CO2)。孵育后，将细胞用膜联蛋白V结合缓冲液(BioLegend，目录号422201)洗涤两次，并用膜联蛋白V和7-AAD(BioLegend，目录号640945和420404)染色。然后通过流式细胞仪(Guava easyCyte8HT,EMD Millipore)分析样品，并将活细胞的百分比确定为对于膜联蛋白V和7AAD阴性的群体。
CD38水解酶活性测定
为了测量对CD38水解酶活性的抑制，将重组人CD38蛋白(Sino Biological)或表达人CD38的CHO细胞(125,000个细胞/孔)与每种纯化的抗CD38 UniAbTM在水解酶活性缓冲液(40mM Tris，250mM蔗糖，25μg/mL BSA，pH 7.5)中在室温下一起孵育15分钟。孵育后，加入ε-NAD+(BioLog目录号N010)至终浓度150μM。使用Spectramax i3x酶标仪(MolecularDevices)在1小时(ex 300nm/em 410nm)时测量荧光产物的产生。通过将来自UniAbTM处理的孔的信号与在用同种型对照抗体处理CD38蛋白时观察到的总酶活性百分比(max)进行比较来评估水解酶抑制。
实施例
实施例1：基因组装、表达和测序
选择编码在淋巴结细胞中高度表达的仅重链抗体的cDNA进行基因组装，并将其克隆至表达载体内。随后，这些重链序列作为UniAbTM仅重链抗体(CH1缺失，无轻链)在HEK细胞中表达。
图1、2、3和5分别示出了抗CD38 UniAbTM家族CD38_F11、CD38_F12和CD38_F13的重链可变结构域氨基酸序列。这些图示出了测试的UniAbTM的克隆ID，在与对照UniAbTM相对的相应的与CD38结合的UniAbsTM的存在下重组CD38的水解酶酶活性的抑制百分比，以及与Ramos细胞结合的平均荧光强度(MFI)。在图1、2、3和5中还提供了序列(CDR序列、可变区序列(氨基酸和核苷酸))以及分别F11、F12和F13家族的与CD38结合的重链抗体的VH和VJ基因用法。在图4中提供了另外的序列。
实施例2：抗CD38 UniAb的细胞结合
图1-2提供了用于与CD38_F11和CD38_F12家族成员的Ramos细胞结合的细胞结合数据。图6示出了不同浓度的抗CD38 UniAbTM CD38_F11和CD38_F12抗体与稳定转染了人CD38的CHO细胞的结合。
实施例3：CD38结合重链抗体在阻断CD38水解酶活性中的协同作用
如图7所示，代表两个独特的重链CDR3序列家族的CD38_F11和CD38_F12的UniAbsTM在单独施用时部分抑制CD38的水解酶活性，但是当以等摩尔浓度混合(即，组合)时，则更强烈地抑制CD38水解酶活性。
图8示出了二价UniAbsTM对CD38的水解酶活性的酶抑制。两种抗CD38 UniAbsTM(CD38_F11A+CD38_F12A)的混合物作为二价重链抗体在抑制细胞上的水解酶活性方面同等有效，所述二价重链抗体中一个臂具有CD38_F11A的VH，而另一个臂具有CD38_F12A的VH(CD38_F11A_F12A)。具有IgG1 Fc尾或IgG4 Fc尾的双互补位UniAbsTM(CD38_F11A_F12A)均抑制细胞上的水解酶活性。这些UniAbsTM及其VH结构域与CD38上的两个非重叠表位结合。
图9示出了由UniAbsTM CD38_F13A或CD38_F13B与伊莎妥昔单抗的混合物对CD38的水解酶活性的酶抑制。单独的伊莎妥昔单抗会部分抑制CD38水解酶的活性，但是伊莎妥昔单抗与CD38_F13A或CD38_F13B的组合更强烈地抑制酶活性，这证明具有协同作用。
图10示出了Daudi细胞的直接细胞毒性。UniAbTM CD38_F11A与等摩尔量的CD38_F12A混合，并且表明不诱导Daudi细胞的凋亡。包含CD38_F11A和CD38_F12A的VH的双互补位二价抗体也不会杀伤Daudi细胞。伊莎妥昔单抗用作阳性对照，并示出可有效杀伤Daudi细胞。
图11示出了根据本发明实施方案的两种二价(图C和D)和两种四价(图A和B)UniAbTM形式的示意图。这些示意性表示是非限制性的。
图12示出了如图11所述的四价UniAbsTM对CHO细胞上表达的人CD38的水解酶活性的酶抑制(图B代表本实施例中的形式)。总体设计首先是最远端VH的ID，然后是接头甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(GGGGS(SEQ ID NO:29))，并且接下来是Fc尾附近的VH的ID。四价UniAbsTM表示为人IgG1、沉默的人IgG4和沉默的人IgG1。所有四价抗体完全抑制CD38的水解酶活性，并且比330204(也称为CD38F12A)和309157(也称为CD38F11A)的两个UniAb的混合物更有效力。VH(Fc的近端或远端)的取向和Fc同种型表现出相似的效力。
图13示出了UniAb与伊莎妥昔单抗的混合物的抑制。UniAb和伊莎妥昔单抗以单独的400nM和每种抗体200nM的混合物形式进行测试。伊莎妥昔单抗部分抑制CD38的水解酶活性(60％)。UniAb也是水解酶活性的部分阻断剂。这些部分阻断剂的混合物与伊莎妥昔单抗本身相比不能更有效地抑制CD38的水解酶活性。
图14示出了UniAb的混合物对CD38的水解酶活性的抑制。UniAb CD38_F12A以单独的400nM进行测试，并且以每种抗体200nM与其他UniAb混合。CD38_F12A部分抑制CD38的水解酶活性(约50％)。CD38的其他部分抑制剂未能表现出与CD38_F12A协同作用以抑制CD38的水解酶活性。例如，CD38_F13A在与伊莎妥昔单抗组合时表现出协同作用，但是在与CD38_F12A组合施用时不增强抑制。
图15示出了UniAb的混合物对CD38的水解酶活性的抑制。UniAb CD38_F11A以单独的400nM进行测试，并且以每种抗体200nM与其他UniAb混合。CD38_F11A部分抑制CD38的水解酶活性(约58％)。CD38的其他部分抑制剂未能表现出与CD38_F11A协同作用以抑制CD38的水解酶活性。例如，CD38_F13A在与伊莎妥昔单抗一起施用时表现出协同作用，但是在与CD38_F11A组合时不增强抑制。
图16示出了如图11所述的四价UniAbsTM对CHO细胞上表达的人CD38的水解酶活性的酶抑制(图B代表CD38F12A_2GS_CD38F11A的形式，并且图A代表CD38F12A_IH/CD38F11A_IgK的形式)。总体设计首先是最远端VH的抗原结合结构域(ID)，然后是接头甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(GGGGS(SEQ ID NO:29))，并且接下来是Fc区附近的VH的抗原结合结构域(ID)。四价UniAbsTM表示为人IgG4 Fc区。所有四价抗体完全抑制CD38的水解酶活性，并且具有相当的效力(图B形式的IC50＝4.5nM，图A形式的IC50＝8.6nM)。
实施例4：水解酶抑制性UniAb在DSS结肠炎模型中的功效
流程描述：在饮用水中给予C57BL/6小鼠或人CD38敲入小鼠DSS(0.5％-5％)。低剂量(0.5％-3％)导致慢性结肠炎的发展，而高剂量(2％-5％)导致急性结肠炎的发展。在结肠炎之后，测量体重、隐血和肠道炎症的其他标志物(Chassaing,B.,等人,“Dextransulfate sodium(DSS)-induced colitis in mice.”Curr Protoc Immunol,2014.104:p.Unit 15 25)。体重，肠道组织的组织学检查和结肠长度用于评估治疗的功效(Chassaing,B.,等人,“Dextran sulfate sodium(DSS)-induced colitis in mice”,CurrProtoc Immunol,2014,104:p.Unit 15 25)。通过每周一次、两次或三次静脉内注射所选择的UniAb来治疗小鼠，剂量范围为0.5mg/kg至5mg/kg。
动物和物种的选择：实验是在人CD38敲入模型或野生型小鼠中进行的。使用C57BL/C小鼠品系或其他易感小鼠品系，并且它们是人IBD的公认模型。性别：雄性和磁性；年龄：4周龄至2-3岁体重：可变的。
在C57BL/6小鼠中生成人CD38组成性敲入模型：外显子1加上部分内含子1的编码序列被“人CD38 CDS-polyA”盒替代。为了工程化靶向载体，使用来自C57BL/6文库的BAC克隆RP24-163F10或RP23-58C20作为模板通过PCR产生同源臂。在靶向载体中，Neo盒侧接SDA(自删除锚)位点。DTA用于阴性选择。C57BL/6ES细胞用于基因靶向。产生了与人CD38转基因杂合的基础动物，并且随后将其繁育成纯合子。
样品大小：每组8只或更多的动物在饮用水中接触DSS，并用水解酶阻断抗体或对照抗体处理。重复进行至少2-3次一些测量，以提供可靠的生物学和统计能力。通常，过去的生化和生理研究表明，n＝4-6只动物的样品大小提供了足够的统计功效(即，80％功效)，以使用具有0.05双面显著性水平的两个样品的t检验检测治疗条件之间1.6SD单位的效应量。在DSS动物模型中，抗CD38抗体在统计学上可显著减少炎症并改善临床评分(体重、便血和腹泻的综合评分)。
实施例5：CD38水解酶活性的抑制
评估了根据本发明实施方案的各种结合化合物抑制CD38水解酶活性的能力。在20mM柠檬酸盐，100mM NaCl，pH 6.2中以0.97mg/mL的浓度配制结合化合物。将测试物质在-80℃下冷冻保存直至使用当天。使用稳定转染以表达人CD38的CD38阳性细胞系Daudi、Ramos和CHO细胞评估细胞表面CD38水解酶的活性。在存在或不存在抗体的情况下，将CD38阳性细胞系与亚乙烯基(etheno)-NAD底物一起孵育。随时间推移测量在300nm激发和410nm发射下的荧光。
细胞表面CD38水解酶抑制测定：随时间推移在SpectraMax i3x上分析300nm激发和410发射下的荧光。在饱和之前的时间点，将未处理的RLU除以实验RLU，以确定最大CD38活性的百分比。
结果描绘在图17中，并证明结合化合物强烈抑制稳定转染以表达人CD38的Daudi、Ramos和CHO细胞的细胞表面CD38水解酶活性，其中EC50值分别为3.4nM、5.1nM和9.0nM。最大抑制范围为82％-88％。这些结果证明结合化合物是细胞表面CD38水解酶活性的强抑制剂。
实施例6：同种型和价格式的活性概述
根据本发明的实施方案，评估了各种结合化合物以及参考结合化合物伊莎妥昔单抗和达雷木单抗的酶抑制活性、细胞结合活性和凋亡活性。量化这些活性的相对水平，并以表格形式总结在图18中。
实施例7：NAD+测定
进行研究以评估用主题结合化合物阻断CD38的胞外NMN酶活性是否引起表达CD38的B细胞系Ramos和Daudi中NMN介导的NAD+的增加。所述测定基于酶促循环反应，其中NAD+被还原为NADH。NAD+与比色探针反应生成有色产物。颜色的强度与样品中的NAD+和NADH成比例。通过在碱性溶液中加热选择性地破坏氧化形式，而还原形式在酸性溶液中不稳定。
在20mM柠檬酸盐，100mM NaCl，pH 6.2中以0.97mg/mL的浓度配制结合化合物。将测试物质在-80℃下冷冻保存直至使用当天。
结果描绘在图19中，并且证明与不存在NMN的情况相比，在Daudi或Ramos细胞中存在NMN的情况下，双特异性二价三链结合化合物明显增加了NAD+水平。结果还证明，在Ramos而非Daudi中的伊莎妥昔单抗的情况下，NAD+增加的细微差别。据推测这是因为伊莎妥昔单抗也是一种CD38酶阻断剂，但它还诱导细胞直接凋亡，Ramos的敏感性不及Daudi。伊莎妥昔单抗在24小时内导致Daudi细胞直接凋亡。
在同种型处理的细胞中，或在没有任何结合化合物的情况下，未观察到NAD+的这种增加，这表明在有或没有NMN的情况下，NAD+的增加作用完全与CD38酶活性的抑制有关。
实施例8：MLR中的T细胞增殖
评估了根据本发明的实施方案的各种结合化合物抑制CD38水解酶活性而不活化混合淋巴细胞反应(MLR)的能力。当MHC错配的免疫细胞相互作用时，会发生MLR，并通过T细胞过度增殖和加剧的细胞因子释放触发免疫反应。这种现象在T细胞接合抗体或通常表现出效应子功能的治疗性性抗体中更为明显。在20mM柠檬酸盐，100mM NaCl，pH 6.2中以0.97mg/mL的浓度配制结合化合物。将测试物质在-80℃下冷冻保存直至使用当天。
进行分析以评估CD4 T细胞增殖和IFNγ产生。结果描绘图20中。图A证明双特异性二价三链结合化合物没有引起CD4 T细胞增殖百分比的增加，而达雷木单抗确实导致了CD4T细胞增殖的增加。图C还示出了多种其他结合化合物的CD4 T细胞增殖百分比。IFNγ产生在图B中示出，并且证明与IgG4同种型对照相比，达雷木单抗引起IFNγ产生的增加，而其他结合化合物对IFNγ产生没有影响。
这项研究的结果表明，达雷木单抗在MLR期间会加剧T细胞增殖和IFNγ产生，而双特异性二价三链结合化合物在MLR期间不会诱导T细胞活化。
实施例9：IgG4二价对环化酶的部分抑制
评估了如图10图D中描绘的双特异性二价三链结合化合物抑制CD38环化酶活性的能力。在20mM柠檬酸盐，100mM NaCl，pH 6.2中以0.97mg/mL的浓度配制结合化合物。将测试物质在-80℃下冷冻保存直至使用当天。使用稳定转染以表达人CD38的CD38阳性细胞系Daudi、Ramos和CHO细胞评估细胞表面CD38环化酶的活性。在存在或不存在结合化合物的情况下，将CD38阳性细胞系与NGD+底物一起孵育。随时间推移测量在300nm激发和410nm发射下的荧光。
细胞表面CD38环化酶抑制测定：随时间推移在SpectraMax i3x上分析300nm激发和410发射下的荧光。在饱和之前的时间点，将未处理的RLU除以实验RLU，以确定最大CD38活性的百分比。
结果描绘在图21中，并证明双特异性二价三链结合化合物部分抑制稳定转染以表达人CD38的Ramos、Daudi和CHO细胞系上的CD38环化酶活性，其中EC50值分别为3.3nM、1.6nM和29.2nM。最大抑制范围为57％至61％。这些结果证明结合化合物是CD38环化酶活性的部分抑制剂。
实施例10：在靶和脱靶细胞结合
评估了如图11图D中描绘的双特异性二价三链结合化合物的在靶和脱靶细胞结合。在20mM柠檬酸盐，100mM NaCl，pH 6.2中以0.97mg/mL的浓度配制结合化合物。将测试物质在-80℃下冷冻保存直至使用当天。使用流式细胞术评估与CD38阳性和CD38阴性细胞系的结合。使用的CD38阳性细胞系是转染以稳定表达CD38的Daudi、Ramos和CHO细胞系。使用的CD38阴性细胞系是293-Freestyle、HL-60、K562和CHO。
细胞结合的流式细胞术分析：将未染色孔的平均MFI设置为背景信号。为了计算每个实验样品相对于背景的倍数，将实验样品MFI除以平均背景MFI。
在靶细胞结合的结果在图22中示出，并证明双特异性二价三链结合化合物与Ramos、CHO HuCD38和Daudi细胞结合，其中EC50值分别为50.25nM、70.2nM和39.67nM。如图23所注明，双特异性二价三链结合化合物不与所测试的CD38阴性细胞系(293-Freestyle、CHO、K562和HL-60)结合。这些结果证明双特异性二价三链结合化合物与CD38特异性结合，而不与脱靶细胞系结合。
实施例11：直接凋亡
评估了如图10图D中描绘的双特异性二价三链结合化合物诱导直接凋亡的能力。在20mM柠檬酸盐，100mM NaCl，pH 6.2中以0.97mg/mL的浓度配制结合化合物。将测试物质在-80℃下冷冻保存直至使用当天。
使用流式细胞术通过膜联蛋白V和7-AAD染色评估直接凋亡的诱导。膜联蛋白V由于其于磷脂酰丝氨酸结合的能力而通常用于检测凋亡细胞，磷脂酰丝氨酸存在于质膜外小叶上时是凋亡的标志物。7-AAD与双链DNA结合，双链DNA被膜受损的濒死或死亡的细胞吸收。在这项研究中使用的CD38阳性细胞系是Daudi和Ramos细胞。
直接凋亡的流式细胞术分析：使用四重门来区分早期凋亡细胞(膜联蛋白V+，7-AAD-)、晚期凋亡细胞(膜联蛋白V+，7-AAD+)和活细胞(膜联蛋白V-，7-AAD-)。将结合化合物的浓度相对于存活百分比在Graphpad Prism 8中作图。将所得的图进行非线性回归拟合以确定EC50。
结果描绘在图24中，并证明双特异性二价三链结合化合物的结合不引起Daudi或Ramos细胞的直接凋亡。伊莎妥昔单抗的结合导致Daudi和Ramos细胞二者直接凋亡，其中最大凋亡分别为57％和37％。这些结果表明，双特异性二价三链结合化合物在结合时不引起不希望的CD38阳性细胞的凋亡。
尽管具有随附权利要求，但本公开也由以下条款限定：
1.一种双特异性结合化合物，其包含对胞外酶上的第一表位具有结合亲和力的第一多肽；和对所述胞外酶上的第二非重叠表位具有结合亲和力的第二多肽。
2.如条款1所述的双特异性结合化合物，其中所述第一多肽包含对所述第一表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域。
3.如条款2所述的双特异性结合化合物，其中所述第二多肽包含对所述第二表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域。
4.如条款1所述的双特异性结合化合物，其中所述第一和第二多肽各自包含铰链区的至少一部分。
5.如条款4所述的双特异性结合化合物，其中所述第一和第二多肽各自包含至少一个CH结构域。
6.如条款5所述的双特异性结合化合物，其中所述CH结构域包含CH2和/或CH3和/或CH4结构域。
7.如条款6所述的双特异性结合化合物，其中所述CH结构域包含CH2结构域和CH3结构域。
8.如条款6所述的双特异性结合化合物，其中所述CH结构域包含CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域。
9.如条款6所述的双特异性结合化合物，其中所述CH结构域包含人IgG1 Fc区。
10.如条款9所述的双特异性结合化合物，其中所述人IgG1 Fc区是沉默的人IgG1Fc区。
11.如条款6所述的双特异性结合化合物，其中所述CH结构域包含人IgG4 Fc区。
12.如条款11所述的双特异性结合化合物，其中所述人IgG4 Fc区是沉默的人IgG4Fc区。
13.如条款6所述的双特异性结合化合物，其中所述CH结构域不包含CH1结构域。
14.如条款6所述的双特异性结合化合物，其还包含所述第一和第二多肽的所述CH2和/或CH3和/或CH4结构域之间的不对称界面。
15.如条款1所述的双特异性结合化合物，其中所述第一多肽包含：对所述第一表位具有结合亲和力的重链抗体的第一抗原结合结构域；和对所述第二表位具有结合亲和力的重链抗体的第二抗原结合结构域。
16.如条款15所述的双特异性结合化合物，其中所述第一和第二抗原结合结构域通过多肽接头连接。
17.如条款16所述的双特异性结合化合物，其中所述多肽接头由SEQ ID NO:45的序列组成。
18.如条款15所述的双特异性结合化合物，其中所述第二多肽包含：对所述第一表位具有结合亲和力的重链抗体的第一抗原结合结构域；和对所述第二表位具有结合亲和力的重链抗体的第二抗原结合结构域。
19.如条款18所述的双特异性结合化合物，其中所述第一和第二抗原结合结构域通过多肽接头连接。
20.如条款19所述的双特异性结合化合物，其中所述多肽接头由SEQ ID NO:45的序列组成。
21.如条款15所述的双特异性结合化合物，其中所述第一和第二多肽各自包含铰链区的至少一部分。
22.如条款21所述的双特异性结合化合物，其中所述第一和第二多肽各自包含至少一个CH结构域。
23.如条款22所述的双特异性结合化合物，其中所述CH结构域包含CH2和/或CH3和/或CH4结构域。
24.如条款23所述的双特异性结合化合物，其中所述CH结构域包含CH2结构域和CH3结构域。
25.如条款23所述的双特异性结合化合物，其中所述CH结构域包含CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域。
26.如条款23所述的双特异性结合化合物，其中所述CH结构域不包含CH1结构域。
27.如条款22所述的双特异性结合化合物，所述CH结构域包含人IgG1 Fc区。
28.如条款27所述的双特异性结合化合物，其中所述人IgG1 Fc区是沉默的人IgG1Fc区。
29.如条款22所述的双特异性结合化合物，所述CH结构域包含人IgG4 Fc区。
30.如条款29所述的双特异性结合化合物，其中所述人IgG4 Fc区是沉默的人IgG4Fc区。
31.如条款1所述的双特异性结合化合物，其包含：第一和第二重链多肽，其各自包含对所述第一表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域；以及第一和第二轻链多肽，其各自包含对所述第二表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域。
32.如条款31所述的双特异性结合化合物，其中所述第一和第二重链多肽各自包含铰链区的至少一部分。
33.如条款31所述的双特异性结合化合物，其中所述第一和第二重链多肽各自包含至少一个CH结构域。
34.如条款33所述的双特异性结合化合物，其中所述CH结构域包含CH1和/或CH2和/或CH3和/或CH4结构域。
35.如条款33所述的双特异性结合化合物，其中所述CH结构域包含CH1结构域和CH2结构域和CH3结构域。
36.如条款33所述的双特异性结合化合物，其中所述CH结构域包含CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域。
37.如条款31所述的双特异性结合化合物，其中所述第一和第二轻链多肽包含CL结构域。
38.如条款33所述的双特异性结合化合物，所述CH结构域包含人IgG1 Fc区。
39.如条款38所述的双特异性结合化合物，其中所述人IgG1 Fc区是沉默的人IgG1Fc区。
40.如条款33所述的双特异性结合化合物，所述CH结构域包含人IgG4 Fc区。
41.如条款40所述的双特异性结合化合物，其中所述人IgG4 Fc区是沉默的人IgG4Fc区。
42.如条款1-41中任一项所述的双特异性结合化合物，其中胞外酶为CD38。
43.如条款42所述的双特异性结合化合物，其中：与CD38上的所述第一表位或所述第二表位具有结合亲和力的所述重链抗体的所述抗原结合结构域包括：(i)在SEQ ID NO:1-5中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR1序列；和/或(ii)在SEQ ID NO:6-12中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR2序列；和/或(iii)在SEQ ID NO:13-17中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR3序列。
44.如条款43所述的双特异性结合化合物，其中所述CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人框架中。
45.如条款43-44中任一项所述的双特异性结合化合物，其包含：(i)CDR1序列，其选自由SEQ ID NO:1-5组成的组；和/或(ii)CDR2序列，其选自由SEQ ID NO:6-12组成的组；和/或(iii)CDR3序列，其选自由SEQ ID NO:13-17组成的组。
46.如条款45所述的双特异性结合化合物，其包含：(i)CDR1序列，其选自由SEQ IDNO:1-5组成的组；和(ii)CDR2序列，其选自由SEQ ID NO:6-12组成的组；和(iii)CDR3序列，其选自由SEQ ID NO:13-17组成的组。
47.如条款46所述的双特异性结合化合物，其包含：SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；或SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列；或SEQ ID NO:4的CDR1序列、SEQ ID NO:11的CDR2序列和SEQ ID NO:17的CDR3序列。
48.如条款47所述的双特异性结合化合物，其中：对CD38上的所述第一表位具有结合亲和力的所述重链抗体的所述抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ IDNO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；并且对CD38上的所述第二表位具有结合亲和力的所述重链抗体的所述抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列。
49.如条款43-48中任一项所述的双特异性结合化合物，其包含与SEQ ID NO:18-28中的任一序列具有至少95％序列同一性的可变区序列。
50.如条款49所述的双特异性结合化合物，其包含选自由SEQ ID NO:18-28组成的组的可变区序列。
51.如条款50所述的双特异性结合化合物，其中：对CD38上的所述第一表位具有结合亲和力的所述重链抗体的所述抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:18的可变区序列；并且对CD38上的所述第二表位具有结合亲和力的所述重链抗体的所述抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:23的可变区序列。
52.一种与CD38结合的重链抗体，所述重链抗体包含抗原结合结构域，其包含：(i)在SEQ ID NO:1-5中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR1序列；和/或(ii)在SEQ ID NO:6-12中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR2序列；和/或(iii)在SEQ ID NO:13-17中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR3序列。
53.如条款52所述的重链抗体，其中所述CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人框架中。
54.如条款52所述的重链抗体，其还包含重链恒定区序列，但不存在CH1序列。
55.如条款52-54中任一项所述的重链抗体，其包含：(a)CDR1序列，其选自由SEQID NO:1-5组成的组；和/或(b)CDR2序列，其选自由SEQ ID NO:6-12组成的组；和/或(c)CDR3序列，其选自由SEQ ID NO:13-17组成的组。
56.如条款55所述的重链抗体，其包含：(a)CDR1序列，其选自由SEQ ID NO:1-5组成的组；和(b)CDR2序列，其选自由SEQ ID NO:6-12组成的组；和(c)CDR3序列，其选自由SEQID NO:13-17组成的组。
57.如条款56所述的重链抗体，其包含：SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；或SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列；或SEQ ID NO:4的CDR1序列、SEQ ID NO:11的CDR2序列和SEQ ID NO:17的CDR3序列。
58.如条款52-57中任一项所述的重链抗体，其包含与SEQ ID NO:18-28中的任一序列具有至少95％序列同一性的可变区序列。
59.如条款58所述的重链抗体，其包含选自由SEQ ID NO:18-28组成的组的可变区序列。
60.如条款52-59中任一项所述的重链抗体，其是单特异性的。
61.如条款52-59中任一项所述的重链抗体，其是多特异性的。
62.如条款61所述的重链抗体，其是双特异性的。
63.如条款62所述的重链抗体，其对同一CD38蛋白上的两个不同表位具有结合亲和力。
64.如条款63所述的重链抗体，其中所述两个不同表位是非重叠表位。
65.如条款61所述的重链抗体，其对效应细胞具有结合亲和力。
66.如条款61所述的重链抗体，其对T细胞抗原具有结合亲和力。
67.如条款66所述的重链抗体，其对CD3具有结合亲和力。
68.如条款52-67中任一项所述的重链抗体，其为CAR-T形式。
69.一种对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性结合化合物，所述双特异性结合化合物包含：(a)对所述第一CD38表位具有结合亲和力的第一多肽，其包含：(i)重链抗体的抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；(ii)铰链区的至少一部分；和(iii)包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域；以及(b)对所述第二CD38表位具有结合亲和力的第二多肽，其包含：(i)重链抗体的抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列；(ii)铰链区的至少一部分；以及(iii)包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域；以及(c)所述第一多肽的所述CH3结构域与所述第二多肽的所述CH3结构域之间的不对称界面。
70.如条款69所述的双特异性结合化合物，其包含选自由以下组成的组的Fc区：人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区和沉默的人IgG4 Fc区。
71.一种对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性结合化合物，所述双特异性结合化合物包含两个相同的多肽，每个多肽包含：(i)对所述第一CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的第一抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；(ii)对所述第二CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的第二抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ IDNO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列；(iii)铰链区的至少一部分；以及(iv)包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域。
72.如条款71所述的双特异性结合化合物，其包含选自由以下组成的组的Fc区：人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区和沉默的人IgG4 Fc区。
73.一种对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性结合化合物，所述双特异性结合化合物包含：(a)第一重链多肽和第二重链多肽，其各自包含：(i)对所述第一CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域，其包含SEQ IDNO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；(ii)铰链区的至少一部分；和(iii)包含CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域的CH结构域；以及(b)第一轻链多肽和第二轻链多肽，其各自包含：(i)对所述第二CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列，以及(ii)CL结构域。
74.如条款73所述的双特异性结合化合物，其包含选自由以下组成的组的Fc区：人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区和沉默的人IgG4 Fc区。
75.一种药物组合物，其包含如条款1至74中任一项所述的结合化合物或重链抗体。
76.一种治疗性组合，其包含：根据条款52-68中任一项所述的结合化合物或重链抗体；以及与CD38结合的第二抗体。
77.如条款76所述的治疗性组合，其中与CD38结合的所述第二抗体是伊莎妥昔单抗或达雷木单抗。
78.一种用于治疗以CD38的表达为特征的病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的受试者施用如条款1至74中任一项所述的结合化合物或重链抗体或者如条款75所述的药物组合物。
79.如条款78所述的方法，其中所述病症的特征在于CD38的水解酶酶活性。
80.如条款78所述的方法，其中所述病症是结肠炎。
81.如条款78所述的方法，其中所述病症是多发性骨髓瘤(MM)。
82.如条款78所述的方法，其中所述病症是自身免疫性疾病。
83.如条款82所述的方法，其中所述病症是类风湿性关节炎(RA)。
84.如条款82所述的方法，其中所述病症是寻常天疱疮(PV)。
85.如条款82所述的方法，其中所述病症是系统性红斑狼疮(SLE)。
86.如条款82所述的方法，其中所述病症是多发性硬化症(MS)、系统性硬化症或纤维化。
87.如条款78所述的方法，其中所述病症是缺血性损伤。
88.如条款87所述的方法，其中所述缺血性损伤是缺血性脑损伤、缺血性心脏损伤、缺血性胃肠道损伤或缺血性肾损伤。
89.如条款78-88中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用与CD38结合的第二抗体。
90.如条款89所述的方法，其中与CD38结合的所述第二抗体是伊莎妥昔单抗或达雷木单抗。
91.一种多核苷酸，其编码如条款1至74中任一项所述的结合化合物或重链抗体。
92.一种载体，其包含如条款91所述的多核苷酸。
93.一种细胞，其包含如条款92所述的载体。
94.一种产生如条款1至74中任一项所述的结合化合物或重链抗体的方法，所述方法包括在允许表达所述结合化合物或所述重链抗体的条件下生长根据条款86所述的细胞，以及从所述细胞和/或在其中生长所述细胞的细胞培养基中分离所述结合化合物或所述重链抗体。
95.一种制备如条款1至74中任一项所述的结合化合物或重链抗体的方法，所述方法包括用胞外酶免疫UniRat动物并鉴定结合胞外酶的重链序列。
虽然本发明的优选实施方案已在本文示出和描述，此类实施方案仅以举例的方式提供，这对本领域的技术人员将是显而易见的。在不偏离本发明的情况下本领域技术人员现将进行各种变型、变化和替换。应当理解可将本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案用于实施本发明。这意味着以下权利要求书限定本发明的范围并且这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构因此被涵盖。

Claims (60)

1.一种双特异性结合化合物，其包含：
对CD38上的第一表位具有结合亲和力的第一多肽；和
对CD38上的第二非重叠表位具有结合亲和力的第二多肽。
2.如权利要求1所述的双特异性结合化合物，其中所述第一多肽包含对CD38上的所述第一表位或所述第二表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域，并且包含：
(i)在SEQ ID NO:1-5中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR1序列；和/或
(ii)在SEQ ID NO:6-12中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR2序列；和/或
(iii)在SEQ ID NO:13-17中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR3序列。
3.如权利要求2所述的双特异性结合化合物，其中所述CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人框架中。
4.如权利要求2-3中任一项所述的双特异性结合化合物，其包含：
(i)包含SEQ ID NO:1-5中的任一个的CDR1序列；和/或
(ii)包含SEQ ID NO:6-12中的任一个的CDR2序列；和/或
(iii)包含SEQ ID NO:13-17中的任一个的CDR3序列。
5.如权利要求4所述的双特异性结合化合物，其包含：
(i)包含SEQ ID NO:1-5中的任一个的CDR1序列；和
(ii)包含SEQ ID NO:6-12中的任一个的CDR2序列；和
(iii)包含SEQ ID NO:13-17中的任一个的CDR3序列。
6.如权利要求5所述的双特异性结合化合物，其包含：
SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；或者
SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列；或者
SEQ ID NO:4的CDR1序列、SEQ ID NO:11的CDR2序列和SEQ ID NO:17的CDR3序列。
7.如权利要求6所述的双特异性结合化合物，其中：
对CD38上的所述第一表位具有结合亲和力的所述重链抗体的所述抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；并且
对CD38上的所述第二表位具有结合亲和力的所述重链抗体的所述抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列。
8.如权利要求2-7中任一项所述的双特异性结合化合物，其包含与SEQ ID NO:18-28中的任一序列具有至少95％序列同一性的可变区序列。
9.如权利要求8所述的双特异性结合化合物，其包含选自由SEQ ID NO:18-28组成的组的可变区序列。
10.如权利要求9所述的双特异性结合化合物，其中：
对CD38上的所述第一表位具有结合亲和力的所述重链抗体的所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:18的可变区序列；并且
对CD38上的所述第二表位具有结合亲和力的所述重链抗体的所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:23的可变区序列。
11.一种与CD38结合的重链抗体，所述重链抗体包含抗原结合结构域，其包含：
(i)在SEQ ID NO:1-5中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR1序列；和/或
(ii)在SEQ ID NO:6-12中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR2序列；和/或
(iii)在SEQ ID NO:13-17中的任一氨基酸序列中具有两个或更少取代的CDR3序列。
12.如权利要求11所述的重链抗体，其中所述CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人框架中。
13.如权利要求11所述的重链抗体，其还包含重链恒定区序列，但不存在CH1序列。
14.如权利要求11-13中任一项所述的重链抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:1-5中的任一个的CDR1序列；和/或
(b)包含SEQ ID NO:6-12中的任一个的CDR2序列；和/或
(c)包含SEQ ID NO:13-17中的任一个的CDR3序列。
15.如权利要求14所述的重链抗体，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:1-5中的任一个的CDR1序列；和
(b)包含SEQ ID NO:6-12中的任一个的CDR2序列；和
(c)包含SEQ ID NO:13-17中的任一个的CDR3序列。
16.如权利要求15所述的重链抗体，其包含：
SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；或者
SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列；或者
SEQ ID NO:4的CDR1序列、SEQ ID NO:11的CDR2序列和SEQ ID NO:17的CDR3序列。
17.如权利要求11-16中任一项所述的重链抗体，其包含与SEQ ID NO:18-28中的任一序列具有至少95％序列同一性的可变区序列。
18.如权利要求17所述的重链抗体，其包含选自由SEQ ID NO:18-28组成的组的可变区序列。
19.如权利要求11-18中任一项所述的重链抗体，其是单特异性的。
20.如权利要求11-18中任一项所述的重链抗体，其是多特异性的。
21.如权利要求20所述的重链抗体，其是双特异性的。
22.如权利要求21所述的重链抗体，其对同一CD38蛋白上的两个不同表位具有结合亲和力。
23.如权利要求22所述的重链抗体，其中所述两个不同表位是非重叠表位。
24.如权利要求20所述的重链抗体，其对效应细胞具有结合亲和力。
25.如权利要求20所述的重链抗体，其对T细胞抗原具有结合亲和力。
26.如权利要求25所述的重链抗体，其对CD3具有结合亲和力。
27.如权利要求11-26中任一项所述的重链抗体，其为CAR-T形式。
28.一种对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性结合化合物，所述双特异性结合化合物包含：
(a)对所述第一CD38表位具有结合亲和力的第一多肽，其包含：
(i)重链抗体的抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；
(ii)铰链区的至少一部分；以及
(iii)包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域；以及
(b)对所述第二CD38表位具有结合亲和力的第二多肽，其包含：
(i)重链抗体的抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列；
(ii)铰链区的至少一部分；以及
(iii)包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域；以及
(c)所述第一多肽的所述CH3结构域与所述第二多肽的所述CH3结构域之间的不对称界面。
29.如权利要求28所述的双特异性结合化合物，其包含选自由以下组成的组的Fc区：人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区和沉默的人IgG4 Fc区。
30.一种对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性结合化合物，所述双特异性结合化合物包含两个相同的多肽，每个多肽包含：
(i)对所述第一CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的第一抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；
(ii)对所述第二CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的第二抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列；
(iii)铰链区的至少一部分；以及
(iv)包含CH2结构域和CH3结构域的CH结构域。
31.如权利要求30所述的双特异性结合化合物，其包含选自由以下组成的组的Fc区：人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区和沉默的人IgG4 Fc区。
32.一种对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性结合化合物，所述双特异性结合化合物包含：
(a)第一重链多肽和第二重链多肽，其各自包含：
(i)对所述第一CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域，其包含SEQID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；
(ii)铰链区的至少一部分；以及
(iii)包含CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域的CH结构域；以及
(b)第一轻链多肽和第二轻链多肽，其各自包含：
(i)对所述第二CD38表位具有结合亲和力的重链抗体的抗原结合结构域，其包含SEQID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的可变区序列；以及
(ii)CL结构域。
33.如权利要求32所述的双特异性结合化合物，其包含选自由以下组成的组的Fc区：人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区和沉默的人IgG4 Fc区。
34.一种对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性结合化合物，所述双特异性结合化合物包含：
(a)包含重链可变区的第一多肽亚基，所述重链可变区在人重链框架中包含SEQ IDNO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:6的CDR2序列和SEQ ID NO:13的CDR3序列；
(b)包含轻链可变区的第二多肽亚基，所述轻链可变区在人轻链框架中包含SEQ IDNO:49的CDR1序列、SEQ ID NO:50的CDR2序列和SEQ ID NO:51的CDR3序列；
其中所述第一多肽亚基和所述第二多肽亚基一起对所述第一CD38表位具有结合亲和力；以及
(c)包含重链抗体的抗原结合结构域的第三多肽亚基，所述抗原结合结构域在人重链框架中包含SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:9的CDR2序列和SEQ ID NO:16的CDR3序列，呈单价和二价构型；
其中所述第三多肽亚基对所述第二非重叠CD38表位具有结合亲和力。
35.如权利要求34所述的双特异性结合化合物，其中所述第一多肽亚基还包含CH1结构域、铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域。
36.如权利要求34或35所述的双特异性结合化合物，其中所述第三多肽亚基还包含恒定区序列，所述恒定区序列包含铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域，但不存在CH1结构域。
37.如权利要求34-36中任一项所述的双特异性结合化合物，其中所述人轻链框架是人κ轻链框架或人λ轻链框架。
38.如权利要求34-37中任一项所述的双特异性结合化合物，其中所述第二多肽亚基还包含CL结构域。
39.如权利要求34-38中任一项所述的双特异性结合化合物，其包含选自由以下组成的组的Fc区：人IgG1 Fc区、人IgG4 Fc区、沉默的人IgG1 Fc区和沉默的人IgG4 Fc区。
40.如权利要求34-39中任一项所述的双特异性结合化合物，其包含在所述第一多肽亚基的所述CH3结构域与所述第三多肽亚基的所述CH3结构域之间的不对称界面。
41.一种对第一CD38表位和第二非重叠CD38表位具有结合亲和力的双特异性结合化合物，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:46的序列的第一重链多肽；
(b)包含SEQ ID NO:48的序列的第一轻链多肽；以及
(c)包含SEQ ID NO:47的序列的第二重链多肽。
42.一种药物组合物，其包含如权利要求1至41中任一项所述的结合化合物或重链抗体。
43.一种用于治疗以CD38的表达为特征的病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的受试者施用如权利要求1至41中任一项所述的结合化合物或重链抗体或者如权利要求42所述的药物组合物。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述病症的特征在于CD38的水解酶酶活性。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述病症是结肠炎。
46.如权利要求43所述的方法，其中所述病症是多发性骨髓瘤(MM)。
47.如权利要求43所述的方法，其中所述病症是自身免疫性疾病。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述病症是类风湿性关节炎(RA)。
49.如权利要求47所述的方法，其中所述病症是寻常天疱疮(PV)。
50.如权利要求47所述的方法，其中所述病症是系统性红斑狼疮(SLE)。
51.如权利要求47所述的方法，其中所述病症是多发性硬化症(MS)、系统性硬化症或纤维化。
52.如权利要求43所述的方法，其中所述病症是缺血性损伤。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述缺血性损伤是缺血性脑损伤、缺血性心脏损伤、缺血性胃肠道损伤或缺血性肾损伤。
54.如权利要求43-53中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用与CD38结合的第二抗体。
55.如权利要求54所述的方法，其中与CD38结合的所述第二抗体是伊莎妥昔单抗或达雷木单抗。
56.一种多核苷酸，其编码如权利要求1至41中任一项所述的结合化合物或重链抗体。
57.一种载体，其包含如权利要求56所述的多核苷酸。
58.一种细胞，其包含如权利要求57所述的载体。
59.一种产生如权利要求1至41中任一项所述的结合化合物或重链抗体的方法，所述方法包括在允许表达所述结合化合物或所述重链抗体的条件下生长根据权利要求58所述的细胞，以及从所述细胞和/或在其中生长所述细胞的细胞培养基中分离所述结合化合物或所述重链抗体。
60.一种制备如权利要求1至41中任一项所述的结合化合物或重链抗体的方法，所述方法包括用CD38蛋白免疫UniRat动物并鉴定结合CD38蛋白的重链序列。
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