BR112021000173A2

BR112021000173A2 - anticorpos de cadeia pesada com ligação a cd38

Info

Publication number: BR112021000173A2
Application number: BR112021000173-5A
Authority: BR
Inventors: Wim Van Schooten; Starlynn Clarke; Kevin Dang
Original assignee: Teneobio, Inc.
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2021-05-04
Also published as: CA3100232A1; KR20210086651A; IL282590A; JP2022505445A; EP3870611A1; AU2019367218A1; MX2021004732A; WO2020087065A1; CN112955467A; US20210388106A1

Abstract

ANTICORPOS DE CADEIA PESADA COM LIGAÇÃO A CD38. A presente invenção refere-se a compostos de ligação, tais como anticorpos de cadeia pesada humana (por exemplo, UniAbsTM) que se ligam a CD38, juntamente com métodos de preparação de tais compostos de ligação, composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo tais compostos de ligação e seus vários usos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS DE CADEIA PESADA COM LIGAÇÃO A CD38".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade da data de depósito do Pedido de Patente Provisório dos EUA nº 62/751.520, de- positado em 26 de outubro de 2018, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se a compostos de ligação, tais como anticorpos de cadeia pesada humana (por exemplo, UniAbs""M) que se ligam a CD38. Aspectos da invenção referem-se a anticorpos de cadeia pesada anti-CD38, combinações, incluindo combinações sinérgicas, de anticorpos de cadeia pesada anti-CD38 direcionados a epitopos não sobrepostos em CD38, anticorpos de cadeia pesada anti- CD38 multiespecíficos com especificidade de ligação a mais de um epitopo não sobreposto em CD38, bem como métodos de preparação de tais compostos de ligação, composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo tais compostos de ligação e seus vá- rios usos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Ectoenzima CD38

[0003] A ectoenzima CD38 é uma proteína de membrana que tem seu sítio catalítico na parte externa da membrana no compartimento extracelular. Esta proteína da superfície celular facilita muitas funções e é encontrada em uma ampla variedade de células, como células do sistema imunológico, células endoteliais e células do tecido neuronal.

[0004] O CD38, também conhecido como ADP-ribosil ciclase/ADP- ribose hidrolase 1 cíclico, é uma proteína transmembrana do tipo |1l de passagem única com atividades ectoenzimáticas. Utilizando o NAD (P) como substrato, catalisa a formação de diversos produtos: ADP-ribose cíclica (CADPR); ADP-ribose (ADPR); fosfato de dinucleotídeo de ade- nina de ácido nicotínico (NAADP); ácido nicotínico (NA); ADP-ribose- 2'-fosfato (ADPRP) (ver, por exemplo, HC Lee, Mol. Med., 2006, 12: 317-323). O CD38 também pode usar o mononucleotídeo de nicotina- mida (NMN) como substrato e convertê-lo em nicotinamida e R5P (Liu et al., "Covalent and noncovalent intermediates of an NAD utilizing enzyme, human CD38." Chem Biol 15 (10): 1068-78.

[0005] O CD38 é expresso predominantemente em células imunes, incluindo células plasmáticas, células T efetoras ativadas, células apresentadoras de antígeno, células de músculo liso no pulmão, célu- las de mieloma múltiplo (MM), linfoma de células B, células de leuce- mia de células B, células de linfoma de células T, células de câncer de mama, células supressoras derivadas de mieloides, células B regula- doras e células T reguladoras. CD38 nas células imunes interage com o CD31/PECAM-1 expresso pelas células endoteliais e outras linha- gens celulares. Esta interação promove a proliferação de leucócitos, migração, ativação de células T e maturação de DC derivadas de mo- nócitos.

[0006] Os anticorpos que se ligam ao CD38 são descritos, por exemplo, em Deckert et al., Clin. Cancer Res., 2014, 20 (17): 4574-83 e Patentes US Nºs 8.153.765; 8.263.746; 8.362.211; 8.926.969;

9.187.565; 9.193.799; 9.249.226; e 9.676.869.

[0007] Daratumumab, um anticorpo específico para CD38 humano, foi aprovado para uso humano em 2015 para o tratamento de mieloma múltiplo (revisado em Shallis et al., Cancer Immunol. Immunother. 2017, 66 (6): 697-703). Outro anticorpo contra o CD38, o isatuximab (SARG650984), está em ensaios clínicos para o tratamento do mieloma múltiplo. (Ver, por exemplo, Deckert et al., Clin Cencer Res, 2014, 20 (17): 4574-83; Martin et al., Blood, 2015, 126: 509; Martin et al., Blood, 2017, 129: 3294 -3303). Estes anticorpos induzem citotoxicidade de-

pendente do complemento potente (CDC), citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose celular depen- dente de anticorpos (ADCP) e apoptose indireta de células tumorais. O isatuximabe também bloqueia as atividades enzimáticas da ciclase e hidrolase do CD38 e induz a apoptose direta das células tumorais.

[0008] Exemplos de modulação alostérica de proteínas por anti- corpos são o hormônio do crescimento humano, integrinas e beta- glactosidase (LP Roguin & LA Retegui, 2003, Scand. J. Immunol. 58 (4): 387—394). Estes exemplos mostram a modulação das interações ligante-receptor por anticorpos únicos direcionados a diferentes epito- pos. Um exemplo de um anticorpo biespecífico direcionado a dois epi- topos em uma única molécula é contra c-MET ou receptor do fator de crescimento de hepatócitos (HGFR) (DaSilva, J., Abstract 34: Um anti- corpo biespecífico MET x MET que induz a degradação do receptor inibe de forma potente o crescimento de xenoenxertos de tumor de- pendentes de MET. AACR Annual Meeting 2017; 1-5 de abril de 2017; Washington, DC). Anticorpos de Cadeia Pesada

[0009] Em um anticorpo IgG convencional, a associação da cadeia pesada e da cadeia leve se deve em parte a uma interação hidrofóbica entre a região constante da cadeia leve e o domínio constante de CH1 da cadeia pesada. Existem resíduos adicionais nas regiões de fra- mework 2 (FR2) e framework 4 (FR4) da cadeia pesada que também contribuem para esta interação hidrofóbica entre as cadeias pesadas e leves.

[0010] É conhecido, no entanto, que os soros de camelídeos (sub- ordem Tylopoda, que inclui camelos, dromedários e lamas) contêm um tipo principal de anticorpos compostos apenas por cadeias H empare- lhadas (anticorpos apenas de cadeia pesada, anticorpos de cadeia pe- sada ou UniAbs"Y). O UniAbs'Y de Camelidae (Camelus dromedarius,

Camelus bactrianus, Lama glama, Lama guanaco, Lama alpaca e La- ma vicugna) têm uma estrutura única que consiste em um único domí- nio variável (VHH), uma região de dobradiça e dois domínios constan- tes (CH2 e CH3), que são altamente homólogos aos domínios CH2 e CH3 dos anticorpos clássicos. Estes UniAbs'!Y não possuem o primei- ro domínio da região constante (CH1), que está presente no genoma, mas é processado durante o processamento do mRNA. A ausência do domínio CH1 explica a ausência da cadeia leve no UniAbs'Y, uma vez que este domínio é o lugar de ancoragem para o domínio constante da cadeia leve. Tal UniAbs'!Y evoluiu naturalmente para conferir especifi- cidade de ligação ao antígeno e alta afinidade por três CDRs a partir de anticorpos convencionais, ou fragmentos dos mesmos (Muylder- mans, 2001; J Biotechnol 74:277-302; Revets et al., 2005; Expert Opin Biol Ther 5:111—124). Os peixes cartilaginosos, como os tubarões, também desenvolveram um tipo distinto de imunoglobulina, denomina- da IQNAR, que não possui as cadeias polipeptídicas leves e é compos- ta inteiramente por cadeias pesadas. As moléculas de IINAR podem ser manipuladas por manipulação molecular para produzir o domínio variável de um único polipeptídeo de cadeia pesada (vNARs) (Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al., Molecular Immu- nology 40, 25-33 (2003)).

[0011] A capacidade de anticorpos apenas de cadeia pesada des- providos de cadeia leve para se ligarem ao antígeno foi estabelecida na década de 1960 (Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). A imunoglobulina de cadeia pesada fisicamente separada da cadeia leve reteve 80% da atividade de ligação ao antígeno em relação ao anticor- po tetramérico. Sitia et al. (1990) Cell, 60, 781-790 demonstrou que a remoção do domínio CH1 a partir de um gene py de camundongo rear- ranjado resulta na produção de um anticorpo apenas de cadeia pesa-

da, desprovido de cadeia leve, em cultura de células de mamíferos. Os anticorpos produzidos retiveram a especificidade de ligação de VH e funções efetoras.

[0012] Os anticorpos de cadeia pesada com alta especificidade e afinidade podem ser gerados contra uma variedade de antígenos por meio de imunização (van der Linden, RH, et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)), e a porção de VHH pode ser facilmente clonada e expressa em levedura (Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). Os seus níveis de expressão, solubilidade e estabilidade são significativamente mais elevados do que os dos fragmentos F(ab) ou Fv clássicos (Ghahroudi, MA et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)).

[0013] Os camundongos nos quais o locus da cadeia À (lambda) leve (L) e/ou os loci da cadeia À e K (kappa) L foram funcionalmente silenciados e os anticorpos produzidos por tais camundongos são des- critos nas Patentes U.S. nºs 7.541.513 e 8.367.888. A produção re- combinante de anticorpos apenas de cadeia pesada em camundongos e ratos foi relatada, por exemplo, em WO2006008548; Publicação de Pedido US Nº 20100122358; Nguyen et al., 2003, Immunology; 109 (1), 93-101; Brúggemann et al., Crit. Rev. Immunol.; 2006, 26 (5): 377-90; e Zou et al., 2007, J Exp Med; 204 (13): 3271-3283. A produção de ratos nocaute via microinjeções de embrião de nucleases de dedo de zinco é descrita em Geurts et al., 2009, Science, 325(5939):433. Os anticorpos solúveis apenas de cadeia pesada e roedores transgênicos compreendendo um locus de cadeia pesada heterólogo que produz tais anticorpos são descritos nas Patentes U.S. nºs 8.883.150 e

9.365.655. As estruturas CAR-T compreendendo os anticorpos de do- mínio único como um domínio de ligação (direcionamento) são descri- tas, por exemplo, em Iri-Sofla et al., 2011, Experimental Cell Research 317:2630-2641 e Jamnani et al, 2014, Biochim Biophys Acta, 1840:378-386.0

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] Aspectos da invenção incluem compostos de ligação bies- pecíficos compreendendo um primeiro polipeptídeo com afinidade de ligação a um primeiro epitopo em uma ectoenzima e um segundo poli- peptídeo com afinidade de ligação a um segundo epitopo não sobre- posto na ectoenzima. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptí- deo compreende um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao primeiro epitopo. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo compreende um domí- nio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afi- nidade de ligação ao segundo epitopo. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem cada um pelo me- nos uma porção de uma região de dobradiça. Em algumas modalida- des, o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem cada um pelo menos um domínio CH. Em algumas modalidades, o domínio CH compreende um domínio CH2 e/ou CH3 e/ou CH4. Em algumas moda- lidades, o domínio CH compreende um domínio CH2 e um domínio CH3. Em algumas modalidades, o domínio CH compreende um domí- nio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4. Em algumas modalida- des, o domínio CH compreende uma região Fc de I9gG1 humana. Em algumas modalidades, a região Fc de IgG1 humana é uma região Fc de IgG1 humana silenciada. Em algumas modalidades, o domínio CH compreende uma região Fc de IgG4 humana. Em algumas modalida- des, a região Fc de IgG4 humana é uma região Fc de IgG4 humana silenciada. Em algumas modalidades, o domínio CH não compreende um domínio CH1. Em algumas modalidades, uma interface assimétrica está presente entre os domínios CH2 e/ou CH3 e/ou CH4 do primeiro e do segundo polipeptídeos.

[0015] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo compre- ende um primeiro domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao primeiro epitopo e um se- gundo domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pe- sada tendo afinidade de ligação ao segundo epitopo. Em algumas mo- dalidades, o segundo polipeptídeo compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afini- dade de ligação ao primeiro epitopo e um segundo domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada tendo afinidade de |i- gação ao segundo epitopo. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno estão conectados por um ligante polipeptídico. Em algumas modalidades, o ligante polipeptídico consiste na sequência de SEQ ID NO: 45.

[0016] Em algumas modalidades, um composto de ligação biespe- cífico compreende um primeiro e um segundo polipeptídeos de cadeia pesada, cada um compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação para o primeiro epitopo e um primeiro e um segundo polipeptídeos de cadeia leve, cada compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação para o segundo epitopo. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo polipeptí- deos de cadeia leve compreendem, cada um, um domínio CL.

[0017] Em algumas modalidades, a ectoenzima é CD38.

[0018] Aspectos da invenção incluem anticorpos de cadeia pesada que se ligam a CD38 e que compreendem um domínio de ligação ao antígeno compreendendo: (i) uma sequência CDR1 tendo duas ou menos substituições em qualquer uma das sequências de aminoáci- dos de SEQ ID NOs: 1-5; e/ou (ii) uma sequência CDR2 tendo duas ou menos substituições em qualquer uma das sequências de aminoáci- dos de SEQ ID NOs: 6-12; e/ou (iii) uma sequência CDR3 tendo duas ou menos substituições em qualquer uma das sequências de aminoá- cidos de SEQ ID NOs: 13-17. Em algumas modalidades, as sequên-

cias CDR1, CDR2 e CDR3 estão presentes em um framework humano. Em algumas modalidades, um anticorpo de cadeia pesada compreen- de adicionalmente uma sequência da região constante da cadeia pe- sada na ausência de uma sequência de CH1.

[0019] Em algumas modalidades, um anticorpo de cadeia pesada compreende uma sequência de região variável com pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de SEQ ID NOs: 18-28. Em algumas modalidades, um anticorpo de ca- deia pesada compreende uma sequência de região variável seleciona- da do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18-28. Em algumas moda- lidades, um anticorpo de cadeia pesada é monoespecífico. Em algu- mas modalidades, um anticorpo de cadeia pesada é multiespecífico. Em algumas modalidades, um anticorpo de cadeia pesada é biespecií- fico. Em algumas modalidades, um anticorpo de cadeia pesada tem afinidade de ligação a dois epitopos diferentes na mesma proteína CD38. Em algumas modalidades, os dois epitopos diferentes são epi- topos não sobrepostos. Em algumas modalidades, um anticorpo de cadeia pesada tem afinidade de ligação a uma célula efetora. Em al- gumas modalidades, um anticorpo de cadeia pesada tem afinidade de ligação a um antígeno de células T. Em algumas modalidades, um an- ticorpo de cadeia pesada tem afinidade de ligação a CD3. Em algumas modalidades, um anticorpo de cadeia pesada está em um formato CAR-T.

[0020] Aspectos da invenção incluem composições farmacêuticas compreendendo um composto de ligação ou um anticorpo de cadeia pesada descrito neste documento.

[0021] Aspectos da invenção incluem combinações terapêuticas compreendendo um composto de ligação ou um anticorpo de cadeia pesada descrito neste documento e um segundo anticorpo que se liga a CD38. Em algumas modalidades, o segundo anticorpo que se liga ao

CD38 é isatuximabe ou daratumumabe.

[0022] Aspectos da invenção incluem métodos para o tratamento de um distúrbio caracterizado pela expressão de CD38, os métodos compreendendo a administração a um sujeito com o referido distúrbio de um composto de ligação ou um anticorpo de cadeia pesada, uma composição farmacêutica e/ou uma combinação terapêutica conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, o distúrbio é ca- racterizado por uma atividade enzimática de hidrolase de CD38. Em algumas modalidades, o distúrbio é colite. Em algumas modalidades, o distúrbio é mieloma múltiplo (MM). Em algumas modalidades, o distúr- bio é um distúrbio autoimune. Em algumas modalidades, o distúrbio é artrite reumatoide (RA). Em algumas modalidades, o distúrbio é pênfi- go vulgar (PV). Em algumas modalidades, o distúrbio é lúpus eritema- toso sistêmico (SLE). Em algumas modalidades, o distúrbio é esclero- se múltipla (MS), esclerose sistêmica ou fibrose. Em algumas modali- dades, o distúrbio é uma lesão isquêmica. Em algumas modalidades, a lesão isquêmica é uma lesão cerebral isquêmica, uma lesão cardíaca isquêmica, uma lesão gastrointestinal isquêmica ou uma lesão renal isquêmica. Em algumas modalidades, um método compreende adicio- nalmente a administração ao sujeito de um segundo anticorpo que se liga a CD38. Em algumas modalidades, o segundo anticorpo que se liga ao CD38 é isatuximabe ou daratumumabe.

[0023] Estes e outros aspectos serão explicados com mais deta- lhes no restante da divulgação, incluindo os Exemplos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0024] Na FIG. 1, os painéis A-E fornecem sequências de CDR, sequências de região variável, informações do gene V e do gene Ju, atividade de inibição da hidrolase de CD38 percentual e dados de MFI de ligação celular para compostos de ligação anti-CD38 na família F11.

[0025] Na FIG. 2, os painéis A-D fornecem sequências de CDR,

sequências de região variável, informações de Gene V e Gene J, ativi- dade de inibição de hidrolase de CD38 percentual e dados de MFI de ligação celular para compostos de ligação anti-CD38 na família F12.

[0026] Na FIG. 3, os painéis A-B fornecem sequências de CDR, sequências de região variável, informações do gene V e do gene Ju, atividade de inibição da hidrolase de CD38 percentual e dados de MFI de ligação celular para compostos de ligação anti-CD38 na família F13.

[0027] A FIG. 4 fornece informações de sequência para sequên- cias de aminoácidos adicionais na aplicação.

[0028] A FIG. 5 fornece informações de sequência para sequên- cias de aminoácidos adicionais na aplicação.

[0029] A FIG. 6 mostra um gráfico que representa os dados de |li- gação de células em função da concentração para os compostos de ligação observados.

[0030] A FIG. 7 mostra um gráfico que representa a atividade de hidrolase baseada em células como uma função da concentração para os compostos de ligação observados.

[0031] A FIG. 8 mostra um gráfico que representa a inibição enzi- mática da atividade de hidrolase de CD38 por UniAbs'"Y bivalente.

[0032] A FIG. 9 mostra um gráfico que representa a inibição enzi- mática da atividade de hidrolase de CD38 por uma mistura de UniA- bs'"y CD38 F13A ou CD38 F13B com Isatuximab.

[0033] A FIG. 10 mostra um gráfico que representa a citotoxicida- de direta de células Daudi induzidas com compostos de ligação de acordo com modalidades da invenção.

[0034] A FIG. 11 mostra uma representação esquemática de dois formatos UniAb'Y bivalentes (Painéis C e D) e dois tetravalentes (Pai- néis A e B) de acordo com as modalidades da invenção.

[0035] A FIG. 12 mostra um gráfico que representa a inibição en- zimática da atividade de hidrolase de CD38 humano expresso em cé-

lulas CHO por UniAbs'Y tetravalente conforme descrito na FIG. 11

[0036] A FIG. 13 mostra um gráfico que representa a inibição de misturas de UniAbs com Isatuximab.

[0037] A FIG. 14 mostra um gráfico que representa a inibição da atividade de hidrolase de CD38 por misturas de UniAbs.

[0038] A FIG. 15 mostra outro gráfico que representa a inibição da atividade de hidrolase de CD38 por misturas de UniAbs.

[0039] A FIG. 16 mostra um gráfico que representa a atividade de hidrolase baseada em células para dois compostos de ligação biespe- cíficos tetravalentes de acordo com modalidades da invenção, confor- me representado na FIG. 11.

[0040] A FIG. 17 mostra um gráfico que representa a atividade de hidrolase baseada em células para vários compostos de ligação de acordo com modalidades da invenção.

[0041] A FIG. 18 fornece dados em formato tabular, resumindo vá- rias atividades de compostos de ligação de acordo com modalidades da invenção.

[0042] Na FIG. 19, os painéis A e B mostram gráficos que repre- sentam a concentração de NAD + intracelular como uma função do composto de ligação para células Daudi e Ramos, respectivamente.

[0043] Na FIG. 20, os painéis A-C, representam gráficos que mos- tram resultados de ensaios de proliferação de células T e ensaios de produção de IFNy.

[0044] A FIG. 21 mostra um gráfico que representa a atividade de CD38 ciclase como uma função da concentração do composto de liga- ção para vários compostos de ligação de acordo com modalidades da invenção.

[0045] A FIG. 22 mostra um gráfico que descreve a atividade de ligação da célula alvo em três linhagens celulares diferentes em fun- ção da concentração do composto de ligação.

[0046] A FIG. 23 mostra um gráfico que representa a atividade de ligação fora da célula alvo em quatro linhagens celulares diferentes em função da concentração do composto de ligação.

[0047] Na FIG. 24, os painéis A e B mostram gráficos que repre- sentam a viabilidade celular percentual em função da concentração do composto de ligação para as linhagens celulares Daudi e Ramos, res- pectivamente. O painel C fornece dados em formato tabular.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

[0048] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bio- química e imunologia, que estão dentro da habilidade na técnica. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura, tais como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. |. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Aca- demic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Au- subel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Mole- cular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001); Harlow, Lane and Harlow, Using Antibo- dies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. |, Cold Spring Harbor Laboratory (1998); e Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Ma- nual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988).

[0049] Quando um intervalo de valores é produzido, entende-se que cada valor interveniente, ao décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto dite claramente de outra forma, entre os limites superior e inferior do intervalo e qualquer outro valor declarado ou in- terveniente nesse intervalo declarado é englobado na invenção. Os limites superior e inferior desses intervalos menores podem ser inde-

pendentemente incluídos nos intervalos menores e também são en- globados na invenção, sujeitas a qualquer limite especificamente ex- cluído no intervalo estabelecido. Onde o intervalo estabelecido inclui um ou ambos os limites, os intervalos que excluem qualquer um ou ambos os limites incluídos também são incluídos na invenção.

[0050] Salvo indicação em contrário, os resíduos de anticorpos neste documento são numerados de acordo com o sistema de nume- ração de Kabat (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunologi- cal Interest. 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

[0051] Na seguinte descrição, vários detalhes específicos são es- tabelecidos a fim de estabelecer uma compreensão mais completa da presente invenção. Todavia, ficará evidente para aqueles versados na técnica que a presente invenção pode ser praticada sem um ou mais destes detalhes específicos. Em outros casos, características bem co- nhecidas e procedimentos bem conhecidos por aqueles versados na técnica não foram descritos a fim de não obscurecer a invenção.

[0052] Todas as referências citadas ao longo da divulgação, inclu- indo pedidos de patente e publicações, estão incorporadas neste do- cumento a título de referência em sua totalidade. |. Definições

[0053] Por "compreendendo" entende-se que os elementos indica- dos são necessários na composição/método/Kkit, mas outros elementos podem ser incluídos para formar a composição/método/Kkit etc. dentro do escopo da reivindicação.

[0054] Por "consistindo essencialmente em", entende-se uma limi- tação do âmbito da composição ou método descrito para os materiais especificados ou etapas que não afetam materialmente a(s) caracterís- tica(s) básica(s) e inovadora(s) da presente invenção.

[0055] Por "composto de", entende-se a exclusão da composição,

método ou kit de qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especi- ficado no pedido.

[0056] Os termos "composto de ligação" e "composição de liga- ção", conforme usados indistintamente neste documento, referem-se a uma entidade molecular com afinidade de ligação a um ou mais alvos de ligação. Os compostos de ligação de acordo com as modalidades da invenção podem incluir, sem limitação, anticorpos, domínios de |i- gação a antígeno de anticorpos, fragmentos de anticorpos de ligação a antígeno, moléculas semelhantes a anticorpos, anticorpos de cadeia pesada (por exemplo, UniAbs'Y), ligantes, receptores e semelhantes.

[0057] O termo "anticorpo" é usado neste documento no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais, anticor- pos policlonais, monômeros, dímeros, multímeros, anticorpos multies- pecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos apenas de cadeia pesada, anticorpos de três cadeias, Fv de cadeia única (scFv), nanocorpos, etc, e também incluem fragmentos de anticorpo, desde que exibam a atividade biológica desejada (Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170: 4854-4861). Os anticorpos podem ser muri- nos, humanos, humanizados, quiméricos ou derivados de outras espé- cies.

[0058] O termo anticorpo pode se referir a uma cadeia pesada de comprimento total, uma cadeia leve de comprimento total, uma molé- cula de imunoglobulina intacta; ou uma porção imunologicamente ativa de qualquer destes polipeptídeos, isto é, um polipeptídeo que compre- ende um sítio de ligação ao antígeno que se liga imunoespecificamen- te a um antígeno de um alvo de interesse ou parte do mesmo, incluin- do alvos que incluem, mas não se limitam a, células cancerígenas ou células que produzem anticorpos autoimunes associados a uma doen- ça autoimune. As imunoglobulinas divulgadas neste documento podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), classe

(por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina, incluindo subclasses manipuladas com porções alteradas de Fc que fornecem atividade de células efetoras aprimorada ou reduzida. As cadeias leves dos anticorpos em questão podem ser cadeias leves kappa (Vkappa) ou cadeias leves lambda (Vlambda). As imunoglobulinas podem ser derivadas de qualquer es- pécie. Em um aspecto, a imunoglobulina é de origem amplamente hu- mana.

[0059] Resíduos de anticorpos neste documento são numerados de acordo com o sistema de numeração de Kabat e o sistema de nu- meração da UE. O sistema de numeração de Kabat é geralmente usa- do quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximada- mente resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). O "sistema de numeração EU" ou "índice EU" é geralmente utilizado ao se referir a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de imunoglo- bulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat et al., supra). O "índice UE como em Kabat" refere-se à numeração dos resíduos do anticorpo UE IgG1 humana. A menos que indicado de outra forma nes- te documento, as referências a números de resíduos no domínio variá- vel de anticorpos significam numeração de resíduos pelo sistema de numeração de Kabat. A menos que indicado de outra forma neste do- cumento, as referências a números de resíduos no domínio constante de anticorpos significam numeração de resíduos pelo sistema de nu- meração da EU.

[0060] O termo "anticorpo monoclonal" usado neste documento se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, em que os anticorpos individu- ais que compreendem a população são idênticos exceto pelas muta-

ções de ocorrência natural possíveis que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monocilonais são altamente es- pecíficos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Adicio- nalmente, em contraste com as preparações de anticorpo (policlonal) convencionais que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monocional é dirigido contra um único determinante no antígeno. Os anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção podem ser produzi- dos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, e também pode ser feito através de métodos de produção de proteína recombinante (ver, por exemplo, Patente U.S.

4.816.567), por exemplo.

[0061] O termo "variável", conforme usado em conexão com os anticorpos, refere-se ao fato de que certas porções dos domínios vari- áveis do anticorpo diferem extensivamente na sequência entre os anti- corpos e são usados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não está uniformemente distribuída ao longo dos domínios variáveis dos anticorpos. A variabilidade está concentrada em três segmentos de- nominados regiões hipervariáveis (HVRs), tanto nos domínios variá- veis da cadeia leve como nos domínios variáveis da cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são de- nominadas regiões de framework (FRs). Os domínios variáveis de ca- deias leves e pesadas nativas, cada um, compreendem quatro FRs, amplamente adotando uma configuração de folha B, conectada por três regiões hipervariáveis que formam conexão em alças, e em al- guns casos, formando parte da estrutura de folha B. As regiões hiper- variáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis a partir da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anti-

corpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Inte- rest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo na citoxi- cidade celular dependente de anticorpos (ADCC).

[0062] O termo "região hipervariável", quando usado neste docu- mento, refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável geral- mente compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determi- nante de complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, resíduos 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º edi- ção. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos de uma "alça hipervariável" resíduos 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Os resíduos da "re- gião de framework" ou "FR" são os resíduos de domínio variável que não são os resíduos da região hipervariável como definidos neste do- cumento.

[0063] Designações da CDR exemplificativas são mostradas neste documento, no entanto, um versado na técnica entenderá que uma série de definições das CDRs estão comumente em uso, incluindo a definição de Kabat (ver "Zhao et al. A germline knowledge based com- putational approach for determining antibody complementarity determi- ning regions" Mol Immunol. 2010; 47:694-700), que se baseia na vari- abilidade da sequência e é o mais comumente usado. A definição de Chothia é baseada na localização das regiões de alça estrutural (Chothia et al. "Conformations of immunoglobulin hypervariable re- gions." Nature. 1989; 342:877-883). As definições alternativas de CDR de interesse incluem, sem limitação, aquelas divulgadas por Honegger, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool." J Mol Biol. 2001;309:657- 670; Ofran et al. "Automated identification of complementarity determi- ning regions (CDRs) reveals peculiar characteristics of CDRs and B cell epitopes." J Immunol. 2008;181:6230—6235; Almagro "Identification of differences in the specificity-determining residues of antibodies that recognize antigens of different size: implications for the rational design of antibody repertoires." J Mol Recognit. 2004;17:132—143; d Padlanet al. "Identification of specificity-determining residues in antibodies." Fa- seb J. 1995;9:133—139., cada um dos quais é incorporado neste do- cumento especificamente por referência.

[0064] Os termos "anticorpo apenas de cadeia pesada" e "anticor- po de cadeia pesada" são usados de forma intercambiável neste do- cumento e se referem, no sentido mais amplo, a anticorpos sem a ca- deia leve de um anticorpo convencional. Os termos incluem especifi- camente, sem limitação, anticorpos homodiméricos compreendendo o domínio de ligação ao antígeno VH e os domínios constantes CH2 e CH3, na ausência do domínio CH1; variantes funcionais (de ligação ao antígeno) de tais anticorpos, variantes VH solúveis, I9-NAR compre- endendo um homodímero de um domínio variável (V-NAR) e cinco domínios constantes semelhantes a C (C-NAR) e fragmentos funcio- nais dos mesmos; e anticorpos de domínio único solúveis (sUniDa- bs"Y). Em uma modalidade, um anticorpo apenas de cadeia pesada é composto do domínio de ligação ao antígeno de região variável com- posto por framework 1, CDR1, framework 2, CDR2, framework 3, CDR3 e framework 4. Em outra modalidade, um anticorpo apenas de cadeia pesada é composto de um domínio de ligação ao antígeno, pe- lo menos parte de uma região de dobradiça e domínios CH2 e CH3, a ausência um domínio CH1. Em outra modalidade, o anticorpo apenas de cadeia pesada é composto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e um domínio de CH2. Em uma modalidade adicional, o anticorpo apenas de cadeia pesada é composto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e um domínio de CH3. Os anticorpos apenas de cadeia pesada nos quais o domínio CH2 e/ou CH3 é trun- cado também são incluídos neste documento.

Em uma modalidade adicional, a cadeia pesada é composta de um domínio de ligação ao antígeno e pelo menos um domínio de CH (CH1, CH2, CH3 ou CH4), mas nenhuma região de dobradiça.

Em outra modalidade, a cadeia pesada é composta por um domínio de ligação ao antígeno, pelo me- nos um domínio de CH (CH1, CH2, CH3 ou CH4) e pelo menos uma porção de uma região de dobradiça.

O anticorpo apenas de cadeia pe- sada pode estar na forma de um dímero, no qual duas cadeias pesa- das são ligadas por dissulfeto ou, de outra forma, covalentemente ou não covalentemente ligadas uma à outra.

O anticorpo apenas de ca- deia pesada pode pertencer à subclasse IgG, mas os anticorpos per- tencentes a outras subclasses, como as subclasses IgM, IgA, IgD e IgE, também estão incluídos neste documento.

Em uma modalidade particular, o anticorpo de cadeia pesada é do subtipo I9gG1, IgG2, I9G3 ou IgG4, em particular o subtipo IgG1 ou subtipo IgG4. Em uma moda- lidade, o anticorpo de cadeia pesada é do subtipo IgG4, em que um ou mais dos domínios CH são modificados para alterar uma função efeto- ra do anticorpo.

Em uma modalidade, o anticorpo de cadeia pesada é do subtipo I9gG1, em que um ou mais dos domínios de CH são modifi- cados para alterar uma função efetora do anticorpo.

As modificações dos domínios de CH que alteram a função efetora são descritas adici- onalmente neste documento.

Exemplos não limitativos de anticorpos de cadeia pesada são descritos, por exemplo, em WO2018/039180, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[0065] Em uma modalidade, os anticorpos apenas de cadeia pe- sada neste documento são usados como um domínio de ligação (dire- cionamento) de um receptor de antígeno quimérico (CAR). A definição inclui especificamente anticorpos de cadeia pesada humana produzi- dos por ratos transgênicos de imunoglobulina humana (UniRat"Y), de- nominados UniAbs'Y. As regiões variáveis (VH) de UniAbs'"Y são de- nominadas de UniDabs'Y e são blocos de construção versáteis que podem ser ligados a regiões de Fc ou albumina sérica para o desen- volvimento de novas terapêuticas com multiespecificidade, potência aumentada e meia-vida estendida. Uma vez que o UniAbs'!Y homodi- mérico carece de uma cadeia leve e, portanto, de um domínio de VL, o antígeno é reconhecido por um único domínio, ou seja, o domínio vari- ável (domínio de ligação ao antígeno) da cadeia pesada de um anti- corpo de cadeia pesada (VH).

[0066] Uma "cadeia de anticorpo intacta", como usado neste do- cumento, é aquela que compreende uma região variável de compri- mento total e uma região constante de comprimento total (Fc). Um an- ticorpo "convencional" intacto compreende uma cadeia leve intacta e uma cadeia pesada intacta, assim como um domínio constante de ca- deia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, dobra- diça, CH2 e CH3 para o IgG secretado. Outros isotipos, como IgM ou IgA podem ter diferentes domínios CH. Os domínios constantes po- dem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, do- mínios constantes de sequência nativa humana) ou sequência de ami- noácidos variantes dos mesmos. O anticorpo intacto pode ter uma ou mais "funções efetoras", que se referem às atividades biológicas atri- buíveis à região constante Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc de sequência de aminoácidos variante) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem ligação C1g9; com-

plemento dependente de citotoxicidade; ligação ao receptor Fc; citoto- xicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fago- citose; e regulação negativa de receptores de superfície celular. Vari- antes de região constante incluem aquelas que alteram o perfil efetor, a ligação a receptores Fc e semelhantes.

[0067] Dependendo da sequência de aminoácidos do Fc (domínio constante) das suas cadeias pesadas, podem ser fornecidos anticor- pos e várias proteínas de ligação ao antígeno como classes diferentes. Existem cinco classes principais de regiões Fc de cadeia pesada: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias dessas podem ser divididas em "subclas- ses" (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de Fc que correspondem às diferentes classes de anticorpos podem ser referenciados como qa, ô, e, y e u, respectiva- mente. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensio- nais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. As formas de lg incluem modificações com dobradiça ou formas sem do- bradiça (Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; US 2005/0048572; US 2004/0229310). As cadeias leves de anticorpos (imunoglobulinas) a partir de quaisquer espécies de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos denominados capa (K) e lambda (A), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Os anti- corpos de acordo com as modalidades da invenção podem compreen- der sequências de cadeia leve kappa ou sequências de cadeia leve lambda.

[0068] Uma "região Fc funcional" possui uma "função efetora" de uma região Fc de sequência nativa. Exemplos não limitativos de fun- ções efetoras incluem ligação de C1g; CDC; Ligação do receptor Fc; ADCC; ADCP; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B), etc. Tais funções efetoras geral-

mente requerem que a região Fc interaja com um receptor, por exem- plo, o FoyRI; FoyRIIA; FeyRIIB1; FeyRIIB2; receptores FeyRIIIA; FCyRIIIB e o receptor FcRn de baixa afinidade; e pode ser avaliado usando vários ensaios conhecidos na técnica. Um Fc "morto" ou "si- lenciado" é aquele que sofreu mutação para reter a atividade em rela- ção a, por exemplo, prolongar a meia-vida sérica, mas que não ativa um receptor Fc de alta afinidade ou que tem uma afinidade reduzida para um Receptor Fc.

[0069] Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma se- quência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. As regiões Fc humanas de sequên- cia nativa incluem, por exemplo, uma região Fc de IgG1 humana de sequência nativa (alotipos A e não A); uma região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; uma região Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e uma região Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como variantes de ocorrência natural das mesmas.

[0070] Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere a partir de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, de prefe- rência uma ou mais substituição(ões) de aminoácidos. Preferencial- mente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de ami- noácidos em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferencialmente de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante, neste documento, preferencialmente terá pelo menos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental e, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90% de homologia com as mesmas, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% de homologia com as mesmas.

[0071] As sequências Fc variantes podem incluir três substituições de aminoácidos na região CH2 para reduzir a ligação de FcyRI nas po- sições de índice UE 234, 235 e 237 (ver Duncan et al., (1988) Nature 332: 563). Duas substituições de aminoácidos no sítio complementar de ligação de C1g nas posições de índice da UE 330 e 331 reduzem a fixação de complemento (ver Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993) e Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991)). A substituição em resíduos de IgG1 ou IgG2 humana nas posições 233-236 e resí- duos de IgG4 nas posições 327, 330 e 331 reduz muito ADCC e CDC (ver, por exemplo, Armour KL. et a/., 1999 Eur J Immunol. 29(8):2613- 24; and Shields RL. et a/., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604). A se- quência de aminoácidos de IgG1 humana (UniProtKB Nº PO01857) é fornecida neste documento como SEQ ID NO: 43. A sequência de aminoácidos de IgG4 humana (UniProtKB Nº PO01861) é fornecida nes- te documento como a SEQ ID NO: 44. A IgG1 silenciada é descrita, por exemplo, em Boesch, A.W,, et al., "Highly parallel characterization of IgG Fc binding interactions." MAbs, 2014. 6(4): p. 915-27, cuja di- vulgação é incorporada neste documento por referência em sua totali- dade.

[0072] Outras variantes de Fc são possíveis, incluindo, sem limita- ção, uma em que uma região capaz de formar uma ligação dissulfeto é deletada, ou na qual certos resíduos de aminoácidos são eliminados na extremidade N-terminal de um Fc nativo, ou um resíduo de metioni- na é adicionado a ele. Portanto, em algumas modalidades, uma ou mais porções Fc de um composto de ligação podem compreender uma ou mais mutações na região de dobradiça para eliminar a ligação dis- sulfeto. Em ainda outra modalidade, a região de dobradiça de um Fc pode ser completamente removida. Em ainda outra modalidade, um composto de ligação pode compreender uma variante Fc.

[0073] Além disso, uma variante Fc pode ser construída para re- mover ou reduzir substancialmente as funções efetoras por meio da substituição (mutação), deleção ou adição de resíduos de aminoácidos para efetuar a ligação ao complemento ou ao receptor Fc. Por exem- plo, e sem limitação, uma deleção pode ocorrer em um sítio de ligação ao complemento, como um sítio de ligação a C1q. As técnicas para a preparação de tais derivados de sequência do fragmento Fc de imu- noglobulina são divulgadas nas Publicações de Patentes Internacio- nais WO 97/34631 e WO 96/32478. Além disso, o domínio Fc pode ser modificado por fosforilação, sulfatação, acilação, glicosilação, metila- ção, farnesilação, acetilação, amidação e semelhantes.

[0074] O Fc pode estar na forma de ter cadeias de açúcar nativas, cadeias de açúcar aumentadas em comparação com uma forma nativa ou cadeias de açúcar diminuídas em comparação com a forma nativa, ou pode estar em uma forma aglicosilada ou desglicosilada. O aumen- to, diminuição, remoção ou outra modificação das cadeias de açúcar podem ser alcançados por métodos comuns na técnica, como um mé- todo químico, um método enzimático ou expressando-o em uma linha- gem de células de produção geneticamente modificada. Essas linha- gens de células podem incluir microrganismos, por exemplo, Pichia Pastoris, e linhagens de células de mamíferos, por exemplo, células CHO, que expressam naturalmente enzimas glicosilantes. Além disso, micro-organismos ou células podem ser manipulados para expressar enzimas de glicosilação ou podem ser tornados incapazes de expres- sar enzimas de glicosilação (Ver, por exemplo, Hamilton, et al., Scien- ce, 313: 1441 (2006); Kanda, et al, J. Biotechnology, 130: 300 (2007); Kitagawa, et al., J. Biol. Chem., 269 (27): 17872 (1994); Ujita-Lee et al., J. Biol. Chem., 264 (23): 13848 (1989); Imai-Nishiya, et al, BMC Bio- technology 7:84 (2007); e WO 07/055916). Como um exemplo de uma célula manipulada para ter atividade de sialilação alterada, o gene alfa- 2,6-sialiltransferase 1 foi projetado em células de ovário de hamster chinês e em células sf9. Os anticorpos expressos por essas células modificadas são, portanto, sialilados pelo produto do gene exógeno. Um outro método para obter moléculas Fc com uma quantidade modificada de resíduos de açúcar em comparação com uma pluralidade de molécu- las nativas inclui a separação da referida pluralidade de moléculas em frações glicosiladas e não glicosiladas, por exemplo, usando cromatogra- fia de afinidade de lectina (ver, por exemplo, WO 07/117505). Foi de- monstrado que a presença de porções de glicosilação particulares al- tera a função das imunoglobulinas. Por exemplo, a remoção de cadei- as de açúcar de uma molécula de Fc resulta em uma diminuição acen- tuada na afinidade de ligação à parte C1qg do primeiro componente do complemento C1 e uma diminuição ou perda na citotoxicidade media- da por células dependente de anticorpos (ADCC) ou dependente de complemento citotoxicidade (CDC), não induzindo assim respostas imunes desnecessárias in vivo. Modificações adicionais importantes incluem sialilação e fucosilação: a presença de ácido siálico em IgG foi correlacionada com atividade anti-inflamatória (Ver, por exemplo, Kaneko, et al, Science 313: 760 (2006)), enquanto a remoção de fuco- se das derivações de IgG para aumentar a atividade de ADCC (ver, por exemplo, Shoj-Hosaka, et al, J. Biochem., 140: 777 (2006)).

[0075] Em modalidades alternativas, os conjuntos de ligação da invenção podem ter uma sequência Fc com funções efetoras aprimo- radas, por exemplo, aumentando suas capacidades de ligação a FCyRIIIA e aumentando a atividade de ADCC. Por exemplo, a fucose ligada ao glicano ligado a N em Asn-297 de Fc impede estericamente a interação de Fc com FCyRIIIA e a remoção de fucose por glicoenge- nharia pode aumentar a ligação a FCyRIIIA, que se traduz em ADCC > 50 vezes maior atividade em comparação com controles de IgG1 do tipo selvagem. A manipulação de proteínas, por meio de mutações de aminoácidos na porção Fc de IgG1, gerou múltiplas variantes que au- mentam a afinidade de ligação de Fc a FCyRIIIA. Notavelmente, o mu- tante triplo de alanina S298A/E333A/K334A exibe aumento de 2 vezes na ligação a FCyRIIIA e função de ADCC. As variantes S239D/1332E (2X) e S239D/1332E/A330L (3X) têm um aumento significativo na afini- dade de ligação para FCyRIIIA e aumento da capacidade de ADCC in vitro e in vivo. Outras variantes de Fc identificadas por exibição de le- vedura também mostraram a ligação aprimorada a FCyRIIIA e a morte de células tumorais aumentada em modelos de xenoenxerto de ca- mundongo. Ver, por exemplo, Liu et al. (2014) JBC 289 (6): 3571-920, especificamente incorporado neste documento por referência.

[0076] O termo "anticorpo compreendendo a região Fc" refere-se a um anticorpo que compreende uma região Fc. A lisina do C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração da EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do anticorpo ou por manipulação recombinante do ácido nucleico que codifica o anti- corpo. Consequentemente, um anticorpo com uma região Fc, de acor- do com esta invenção, pode compreender um anticorpo com ou sem K447.

[0077] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, roedores), incluindo anticorpos de cadeia única, são anticor- pos quiméricos (incluindo anticorpos de cadeia única) que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Ver, por exemplo, Jones et al, (1986) Nature 321: 522-525; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877; Riechmann et al (1992) J. Mol. Biol. 224, 487- 499; Foote e Winter, (1992) J. Mol. Biol. 224: 487-499; Presta et al (1993) J. Immunol. 151, 2623-2632; Werther et al (1996) J. Immunol. Methods 157: 4986-4995; e Presta et al (2001) Thromb. Haemost. 85: 379-389. Para mais detalhes, ver Pat. U.S. Nºs 5.225.539; 6.548.640;

6.982.321; 5.585.089; 5.693.761; 6.407.213; Jones et al. (1986) Nature, 321: 522-525; e Riechmann et al (1988) Nature 332: 323-329.

[0078] Aspectos da invenção incluem compostos de ligação com configurações multiespecíficas, que incluem, sem limitação, biespecífi- co, trispecífico, etc. Uma grande variedade de métodos e configura- ções de proteínas são conhecidos e usados em anticorpos monoclo- nais biespecíficos (BSMAB), anticorpos triespecíficos, etc.

[0079] Os aspectos da invenção incluem anticorpos que compre- endem uma região variável apenas da cadeia pesada em uma configu- ração monovalente ou bivalente. Conforme usado neste documento, o termo "configuração monovalente", conforme usado em referência a um domínio de região variável apenas de cadeia pesada, significa que apenas um domínio de região variável apenas de cadeia pesada está presente, tendo um único local de ligação (ver, por exemplo, FIG. 11, Painel D, lado direito da molécula representada). Em contraste, o ter- mo "configuração bivalente", conforme usado em referência a um do- mínio de região variável apenas de cadeia pesada, significa que dois domínios de região variável apenas de cadeia pesada estão presentes (cada um tendo um único sítio de ligação) e estão conectados por uma sequência de ligante (ver, por exemplo, FIG. 11, Painel B, de cada la- do da molécula representada). Exemplos não limitativos de sequências de ligante são discutidos mais adiante neste documento e incluem, sem limitação, sequências de ligante GS de vários comprimentos. Quando uma região variável apenas de cadeia pesada está em uma configuração bivalente, cada um dos dois domínios de região variável apenas de cadeia pesada pode ter afinidade de ligação para o mesmo antígeno ou para diferentes antígenos (por exemplo, para diferentes epitopos na mesma proteína; para duas proteínas diferentes, etc.). No entanto, a menos que especificamente indicado de outra forma, uma região variável apenas de cadeia pesada denotada como estando em uma "configuração bivalente" é entendida como contendo dois domí- nios de região variável apenas de cadeia pesada idênticos, conecta- dos por uma sequência de ligante, em que cada um dos dois domínios pesados idênticos domínios de região variável apenas de cadeia têm afinidade de ligação para o mesmo antígeno alvo.

[0080] Vários métodos para a produção de anticorpos artificiais multivalentes foram desenvolvidos por fusão recombinante de domí- nios variáveis de dois ou mais anticorpos. Em algumas modalidades, um primeiro e um segundo domínio de ligação ao antígeno em um po- lipeptídeo são conectados por peptídeo de ligação polipeptídica. Um exemplo não limitativo de tal peptídeo de ligação polipeptídico é um peptídeo de ligação GS, tendo uma sequência de aminoácidos de qua- tro resíduos de glicina, seguido por um resíduo de serina, e em que a sequência é repetida n vezes, em que n é um número inteiro variando de 1 a cerca de 10, tal como 2, 3, 4, 5, 6,7, 8 ou 9. Exemplos não limi- tativos de tais peptídeo de ligação incluem GGGGS (SEQ ID NO: 29) (n=1) e GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 45) (n=2). Outros ligantes ade- quados também podem ser usados e são descritos, por exemplo, em Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013, 15 de outubro; 65(10):1357-69, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[0081] O termo "molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico" ou "TCA" é utilizado neste documento para fazer referên- cia a moléculas semelhantes a anticorpos compreendendo, consistin- do essencialmente em ou consistindo em três subunidades polipeptídi- cas, duas das quais compreendem, consistem essencialmente em ou consistem em uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo monoclonal ou fragmentos funcionais de ligação ao antígeno de tais cadeias de anticorpo, compreendendo uma região de ligação ao antí- geno e pelo menos um domínio de CH. Este par cadeia pesada/cadeia leve tem especificidade de ligação a um primeiro antígeno.

Em algu- mas modalidades, um TCA compreende uma subunidade polipeptídica de cadeia leve compreendendo uma sequência de CDR1 de SEQ ID NO: 49, uma sequência de CDR2 de SEQ ID NO: 50 e uma sequência de CDR3 de SEQ ID NO: 51, em uma estrutura de cadeia leve huma- na.

Em algumas modalidades, a estrutura da cadeia leve humana é uma estrutura kappa humana (Vkappa) ou lambda humana (Vlambda). Em algumas modalidades, um TCA compreende uma subunidade po- lipeptídica de cadeia leve compreendendo uma região variável de ca- deia leve (VL) compreendendo uma sequência com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, um TCA compreende uma subunidade polipeptídica de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, um TCA compreende uma subunidade polipeptídica de cadeia leve que compreende uma região constante de cadeia leve (CL). Em algumas modalidades, a re- gião constante de cadeia leve é uma região constante de cadeia leve kappa humana ou uma região constante de cadeia leve lambda huma- na.

Em algumas modalidades, um TCA compreende uma subunidade polipeptídica de cadeia leve compreendendo uma cadeia level comple- ta compreendendo uma sequência com pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, um TCA compreende uma subuni- dade polipeptídica de cadeia leve que compreende a sequência de SEQ ID NO: 48. A terceira subunidade polipeptídica compreende, con- siste essencialmente em, ou consiste em um anticorpo apenas de ca- deia pesada compreendendo uma porção Fc compreendendo domií- nios de CH2 e/ou CH3 e/ou CH4, na ausência de um domínio de CH1, e um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um epitopo de um segundo antígeno, ou um epitopo diferente do primeiro antígeno, em que tal domínio de ligação é derivado de ou tem identidade de se- quência com a região variável de uma cadeia pesada ou leve do anti- corpo. Partes de tal região variável podem ser codificadas por seg- mentos gênicos Vx e/ou V., segmentos gênicos D e Jr ou segmentos gênicos J.. A região variável pode ser codificada pelos segmentos gê- nicos VHDJn, VLDJH, VnJL, ou VLyJ, rearranjados.

[0082] Um composto de ligação de TCA faz uso de um "anticorpo apenas de cadeia pesada" ou "anticorpo de cadeia pesada" ou "poli- peptídeo de cadeia pesada" que, como utilizado neste documento, significa um anticorpo de cadeia única compreendendo regiões cons- tantes de cadeia pesada CH2 e/ou CH3 e/ou CH4, mas nenhum domí- nio de CH1. Em uma modalidade, o anticorpo de cadeia pesada é composto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e domínios de CH2 e CH3. Em outra mo- dalidade, o anticorpo de cadeia pesada é composto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e um domínio de CH2. Em uma modalidade adicional, o anticorpo de cadeia pesada é composto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e um domínio de CH3. Anticorpos de cadeia pesada nos quais o domínio CH2 e/ou CH3 é truncado também são incluídos neste documento. Em uma modalidade adicional, a cadeia pesada é composta de um domínio de ligação ao antígeno e pelo menos um domínio de CH (CH1, CH2, CH3 ou CH4), mas nenhuma região de dobradiça. O anticorpo apenas de cadeia pe- sada pode estar na forma de um dímero, no qual duas cadeias pesa- das são ligadas por dissulfeto ou, de outra forma, covalentemente ou não covalentemente ligadas uma à outra, e podem opcionalmente in- cluir uma interface assimétrica entre dois ou mais dos domínios de CH para facilitar o emparelhamento adequado entre as cadeias polipeptí- dicas. O anticorpo apenas de cadeia pesada pode pertencer à sub-

classe IgG, mas os anticorpos pertencentes a outras subclasses, como as subclasses IgM, IgA, IgD e IgE, também estão incluídos neste do- cumento. Em uma modalidade particular, o anticorpo de cadeia pesa- da é do subtipo I9gG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, em particular do subtipo I9gG1 ou subtipo IgG4. Exemplos não limitativos de um composto de ligação a TCA são descritos, por exemplo, em WO2017/223111 e WOZ2018/052503, cujas divulgações são incorporadas neste documen- to por referência em sua totalidade.

[0083] Os anticorpos de cadeia pesada constituem cerca de um quarto dos anticorpos IgG produzidos pelos camelídeos, por exemplo, camelos e lamas Hamers-Casterman C.,, et al. Nature. 363, 446-448 (1993)). Estes anticorpos são formados por duas cadeias pesadas, mas são desprovidos de cadeias leves. Como consequência, a parte variável de ligação ao antígeno é referida como o domínio de VHH e representa o menor sítio de ligação ao antígeno intacto de ocorrência natural, que é cerca de apenas 120 aminoácidos em comprimento (Desmyter, A., et al. J. Biol. Chem. 276, 26285-26290 (2001)). Os anti- corpos de cadeia pesada com alta especificidade e afinidade podem ser gerados contra uma variedade de antígenos por meio de imuniza- ção (van der Linden, RH, et al. Biochim. Biophys. 1431, 37-46 (1999)), e a porção de VHH pode ser facilmente clonada e expressa em leve- dura (Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). Os seus níveis de expressão, solubilidade e estabilidade são significativamente mais elevados do que os dos fragmentos F(ab) ou Fv clássicos (Ghahroudi, MA et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)). Também foi demonstrado que os tubarões possuem um único domínio semelhante ao VH em seus anticorpos, denominado VNAR. (Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al. Function and Bioinfor- matics 55, 187-197 (2004); Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)).

[0084] O termo "interface", conforme usado neste documento, é usado para referir-se a uma região, que compreende aqueles resíduos de aminoácidos de "contato" (ou outros grupos não aminoácidos, como, por exemplo, grupos de carboidratos) em uma primeira região constan- te de cadeia pesada que interage com um ou mais resíduos de amino- ácidos de "contato" (ou outros grupos não aminoácidos) em uma se- gunda região constante de cadeia pesada.

[0085] O termo "interface assimétrica" é usado para se referir a uma interface (como definido acima) formada entre duas cadeias poli- peptídicas, como uma primeira e uma segunda região constante de cadeia pesada e/ou entre uma região constante de cadeia pesada e sua cadeia leve correspondente, em que os resíduos de contato na primeira e na segunda cadeias são diferentes por projeto, compreen- dendo resíduos de contato complementares. A interface assimétrica pode ser criada, por exemplo, por interações de botões/orifícios e/ou acoplamento de pontes salinas (troca de carga) e/ou outras técnicas conhecidas na técnica.

[0086] Uma "cavidade" ou "hole" refere-se a, pelo menos, uma ca- deia lateral de aminoácido, que é rebaixada a partir da interface do se- gundo polipeptídeo e, por conseguinte, acomoda uma protuberância ("knob") correspondente na interface adjacente do primeiro polipeptí- deo. A cavidade (hole) pode estar na interface original ou pode ser in- troduzida sinteticamente (por exemplo, alterando o ácido nucleico que codifica o resíduo de interface). Normalmente, um ácido nucleico que codifica a interface do segundo polipeptídeo é alterado para codificar a cavidade. Para conseguir isto, o ácido nucleico que codifica pelo me- nos um resíduo de aminoácido "original" na interface do segundo poli- peptídeo é substituído por DNA que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido "importado" que tem um volume de cadeia lateral me- nor do que o resíduo de aminoácido original. Será apreciado que pode haver mais do que um resíduo importado original e correspondente. O limite superior para o número de resíduos originais que são substituí- dos é o número total de resíduos na interface do segundo polipeptídeo. Os resíduos importados preferenciais para a formação de uma cavida- de são normalmente resíduos de aminoácidos de ocorrência natural e são, de preferência, selecionados a partir de alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V) e glicina (G). Os resíduos de aminoácidos mais preferidos são serina, alanina ou treonina, mais preferencialmente ala- nina. Em uma modalidade preferencial, o resíduo original para a for- mação da protuberância tem um grande volume de cadeia lateral, co- mo tirosina (Y), arginina (R), fenilalanina (F) ou triptofano (W). As inter- faces assimétricas são descritas em detalhes, por exemplo, em Xu et al., "Production of bispecific antibodies in “knobs-into-holes' using a cell-free expression system", MAbs. 2015, 7(1):231-42, cuja divulgação é incorporada por referência neste documento em sua totalidade.

[0087] O termo "CD38", conforme usado neste documento, refere- se a uma proteína transmembrana tipo Il de passagem única com ati- vidades ectoenzimáticas, também conhecida como ADP-ribosil ci- clase/ADP-ribose hidrolase cíclica 1. O termo "CD38" inclui uma prote- ína CD38 de qualquer ser humano ou espécies animais não humanas, e especificamente inclui CD38 humano, bem como CD38 de mamiífe- ros não humanos.

[0088] O termo "CD38 humano", conforme usado neste documen- to, inclui quaisquer variantes, isoformas e espécies homólogas de CD38 humano (UniProt P28907), independentemente de sua fonte ou modo de preparo. Assim, "CD38 humano" inclui CD38 humano ex- presso naturalmente pelas células e CD38 expresso em células trans- fectadas com o gene CD38 humano.

[0089] Os termos "anticorpo apenas de cadeia pesada anti-CD38", "anticorpo apenas de cadeia pesada CD38", "anticorpo de cadeia pe-

sada anti-CD38" e "anticorpo de cadeia pesada CD38" são usados neste documento indistintamente para se referir a um anticorpo ape- nas de cadeia pesada como definido acima neste documento, ligação imunoespecificamente a CD38, incluindo CD38 humano, como defini- do acima neste documento. A definição inclui, sem limitação, anticor- pos de cadeia pesada humana produzidos por animais transgênicos, tais como ratos transgênicos ou camundongos transgênicos que ex- pressam imunoglobulina humana, incluindo UniRats'M produzindo an- ticorpos UniAb!"M humanos anti-CD38, como definido acima neste do- cumento.

[0090] "Identidade de sequência de aminoácidos percentual (%)" em relação a uma sequência polipeptídica de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que é idêntica aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e in- trodução de lacunas, se necessário, para atingir a identidade de se- quência percentual máxima, e não levando em consideração quais- quer substituições conservativas como parte da identidade de sequên- cia. O alinhamento para fins de determinação do percentual de identi- dade da sequência de aminoácidos pode ser atingido de muitas for- mas no estado da técnica, por exemplo, usando software de computa- dor livre, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar parâmetros apropria- dos para o alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo sobre o comprimento total das sequências sendo comparadas. Para a finalidade deste do- cumento, no entanto, os valores % de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa de computador de com- paração de sequência ALIGN-2.

[0091] Um composto de ligação "isolado" (como um anticorpo iso-

lado) é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam nos usos diag- nósticos ou terapêuticos para o composto de ligação, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em algumas modalidades preferidas, o composto de ligação será purifica- do (1) a mais de 95% em peso do composto de ligação, conforme de- terminado pelo método de Lowry e, mais preferencialmente, mais de 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resí- duos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interna pela utiliza- ção de um sequenciador de copo giratório ou (3) à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução usando corante Coomassie azul ou, preferencialmente, prata. O composto de ligação isolado inclui o composto de ligação in situ dentro das células recom- binantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natu- ral do composto de ligação não estará presente. Normalmente, contu- do, o composto de ligação isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[0092] Os compostos de ligação de acordo com as modalidades da invenção incluem compostos de ligação multiespecíficos. Os com- postos de ligação multiespecíficos têm mais de uma especificidade de ligação. O termo "multiespecífico" inclui especificamente "biespecífico" e "triespecífico", bem como afinidades de ligação específicas indepen- dentes de ordem superior, como especificidade poliepitópica de ordem superior, bem como compostos de ligação tetravalente e fragmentos de ligação ao antígeno de compostos de ligação (por exemplo, anti- corpos e fragmentos de anticorpos). Os compostos de ligação "multi- específicos" incluem especificamente anticorpos que compreendem uma combinação de diferentes entidades de ligação, bem como anti- corpos que compreendem mais do que um da mesma entidade de li-

gação. Os termos "anticorpo multiespecífico", "anticorpo multiespecíifi- co apenas de cadeia pesada", "anticorpo multiespecífico de cadeia pe- sada", e "UniAb!M multiespecífico" são usados neste documento na forma mais ampla e abrangem todos os anticorpos com mais de uma especificidade de ligação. Os anticorpos anti-CD38 de cadeia pesada multiespecíficos da presente invenção incluem especificamente anti- corpos que se ligam imunoespecificamente a dois ou mais epitopos não sobrepostos em uma proteína CD38, tal como um CD38 humano.

[0093] Um "epitopo" é o sítio na superfície de uma molécula de antígeno ao qual se liga uma região de ligação ao antígeno de um composto de ligação. Geralmente, um antígeno tem vários ou muitos epitopos diferentes e reage com muitos compostos de ligação diferen- tes (por exemplo, muitos anticorpos diferentes). O termo inclui especi- ficamente epitopos lineares e epitopos conformacionais.

[0094] "Mapeamento de epitopos" é o processo de identificação dos sítios de ligação ou epitopos de anticorpos em seus antígenos- alvo. Os epitopos de anticorpo podem ser epitopos lineares ou epito- pos conformacionais. Os epitopos lineares são formados por uma se- quência contínua de aminoácidos em uma proteína. Os epitopos con- formacionais são formados por aminoácidos que são descontínuos na sequência proteica, mas que são reunidos mediante a drobragem da proteína na sua estrutura tridimensional.

[0095] "Especificidade poliepitópica" refere-se à capacidade de se ligar especificamente a dois ou mais epitopos diferentes no(s) mes- mo(s) ou diferente(s) alvo(s). Conforme observado acima, a presente invenção inclui especificamente anticorpos de cadeia pesada anti- CD38 com especificidades poliepitópicas, isto é, anticorpos de cadeia pesada anti-CD38 que se ligam a dois ou mais epitopos não sobrepos- tos em uma proteína CD38, como um CD38 humano. O termo "epito- po(s) não sobreposto(s)" ou "epitopo(s) não competitivo(s)" de um an-

tígeno é definido neste documento para significar epitopo(s) que são reconhecidos por um membro de um par de anticorpos específicos do antígeno, mas não o outro membro. Pares de anticorpos, ou regiões de ligação ao antígeno direcionadas ao mesmo antígeno em um anti- corpo multiespecífico, que reconhecem epitopos não sobrepostos, não competem pela ligação a esse antígeno e são capazes de se ligar a esse antígeno simultaneamente.

[0096] Um composto de ligação se liga "essencialmente ao mesmo epitopo" que um composto de ligação de referência (por exemplo, um anticorpo de referência), quando o composto de ligação e o anticorpo de referência reconhecem epitopos idênticos ou estericamente sobre- postos. Os métodos mais amplamente usados e rápidos para determi- nar se dois epitopos se ligam a epitopos idênticos ou estericamente sobrepostos são ensaios de competição, que podem ser configurados em vários formatos diferentes, usando antígeno marcado ou anticorpo marcado. Normalmente, o antígeno é imobilizado em uma placa de 96 poços, e a capacidade dos anticorpos não marcados de bloquear a ligação dos anticorpos marcados é medida usando marcadores radioa- tivos ou enzimáticos.

[0097] O termo "competir", conforme usado neste documento com relação a um composto de ligação (por exemplo, um anticorpo) e um composto de ligação de referência (por exemplo, um anticorpo de refe- rência) significa que o composto de ligação causa cerca de 15-100% de redução na ligação do composto de ligação de referência para o antígeno alvo, conforme determinado por técnicas padrão, tal como pelos ensaios de ligação de competição descritos neste documento.

[0098] O termo "grupo de competição", conforme usado neste do- cumento, refere-se a dois ou mais compostos de ligação (por exemplo, um primeiro e um segundo anticorpo) que se ligam ao mesmo antíge- no alvo (ou epitopo) e que competem com os membros do grupo de competição pela ligação a o antígeno alvo. Os membros do mesmo grupo de competição competem uns com os outros pela ligação a um antígeno alvo, mas não têm necessariamente a mesma atividade fun- cional.

[0099] O termo "valente", tal como utilizado neste documento, refe- re-se a um número específico de sítios de ligação em uma molécula de anticorpo ou composto de ligação.

[00100] Um composto de ligação "multivalente" tem dois ou mais sítios de ligação. Assim, os termos "bivalente", "trivalente" e "tetrava- lente" referem-se à presença de dois sítios de ligação, três sítios de ligação e quatro sítios de ligação, respectivamente. Assim, um anticor- po biespecífico, de acordo com a invenção, é pelo menos bivalente e pode ser trivalente, tetravalente ou de outra forma multivalente. Uma grande variedade de métodos e configurações de proteínas são co- nhecidos e usados para a preparação de anticorpos monoclonais bi- específicos (BSMAB), anticorpos triespecíficos e semelhantes.

[00101] O termo "receptor de antígeno quimérico" ou "CAR" é usa- do neste documento no sentido mais amplo para se referir a um recep- tor manipulado, que enxerta uma especificidade de ligação desejada (por exemplo, a região de ligação ao antígeno de um anticorpo mono- clonal ou outro ligante) à membrana abrangendo e domínios de sinali- zação intracelular. Normalmente, o receptor é usado para enxertar a especificidade de um anticorpo monoclonal em uma célula T para criar um receptor de antígeno quimérico (CAR). (Dai et al., J Natl Cancer Inst, 2016; 108(7): djv439; e Jackson et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 2016; 13:370-383).

[00102] O termo "anticorpo humano" é usado neste documento para incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas a partir das sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos, neste documento, podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da li- nhagem germinativa humana, por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do in vitro ou por mutação somáti- ca in vivo. O termo "anticorpo humano" inclui especificamente anticor- pos apenas de cadeia pesada com sequências de região variável de cadeia pesada humana, produzidas por animais transgênicos, como ratos ou camundongos transgênicos, em particular UniAbs'Y produzido por UniRats'Y, conforme definido acima.

[00103] Por um "anticorpo quimérico" ou uma "imunoglobulina qui- mérica" entende-se uma molécula de imunoglobulina compreendendo sequências de aminoácidos a partir de pelo menos dois loci de lg dife- rentes, por exemplo, um anticorpo transgênico compreendendo uma porção codificada por um locus de Ig humano e uma porção codificada por um locus de lg de rato. Os anticorpos quiméricos incluem anticor- pos transgênicos com regiões Fc não humanas ou regiões Fc artificiais e idiotipos humanos. Essas imunoglobulinas podem ser isoladas de animais da invenção que foram manipulados para produzir tais anti- corpos quiméricos.

[00104] Conforme usado neste documento, o termo "célula efetora" refere-se a uma célula imune que está envolvida na fase efetora de uma resposta imune, em oposição às fases cognitivas e de ativação de uma resposta imune. Algumas células efetoras expressam recepto- res Fc específicos e realizam funções imunológicas específicas. Em algumas modalidades, uma célula efetora, como uma célula assassina natural, é capaz de induzir citotoxicidade celular dependente de anti- corpo (ADCC). Por exemplo, monócitos e macrófagos, que expressam FcR, estão envolvidos na eliminação específica de células-alvo e na apresentação de antígenos a outros componentes do sistema imuno- lógico, ou na ligação a células que apresentam antígenos. Em algu- mas modalidades, uma célula efetora pode fagocitar um antígeno alvo ou célula alvo.

[00105] "Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam receptores, como receptores de células T ou FcRs, e desempenham funções efetoras. Preferivelmente, as células expressam pelo menos FecyRIIl e executam a função efetora de ADCC. Exemplos de leucóci- tos humanos que medeiam ADCC incluem células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; sendo as células NK as preferidas. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa das mesmas, por exemplo, de sangue ou PBMC, tal como descrito neste documento.

[00106] O termo "célula imune" é usado neste documento no senti- do mais amplo, incluindo, sem limitação, células de origem mieloide ou linfoide, por exemplo, linfócitos (tais como células B e células T inclu- indo células T citolíticas (CTLs)), células assassinas, células assassi- nas naturais (NK), macrófagos, monócitos, eosinófilos, células polimor- fonucleares, como neutrófilos, granulócitos, mastócitos e basófilos.

[00107] "Funções efetoras" de anticorpos referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc variante de sequência de aminoácido) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras do anticorpo incluem a ligação de C1q, a citotoxicidade dependente de complemento; a ligação do receptor de Fc; a citotoxicidade mediata por célula dependente de anticorpo (ADCC); a fagocitose; a regulação negativa dos receptores da superfí- cie celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc.

[00108] "citotoxicidade mediada por células dependente de anticor- po" e "ADCC" referem-se a uma reação mediada por células na qual as células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FCcR) (por exemplo, células assassinas naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado a uma célula alvo e sub- sequentemente causam a lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam FcyRIll apenas, enquanto mo- nócitos expressam FecyRI, FeyRII e FeyRIll. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio ADCC in vitro pode ser realizado, tal como descrito na Patente US 5.500.362 ou

5.821.337. As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

[00109] "Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" re- fere-se à capacidade de uma molécula de lisar um alvo na presença de complemento. A via de ativação do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1g9) a uma molécula (por exemplo um anticorpo) complexado com um antí- geno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser realizado.

[00110] "Afinidade de ligação" refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma mo- lécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, como usado neste documento, "afinidade de ligação" se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X com seu parceiro Y geralmente pode ser represen- tada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica. Os anticorpos de baixa afinidade geralmente se ligam ao antígeno lentamente e tendem a se dissociar facilmente, enquanto os anticorpos de alta afinidade geral- mente se ligam ao antígeno mais rapidamente e tendem a permanecer ligados.

[00111] Tal como utilizado neste documento, o "Kd" ou "valor Kd" refere-se a uma constante de dissociação determinada por Interfero- metria BioLayer, usando um instrumento Octet QK384 (Fortebio Inc., Menlo Park, CA) no modo cinético. Por exemplo, os sensores Fc anti- camundongo são carregados com antígeno fundido com Fc de ca- mundongo e, em seguida, mergulhados em poços contendo anticorpos para medir as taxas de associação dependente da concentração (kon). As taxas de dissociação de anticorpos (koff) são medidas na etapa fi- nal, onde os sensores são mergulhados em poços contendo apenas tampão. O Kd é a razão de koff/kon. (Para obter mais detalhes, ver Concepcion, J, et al., Comb Chem High Throughput Screen, 12(8), 791-800, 2009).

[00112] Os termos "tratamento" e "tratar" e semelhantes são usados neste documento para geralmente significar a obtenção do efeito far- macológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção completa ou parcial de uma doença ou um sin- toma do mesmo e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa de uma doença e/ou efeito adverso atribuído à do- ença. "Tratamento", conforme usado neste documento, abrange qual- quer tratamento de uma doença em um mamífero, e inclui: (a) prevenir que a doença ocorra em um sujeito que possa ser predisposto à doen- ça, mas que ainda não tenha sido diagnosticado como a tendo; (b) ini- bir a doença, isto é, interromper o seu desenvolvimento; ou (c) aliviar a doença, isto é, causar a regressão da doença. O agente terapêutico pode ser administrado antes, durante ou após a aparição da doença ou lesão. O tratamento da doença em curso, em que o tratamento es-

tabiliza ou reduz os sintomas clínicos indesejáveis do paciente, é de particular interesse. Tal tratamento é desejavelmente realizado antes da completa perda de função nos tecidos afetados. A terapia em ques- tão pode ser administrada durante a fase sintomática da doença e, em alguns casos, após a fase sintomática da doença.

[00113] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é destinada a uma quantidade de agente ativo que é necessária para transmitir be- nefício terapêutico a um sujeito. Por exemplo, uma "quantidade tera- peuticamente eficaz" é uma quantidade que induz, melhora ou de ou- tra forma causa uma melhora nos sintomas patológicos, progressão da doença ou condições fisiológicas associadas a uma doença ou que melhora a resistência a um distúrbio.

[00114] Os termos "neoplasias de células B" ou "neoplasias de cé- lulas B maduras" no contexto da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, todas as leucemias linfoides e linfomas, leucemia linfocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia prolinfocítica, leucemia linfoblástica precursora B, leucemia de células ciliadas, lin- foma linfocítico pequeno, linfoma prolinfocítico de células B, leucemia linfocítica crônica de células B, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), mieloma múltiplo, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de zona marginal esplênica, neoplasias de células plasmáticas, como mieloma de célu- las plasmáticas, plasmocitoma, doença de deposição de imunoglobuli- na monoclonal, doença da cadeia pesada, linfoma MALT, linfoma no- dal marginal de células B, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de efusão primária, linfomatoide granulomatose Linfoma não Hodgkins, linfoma de Hodgkins, leucemia de células ciliadas, linfoma primário de efusão e linfoma não Hodgkins relacionado à AIDS.

[00115] O termo "colite", conforme usado neste documento, refere- se amplamente a um distúrbio caracterizado pela inflamação do reves-

timento do cólon. Conforme usado neste documento, "colite" inclui coli- te autoimune, que pode ser causada por doença inflamatória do intes- tino, colite ulcerosa ou doença de Crohn; colite induzida por tratamento, como colite de desvio, colite química, colite induzida por quimioterapia ou colite que é induzida por tratamento com um ou mais agentes tera- pêuticos, por exemplo, PD-1/PD-L1, CTLA-4, TIGIT, TIM-3, LAG-3 e outros inibidores do checkpoint imunológico; doença vascular, como colite isquêmica; colite infecciosa, como colite infecciosa causada por Clostridium difficile, toxina Shiga ou infecção parasitária (por exemplo, Entamoeba histolytica); colite de origem desconhecida, por exemplo, colite microscópica, colite linfocítica ou colite colagenosa; ou colite atí- pica (ou seja, colite que não está em conformidade com os critérios para tipos de colite clinicamente aceitos).

[00116] O termo "lesão isquêmica", conforme usado neste docu- mento, refere-se a qualquer lesão causada pela diminuição do fluxo sanguíneo para um tecido. Lesões isquêmicas incluem, mas não estão limitadas a, lesão cerebral isquêmica, lesão cardíaca isquêmica, lesão renal isquêmica, lesão gastrointestinal (GI) isquêmica, etc.

[00117] Os termos "sujeito", "indivíduo" e "paciente" são usados neste documento indistintamente para se referir a um mamífero sendo avaliado para tratamento e/ou sendo tratado. Em uma modalidade, o mamífero é um ser humano. Os termos "sujeito", "indivíduo" e "pacien- te" abrangem, sem limitação, indivíduos com câncer e/ou indivíduos com doenças autoimunes, e semelhantes. Os sujeitos podem ser hu- manos, mas também incluem outros mamíferos, particularmente aque- les mamíferos úteis como modelos de laboratório para doenças huma- nas, por exemplo: camundongo, rato, etc.

[00118] O termo "formulação farmacêutica" se refere a uma prepa- ração cuja forma permite que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos a um sujeito ao qual a formulação seria ad- ministrada. Essas formulações são estéreis. Excipientes "farmaceuti- camente aceitáveis" (veículos, aditivos) são aqueles que podem ser razoavelmente administrados a um sujeito mamífero para fornecer uma dose eficaz do ingrediente ativo empregado.

[00119] Os termos "sinergia" e "sinérgica", conforme usados neste documento, referem-se a uma combinação de dois ou mais compo- nentes individuais (por exemplo, dois ou mais anticorpos de cadeia pesada) que são juntos mais eficazes na obtenção de um determinado resultado (por exemplo, uma redução na hidrolase atividade) em com- paração com os resultados alcançados quando os dois ou mais com- ponentes individuais são usados separadamente. Por exemplo, uma combinação sinérgica de dois ou mais anticorpos de cadeia pesada de bloqueio de hidrolase é mais eficaz na inibição da atividade de hidro- lase do que qualquer um dos anticorpos de cadeia pesada de bloqueio de hidrolase individuais quando usados separadamente. Da mesma forma, uma combinação terapêutica sinérgica é mais eficaz do que os efeitos de dois ou mais agentes únicos que constituem a combinação terapêutica. A determinação de uma interação sinérgica entre dois ou mais agentes individuais em uma combinação terapêutica pode ser baseada nos resultados obtidos a partir de vários ensaios conhecidos na técnica. Os resultados destes ensaios podem ser analisados usan- do o método de combinação de Chou e Talalay e Análise de Efeito de Dose com software CalcuSyn para obter um Índice de Combinação "CI" (Chou e Talalay (1984) Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55). Uma tera- pia combinada pode fornecer "sinergia" e se apresentar como "sinérgi- ca", isto é, o efeito obtido quando os ingredientes ativos usados em conjunto são maiores do que os efeitos que resultam do uso dos com- postos separadamente. Um efeito sinérgico pode ser obtido quando os ingredientes ativos são: (1) coformulados e administrados ou distribuí-

dos simultaneamente em uma formulação de dosagem unitária combi- nada; (2) administrada pela alteração como formulações separadas ou (3) por algum outro regime. Quando administrados em uma terapia de alternação, um efeito sinérgico pode ser obtido quando os compostos são administrados ou distribuídos subsequencialmente, por exemplo, por diferentes injeções em seringas separadas. Em geral, durante a terapia de alternação, uma dosagem eficaz de cada ingrediente ativo é administrada sequencialmente, isto é, em série no tempo.

[00120] Uma formulação "estéril" é asséptica ou livre, ou essenci- almente livre, de todos os microorganismos que vivem e seus esporos. Uma formulação "congelada" é aquela a uma temperatura abaixo de 0ºC.

[00121] Uma formulação "estável" é aquela na qual a proteína man- tém essencialmente a sua estabilidade física e/ou a estabilidade quíi- mica e/ou a atividade biológica mediante o armazenamento. De prefe- rência, a formulação retém essencialmente a sua estabilidade física e química, bem como a sua atividade biológica mediante o armazena- mento. O período de armazenamento é geralmente selecionado com base na vida em prateleira pretendida da formulação. Várias técnicas analíticas para medir a estabilidade da proteína estão disponíveis na técnica e são revistas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301. Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones. A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90) (1993), por exemplo. A estabilidade pode ser medida em uma temperatura selecionada du- rante um período de tempo selecionado. A estabilidade pode ser avali- ada qualitativamente e/ou quantitativamente em uma variedade de maneiras diferentes, incluindo avaliação da formação de agregados (por exemplo, usando cromatografia de exclusão de tamanho, medin- do a turbidez e/ou por inspeção visual); avaliando a heterogeneidade de carga usando cromatografia de troca catiônica, focagem isoelétrica capilar de imagem (iclEF) ou eletroforese de zona capilar; análise de sequência amino-terminal ou carboxi-terminal; análise espectrométrica de massa; análise SDS-PAGE para comparar o anticorpo reduzido e intacto; análise de mapa de péptidos (por exemplo, tríptico ou LYS-C); avaliar a atividade biológica ou função de ligação ao antígeno do anti- corpo; etc. A instabilidade pode envolver qualquer um ou mais de: agregação, desamidação (por exemplo, desamidação Asn), oxidação (por exemplo, oxidação de Met), isomerização (por exemplo, isomeria- ção Asp), corte/hidrólise/fragmentação (por exemplo, fragmentação da região de dobradiça), formação de succinimida, cisteína(s) não parea- da(s), extensão N-terminal, processamento C-terminal, diferenças de glicosilação, etc.

Il.Descrição Detalhada

[00122] A invenção é baseada, pelo menos em parte, na descober- ta de que compostos de ligação, tais como anticorpos de cadeia pesa- da, que têm especificidade de ligação a um ou mais epitopos em uma ectoenzima podem ser usados para lisar células tumorais e/ou inibir a atividade enzimática de uma ectoenzima alvo. A invenção também se baseia, pelo menos em parte, na descoberta de que os compostos de ligação, ou combinações dos mesmos, que têm especificidade de liga- ção a pelo menos dois epitopos não sobrepostos em uma ectoenzima (por exemplo, multiespecífico, por exemplo, compostos de ligação bi- específicos) funcionam sinergicamente para lisar células tumorais e/ou modular (por exemplo, inibir) a atividade enzimática da ectoenzima al- vo. Aspectos da invenção, portanto, se referem a compostos de liga- ção, incluindo, sem limitação, compostos de ligação monoespecíficos com especificidade de ligação a um único alvo (por exemplo, um único epitopo em uma ectoenzima), bem como compostos de ligação multi- específicos (por exemplo, biespecíficos) com especificidade de ligação a pelo menos dois alvos (por exemplo, um primeiro e um segundo epi-

topo em uma ectoenzima). Aspectos da invenção também se referem a combinações terapêuticas dos compostos de ligação descritos neste documento, bem como métodos de preparação e uso de tais compos- tos de ligação. Ectoenzimas

[00123] As ectoenzimas são um grupo diverso de proteínas de membrana com sítios catalíticos fora da membrana plasmática. Muitas ectoenzimas são encontradas em leucócitos e células endoteliais, on- de desempenham vários papéis biológicos. Além da atividade catalíti- ca extracelular que é comum a todos, as ectoenzimas são uma classe diversa de moléculas que estão envolvidas em tipos muito diferentes de reações enzimáticas. Diferentes ectoenzimas podem modular cada etapa das interações de contato leucócito-endotelial, bem como a sub- sequente migração celular nos tecidos. As ectoenzimas incluem, sem limitação, CD38, CD10, CD13, CD26, CD39, CD73, CD156b, CD156c, CD157, CD203, VAP1, ART2 e MT1-MMP.

[00124] A ectoenzima CD38 pertence à família das enzimas meta- bolizadoras de nucleotídeos que, além de reciclar nucleotídeos, geram compostos que controlam a homeostase e o metabolismo celular. À atividade catalítica de CD38 é necessária para vários processos fisio- lógicos, incluindo secreção de insulina, sinalização de Ca?* muscaríni- co em células acinares pancreáticas, quimiotaxia de neutrófilos, tráfico de células dendríticas, secreção de oxitocina e no desenvolvimento de obesidade induzida por dieta. Ver, Vaisitti et al., Laeukemia, 2015, 29: 356-368, e as referências lá citadas. CD38 tem ciclase ectoenzimática bifuncional, bem como atividade de hidrolase. CD38 é expresso em uma variedade de doenças malignas, incluindo leucemia linfocítica crônica (CLL). Foi demonstrado que o CD38 identifica uma forma par- ticularmente agressiva de CLL e é considerado um marcador de prog- nóstico negativo, predizendo uma sobrevida global mais curta dos pa-

cientes com essa variante agressiva de CLL. Ver, Malavasi et al., 2011, Blood, 118: 3470-3478 e Vaisitti, 2015, supra.

[00125] O CD38 também é expresso em tumores sólidos e é supe- rexpresso em células tumorais de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas refratário a PD1 (SNCLC) (Chen et al., Cancer Discov, 8(9): 1156-75). O CD38 possivelmente desempenha um papel em outros tumores sólidos que são resistentes ao bloqueio do check- point imunológico, como tumores pancreáticos, carcinoma de células renais, melanoma, carcinoma colorretal e outros. Compostos de Ligação anti-CD38

[00126] Aspectos da invenção incluem compostos de ligação com afinidade de ligação a uma ectoenzima, como CD38. Os compostos de ligação podem incluir, sem limitação, uma variedade de moléculas se- melhantes a anticorpos, tais como aquelas representadas na FIG. 11. Em algumas modalidades, um composto de ligação inclui um domínio variável de um anticorpo com afinidade de ligação a um epitopo parti- cular em uma ectoenzima. Em algumas modalidades, um composto de ligação inclui pelo menos um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação a um epitopo particular. Em certas modalidades, um composto de ligação inclui dois ou mais domínios de ligação ao antígeno, em que um domínio de liga- ção ao antígeno tem afinidade de ligação a um primeiro epitopo e um domínio de ligação ao antígeno tem afinidade de ligação a um segun- do epitopo. Em certas modalidades, os epitopos são epitopos não so- brepostos. Os compostos de ligação descritos neste documento forne- cem uma série de benefícios que contribuem para a utilidade como agente(s) clinicamente terapêutico(s). Os compostos de ligação inclu- em membros com uma faixa de afinidades de ligação, permitindo a seleção de uma sequência específica com uma afinidade de ligação desejada.

[00127] — Aspectos da invenção incluem anticorpos de cadeia pesada que se ligam ao CD38 humano. Os anticorpos compreendem um con- junto de sequências CDR conforme definido neste documento e mos- trado nas FIGS. 1-3 e 5, e são exemplificados pelas sequências de região variável de cadeia pesada (VH) fornecidas de SEQ ID NOs: 18- 28 estabelecidas nas FIGS. 1-3. Os anticorpos fornecem uma série de benefícios que contribuem para a utilidade como agente(s) clinicamen- te terapêutico(s). Os anticorpos incluem membros com uma faixa de afinidades de ligação, permitindo a seleção de uma sequência especí- fica com uma afinidade de ligação desejada.

[00128] Um composto de ligação adequado pode ser selecionado a partir daqueles fornecidos neste documento para o desenvolvimento e uso terapêutico ou outro, incluindo, sem limitação, o uso como um com- posto de ligação biespecífico, por exemplo, como mostrado na Figura 11, ou um anticorpo triespecífico, ou parte de uma estrutura CAR-T.

[00129] A determinação da afinidade para uma proteína candidata pode ser realizada usando métodos conhecidos na técnica, tais como medições Biacore. Os compostos de ligação descritos neste documen- to podem ter uma afinidade para CD38 com um Kd de cerca de 10º a cerca de 10, incluindo, sem limitação: de cerca de 10º a cerca de 10º; de cerca de 10 a cerca de 10º; de cerca de 10º a cerca de 10 8: de cerca de 10º a cerca de 10; de cerca de 10º a cerca de 10º; de cerca de 10º a cerca de 10º; de cerca de 10º a cerca de 10; de cerca de 10º a cerca de 10º; ou qualquer valor dentro desses interva- los. A seleção de afinidade pode ser confirmada com uma avaliação biológica para modular, por exemplo, bloquear, uma atividade biológi- ca de CD38, como atividade de hidrolase, incluindo ensaios in vitro, modelos pré-clínicos e ensaios clínicos, bem como a avaliação de to- xicidade potencial.

[00130] Os compostos de ligação descritos neste documento não apresentam reatividade cruzada com a proteína CD38 do macaco Cynomolgus, mas podem ser modificados para fornecer reatividade cruzada com a proteína CD38 do macacoCynomolgus ou com o CD38 de qualquer outra espécie animal, se desejado.

[00131] Os compostos de ligação específica de CD38 neste docu- mento compreendem um domínio de ligação ao antígeno, compreen- dendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 em uma estrutura VH humana. As sequências de CDR podem estar situadas, por exemplo, na região em torno dos resíduos de aminoácidos 26-35; 53-59; e 98- 117 quanto às CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, do conjunto de sequências de região variável exemplificativas apresentadas nas SEQ ID NOs: 18-28. Será entendido por aqueles de conhecimento comum à técnica que as sequências de CDR podem estar em posições diferen- tes se uma sequência de framework diferente for selecionada, embora geralmente a ordem das sequências permaneça a mesma.

[00132] Sequências representativas de CDR1, CDR2 e CDR3 são mostradas nas FIGS. 1-3 e 5.

[00133] Em algumas modalidades, um anticorpo apenas de cadeia pesada anti-CD38 da invenção compreende uma sequência CDR1 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-5. Em uma modalidade particular, a sequência CDR1 é SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade particular, a sequência CDR1 é SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade particular, a sequência CDR1 é SEQ ID NO: 4.

[00134] Em algumas modalidades, um anticorpo de cadeia pesada anti-CD38 da invenção compreende uma sequência de CDR2 de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 6-12. Em uma modalidade particular, a sequência CDR2 é SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade particular, a sequência CDR2 é SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade particular, a sequência CDR2 é SEQ ID NO: 11.

[00135] Em algumas modalidades, um anticorpo de cadeia pesada anti-CD38 da invenção compreende uma sequência CDR3 de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 13-17. Em uma modalidade particular, a sequência CDR3 é SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade particular, a sequência CDR3 é SEQ ID NO: 16. Em uma modalidade particular, a sequência CDR3 é SEQ ID NO: 17.

[00136] Em uma modalidade adicional, um anticorpo de cadeia pe- sada anti-CD38 da invenção compreende a sequência CDR1 de SEQ ID NO: 1; a sequência CDR2 da SEQ ID NO: 6; e a sequência CDR3 de SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade adicional, um anticorpo de cadeia pesada anti-CD38 da invenção compreende a sequência CDR1 de SEQ ID NO: 3; a sequência CDR2 da SEQ ID NO: 9; e a sequência CDR3 de SEQ ID NO: 16. Em uma modalidade adicional, um anticorpo de cadeia pesada anti-CD38 da invenção compreende a sequência CDR1 de SEQ ID NO: 4; a sequência CDR2 da SEQ ID NO: 11; ea sequência CDR3 de SEQ ID NO: 17.

[00137] Em modalidades adicionais, um anticorpo de cadeia pesada anti-CD38 da invenção compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NOs: 18- 28 (FIGS. 1-3).

[00138] Em outramodalidade adicional, um anticorpo de cadeia pe- sada anti-CD38 da presente invenção compreende a sequência da re- gião variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 18. Em outra modali- dade adicional, um anticorpo de cadeia pesada anti-CD38 da presente invenção compreende a sequência da região variável de cadeia pesa- da da SEQ ID NO: 23. Em outra modalidade adicional, um anticorpo de cadeia pesada anti-CD38 da presente invenção compreende a se- quência da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 27.

[00139] Em algumas modalidades, uma sequência de CDR em um anticorpo de cadeia pesada anti-CD38 da invenção compreende uma ou duas substituições de aminoácidos em relação a uma sequência

CDR1, CDR2 e/ou CDR3 ou conjunto de sequências CDR1, CDR2 e CDR3 em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-17 (FIGS. 1-3) ou SEQ ID NOs: 49-51 (FIG. 5). Em algumas modalidades, os anticorpos de ca- deia pesada anti-CD38, neste documento, compreenderão uma se- quência de região variável de cadeia pesada com pelo menos cerca de 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 98% de identidade ou pelo menos pelo me- nos 99% de identidade com qualquer uma das sequências da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NOs: 18-28 (mostradas nas FIGS. 1-3) ou SEQ ID NOs: 46 ou 47 (mostradas na FIG. 5).

[00140] Em algumas modalidades, compostos de ligação biespecií- ficos ou multiespecíficos são fornecidos, os quais podem ter qualquer uma das configurações discutidas neste documento, incluindo, sem limitação, um anticorpo de cadeia pesada bivalente biespecífico com- preendendo duas subunidades polipeptídicas não idênticas que estão associadas uma à outra por meio de um interface assimétrica; um an- ticorpo biespecífico de cadeia pesada tetravalente compreendendo duas subunidades polipeptídicas idênticas, cada uma contendo um primeiro e um segundo domínio de ligação ao antígeno; um anticorpo biespecífico de cadeia pesada tetravalente compreendendo duas su- bunidades polipeptídicas de cadeia pesada idênticas e duas subunida- des polipeptídicas de cadeia leve idênticas; ou uma molécula seme- lhante a um anticorpo biespecífico de três cadeias, compreendendo uma primeira subunidade polipeptídica de cadeia pesada, uma primei- ra subunidade polipeptídica de cadeia leve e uma segunda subunidade polipeptídica de cadeia pesada.

[00141] Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico pode compreender pelo menos uma região variável de cadeia pesada com especificidade de ligação a CD38, e pelo menos uma região variável de cadeia pesada com especificidade de ligação a uma proteína dife-

rente de CD38. Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico pode compreender um par de cadeia pesada/cadeia leve que tem es- pecificidade de ligação a um primeiro antígeno e uma cadeia pesada de um anticorpo apenas de cadeia pesada, compreendendo uma por- ção Fc que compreende os domínios de CH2 e/ou CH3 e/ou CHA, na ausência de um domínio de CH1, e um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um epitopo de um segundo antígeno ou a um epitopo di- ferente do primeiro antígeno (por exemplo, um segundo epitopo não sobreposto em uma proteína CD38). Em uma modalidade particular, um anticorpo biespecífico compreende um par de cadeia pesada/cadeia leve que tem especificidade de ligação a um antígeno em uma célula efetora (por exemplo, uma proteína CD3 em uma célula T) e uma cadeia pe- sada de um anticorpo apenas de cadeia pesada compreendendo um domínio de ligação ao antígeno que tem especificidade de ligação ao CD38.

[00142] Em algumas modalidades, onde uma proteína da invenção é um anticorpo biespecífico, um braço do anticorpo (uma fração de |i- gação) é específico para o CD38 humano, enquanto o outro braço po- de ser específico para as células alvo, antígenos associados a tumor, antígenos alvo, por exemplo, integrinas, etc., antígenos de patógenos, proteínas de checkpoint e semelhantes. As células alvo incluem espe- cificamente células cancerígenas, incluindo, sem limitação, células de tumores hematológicos, por exemplo, tumores de células B, como dis- cutido abaixo.

[00143] Vários formatos de compostos de ligação biespecíficos es- tão dentro do âmbito da invenção, incluindo, sem limitação, polipeptí- deos de cadeia única, polipeptídeos de cadeia dupla, polipeptídeos de cadeia tripla, polipeptídeos de cadeia quádrupla e múltiplos dos mes- mos. Os compostos de ligação biespecíficos neste documento especi- ficamente incluem anticorpos biespecíficos de células T que se ligam a

CD38, que é expresso predominantemente em células imunes, e CD3 (anticorpos anti-CD38 x anti-CD3). Esses anticorpos induzem a elimi- nação mediada por células T para eliminar as células que expressam CD38.

[00144] Em algumas modalidades, um composto de ligação inclui um primeiro e um segundo polipeptídeo, isto é, uma primeira e uma segunda subunidade polipeptídica, em que cada polipeptídeo compre- ende um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada. Em algumas modalidades, cada um dos primeiro e segundo polipeptídeos inclui ainda uma região de dobradiça, ou pelo menos uma porção de uma região de dobradiça, que pode facilitar a formação de pelo menos uma ligação dissulfeto entre o primeiro e o segundo polipeptídeos. Em algumas modalidades, cada um do primeiro e se- gundo polipeptídeos inclui ainda pelo menos um domínio de região constante de cadeia pesada (CH), como um domínio CH2 e/ou um domínio CH3 e/ou um domínio CH4. Em certas modalidades, o domí- nio CH não possui um domínio CH1. O domínio de ligação ao antígeno de cada um dos primeiro e segundo polipeptídeos pode incorporar qualquer uma das sequências CDR e/ou sequências de região variável descritas neste documento, a fim de conferir capacidade de ligação ao antígeno no composto de ligação. Assim, em certas modalidades, ca- da polipeptídeo no composto de ligação pode incluir um domínio de ligação ao antígeno que tem especificidade de ligação ao mesmo epi- topo ou a diferentes epitopos (por exemplo, um primeiro e um segundo epitopo não sobreposto na proteína CD38).

[00145] Um exemplo não limitativo de um composto de ligação de acordo com modalidades da invenção é representado na FIG. 11, Pai- nel C. Na modalidade representada, o composto de ligação é um anti- corpo bivalente de cadeia pesada biespecífico que compreende um primeiro polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação ao antí-

geno de um anticorpo de cadeia pesada, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça, um domínio CH compreendendo um domínio CH2 e um domínio CH3 (e sem um domínio CH1) e um segundo poli- peptídeo compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça e um domínio CH compreendendo um CH2 e um domí- nio CH3 (e sem um domínio CH1). A modalidade representada inclui uma interface assimétrica entre o domínio CH3 do primeiro polipeptí- deo e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo, e pelo menos uma |i- gação dissulfeto na região de dobradiça que conecta o primeiro e o segundo polipeptídeos para formar o composto de ligação. Interfaces assimétricas de acordo com modalidades da invenção são ainda des- critas neste documento.

[00146] Em algumas modalidades, um composto de ligação inclui um primeiro e um segundo polipeptídeo, ou seja, uma primeira e uma segunda subunidade polipeptídica, em que cada polipeptídeo compre- ende dois domínios de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, cada um dos primeiro e segundo polipeptídeos inclui ainda uma região de dobradiça, ou pelo menos uma porção de uma região de dobradiça, que pode facilitar a formação de pelo menos uma ligação dissulfeto entre o primeiro e o segundo polipeptídeos. Em algumas modalidades, cada um do primeiro e segundo polipeptídeos inclui ainda pelo menos um domínio de região constante de cadeia pesada (CH), como um domínio CH2 e/ou um domínio CH3 e/ou um domínio CH4. Em certas modalidades, o domínio CH não possui um domínio CH1. O domínio de ligação ao antígeno de cada um dos primeiro e segundo polipeptí- deos pode incorporar qualquer uma das sequências CDR e/ou se- quências de região variável descritas neste documento, a fim de confe- rir capacidade de ligação ao antígeno no composto de ligação. Assim, em certas modalidades, cada polipeptídeo no composto de ligação po-

de incluir dois domínios de ligação ao antígeno com especificidade de ligação ao mesmo epitopo ou a diferentes epitopos (por exemplo, um primeiro e um segundo epitopo não sobreposto em uma proteína CD38).

[00147] Um exemplo não limitativo de um composto de ligação de acordo com modalidades da invenção é representado na FIG. 11, Pai- nel B. Na modalidade representada, o composto de ligação é um com- posto de ligação tetravalente biespecífico que compreende um primei- ro polipeptídeo compreendendo dois domínios de ligação ao antígeno, um com especificidade de ligação a um primeiro epitopo e um com es- pecificidade de ligação a um segundo epitopo não sobreposto, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça, um domínio CH com- preendendo um domínio CH2 e um CH3 (e sem um domínio CH1) e um segundo polipeptídeo compreendendo dois domínios de ligação ao antígeno, um com especificidade de ligação ao primeiro epitopo e um com especificidade de ligação ao segundo epitopo não sobreposto, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça, um domínio CH compreendendo um CH2 e um domínio CH3 (e sem um domínio CH1). A modalidade representada inclui pelo menos uma ligação dissulfeto na região de dobradiça que conecta o primeiro e o segundo polipeptí- deos para formar o composto de ligação.

[00148] Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo domínio de ligação ao antígeno em cada polipeptídeo estão conectados por um ligante polipeptídico. Um exemplo não limitativo de um ligante polipep- tídico que pode conectar o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno é um ligante GS, tal como o ligante G4S com a sequência de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 29). Outros ligantes adequados também podem ser usados e são descritos, por exemplo, em Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013, 15 de outubro; 65(10:1357-69, cuja di- vulgação é incorporada neste documento por referência em sua totali-

dade.

[00149] Em algumas modalidades, um composto de ligação inclui um primeiro e um segundo polipeptídeo de cadeia pesada, ou seja, uma primeira e uma segunda subunidades polipeptídicas de cadeia pesada, bem como um primeiro e um segundo polipeptídeo de cadeia leve, ou seja, uma primeira e uma segunda subunidades polipeptídicas de cadeia leve. Em algumas modalidades, cada um dos polipeptídeos de cadeia pesada compreende um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada. Em algumas modalidades, cada um dos polipeptídeos de cadeia pesada inclui ainda uma região de dobra- diça, ou pelo menos uma porção de uma região de dobradiça, que po- de facilitar a formação de pelo menos uma ligação dissulfeto entre o primeiro e o segundo polipeptídeos de cadeia pesada. Em algumas modalidades, cada um dentre o primeiro e o segundo polipeptídeos de cadeia pesada inclui ainda pelo menos um domínio de região constan- te de cadeia pesada (CH), como um domínio CH2 e/ou um domínio CH3 e/ou um domínio CH4. Em certas modalidades, o domínio CH in- clui um domínio CH1. O domínio de ligação ao antígeno de cada um dentre o primeiro e o segundo polipeptídeos de cadeia pesada pode incorporar qualquer uma das sequências CDR e/ou sequências de re- gião variável descritas neste documento, a fim de conferir capacidade de ligação ao antígeno no composto de ligação.

[00150] Em algumas modalidades, cada um dos polipeptídeos de cadeia leve compreende um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada. Em algumas modalidades, cada um dos polipeptídeos de cadeia leve inclui ainda um domínio da região cons- tante de cadeia leve (CL). O domínio de ligação ao antígeno de cada um dentre o primeiro e o segundo polipeptídeos de cadeia leve pode incorporar qualquer uma das sequências CDR e/ou sequências de re- gião variável descritas neste documento, a fim de conferir capacidade de ligação ao antígeno no composto de ligação. Além disso, os domí- nios CH1 nos polipeptídeos da cadeia pesada e os domínios CL nos polipeptídeos da cadeia leve podem incluir, cada um, pelo menos um resíduo de cisteína que facilita a formação de uma ligação dissulfeto que conecta cada polipeptídeo da cadeia leve a um dos polipeptídeos da cadeia pesada.

[00151] Um exemplo não limitativo de um composto de ligação de acordo com modalidades da invenção é representado na FIG. 11, Pai- nel A. Na modalidade representada, o composto de ligação é um com- posto de ligação tetravalente biespecífico compreendendo dois poli- peptídeos de cadeia pesada e dois polipeptídeos de cadeia leve. Cada polipeptídeo de cadeia pesada compreende um domínio de ligação ao antígeno com especificidade de ligação a um primeiro epitopo, um domínio CH1, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. A modalidade representada inclui pelo menos uma ligação dissulfeto na região de dobradiça que conecta o primeiro e o segundo polipeptídeos de cadeia pesada. Cada polipep- tídeo de cadeia leve compreende um domínio de ligação ao antígeno com especificidade de ligação a um segundo epitopo e um domínio CL. A modalidade representada inclui pelo menos uma ligação dissulfeto entre os domínios CL e CH1 que conecta o primeiro e o segundo poli- peptídeos de cadeia pesada ao primeiro e segundo polipeptídeos de cadeia leve para formar o composto de ligação.

[00152] Um exemplo não limitativo de um composto de ligação de acordo com modalidades da invenção é representado na FIG. 11, Pai- nel D. Na modalidade representada, o composto de ligação é um com- posto de ligação bivalente biespecífico compreendendo três polipeptí- deos (dois polipeptídeos de cadeia pesada e um polipeptídeo de ca- deia leve). A primeira subunidade polipeptídica de cadeia pesada e a subunidade polipeptídica de cadeia leve juntas formam uma unidade de ligação com afinidade de ligação a um primeiro epitopo e o segun- do polipeptídeo de cadeia pesada compreende uma região variável apenas de cadeia pesada com afinidade de ligação a um segundo epi- topo. Em algumas modalidades, a segunda subunidade polipeptídica compreende um único domínio de região variável apenas de cadeia pesada (configuração monovalente). Em algumas modalidades, a se- gunda subunidade polipeptídica compreende duas regiões variáveis apenas de cadeia pesada (configuração bivalente), conectadas por um ligante. O primeiro polipeptídeo de cadeia pesada compreende um domínio de ligação ao antígeno com especificidade de ligação a um primeiro epitopo, um domínio CH1, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. A modali- dade representada inclui pelo menos uma ligação dissulfeto na região de dobradiça que conecta o primeiro e o segundo polipeptídeos de ca- deia pesada. O polipeptídeo de cadeia leve compreende um domínio de ligação ao antígeno com especificidade de ligação ao primeiro epi- topo e um domínio CL.

[00153] Em uma modalidade preferencial, um composto de ligação biespecífico com afinidade de ligação a um primeiro epitopo CD38 e um segundo epitopo CD38 não sobreposto compreende um primeiro polipeptídeo com afinidade de ligação ao primeiro epitopo CD38 com- preendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada compreendendo uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR2 da SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 13, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça e um domínio CH compreendendo um domínio CH2 e um domínio CH3 e um segundo polipeptídeo com afinidade de ligação para o se- gundo epitopo CD38 compreendendo um domínio de ligação ao antí- geno de um anticorpo de cadeia pesada compreendendo uma se- quência CDR1 de SEQ ID NO: 3, uma sequência CDR2 de SEQ ID

NO: 9, e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 16, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça e um domínio CH compreendendo um domínio CH2 e um domínio CH3, e uma interface assimétrica entre o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo. Em certas modalidades preferenciais, este composto de ligação inclui uma região Fc que é uma região Fc de IgG1 humana, uma região Fc de IgG4 humana, uma região Fc de IgG1 humana si- lenciada ou uma região Fc de IgG4 humana silenciada.

[00154] Em outra modalidade preferenciais, um composto de liga- ção biespecífico com afinidade de ligação a um primeiro epitopo CD38 e um segundo epitopo CD38 não sobreposto inclui dois polipeptídeos idênticos, cada polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada tendo afinidade de ligação para o primeiro epitopo CD38, compreendendo uma se- quência CDR1 de SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 13, um segundo domí- nio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afi- nidade de ligação ao segundo epitopo CD38, compreendendo uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 3, uma sequência CDR2 da SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 16, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça, e um domínio CH compreenden- do um domínio CH2 e um domínio CH3. Em certas modalidades prefe- renciais, este composto de ligação inclui uma região Fc que é uma re- gião Fc de IgG1 humana, uma região Fc de IgG4 humana, uma região Fc de IgG1 humana silenciada ou uma região Fc de I9gG4 humana si- lenciada.

[00155] Em outra modalidade preferencial, um composto de ligação biespecífico com afinidade de ligação a um primeiro epitopo CD38 e um segundo epitopo CD38 não sobreposto compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo de cadeia pesada, cada um compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada tendo afinidade de ligação ao primeiro epitopo CD38, compreendendo uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 13, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça, e um domínio CH compre- endendo um domínio CH1, um domínio CH2 e um domínio CH3, e um primeiro e um segundo polipeptídeo de cadeia leve, cada um compre- endendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de ca- deia pesada com afinidade de ligação para o segundo epitopo CD38, compreendendo um Sequência CDR1 de SEQ ID NO: 3, uma sequên- cia CDR2 de SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 16 e um domínio CL. Em certas modalidades preferenciais, este com- posto de ligação inclui uma região Fc que é uma região Fc de I1gG1 humana, uma região Fc de IgG4 humana, uma região Fc de IgG1 hu- mana silenciada ou uma região Fc de IgG4 humana silenciada.

[00156] Em outramodalidade preferencial, um composto de ligação biespecífico com afinidade de ligação a um primeiro epitopo de CD38 e um segundo epitopo de CD38 não sobreposto, o composto de liga- ção biespecífico compreende: uma primeira subunidade de polipeptí- deo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compre- endendo uma sequência de CDR1 de SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR?2 da SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 13 em uma estrutura framework de cadeia pesada humana; uma segunda subunidade polipeptídica compreendendo uma região variável de ca- deia leve compreendendo uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 49, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 50 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 51, em uma estrutura framework de cadeia leve humana; em que a primeira subunidade polipeptídica e a segunda subunidade polipeptídica em conjunto têm afinidade de ligação ao primeiro epitopo CD38; e uma terceira subunidade polipeptídica compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada compreendendo uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 3, uma se- quência CDR2 da SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 16 em uma estrutura framework de cadeia pesada humana, em uma configuração monovalente ou bivalente; em que a terceira subu- nidade polipeptídica tem afinidade de ligação ao segundo epitopo CD38 não sobreposto. Em algumas modalidades preferidas, a primeira subunidade polipeptídica compreende ainda um domínio CH1, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. Em algumas modalidades preferenciais, a terceira subunidade polipeptídica compreende ainda uma sequência de região constante compreendendo pelo menos uma porção de uma região de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3, na ausência de um domínio CH1. Em algumas modalidades preferenciais, a estrutura fra- mework de cadeia leve humana é uma estrutura de cadeia leve kappa humana ou uma estrutura de cadeia leve lambda humana. Em algu- mas modalidades preferenciais, a segunda subunidade polipeptídica compreende ainda um domínio CL. Em algumas modalidades prefe- renciais, o composto de ligação biespecífico compreende uma região Fc selecionada do grupo que consiste em: uma região Fc de I9gG1 hu- mana, uma região Fc de IgG4 humana, uma região Fc de I9gG1 huma- na silenciada e uma região Fc de IgG4 humana silenciada. Em algu- mas modalidades preferenciais, o composto de ligação biespecífico compreende uma interface assimétrica entre o domínio CH3 da primei- ra subunidade polipeptídica e o domínio CH3 da terceira subunidade polipeptídica.

[00157] Aspectos da invenção incluem combinações (por exemplo, combinações terapêuticas) de dois ou mais compostos de ligação des- critos neste documento. Em algumas modalidades, uma combinação terapêutica compreende um primeiro composto de ligação que tem es-

pecificidade de ligação para um primeiro epitopo em CD38 e um se- gundo composto de ligação que tem especificidade de ligação para um segundo epitopo não sobreposto em CD38. As combinações terapêu- ticas de acordo com as modalidades da invenção podem compreender dois ou mais dos compostos de ligação descritos neste documento, ou podem compreender um ou mais dos compostos de ligação descritos neste documento, bem como um ou mais compostos de ligação co- nhecidos na técnica, por exemplo, um ou mais segundos anticorpos que se ligam a CD38.

[00158] Por exemplo, o isatuximabe (SAR650984), que é um anti- corpo em ensaios clínicos para o tratamento de mieloma múltiplo, in- duz citotoxicidade dependente do complemento potente (CDC), citoto- xicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), fago- citose celular dependente de anticorpos (ADCP), e apoptose indireta de células tumorais. O isatuximabe também bloqueia as atividades en- zimáticas da ciclase e hidrolase do CD38 e induz a apoptose direta das células tumorais. Aspectos da invenção incluem combinações te- rapêuticas que incluem um ou mais dos compostos de ligação descri- tos neste documento, bem como isatuximabe. A sequência da região variável da cadeia pesada de isatuximabe é fornecida na SEQ ID NO: 30, e a sequência da região variável da cadeia leve do isatuximabe é fornecida na SEQ ID NO: 31. Isatuximabe é descrito, por exemplo, em Deckert, J., et al., "SAR650984, a novel humanized CD38-targeting antibody, demonstrates potent antitumor activity in models of multiple myeloma and other CD38+ hematologic malignancies." Clin Cancer Res, 2014. 20(17): p. 4574-83, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

[00159] —“Daratumumabe, um anticorpo específico para CD38 huma- no, foi aprovado para uso humano em 2015 para o tratamento de mi- eloma múltiplo (revisado em Shallis et al., Cancer Immunol. Immu-

nother., 2017, 66 (6): 697-703). Aspectos da invenção incluem combi- nações terapêuticas que incluem um ou mais dos compostos de liga- ção descritos neste documento, bem como daratumumabe.

[00160] Em uma modalidade preferencial, uma combinação tera- pêutica compreende um anticorpo de cadeia pesada que se liga a CD38, o anticorpo de cadeia pesada compreendendo um domínio de ligação ao antígeno compreendendo uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 4, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 11, e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 17 e isatuximabe como um segundo anticorpo que se liga a CD38. Preparação de compostos de ligação antiectoenzima

[00161] Os compostos de ligação da presente invenção podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade preferencial, os compostos de ligação neste documento são produzi- dos por animais transgênicos, incluindo camundongos e ratos transgê- nicos, preferencialmente ratos, nos quais os genes da imunoglobulina endógena são nocauteados ou desativados. Em uma modalidade pre- ferencial, os compostos de ligação neste documento são produzidos em UniRat'"Y. O UniRat'Y“ tem seus genes de imunoglobulina endóge- na silenciados e usa um translocus de cadeia pesada de imunoglobuli- na humana para expressar um repertório diversificado e naturalmente otimizado de anticorpos de cadeia pesada totalmente humanos. En- quanto os loci de imunoglobulina endógena em ratos podem ser no- cauteados ou silenciados usando uma variedade de tecnologias, em UniRat'Y, a tecnologia de dedo de zinco (endo)nuclease (ZNF) foi usada para inativar o locus J de cadeia pesada de rato endógeno, lo- cus CK de cadeia leve e locus CA de cadeia leve. Os construtos ZNF para microinjeção em oócitos podem produzir linhas de IgH e Igl de nocaute (KO). Para obter detalhes, ver, por exemplo, Geurts et al., 2009, Science 325:433. A caracterização de ratos nocaute de cadeia pesada de lg foi relatada por Menoret et al., 2010, Eur. J. Immunol. 40: 2932-2941. As vantagens da tecnologia ZNF são que a união final não homóloga para silenciar um gene ou locus por meio de deleções de até vários kb também pode fornecer um sítio alvo para integração ho- móloga (Cui et al., 2011, Nat Biotechnol 29:64-67). Os anticorpos de cadeia pesada humana produzidos em UniRat'yY são chamados de UniAbs'Y e podem se ligar a epitopos que não podem ser atacados com anticorpos convencionais. Sua alta especificidade, afinidade e tamanho pequeno os tornam ideais para aplicações mono e poliespe- cíficas.

[00162] Além de UniAbs'Y, especificamente incluídos neste docu- mento, estão os anticorpos apenas de cadeia pesada sem a estrutura framework VHH de camelídeo e mutações e suas regiões de VH funci- onais. Tais anticorpos apenas de cadeia pesada podem, por exemplo, ser produzidos em ratos ou camundongos transgênicos que compre- endem loci de genes apenas de cadeia pesada totalmente humanos, conforme descrito, por exemplo, em WOZ2006/008548, mas outros mamíferos transgênicos, como coelho, porquinho-da-índia, rato tam- bém podem ser usados, ratos e camundongos sendo preferenciais. Os anticorpos de cadeia pesada apenas, incluindo seus fragmentos funci- onais VHH ou VH, também podem ser produzidos por tecnologia de DNA recombinante, pela expressão do(s) ácido(s) nucleico(s) codifica- dor(es) em um hospedeiro eucariótico ou procariótico adequado, inclu- indo, por exemplo, células de mamíferos (por exemplo, células CHO), E. coli ou levedura.

[00163] Os domínios de anticorpos apenas de cadeia pesada com- binam vantagens de anticorpos e drogas de moléculas pequenas: po- dem ser monovalentes ou multivalentes; têm baixa toxicidade; e são de fabricação econômica. Devido ao seu pequeno tamanho, esses domínios são fáceis de administrar, incluindo administração oral ou tópica, são caracterizados por alta estabilidade, incluindo estabilidade gastrointestinal; e sua meia-vida pode ser ajustada para o uso ou indi- cação desejada. Além disso, os domínios VH e VHH de anticorpos de cadeia pesada podem ser fabricados de uma maneira econômica.

[00164] Em uma modalidade particular, os anticorpos de cadeia pe- sada da presente invenção, incluindo UniAbs'Y, têm o resíduo de ami- noácido nativo na primeira posição da região FR4 (posição de aminoá- cido 101, de acordo com o sistema de numeração de Kabat), substitu- ído por outro resíduo de aminoácido que é capaz de interromper um emplastro hidrofóbico exposto à superfície que compreende ou está associado ao resíduo de aminoácido nativo dessa posição. Esses em- plastros hidrofóbicos são normalmente enterrados na interface com a região constante da cadeia leve do anticorpo, mas tornam-se expostos à superfície nos anticorpos da cadeia pesada e são, pelo menos parci- almente, responsáveis pela agregação indesejada e associação da cadeia leve dos anticorpos da cadeia pesada. O resíduo de aminoáci- do substituído preferencial é carregado, e mais preferencialmente é carregado positivamente, tal como lisina (Lys, K), arginina (Arg, R) ou histidina (His, H), preferencialmente arginina (R). Em uma modalidade preferencial, os anticorpos apenas de cadeia pesada derivados de animais transgênicos contêm uma mutação Trp para Arg na posição

101. Os anticorpos de cadeia pesada resultantes têm preferencialmen- te elevada afinidade de ligação ao antígeno e solubilidade em condi- ções fisiológicas na ausência de agregação.

[00165] Em certas modalidades, um composto de ligação é um an- ticorpo antiectoenzima de cadeia pesada que se liga a CD38. Em uma modalidade preferencial, os anticorpos anti-CD38 de cadeia pesada são UniAbs'V".

[00166] Como parte da presente invenção, famílias de anticorpos anti-CD38 de cadeia pesada de IgG humana com sequências CDR3 únicas de animais UniRat"Y (UniAb!Y) foram identificadas que se ligam a CD38 humano em ensaios de proteína e ligação celular ELISA (do- mínio extracelular de CD38 recombinante). As sequências de região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo três famílias de se- quência (F11, F12 e F13, ver FIGS. 1-3 e 5) são positivas para a liga- ção da proteína CD38 humana e/ou para a ligação às células CD38+, e são todas negativas para a ligação às células que não expressam CD38. UniAbs'Y dessas três famílias de sequência se enquadram em dois grupos sinérgicos amplos com base na capacidade de inibir a função de hidrolase do CD38.

[00167] Um grupo sinérgico inclui as famílias de sequência F11 e F12. Os membros do grupo sinérgico F11/F12 não sinergizam com o isatuximabe para inibir a função hidrolase de CD38, mas exibem inibi- ção da hidrolase sinérgica entre si. Por exemplo, quando combinados, F11A e F12A atingem um nível de inibição de hidrolase que é maior do que F11A ou F12A podem atingir individualmente (FIG. 7).

[00168] Outro grupo sinérgico inclui a família de sequências F13 e Isatuximabe. O isatuximabe sozinho induz uma inibição parcial da ati- vidade de hidrolase de CD38 (inibição de -55%, FIG. 9). O F13A sozi- nho também induz a inibição parcial da atividade de hidrolase de CD38. Quando combinados, o Isatuximabe e o F13A demonstram inibição sinérgica da atividade da hidrolase ao atingir uma redução na atividade da hidrolase que é maior do que a alcançada por qualquer um dos an- ticorpos individualmente. Alguns membros do grupo sinérgico F13 não bloqueiam a atividade da hidrolase de CD38 por conta própria, mas fazem sinergia com o Isatuximabe para fazer isso. Por exemplo, F13B não bloqueia a atividade da hidrolase de CD38 por si só, mas sinergiza com o Isatuximabe para inibir a atividade da hidrolase de CD38 em até 75% (por exemplo, FIG. 9).

[00169] Notavelmente, F12A inibe a atividade da hidrolase de CD38 por si só (-50% de inibição, FIGS. 13-14), mas não sinergiza com o Isatuximabe. A combinação de F12A e Isatuximabe resultou em uma inibição ligeiramente menor do que o Isatuximabe sozinho (-65% para o isatuximabe sozinho contra -58% para a combinação de Isatuxima- be e F12A).

[00170] “Combinações de dois ou mais UniAbs'"Y que se ligam a epi- topos distintos e não sobrepostos induzem atividade CDC potente e apoptose direta, enquanto o mesmo UniAbs'Y, quando administrados sozinhos, não induzem nenhuma dessas funções efetoras. As combi- nações de UniAbs"Y também inibiram as atividades enzimáticas de forma mais potente do que os UniAbs'Y individuais quando adminis- trados sozinhos. Em outras palavras, em certas modalidades, uma combinação de dois compostos de ligação diferentes (por exemplo, uma combinação terapêutica) da presente invenção resulta em um ou mais resultados sinérgicos (por exemplo, atividade CDC sinérgica, ati- vidade de modulação enzimática sinérgica, por exemplo, bloqueio de hidrolase sinérgica atividade).

[00171] Os compostos de ligação de acordo com as modalidades da invenção se ligam à linhagem celular de linfoma de Burkitt positivo para CD38 e apresentam reação cruzada com a proteína CD38 do macaco Cynomolgus. Além disso, eles podem ser projetados para for- necer reatividade cruzada com a proteína CD38 de qualquer espécie animal, se desejado.

[00172] Os compostos de ligação de acordo com as modalidades da invenção podem ter uma afinidade para CD38 com um Kd de cerca de 10% a cerca de 10, incluindo, sem limitação: de cerca de 10º a cerca de 10º; de cerca de 10º a cerca de 10º; de cerca de 10º a cer- ca de 10; de cerca de 10º a cerca de 10; de cerca de 10 a cerca de 10º; de cerca de 10º a cerca de 10º; de cerca de 10º a cerca de 107; de cerca de 10º a cerca de 10%; ou qualquer valor dentro des-

tes intervalos. A seleção de afinidade pode ser confirmada com uma avaliação biológica para modular, por exemplo, bloquear, uma ativida- de biológica de CD38, incluindo ensaios in vitro, modelos pré-clínicos e ensaios clínicos, bem como a avaliação de toxicidade potencial.

[00173] Os compostos de ligação de acordo com as modalidades da invenção que se ligam a dois ou mais epitopos não sobrepostos em um alvo de ectoenzima, incluindo, mas não se limitando a anticorpos de cadeia pesada anti-CD38, por exemplo, UniAbs"Y podem ser identi- ficados por ensaios de ligação de competição, como enzima- imuno- ensaios ligados (ensaios ELISA) ou ensaios de citometria de fluxo de ligação competitiva. Por exemplo, pode-se usar competição entre anti- corpos conhecidos que se ligam ao antígeno alvo e o anticorpo de in- teresse. Usando esta abordagem, pode-se dividir um conjunto de anti- corpos entre aqueles que competem com o anticorpo de referência e aqueles que não o fazem. Os anticorpos não competidores são identi- ficados como se ligando a um epitopo distinto que não se sobrepõe ao epitopo ligado pelo anticorpo de referência. Frequentemente, um anti- corpo é imobilizado, o antígeno é ligado e um segundo anticorpo mar- cado (por exemplo, biotinilado) é testado em um ensaio ELISA quanto à capacidade de se ligar ao antígeno capturado. Isso também pode ser realizado usando plataformas de ressonância de plasmon de superfí- cie (SPR), incluindo ProteOn XPR36 (BioRad, Inc), Biacore 2000 e Bi- acore T200 (GE Healthcare Life Sciences) e gerador de imagens MX96 SPR (lbis technologies BV), bem como em plataformas de inter- ferometria de biocamada, como Octet Red384 e Octet HTX (ForteBio, Pall Inc). Para obter mais detalhes, consulte a seção de Exemplos abaixo.

[00174] Normalmente, um composto de ligação (por exemplo, um anticorpo) compete com um composto de ligação de referência (por exemplo, um anticorpo de referência) se causar cerca de 15-100% de redução na ligação do anticorpo de referência ao antígeno alvo, con- forme determinado por técnicas padrão, tal como pelos ensaios de |i- gação de competição aqui descritos. Em várias modalidades, a inibi- ção relativa é de pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cer- ca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50% pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo me- nos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou mais. Composições Farmacêuticas

[00175] É outro aspecto da presente invenção fornecer composi- ções farmacêuticas compreendendo um ou mais compostos de ligação da presente invenção em mistura com um carreador farmaceuticamen- te aceitável adequado. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis, como utilizados neste documento, são exemplificados, mas não limita- dos a adjuvantes, carreadores sólidos, água, tampões, ou outros car- readores utilizados na técnica para conter componentes terapêuticos ou combinações dos mesmos.

[00176] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica com- preende dois ou mais anticorpos de cadeia pesada que se ligam a epi- topos não sobrepostos em uma ectoenzima, como, por exemplo, CD38, CD73 ou CD39. Em uma modalidade preferencial, as composições farmacêuticas compreendem combinações sinérgicas de dois ou mais anticorpos de cadeia pesada que se ligam a epitopos não sobrepostos de uma ectoenzima, tal como, por exemplo, CD38, CD73 ou CD39.

[00177] Em outra modalidade, uma composição farmacêutica com- preende um anticorpo de cadeia pesada multiespecífico (incluindo bi- específico) com especificidade de ligação para dois ou mais epitopos não sobrepostos em uma ectoenzima, como, por exemplo, CD38,

CD73 ou CD39. Em uma modalidade preferencial, uma composição farmacêutica compreende um anticorpo de cadeia pesada multiespecí- fico (incluindo biespecífico) com especificidade de ligação a dois ou mais epitopos não sobrepostos em uma ectoenzima, por exemplo, CD38, CD73 ou CD39, com propriedades relacionadas sinergicamente melhoradas a qualquer um dos anticorpos monoespecíficos que se ligam ao mesmo epitopo.

[00178] As composições farmacêuticas dos compostos farmacêuti- cos usados de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento misturando proteínas com o grau de pureza desejado com carreadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 16º edição, Osol, A. Ed. (1980)), tal como na forma de formu- lações liofiizadas ou soluções aquosas. Os carreadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos aos recipientes nas do- sagens e concentrações empregadas, e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo o ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como o cloreto de oc- tadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de ben- zalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; al- quil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como al- bumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como a glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarí- deos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína);

e/ou surfactantes não iônicos, tais como TWEENTY, PLURONICSTY ou polietileno glicol (PEG).

[00179] As composições farmacêuticas para administração parente- ral são, de preferência, estéreis e substancialmente isotônicas e fabri- cadas sob condições de Boas Práticas de Fabricação (GMP). As com- posições farmacêuticas podem ser fornecidas na forma de dosagem unitária (isto é, a dose para uma administração única). A formulação depende da via de administração escolhida. Os compostos de ligação neste documento podem ser administrados por injeção intravenosa ou infusão ou por via subcutânea. Para administração por injeção, os compostos de ligação da presente invenção podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis para reduzir o desconforto no sítio da injeção. A solução pode conter carreadores, excipientes ou estabilizantes como discutido acima. Alternativamente, os compostos de ligação podem estar na forma liofiizada para constituição com um veículo adequado, por exemplo água estéril isenta de pirogênios, antes da utilização.

[00180] As formulações de anticorpos anti-CD38 são divulgadas, por exemplo, na Patente US 9.034.324. Formulações semelhantes po- dem ser usadas para os anticorpos de cadeia pesada, incluindo UniA- bs'Y, da presente invenção. As formulações de anticorpos subcutã- neos são descritas, por exemplo, em US 20160355591 e US

20160166689. Artigos de Fabricação

[00181] Aspectos da invenção incluem artigos de manufatura, ou "kits", contendo um ou mais compostos de ligação da invenção que são úteis para o tratamento das doenças e distúrbios descritos neste documento. Em uma modalidade, um kit compreende um recipiente que compreende um composto de ligação ao anti-CD38 conforme descrito neste documento. O kit pode compreender ainda um rótulo ou bula, no ou associado ao recipiente. O termo "bula" é usado para se referir às instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais dos produtos terapêuticos, que contêm as informações sobre as indi- cações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou avisos em relação ao uso desses produtos terapêuticos. Recipientes adequa- dos incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, embalagens alveolares, etc. O recipiente pode ser formado de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente pode conter um ou mais compostos de ligação anti-CD38, conforme descrito neste documento, ou uma formulação dos mesmos, por exemplo, uma formulação de combinação de dois ou mais compostos de ligação anti-CD38, que é eficaz para o tratamento de uma condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O rótulo ou bula indica que a composição é usa- da para tratar a condição de escolha, como um câncer ou um distúrbio imunológico. Alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação po- de compreender adicionalmente um segundo recipiente compreen- dendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacte- riostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[00182] O kit pode compreender ainda instruções para a adminis- tração de um ou mais compostos de ligação e, se presente, uma for- mulação de combinação dos mesmos. Por exemplo, se o kit compre- ende uma primeira composição farmacêutica compreendendo um pri- meiro composto de ligação a anti-CD38 e uma segunda composição farmacêutica compreendendo um segundo composto de ligação a anti- CD38, o kit pode compreender ainda instruções para a administração simultânea, sequencial ou separada do primeiro e segundas composi- ções farmacêuticas para um paciente em necessidade. Quando um kit compreende duas ou mais composições, o kit pode compreender um recipiente para conter as composições separadas, como uma garrafa dividida ou um pacote de folha dividido, no entanto, as composições separadas também podem estar contidas em um único recipiente não dividido. Um kit pode compreender instruções para a administração dos componentes separados, ou para a administração de uma formu- lação combinada dos mesmos. Métodos de Uso

[00183] Os compostos de ligação aqui descritos, que se ligam a epi- topos não sobrepostos em uma ectoenzima, combinações, incluindo combinações sinérgicas, de tais compostos de ligação, anticorpos mul- tiespecíficos com especificidades de ligação a dois ou mais epitopos não sobrepostos em uma ectoenzima e composições farmacêuticas compreendendo tais anticorpos e combinações de anticorpos, podem ser usados para direcionar doenças e condições caracterizadas pela expressão da ectoenzima alvo.

[00184] Em várias modalidades, a ectoenzima é selecionada a par- tir do grupo que consiste em CD10, CD13, CD26, CD38, CD39, CD73, CD156b, CD156c, CD157, CD203, VAP1, ART2 e MT1-MMP.

[00185] Em uma modalidade particular, a ectoenzima é CD38, CD73 e/ou CD39.

[00186] CD38 é uma glicoproteína transmembranar de tipo 1l de 46 KkDa com uma cauda citoplasmática N-terminal curta de 20 aa e um domínio extracelular longo de 256 aa (Malavasi et al., Immunol. Today, 1994, 15:95-97). Devido ao seu alto nível de expressão em uma série de doenças malignas hematológicas, incluindo mieloma múltiplo (MM), linfoma não Hodgkin (revisado em Shallis et al., Cancer Immunol. Immunother., 2017, 66(6): 697-703), leucemia linfocílica crônica de cé-

lulas B (CLL) (Vaisitti et al., Leukemia, 2015, 29"356-368), leucemia linfoblástica aguda de células B (ALL), uma célula dT ALL, CD38 é um alvo promissor para terapêutica baseada em anticorpos para tratar do- enças hematológicas malignas. O CD38 também foi implicado como um ator-chave no declínio do dinucleotídeo nicotinamida adenina (NAD) relacionado à idade, e foi sugerido que a inibição do CD38, combinada com os precursores do NAD pode servir como uma terapia potencial para disfunção metabólica e doenças relacionadas à idade (ver, por exemplo, Camacho-Pereira et al., Cell Metabolism 2016, 23:1127-1139). O CD38 também foi descrito como estando envolvido no desenvolvimento da hiper-responsividade das vias aéreas, uma ca- racterística marcante da asma, e foi sugerido como um alvo para o tra- tamento de tais condições.

[00187] O metabolismo do dinucleotídeo adenina nicotinamida (NAD+) desempenha um papel crítico em muitos distúrbios inflamató- rios, incluindo doenças metabólicas e doença de Alzheimer. NAD é uma coenzima importante em processos bioenergéticos e sua cliva- gem por várias enzimas, incluindo CD38, é a chave para muitos pro- cessos biológicos, como metabolismo celular, respostas inflamatórias e morte celular (Chini et al., Trends Pharmacol Sci, 39 (4):424 -36.

[00188] A enzima de clivagem do NAD, CD38, promove a inflama- ção intestinal em modelos animais. O CD38 é uma ectoenzima multi- funcional envolvida na degradação de NAD+ e na produção de meta- bólitos ativadores de células, como adenosina difosfato ribose (ADPR) e ADPR cíclico (cCADPR). O CD38 é expresso principalmente em célu- las hematopoiéticas, como células T, células B e macrófagos. As célu- las imunes aumentam a expressão de CD38 após ativação e diferen- ciação. Com base em estudos em animais, parece que as respostas imunes de ambas as células T, macrófagos e neutrófilos são modula- das pelo CD38. A expressão de CD38 de alto nível e suas funções ec-

toenzimáticas associadas parecem aumentar o desenvolvimento de doenças inflamatórias. Em contraste, a deficiência de CD38 e conco- mitantes concentrações aumentadas de NAD reduzem o recrutamento de células para locais inflamados e reduzem a produção de citocinas pró-inflamatórias (Schneider et al., PLos One, 10(5): e0126007 (2015); Gerner et al., Gut, 06 de setembro de 2017, doi: 10.1136/gutjnl-2017- 314241; Garcia-Rodriguez et al., Sci Rep, 8(1): 3357 (2018)). Em mo- delos autoimunes, os camundongos CD38-/- mostram desenvolvimen- to melhorado da doença, menos inflamação das articulações em um modelo de artrite induzida por colágeno e menos inflamação do intes- tino em um modelo de colite de sulfato de dextrano de sódio (DSS) (Garcia-Rodriguez et al., Sci Rep, 8(1): 3357 (2018)). Todos esses re- sultados combinados suportam a hipótese de que a inflamação do có- lon leva a uma diminuição dos níveis de NAD nas células por meio da ativação de CD38. O declínio subsequente do NAD diminuiria a ativi- dade das desacetilases dependentes de NAD (sirtuínas) que são co- nhecidas por terem efeitos antiinflamatórios e protetores de tecido.

[00189] Os anticorpos monoclonais contra o CD38 demonstraram ser altamente eficazes no tratamento do mieloma múltiplo (MM), entre- tanto, não são adequados para o tratamento da DIl. Atualmente, quatro anticorpos monoclonais estão em ensaios clínicos para o tratamento de doenças malignas CD38+. O mais avançado é o Daratumumabe (Jans- sen Biotech), que foi aprovado para uso humano pela FDA para o trata- mento de MM em 2015. Todos os três anticorpos monoclonais anti-CD38 em ensaios clínicos para MM mostram perfis de segurança e eficácia fa- voráveis semelhantes (van de Donk, et al., Blood 2017, blood-2017-06- 740944; doi: https://doi.org/10.1182/blood-2017-06-740944). Um anti- corpo monoclonal (TAK-079) está em testes clínicos para o tratamento de doenças autoimunes, incluindo lúpus eritematoso sistêmico (LES) e artrite reumatoide. Além das células plasmáticas, os anticorpos mono-

clonais anti-CD38 empobrecem outras células CD38+ no baço e no sangue, incluindo todas as células NK e -50% dos monócitos, células T e células B. Células imunológicas regulatórias críticas, como células Treg e células supressoras derivadas do mieloide (MDSC), são esgo- tadas em pacientes com MM após o tratamento com anticorpos mono- clonais anti-CD38, e a expansão de células T efetoras é observada (Krejcik, et al., Blood, 128(3): 384-94 (2016)). Com toda a probabilida- de, a expansão das células T efetoras antitumorais contribui para a eficácia dos mAbs anti-CD38 em MM. No entanto, a remoção de célu- las imunes regulatórias importantes em doenças autoimunes pode le- var à exacerbação da doença.

[00190] A inibição da função enzimática do CD38 pode ser uma abordagem segura e eficaz para o tratamento de doenças inflamató- rias. Vários inibidores de moléculas pequenas, incluindo um com forte potência (Kd-5nM, Haffner et al 2015) de CD38 foram desenvolvidos (Haffner et al., J Med. Chem, 58(8): 3548-71 (2015)). Este composto elevou os níveis de NAD em tecidos de camundongos 6 horas após a injeção, indicando que a inibição de CD38 leva a maior NAD intracelu- lar em camundongos. No entanto, o CD38 também é expresso no cé- rebro e desempenha um papel no comportamento, de modo que tais moléculas apresentam risco significativo de toxicidade. Em contraste com compostos de moléculas pequenas, os anticorpos não podem cruzar a barreira hematoencefálica e geralmente têm especificidade de alvo superior em comparação com moléculas pequenas e, portanto, devem ter um perfil de segurança significativamente melhor. As doen- ças inflamatórias incluem esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistê- mico, artrite reumatoide, doença do enxerto contra o hospedeiro, etc.

[00191] Os anticorpos em ensaios clínicos foram selecionados com base na citólise e inibem fracamente as funções biológicas do CD38, mas a modulação dessas funções também pode ser relevante para terapias contra o câncer. Artigos recentes de Chatterjee et al. e Chen et al. estabeleceram que o eixo CD38-NAD+ é importante em modelos pré-clínicos de câncer de pulmão e melanoma. Esses estudos indicam que níveis elevados de NAD+, regulados negativamente pelo CD38, preservam a funcionalidade das células T efetoras (Teff).

[00192] Os compostos de ligação descritos neste documento, inclu- indo anticorpos anti-CD38 apenas de cadeia pesada, combinações de anticorpos, anticorpos multiespecíficos e composições farmacêuticas neste documento podem ser usados para direcionar doenças e condi- ções caracterizadas pela expressão ou superexpressão de CD38, in- cluindo, sem limitação, o condições e doenças listadas acima.

[00193] Em um aspecto, os compostos de ligação a CD38 e com- posições farmacêuticas neste documento podem ser usados para tra- tar doenças hematológicas malignas caracterizadas pela expressão de CD38, incluindo mieloma múltiplo (MM), linfoma não Hodgkin, leuce- mia linfocílica crônica de células B (CLL), B- leucemia linfoblástica aguda de células (LLA) e LLA de células T. Os compostos de ligação a CD38 e as composições farmacêuticas da presente invenção também podem ser usados para tratar asma e outras condições caracterizadas por hiper-responsividade das vias aéreas e relacionada à idade e dis- função metabólica caracterizada por declínio de micorinamida adenina dinucleotídeo (NAD). Os compostos de ligação a CD38 e as composi- ções farmacêuticas da presente invenção também podem ser usados para tratar a colite.

[00194] MM é uma doença maligna de células B caracterizada por uma expansão monoclonal e acúmulo de células plasmáticas anormais no compartimento da medula óssea. As terapias atuais para MM fre- quentemente causam remissões, mas quase todos os pacientes even- tualmente recaem e morrem. Há evidências substanciais de uma eli- minação imunomediada de células de mieloma no contexto de trans-

plante de células-tronco hematopoéticas alogênicas; no entanto, a to- xicidade dessa abordagem é alta e poucos pacientes são curados. Embora alguns anticorpos monoclonais tenham se mostrado promisso- res para o tratamento do MM em estudos pré-clínicos e ensaios clíni- cos iniciais, a eficácia clínica consistente de qualquer terapia com anti- corpos monoclonais para MM não foi demonstrada de forma conclusi- va. Existe, portanto, uma grande necessidade de novas terapias, inclu- indo imunoterapias para MM (ver, por exemplo, Shallis et al, supra).

[00195] Os compostos de ligação a CD38 e composições farmacêu- ticas neste documento também podem ser usados para tratar distúr- bios autoimunes, incluindo, mas não se limitando a, artrite reumatoide (RA), pênfigo vulgar (PV), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), esclero- se sistêmica (esclerodermia sistêmica, esclerodermia difusa), fibrose e esclerose múltipla (EM). Os compostos de ligação a CD38 e composi- ções farmacêuticas neste documento também podem ser usados para tratar lesões isquêmicas, incluindo, mas não se limitando a, lesões ce- rebrais isquêmicas, lesões cardíacas isquêmicas, lesões gastrointesti- nais isquêmicas e lesões renais isquêmicas (por exemplo, lesões is- quêmicas renais agudas).

[00196] O CD73 foi descrito para funcionar como uma ectoenzima para produzir adenosina extracelular, que promove o crescimento do tumor ao limitar a imunidade das células T antitumorais através da si- nalização do receptor de adenosina. O CD73 é expresso em certos tipos de câncer, como câncer de mama, cólon e próstata. Os resulta- dos com inibidores de moléculas pequenas ou anticorpos monoclonais direcionados a CD73 em modelos de tumor murino sugerem o poten- cial da terapia de CD73 direcionada, incluindo imunoterapia, para con- trolar o crescimento de tumores caracterizados pela expressão de CD73, como monoterapia ou em combinação com outros agentes anti- câncer.

[00197] O €CD39eoCD73 têm sido amplamente considerados es- senciais na geração de microambientes imunossupressores por meio da produção de adenosina. A regulação positiva de CD39 foi relatada em uma série de neoplasias malignas epiteliais e hematológicas e sua expressão na leucemia linfocítica crônica demonstrou estar correlacio- nada com mau prognóstico (Pulte et al., 2011, Clin Lymphoma Myelo- ma Leuk. 2011; 11: 367—372; Bastid et al., 2013, Oncogene, 32: 1743 1751; Bastid et al., 2015, Cancer Immunol Res., 3: 254—265). O CD39 também é altamente expresso em células T regulatórias (Tregs) e é necessário para sua função supressora, conforme demonstrado com atividade supressiva diminuída de Tregs em camundongos CD39 nu- los (Deaglio et al., 2007, J Exp Med., 204: 1257— 1265). Foi sugerido que o CD39 pode ajudar a conduzir a tumorigênese por sua atividade enzimática aumentada tanto em Tregs, estroma associado a tumor ou em células epiteliais malignas, resultando em imunossupressão medi- ada por adenosina de células T antitumorais e células assassinas na- turais (NK) também como neutralização da morte celular induzida por ATP por quimioterapia (Bastid et al., 2013 e 2015, supra; Feng et al. 2011, Neoplasia, 13: 206-216). A modulação da via imunossupressora CD39/CD73-adenosina foi sugerida como uma estratégia imunotera- pêutica promissora para a terapia do câncer (Sitkovsky et al., 2014, Cancer Immunol Res. 2: 598—605). Ver também Hayes et al., Am J Trans Res, 2015, 7 (6):1181-1188.

[00198] Para uma revisão do papel das ectonucleotidases CD73 e CD39 na diferenciação de células T, ver, por exemplo, Bono et al., FEBS Letters, 2015, 589:3454-3460.

[00199] Doses eficazes das composições da presente invenção pa- ra o tratamento de doenças variam dependendo de diversos fatores, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paci- ente, se o paciente é humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Normal- mente, o paciente é um humano, mas mamíferos não humanos tam- bém podem ser tratados, por exemplo, animais de estimação, como cães, gatos, cavalos, etc., mamíferos de laboratório, como coelhos, camundongos, ratos, etc., e semelhantes. As dosagens de tratamento podem ser tituladas para otimizar a segurança e a eficácia.

[00200] Os níveis de dosagem podem ser prontamente determina- dos pelo clínico de conhecimento comum e podem ser modificados conforme necessário, por exemplo, conforme necessário para modifi- car a resposta de um sujeito à terapia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com os materiais carreadores para pro- duzir uma forma de dosagem única varia dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração específico. As formas de unidade de dosagem contêm geralmente entre cerca de 1 mg a cerca de 500 mg de um ingrediente ativo.

[00201] Em algumas modalidades, a dosagem terapêutica do agen- te pode variar de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e, mais normalmente, 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as do- sagens podem ser de 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplificativo implica a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês, ou uma vez a cada 3 a 6 meses. As entidades terapêuticas da presente invenção são geralmente administradas em múltiplas ocasiões. Intervalos entre as dosagens únicas podem ser semanais, mensais ou anuais. Intervalos também podem ser irregula- res, como indicado pela medição dos níveis sanguíneos da entidade terapêutica no paciente. Alternativamente, as entidades terapêuticas da presente invenção podem ser administradas como uma formulação de liberação sustentada, em que uma administração menos frequente seja necessária. A dosagem e frequência variam dependendo da meia-vida do polipeptídeo no paciente.

[00202] “Tipicamente, as composições são preparadas como injetá- veis, quer como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas ade- quadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da inje- ção podem também ser preparadas. As composições farmacêuticas apresentadas neste documento são adequadas para administração intravenosa ou subcutânea, diretamente ou após reconstituição de composições sólidas (por exemplo, liofilizadas). A preparação também pode ser emulsionada ou encapsulada em lipossomas ou micropartií- culas, tais como polilactídeo, poliglicolídeo ou copolímero para um efeito adjuvante melhorado, conforme discutido acima. Langer, Scien- ce 249:1527, 1990 e Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97- 119, 1997. Os agentes desta invenção podem ser administrados na forma de uma injeção de depósito ou preparação de implante que po- de ser formulada, de maneira a permitir uma liberação sustentada ou pulsátil do ingrediente ativo. As composições farmacêuticas são ge- ralmente formuladas como estéreis, substancialmente isotônicas e em total conformidade com todos os regulamentos da Boas Práticas de Fabricação (GMP) da U.S. Food and Drug Administration.

[00203] A toxicidade dos compostos de ligação descritos neste do- cumento pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos pa- drão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, determinando o LDso (a dose letal para 50% da população) ou o LD100 (a dose letal para 100% do população). A razão de dose entre efeito tóxico e terapêutico é o índice terapêutico. Os dados obtidos a partir desses ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem que não é tóxica para uso em humanos. A dosagem dos anticorpos descritos neste docu- mento encontra-se preferencialmente dentro de uma faixa de concen- trações circulantes que incluem a dose eficaz com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa razão, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. A composição exata, a via de administração e a dosagem podem ser escolhidas pelo médico, tendo em vista a condição do paciente.

[00204] As composições para administração compreenderão nor- malmente um composto de ligação da invenção dissolvido em um car- reador farmaceuticamente aceitável, de preferência um carreador aquoso. Uma variedade de carreadores aquosos pode ser usada, por exemplo, solução salina tamponada e semelhantes. Estas soluções são estéreis e geralmente livres de matéria indesejável. Estas compo- sições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convenci- onais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitávei, conforme necessário para aproximar condições fisiológicas, tais como ajuste do pH e agentes tamponantes, agentes de ajuste de toxicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, clore- to de cálcio, lactato de sódio e semelhantes. A concentração de agen- te ativo nessas formulações pode variar amplamente e será seleciona- da principalmente com base em volumes de fluidos, viscosidades, pe- so corporal e semelhantes, de acordo com o modo particular de admi- nistração selecionado e as necessidades do paciente (por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science (15º edição, 1980) e Goodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman et al., eds., 1996)).

[00205] Também dentro do escopo da invenção estão artigos de fabricação, ou "kits" (conforme descrito acima) compreendendo os agentes ativos e suas formulações, da invenção e instruções de uso. Um kit pode conter adicionalmente, pelo menos, um reagente adicional, por exemplo, uma droga quimioterapêutica, etc. Os kits incluem tipi- camente um marcador que indica o uso pretendido do conteúdo do Kit.

O termo "marcador", conforme usado neste documento, inclui qualquer material escrito ou gravado fornecido em ou com um Kkit, ou que, de outra forma acompanha um kit.

[00206] A invenção sendo completamente descrita agora, será evi- dente para uma pessoa versada na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito ou escopo da invenção. Materiais e Métodos

[00207] Os seguintes materiais e métodos foram utilizados para realizar os exemplos descritos abaixo. Ligação a Células CD38

[00208] A ligação a células positivas para CD38 foi avaliada por ci- tometria de fluxo (Guava easyCyte 8HT, EMD Millipore) usando a |i- nhagem de células Ramos (ATCC) ou células CHO expressando de forma estável CD38 humano. Resumidamente, 100,000 células alvo foram coradas com uma série de diluições de UniAbs"Y purificado por minutos a 4ºC. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com tampão de citometria de fluxo (1X PBS, BSA a 1%, NaN; a 0,1%) e coradas com F(ab')> IgG anti-humano de cabra conjugado com R-ficoeritrina (PE) (Southern Biotech, cat. tt2042-09) para detectar anticorpos ligados a células. Após uma incubação de 20 minutos a 4ºC, as células foram lavadas duas vezes com tampão de citometria de flu- xo e, em seguida, a intensidade média de fluorescência (MFI) foi me- dida por citometria de fluxo. Apoptose Direta Induzida por Anticorpos

[00209] A citotoxicidade por apoptose direta induzida por anticorpos foi analisada usando células Ramos positivas para CD38 (ATCC). Em resumo, 45,000 células-alvo foram tratadas com 2 ug/mL de UniAbs'!M purificado por 48 horas (37 ºC, 8% de CO>). Após a incubação, as cé- lulas foram lavadas duas vezes com tampão de ligação de Anexina-V

(BioLegend, cat. %422201) e coradas com Anexina V e 7-AAD (BioLe- gend, cat. %640945 e 420404). As amostras foram então analisadas por citometria de fluxo (Guava easyCyte 8HT, EMD Millipore) e a por- centagem de células viáveis foi determinada como a população nega- tiva para Anexina V e 7AAD. Ensaio de Atividade de Hidrolase de CD38

[00210] Para medir a inibição da atividade da CD38 hidrolase, a proteína CD38 humana recombinante (Sino Biological) ou células CHO expressando CD38 humana (125,000 células/poço) foram incubadas com cada UniAb'Y anti-CD38 purificado em tampão de atividade de hidrolase (Tris 40 mM, sacarose 250 mM, 25 ug/mL de BSA, pH 7,5) por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, e-NAD* (BioLog Cat. No. NO10) foi adicionado a uma concentração final de 150 UM. A produção de um produto fluorescente foi medida em 1 hora (ex 300 nm/em 410 nm) usando um leitor de placa Spectramax i3x (Molecular Devices). A inibição da enzima hidrolase foi avaliada com- parando o sinal de poços tratados com UniAb!M com a porcentagem da atividade enzimática total observada quando a proteína CD38 foi tratada com um anticorpo de controle de isotipo (máx).

EXEMPLOS Exemplo 1: Montagem, Expressão e Sequenciamento de genes

[00211] Os cDNAs que codificam anticorpos apenas de cadeia pe- sada altamente expressos em células de nódulos linfáticos foram sele- cionados para a montagem do gene e clonados em um vetor de ex- pressão. Posteriormente, essas sequências de cadeia pesada foram expressas em células HEK como anticorpos UniAb'!Y apenas de ca- deia pesada (CH1 deletado, sem cadeia leve).

[00212] As FIGURAS 1,2,3e 5 mostram as sequências de amino- ácidos de domínio variável da cadeia pesada das famílias anti-CD38 UniAb!Y CD38 F11, CD38 F12 e CD38 F13, respectivamente. Estas figuras indicam a ID de clone de UniAb'Y testado, a inibição percentual da atividade enzimática de hidrolase de CD38 recombinante na pre- sença do respectivo UniAbs'Y de ligação a CD38 versus UniAb"Y de controle e a intensidade fluorescente média (MFI) da ligação das célu- las às células Ramos. Também são fornecidas nas FIGURAS 1,2,3e as sequências (sequências de CDR, sequências de região variável, (ambos de aminoácidos e nucleotídeos)), bem como o uso do gene VH e VJ de anticorpos de cadeia pesada de ligação a CD38 das famílias F11, F12 e F13, respectivamente. Sequências adicionais são forneci- das na FIGURA 4. Exemplo 2: Ligação celular de UniAbs anti-CD38

[00213] As FIGURAS 1-2 fornecem dados de ligação celular para ligação a células Ramos para membros da família CD38 F11 e CD38 F12. A FIGURA 6 mostra a ligação de anticorpos anti-CD38 UniAb!Y CD38 F11 e CD38 F12 em diferentes concentrações a célu- las CHO estavelmente transfectadas com CD38 humano. Exemplo 3: Sinergias de anticorpos de cadeia pesada com ligação a CD38 no bloqueio da atividade de hidrolase de CD38

[00214] “Como mostrado na FIGURA 7, UniAbs"Y representando duas famílias únicas de sequências de CDR3 de cadeia pesada, CD38 F11 e CD38 F12, inibiu parcialmente a atividade de hidrolase de CD38 quando administrado sozinho, mas quando misturado (isto é, combinado) em concentrações equimolares, inibiu a atividade de CD38 hidrolase mais fortemente.

[00215] A FIGURA 8 mostra um gráfico que representa a inibição enzimática da atividade de hidrolase de CD38 por UniAbs'Y bivalente. Uma mistura de dois UniAbs'Y anti-CD38 (CD38 F11A + CD38 F12A) foi igualmente eficaz como um anticorpo de cadeia pesada bivalente com um braço com o VH de CD38 F11A e o outro braço com o VH de CD38 F12A (CD38 F11A F12A) na inibição da atividade da hidrolase nas células. UniAbs'M biparatópico (CD38 F11A F12A) tendo uma cauda Fc IgG1 ou uma cauda Fc IgG4 inibiu a atividade de hidrolase nas células. Esses UniAbs"Y e seus domínios VH se ligam a dois epi- topos não sobrepostos no CD38.

[00216] A FIGURA 9 mostra um gráfico que representa a inibição enzimática da atividade de hidrolase de CD38 por uma mistura de UniAbs'Y CD38 F13A ou CD38 F13B com Isatuximabe. O isatuxima- be sozinho inibiu parcialmente a atividade da hidrolase de CD38, mas as combinações de isatuximabe com CD38 F13A ou CD38 F13B ini- biram a atividade da enzima mais fortemente, demonstrando um efeito sinérgico.

[00217] A FIGURA 10 mostra a citotoxicidade direta de células Daudi. UniAb'"Y CD38 F11A foi misturado com uma quantidade equi- molar de CD38 F12A e mostrou não induzir apoptose de células Dau- di. Os anticorpos biparatópicos bivalentes compreendendo os VHs de CD38 F11A e CD38 F12A também não eliminaram as células Daudi. O isatuximabe foi usado como controle positivo e demonstrou eliminar potentemente as células Daudi.

[00218] A FIGURA 11 mostra uma representação esquemática de dois formatos de UniAb"Y bivalentes (Painéis C e D) e dois tetravalen- tes (Painéis A e B) de acordo com as modalidades da invenção. Essas representações esquemáticas não são limitantes.

[00219] A FIGURA 12 mostra a inibição enzimática da atividade de hidrolase de CD38 humano expresso em células CHO por UniAbs'!Y tetravalente como descrito na FIGURA 11 (o Painel B representa o formato neste exemplo). O projeto geral é primeiro o ID da VH mais distal, então o ligante Glicina-Glicina-Glicina-Glicina-Serina (GGGGS (SEQ ID NO: 29)) e em seguida o ID da VH proximal à cauda Fc. Uni- Abs'Y tetravalente foram expressos com IgG1 humana, IgG4 humana silenciada e IgG1 humana silenciada. Todos os anticorpos tetravalen-

tes inibiram a atividade da hidrolase de CD38 completamente e mais potentemente do que uma mistura de dois UniAbs de 330204 (também denominado CD38F12A) e 309157 (também denominado CD38F11A). A orientação de VH (proximal ou distal de Fc) e o isótipo de Fc mostra- ram potência semelhante.

[00220] A FIGURA 13 mostra um gráfico que representa a inibição de misturas de UniAbs com Isatuximabe. UniAbs e Isatuximabe foram testados individualmente a 400 nM e como misturas a 200 nM de cada anticorpo. O isatuximabe inibiu parcialmente a atividade da hidrolase do CD38 (60%). UniAbs também foram bloqueadores parciais da ativi- dade da hidrolase. As misturas desses bloqueadores parciais não inibi- ram a atividade da hidrolase de CD38 de forma mais potente do que o isatuximabe sozinho.

[00221] A FIGURA 14 mostra um gráfico que representa a inibição da atividade de hidrolase de CD38 por misturas de UniAbs. UniAb CD38 F12A foi testado individualmente a 400 nM e misturado com ou- tros UniAbs a 200 nM de cada anticorpo. CD38 F12A inibiu a atividade de hidrolase de CD38 parcialmente (-50%). Outros inibidores parciais de CD38 falharam em mostrar sinergia com CD38 F12A para inibir a ativi- dade de hidrolase de CD38. Por exemplo, CD38 F13A mostra sinergia quando combinado com Isatuximabe, mas não potencializa a inibição quando administrado em combinação com CD38 F12A.

[00222] A FIGURA 15 mostra a inibição da atividade de hidrolase de CD38 por misturas de UniAbs. CD38 F11A de UniAb foi testado individualmente a 400 nM e misturado com outros UniAbs a 200 nM de cada anticorpo. CD38 F11A inibiu a atividade de hidrolase de CD38 parcialmente (-58%). Outros inibidores parciais de CD38 falharam em mostrar sinergia com CD38 F11A para inibir a atividade de hidrolase de CD38. Por exemplo, CD38 F13A mostra sinergia quando adminis- trado com Isatuximabe, mas não potencializa a inibição quando admi-

nistrado em combinação com CD38 F11A.

[00223] A FIGURA 16 mostra a inibição da enzima da atividade de hidrolase de CD38 humano expresso em células CHO por UniAbs'!Y tetravalente como descrito na FIGURA 11 (o Painel B representa o formato de CD38F12A 2GS CD38F11A e o Painel A representa o formato de CD38F12A IH/CD38F11A IgK). O projeto geral é primeiro o domínio de ligação ao antígeno (ID) da VH mais distal, então o ligan- te Glicina-Glicina-Glicina-Glicina-Serina (GGGGS (SEQ ID NO: 29)) e em seguida o domínio de ligação ao antígeno (ID) da VH proximal à região Fc. UniAbs'"Y tetravalente foram expressos com uma região Fc de IgG4 humana. Todos os anticorpos tetravalentes inibiram a ativida- de de hidrolase de CD38 completamente e com potência comparável (IC50 = 4,5nM para o formato do Painel B versus IC50=8,6 nM para o formato do Painel A). Exemplo 4: Eficácia de UniAbs inibidores de hidrolase em um modelo de colite DSS

[00224] “Descrição dos procedimentos: Camundongos C57BL/6 ou camundongos knock-in CD38 humanos recebem DSS (0,5% -5%) em água potável. Doses baixas (0,5%-3%) resultam no desenvolvimento de colite crônica e doses altas (2%-5%) no desenvolvimento de colite aguda. A colite será seguida pela medição do peso corporal, sangue oculto e outros marcadores de inflamação do intestino (Chassaing, B., et al., "Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice." Curr Pro- toc Immunol, 2014. 104: p. Unidade 15 25). O peso corporal, o exame histológico dos tecidos intestinais e o comprimento do cólon são usa- dos para avaliar a eficácia do tratamento (Chassaing, B., et al., "Dex- tran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice", Curr Protoc Immu- nol, 2014, 104: p. Unidade 15 25). Os camundongos são tratados pela injeção intravenosa de UniAbs selecionados uma, duas ou três vezes por semana em doses que variam de 0,5 mg/kg a 5 mg/kg.

[00225] Escolha de Animal e Espécie: Os experimentos são condu- zidos em modelos knock-in de CD38 humanos ou camundongos do tipo selvagem. Cepas de camundongos C57BL/C ou outras cepas de camundongos suscetíveis são usadas e são um modelo amplamente aceito de DIl em humanos. Gênero: Homens e mulheres; Idade: das 4 semanas aos 2-3 anos. Peso: variável.

[00226] Geração de um modelo knock-in constitutivo de CD38 hu- mano em camundongos C57BL/6: A sequência de codificação do exon 1 mais o intron 1 parcial são substituídos por um cassete "CD38 CDS- polyA humano". Para manipular o vetor de direcionamento, braços de homologia são gerados por PCR usando o clone BAC RP24-163F10 ou RP23-58C20 da biblioteca C57BL/6 como modelo. No vetor de di- recionamento, o cassete Neo é flanqueado por sítios SDA (âncora de auto-deleção). DTA é usado para seleção negativa. As células C57BL/6 ES são usadas para direcionamento de genes. Animais fun- dadores heterozigotos para o transgene CD38 humano são produzidos e, subsequentemente, são reproduzidos em homozigose.

[00227] “Tamanhos de amostra: 8 ou mais animais por grupo são expostos a DSS na água potável e tratados com bloqueio de hidrolase ou anticorpos de controle. Algumas medições são repetidas pelo me- nos 2-3 vezes para oferecer um sólido poder biológico e estatístico. Em geral, estudos bioquímicos e fisiológicos anteriores indicaram que um tamanho de amostra de n=4-6 animais fornecem poder estatístico adequado (ou seja, poder de 80%) para detectar um tamanho de efeito de unidades de 1,6 SD entre as condições de tratamento usando um t- teste de duas amostras com um nível de significância bilateral de 0,05. Os anticorpos anti-CD38 reduzem estatisticamente a inflamação e me- lhoram as pontuações clínicas (composto de peso corporal, sangue nas fezes e diarreia) em modelos animais DSS.

Exemplo 5: Inibição da Atividade da Hidrolase de CD38

[00228] A capacidade de vários compostos de ligação de acordo com modalidades da invenção para inibir a atividade da hidrolase de CD38 foi avaliada. Os compostos de ligação foram formulados a uma concentração de 0,97 mg/mL em Citrato 20 MM, NaCl 100 mM, pH 6,2. A substância de teste foi armazenada congelada a -80 “C até o dia de uso. A atividade da hidrolase de CD38 na superfície celular foi avalia- da usando linhagens de células positivas para CD38 Daudi, Ramos e células CHO transfectadas de forma estável para expressar CD38 hu- mano. As linhagens de células CD38 positivas foram incubadas com substrato eteno-NAD na presença ou ausência de anticorpo. Fluores- cência a 300 nm de excitação e emissão de 410 nm foi medida ao lon- go do tempo.

[00229] Ensaio de Inibição da Hidrolase de CD38 de Superfície Ce- lular: A fluorescência a 300 nm de excitação e emissão de 410 foi ana- lisada ao longo do tempo no SpectraMax i3ôx. O RLU não tratado foi dividido pelo RLU experimental em um momento antes da saturação determinar a porcentagem da atividade máxima de CD38.

[00230] Os resultados estão representados na FIGURA 17, e de- monstram que os compostos de ligação inibem fortemente a atividade de hidrolase de CD38 da superfície celular em células Daudi, Ramos e CHO transfectadas de forma estável para expressar CD38 humano com valores de EC50 de 3,4 nM, 5,1 nM e 9,0 nM, respectivamente. À inibição máxima variou de 82-88%. Estes resultados demonstram que os compostos de ligação são fortes inibidores da atividade de CD38 hidrolase da superfície celular. Exemplo 6: Sumário da Atividade de Formatos de Isotipo e Valência

[00231] A atividade de inibição enzimática, a atividade de ligação celular e a atividade de apoptose foram avaliadas para vários compos- tos de ligação de acordo com as modalidades da invenção, bem como os compostos de ligação de referência isatuximabe e daratumumabe. Os níveis relativos dessas atividades foram quantificados e estão re- sumidos em um formato tabular na FIGURA 18 Exemplo 7: Ensaio de NAD+

[00232] Estudos foram realizados para avaliar se o bloqueio da ati- vidade de ecto-NMNase de CD38 com os compostos de ligação em questão causa um aumento no aumento mediado por NMN em NAD+ dentro das linhagens de células B Ramos e Daudi que expressam CD38. O ensaio é baseado na reação de ciclo enzimático em que NAD+ é reduzido a NADH. O NAD+ reage com uma sonda colorimétri- ca que produz um produto colorido. A intensidade da cor é proporcio- nal ao NAD+ e ao NADH em uma amostra. A forma oxidada é destruí- da seletivamente por aquecimento em solução básica, enquanto a forma reduzida não é estável em solução ácida.

[00233] Os compostos de ligação foram formulados a uma concentra- ção de 0,97 mg/mL em Citrato 20 MM, NaCl 100 mM, pH 6,2. A substân- cia de teste foi armazenada congelada a -80 ºC até o dia de uso.

[00234] Os resultados estão representados na FIGURA 19, e de- monstram que o composto de ligação de três cadeias bivalente bies- pecífico aumentou notavelmente os níveis de NAD+ na presença de NMN em células Daudi ou Ramos, em comparação com a ausência de NMRN. Os resultados também demonstram uma diferença sutil no au- mento de NAD+ no caso de isatuximabe em Ramos e não em Daudi. Isso presumivelmente porque o isatuximabe também é um bloqueador da enzima CD38, mas também induz a apoptose direta das células, sendo Ramos menos sensível que Daudi. O isatuximabe causa apop- tose direta das células Daudi em 24 horas.

[00235] “Nenhum aumento em NAD+ foi observado em células tra- tadas com isotipo, ou na ausência de qualquer composto de ligação, demonstrando que o efeito do aumento de NAD+ com ou sem NMN está completamente relacionado com a inibição da atividade da enzi- ma CD38. Exemplo 8: Proliferação de células T em MLR

[00236] Vários compostos de ligação de acordo com modalidades da invenção foram avaliados quanto à sua capacidade de inibir a ativi- dade de CD38 hidrolase sem ativar uma reação mista de linfócitos (MLR). A MLR ocorre quando as células imunes incompatíveis do MHC interagem, desencadeando uma resposta imune por hiperprolife- ração de células T e liberação exacerbada de citocinas. Este fenôme- no é mais pronunciado em anticorpos que envolvem células T ou, em geral, anticorpos terapêuticos exibindo função efetora. Os compostos de ligação foram formulados a uma concentração de 0,97 mg/mL em Citrato 20 mM, NaCl 100 mM, pH 6,2. A substância de teste foi arma- zenada congelada a -80 “C até o dia de uso.

[00237] As análises foram realizadas para avaliar a proliferação de células T CD4 e a produção de IFNy. Os resultados estão representa- dos na FIGURA 20. O painel A demonstra que o composto de ligação a três cadeias biespecífico bivalente não causou um aumento na por- centagem de proliferação de células T CDA, enquanto o daratumuma- be resultou em um aumento na proliferação de células T CDA4. A por- centagem de proliferação de células T CD4 também é mostrada no Painel C para uma variedade de outros compostos de ligação. A pro- dução de IFNy é mostrada no Painel B e demonstra que daratumuma- be causou um aumento na produção de IFNy, enquanto os outros compostos de ligação não tiveram efeito na produção de IFNy, em comparação com o controle istp de IgG4.

[00238] Os resultados deste estudo demonstram que o daratumu- mabe agrava a proliferação de células T e a produção de IFNy durante MLR, enquanto o composto bivalente de ligação de três cadeias bies- pecífico não induz a ativação de células T durante MLR.

Exemplo 9: Inibição Parcial da Ciclase por IgG4 Bivalente

[00239] A capacidade de um composto de ligação de três cadeias bivalente, biespecífico, como representado na FIGURA 10, Painel D, para inibir a atividade de CD38 ciclase. Os compostos de ligação fo- ram formulados a uma concentração de 0,97 mg/mL em Citrato 20 mM, NaCl 100 mM, pH 6,2. A substância de teste foi armazenada congela- da a -80 ºC até o dia de uso. A atividade de CD38 ciclase na superfície celular foi avaliada usando linhagens de células positivas para CD38 Daudi, Ramos e células CHO transfectadas de forma estável para ex- pressar CD38 humano. As linhagens de células positivas para CD38 foram incubadas com substrato NGD+ na presença ou ausência do composto de ligação. Fluorescência a 300 nm de excitação e emissão de 410 nm foi medida ao longo do tempo.

[00240] Ensaio de Inibição de CD38 Ciclase de Superfície Celular: A fluorescência a 300 nm de excitação e emissão de 410 foi analisada ao longo do tempo no SpectraMax i3x. O RLU não tratado foi dividido pelo RLU experimental em um momento antes da saturação determi- nar a porcentagem da atividade máxima de CD38.

[00241] Os resultados estão representados na FIGURA 21, e de- monstrar que o composto de ligação de três cadeias bivalente, biespe- cífico, inibiu parcialmente a atividade da ciclase CD38 em Ramos, Daudi e uma linhagens de células CHO estavelmente transfectada pa- ra expressar CD38 humano com valores de EC50 de 3,3 nM, 1,6 nM e 29,2 nM, respectivamente. A inibição máxima variou de 57% a 61%. Estes resultados demonstram que o composto de ligação é um inibidor parcial da atividade de CD38 ciclase. Exemplo 10: Ligação da Célula no Alvo e Fora do Alvo

[00242] Foi avaliada a ligação da célula no alvo e fora do alvo de um composto de ligação de três cadeias bivalente biespecífico como representado na FIGURA 11, Painel D. Os compostos de ligação fo-

ram formulados a uma concentração de 0,97 mg/mL em Citrato 20 mM, NaCl 100 mM, pH 6,2. A substância de teste foi armazenada congela- da a -80 ºC até o dia de uso. A ligação a linhagens celulares positivas para CD38 e negativas para CD38 foi avaliada usando citometria de fluxo. As linhagens de células positivas para CD38 utilizadas foram Daudi, Ramos e uma linhagem de células CHO transfectadas para ex- pressar CD38 de forma estável. As linhagens celulares negativas para CD38 utilizadas foram 293-Freestyle, HL-60, K562 e CHO.

[00243] Análise de Citometria de Fluxo de Ligação de Células: O MFI médio de poços não corados foi definido como o sinal de background. Para calcular fold over background de cada amostra ex- perimental, a MFI da amostra experimental foi dividida pela MFI média de background.

[00244] Os resultados da ligação na célula alvo são mostrados na FIGURA 22 e demonstram que o composto de ligação de três cadeias bivalente biespecífico se liga a células Ramos, CHO HuCD38 e Daudi com valores de EC50 de 50,25 nM, 70,2 nM e 39,67 nM, respectiva- mente. O composto de ligação de três cadeias bivalente biespecífico não se liga às linhagens de células negativas para CD38 testadas (293-Freestyle, CHO, K562 e HL-60), como demonstrado na FIGURA

23. Estes resultados demonstram que o composto de ligação de três cadeias bivalente biespecífico se liga especificamente a CD38, sem ligação a linhagens celulares fora do alvo. Exemplo 11: Apoptose Direta

[00245] A capacidade de um composto de ligação de três cadeias bivalente, biespecífico, como representado na FIGURA 10, Painel D, para induzir a apoptose direta foi avaliada. Os compostos de ligação foram formulados a uma concentração de 0,97 mg/mL em Citrato 20 MM, NaCl 100 mM, pH 6,2. A substância de teste foi armazenada con- gelada a -80 ºC até o dia de uso.

[00246] A indução de apoptose direta foi avaliada por coloração com Anexina-V e 7-AAD usando citometria de fluxo. A Anexina-V é comumente usada para detectar células apoptóticas por sua capaci- dade de se ligar à fosfatidilserina, um marcador de apoptose quando está presente no folheto externo da membrana plasmática. O 7-AAD liga-se ao DNA de fita dupla que é absorvido pelas células moribundas ou mortas com membranas comprometidas. As linhagens de células positivas para CD38 utilizadas neste estudo foram células Daudi e Ramos.

[00247] Análise de Citometria de Fluxo de Apoptose Direta: Um quad gate foi usado para distinguir entre apoptose precoce (Anexina- V+, 7-AAD-), apoptose tardia (Anexina-V+, 7-AAD+) e células viáveis (Anexina-V-, 7 -AAD-). A concentração do composto de ligação foi re- presentada graficamente em relação à viabilidade percentual no Gra- phpad Prism 8. O gráfico resultante foi ajustado a uma regressão não linear para determinar EC50.

[00248] Os resultados estão representados na FIGURA 24, e de- monstram que a ligação do composto de ligação de três cadeias biva- lente biespecífico não causou apoptose direta de células Daudi ou Ramos. A ligação do Isatuximabe causou apoptose direta das células Daudi e Ramos, com apoptose máxima de 57% e 37%, respectiva- mente. Estes resultados demonstram que o composto de ligação de três cadeias biespecífico bivalente não causa apoptose indesejada de células CD38 positivas após a ligação.

[00249] “Não obstante as reivindicações anexas, a divulgação tam- bém é definida pelas seguintes cláusulas:

[00250] 1. Um composto de ligação biespecífico compreendendo um primeiro polipeptídeo com afinidade de ligação a um primeiro epi- topo em uma ectoenzima; e um segundo polipeptídeo com afinidade de ligação a um segundo epitopo não sobreposto na ectoenzima.

[00251] 2. O composto de ligação biespecífico da cláusula 1, em que o primeiro polipeptídeo compreende um domínio de ligação ao an- tígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao primeiro epitopo.

[00252] 3.O composto de ligação biespecífico da cláusula 2, em que o segundo polipeptídeo compreende um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao segundo epitopo.

[00253] 4. O composto de ligação biespecífico da cláusula 1, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem, cada um, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça.

[00254] 5.O composto de ligação biespecífico da cláusula 4, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem cada um pelo menos um domínio CH.

[00255] 6.O composto de ligação biespecífico da cláusula 5, em que o domínio CH compreende um domínio CH2 e/ou CH3 e/ou CHA4.

[00256] 7.0O composto de ligação biespecífico da cláusula 6, em que o domínio CH compreende um domínio CH2 e um domínio CH3.

[00257] 8. O composto de ligação biespecífico da cláusula 6, em que o domínio CH compreende um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CHA4.

[00258] 9 O composto de ligação biespecífico da cláusula 6, em que o domínio CH compreende uma região Fc de IgG1 humana.

[00259] 10. O composto de ligação biespecífico da cláusula 9, em que a região Fc de IgG1 humana é uma região Fc de IgG1 humana silenciada.

[00260] 11. O composto de ligação biespecífico da cláusula 6, em que o domínio CH compreende uma região Fc de IgG4 humana.

[00261] 12. O composto de ligação biespecífico da cláusula 11, em que a região Fc de IgG4 humana é uma região Fc de IgG4 humana silenciada.

[00262] 13. O composto de ligação biespecífico da cláusula 6, em que o domínio CH não compreende um domínio CH1.

[00263] 14. O composto de ligação biespecífico da cláusula 6, com- preendendo uma interface assimétrica entre os domínios CH2 e/ou CH3 e/ou CH4 do primeiro e do segundo polipeptídeos.

[00264] 15.O composto de ligação biespecífico da cláusula 1, em que o primeiro polipeptídeo compreende: um primeiro domínio de liga- ção ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao primeiro epitopo; e um segundo domínio de ligação ao antí- geno de um anticorpo de cadeia pesada tendo afinidade de ligação ao segundo epitopo.

[00265] 16.O composto de ligação biespecífico da cláusula 15, em que o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno são co- nectados por um ligante de polipeptídeo.

[00266] 17.O composto de ligação biespecífico da cláusula 16, em que o ligante de polipeptídeo consiste na sequência da SEQ ID NO: 45.

[00267] 18.O composto de ligação biespecífico da cláusula 15, em que o segundo polipeptídeo compreende: um primeiro domínio de liga- ção ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao primeiro epitopo; e um segundo domínio de ligação ao antí- geno de um anticorpo de cadeia pesada tendo afinidade de ligação ao segundo epitopo.

[00268] 19. O composto de ligação biespecífico da cláusula 18, em que o primeiro e o segundo domínios de ligação ao antígeno são co- nectados por um ligante de polipeptídeo.

[00269] 20.O composto de ligação biespecífico da cláusula 19, em que o ligante de polipeptídeo consiste na sequência da SEQ ID NO: 45.

[00270] 21.O composto de ligação biespecífico da cláusula 15, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem, cada um,

pelo menos uma porção de uma região de dobradiça.

[00271] 22.O composto de ligação biespecífico da cláusula 21, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem cada um pelo menos um domínio CH.

[00272] 23.O composto de ligação biespecífico da cláusula 22, em que o domínio CH compreende um domínio CH2 e/ou CH3 e/ou CHA4.

[00273] 24.O composto de ligação biespecífico da cláusula 23, em que o domínio CH compreende um domínio CH2 e um domínio CH3.

[00274] 25.O composto de ligação biespecífico da cláusula 23, em que o domínio CH compreende um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CHA4.

[00275] 26.O composto de ligação biespecífico da cláusula 23, em que o domínio CH não compreende um domínio CH1.

[00276] 27.O composto de ligação biespecífico da cláusula 22, em que o domínio CH compreende uma região Fc de IgG1 humana.

[00277] 28.O composto de ligação biespecífico da cláusula 27, em que a região Fc de IgG1 humana é uma região Fc de IgG1 humana silenciada.

[00278] 29.O composto de ligação biespecífico da cláusula 22, em que o domínio CH compreende uma região Fc de IgG4 humana.

[00279] 30. O composto de ligação biespecífico da cláusula 29, em que a região Fc de IgG4 humana é uma região Fc de IgG4 humana silenciada.

[00280] 31.O composto de ligação biespecífico da cláusula 1 com- preendendo: um primeiro e um segundo polipeptídeos de cadeia pe- sada, cada um compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao primeiro epitopo e um primeiro e um segundo polipeptídeos de cadeia leve, ca- da compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticor- po de cadeia pesada com afinidade de ligação ao segundo epitopo.

[00281] 32.O composto de ligação biespecífico da cláusula 31, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos de cadeia pesada compre- endem, cada um, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça.

[00282] 33.O composto de ligação biespecífico da cláusula 31, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos de cadeia pesada compre- endem cada um pelo menos um domínio CH.

[00283] 34.O composto de ligação biespecífico da cláusula 33, em que o domínio CH compreende um domínio CH1 e/ou CH2 e/ou CH3 e/ou CHA4.

[00284] 35.O composto de ligação biespecífico da cláusula 33, em que o domínio CH compreende um domínio CH1 e um domínio CH2 e um domínio CH3.

[00285] 36.O composto de ligação biespecífico da cláusula 33, em que o domínio CH compreende um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CHA4.

[00286] 37.O composto de ligação biespecífico da cláusula 31, em que o primeiro e o segundo polipeptídeos de cadeia leve compreen- dem, cada um, um domínio CL.

[00287] 38.O composto de ligação biespecífico da cláusula 33, em que o domínio CH compreende uma região Fc de IgG1 humana.

[00288] 39.O composto de ligação biespecífico da cláusula 38, em que a região Fc de IgG1 humana é uma região Fc de IgG1 humana silenciada.

[00289] 40.O composto de ligação biespecífico da cláusula 33, em que o domínio CH compreende uma região Fc de IgG4 humana.

[00290] 41.O composto de ligação biespecífico da cláusula 40, em que a região Fc de IgG4 humana é uma região Fc de IgG4 humana silenciada.

[00291] 42. O composto de ligação biespecífico de qualquer uma das cláusulas 1-41, em que a ectozima é CD38.

[00292] 43. O composto de ligação biespecífico da cláusula 42, em que: o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo de cadeia pesada tendo afinidade de ligação ao primeiro epitopo ou o segundo epitopo em CD38 compreende: (i) uma sequência de CDR1 tendo duas ou menos substituições em qualquer uma das sequências de aminoáci- dos da SEQ ID NOs: 1-5; e/ou (ii) uma sequência CDR2 tendo duas ou menos substituições em qualquer uma das sequências de aminoáci- dos de SEQ ID NOs: 6-12; e/ou (iii) uma sequência CDR3 tendo duas ou menos substituições em qualquer uma das sequências de aminoá- cidos de SEQ ID NOs: 13-17.

[00293] 44. O composto de ligação biespecífico da cláusula 43, em que as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 estão presentes em um es- trutura framework humano.

[00294] 45. O composto de ligação biespecífico de qualquer uma das cláusulas 43-44, compreendendo: (i) uma sequência CDR1 seleci- onada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-5; e/ou (ii) uma sequência de CDR2 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6-12; e/ou (iii) uma sequência de CDR3 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 13-17.

[00295] 46. O composto de ligação biespecífico da cláusula 45, compreendendo: (i) uma sequência CDR1 selecionada a partir do gru- po que consiste em SEQ ID NOs: 1-5; e (ii) uma sequência CDR2 se- lecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6-12; e (iii) uma se- quência CDR3 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 13-17.

[00296] 47. O composto de ligação biespecífico da cláusula 46, compreendendo: uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma se- quência CDR2 da SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 13; ou uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 3, uma sequência CDR?2 de SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 16;

ou uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma sequência CDR2 da SEQ ID NO: 11 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 17.

[00297] 48.O composto de ligação biespecífico da cláusula 47, em que: o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao primeiro epitopo em CD38 compreende uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 13; e o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao segundo epitopo em CD38 compreende uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 3, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 16.

[00298] 49. O composto de ligação biespecífico de qualquer uma das cláusulas 43-48, compreendendo uma sequência de região variá- vel com pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de SEQ ID NOs: 18-28.

[00299] 50. Os compostos de ligação biespecíficos da cláusula 49, compreendendo uma sequência de região variável selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 18-28.

[00300] 51.O composto de ligação biespecífico da cláusula 50, em que: o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao primeiro epitopo em CD38 compreende uma sequência de região variável de SEQ ID NO: 18; e o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo de cadeia pesada possuindo afinida- de de ligação ao segundo epitopo em CD38 compreende uma se- quência de região variável de SEQ ID NO: 23.

[00301] 52.Um anticorpo de cadeia pesada que se ligam a CD38, o anticorpo de cadeia pesada compreendendo um domínio de ligação ao antígeno compreendendo: (i) uma sequência CDR1 tendo duas ou menos substituições em qualquer uma das sequências de aminoáci- dos de SEQ ID NOs: 1-5; e/ou (ii) uma sequência CDR2 tendo duas ou menos substituições em qualquer uma das sequências de aminoáci- dos de SEQ ID NOs: 6-12; e/ou (iii) uma sequência CDR3 tendo duas ou menos substituições em qualquer uma das sequências de aminoá- cidos de SEQ ID NOs: 13-17.

[00302] 53.0O anticorpo de cadeia pesada da cláusula 52, em que as referidas sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 estão presentes em um framework humano.

[00303] 54.0 anticorpo de cadeia pesada da cláusula 52, compre- endendo adicionalmente uma sequência da região constante da ca- deia pesada na ausência de uma sequência de CH1.

[00304] 55.0O anticorpo de cadeia pesada de qualquer uma das cláusulas 52-54, compreendendo: (a) uma sequência CDR1 selecio- nada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-5; e/ou (b) uma se- quência de CDR2 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6-12; e/ou (c) uma sequência de CDR3 selecionada do grupo que con- siste em SEQ ID NOs: 13-17.

[00305] 56.0O anticorpo de cadeia pesada da cláusula 55, compre- endendo: (a) uma sequência CDR1 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-5; e (b) uma sequência CDR2 selecionada do gru- po que consiste em SEQ ID NOs: 6-12; e (c) uma sequência CDR3 selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 13-17.

[00306] 57.0O anticorpo de cadeia pesada da cláusula 56, compre- endendo: uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR?2 da SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 13; ou uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 3, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 16; ou uma se- quência CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma sequência CDR2 da SEQ ID NO: 11 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 17.

[00307] 58.0O anticorpo de cadeia pesada de qualquer uma das cláusulas 52-57, compreendendo uma sequência de região variável com pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de SEQ ID NOs: 18-28.

[00308] 59.0 anticorpo de cadeia pesada da cláusula 58, compre- endendo uma sequência de região variável selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 18-28.

[00309] 60. O anticorpo de cadeia pesada de qualquer uma das cláusulas 52-59, que é monoespecífico.

[00310] 61.0O anticorpo de cadeia pesada de qualquer uma das cláusulas 52-59, que é multiespecífico.

[00311] 62.0 anticorpo de cadeia pesada da cláusula 61, que é bi- específico.

[00312] 63.0O anticorpo de cadeia pesada da cláusula 62, que pos- sui afinidade de ligação a dois epitopos diferentes na mesma proteína CD38.

[00313] 64.0O anticorpo de cadeia pesada da cláusula 63, em que os dois epitopos diferentes são epitopos não sobrepostos.

[00314] 65.O anticorpo de cadeia pesada da cláusula 61, tendo afi- nidade de ligação a uma célula efetora.

[00315] 66.O anticorpo de cadeia pesada da cláusula 61, que pos- sui afinidade de ligação a um antígeno de célula T.

[00316] 67.O anticorpo de cadeia pesada da cláusula 66, tendo afi- nidade de ligação a CD3.

[00317] 68.0O anticorpo de cadeia pesada de qualquer uma das cláusulas 52-67, que está em um formato CAR-T.

[00318] 69. Um composto de ligação biespecífico com afinidade de ligação para um primeiro epitopo de CD38 e um segundo epitopo de CD38 não sobreposto, o composto de ligação biespecífico compreen- dendo: (a) um primeiro polipeptídeo tendo afinidade de ligação ao pri- meiro epitopo de CD38 compreendendo: (i) um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo de cadeia pesada compreendendo uma se-

quência CDR1 de SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 13; (ii) pelo menos uma porção de uma região de dobradiça; e (iii) um domínio CH compreen- dendo um domínio CH2 e um domínio CH3; e (b) um segundo polipep- tídeo com afinidade de ligação ao segundo epitopo de CD38 compre- endendo: (i) um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada compreendendo uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 3, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 9, e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 16; (ii) pelo menos uma porção de uma região de dobra- diça; e (ili) um domínio CH compreendendo um domínio CH2 e um domínio CH3; e (c) uma interface assimétrica entre o domínio CH3 do primeiro polipeptídeo e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo.

[00319] 70. O composto de ligação biespecífico da cláusula 69, compreendendo uma região Fc selecionada do grupo que consiste em: uma região Fc de IgG1 humana, uma região Fc de IgG4 humana, uma região Fc de IgG1 humana silenciada e uma região Fc de I9gG4 huma- na silenciada.

[00320] 71.Um composto de ligação biespecífico com afinidade de ligação a um primeiro epitopo de CD38 e um segundo epitopo de CD38 não sobreposto, o composto de ligação biespecífico compreen- dendo dois polipeptídeos idênticos, cada polipeptídeo compreendendo: (i) um primeiro domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de ca- deia pesada tendo afinidade de ligação para o primeiro epitopo CD38, compreendendo uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma se- quência CDR2 da SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 13; (ii) um segundo domínio de ligação ao antígeno de um anti- corpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao segundo epitopo CD38, compreendendo uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 3, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 16; (iii)pelo menos uma porção de uma região de dobradiça; e (iv)

um domínio CH compreendendo um domínio CH2 e um domínio CH3.

[00321] 72. O composto de ligação biespecífico da cláusula 71, compreendendo uma região Fc selecionada do grupo que consiste em: uma região Fc de IgG1 humana, uma região Fc de IgG4 humana, uma região Fc de IgG1 humana silenciada e uma região Fc de I9gG4 huma- na silenciada.

[00322] 73. Um composto de ligação biespecífico tendo afinidade de ligação a um primeiro epitopo de CD38 e um segundo epitopo de CD38 não sobreposto, o composto de ligação biespecífico compreen- dendo: (a) um primeiro e um segundo polipeptídeo de cadeia pesada, cada um compreendendo: (i) um domínio de ligação ao antígeno um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao primeiro epi- topo CD38, compreendendo uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 11, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 13; (ii) pelo menos uma porção de uma região de dobra- diça; e (iii) um domínio CH compreendendo um domínio CH1, um do- mínio CH2 e um domínio CH3; e (b) um primeiro e um segundo poli- peptídeo de cadeia leve, cada um compreendendo: (i) um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao segundo epitopo CD38, compreendendo uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 3, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 16; e (ii) um domínio CL.

[00323] 74. O composto de ligação biespecífico da cláusula 73, compreendendo uma região Fc selecionada do grupo que consiste em: uma região Fc de IgG1 humana, uma região Fc de IgG4 humana, uma região Fc de IgG1 humana silenciada e uma região Fc de I9gG4 huma- na silenciada.

[00324] 75. Uma composição farmacêutica que compreende um composto de ligação ou um anticorpo de cadeia pesada de qualquer uma das cláusulas 1 a 74.

[00325] 76. Uma combinação terapêutica compreendendo: o com- posto de ligação ou anticorpo de cadeia pesada de acordo com qual- quer uma das cláusulas 52-68; e um segundo anticorpo que se liga ao CD38.

[00326] 77.A combinação terapêutica da cláusula 76, em que o se- gundo anticorpo que se liga ao CD38 é isatuximabe ou daratumumabe.

[00327] 78. Um método para o tratamento de um distúrbio caracte- rizado pela expressão de CD38, compreendendo administrar a um su- jeito com o referido distúrbio um composto de ligação ou um anticorpo de cadeia pesada de qualquer uma das cláusulas 1 a 74, ou uma composição farmacêutica da cláusula 75.

[00328] 79.O método da cláusula 78, em que o distúrbio é caracte- rizado por uma atividade enzimática de hidrolase de CD38.

[00329] 80.O método da cláusula 78, em que o distúrbio é colite.

[00330] 81.O método da cláusula 78, em que o distúrbio é mieloma múltiplo (MM).

[00331] 82.O método da cláusula 78, em que o distúrbio é um dis- túrbio autoimune.

[00332] 83.O método da cláusula 82, em que o distúrbio é artrite reumatóide (RA).

[00333] 84. O método da cláusula 82, em que o distúrbio é pênfigo vulgar (PV).

[00334] 85.O método, de acordo com a cláusula 82, em que o dis- túrbio é lúpus eritematoso sistêmico (SLE).

[00335] 86.O método da cláusula 82, em que o distúrbio é esclero- se múltipla (MS), esclerose sistêmica ou fibrose.

[00336] 87.O método da cláusula 78, em que o distúrbio é uma le- são isquêmica.

[00337] 88.O método da cláusula 87, em que a lesão isquêmica é uma lesão cerebral isquêmica, uma lesão cardíaca isquêmica, uma lesão gastrointestinal isquêmica ou uma lesão renal isquêmica.

[00338] 89. O método de qualquer uma das cláusulas 78-88, com- preendendo ainda a administração ao sujeito de um segundo anticorpo que se liga a CD38.

[00339] 90.O método da cláusula 89, em que o segundo anticorpo que se liga ao CD38 é isatuximabe ou daratumumabe.

[00340] 91. Um polinucleotídeo que codifica um composto de liga- ção ou um anticorpo de cadeia pesada de qualquer uma das cláusulas 1a7a4.

[00341] 92. Um vetor compreendendo o polinucleotídeo da cláusula

91.

[00342] 93. Uma célula que compreende o vetor da cláusula 92.

[00343] 94. Um método de produção de um composto de ligação ou anticorpo de cadeia pesada de qualquer uma das cláusulas 1 a 74, 0 método compreendendo cultivar uma célula de acordo com a cláusula 86 sob condições permissivas para a expressão do composto de liga- ção ou do anticorpo de cadeia pesada e isolamento o composto de ligação ou o anticorpo de cadeia pesada da célula e/ou um meio de cultura de células em que a célula é cultivada.

[00344] 95.Um método de preparação de um composto de ligação ou anticorpo de cadeia pesada de qualquer uma das cláusulas 1 a 74, o método compreendendo a imunização de um animal UniRat com uma ectoenzima e a identificação de sequências de cadeia pesada de ligação a ectoenzima.

[00345] “Embora as modalidades preferíveis da presente invenção tenham sido mostradas e descritas neste documento, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas so- mente a título de exemplo. Diversas variações, alterações e substitui- ções ocorrerão agora àqueles versados na técnica, sem que haja afas- tamento da invenção. Deve-se entender que diversas alternativas às modalidades da invenção descritas neste documento podem ser em- pregadas na prática da invenção.

Pretende-se que as seguintes reivin- dicações definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo destas reivindicações e seus equivalentes sejam abrangidos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto de ligação biespecífico, caracterizado pelo fa- to de que compreende: um primeiro polipeptídeo com afinidade de ligação a um primeiro epitopo em CD38; e um segundo polipeptídeo com afinidade de ligação a um segundo epitopo não sobreposto em CD38.

2. Composto de ligação biespecífico, de acordo com a rei- vindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo compreende um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao primeiro epitopo ou ao se- gundo epitopo em CD38 e compreende: (i) uma sequência CDR1 possuindo duas ou menos substi- tuições em qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1-5; e/ou (ii) uma sequência CDR2 possuindo duas ou menos substi- tuições em qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6-12; e/ou (li) uma sequência CDR3 com duas ou menos substitui- ções em qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 13-17.

3. Composto de ligação biespecífico, de acordo com a rei- vindicação 2, caracterizado pelo fato de que as sequências CDR1, CDR?2 e CDR3 estão presentes em um framework humano.

4. Composto de ligação biespecífico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 2 e 3, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma sequência CDR1 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-5; e/ou (ii) uma sequência CDR2 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 6-12; e/ou (iii) uma sequência CDR3 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 13-17.

5. Composto de ligação biespecífico, de acordo com a rei- vindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma sequência CDR1 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-5; e/ou (ii) uma sequência CDR2 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 6-12; e/ou (iii) uma sequência CDR3 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 13-17.

6. Composto de ligação biespecífico, de acordo com a rei- vindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende: uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR?2 da SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 13; ou uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 3, uma sequência CDR?2 da SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 16; ou uma sequência de CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma sequência de CDR2 da SEQ ID NO: 11 e uma sequência de CDR3 da SEQ ID NO: 17.

7. Composto de ligação biespecífico, de acordo com a rei- vindicação 6, caracterizado pelo fato de que: o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao primeiro epitopo em CD38 com- preende uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR?2 da SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 13; e o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao segundo epitopo em CD38 com-

preende uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 3, uma sequência CDR?2 da SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 16.

8. Composto de ligação biespecífico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de região variável com pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de SEQ ID NOs: 18-28.

9. Compostos de ligação biespecíficos, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma se- quência de região variável selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 18-28.

10. Composto de ligação biespecífico, de acordo com a rei- vindicação 9, caracterizado pelo fato de que: o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo de cadeia pesada possuindo afinidade de ligação ao primeiro epitopo em CD38 compreende uma sequência de região variável de SEQ ID NO: 18; e o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao segundo epitopo em CD38 com- preende uma sequência de região variável de SEQ ID NO: 23.

11. Anticorpo de cadeia pesada que se liga a CD38, carac- terizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antí- geno compreendendo: (i) uma sequência CDR1 possuindo duas ou menos substi- tuições em qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1-5; e/ou (ii) uma sequência CDR2 possuindo duas ou menos substi- tuições em qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6-12; e/ou (li) uma sequência CDR3 com duas ou menos substitui- ções em qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID

NOs: 13-17.

12. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com a reivindi- cação 11, caracterizado pelo fato de que as referidas sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 estão presentes em um framework humano.

13. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com a reivindi- cação 11, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma sequência da região constante da cadeia pesada na ausência de uma sequência de CH1.

14. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que com- preende: (a) uma sequência CDR1 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-5; e/ou (b) uma sequência CDR2 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 6-12; e/ou (c) uma sequência CDR3 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 13-17.

15. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com a reivindi- cação 14, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma sequência CDR1 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-5; e/ou (b) uma sequência CDR2 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 6-12; e/ou (c) uma sequência CDR3 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 13-17.

16. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com a reivindi- cação 15, caracterizado pelo fato de que compreende: uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR?2 da SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 13; ou uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 3, uma sequência CDR?2 da SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 16; ou uma sequência de CDR1 da SEQ ID NO: 4, uma sequência de CDR2 da SEQ ID NO: 11 e uma sequência de CDR3 da SEQ ID NO: 17.

17. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado pelo fato de que com- preende uma sequência de região variável com pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de SEQ ID NOs: 18-28.

18. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com a reivindi- cação 17, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de região variável selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 18-28.

19. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizado pelo fato de que é mo- noespecífico.

20. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizado pelo fato de que é mul- tiespecífico.

21. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com a reivindi- cação 20, caracterizado pelo fato de que é biespecífico.

22. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com a reivindi- cação 21, caracterizado pelo fato de que possui afinidade de ligação a dois epitopos diferentes na mesma proteína CD38.

23. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com a reivindi- cação 22, caracterizado pelo fato de que os dois epitopos diferentes são epitopos não sobrepostos.

24. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com a reivindi-

cação 20, caracterizado pelo fato de que possui afinidade de ligação a uma célula efetora.

25. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com a reivindi- cação 20, caracterizado pelo fato de que possui afinidade de ligação a um antígeno de célula T.

26. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com a reivindi- cação 25, caracterizado pelo fato de que possui afinidade de ligação a CD3.

27. Anticorpo de cadeia pesada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 26, caracterizado pelo fato de que está em um formato CAR-T.

28. Composto de ligação biespecífico que possui afinidade de ligação a um primeiro epitopo de CD38 e um segundo epitopo de CD38 não sobreposto, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um primeiro polipeptídeo com afinidade de ligação ao primeiro epitopo CD38 compreendendo: (i) um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada compreendendo uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR2 da SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 13; (ii) pelo menos uma porção de uma região de dobradiça; e (iii) um domínio CH compreendendo um domínio CH2 e um domínio CH3; e (b) um segundo polipeptídeo com afinidade de ligação ao segundo epitopo de CD38, compreendendo: (i) um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada compreendendo uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 3, uma sequência CDR2 da SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 16; (ii) pelo menos uma porção de uma região de dobradiça; e

(iii) um domínio CH compreendendo um domínio CH2 e um domínio CH3; e (c) uma interface assimétrica entre o domínio CH3 do pri- meiro polipeptídeo e o domínio CH3 do segundo polipeptídeo.

29. Composto de ligação biespecífico, de acordo com a rei- vindicação 28, caracterizado pelo fato de que compreende uma regi- ão Fc selecionada do grupo que consiste em: uma região Fc de I9G1 humana, uma região Fc de IgG4 humana, uma região Fc de IgG1 hu- mana silenciada e uma região Fc de IgG4 humana silenciada.

30. Composto de ligação biespecífico que possui afinidade de ligação a um primeiro epitopo de CD38 e um segundo epitopo de CD38 não sobreposto, o composto de ligação biespecífico caracteri- zado pelo fato de que compreende dois polipeptídeos idênticos, cada polipeptídeo compreendendo: (i) um primeiro domínio de ligação ao antígeno de um anti- corpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao primeiro epitopo CD38, compreendendo uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 13; (ii) um segundo domínio de ligação ao antígeno de um anti- corpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao segundo epitopo CD38, compreendendo uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 3, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 16; (ili) pelo menos uma porção de uma região de dobradiça; e (iv) um domínio CH compreendendo um domínio CH2 e um domínio CH3.

31. Composto de ligação biespecífico, de acordo com a rei- vindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende uma regi- ão Fc selecionada do grupo que consiste em: uma região Fc de I9G1 humana, uma região Fc de IgG4 humana, uma região Fc de IgG1 hu- mana silenciada e uma região Fc de IgG4 humana silenciada.

32. Composto de ligação biespecífico que possui afinidade de ligação a um primeiro epitopo de CD38 e um segundo epitopo de CD38 não sobreposto, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um primeiro e um segundo polipeptídeo de cadeia pe- sada, cada um compreendendo: (i) um primeiro domínio de ligação ao antígeno de um anti- corpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao primeiro epitopo CD38, compreendendo uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 13; (ii) pelo menos uma porção de uma região de dobradiça; e (iii) um domínio CH compreendendo um domínio CH1, um domínio CH2 e um domínio CH3; e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo de cadeia leve, cada um compreendendo: (i) um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada com afinidade de ligação ao segundo epitopo CD38, compreendendo uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 3, uma se- quência CDR2 de SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 16; e (ii) um domínio CL.

33. Composto de ligação biespecífico, de acordo com a rei- vindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende uma regi- ão Fc selecionada do grupo que consiste em: uma região Fc de I9G1 humana, uma região Fc de IgG4 humana, uma região Fc de IgG1 hu- mana silenciada e uma região Fc de IgG4 humana silenciada.

34. Composto de ligação biespecífico que possui afinidade de ligação a um primeiro epitopo de CD38 e um segundo epitopo de

CD38 não sobreposto, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma primeira subunidade polipeptídica compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 1, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 6 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 13 em um framework de cadeia pesada humana; (b) uma segunda subunidade polipeptídica compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 49, uma sequência CDR2 da SEQ ID NO: 50 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 51, em um framework de cadeia leve humana; em que a primeira subunidade polipeptídica e a segunda subunidade polipeptídica em conjunto têm afinidade de ligação ao pri- meiro epitopo CD38; e (c) uma terceira subunidade polipeptídica compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia pesada compreendendo uma sequência CDR1 da SEQ ID NO: 3, uma se- quência CDR2 da SEQ ID NO: 9 e uma sequência CDR3 da SEQ ID NO: 16 em um framework de cadeia pesada humana, em uma configu- ração monovalente ou bivalente; em que a terceira subunidade polipeptídica tem afinidade de ligação ao segundo epitopo CD38 não sobreposto.

35. Composto de ligação biespecífico, de acordo com a rei- vindicação 34, caracterizado pelo fato de que a primeira subunidade polipeptídica compreende ainda um domínio CH1, pelo menos uma porção de uma região de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio cH3.

36. Composto de ligação biespecífico, de acordo com a rei- vindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que a terceira subuni- dade polipeptídica compreende ainda uma sequência de região cons-

tante que compreende pelo menos uma porção de uma região de do- bradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3, na ausência de um do- mínio CH1.

37. Composto de ligação biespecífico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pelo fato de que o framework da cadeia leve humana é um framework da cadeia leve kappa humana ou um framework da cadeia leve lambda humana.

38. Composto de ligação biespecífico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 34 a 37, caracterizado pelo fato de que a segunda subunidade polipeptídica compreende ainda um domínio CL.

39. Composto de ligação biespecífico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 34 a 38, caracterizado pelo fato de que compreende uma região Fc selecionada do grupo que consiste em: uma região Fc de IgG1 humana, uma região Fc de IgG4 humana, uma região Fc de IgG1 humana silenciada e uma região Fc de I9gG4 huma- na silenciada.

40. Composto de ligação biespecífico, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 34 a 39, caracterizado pelo fato de que compreende uma interface assimétrica entre o domínio CH3 da primei- ra subunidade polipeptídica e o domínio CH3 da terceira subunidade polipeptídica.

41. Composto de ligação biespecífico que possui afinidade de ligação a um primeiro epitopo de CD38 e um segundo epitopo de CD38 não sobreposto, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um primeiro polipeptídeo de cadeia pesada compreen- dendo a sequência de SEQ ID NO: 46; (b) um primeiro polipeptídeo de cadeia leve compreenden- do a sequência de SEQ ID NO: 48; e (c) um segundo polipeptídeo de cadeia pesada compreen-

dendo a sequência de SEQ ID NO: 47.

42. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto de ligação ou um anticorpo de cadeia pesada, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 41.

43. Método para o tratamento de um distúrbio, caracteriza- do pelo fato de que a expressão de CD38, compreendendo adminis- trar a um sujeito com o referido distúrbio um composto de ligação ou um anticorpo de cadeia pesada, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 41, ou uma composição farmacêutica, como defini- da na reivindicação 42.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio é distinguido por uma atividade en- zimática de hidrolase de CD38.

45. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio é colite.

46. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio é mieloma múltiplo (MM).

47. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio é um distúrbio autoimune.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio é artrite reumatoide (RA).

49. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio é pênfigo vulgar (PV).

50. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio é lúpus eritematoso sistêmico (SLE).

51. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio é esclerose múltipla (MS), esclerose sistêmica ou fibrose.

52. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteri- zado pelo fato de que o distúrbio é uma lesão isquêmica.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteri- zado pelo fato de que a lesão isquêmica é uma lesão cerebral isquê- mica, uma lesão cardíaca isquêmica, uma lesão gastrointestinal is- quêmica ou uma lesão renal isquêmica.

54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 a 53, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração ao sujeito de um segundo anticorpo que se liga a CD38.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracteri- zado pelo fato de que o segundo anticorpo que se liga ao CD38 é isatuximabe ou daratumumabe.

56. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato que codifica um composto de ligação ou um anticorpo de cadeia pesada, como de- finido em qualquer uma das reivindicações 1 a 41.

57. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 56.

58. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, como definido na reivindicação 57.

59. Método de produção de um composto de ligação ou an- ticorpo de cadeia pesada, como definido em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula, como definida na reivindicação 58, sob condições permis- sivas para a expressão do composto de ligação ou do anticorpo de ca- deia pesada e isolar o composto de ligação ou o anticorpo de cadeia pesada da célula e/ou um meio de cultura de células em que a célula é cultivada.

60. Método de produção de um composto de ligação ou an- ticorpo de cadeia pesada, como definido em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que compreende a imuni- zação de um animal UniRat com uma proteína CD38 e a identificação de sequências de cadeia pesada de ligação à proteína CD38.