KR20230148828A - 항-psma 항체 및 car-t 구조 - Google Patents
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Abstract
항-PSMA 항체(예를 들어, UniAbTM) 및 CAR-T 구조가 이러한 항체 및 CAR-T 구조의 제조 방법, 이러한 항체 및 CAR-T 구조를 포함하는 조성물(약학적 조성물 포함), 및 PSMA의 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하기 위한 이들의 용도와 함께 개시된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 2월 25일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/153,884호의 출원일에 대한 우선권 이익을 주장하며, 이의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 PSMA에 결합하는 항체(예를 들어, UniAbTM) 및 CAR-T 구조에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 항체 및 CAR-T 구조의 제조 방법, 이러한 항체 및 CAR-T 구조를 포함하는 조성물(약학적 조성물 포함), 및 PSMA의 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
PSMA
전립선 특이적 막 항원 및 글루타메이트 카복시펩티다제 II(UniProt Q04609)로도 알려진 PSMA는 N-아세틸화-알파-연결-산성 디펩티다제, 폴레이트 하이드롤라제, 및 디펩티딜-펩티다제 활성을 갖는 II형 막관통 단백질이다. 이는 인간에서 FOLH1 유전자에 의해 암호화되며, 19아미노산 세포질 도메인, 24아미노산 막관통 부분, 및 707아미노산 세포외 부분으로 구성된다. 이 단백질은 비공유 동종이량체로서 효소 활성을 띤다. PSMA는 전립선 상피 조직에서 발현되며, 전립선암 및 고형 종양의 신생혈관계에서 상향조절된다. 이는 뇌, 신장, 및 침샘과 같은 건강한 조직에서도 낮은 수준으로 발현되지만, 악성 전립선 조직에서 과발현되므로 전립선암의 치료적 요법에 대한 매력적인 표적이 된다. 이는 또한 악성 신생혈관계에서 발현이 높다는 점에서 고형 종양의 치료법 또는 영상화와 관련이 있을 수 있다. 전이성 전립선암의 치료에 대해, PSMA를 표적화하는 단일클론 항체, 항체-약물 접합체, 및 키메라 항원 수용체 T-세포가 기술된 바 있다(Hernandez-Hoyos et al 2016, PMID: 27406985, DiPippo et al 2014, PMID: 25327986, Serganova et al 2016, PMID: 28345023). 또한, 전립선암의 영상화 및 치료에 대해, PSMA에 특이적인 방사성핵종 접합체가 연구되고 있다(예를 들어, 문헌[Hofman et al., 2018 PMID: 29752180]).
중쇄 항체
통상적인 IgG 항체에서, 중쇄와 경쇄의 회합은 부분적으로 경쇄 불변 영역과 중쇄의 CH1 불변 도메인 사이의 소수성 상호작용에 기인한다. 중쇄 프레임워크 2(FR2) 및 프레임워크 4(FR4) 영역에는 중쇄와 경쇄 사이의 이러한 소수성 상호작용에도 기여하는 추가 잔기가 있다.
그러나, 낙타과(낙타, 단봉 낙타, 및 라마를 포함하는 틸로포다 아목)의 혈청에는 쌍을 이룬 H-사슬만으로 구성된 주요 유형의 항체(중쇄 단독 항체 또는 UniAbTM)가 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 낙타과(Camelidae)(단봉낙타, 쌍봉 낙타, 글라마 라마, 과나코 라마, 알파카 라마, 및 비쿠냐 라마)의 UniAbTM는 단일 가변 도메인(VHH), 힌지 영역, 및 전형적 항체의 CH2 및 CH3 도메인과 매우 상동성인 2개의 불변 도메인(CH2 및 CH3)으로 이루어진 특유의 구조를 가지고 있다. 이러한 UniAbTM에는 불변 영역의 제1 도메인(CH1)이 없으며, 이는 게놈에 존재하지만 mRNA 처리 중에 제거된다. CH1 도메인은 경쇄의 불변 도메인에 대한 고정 위치이므로, 이 도메인의 부재는 UniAbTM에서의 경쇄의 부재를 설명한다. 이러한 UniAbTM는 통상적인 항체 또는 이의 단편으로부터 3개의 CDR에 의해 항원 결합 특이성과 높은 친화성을 부여하도록 자연적으로 진화하였다(Muyldermans, 2001; J Biotechnol 74:277-302; Revets et al., 2005; Expert Opin Biol Ther 5:111-124). 상어와 같은 연골 어류는 또한, 폴리펩티드 경쇄가 없고 전부 중쇄로 구성된, IgNAR로 명명된 독특한 유형의 면역글로불린을 진화시켰다. IgNAR 분자는 단일 중쇄 폴리펩티드의 가변 도메인(vNAR)을 생성하도록 분자 공학에 의해 조작될 수 있다(Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)).
경쇄가 없는 중쇄 단독 항체가 항원에 결합하는 능력은 1960년대에 규명되었다(Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). 경쇄로부터 물리적으로 분리된 중쇄 면역글로불린은 사량체 항체에 비해 항원 결합 활성의 80%를 유지하였다. Sitia 등((1990) Cell, 60, 781-790)은 재배열된 마우스 μ 유전자에서 CH1 도메인을 제거함으로써 포유류 세포 배양에서 경쇄가 없는 중쇄 단독 항체가 생성됨을 입증하였다. 생성된 항체는 VH 결합 특이성과 이펙터 기능을 유지하였다.
높은 특이성과 친화성을 갖는 중쇄 항체는 면역화를 통해 다양한 항원에 대해 생성될 수 있으며(van der Linden, R. H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)), VHH 부분은 쉽게 클로닝되어 효모에서 발현될 수 있다(Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). 이들의 발현, 용해도, 및 안정성 수준은 전형적인 F(ab) 또는 Fv 단편보다 훨씬 높다(Ghahroudi, M. A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)).
λ(람다) 경(L)쇄 유전자좌 및/또는 λ 및 κ(카파) L쇄 유전자좌가 기능적으로 침묵된 마우스 및 이러한 마우스에 의해 생성된 항체는 미국 특허 7,541,513호 및 8,367,888호에 기재되어 있다. 마우스 및 래트에서의 중쇄 단독 항체의 재조합 생성은 예를 들어 문헌[WO 2006008548; 미국 출원 공개 20100122358호; Nguyen et al., 2003, Immunology; 109(1), 93-101; Br
ggemann et al., Crit. Rev. Immunol.; 2006, 26(5):377-90; 및 Zou et al., 2007, J Exp Med; 204(13): 3271-3283]에 보고된 바 있다. 징크 핑거 뉴클레아제의 배아 미세주입을 통한 녹아웃 래트의 생성은 문헌[Geurts et al., 2009, Science, 325(5939):433]에 기재되어 있다. 가용성 중쇄 단독 항체 및 이러한 항체를 생성하는 이종 중쇄 유전자좌를 포함하는 유전자이식 설치류는 미국 특허 8,883,150호 및 9,365,655호에 기재되어 있다. 결합(표적화) 도메인으로서 단일-도메인 항체를 포함하는 CAR-T 구조는 예를 들어 문헌[Iri-Sofla et al., 2011, Experimental Cell Research 317:2630-2641 및 Jamnani et al., 2014, Biochim Biophys Acta, 1840:378-386]에 기재되어 있다.
본 발명의 양태는 PSMA에 결합하는 항체로서, (a) 서열번호 1 또는 4의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 포함하는 CDR1 서열; 및/또는 (b) 서열번호 2 또는 5의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 포함하는 CDR2 서열; 및/또는 (c) 서열번호 3 또는 6의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 인간 프레임워크에 존재한다. 일부 구현예에서, 항체는 CH1 서열의 부재하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 (a) 서열번호 1 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열; 및/또는 (b) 서열번호 2 및 5로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열; 및/또는 (c) 서열번호 3 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 (a) 서열번호 1 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열; 및 (b) 서열번호 2 및 5로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열; 및 (c) 서열번호 3 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 (a) 서열번호 1의 CDR1 서열, 서열번호 2의 CDR2 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 서열; 또는 (b) 서열번호 4의 CDR1 서열, 서열번호 5의 CDR2 서열, 및 서열번호 6의 CDR3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 서열번호 7 내지 8의 임의의 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 서열번호 7 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 서열번호 7의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 서열번호 8의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
본 발명의 양태는 PSMA에 결합하는 항체로서, 인간 VH 프레임워크에 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함하며, CDR 서열은 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 서열에서 2개 이하의 치환을 갖는 서열이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 VH 프레임워크에 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDR 서열은 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 양태는 PSMA에 결합하는 항체로서, (a) 인간 VH 프레임워크 내 서열번호 1의 CDR1 서열, 서열번호 2의 CDR2 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 서열; 또는 (b) 인간 VH 프레임워크 내 서열번호 4의 CDR1 서열, 서열번호 5의 CDR2 서열, 및 서열번호 6의 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 다중특이적이다. 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적이다. 일부 구현예에서, 항체는 2개의 상이한 PSMA 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 동일한 PSMA 단백질 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 이펙터 세포에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 T-세포 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 CD3에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 CAR-T 형식이다.
본 발명의 양태는 (a) 서열번호 1의 CDR1 서열, 서열번호 2의 CDR2 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 서열; 또는 (b) 서열번호 4의 CDR1 서열, 서열번호 5의 CDR2 서열, 및 서열번호 6의 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, PSMA에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 CAR-T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, PSMA에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 7 내지 8의 임의의 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, PSMA에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 7 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PSMA에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 7의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PSMA에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 8의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
본 발명의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 항체, 또는 본원에 기재된 바와 같은 CAR-T 세포를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 양태는 PSMA의 발현을 특징으로 하는 장애의 치료 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 항체, 본원에 기재된 바와 같은 CAR-T 세포, 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을 상기 장애가 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 장애는 전립선암이다.
본 발명의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 항체, 또는 본원에 기재된 바와 같은 CAR-T 세포의 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 본 발명의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 세포를 포함한다.
본 발명의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 생성하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 세포를 항체의 발현이 허용되는 조건하에 성장시키는 단계, 및 세포가 성장되는 세포 배양 배지 및/또는 세포로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 본 발명의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 제조하는 방법으로서, PSMA로 UniRat 동물을 면역화하는 단계, 및 PSMA 결합 중쇄 서열을 확인하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
본 발명의 양태는 치료를 필요로 하는 개체에게 본원에 기재된 바와 같은 항체, 본원에 기재된 바와 같은 CAR-T 세포, 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물의 유효 용량을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 양태는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 항체, 또는 본원에 기재된 바와 같은 CAR-T 세포의 용도를 포함한다.
본 발명의 양태는 치료법을 필요로 하는 개체에서의 치료법에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 항체, 본원에 기재된 바와 같은 CAR-T 세포, 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물의 용도를 포함한다.
본 발명의 양태는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하기 위한 키트로서, 본원에 기재된 바와 같은 항체, 본원에 기재된 바와 같은 CAR-T 세포, 또는 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 적어도 하나의 추가 시약을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가 시약은 화학요법 약물을 포함한다.
이러한 양태 및 추가 양태는 실시예를 포함하여 본 명세서의 나머지 부분에서 추가로 설명될 것이다.
도 1은 표시된 항체 구성체에 대한 세포 결합 및 ELISA 데이터를 보여주는 표이다.
도 2는 표시된 항체 구성체에 대해 항체 농도의 함수로서 세포 용해 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 3은 표시된 항체 구성체에 대한 결합 친화도 데이터를 보여주는 표이다.
도 4a는 항-PSMA 세포외 결합 도메인을 포함하는 CAR-T 구조의 개략도이다.
도 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-PSMA CAR 구성체로 형질감염된 Jurkat 세포의 T-세포 활성을 보여주는 그래프이다.
도 4c는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-PSMA CAR 구성체로 형질감염된 Jurkat 세포의 T-세포 활성을 보여주는 그래프이다.
도 5a는 표시된 항체 구성체에 대해 CAR-T 주입 후 일수의 함수로서 종양 진행을 보여주는 그래프이다.
도 5b는 표시된 항체 구성체에 대해, 도 5a에 나타낸 그래프의 곡선 아래 면적을 보여주는 막대 차트이다.
도 6a는 표시된 항체 구성체에 대해 CAR-T 주입 후 일수의 함수로서 혈중 생체내 T-세포 수를 보여주는 그래프이다.
도 6b는 표시된 항체 구성체에 대해, 도 6a에 나타낸 그래프의 곡선 아래 면적을 보여주는 막대 차트이다.
도 2는 표시된 항체 구성체에 대해 항체 농도의 함수로서 세포 용해 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 3은 표시된 항체 구성체에 대한 결합 친화도 데이터를 보여주는 표이다.
도 4a는 항-PSMA 세포외 결합 도메인을 포함하는 CAR-T 구조의 개략도이다.
도 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-PSMA CAR 구성체로 형질감염된 Jurkat 세포의 T-세포 활성을 보여주는 그래프이다.
도 4c는 본 발명의 일 구현예에 따른 항-PSMA CAR 구성체로 형질감염된 Jurkat 세포의 T-세포 활성을 보여주는 그래프이다.
도 5a는 표시된 항체 구성체에 대해 CAR-T 주입 후 일수의 함수로서 종양 진행을 보여주는 그래프이다.
도 5b는 표시된 항체 구성체에 대해, 도 5a에 나타낸 그래프의 곡선 아래 면적을 보여주는 막대 차트이다.
도 6a는 표시된 항체 구성체에 대해 CAR-T 주입 후 일수의 함수로서 혈중 생체내 T-세포 수를 보여주는 그래프이다.
도 6b는 표시된 항체 구성체에 대해, 도 6a에 나타낸 그래프의 곡선 아래 면적을 보여주는 막대 차트이다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한 당업계의 기술 범위 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001); Harlow, Lane and Harlow, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998); 및 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988)]에 충분히 설명되어 있다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 해당 범위의 상한과 하한 사이에서 하한의 10분의 1 단위까지의 각 중간 값 및 명시된 범위 내의 임의의 다른 명시된 값 또는 사이의 값은 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있는 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한도 명시된 범위에서 임의의 구체적으로 제외된 한계에 따라 본 발명 내에 포함된다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 한계의 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
달리 나타내지 않는 한, 본원의 항체 잔기는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]).
하기 설명에서, 본 발명의 보다 철저한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 제시된다. 그러나, 이러한 특정 세부사항 중 하나 이상 없이 본 발명이 실시될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 당업자에게 잘 알려진 특징 및 절차는 본 발명을 모호하게 하는 것을 피하기 위해 설명되지 않았다.
특허 출원 및 간행물을 포함하여 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
I.
정의
"포함하는"은 언급된 요소가 조성물/방법/키트에 필요하지만 청구범위 내에서 조성물/방법/키트 등을 형성하기 위해 다른 요소가 포함될 수 있음을 의미한다.
"~로 본질적으로 이루어진"은 대상 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 명시된 재료 또는 단계로 기술된 조성물 또는 방법의 범위를 제한하는 것을 의미한다.
"~로 이루어진"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 조성물, 방법, 또는 키트에서 제외함을 의미한다.
본원의 항체 잔기는 Kabat 넘버링 시스템 및 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 가변 도메인의 잔기(대략적으로 중쇄의 잔기 1~113)를 언급하는 경우 Kabat 넘버링 시스템이 일반적으로 사용된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기를 언급하는 경우 "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"가 일반적으로 사용된다(예를 들어, 상기 Kabat 등의 문헌에 보고된 EU 인덱스). "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본원에서 달리 언급하지 않는 한, 항체의 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 Kabat 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급하지 않는 한, 항체의 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다.
면역글로불린이라고도 하는 항체는 통상적으로 적어도 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 포함하며, 중쇄 및 경쇄의 아미노 말단 도메인은 서열이 가변적이므로, 일반적으로 가변 영역 도메인, 또는 가변 중쇄(VH) 또는 가변 경쇄(VL) 도메인이라고 한다. 두 도메인은 통상적으로 회합하여 특이적 결합 영역을 형성하고, 본원에서 논의하겠지만, 특이적 결합은 중쇄 단독 가변 서열로도 얻을 수 있으며, 다양한 비천연 배열의 항체가 당업계에 알려져 있고 사용된다.
"기능적" 또는 "생물학적으로 활성인" 항체 또는 항원 결합 분자(본원에 기재된 중쇄 단독 항체 및 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 3쇄 항체유사 분자(TCA) 포함)는 구조적, 조절적, 생화학적, 또는 생물물리학적 이벤트에서 천연 활성 중 하나 이상을 발휘할 수 있는 것이다. 예를 들어, 기능적 항체 또는 다른 결합 분자, 예를 들어 TCA는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 가질 수 있으며, 결합은 결과적으로 신호 전달 또는 효소 활성과 같은 세포 또는 분자 이벤트를 유도하거나 변경할 수 있다. 기능적 항체 또는 다른 결합 분자, 예를 들어 TCA는 또한 수용체의 리간드 활성화를 차단하거나 작용제 또는 길항제로 작용할 수 있다. 항체 또는 다른 결합 분자, 예를 들어 TCA가 천연 활성 중 하나 이상을 발휘하는 능력은 폴리펩티드 쇄의 적절한 폴딩 및 어셈블리를 비롯한 여러 요인에 따라 달라진다.
본원에서 "항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 단일클론 항체, 다클론 항체, 단량체, 이량체, 다량체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 중쇄 단독 항체, 3쇄 항체, TCA, 단일쇄 Fc(scFv), 나노바디 등을 포함하며, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편도 포함한다(Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). 항체는 뮤린 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 다른 종에서 유래된 항체일 수 있다.
"항체"라는 용어는 전장 중쇄, 전장 경쇄, 온전한 면역글로불린 분자, 또는 이러한 폴리펩티드 중 임의의 것의 면역학적 활성 부분, 즉 관심 표적의 항원 또는 이의 일부에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있으며, 이러한 표적은 암세포, 또는 자가면역 질환과 관련된 자가면역 항체를 생성하는 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본원에 개시된 면역글로불린은 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 서브클래스(감소 또는 강화된 이펙터 세포 활성을 제공하는 변경된 Fc 부분을 갖는 조작된 서브클래스 포함)일 수 있다. 대상 항체의 경쇄는 카파 경쇄(V카파) 또는 람다 경쇄(V람다)일 수 있다. 면역글로불린은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, 면역글로불린은 주로 인간에서 유래된 것이다.
본원에서 사용되는 "단일클론 항체"라는 용어는 실질적으로 동종인 항체의 집단(즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는, 집단을 구성하는 개별 항체가 동일함)으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 단일클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지정된다. 또한, 일반적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지정된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (다클론) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지정된다. 본 발명에 따른 단일클론 항체는 문헌[Kohler et al. (1975) Nature 256:495]에서 처음 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있으며, 또한 예를 들어 재조합 단백질 생성 방법을 통해 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 4,816,567호 참조).
항체와 관련하여 사용되는 "가변"이라는 용어는 항체 가변 도메인의 특정 부분이 항체 간에 서열에 있어 광범위하게 다르고 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 나타낸다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전체에 고르게 분포되어 있지는 않다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 초가변 영역이라고 하는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분을 프레임워크 영역(FR)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 β-시트 구조를 연결(일부 경우에는 그 일부를 형성)하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 주로 β-시트 배열을 채택하는, 4개의 FR을 포함한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 밀접하게 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)에 대한 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "초가변 영역"이라는 용어는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, 중쇄 가변 도메인의 잔기 31~35(H1), 50~65(H2), 및 95~102(H3); 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 및/또는 중쇄 가변 도메인의 "초가변 루프" 잔기 26~32(H1), 53~55(H2), 및 96~101(H3)로부터의 잔기; 문헌[Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함한다. 일부 구현예에서, "CDR"은 문헌[Lefranc, MP et al., IMGT, the International ImMunoGeneTics database, Nucleic Acids Res., 27:209-212 (1999)]에 정의된 바와 같은 항체의 상보성 결정 영역을 의미한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역/CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
예시적인 CDR 명칭이 본원에 제시되어 있지만, 당업자는 서열 가변성 기반의 가장 일반적으로 사용되는 Kabat 정의(문헌["Zhao et al. A germline knowledge based computational approach for determining antibody complementarity determining regions." Mol Immunol. 2010;47:694-700] 참조)를 포함하여 다수의 CDR 정의가 일반적으로 사용되고 있음을 이해할 것이다. Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 한다(Chothia et al. "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions." Nature. 1989; 342:877-883). 관심 있는 대체 CDR 정의는 문헌[Honegger, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool." J Mol Biol. 2001;309:657-670; Ofran et al. "Automated identification of complementarity determining regions (CDRs) reveals peculiar characteristics of CDRs and B-cell epitopes." J Immunol. 2008;181:6230-6235; Almagro "Identification of differences in the specificity-determining residues of antibodies that recognize antigens of different size: implications for the rational design of antibody repertoires." J Mol Recognit. 2004;17:132-143; 및 Padlanet al. "Identification of specificity-determining residues in antibodies." Faseb J. 1995;9:133-139]에 개시된 것들을 제한 없이 포함하며, 각각의 문헌은 참조로 본원에 구체적으로 포함된다.
용어 "중쇄 단독 항체" 및 "중쇄 항체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 가장 넓은 의미에서, 통상적인 항체의 경쇄가 결여된 항체, 또는 항체의 하나 이상의 부분, 예를 들어 항체의 하나 이상의 아암을 지칭한다. 이 용어는 구체적으로, CH1 도메인의 부재하에 VH 항원 결합 도메인 및 CH2 및 CH3 불변 도메인을 포함하는 동종이량체 항체; 이러한 항체의 기능적 (항원 결합) 변이체, 가용성 VH 변이체, 1개의 가변 도메인(V-NAR) 및 5개의 C-유사 불변 도메인(C-NAR)을 포함하는 Ig-NAR 및 이의 기능적 단편; 및 가용성 단일 도메인 항체(sUniDabTM)를 제한 없이 포함한다. 일 구현예에서, 중쇄 단독 항체는 프레임워크 1, CDR1, 프레임워크 2, CDR2, 프레임워크 3, CDR3, 및 프레임워크 4로 구성된 가변 영역 항원 결합 도메인으로 구성된다. 다른 구현예에서, 중쇄 단독 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH2 및 CH3 도메인으로 구성된다. 다른 구현예에서, 중쇄 단독 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH2 도메인으로 구성된다. 추가 구현예에서, 중쇄 단독 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH3 도메인으로 구성된다. CH2 및/또는 CH3 도메인이 절단된 중쇄 단독 항체가 또한 본원에 포함된다. 추가 구현예에서, 중쇄는 항원 결합 도메인, 및 적어도 하나의 CH(CH1, CH2, CH3, 또는 CH4) 도메인으로 구성되지만, 힌지 영역은 없다. 중쇄 단독 항체는 2개의 중쇄가 이황화 결합되거나 달리 공유적으로 또는 비공유적으로 서로 부착된 이량체 형태일 수 있다. 중쇄 단독 항체는 IgG 서브클래스에 속할 수 있지만, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 서브클래스와 같은 다른 서브클래스에 속하는 항체도 본원에 포함된다. 특정 구현예에서, 중쇄 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입, 특히 IgG1 또는 IgG4 서브타입이다. 일 구현예에서, 중쇄 항체는 CH 도메인 중 하나 이상이 항체의 이펙터 기능을 변경하도록 변형된 IgG4 서브타입이다. 일 구현예에서, 중쇄 항체는 CH 도메인 중 하나 이상이 항체의 이펙터 기능을 변경하도록 변형된 IgG1 또는 IgG4 서브타입이다. 이펙터 기능을 변경하는 CH 도메인의 변형은 본원에 추가로 설명된다. 중쇄 항체의 비제한적인 예는 예를 들어 WO2018/039180에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 본원의 중쇄 단독 항체는 키메라 항원 수용체(CAR)의 결합(표적화) 도메인으로서 사용된다. 이 정의는 구체적으로 인간 면역글로불린 유전자이식 래트(UniRatTM)에 의해 생성되는 UniAbTM라고 하는 중쇄 단독 항체를 포함한다. UniAbTM의 가변 영역(VH)은 UniDabTM라고 하며, 다중특이성, 증가된 효능 및 연장된 반감기를 갖는 신규 치료제의 개발을 위해 Fc 영역 또는 혈청 알부민에 연결될 수 있는 다용도의 빌딩 블록이다. 동종이량체 UniAbTM는 경쇄가 없고 따라서 VL 도메인이 없기 때문에, 항원은 하나의 단일 도메인, 즉 중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인(VH 또는 VHH)에 의해 인식된다.
본원에서 사용되는 "온전한 항체 사슬"은 전장 가변 영역 및 전장 불변 영역(Fc)을 포함하는 것이다. 온전한 "통상적인" 항체는 온전한 경쇄 및 온전한 중쇄를 포함할 뿐만 아니라, 분비된 IgG의 경우 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, 힌지, CH2 및 CH3을 포함할 수 있다. IgM 또는 IgA와 같은 다른 이소형은 다른 CH 도메인을 가질 수 있다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 온전한 항체는 하나 이상의 "이펙터 기능"을 가질 수 있으며, 이는 항체의 Fc 불변 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 의미한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 및 세포 표면 수용체의 하향 조절을 포함한다. 불변 영역 변이체는 이펙터 프로파일, Fc 수용체에 대한 결합 등을 변경하는 것을 포함한다.
중쇄의 Fc(불변 도메인)의 아미노산 서열에 따라, 항체 및 다양한 항원 결합 단백질은 상이한 클래스로서 제공될 수 있다. 중쇄 Fc 영역에는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 5가지 주요 클래스가 있으며, 이들 중 일부는 "서브클래스"(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 상응하는 Fc 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있다. Ig 형태는 힌지-변형 형태 또는 힌지 없는 형태를 포함한다(Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; US 2005/0048572; US 2004/0229310). 모든 척추동물 종의 항체 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 κ(카파) 및 λ(람다)라는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 본 발명의 구현예에 따른 항체는 카파 경쇄 서열 또는 람다 경쇄 서열을 포함할 수 있다.
"기능적 Fc 영역"은 천연-서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 이펙터 기능의 비제한적인 예는 C1q 결합; CDC; Fc-수용체 결합; ADCC; ADCP; 세포 표면 수용체(예를 들어, B-세포 수용체)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 수용체, 예를 들어 FcγRI; FcγRIIA; FcγRIIB1; FcγRIIB2; FcγRIIIA; FcγRIIIB 수용체, 및 저친화성 FcRn 수용체와 상호작용하기 위해 Fc 영역을 필요로 하며; 당업계에 알려진 다양한 분석법을 사용하여 평가할 수 있다. "죽은" 또는 "침묵된" Fc는 예를 들어 혈청 반감기 연장과 관련하여 활성을 유지하도록 돌연변이되었지만, 고친화성 Fc 수용체를 활성화하지 않거나 Fc 수용체에 대해 감소된 친화도를 갖는 것이다.
"천연-서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연-서열 인간 Fc 영역은 예를 들어 천연-서열 인간 IgG1 Fc 영역(비-A 및 A 동종이형); 천연-서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연-서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연-서열 인간 IgG4 Fc 영역, 뿐만 아니라 이의 자연발생적 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 천연-서열 Fc 영역의 아미노산 서열과는 다른 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연-서열 Fc 영역 또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어 천연-서열 Fc 영역 또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역에 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연-서열 Fc 영역 및/또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90%의 상동성, 더 바람직하게는 적어도 약 95%의 상동성을 가질 것이다.
변이체 Fc 서열은 EU 인덱스 위치 234, 235, 및 237에서 FcγRI 결합을 감소시키기 위해 CH2 영역에 3개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다(문헌[Duncan et al., (1988) Nature 332:563] 참조). EU 인덱스 위치 330 및 331의 보체 C1q 결합 부위에서 2개의 아미노산 치환은 보체 고정을 감소시킨다(문헌[Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993) 및 Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991)] 참조). 위치 233~236의 인간 IgG1 또는 IgG2 잔기로의 치환 및 위치 327, 330, 및 331의 IgG4 잔기로의 치환은 ADCC 및 CDC를 크게 감소시킨다(예를 들어, 문헌[Armour KL. et al., 1999 Eur J Immunol. 29(8):2613-24; 및 Shields RL. et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604] 참조). 인간 IgG4 Fc 아미노산 서열(UniProtKB No. P01861)은 본원에서 서열번호 76으로 제공된다. 침묵된 IgG1은 예를 들어 문헌[Boesch, A.W., et al., "Highly parallel characterization of IgG Fc binding interactions." MAbs, 2014. 6(4): p. 915-27]에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
이황화 결합을 형성할 수 있는 영역이 결실된 것, 또는 천연 Fc의 N-말단에서 특정 아미노산 잔기가 제거된 것, 또는 천연 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 추가된 것을 포함하여, 다른 Fc 변이체가 가능하다. 따라서, 일부 구현예에서, 항체의 하나 이상의 Fc 부분은 이황화 결합을 제거하기 위해 힌지 영역에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, Fc의 힌지 영역은 완전히 제거될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항체는 Fc 변이체를 포함할 수 있다.
또한, Fc 변이체는 보체 결합 또는 Fc 수용체 결합을 일으키기 위해 아미노산 잔기를 치환(돌연변이)시키거나 결실시키거나 추가함으로써 이펙터 기능을 제거하거나 실질적으로 감소시키도록 구성될 수 있다. 비제한적인 예를 들어, 결실은 C1q-결합 부위와 같은 보체-결합 부위에서 발생할 수 있다. 면역글로불린 Fc 단편의 이러한 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제 특허 공개 WO 97/34631호 및 WO 96/32478호에 개시되어 있다. 또한, Fc 도메인은 인산화, 황산화, 아실화, 글리코실화, 메틸화, 파르네실화, 아세틸화, 아미드화 등에 의해 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함하며, 이는 본원에서 선택적으로 IgG4 CH3 노브 서열로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 T366S 돌연변이, L368A 돌연변이, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함하며, 이는 본원에서 선택적으로 IgG4 CH3 홀 서열로 지칭될 수 있다. 본원에 기재된 IgG4 CH3 돌연변이는 임의의 적합한 방식으로 항체 이량체에서 제1 단량체의 제1 중쇄 불변 영역 상에 "노브"를 배치하고 항체 이량체에서 제2 단량체의 제2 중쇄 불변 영역 상에 "홀"을 배치함으로써 항체에서 중쇄 폴리펩티드 서브유닛의 목적하는 쌍의 적절한 쌍 형성(이종이량체화)을 촉진하도록 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 S228P 돌연변이, F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 Fc 영역을 포함하는 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(노브)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 S228P 돌연변이, F234A 돌연변이, L235A 돌연변이, T366S 돌연변이, L368A 돌연변이, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG4 Fc 영역을 포함하는 중쇄 폴리펩티드 서브유닛(홀)을 포함한다.
"Fc-영역 포함 항체"라는 용어는 Fc 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 라이신(EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 정제 중에 또는 항체를 암호화하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 항체는 K447이 있거나 없는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 양태는 1가 또는 2가 배열의 중쇄 단독 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 중쇄 단독 가변 영역 도메인과 관련하여 본원에서 사용되는 "1가 배열"이라는 용어는 단 하나의 중쇄 단독 가변 영역 도메인이 단일 결합 부위를 갖고 존재함을 의미한다. 대조적으로, 중쇄 단독 가변 영역 도메인과 관련하여 본원에서 사용되는 "2가 배열"이라는 용어는 2개의 중쇄 단독 가변 영역 도메인이 존재하고(각각 단일 결합 부위를 가짐), 링커 서열에 의해 연결되어 있음을 의미한다. 링커 서열의 비제한적인 예는 본원에서 추가로 논의되며, 다양한 길이의 GS 링커 서열을 제한 없이 포함한다. 중쇄 단독 가변 영역이 2가 배열인 경우, 2개의 중쇄 단독 가변 영역 도메인 각각은 동일한 항원에, 또는 상이한 항원에(예를 들어, 동일한 단백질 상의 상이한 에피토프; 2개의 상이한 단백질 등에) 결합할 수 있다. 그러나, 특별히 달리 언급하지 않는 한, "2가 배열"인 것으로 표시되는 중쇄 단독 가변 영역은 링커 서열에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄 단독 가변 영역 도메인을 포함하고, 2개의 동일한 중쇄 단독 가변 영역 도메인 각각은 동일한 표적 항원에 결합하는 것으로 이해된다.
본 발명의 양태는 이중특이적, 삼중특이적 등을 제한 없이 포함하는 다중특이적 배열을 갖는 항체를 포함한다. 매우 다양한 방법 및 단백질 배열이 이중특이적 단일클론 항체(BsMAB), 삼중특이적 항체 등에서 알려져 있고 사용된다.
2개 이상의 항체의 가변 도메인을 재조합적으로 융합함으로써 다가의 인공 항체를 생성하는 다양한 방법이 개발되었다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 상의 제1 및 제2 항원 결합 도메인은 폴리펩티드 링커에 의해 연결된다. 이러한 폴리펩티드 링커의 하나의 비제한적인 예는 4개의 글리신 잔기에 이어 1개의 세린 잔기의 아미노산 서열을 갖는 GS 링커이며, 서열은 n번 반복되고, n은 1 내지 약 10까지의, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9의 정수이다. 이러한 링커의 비제한적인 예는 GGGGS(서열번호 40)(n=1) 및 GGGGSGGGGS(서열번호 41)(n=2)를 포함한다. 다른 적합한 링커가 또한 사용될 수 있고, 예를 들어 문헌[Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013 October 15; 65(10): 1357-69]에 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
"3쇄 항체유사 분자" 또는 "TCA"라는 용어는 3개의 폴리펩티드 서브유닛(그중 2개는 단일클론 항체의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄, 또는 항원 결합 영역 및 적어도 하나의 CH 도메인을 포함하는, 이러한 항체 사슬의 기능적 항원 결합 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어짐)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 항체유사 분자를 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 이 중쇄/경쇄 쌍은 제1 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다. 제3 폴리펩티드 서브유닛은 CH1 도메인의 부재하에 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4 도메인을 포함하는 Fc 부분, 및 제2 항원의 에피토프 또는 제1 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인(예를 들어, 2개의 항원 결합 도메인)을 포함하는 중쇄 단독 항체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 이러한 결합 도메인은 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역으로부터 유래되거나 그와 서열 동일성을 갖는다. 이러한 가변 영역의 부분은 VH 및/또는 VL 유전자 세그먼트, D 및 JH 유전자 세그먼트, 또는 JL 유전자 세그먼트에 의해 암호화될 수 있다. 가변 영역은 재배열된 VHDJH, VLDJH, VHJL, 또는 VLJL 유전자 세그먼트에 의해 암호화될 수 있다.
TCA 결합 화합물은, 본원에서 사용되는 바와 같이 중쇄 불변 영역 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4를 포함하지만 CH1 도메인을 포함하지 않는 단일쇄 항체를 의미하는 "중쇄 단독 항체" 또는 "중쇄 항체" 또는 "중쇄 폴리펩티드"를 사용한다. 일 구현예에서, 중쇄 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH2 및 CH3 도메인으로 구성된다. 다른 구현예에서, 중쇄 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH2 도메인으로 구성된다. 추가 구현예에서, 중쇄 항체는 항원 결합 도메인, 힌지 영역의 적어도 일부, 및 CH3 도메인으로 구성된다. CH2 및/또는 CH3 도메인이 절단된 중쇄 항체가 또한 본원에 포함된다. 추가 구현예에서, 중쇄는 항원 결합 도메인, 및 적어도 하나의 CH(CH1, CH2, CH3, 또는 CH4) 도메인으로 구성되지만, 힌지 영역은 없다. 중쇄 단독 항체는 2개의 중쇄가 이황화 결합되거나 달리 공유적으로 또는 비공유적으로 서로 부착된 이량체 형태일 수 있으며, 폴리펩티드 쇄 사이의 적절한 쌍 형성을 용이하게 하기 위해 CH 도메인 중 하나 이상 사이에 비대칭 인터페이스(예를 들어, 노브-인-홀(KiH) 인터페이스)를 임의로 포함할 수 있다. 중쇄 항체는 IgG 서브클래스에 속할 수 있지만, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 서브클래스와 같은 다른 서브클래스에 속하는 항체도 본원에 포함된다. 특정 구현예에서, 중쇄 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입, 특히 IgG1 서브타입 또는 IgG4 서브타입이다. TCA 결합 화합물의 비제한적인 예는 예를 들어 WO2017/223111 및 WO2018/052503에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
중쇄 항체는 낙타과, 예를 들어 낙타 및 라마에 의해 생성된 IgG 항체의 약 1/4을 구성한다(Hamers-Casterman C., et al. Nature. 363, 446-448 (1993)). 이러한 항체는 2개의 중쇄에 의해 형성되지만 경쇄는 없다. 결과적으로, 가변 항원 결합 부분은 VHH 도메인으로 지칭되며, 길이가 약 120개 아미노산에 불과한 가장 작은 자연발생적, 온전한 항원 결합 부위를 나타낸다(Desmyter, A., et al. J. Biol. Chem. 276, 26285-26290 (2001)). 높은 특이성과 친화성을 갖는 중쇄 항체는 면역화를 통해 다양한 항원에 대해 생성될 수 있으며(van der Linden, R. H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)), VHH 부분은 쉽게 클로닝되어 효모에서 발현될 수 있다(Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). 이들의 발현, 용해도, 및 안정성 수준은 전형적인 F(ab) 또는 Fv 단편보다 훨씬 높다(Ghahroudi, M. A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)). 상어는 또한 항체에 VNAR이라고 하는 단일 VH-유사 도메인을 갖는 것으로 나타났다(Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)).
본원에서 사용되는 "PSMA"라는 용어는 N-아세틸화-알파-연결-산성 디펩티다제, 폴레이트 하이드롤라제, 및 디펩티딜-펩티다제 활성을 갖는 II형 막관통 단백질을 지칭한다. "PSMA"라는 용어는 임의의 인간 및 비인간 동물 종의 PSMA 단백질을 포함하며, 구체적으로 인간 PSMA뿐만 아니라 비인간 포유동물의 PSMA를 포함한다.
본원에서 사용되는 "인간 PSMA"라는 용어는 공급원 또는 제조 방식에 관계없이, 인간 PSMA(UniProt Q04609)의 임의의 변이체, 동형체, 및 종 상동체를 포함한다. 따라서, "인간 PSMA"는 세포에 의해 자연적으로 발현된 인간 PSMA, 및 인간 PSMA 유전자로 형질감염된 세포에서 발현된 PSMA를 포함한다.
"항-PSMA 중쇄 단독 항체", "PSMA 중쇄 단독 항체", "항-PSMA 중쇄 항체", 및 "PSMA 중쇄 항체"라는 용어는 상기 정의된 바와 같은 인간 PSMA를 포함하는 PSMA에 면역특이적으로 결합하는 상기 정의된 바와 같은 중쇄 단독 항체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 정의는 상기 정의된 바와 같은 인간 항-PSMA UniAbTM 항체를 생성하는 UniRatTM를 포함하여, 인간 면역글로불린을 발현하는 유전자이식 래트 또는 유전자이식 마우스와 같은 유전자이식 동물에 의해 생성된 인간 중쇄 항체를 제한 없이 포함한다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은 서열을 정렬하고 최대 백분율의 서열 동일성을 달성하기 위해, 필요한 경우 갭을 도입한 후, 기준 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되며, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부분으로 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같이 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다.
"단리된" 항체는 자연 환경의 성분으로부터 확인되어 분리 및/또는 회수된 것이다. 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는 (1) Lowry 방법에 의해 측정시 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 항체까지, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는, 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건에서 SDS-PAGE에 의해 균질하게 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내에서 인시튜로 항체를 포함한다. 그러나 일반적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.
본 발명의 항체는 다중특이적 항체를 포함한다. 다중특이적 항체는 하나 초과의 결합 특이성을 갖는다. "다중특이적"이라는 용어는 구체적으로 "이중특이적" 및 "삼중특이적", 뿐만 아니라 고차의 독립적인 특이적 결합 친화성, 예컨대 고차 폴리에피토프 특이성, 뿐만 아니라 4가 항체 및 항체 단편을 포함한다. "다중특이적 항체", "다중특이적 중쇄 단독 항체", "다중특이적 중쇄 항체", 및 "다중특이적 UniAbTM"라는 용어는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되며, 하나 초과의 결합 특이성을 갖는 모든 항체를 포함한다. 본 발명의 다중특이적 중쇄 항-PSMA 항체는 구체적으로 인간 PSMA와 같은 PSMA 단백질 상의 2개 이상의 비중첩 에피토프에 면역특이적으로 결합하는(즉, 2가 및 이중파라토프성) 항체를 포함한다. 본 발명의 다중특이적 중쇄 항-PSMA 항체는 또한 구체적으로 인간 PSMA와 같은 PSMA 단백질 상의 에피토프, 및 예를 들어 CD3 단백질, 예컨대 인간 CD3과 같은 상이한 단백질 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는(즉, 2가 및 이중파라토프성) 항체를 포함한다. 본 발명의 다중특이적 중쇄 항-PSMA 항체는 또한 구체적으로 인간 PSMA 단백질과 같은 PSMA 단백질 상의 2개 이상의 비중첩 또는 부분 중첩 에피토프, 및 예를 들어 CD3 단백질, 예컨대 인간 CD3 단백질과 같은 상이한 단백질 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는(즉, 3가 및 이중파라토프성) 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 하나의 결합 특이성을 갖는 단일특이적 항체를 포함한다. 단일특이적 항체는 구체적으로 단일 결합 특이성을 포함하는 항체, 뿐만 아니라 동일한 결합 특이성을 갖는 하나 초과의 결합 유닛을 포함하는 항체를 포함한다. "단일특이적 항체", "단일특이적 중쇄 단독 항체", "단일특이적 중쇄 항체", 및 "단일특이적 UniAbTM"라는 용어는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되며, 하나의 결합 특이성을 갖는 모든 항체를 포함한다. 본 발명의 단일특이적 중쇄 항-PSMA 항체는 구체적으로 인간 PSMA 단백질과 같은 PSMA 단백질 상의 하나의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는(1가 및 단일특이적) 항체를 포함한다. 본 발명의 단일특이적 중쇄 항-PSMA 항체는 또한 구체적으로 인간 PSMA와 같은 PSMA 단백질 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 하나 초과의 결합 유닛을 갖는 항체(예를 들어, 다가 항체)를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 구현예에 따른 단일특이적 항체는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 각각의 항원 결합 도메인은 PSMA 단백질 상의 동일한 에피토프에 결합한다(즉, 2가 및 단일특이적).
"에피토프"는 단일 항체 분자가 결합하는 항원 분자의 표면 상의 부위이다. 일반적으로, 항원은 몇몇 또는 많은 상이한 에피토프를 가지고 있으며, 많은 상이한 항체와 반응한다. 이 용어는 구체적으로 선형 에피토프 및 입체형태 에피토프를 포함한다.
"에피토프 매핑"은 표적 항원 상의 항체의 결합 부위 또는 에피토프를 확인하는 프로세스이다. 항체 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 단백질 내 아미노산의 연속 서열에 의해 형성된다. 입체형태 에피토프는 단백질 서열 내 불연속적이되 단백질 폴딩시 3차원 구조로 합쳐지는 아미노산으로 형성된다.
"폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 의미한다. 위에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 구체적으로 폴리에피토프 특이성을 갖는 항-PSMA 중쇄 항체, 즉 인간 PSMA와 같은 PSMA 단백질 상의 하나 이상의 비중첩 에피토프에 결합하는 항-PSMA 중쇄 항체; 및 PSMA 단백질 상의 하나 이상의 에피토프 및 예를 들어 CD3 단백질과 같은 상이한 단백질 상의 에피토프에 결합하는 항-PSMA 중쇄 항체를 포함한다. 항원의 "비중첩 에피토프(들)" 또는 "비경쟁적 에피토프(들)"이라는 용어는 한 쌍의 항원 특이적 항체 중 하나의 구성원은 인식하지만 다른 구성원은 인식하지 못하는 에피토프(들)를 의미하는 것으로 본원에서 정의된다. 비중첩 에피토프를 인식하는, 다중특이적 항체 상의 동일한 항원을 표적화하는 항원 결합 영역, 또는 항체의 쌍은 해당 항원에 결합하기 위해 경쟁하지 않고 동시에 해당 항원에 결합할 수 있다.
항체가 기준 항체와 "본질적으로 동일한 에피토프"에 결합하는 것은 두 항체가 동일하거나 입체적으로 중첩하는 에피토프를 인식하는 경우이다. 2개의 에피토프가 동일하거나 입체적으로 중첩하는 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 가장 널리 사용되고 신속한 방법은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여 다양한 형식으로 구성될 수 있는 경쟁 분석이다. 일반적으로, 항원을 96웰 플레이트에 고정시키고, 표지된 항체의 결합을 차단하는 표지되지 않은 항체의 능력을 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정한다.
본원에서 사용되는 용어 "가(valent)"는 항체 분자에서의 명시된 결합 부위 수를 나타낸다.
"1가" 항체는 하나의 결합 부위를 갖는다. 따라서 1가 항체는 또한 단일특이적이다.
"다가" 항체는 2개 이상의 결합 부위를 갖는다. 따라서, 용어 "2가", "3가", 및 "4가"는 각각 2개의 결합 부위, 3개의 결합 부위, 및 4개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 적어도 2가이며, 3가, 4가, 또는 다가일 수 있다. 본 발명의 구현예에 따른 2가 항체는 동일한 에피토프에 대한 2개의 결합 부위(즉, 2가, 단일파라토프성), 또는 2개의 상이한 에피토프에 대한 2개의 결합 부위(즉, 2가, 이중파라토프성)를 가질 수 있다.
매우 다양한 방법 및 단백질 배열이 이중특이적 단일클론 항체(BsMAB), 삼중특이적 항체 등의 제조에 대해 알려져 있고 사용된다.
"3쇄 항체유사 분자" 또는 "TCA"라는 용어는 3개의 폴리펩티드 서브유닛(그중 2개는 단일클론 항체의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄, 또는 항원 결합 영역 및 적어도 하나의 CH 도메인을 포함하는, 이러한 항체 사슬의 기능적 항원 결합 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어짐)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 항체유사 분자를 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 이 중쇄/경쇄 쌍은 제1 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다. 제3 폴리펩티드 서브유닛은 CH1 도메인의 부재하에 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4 도메인을 포함하는 Fc 부분, 및 제2 항원의 에피토프 또는 제1 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 중쇄 단독 항체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어지며, 이러한 결합 도메인은 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역으로부터 유래되거나 그와 서열 동일성을 갖는다. 이러한 가변 영역의 부분은 VH 및/또는 VL 유전자 세그먼트, D 및 JH 유전자 세그먼트, 또는 JL 유전자 세그먼트에 의해 암호화될 수 있다. 가변 영역은 재배열된 VHDJH, VLDJH, VHJL, 또는 VLJL 유전자 세그먼트에 의해 암호화될 수 있다. TCA 단백질은 상기 정의된 바와 같은 중쇄 단독 항체를 사용한다.
"키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"이라는 용어는 목적하는 결합 특이성(예를 들어, 단일클론 항체 또는 다른 리간드의 항원 결합 영역)을 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인에 이식하는 조작된 수용체를 지칭하기 위해 가장 넓은 의미로 본원에서 사용된다. 일반적으로, 수용체는 단일클론 항체의 특이성을 T-세포에 이식하여 키메라 항원 수용체(CAR)를 생성하는 데 사용된다(J Natl Cancer Inst, 2015; 108(7):dvj439; and Jackson et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 2016; 13:370-383). CAR-T 세포는 면역요법에 사용하기 위한 인공 T-세포 수용체를 생성하도록 유전자 조작된 T-세포이다. 일 구현예에서, "CAR-T 세포"는, 최소한 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 적어도 하나의 세포기질 도메인으로 구성된 하나 이상의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 이식유전자를 발현하는 치료용 T-세포를 의미한다.
"인간 항체"라는 용어는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 본원에서 사용된다. 본원의 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기, 예를 들어 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 도입되거나 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이를 포함할 수 있다. "인간 항체"라는 용어는 구체적으로 유전자이식 래트 또는 마우스와 같은 유전자이식 동물에 의해 생성된, 인간 중쇄 가변 영역 서열을 갖는 중쇄 단독 항체, 특히 상기 정의된 바와 같은 UniRatTM에 의해 생성된 UniAbTM를 포함한다.
"키메라 항체" 또는 "키메라 면역글로불린"은 적어도 2개의 상이한 Ig 유전자좌로부터의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 분자, 예를 들어 인간 Ig 유전자좌에 의해 암호화된 부분 및 래트 Ig 유전자좌에 의해 암호화된 부분을 포함하는 유전자이식 항체를 의미한다. 키메라 항체는 비인간 Fc 영역 또는 인공 Fc 영역, 및 인간 이디오타입을 갖는 유전자이식 항체를 포함한다. 이러한 면역글로불린은 이러한 키메라 항체를 생성하도록 조작된 본 발명의 동물로부터 단리될 수 있다.
본원에서 사용되는 "이펙터 세포"라는 용어는 면역 반응의 인지 및 활성화 단계가 아닌 면역 반응의 효과기 단계에 관여하는 면역 세포를 지칭한다. 이러한 이펙터 세포는 특정 Fc 수용체를 발현하며 특정 면역 기능을 수행한다. 일부 구현예에서, 자연살해 세포와 같은 이펙터 세포는 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)을 유도할 수 있다. 예를 들어, FcR을 발현하는 단핵구 및 대식세포는 표적 세포의 특이적 사멸 및 면역계의 다른 구성요소에 항원을 제시하는 것, 또는 항원을 제시하는 세포에 대한 결합에 관여한다. 일부 구현예에서, 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포에 식균작용을 할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 T-세포 수용체 또는 FcR과 같은 수용체를 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 자연살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T-세포, 및 호중구를 포함하며, NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 이의 천연 공급원, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 혈액 또는 PBMC로부터 단리될 수 있다.
"면역 세포"라는 용어는 골수성 또는 림프성 기원의 세포, 예를 들어 림프구(예컨대, B-세포 및 세포용해 T-세포(CTL)를 포함하는 T-세포), 살해 세포, 자연살해(NK) 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 다형핵 세포, 예컨대 호중구, 과립구, 비만세포, 및 호염기구를 제한 없이 포함하는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용된다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 의미한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B-세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다.
"항체 의존성 세포매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포에 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해를 유발하는 세포매개 반응을 의미한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 5,500,362호 및 5,821,337호에 기재된 것과 같은 시험관내 ADCC 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포는 말초혈액 단핵세포(PBMC) 및 자연살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체를 형성한 분자(예를 들어, 항체)에 대한 보체 시스템(C1q)의 첫 번째 구성요소의 결합에 의해 시작된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석이 수행될 수 있다.
"결합 친화도"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용 총계의 강도를 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용되는 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 측정될 수 있다. 저친화성 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화성 항체는 일반적으로 항원에 더 빨리 결합하고 결합 상태를 유지하는 경향이 있다.
본원에서 사용되는 "Kd" 또는 "Kd 값"은 동역학 모드로 Octet QK384 기기(Fortebio Inc., Menlo Park, CA)를 사용하여 생물층 간섭계로 측정된 해리 상수를 의미한다. 예를 들어, 항마우스 Fc 센서에 마우스-Fc 융합 항원을 로드한 다음, 이를 항체가 포함된 웰에 침지시켜 농도 의존적 결합률(kon)을 측정한다. 항체 해리율(koff)은 최종 단계에서 센서를 버퍼만 포함하는 웰에 침지시켜 측정한다. Kd는 Koff/kon의 비이다(더 자세한 내용은 문헌[Concepcion, J, et al., Comb Chem High Throughput Screen, 12(8), 791-800, 2009] 참조).
"치료", "치료하는" 등의 용어는 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 일반적으로 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 면에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인한 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유 면에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용되는 "치료"는 포유동물의 질환 치료를 다루며, 다음을 포함한다: (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 질환의 발달을 저지하는 것; 또는 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉 질환의 퇴행을 유발하는 것. 치료제는 질환 또는 손상의 발병 전에, 발병 중에, 또는 발병 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화시키거나 감소시키는 진행중인 질환의 치료가 특히 중요하다. 이러한 치료는 영향을 받은 조직의 기능이 완전히 상실되기 전에 수행하는 것이 바람직하다. 대상 요법은 질환의 증상 단계 동안 투여될 수 있고, 일부 경우 질환의 증상 단계 후에 투여될 수 있다.
"치료 유효량"은 대상체에게 치료적 이점을 부여하는 데 필요한 활성제의 양을 의미한다. 예를 들어, "치료 유효량"은 질환과 관련된 병리학적 증상, 질환 진행, 또는 생리학적 상태의 호전을 유도, 개선, 또는 달리 유발하거나, 장애에 대한 내성을 향상시키는 양이다.
본원에서 사용되는 용어 "전립선암"은 전립선의 선상 기원 악성 종양을 의미한다.
"PSMA의 발현을 특징으로 하는"이라는 용어는 PSMA 발현이 질환 또는 장애의 특징인 하나 이상의 병리학적 과정과 연관되거나 관련된 임의의 질환 또는 장애를 광범위하게 지칭한다. 이러한 장애는 전립선암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"대상체", "개체", 및 "환자"라는 치료에 대해 평가되고/되거나 치료받는 포유동물을 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일 구현예에서, 포유동물은 인간이다. "대상체", "개체", 및 "환자"라는 용어는 암이 있는 개체, 자가면역 질환이 있는 개체, 병원균 감염이 있는 개체 등을 제한 없이 포함한다. 대상체는 인간일 수 있지만, 다른 포유동물, 특히 인간 질환에 대한 실험실 모델로 유용한 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트 등을 포함할 수도 있다.
"약학적 조성물"이라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태의 제제로, 제형이 투여되는 대상체에게 허용할 수 없을 정도로 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제형은 무균이다. "약학적으로 허용가능한" 부형제(비히클, 첨가제)는 사용된 활성 성분의 유효 용량을 제공하기 위해 대상 포유동물에게 합리적으로 투여될 수 있는 것이다.
"멸균" 제형은 무균이거나 모든 살아있는 미생물 및 포자가 없거나 본질적으로 없다. "동결" 제형은 0℃ 미만 온도의 것이다.
"안정한" 제형은 제형 내의 단백질이 보관시 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 제형이다. 바람직하게는, 제형은 보관시 물리적 및 화학적 안정성, 뿐만 아니라 생물학적 활성을 본질적으로 유지한다. 보관 기간은 일반적으로 제형의 의도된 유효 기간에 따라 선택된다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 당업계에서 이용가능하며, 예를 들어 문헌[Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301. Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones. A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에 검토되어 있다. 안정성은 선택 온도에서 선택 기간 동안 측정될 수 있다. 안정성은 응집체 형성 평가(예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 사용, 혼탁도 측정, 및/또는 육안 검사); 양이온 교환 크로마토그래피, 이미지 모세관 등전위 포커싱(icIEF), 또는 모세관 구역 전기영동을 사용한 전하 이질성 평가; 아미노-말단 또는 카복시-말단 서열 분석; 질량 분석; 감소된 항체와 온전한 항체를 비교하기 위한 SDS-PAGE 분석; 펩티드 맵(예를 들어, 트립신 또는 LYS-C) 분석; 항체의 생물학적 활성 또는 항원 결합 기능 평가 등을 비롯한, 다양한 방법으로 정성적 및/또는 정량적으로 평가될 수 있다. 불안정성은 다음 중 하나 이상을 수반할 수 있다: 응집, 탈아미드화(예를 들어, Asn 탈아미드화), 산화(예를 들어, Met 산화), 이성질화(예를 들어, Asp 이성질화), 클리핑/가수분해/단편화(예를 들어, 힌지 영역 단편화), 석신이미드 형성, 쌍을 이루지 않은 시스테인(들), N-말단 확장, C-말단 처리, 글리코실화 차이 등.
II.
상세한 설명
항-PSMA 항체
본 발명은 인간 PSMA에 결합하는 밀접하게 관련된 항체 계열을 제공한다. 이 계열의 항체는 본원에 정의되고 표 1에 나타낸 바와 같은 일련의 CDR 서열을 포함하며, 표 2에 제시된 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, 및 표 3에 제시된 서열번호 5 및 6의 중쇄 가변 영역(VH) 서열에 의해 예시된다. 이러한 항체 계열은 임상 치료제(들)로서의 유용성에 기여하는 다수의 이점을 제공한다. 이러한 항체는 다양한 결합 친화도를 갖는 구성원을 포함하여, 목적하는 결합 친화도를 갖는 특정 서열의 선택을 가능하게 한다.
| SEQ_aa_CDR1 | SEQ_aa_CDR2 | SEQ_aa_CDR3 |
| GFSFSGYG (서열번호 1) | ISYDGSNK (서열번호 2) | AKDANWGQHPDHTSFDY (서열번호 3) |
| GFTFKFYA (서열번호 4) | ISGSGGST (서열번호 5) | AKEIAEASRGFDY(서열번호 6) |
| 클론 ID # | SEQ_aa_CDR1 | SEQ_aa_CDR2 | SEQ_aa_CDR3 |
| 325972 | GFSFSGYG(서열번호 1) | ISYDGSNK (서열번호 2) |
AKDANWGQHPDHTSFDY (서열번호 3) |
| 325795 | GFTFKFYA(서열번호 4) | ISGSGGST (서열번호 5) |
AKEIAEASRGFDY (서열번호 6) |
| 클론 ID # | SEQ_aa_FR1_FR4 |
서열
번호 |
| 325972 | EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSGYGMHWVRQAPGKEREW VAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKDANWGQHPDHTSFDYRGQGTLVTVSS |
7 |
| 325795 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKFYAMSWVRQAPGKGPEWVSVISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYF CAKEIAEASRGFDYRGQGTLVTVSS |
8 |
적합한 항체는 개발 및 치료적 사용 또는 예를 들어 도 1에 나타낸 바와 같은, 이중특이적 항체, 또는 CAR-T 구조의 일부로서의 사용을 제한 없이 포함하는 기타 사용을 위해 본원에 제공된 항체로부터 선택될 수 있다.
후보 단백질에 대한 친화도의 결정은 Biacore 측정과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 항체 계열의 구성원은 약 10-6 내지 약 10-10; 약 10-6 내지 약 10-9; 약 10-6 내지 약 10-8; 약 10-8 내지 약 10-11; 약 10-8 내지 약 10-10; 약 10-8 내지 약 10-9; 약 10-9 내지 약 10-11; 약 10-9 내지 약 10-10; 또는 이들 범위 내의 임의의 값을 제한 없이 포함하는 약 10-6 내지 약 10-11의 Kd로 PSMA에 대한 친화도를 가질 수 있다. 친화도 선택은 잠재적 독성 평가뿐만 아니라, 시험관내 분석, 전임상 모델, 및 임상 시험을 포함하여, PSMA 생물학적 활성을 조절하기 위한, 예를 들어 차단하기 위한 생물학적 평가로 확인될 수 있다.
본원의 항체 계열 구성원은 시노몰구스 마카크의 PSMA 단백질과 교차 반응하지 않지만, 필요한 경우, 시노몰구스 마카크의 PSMA 단백질, 또는 임의의 다른 동물 종의 PSMA와의 교차 반응성을 제공하도록 조작될 수 있다.
본원의 PSMA-특이적 항체 계열은 인간 VH 프레임워크에 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. CDR 서열은 예를 들어 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 대해 각각, 서열번호 7 내지 8에 제시된 예시적인 가변 영역 서열의 아미노산 잔기 26~33; 51~58; 및 97~116 부근의 영역에 위치할 수 있다. 일반적으로 서열의 순서는 동일하게 유지되지만, 상이한 프레임워크 서열이 선택되는 경우 CDR 서열이 상이한 위치에 있을 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
특정 구현예에서, 항-PSMA 항체는 서열번호 1 또는 4 중 어느 하나의 CDR1 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDR1 서열은 서열번호 1을 포함한다. 특정 구현예에서, CDR1 서열은 서열번호 4를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-PSMA 항체는 서열번호 2 또는 5 중 어느 하나의 CDR2 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDR2 서열은 서열번호 2를 포함한다. 특정 구현예에서, CDR2 서열은 서열번호 5를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-PSMA 항체는 서열번호 3 또는 6 중 어느 하나의 CDR3 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CDR3 서열은 서열번호 3을 포함한다. 특정 구현예에서, CDR2 서열은 서열번호 6을 포함한다.
추가 구현예에서, 항-PSMA 중쇄 단독 항체는 서열번호 1의 CDR1 서열, 서열번호 2의 CDR2 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 구현예에서, 항-PSMA 항체는 서열번호 4의 CDR1 서열, 서열번호 5의 CDR2 서열, 및 서열번호 6의 CDR3 서열을 포함한다.
추가 구현예에서, 항-PSMA 항체는 서열번호 7 내지 8의 임의의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함한다(표 3).
또 다른 구현예에서, 항-PSMA 항체는 서열번호 7의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항-PSMA 항체는 서열번호 8의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-PSMA 항체의 CDR 서열은 서열번호 1 내지 6(표 1; 표 2) 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열 또는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 세트에 대해 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-PSMA 항체는 바람직하게는 표 1 또는 표 2에 제공된 CDR3 서열을 갖는 항체 중 어느 하나의 CDR3 서열에 대해 아미노산 수준에서 CDR3 서열이 80% 이상, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며, PSMA에 결합한다.
일부 구현예에서, 항-PSMA 항체는 바람직하게는 표 1 또는 표 2에 제공된 CDR 서열을 갖는 항체의 CDR 1, 2, 및 3(조합)에 대해 아미노산 수준에서 CDR 1, 2, 및 3(조합)의 전체 세트가 85 퍼센트(85%) 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하며, PSMA에 결합한다.
일부 구현예에서, 항-PSMA 항체는 (표 3에 나타낸) 서열번호 7 내지 8의 임의의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 80%의 동일성, 적어도 85%의 동일성, 적어도 90%의 동일성, 적어도 95%의 동일성, 적어도 98%의 동일성, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하며, PSMA에 결합한다.
일부 구현예에서, 이중특이적 3쇄 항체유사 분자(TCA)를 제한 없이 포함하는, 본원에 논의된 임의의 배열을 가질 수 있는 이중특이적 또는 다중특이적 항체가 제공된다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 PSMA에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역, 및 PSMA 이외의 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 PSMA에 결합하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역, 및 PSMA 이외의 단백질에 결합하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 적어도 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 각각의 항원 결합 도메인은 PSMA에 결합한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 제1 항원(예를 들어, CD3)에 결합하는 중쇄/경쇄 쌍, 및 중쇄 단독 항체로부터의 중쇄를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 중쇄 단독 항체로부터의 중쇄는 CH1 도메인의 부재하에 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4 도메인을 포함하는 Fc 부분을 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 이펙터 세포 상의 항원(예를 들어, T-세포 상의 CD3 단백질)에 결합하는 중쇄/경쇄 쌍, 및 PSMA에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 중쇄 단독 항체로부터의 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 경쇄 가변 도메인과 쌍을 형성하는 CD3-결합 VH 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 경쇄는 고정된 경쇄이다. 일부 구현예에서, CD3-결합 VH 도메인은 인간 VH 프레임워크에 서열번호 9의 CDR1 서열, 서열번호 10의 CDR2 서열, 및 서열번호 11의 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3-결합 VH 도메인은 인간 VH 프레임워크에 서열번호 12의 CDR1 서열, 서열번호 13의 CDR2 서열, 및 서열번호 14의 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고정된 경쇄는 인간 VL 프레임워크에 서열번호 15의 CDR1 서열, 서열번호 16의 CDR2 서열, 및 서열번호 17의 CDR3 서열을 포함한다. 종합하면, CD3-결합 VH 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 CD3에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, CD3-결합 VH 도메인은 서열번호 18의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3-결합 VH 도메인은 서열번호 19의 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3-결합 VH 도메인은 서열번호 18 또는 19의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 백분율 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고정된 경쇄는 서열번호 20의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 고정된 경쇄는 서열번호 20의 중쇄 가변 영역 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 백분율 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
상기 CD3-결합 VH 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 다중특이적 항체는, 예를 들어, 공개된 PCT 출원 공개 번호 WO2018/052503에 기재된 바와 같이, 유리한 특성을 가지며, 이의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다. PSMA에 대한 결합 친화성을 갖는 본원에 기재된 임의의 다중특이적 항체 및 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 CD3-결합 도메인 및 고정된 경쇄 도메인(예를 들어, 표 4 및 표 5 참조), 뿐만 아니라 표 6 및 표 7에 제공된 것과 같은 추가적인 서열과 조합되어, 하나 이상의 PSMA 에피토프뿐만 아니라 CD3에 대한 결합 친화성을 갖는 다중특이적 항체를 생성할 수 있다.
| SEQ_aa_CDR1 | SEQ_aa_CDR2 | SEQ_aa_CDR3 | |
| 중쇄 (F2B) | GFTFDDYA (서열번호 9) |
ISWNSGSI (서열번호 10) |
AKDSRGYGDYRLGGAY (서열번호 11) |
| 중쇄 (F2F) | GFTFHNYA(서열번호 12) | ISWNSGSI (서열번호 13) |
AKDSRGYGDYSLGGAY (서열번호 14) |
| 경쇄 | QSVSSN(서열번호 15) | GAS (서열번호 16) |
QQYNNWPWT (서열번호 17) |
| VH (F2B) | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYC AKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSS (서열번호 18) |
| VH(F2F) | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFHNYAMHWVRQAPGKGLEW VSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYC AKDSRGYGDYSLGGAYWGQGTLVTVSS (서열번호 19) |
| VL | EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPWTFGQ GTKVEIK (서열번호 20) |
| 인간 IgG1 (UniProt 번호 P01857) |
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (서열번호 21) |
| 인간 IgG4(UniProt 번호 P01861) | ASTKGPSVFP LAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKT YTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK (서열번호 22) |
| 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 (Fc 영역) | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 23) |
| 침묵 돌연변이를 갖는 인간 IgG4 (Fc 영역) | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열번호 24) |
| 항-CD3 경쇄 불변 영역 서열 (카파 경쇄) | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 25) |
| 항-CD3 중쇄 서열 (VH + wt IgG1 Fc) | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 26) |
| 항-CD3 중쇄 서열 (침묵된 IgG1 Fc를 가짐) | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 27) |
| 항-CD3 중쇄 불변 영역 서열 (wt IgG4 Fc를 가짐) | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 28) |
| 항-CD3 중쇄 불변 영역 서열 (침묵된 IgG4 Fc를 가짐) | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 29) |
| 침묵된 IgG4 (힌지 - CH2 - CH3; 홀(S228P, F234A, L235A; T366S, L368A, Y407V)) | ESKYGPPCP P CPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 30) |
| 침묵된 IgG4 (힌지 - CH2 - CH3; 노브(S228P, F234A, L235A; T366W)) | ESKYGPPCP P CPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 31) |
| 항-CD3 전장 경쇄 (VL + 카파 CL) | EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 32) |
| 항-CD3 전장 중쇄 (VH + 침묵된 IgG4 Fc + 노브(S228P, F234A, L235A; T366W)) | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCP P CPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 33) |
| PSMA 1가 중쇄 (클론 ID 325972) + 침묵된 IgG4 Fc, 홀(S228P, F234A, L235A, T366S, L368A, Y407V | EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSGYGMHWVRQAPGKEREWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDANWGQHPDHTSFDYRGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 34) |
| PSMA 2가 중쇄 (클론 ID 325972) + 침묵된 IgG4 Fc, 홀(S228P, F234A, L235A, T366S, L368A, Y407V | EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSGYGMHWVRQAPGKEREWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDANWGQHPDHTSFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSGYGMHWVRQAPGKEREWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKDANWGQHPDHTSFDYRGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 35) |
| PSMA 1가 중쇄 (클론 ID 325795) + 침묵된 IgG4 Fc, 홀(S228P, F234A, L235A, T366S, L368A, Y407V | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKFYAMSWVRQAPGKGPEWVSVISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYFCAKEIAEASRGFDYRGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 36) |
| PSMA 2가 중쇄 (클론 ID 325795) + 침묵된 IgG4 Fc, 홀(S228P, F234A, L235A, T366S, L368A, Y407V | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKFYAMSWVRQAPGKGPEWVSVISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYFCAKEIAEASRGFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKFYAMSWVRQAPGKGPEWVSVISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYFCAKEIAEASRGFDYRGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 37) |
| PSMA 2가 중쇄 (클론 ID 325972 x 클론 ID 325795) + 침묵된 IgG4 Fc, 홀(S228P, F234A, L235A, T366S, L368A, Y407V | EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSGYGMHWVRQAPGKEREWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDANWGQHPDHTSFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKFYAMSWVRQAPGKGPEWVSVISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYF CAKEIAEASRGFDYRGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 38) |
| PSMA 2가 중쇄 (클론 ID 325795 x 클론 ID 325972) + 침묵된 IgG4 Fc, 홀(S228P, F234A, L235A, T366S, L368A, Y407V | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKFYAMSWVRQAPGKGPEWVSVISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYFCAKEIAEASRGFDYRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSGYGMHWVRQAPGKEREWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDANWGQHPDHTSFDYRGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 39) |
일부 구현예에서, 이중특이적 3쇄 항체유사 분자(TCA)를 제한 없이 포함하는, 본원에 논의된 임의의 배열을 가질 수 있는 이중특이적 또는 다중특이적 항체가 제공된다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 PSMA에 결합하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역, 및 PSMA 이외의 단백질에 결합하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 CH1 도메인의 부재하에 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4 도메인을 포함하는 Fc 부분, 및 제2 항원의 에피토프 또는 제1 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 제1 항원에 결합하는 중쇄/경쇄 쌍, 및 중쇄 단독 항체로부터의 중쇄를 포함할 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 이펙터 세포 상의 항원(예를 들어, T-세포 상의 CD3 단백질)에 결합하는 중쇄/경쇄 쌍, 및 PSMA에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 중쇄 단독 항체로부터의 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체가 이중특이적 항체인 경우, 항체의 하나의 아암(하나의 결합 모이어티 또는 하나의 결합 단위)은 인간 PSMA에 특이적인 반면, 다른 아암은 표적 세포, 종양 관련 항원, 표적화 항원, 예를 들어 인테그린 등, 병원균 항원, 체크포인트 단백질 등에 특이적일 수 있다. 표적 세포는 구체적으로, PSMA의 발현을 특징으로 하는 혈액 악성종양과 관련된 세포뿐만 아니라 PSMA의 발현을 특징으로 하는 자가면역 장애와 관련된 병원성 B-세포를 제한 없이 포함하는 암세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체의 하나의 아암(하나의 결합 모이어티 또는 하나의 결합 단위)은 인간 PSMA에 특이적인 반면, 다른 아암은 CD3에 특이적이다.
일부 구현예에서, 항체는 서열번호 30 또는 31 중 어느 하나의 서열에 연결된, 1가 또는 2가 배열의, 서열번호 32의 서열을 포함하는 항-CD3 경쇄 폴리펩티드, 서열번호 18 또는 19의 서열을 포함하는 항-CD3 중쇄 폴리펩티드, 및 서열번호 7 또는 8의 서열을 포함하는 항-PSMA 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 이들 서열은 목적하는 IgG 서브클래스, 예를 들어 IgG1, IgG4, 침묵된 IgG1, 침묵된 IgG4의 이중특이적 항체를 생성하기 위해 다양한 방식으로 조합될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 항체는 서열번호 32를 포함하는 제1 폴리펩티드, 서열번호 33을 포함하는 제2 폴리펩티드, 및 서열번호 34, 35, 36, 37, 38, 또는 39를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하는 TCA이다.
단일쇄 폴리펩티드, 2쇄 폴리펩티드, 3쇄 폴리펩티드, 4쇄 폴리펩티드, 이들의 다중체를 포함하는 다양한 형태의 다중특이적 항체가 본 발명의 범위에 속한다. 본원의 다중특이적 항체는 구체적으로 PSMA 및 CD3에 결합하는 T-세포 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체(항-PSMA x 항-CD3 항체)를 포함한다. 이러한 항체는 PSMA를 발현하는 세포의 강력한 T-세포 매개 사멸을 유도한다.
항-PSMA 항체의 제조
본 발명의 항체는 당업계에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원의 항체는 유전자이식 마우스 및 래트를 포함하는 유전자이식 동물, 바람직하게는 내인성 면역글로불린 유전자가 녹아웃되거나 비활성화된 래트에 의해 생성된다. 바람직한 구현예에서, 본원의 중쇄 항체는 UniRat™에서 생성된다. UniRat™는 침묵된 내인성 면역글로불린 유전자를 갖고 있으며, 완전 인간 HCAb의 다양한, 자연적으로 최적화된 레퍼토리를 발현하기 위해 인간 면역글로불린 중쇄 전좌(translocus)를 사용한다. 래트의 내인성 면역글로불린 유전자좌는 다양한 기술을 사용하여 녹아웃 또는 침묵될 수 있지만, UniRat™에서는 징크 핑거 (엔도)뉴클레아제(ZNF) 기술을 사용하여 내인성 래트 중쇄 J-유전자좌, 경쇄 Cκ 유전자좌, 및 경쇄 Cλ 유전자좌를 비활성화시켰다. 난모세포에 미세주입하기 위한 ZNF 구성체는 IgH 및 IgL 녹아웃(KO) 계통을 생성할 수 있다. 자세한 내용은 예를 들어 문헌[Geurts et al., 2009, Science 325:433] 참조. Ig 중쇄 녹아웃 래트의 특성화는 문헌[Menoret et al., 2010, Eur. J. Immunol. 40:2932-2941]에 보고된 바 있다. ZNF 기술의 장점은 최대 수 kb의 결실을 통해 유전자 또는 유전자좌를 침묵시키기 위한 비상동 말단 연결도 상동성 통합을 위한 표적 부위를 제공할 수 있다는 것이다(Cui et al., 2011, Nat Biotechnol 29:64-67). UniRat™에서 생성된 인간 중쇄 항체는 UniAbTM라고 하며, 통상적인 항체로는 공격할 수 없는 에피토프에 결합할 수 있다. 이들은 높은 특이성, 친화성, 및 작은 크기로 인해 단일 및 다중 특이적 용도에 이상적이다.
UniAbTM 외에도, 낙타과 VHH 프레임워크 및 돌연변이, 및 이들의 기능적 VH 영역이 결여된 중쇄 단독 항체가 본원에 구체적으로 포함된다. 이러한 중쇄 단독 항체는 예를 들어 WO2006/008548에 기재된 바와 같이, 예를 들어 완전 인간 중쇄 단독 유전자좌를 포함하는 유전자이식 래트 또는 마우스에서 생성될 수 있지만, 토끼, 기니피그, 래트와 같은 다른 유전자이식 포유동물도 사용될 수 있으며, 래트 및 마우스가 바람직하다. 중쇄 단독 항체(이들의 VHH 또는 VH 기능적 단편 포함)는 또한, 예를 들어 포유류 세포(예: CHO 세포), E. 콜라이, 또는 효모를 비롯한 적합한 진핵 또는 원핵 숙주에서 암호화 핵산을 발현시켜, 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다.
중쇄 단독 항체의 도메인은 항체와 저분자 약물의 장점을 결합하여, 1가 또는 다가일 수 있으며; 독성이 낮고; 비용 효율적으로 제조할 수 있다. 작은 크기로 인해, 이러한 도메인은 경구 또는 국소 투여를 포함하여 투여하기 쉽고, 위장 안정성을 포함하여 높은 안정성을 특징으로 하며; 이들의 반감기는 목적하는 용도 또는 적응증에 맞춰질 수 있다. 또한, HCAb의 VH 및 VHH 도메인은 비용 효율적인 방식으로 제조될 수 있다.
특정 구현예에서, UniAbTM를 포함하는 본 발명의 중쇄 항체는, 해당 위치에서 천연 아미노산 잔기를 포함하거나 이와 회합된 표면 노출된 소수성 패치를 파괴할 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된 FR4 영역의 첫 번째 위치(Kabat 넘버링 시스템에 따른 아미노산 위치 101)에 천연 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 소수성 패치는 일반적으로 항체 경쇄 불변 영역과의 인터페이스에 묻혀 있지만, HCAb에서 표면 노출되며, 적어도 부분적으로는 HCAb의 원치 않는 응집 및 경쇄 회합을 위한 것이다. 치환된 아미노산 잔기는 바람직하게는 전하를 띤, 더 바람직하게는 양전하를 띤, 예컨대 라이신(Lys, K), 아르기닌(Arg, R), 또는 히스티딘(His, H), 바람직하게는 아르기닌(R)이다. 바람직한 구현예에서, 유전자이식 동물로부터 유래된 중쇄 단독 항체는 위치 101에 Trp에서 Arg로의 돌연변이를 포함한다. 생성된 HCAb는 바람직하게는 응집의 부재하에 생리학적 조건에서 높은 항원 결합 친화도 및 용해도를 갖는다.
본 발명의 일부로서, UniRatTM 동물(UniAbTM)로부터의 특유 서열을 갖는 인간 IgG 항-PSMA 중쇄 항체가 ELISA 단백질 및 세포-결합 분석에서 인간 PSMA에 결합하는 것으로 확인되었다. 확인된 중쇄 가변 영역(VH) 서열은 인간 PSMA 단백질 결합 및/또는 PSMA+ 세포에 대한 결합에 대해 양성이고, PSMA를 발현하지 않는 세포에 대한 결합에 대해서는 모두 음성이다.
PSMA 단백질 상의 비중첩 에피토프에 결합하는 중쇄 항체, 예를 들어 UniAbTM는 효소-결합 면역분석(ELISA 분석) 또는 유세포 경쟁 결합 분석과 같은 경쟁 결합 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원에 결합하는 알려진 항체와 관심 항체 사이의 경쟁을 사용할 수 있다. 이 접근법을 사용하면, 일련의 항체를 기준 항체와 경쟁하는 것과 그렇지 않은 것으로 나눌 수 있다. 비경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합된 에피토프와 중첩하지 않는 별개의 에피토프에 결합하는 것으로 확인된다. 대개, 하나의 항체가 고정되고, 항원이 결합되고, 제2의 표지된(예를 들어, 비오틴화) 항체가 포획 항원에 결합하는 능력에 대해 ELISA 분석에서 시험된다. 이는 또한, Octet Red384 및 Octet HTX(ForteBio, Pall Inc)와 같은 생물층 간섭계 플랫폼에서뿐만 아니라, ProteOn XPR36(BioRad, Inc), Biacore 2000 및 Biacore T200(GE Healthcare Life Sciences), 및 MX96 SPR 이미저(Ibis technologies B.V.)를 비롯한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 플랫폼을 사용하여 수행될 수 있다. 더 자세한 내용은 본원의 실시예 참조.
일반적으로, 항체는 표준 기술, 예컨대 상기 경쟁 결합 분석으로 측정시 표적 항원에 대한 기준 항체의 결합을 약 15~100% 감소시키는 경우 기준 항체와 "경쟁"한다. 다양한 구현예에서, 상대적 억제는 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50% 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 그 이상이다.
약학적 조성물, 용도, 및 치료 방법
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 하나 이상의 항체를 적합한 약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 담체"의 예는 보조제, 고체 담체, 물, 완충제, 또는 치료 성분을 보유하기 위해 당업계에서 사용되는 다른 담체, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 PSMA에 결합하는 중쇄 항체(예를 들어, UniAbTM)를 포함한다. 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 PSMA 단백질 상의 2개 이상의 비중첩 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 다중특이적(이중특이적 포함) 중쇄 항체(예를 들어, UniAbTM)를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 PSMA에 대한 결합 특이성 및 이펙터 세포 상의 결합 표적(예를 들어, T-세포 상의 결합 표적, 예컨대 T-세포 상의 CD3 단백질)에 대한 결합 특이성을 갖는 다중특이적(이중특이적 및 TCA 포함) 중쇄 항체(예를 들어, UniAbTM)를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 PSMA에 결합하고 이펙터 세포 상의 결합 표적(예를 들어, T-세포 상의 결합 표적, 예컨대 T-세포 상의 CD3 단백질)에 결합하는 다중특이적(이중특이적 및 TCA 포함) 중쇄 항체(예를 들어, UniAbTM)를 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 항체의 약학적 조성물은 목적하는 정도의 순도를 갖는 단백질을 선택적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)] 참조)와 혼합하여 보관을 위해, 예컨대 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸, 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
비경구 투여용 약학적 조성물은 바람직하게는 무균이고 실질적으로 등장성이며, GMP(Good Manufacturing Practice) 조건하에 제조된다. 약학적 조성물은 단위 투약 형태(즉, 단일 투여에 대한 투여량)로 제공될 수 있다. 제형은 선택된 투여 경로에 따라 다르다. 본원의 항체는 정맥 주사 또는 주입 또는 피하로 투여될 수 있다. 주사 투여의 경우, 본원의 항체는 수용액, 바람직하게는 주사 부위의 불편함을 감소시키기 위해 생리학적으로 적합한 완충액으로 제형화될 수 있다. 용액은 상기 논의된 바와 같은 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 발열원이 없는 멸균수와 함께 구성하기 위한 동결건조 형태일 수 있다.
항체 제형은 예를 들어 미국 특허 9,034,324호에 개시되어 있다. 유사한 제형이 본 발명의 중쇄 항체(UniAbTM 포함)에 대해 사용될 수 있다. 피하 항체 제형은 예를 들어 US20160355591 및 US20160166689에 기재되어 있다.
사용 방법
본원에 기재된 항-PSMA 항체 및 약학적 조성물은 본원에 추가로 기재된 병태 및 질환을 포함하는(이에 한정되지 않음), PSMA의 발현을 특징으로 하는 질환 및 병태의 치료에 사용될 수 있다.
PSMA는 전립선 상피 조직에서 발현되어 전립선암 및 고형 종양의 신생혈관계에서 상향조절되는 II형 막관통 단백질이다. 이는 뇌, 신장, 및 침샘과 같은 건강한 조직에서도 낮은 수준으로 발현되지만, 악성 전립선 조직에서 과발현되므로 전립선암의 치료적 요법에 대한 매력적인 표적이 된다. 이는 또한 악성 신생혈관계에서 발현이 높다는 점에서 고형 종양의 치료법 또는 영상화와 관련이 있을 수 있다. 전이성 전립선암의 치료에 대해, PSMA를 표적화하는 단일클론 항체, 항체-약물 접합체, 및 키메라 항원 수용체 T-세포가 기술된 바 있다(Hernandez-Hoyos et al., 2016, PMID: 27406985, DiPippo et al., 2014, PMID: 25327986, Serganova et al., 2016, PMID: 28345023). 또한, 전립선암의 영상화 및 치료에 대해, PSMA에 특이적인 방사성핵종 접합체가 연구되고 있다(예를 들어, 문헌[Hofman et al., 2018 PMID: 29752180]).
일 양태에서, 본원의 항-PSMA 항체(예를 들어, UniAbTM) 및 약학적 조성물은 전립선암 및 고형 종양을 포함하는(이에 한정되지 않음), PSMA의 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본원의 항체는 중쇄 단독 항-PSMA 항체-CAR 구조, 즉 중쇄 단독 항-PSMA 항체-CAR-형질도입된 T-세포 구조의 형태일 수 있다.
질환의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 기타 투여 약물, 및 치료가 예방적인지 치료적인지 여부를 포함한 다양한 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 환자는 인간이지만, 비인간 포유동물, 예를 들어 개, 고양이, 말 등과 같은 반려동물, 토끼, 마우스, 래트 등과 같은 실험용 포유동물 등도 치료될 수 있다. 치료 투여량은 안전성과 효능을 최적화하도록 적정될 수 있다.
투여량 수준은 통상의 숙련된 임상의에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 필요에 따라, 예를 들어 요법에 대한 대상체의 반응을 수정할 필요에 따라 수정될 수 있다. 단일 투약 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 다르다. 투약 단위 형태는 일반적으로 약 1 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분을 함유한다.
일부 구현예에서, 제제의 치료적 투여량은 숙주 체중에 대해 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 더 일반적으로는 0.01 내지 5 mg/kg의 범위일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 체중(kg)당 1 mg 또는 체중(kg)당 10 mg, 또는 1~10 mg/kg의 범위일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 2주에 1회, 또는 1개월에 1회, 또는 3 내지 6개월에 1회 투여를 수반한다. 본 발명의 치료제는 일반적으로 여러 차례 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 매주, 매월, 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 치료제의 혈중 농도를 측정하여 나타나는 바와 같이 불규칙할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 치료제는 서방형 제형으로서 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투여량과 빈도는 환자에서의 폴리펩티드 반감기에 따라 다르다.
일반적으로, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로서 제조되며; 주사 전에 액체 비히클에 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태가 제조될 수도 있다. 본원의 약학적 조성물은 직접 또는 고체(예를 들어, 동결건조된) 조성물의 재구성 후, 정맥내 또는 피하 투여하기에 적합하다. 제제는 또한 유화되거나 리포솜 또는 마이크로 입자, 예컨대 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 또는 공중합체에 캡슐화되어 상기 논의된 바와 같이 강화된 보조 효과를 가질 수 있다. 문헌[Langer, Science 249: 1527, 1990 및 Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997]. 본 발명의 제제는 활성 성분의 지속적 또는 주기적 방출을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 데포 주사 또는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있다. 약학적 조성물은 일반적으로 무균, 실질적으로 등장성 상태로 제형화되며, 미국 식품의약국의 모든 GMP(Good Manufacturing Practice) 규정을 완전히 따른다.
본원에 기재된 항체 및 항체 구조의 독성은 세포 배양 또는 실험 동물의 표준 약학 절차에 의해, 예를 들어 LD50(집단의 50%를 치사에 이르게 하는 용량) 또는 LD100(집단의 100%를 치사에 이르게 하는 용량)을 결정함으로써 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량비는 치료 지수이다. 이러한 세포 배양 분석 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인체에 사용하기에 독성이 없는 투여량 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 항체의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 유효 용량을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투약 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로, 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 의사 각자가 선택할 수 있다.
투여용 조성물은 일반적으로, 약학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 항체 또는 기타 제거제(ablative agent)를 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 완충 식염수 등이 사용될 수 있다. 이러한 용액은 무균이며 일반적으로는 바람직하지 않은 물질을 함유하지 않는다. 이러한 조성물은 기존의 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 가깝게 하는 데 필요한 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이러한 제형에서의 활성제의 농도는 크게 달라질 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 필요에 따라 주로 체액 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 선택될 것이다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., 1980) 및 Goodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman et al., eds., 1996)]).
본 발명의 활성제, 이의 제형, 및 사용 설명서를 포함하는 키트도 본 발명의 범위에 속한다. 키트는 적어도 하나의 추가 시약, 예를 들어 화학요법 약물 등을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 일반적으로 키트 내용물의 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 본원에서 사용되는 "라벨"이라는 용어는 키트에 또는 키트와 함께 제공되거나, 달리 키트에 부속되는 임의의 글 또는 녹음 자료를 포함한다.
이제 본 발명을 충분히 설명하였지만, 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어남이 없이 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
실시예 1: PSMA에 대한 결합의 분석
LNCaP 세포주(ATCC: CRL-1740)를 사용하여 유세포 분석기(Guava easyCyte 8HT, EMD Millipore)를 통해 PSMA-양성 세포에 대한 결합을 평가하였다. 간략하게, 50,000개의 표적 세포를 일련의 정제된 UniAbTM 희석액으로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 인큐베이션 후, 세포를 유세포 분석 완충액(1X PBS, 1% BSA, 0.1% NaN3)으로 2회 세척하고, R-피코에리트린(PE)에 접합된 염소 F(ab')2 항-인간 IgG(Southern Biotech, cat. #2042-09)로 염색하여 세포 결합 항체를 검출하였다. 4℃에서 20분간 인큐베이션한 후, 세포를 유세포 분석 완충액으로 2회 세척하고 평균 형광 강도(MFI)를 유세포 분석기로 측정하였다. 2차 항체 단독으로 염색된 세포의 MFI를 사용하여 백그라운드 신호를 결정하고, 각 항체의 결합을 백그라운드에 대한 배수로 변환하였다. LNCaP 세포 결합 데이터는 도 1의 표에 요약되어 있다.
표시된 2개의 항체를 표준 ELISA 분석으로 인간 PSMA에 대한 결합에 대해 테스트하였다. 인간 PSMA 단백질을 2 μg/mL의 농도로 사용하여 50 ng/mL의 UniAb를 포획하였다. 염소 항-인간 IgG HRP 접합 항체(ThermoFisher 31413)를 사용하여 항체 결합을 검출하였다. 모든 항체를 0.05% Tween-20 및 1% 건조 밀크 파우더를 함유한 1X PBS에 희석하였다. ELISA 결합 분석의 결과는 도 1의 표에 요약되어 있다.
실시예 2: 인간 T-세포의 재지정을 통한 22Rv1 인간 종양 세포의 이중특이적 항체 매개 종양 세포 용해
특정 종양 세포 용해를 일으키는 활성화된 인간 T-세포의 존재하에 이중특이적 항체의 양을 증가시키면서 PSMA-양성 종양 세포주 22Rv1(ATCC: CRL-2505)을 인큐베이션하였다. 간략하게, PBMC를 해동하고, 세척하고, 1 μg/mL의 플레이트 코팅된 OKT3 및 1 ng/mL의 IL-2로 3일 동안 활성화시켰다. 이어서, 활성화된 PBMC(Miltenyi Biotec 카탈로그 # 130-096-535)로부터 pan T-세포를 단리하고, 7.5 μM의 칼세인-AM(ThermoFisher 카탈로그 # C1430)이 로딩된 5,000개의 표적 세포에 이중특이적 항체와 함께 50,000개의 pan T-세포를 첨가하였다. 2시간 인큐베이션 후, 칼세인 방출을 측정하여 세포 독성을 결정하였다. 결과는 도 2에 제공되어 있다. 이중특이적 항체는 표시된 항-PSMA VH 결합 도메인(클론 ID: 325795 또는 325972)과 쌍을 이루는 항-CD3 결합 아암으로 구성되었다. PSMA에 결합하지 않는 VH 결합 도메인을 포함하는 음성 대조군 항체는 특이적 용해를 나타내지 않았다. PSMA-음성 세포는 특이적 용해를 나타내지 않았다(데이터는 표시되지 않음).
실시예 3: 생물층 간섭계(BLI)를 사용한 결합 동역학의 분석
클론 ID# 325972 및 325795에 대한 항체 결합 동역학을 Octet QK-384(ForteBio) 기기에서 분석하였다. 간략하게, 항-Penta HIS Capture(HIS1K) 센서를 사용하여 항원인 재조합 인간 PSMA(R&D Systems Cat No.: 4234-ZN)를 120초 동안 고정시켰다. 기준선 판독 후, 센서를 시험 항체(클론 ID# 325972 또는 325795)가 포함된 용액에 침지시키고, 회합 및 해리 속도를 측정하였다. Octet Data Analysis HT v11.0(ForteBio)으로 데이터 분석을 수행하였으며, 데이터는 도 3에 제공된 표에 요약되어 있다.
실시예 4: 인간 종양 세포에 의한 CAR-T 매개 T-세포 활성화
항-PSMA CAR 및 6x NFAT TK 나노 루시퍼라제 리포터로 Jurkat T 림프구 세포를 형질감염시켜 CAR-T 세포 활성을 측정하였다. 형질감염된 Jurkat를 인간 PSMA, LNCaP, 및 22Rv1을 발현하도록 안정적으로 형질감염된 PSMA+ PC3 세포, 또는 PSMA-음성 DU145 세포와 함께 24시간 동안 공동 배양하였다. Promega Nano-Glo 루시퍼라제 분석 시스템(카탈로그 # N1110)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하고, 데이터를 CAR 형질감염된 Jurkat 및 PSMA-음성 DU145 세포주를 함유하는 공동 배양물로 정규화하였다. 통계적 유의성은 독립표본 양방 t-검정을 사용하여 결정되었다. 결과는 도 4b 및 4c에 제공되어 있다.
도 4a는 본 발명의 구현예에 따른 항체 서열을 포함하는 항-PSMA 세포외 결합 도메인을 포함하는 CAR-T 구조의 개략도이다. 도 4b는 전립선 종양 세포주 PC3-PSMA(**p= 0.0016), LNCaP(**p=0.0011), 및 22Rv1(****p=0.000077) 종양 세포주와 함께 공동 배양된 항-PSMA 325972 CAR 및 T-세포 신호전달의 NFAT 루시퍼라제 리포터로 형질감염된 Jurkat의 T-세포 활성을 나타낸다. 도 4c는 전립선 종양 세포주 PC3-PSMA(***p=0.0004), LNCaP(****p=0.00004), 및 22Rv1(***p=0.00014)과 함께 공동 배양된 항-PSMA 325795 CAR 및 T-세포 신호전달의 NFAT 루시퍼라제 리포터로 형질감염된 Jurkat의 T-세포 활성을 나타낸다. 이들 결과는 PSMA 음성 DU145 세포주와의 공동 배양, 또는 형질감염된 Jurkat 단독의 인큐베이션이 평가가능한 루시퍼라제 리포터 신호를 생성하지 않았다는 점에서 T-세포 활성화가 PSMA 표적 결합에 특이적임을 보여준다.
실시예 5: 생체내 CAR-T 매개 T-세포 활성화 평가에 의한 종양 제어
뮤린 이종이식 모델을 사용하여 클론 ID 번호 325795 및 325972에 해당하는 항체 구성체에 대한 종양 성장의 전임상 평가를 평가하였다. CBG99- 및 루시퍼라제-발현 LNCaP 세포주(LNCaP-CBG99-Luc)를 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/Szj(NSG) 마우스에 피하 주사하여 VHH 키메라 항원 수용체(VCAR)의 생체내 항종양 효능을 평가하였다. 생체내 연구를 위해, 모든 CAR-T 세포를 VCAR 플라스미드의 PiggyBac(PB) 전달을 사용하여 생성하였다. 마우스의 겨드랑이에 LNCaP를 주사하고(낮은 LNCaP "수용" 비율을 설명하기 위해 n=25), 종양이 확실히 형성되면(캘리퍼 측정으로 100~300 mm3, 이식 후 17일) 치료를 실시하였다. 초저용량(1x10^6), '스트레스' 용량(5x10^6), 및 표준 용량(10x10^6)을 포함한 여러 용량의 P-PSMA-101을 IV 주사하여 마우스를 치료하였다.
도 5a는 전임상 평가에서의 표시된 항체 구성체에 대해 CAR-T 주입 후 일수의 함수로서 종양 진행을 보여주는 그래프이다. 캘리퍼 측정을 통해 종양 부피 평가를 완료하였다. 표시된 항체 구성체(클론 ID: 325795 또는 325972)를 포함하는 CAR-T 세포는 치료받지 않은 마우스에 비해 강력한 종양 제어를 나타냈다. 예를 들어, 17일차 치료 직후, 클론 ID 번호 325795 및 325972의 경우 종양 부피의 급격한 감소가 관찰된다. 대조적으로, 치료받지 않은 마우스의 종양 부피는 17일차 이후에도 계속 증가하였고 약 49일차에서 최고치를 나타냈다.
도 5b는 표시된 항체 구성체에 대해, 도 5a에 나타낸 그래프의 곡선 아래 면적(AUC)을 보여주는 막대 차트이다. 치료받지 않은 마우스는 클론 ID 번호 325795 및 325972에 비해 실질적으로 더 높은 AUC를 나타냈다.
실시예 6: 생체내 CAR-T 평가를 위한 T-세포 증식
실시예 5에 기재된 동일한 전임상 평가를 사용하여 T-세포 증식을 평가하였다. 도 6a는 표시된 항체 구성체에 대해 CAR-T 주입 후 일수의 함수로서 혈중 생체내 T-세포 수를 보여주는 그래프이다. 표시된 항체 구성체(클론 ID: 325795 또는 325972)를 포함하는 CAR-T 세포로 치료받은 마우스에 대한 강력한 P-PSMA8-101 CD8+ T-세포 증식이 나타나 있다. 치료 전, 7일차 및 14일차에 마우스는 낮은 T-세포 수를 나타냈다. 표시된 항체 구성체(클론 ID: 325795 또는 325972)를 포함하는 CAR-T 세포를 사용한 17일차 치료 후, 치료받지 않은 마우스에서 변화가 없는 것과 비교하여, 21일차에 T-세포 수의 급격한 증가가 관찰되었다. 두 치료 모두 28일차 및 42일차에 T-세포 수가 감소하였다. 두 항체 모두 63일차에 T-세포 수의 증가를 볼 수 있다. 치료받지 않은 마우스의 경우, T-세포 수는 연구 기간 동안 일관되게 낮게 유지되었으며 변화가 없었다.
도 6b는 표시된 항체 구성체에 대해, 도 6a에 나타낸 그래프의 곡선 아래 면적(총 T-세포 수)을 보여주는 막대 차트이다. 두 항체 구성체에 대한 총 T-세포 수는 치료받지 않은 마우스와 비교하여 유의미하다.
본 발명의 바람직한 구현예를 본원에 나타내고 설명하였으나, 이러한 구현예가 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게는, 이제 본 발명을 벗어나는 일 없이, 수많은 변형, 변경 및 치환이 떠오를 것이다. 본원에 기재된 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음의 청구범위는 본 발명의 범위를 한정하며 이들 청구범위의 범위 내의 방법 및 구조와 이들의 균등물은 이에 의해 보호되는 것으로 의도된다.
Claims (40)
- PSMA에 결합하는 항체로서,
(a) 서열번호 1 또는 4의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 포함하는 CDR1 서열; 및/또는
(b) 서열번호 2 또는 5의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 포함하는 CDR2 서열; 및/또는
(c) 서열번호 3 또는 6의 아미노산 서열 중 어느 하나에서 2개 이하의 치환을 포함하는 CDR3 서열
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는.항체. - 제1항에 있어서, 상기 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 인간 프레임워크에 존재하는, 항체.
- 제1항에 있어서, CH1 서열의 부재하에 중쇄 불변 영역 서열을 추가로 포함하는 항체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 서열번호 1 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열; 및/또는
(b) 서열번호 2 및 5로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열; 및/또는
(c) 서열번호 3 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열
을 포함하는 항체. - 제4항에 있어서,
(a) 서열번호 1 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열; 및
(b) 서열번호 2 및 5로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열; 및
(c) 서열번호 3 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열
을 포함하는 항체. - 제5항에 있어서,
(a) 서열번호 1의 CDR1 서열, 서열번호 2의 CDR2 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 서열; 또는
(b) 서열번호 4의 CDR1 서열, 서열번호 5의 CDR2 서열, 및 서열번호 6의 CDR3 서열
을 포함하는 항체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 7 내지 8의 임의의 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
- 제7항에 있어서, 서열번호 7 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
- 제8항에 있어서, 서열번호 7의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
- 제8항에 있어서, 서열번호 8의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
- PSMA에 결합하는 항체로서, 인간 VH 프레임워크에 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDR 서열은 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR 서열에서 2개 이하의 치환을 갖는 서열인, 항체.
- 제11항에 있어서, 인간 VH 프레임워크에 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, CDR 서열은 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체.
- PSMA에 결합하는 항체로서,
(a) 인간 VH 프레임워크 내 서열번호 1의 CDR1 서열, 서열번호 2의 CDR2 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 서열; 또는
(b) 인간 VH 프레임워크 내 서열번호 4의 CDR1 서열, 서열번호 5의 CDR2 서열, 및 서열번호 6의 CDR3 서열
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적인 항체.
- 제14항에 있어서, 이중특이적인 항체.
- 제15항에 있어서, 2개의 상이한 PSMA 단백질에 결합하는 항체.
- 제15항에 있어서, 동일한 PSMA 단백질 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항체.
- 제14항에 있어서, 이펙터 세포에 결합하는 항체.
- 제14항에 있어서, T-세포 항원에 결합하는 항체.
- 제19항에 있어서, CD3에 결합하는 항체.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-T 형식인 항체.
- PSMA에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 CAR-T 세포로서, 세포외 항원 결합 도메인은
(a) 서열번호 1의 CDR1 서열, 서열번호 2의 CDR2 서열, 및 서열번호 3의 CDR3 서열; 또는
(b) 서열번호 4의 CDR1 서열, 서열번호 5의 CDR2 서열, 및 서열번호 6의 CDR3 서열
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, CAR-T 세포. - 제22항에 있어서, PSMA에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 7 내지 8의 임의의 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는, CAR-T 세포.
- 제23항에 있어서, PSMA에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 7 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는, CAR-T 세포.
- 제24항에 있어서, PSMA에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 7의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는, CAR-T 세포.
- 제24항에 있어서, PSMA에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인은 서열번호 8의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는, CAR-T 세포.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 CAR-T 세포를 포함하는 약학적 조성물.
- PSMA의 발현을 특징으로 하는 장애의 치료 방법으로서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체, 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 CAR-T 세포, 또는 제27항의 약학적 조성물을 상기 장애가 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 장애는 전립선암인, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 CAR-T 세포의 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
- 제30항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제31항의 벡터를 포함하는 세포.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체를 생성하는 방법으로서, 제32항에 따른 세포를 항체의 발현이 허용되는 조건하에 성장시키는 단계, 및 세포가 성장되는 세포 배양 배지 및/또는 세포로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체를 제조하는 방법으로서, PSMA로 UniRat 동물을 면역화하는 단계, 및 PSMA 결합 중쇄 서열을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
- 치료를 필요로 하는 개체에게 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체, 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 CAR-T 세포, 또는 제27항의 약학적 조성물의 유효 용량을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
- 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 CAR-T 세포의 용도.
- 치료법을 필요로 하는 개체에서 치료법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체, 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 CAR-T 세포, 또는 제27항의 약학적 조성물.
- 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 이를 치료하기 위한 키트로서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체, 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 CAR-T 세포, 또는 제27항의 약학적 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
- 제38항에 있어서, 적어도 하나의 추가 시약을 추가로 포함하는 키트.
- 제39항에 있어서, 적어도 하나의 추가 시약은 화학요법 약물을 포함하는, 키트.
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