CN117500835A - 抗psma抗体及car-t结构 - Google Patents
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Abstract
披露了抗PSMA抗体(例如，UniAbsTM)和CAR‑T结构，以及制备此类抗体和CAR‑T结构的方法，包含此类抗体和CAR‑T结构的组合物，包括药物组合物，以及它们治疗特征在于PSMA的表达的疾患的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年2月25日提交的美国临时专利申请序列号63/153,884的提交日期的优先权权益，该临时专利申请的披露内容通过援引以其全文并入本文。
技术领域
本发明涉及与PSMA结合的抗体(例如，UniAbsTM)和CAR-T结构。本发明进一步涉及制备此类抗体和CAR-T结构的方法，包含此类抗体和CAR-T结构的组合物，包括药物组合物，及其治疗特征在于PSMA的表达的疾患的用途。
背景技术
PSMA
PSMA，也称为前列腺特异性膜抗原和谷氨酸羧肽酶II(UniProt Q04609)，是一种具有N-乙酰化-α-连接的酸性二肽酶、叶酸水解酶和二肽基肽酶活性的II型跨膜蛋白。它由人类的FOLH1基因编码，由19个氨基酸的胞质结构域、24个氨基酸的跨膜部分和707个氨基酸的胞外部分组成。该蛋白质作为非共价同二聚体具有酶活性。PSMA在前列腺上皮组织上表达，并在前列腺癌和实体瘤的新血管系统中上调。它在例如脑、肾脏和唾液腺的健康组织中也以低水平表达，但它在恶性前列腺组织中过度表达，使其成为前列腺癌治疗性治疗的有吸引力的靶标。鉴于其在恶性新血管系统中高表达，它也可能与实体瘤的治疗或成像相关。靶向PSMA的单克隆抗体、抗体-药物缀合物和嵌合抗原受体T细胞已被描述用于治疗转移性前列腺癌(Hernandez-Hoyos等人2016,PMID:27406985，DiPippo等人2014,PMID:25327986，Serganova等人2016,PMID:28345023)。此外，正在研究对PSMA特异性的放射性核素缀合物用于前列腺癌的成像和治疗(例如，Hofman等人,2018 PMID:29752180)。
重链抗体
在常规IgG抗体中，重链和轻链的缔合部分是由于轻链恒定区与重链的CH1恒定结构域之间的疏水性相互作用。重链框架2(FR2)和框架4(FR4)区中存在另外的残基，这也有助于重链与轻链之间的这种疏水性相互作用。
然而，已知骆驼科(包括骆驼、单峰骆驼和美洲驼的胼足亚目)的血清含有一种主要类型的抗体，其仅由成对的H链构成(仅重链抗体或UniAbsTM)。骆驼科(单峰驼(Camelusdromedarius)、双峰驼(Camelus bactrianus)、驼羊(Lama glama)、原驼(Lama guanaco)、羊驼(Lama alpaca)和小羊驼(Lama vicugna))的UniAbsTM具有独特的结构，由单个可变结构域(VHH)、铰链区和两个恒定结构域(CH2和CH3)组成，它们与经典抗体的CH2和CH3结构域高度同源。这些UniAbsTM缺乏存在于基因组中的恒定区的第一结构域(CH1)，但在mRNA加工期间被剪接掉。CH1结构域的缺失解释了UniAbsTM中轻链的缺失，因为此结构域是轻链的恒定结构域的锚定位置。此类UniAbsTM自然进化为通过来自常规抗体或其片段的三种CDR而赋予抗原结合特异性和高亲和力(Muyldermans,2001；J Biotechnol[生物技术期刊]74:277-302；Revets等人,2005；Expert Opin Biol Ther[生物治疗专家观点]5:111-124)。软骨鱼类，诸如鲨鱼也进化出一种独特的免疫球蛋白，被称为IgNAR，它缺乏轻多肽链，并且完全由重链构成。IgNAR分子可以通过分子工程化以产生单个重链多肽(vNAR)的可变结构域来操纵(Nuttall等人Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]270,3543-3554(2003)；Nuttall等人Function and Bioinformatics[功能与生物信息学]55,187-197(2004)；Dooley等人,Molecular Immunology[分子免疫学]40,25-33(2003))。
没有轻链的仅重链抗体结合抗原的能力是在20世纪60年代建立的(Jaton等人(1968)Biochemistry[生物化学],7,4185-4195)。与轻链物理分离的重链免疫球蛋白相对于四聚体抗体保留了80％的抗原结合活性。Sitia等人(1990)Cell[细胞],60,781-790证明了从重排的小鼠μ基因中去除CH1结构域导致在哺乳动物细胞培养中产生没有轻链的仅重链抗体。所产生的抗体保留了VH结合特异性和效应子功能。
通过免疫可以产生针对多种抗原具有高特异性和亲和力的重链抗体(van derLinden,R.H.等人Biochim.Biophys.Acta.[生物化学与生物物理学报]1431,37-46(1999))，并且可以在酵母中容易地克隆并表达VHH部分(Frenken,L.G.J.等人J.Biotechnol.[生物技术期刊]78,11-21(2000))。它们的表达水平、溶解性和稳定性显著高于经典F(ab)或Fv片段(Ghahroudi,M.A.等人FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联合会快报]414,521-526(1997))。
其中λ(lambda)轻(L)链基因座和/或λ和κ(kappa)L链基因座已被功能沉默的小鼠以及由此类小鼠产生的抗体描述于美国专利号7,541,513和8,367,888中。例如，例如在以下中已经报告了在小鼠和大鼠中重组产生仅重链抗体：WO 2006008548；美国专利公布号20100122358；Nguyen等人,2003,Immunology[免疫学]；109(1),93-101；Brüggemann等人,Crit.Rev.Immunol.[免疫学评论综述]；2006,26(5):377-90；以及Zou等人,2007,J ExpMed[实验医学杂志]；204(13):3271-3283。通过锌指核酸酶的胚胎显微注射产生敲除大鼠描述于Geurts等人,2009,Science[科学],325(5939):433中。可溶性仅重链抗体和包含产生此类抗体的异源重链基因座的转基因啮齿类动物描述于美国专利号8,883,150和9,365,655中。包含单结构域抗体作为结合(靶向)结构域的CAR-T结构描述于例如Iri-Sofla等人,2011,Experimental Cell Research[实验细胞研究]317:2630-2641和Jamnani等人,2014,Biochim Biophys Acta[生物化学与生物物理学报],1840:378-386中。
发明内容
本发明的各方面包括与PSMA结合的抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含：(a)在SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列中的任一个中包含两个或更少取代的CDR1序列；和/或(b)在SEQ ID NO:2或5的氨基酸序列中的任一个中包含两个或更少取代的CDR2序列；和/或(c)在SEQ ID NO:3或6的氨基酸序列中的任一个中包含两个或更少取代的CDR3序列。在一些实施例中，所述CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人框架中。在一些实施例中，抗体进一步包含CH1序列不存在的重链恒定区序列。
在一些实施例中，抗体包含：(a)选自由SEQ ID NO:1和4组成的组的CDR1序列；和/或(b)选自由SEQ ID NO:2和5组成的组的CDR2序列；和/或(c)选自由SEQ ID NO:3和6组成的组的CDR3序列。在一些实施例中，抗体包含：(a)选自由SEQ ID NO:1和4组成的组的CDR1序列；和(b)选自由SEQ ID NO:2和5组成的组的CDR2序列；和(c)选自由SEQ ID NO:3和6组成的组的CDR3序列。
在一些实施例中，抗体包含：(a)SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:2的CDR2序列和SEQ ID NO:3的CDR3序列；或(b)SEQ ID NO:4的CDR1序列、SEQ ID NO:5的CDR2序列和SEQ ID NO:6的CDR3序列。
在一些实施例中，抗体包含与SEQ ID NO:7-8中任一序列具有至少95％序列同一性的重链可变区。在一些实施例中，抗体包含选自由SEQ ID NO:7-8组成的组的重链可变区序列。在一些实施例中，抗体包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列。在一些实施例中，抗体包含SEQ ID NO:8的重链可变区序列。
本发明的各方面包括与PSMA结合的抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含在人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中这些CDR序列是在选自由SEQ ID NO:1-6组成的组的CDR序列中具有两个或更少取代的序列。在一些实施例中，抗体包含重链可变区，该重链可变区包含在人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中这些CDR序列选自由SEQ IDNO:1-6组成的组。
本发明的各方面包括与PSMA结合的抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含：(a)在人VH框架中的SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:2的CDR2序列和SEQ ID NO:3的CDR3序列；或(b)在人VH框架中的SEQ ID NO:4的CDR1序列、SEQ ID NO:5的CDR2序列和SEQID NO:6的CDR3序列。
在一些实施例中，抗体是多特异性的。在一些实施例中，抗体是双特异性的。在一些实施例中，抗体与两个不同的PSMA蛋白结合。在一些实施例中，抗体与在同一PSMA蛋白上的两个不同表位结合。在一些实施例中，抗体与效应细胞结合。在一些实施例中，抗体与T细胞抗原结合。在一些实施例中，抗体与CD3结合。在一些实施例中，抗体是CAR-T形式的。
本发明的各方面包括包含CAR的CAR-T细胞，该CAR包含与PSMA结合的胞外抗原结合结构域，该胞外抗原结合结构域包含重链可变区，该重链可变区包含：(a)SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:2的CDR2序列和SEQ ID NO:3的CDR3序列；或(b)SEQ ID NO:4的CDR1序列、SEQ ID NO:5的CDR2序列和SEQ ID NO:6的CDR3序列。
在一些实施例中，与PSMA结合的胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:7-8中任一序列具有至少95％序列同一性的重链可变区。在一些实施例中，与PSMA结合的胞外抗原结合结构域包含选自由SEQ ID NO:7-8组成的组的重链可变区序列。在一些实施例中，与PSMA结合的胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列。在一些实施例中，与PSMA结合的胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:8的重链可变区序列。
本发明的各方面包括包含如本文所述的抗体或如本文所述的CAR-T细胞的药物组合物。
本发明的各方面包括用于治疗特征在于PSMA的表达的疾患的方法，其包括向患有所述疾患的受试者施用如本文所述的抗体、如本文所述的CAR-T细胞或如本文所述的药物组合物。在一些实施例中，疾患是前列腺癌。
本发明的各方面包括编码如本文所述的抗体或如本文所述的CAR-T细胞的CAR的多核苷酸。本发明的各方面包括包含如本文所述的多核苷酸的载体。本发明的各方面包括包含如本文所述的载体的细胞。
本发明的各方面包括产生如本文所述的抗体的方法，这些方法包括在允许该抗体表达的条件下使如本文所述的细胞生长，以及从该细胞和/或该细胞在其中生长的细胞培养基中分离该抗体。本发明的各方面包括制备如本文所述的抗体的方法，这些方法包括用PSMA对UniRat动物进行免疫，以及鉴定PSMA结合重链序列。
本发明的各方面包括治疗方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的如本文所述的抗体、如本文所述的CAR-T细胞或如本文所述的药物组合物。
本发明的各方面包括如本文所述的抗体或如本文所述的CAR-T细胞在制备用于治疗有需要的个体的疾病或疾患的药物中的用途。
本发明的各方面包括如本文所述的抗体、如本文所述的CAR-T细胞或如本文所述的药物组合物在有需要的个体中的疗法中的用途。
本发明的各方面包括用于治疗有需要的个体的疾病或疾患的试剂盒，其包含如本文所述的抗体、如本文所述的CAR-T细胞或如本文所述的药物组合物、以及使用说明书。在一些实施例中，试剂盒进一步包含至少一种另外的试剂。在一些实施例中，至少一种另外的试剂包含化疗药物。
这些和另外的方面将在本披露的其余部分(包括实例)中进一步解释。
附图说明
图1是显示所指示抗体构建体的细胞结合和ELISA数据的表。
图2是显示对于所指示抗体构建体，细胞裂解百分比作为抗体浓度的函数的图。
图3是显示所指示抗体构建体的结合亲和力数据的表。
图4，分图A是包含抗PSMA胞外结合结构域的CAR-T结构的示意图。
图4，分图B是显示用根据本发明的一个实施例的抗PSMA CAR构建体转染的Jurkat细胞的T细胞活性的图。
图4，分图C是显示用根据本发明的一个实施例的抗PSMA CAR构建体转染的Jurkat细胞的T细胞活性的图。
图5，分图A是显示对于所指示抗体构建体，肿瘤进展作为CAR-T输注后天数的函数的图。
图5，分图B是显示对于所指示抗体构建体，在图5，分图A中所显示的图的曲线下面积的条形图。
图6，分图A是显示对于所指示抗体构建体，血液中体内T细胞计数作为CAR-T输注后天数的函数的图。
图6，分图B是显示对于所指示抗体构建体，在图6，分图A中所显示的图的曲线下面积的条形图。
具体实施方式
除非另外指示，否则本披露的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术都在本领域的技术范围内。此类技术在文献中有充分说明，诸如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]”,第二版(Sambrook等人,1989)；“Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成]”(M.J.Gait编辑,1984)；“Animal Cell Culture[动物细胞培养]”(R.I.Freshney编辑,1987)；“Methods in Enzymology[酶学方法]”(美国学术出版社(Academic Press,Inc.))；“Current Protocols in Molecular Biology[最新分子生物学实验方法汇编]”(F.M.Ausubel等人编辑,1987，以及定期更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶链式反应]”,(Mullis等人编辑,1994)；“APractical Guide to MolecularCloning[分子克隆实用指南]”(Perbal Bernard V.,1988)；“Phage Display:ALaboratory Manual[噬菌体展示：实验室手册]”(Barbas等人,2001)；Harlow,Lane和Harlow,Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable ProtocolNo.I[使用抗体：实验室手册：I号便携式方案],冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(1998)；以及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)；(1988)。
在提供值范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值(除非上下文另外明确说明，至下限单位的十分之一)，以及在所述范围内的任何其他所述或中间值都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，也包括在本发明内，受制于所述范围内任何特别排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另外指示，否则本文中的抗体残基根据Kabat编号系统进行编号(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.[具有免疫学意义的序列]第5版美国公共卫生署，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.)(1991))。
在以下描述中，列出多个具体细节来提供对本发明的更完全理解。然而，对于本领域技术人员而言明显的是，本发明可以在没有一个或多个这些具体细节的情况下实践。在其他情况下，本领域技术人员熟知的熟知特征和程序尚未被描述，以避免使本发明模糊。
本披露引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)均通过援引以其全文并入本文。
I.定义
“包含(comprising)”意指所列举的元素是组合物/方法/试剂盒中需要的，但也可以包括其他元素以形成权利要求范围内的组合物/方法/试剂盒等。
“基本上由…组成(consisting essentially of)”意指将所描述的组合物或方法的范围限制到不对主题发明的一个或多个基本和新颖特征产生实质性影响的指定材料或步骤。
“由…组成(consisting of)”意指从组合物、方法或试剂盒中排除权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。
本文中的抗体残基根据Kabat编号系统和EU编号系统进行编号。在提及可变区中的残基时，通常使用Kabat编号系统(大约重链的残基1-113)(例如，Kabat等人,Sequencesof Immunological Interest.[具有免疫学意义的序列]第5版美国公共卫生署，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.)(1991))。在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等人,同上中报告的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文另外说明，否则提及抗体的可变结构域中的残基号意指通过Kabat编号系统进行的残基编号。除非本文另外说明，否则提及抗体的恒定结构域中的残基号意指通过EU编号系统进行的残基编号。
抗体，也被称为免疫球蛋白，通常包含至少一条重链和一条轻链，其中重链和轻链的氨基末端结构域在序列上是可变的，因此通常被称为可变区结构域，或可变重(VH)或可变轻(VL)结构域。这两个结构域通常缔合以形成特异性结合区，尽管正如在此将要讨论的，特异性结合也可以用仅重链可变序列获得，并且本领域已知并使用各种非天然构型的抗体。
“功能性”或“生物活性”抗体或抗原结合分子(包括本文所述的仅重链抗体和多特异性(例如，双特异性)三链抗体样分子(TCA))是能够在结构、调节、生物化学或生物物理事件中发挥其一种或多种天然活性的分子。例如，功能性抗体或其他结合分子(例如，TCA)可以具有特异性结合抗原的能力，并且结合可以进而引发或改变细胞或分子事件，诸如信号转导或酶活性。功能性抗体或其他结合分子(例如，TCA)也可以阻断受体的配体激活或充当激动剂或拮抗剂。抗体或其他结合分子(例如，TCA)发挥其一种或多种天然活性的能力取决于若干因素，包括多肽链的适当折叠和组装。
本文中的术语“抗体”以最广泛意义使用，并且特别涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、单体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、仅重链抗体、三链抗体、TCA、单链Fv(scFv)、纳米抗体等，并且还包括抗体片段，只要它们表现出所期望的生物活性即可(Miller等人(2003)Jour.of Immunology[免疫学杂志]170:4854-4861)。抗体可以是鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或来源于其他物种的抗体。
术语抗体可以是指全长重链、全长轻链、完整免疫球蛋白分子；或任何这些多肽的免疫活性部分，即包含抗原结合位点的多肽，该抗原结合位点免疫特异性结合感兴趣的靶标或其部分的抗原，此类靶标包括但不限于癌细胞，或产生与自身免疫性疾病相关联的自身免疫性抗体的细胞。本文披露的免疫球蛋白可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子，包括具有改变的Fc部分的工程化亚类，这些亚类提供降低或增强的效应细胞活性。主题抗体的轻链可以是κ轻链(Vkappa)或λ轻链(Vlambda)。免疫球蛋白可以来源于任何物种。在一方面，免疫球蛋白大部分来自人类。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同源的抗体群获得的一种抗体，即，构成该群体的个别抗体除以微量存在的可能天然存在的突变外是一致的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。根据本发明的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人(1975)Nature[自然]256:495描述的杂交瘤方法制备，并且还可以经由例如重组蛋白生产方法(参见例如，美国专利号4,816,567)制备。
如与抗体结合使用的术语“可变的”是指以下事实：抗体可变结构域的某些部分在抗体之间在序列上差异很大，并且用于每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性在整个抗体的可变结构域中并不均匀分布。在轻链可变结构域和重链可变结构域两者中，该可变性集中在被称为高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，其主要采用β-片层构型，通过三个高变区连接，这三个高变区形成环，这些环连接β-片层结构并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质的序列],第5版,美国公共卫生署，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))。恒定结构域并不直接涉及抗体与抗原的结合，但是表现出不同效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
当本文使用时，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[具有免疫学意义的蛋白质的序列],第5版美国公共卫生署，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987))。在一些实施例中，“CDR”意指抗体的互补决定区，如在Lefranc,MP等人,IMGT,the international ImMunoGeneTics database[IMGT，国际免疫遗传学数据库],Nucleic Acids Res.[核酸研究],27:209-212(1999)中定义的。“框架区”或“FR”残基是除如本文定义的高变区/CDR残基之外的那些可变结构域残基。
本文示出了示例性CDR名称，然而，本领域技术人员将理解，CDR的许多定义是常用的，包括Kabat定义(参见“Zhao等人A germline knowledge based computationalapproach for determining antibody complementarity determining regions.[一种用于确定抗体互补性决定区的基于种系知识的计算方法]”Mol Immunol.[分子免疫学]2010；47:694-700)，其是基于序列可变性并且是最常用的。Chothia定义是基于结构环区的位置(Chothia等人“Conformations of immunoglobulin hypervariable regions.[免疫球蛋白高变区的构象]”Nature.[自然]1989；342:877-883)。替代性的感兴趣的CDR定义包括但不限于由以下披露的那些：Honegger,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variabledomains:an automatic modeling and analysis tool.[免疫球蛋白可变结构域的又一种编号方案：自动建模和分析工具]”J Mol Biol.[分子生物学杂志]2001；309:657-670；Ofran等人“Automated identification of complementaritydetermining regions(CDRs)reveals peculiar characteristics of CDRs and B-cellepitopes.[互补决定区(CDR)的自动鉴定揭示了CDR和B细胞表位的特殊特征]”J Immunol.[免疫学杂志]2008；181:6230-6235；Almagro“Identification of differences in thespecificity-determining residues of antibodies that recognize antigens ofdifferent size:implications for the rational design of antibody repertoires.[鉴定识别不同大小抗原的抗体的特异性决定残基的差异：对抗体库的合理设计的影响]”JMol Recognit.[分子识别期刊]2004；17:132-143；以及Padlan等人“Identification ofspecificity-determining residues in antibodies.[抗体中特异性决定残基的鉴定]”Faseb J.[美国实验生物学会联合会杂志]1995；9:133-139.，其中的每一个特别地通过援引并入本文。
术语“仅重链抗体”和“重链抗体”在本文中可互换使用，并且在最广泛的意义上是指缺乏常规抗体的轻链的抗体，或者抗体的一个或多个部分，例如抗体的一个或多个臂。这些术语特别地包括但不限于在CH1结构域不存在的情况下包含VH抗原结合结构域以及CH2和CH3恒定结构域的同源二聚体抗体；此类抗体的功能性(抗原结合)变体、可溶性VH变体、包含一个可变结构域(V-NAR)和五个C样恒定结构域(C-NAR)的同源二聚体的Ig-NAR及其功能性片段；以及可溶性单结构域抗体(sUniDabsTM)。在一个实施例中，仅重链抗体由可变区抗原结合结构域构成，该可变区抗原结合结构域由框架1、CDR1、框架2、CDR2、框架3、CDR3和框架4构成。在另一个实施例中，仅重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少一部分以及CH2和CH3结构域构成。在另一个实施例中，仅重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少一部分和CH2结构域构成。在另一个实施例中，仅重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少一部分和CH3结构域构成。本文还包括CH2和/或CH3结构域被截短的仅重链抗体。在另一个实施例中，重链由抗原结合结构域和至少一个CH(CH1、CH2、CH3或CH4)结构域构成，但没有铰链区。仅重链抗体可以呈二聚体的形式，其中两条重链彼此以二硫键或其他方式共价或非共价附接。仅重链抗体可以属于IgG亚类，但属于其他亚类(诸如IgM、IgA、IgD和IgE亚类)的抗体也包括在本文中。在特定实施例中，重链抗体属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，特别是IgG1或IgG4亚型。在一个实施例中，重链抗体属于IgG4亚型，其中一个或多个CH结构域被修饰以改变抗体的效应子功能。在一个实施例中，重链抗体属于IgG1或IgG4亚型，其中一个或多个CH结构域被修饰以改变抗体的效应子功能。本文进一步描述了改变效应子功能的CH结构域的修饰。重链抗体的非限制性实例例如在WO 2018/039180中进行了描述，该文献的披露内容通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，本文中的仅重链抗体被用作嵌合抗原受体(CAR)的结合(靶向)结构域。该定义特别地包括通过人免疫球蛋白转基因大鼠(UniRatTM)产生的人仅重链抗体，被称为UniAbsTM。UniAbsTM的可变区(VH)被称为UniDabsTM，并且是多功能构建块，其可以与Fc区或血清白蛋白连接，用于开发具有多特异性、增加效力和延长半衰期的新颖治疗剂。因为同源二聚体UniAbsTM缺乏轻链，并且因此缺乏VL结构域，所以抗原被单个结构域，即重链抗体(VH或VHH)的重链的可变结构域识别。
如本文所用的“完整抗体链”是包含全长可变区和全长恒定区(Fc)的抗体链。完整“常规”抗体包含完整轻链和完整重链，以及用于分泌IgG的轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域、CH1、铰链、CH2和CH3。其他同种型，诸如IgM或IgA可以具有不同的CH结构域。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可以具有一个或多个“效应子功能”，其是指可归因于抗体的Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；以及细胞表面受体的下调。恒定区变体包括改变效应子谱、与Fc受体的结合等的那些变体。
取决于它们的重链的Fc(恒定结构域)的氨基酸序列，抗体和各种抗原结合蛋白可以作为不同的类别提供。重链Fc区有五大类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别的抗体的Fc恒定结构域可以分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。Ig形式包括铰链修饰或无铰链形式(Roux等人(1998)J.Immunol.[免疫学杂志]161:4083-4090；Lund等人(2000)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]267:7246-7256；US2005/0048572；US 2004/0229310)。基于它们的恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的轻链分配到两种类型(被称为κ(kappa)和λ(lambda))之一。根据本发明实施例的抗体可以包含κ轻链序列或λ轻链序列。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。效应子功能的非限制性实例包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；ADCP；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调等。此类效应子功能通常需要Fc区与受体，例如FcγRI；FcγRIIA；FcγRIIB1；FcγRIIB2；FcγRIIIA；FcγRIIIB受体以及低亲和力FcRn受体相互作用；并且可以使用本领域已知的各种测定来评估。“死亡”或“沉默”Fc是已经突变以保留关于例如延长血清半衰期的活性，但不激活高亲和力Fc受体，或对Fc受体的亲和力降低的Fc。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括例如天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区，以及其天然存在的变体。
由于至少一个氨基酸修饰，优选地一个或多个氨基酸取代，“变体Fc区”包含与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。优选地，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如从约一个至约十个氨基酸取代，并且优选地从约一个至约五个氨基酸取代。本文中的变体Fc区优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，并且最优选地与其具有至少约90％同源性，更优选地与其具有至少约95％同源性。
变体Fc序列可以在CH2区中包含三个氨基酸取代，以减少在EU索引位置234、235和237处的FcγRI结合(参见Duncan等人,(1988)Nature[自然]332:563)。EU索引位置330和331处补体C1q结合位点中的两个氨基酸取代减少了补体固定(参见Tao等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]178:661(1993)以及Canfield和Morrison,J.Exp.Med.[实验医学杂志]173:1483(1991))。在位置233-236处取代为人IgG1或IgG2残基和在位置327、330和331处取代为人IgG4残基极大地减少了ADCC和CDC(参见例如，Armour KL.等人,1999Eur JImmunol.[欧洲免疫学杂志]29(8):2613-24；以及Shields RL.等人,2001.J Biol Chem.[生物化学杂志]276(9):6591-604)。人IgG4 Fc氨基酸序列(UniProtKB编号P01861)在本文中以SEQ ID NO:76提供。沉默的IgG1例如在以下中描述：Boesch,A.W.等人,“Highlyparallel characterization of IgG Fc binding interactions.[IgG Fc结合相互作用的高度平行表征]”Mabs[单克隆抗体],2014.6(4):第915-27页，该文献的披露内容通过援引以其全文并入本文。
其他Fc变体是可能的，包括但不限于能够形成二硫键的区域被删除，或者某些氨基酸残基在天然Fc的N末端消除，或者向其中添加甲硫氨酸残基的Fc变体。因此，在一些实施例中，抗体的一个或多个Fc部分可在铰链区中包含一个或多个突变以消除二硫键。在又一个实施例中，Fc的铰链区可以被完全去除。在再一个实施例中，抗体可包含Fc变体。
进一步，可以构建Fc变体以通过取代(突变)、删除或添加氨基酸残基来去除或实质上减少效应子功能，以影响补体结合或Fc受体结合。例如但不限于，缺失可以发生在补体结合位点，诸如C1q结合位点中。用于制备免疫球蛋白Fc片段的此类序列衍生物的技术在国际专利公布号WO 97/34631和WO 96/32478中披露。另外，Fc结构域可以通过磷酸化、硫酸化、酰化、糖基化、甲基化、法呢基化、乙酰化、酰胺化等进行修饰。
在一些实施例中，抗体包含含有T366W突变的变体人IgG4 CH3结构域序列，其在本文中可任选地被称为IgG4 CH3杵序列。在一些实施例中，抗体包含含有T366S突变、L368A突变和Y407V突变的变体人IgG4 CH3结构域序列，其在本文中可任选地被称为IgG4 CH3臼序列。本文所述的IgG4 CH3突变可以以任何合适的方式利用，以便在抗体二聚体中第一单体的第一重链恒定区上放置一个“杵”，并且在抗体二聚体中第二单体的第二重链恒定区上放置一个“臼”，从而促进抗体中所期望的一对重链多肽亚基的适当配对(异源二聚化)。
在一些实施例中，抗体包含含有变体人IgG4 Fc区的重链多肽亚基，该变体人IgG4Fc区包含S228P突变、F234A突变、L235A突变和T366W突变(杵)。在一些实施例中，抗体包含含有变体人IgG4 Fc区的重链多肽亚基，该变体人IgG4 Fc区包含S228P突变、F234A突变、L235A突变、T366S突变、L368A突变和Y407V突变(臼)。
术语“包含Fc区的抗体”是指包含Fc区的抗体。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以例如在抗体纯化期间或通过编码抗体的核酸的重组工程化被去除。因此，具有根据本发明的Fc区的抗体可以包括具有或没有K447的抗体。
本发明的各方面包括包含呈单价或二价构型的仅重链可变区的抗体。如本文所用，如参考仅重链可变区结构域使用的术语“单价构型”意味着仅存在一个仅重链可变区结构域，具有单个结合位点。相比之下，如参考仅重链可变区结构域使用的术语“二价构型”意味着存在两个仅重链可变区结构域(各自具有单个结合位点)，并且通过接头序列连接。接头序列的非限制性实例在本文中进一步讨论，并且包括但不限于具有各种长度的GS接头序列。当仅重链可变区呈二价构型时，两个仅重链可变区结构域中的每一个都可以与相同抗原或不同抗原(例如，对于相同蛋白质上的不同表位；对于两个不同的蛋白质等)结合。然而，除非另外特别说明，否则表示为呈“二价构型”的仅重链可变区被理解为含有两个相同的仅重链可变区结构域，通过接头序列连接，其中两个相同的仅重链可变区结构域中的每一个都可以与相同的靶抗原结合。
本发明的各方面包括具有多特异性构型的抗体，其包括但不限于双特异性、三特异性等。各种方法和蛋白质构型是已知的并且用于双特异性单克隆抗体(BsMAB)、三特异性抗体等。
通过重组融合两个或更多个抗体的可变结构域，已经开发了用于产生多价人工抗体的各种方法。在一些实施例中，多肽上的第一和第二抗原结合结构域通过多肽接头连接。这种多肽接头的一个非限制性实例是GS接头，其氨基酸序列为四个甘氨酸残基，接着一个丝氨酸残基，并且其中该序列重复n次，其中n是范围为从1到约10的整数，诸如2、3、4、5、6、7、8或9。此类接头的非限制性实例包括GGGGS(SEQ ID NO:40)(n＝1)和GGGGSGGGGS(SEQ IDNO:41)(n＝2)。也可以使用其他合适的接头，并且描述于例如Chen等人,Adv Drug DelivRev.[高级药物递送综述]2013年10月15日；65(10):1357-69中，该文献的披露内容通过援引以其全文并入本文。
术语“三链抗体样分子”或“TCA”在本文中用于指抗体样分子，其包含三个多肽亚基、基本上由其组成或由其组成，其中两个包含单克隆抗体的一条重链和一条轻链、基本上由其组成或由其组成，或由此类抗体链的功能性抗原结合片段组成，该功能性抗原结合片段包含抗原结合区和至少一个CH结构域。此重链/轻链对对于第一抗原具有结合特异性。第三多肽亚基包含具有Fc部分的仅重链抗体、基本上由其组成或由其组成，该Fc部分包含CH2和/或CH3和/或CH4结构域，CH1结构域不存在，以及一个或多个结合第二抗原表位或第一抗原的不同表位的抗原结合结构域(例如，两个抗原结合结构域)，其中这种结合结构域来源于抗体重链或轻链的可变区或与其具有序列同一性。这种可变区的一部分可以由VH和/或VL基因片段、D和JH基因片段或JL基因片段编码。可变区可以由重排的VHDJH、VLDJH、VHJL或VLJL基因片段编码。
TCA结合化合物利用“仅重链抗体”或“重链抗体”或“重链多肽”，如本文所用，其意指包含重链恒定区CH2和/或CH3和/或CH4，但没有CH1结构域的单链抗体。在一个实施例中，重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少一部分以及CH2和CH3结构域构成。在另一个实施例中，重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少一部分和CH2结构域构成。在另一个实施例中，重链抗体由抗原结合结构域、铰链区的至少一部分和CH3结构域构成。本文还包括CH2和/或CH3结构域被截短的重链抗体。在另一个实施例中，重链由抗原结合结构域和至少一个CH(CH1、CH2、CH3或CH4)结构域构成，但没有铰链区。仅重链抗体可以呈二聚体的形式，其中两条重链彼此以二硫键或其他方式共价或非共价附接，并且可以任选地包括在一个或多个CH结构域之间的不对称界面(例如杵臼(knobs-in-holes，KiH)界面)，以有利于多肽链之间的适当配对。重链抗体可以属于IgG亚类，但属于其他亚类(诸如IgM、IgA、IgD和IgE亚类)的抗体也包括在本文中。在特定实施例中，重链抗体属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，特别是IgG1亚型或IgG4亚型。TCA结合化合物的非限制性实例例如在WO 2017/223111和WO2018/052503中进行了描述，这些文献的披露内容通过援引以其全文并入本文。
重链抗体占骆驼科动物(例如，骆驼和美洲驼)产生的IgG抗体的约四分之一(Hamers-Casterman C.等人Nature.[自然]363,446-448(1993))。这些抗体由两条重链形成，但没有轻链。因此，可变抗原结合部分被称为VHH结构域，并且它代表最小的天然存在的、完整的抗原结合位点，长度只有大约120个氨基酸(Desmyter,A.等人J.Biol.Chem.[生物化学杂志]276,26285-26290(2001))。通过免疫可以产生针对多种抗原具有高特异性和亲和力的重链抗体(van der Linden,R.H.等人Biochim.Biophys.Acta.[生物化学与生物物理学报]1431,37-46(1999))，并且可以在酵母中容易地克隆并表达VHH部分(Frenken,L.G.J.等人J.Biotechnol.[生物技术期刊]78,11-21(2000))。它们的表达水平、溶解性和稳定性显著高于经典F(ab)或Fv片段(Ghahroudi,M.A.等人FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联合会快报]414,521-526(1997))。还显示鲨鱼在其抗体中具有单个VH样结构域，被称为VNAR。(Nuttall等人Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]270,3543-3554(2003)；Nuttall等人Function and Bioinformatics[功能与生物信息学]55,187-197(2004)；Dooley等人,Molecular Immunology[分子免疫学]40,25-33(2003))。
如本文所用的术语“PSMA”是指具有N-乙酰化-α-连接的酸性二肽酶、叶酸水解酶和二肽基肽酶活性的II型跨膜蛋白。术语“PSMA”包括任何人和非人动物物种的PSMA蛋白，并且特别地包括人PSMA以及非人哺乳动物的PSMA。
如本文所用的术语“人PSMA”包括人PSMA(UniProt Q04609)的任何变体、同种型和物种同源物，无论其来源或制备方式如何。因此，“人PSMA”包括由细胞天然表达的人PSMA和在用人PSMA基因转染的细胞上表达的PSMA。
术语“抗PSMA仅重链抗体”、“PSMA仅重链抗体”、“抗PSMA重链抗体”和“PSMA重链抗体”在本文中可互换使用，是指如上定义的仅重链抗体，与PSMA免疫特异性结合，包括人PSMA，如上所定义。该定义包括但不限于由转基因动物(诸如表达人免疫球蛋白的转基因大鼠或转基因小鼠，包括产生人抗PSMA UniAbTM抗体的UniRatsTM，如上所定义)产生的人重链抗体。
关于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在用以实现最大百分比序列同一性并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分而比对序列和引入缺口(如果需要)之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括为了在被比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成的。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分鉴定并且分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质。在优选的实施例中，抗体将被纯化(1)至通过劳里法确定的大于95％重量、并且最优选大于99％重量的抗体，(2)至足以获得通过使用转杯式测序仪发现的N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染法发现的均质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常的是，通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
本发明的抗体包括多特异性抗体。多特异性抗体具有多于一种结合特异性。术语“多特异性”特别地包括“双特异性”和“三特异性”，以及高阶独立特异性结合亲和力，诸如高阶多表位特异性，以及四价抗体和抗体片段。术语“多特异性抗体”、“多特异性仅重链抗体”、“多特异性重链抗体”和“多特异性UniAbTM”在本文中以最广泛的意义使用，并且涵盖具有多于一种结合特异性的所有抗体。本发明的多特异性重链抗PSMA抗体特别地包括与PSMA蛋白(诸如人PSMA)上的两个或更多个非重叠表位免疫特异性结合的抗体(即，二价和双互补位)。本发明的多特异性重链抗PSMA抗体特别地还包括与PSMA蛋白(诸如人PSMA)上的一个表位和与不同蛋白质(例如像CD3蛋白，诸如人CD3)上的一个表位免疫特异性结合的抗体(即，二价和双互补位)。本发明的多特异性重链抗PSMA抗体特别地还包括与PSMA蛋白(诸如人PSMA蛋白)上的两个或更多个非重叠或部分重叠表位和与不同蛋白质(例如像人CD3蛋白，诸如人CD3蛋白)上的一个表位免疫特异性结合的抗体(即，二价和双互补位)。
本发明的抗体包括单特异性抗体，具有一种结合特异性。单特异性抗体特别地包括具有单一结合特异性的抗体，以及包含具有相同结合特异性的多于一个结合单元的抗体。术语“单特异性抗体”、“单特异性仅重链抗体”、“单特异性重链抗体”和“单特异性UniAbTM”在本文中以最广泛的意义使用，并且涵盖具有一种结合特异性的所有抗体。本发明的单特异性重链抗PSMA抗体特别地包括与PSMA蛋白(诸如人PSMA)上的一个表位免疫特异性结合的抗体(单价和单特异性)。本发明的单特异性重链抗PSMA抗体特别地还包括具有多于一个结合单元的抗体(例如，多价抗体)，这些结合单元与PSMA蛋白(诸如人PSMA)上的一个表位免疫特异性结合。例如，根据本发明实施例的单特异性抗体可以包括包含两个抗原结合结构域的重链可变区，其中每个抗原结合结构域均与PSMA蛋白上的相同表位结合(即，二价和单特异性)。
“表位”是单个抗体分子所结合的抗原分子表面上的位点。通常，抗原具有几个或许多不同的表位，并且与许多不同的抗体反应。该术语特别地包括线性表位和构象表位。
“表位作图”是鉴定抗体在其靶抗原上的结合位点或表位的过程。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中的连续氨基酸序列形成。构象表位由蛋白质序列中不连续的氨基酸形成，但在蛋白质折叠成其三维结构时将它们聚集在一起。
“多表位特异性”是指与相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位特异性结合的能力。如上说明，本发明特别地包括具有多表位特异性的抗PSMA重链抗体，即与PSMA蛋白(诸如人PSMA)上的一个或多个非重叠表位结合的抗PSMA重链抗体；以及与PSMA蛋白上的一个或多个表位和与不同蛋白质(例如像CD3蛋白)上的一个表位结合的抗PSMA重链抗体。术语抗原的“非重叠表位”或“非竞争性表位”在本文中定义为意指被一对抗原特异性抗体的一个成员识别但不被另一个成员识别的表位。靶向多特异性抗体上的相同抗原、识别非重叠表位的成对抗体或抗原结合区不竞争与此抗原的结合，并且能够同时结合此抗原。
当两种抗体识别相同或空间重叠的表位时，抗体将与参考抗体结合“基本上相同的表位”。用于确定两个表位是否与相同或空间重叠的表位结合的最广泛使用和最快速的方法是竞争测定，其可以使用标记抗原或标记抗体以所有数量的不同形式进行配置。通常，将抗原固定在96孔板上，并且使用放射性或酶标记测量未标记抗体阻断标记抗体结合的能力。
如本文所用的术语“价”是指抗体分子中指定数量的结合位点。
“单价”抗体具有一个结合位点。因此，单价抗体也是单特异性的。
“多价”抗体具有两个或更多个结合位点。因此，术语“二价”、“三价”和“四价”分别是指存在两个结合位点、三个结合位点和四个结合位点。因此，根据本发明的双特异性抗体至少是二价的，并且可以是三价的、四价的或其他多价的。根据本发明实施例的二价抗体对于同一表位(即，二价、单互补位)或对于两个不同表位(即，二价、双互补位)可以具有两个结合位点。
各种方法和蛋白质构型是已知的并且用于制备双特异性单克隆抗体(BsMAB)、三特异性抗体等。
术语“三链抗体样分子”或“TCA”在本文中用于指抗体样分子，其包含三个多肽亚基、基本上由其组成或由其组成，其中两个包含单克隆抗体的一条重链和一条轻链、基本上由其组成或由其组成，或由此类抗体链的功能性抗原结合片段组成，这些功能性抗原结合片段包含抗原结合区和至少一个CH结构域。此重链/轻链对对于第一抗原具有结合特异性。第三多肽亚基包含含有Fc部分的仅重链抗体、基本上由其组成或由其组成，该Fc部分包含CH2和/或CH3和/或CH4结构域，CH1结构域不存在，以及结合第二抗原表位或第一抗原的不同表位的抗原结合结构域，其中这种结合结构域来源于抗体重链或轻链的可变区或与其具有序列同一性。这种可变区的一部分可以由VH和/或VL基因片段、D和JH基因片段或JL基因片段编码。可变区可以由重排的VHDJH、VLDJH、VHJL或VLJL基因片段编码。TCA蛋白利用如上定义的仅重链抗体。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”在本文中以最广泛的意义使用，是指工程化受体，其将所期望的结合特异性(例如，单克隆抗体或其他配体的抗原结合区)移植到跨膜和细胞内信号传导结构域。典型地，受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上以产生嵌合抗原受体(CAR)。(J Natl Cancer Inst[美国国立癌症研究所杂志],2015；108(7):dvj439；和Jackson等人,Nature Reviews Clinical Oncology[自然评论·临床肿瘤学],2016；13:370-383)。CAR-T细胞是经过基因工程化以产生用于在免疫疗法中使用的人工T细胞受体的T细胞。在一个实施例中，“CAR-T细胞”意指表达编码一个或多个嵌合抗原受体的转基因的治疗性T细胞，这些嵌合抗原受体至少由胞外结构域、跨膜结构域和至少一个胞质结构域组成。
术语“人抗体”在本文中用于包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本文中的人抗体可以包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点特异性诱变引入的突变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。术语“人抗体”特别地包括具有人重链可变区序列的仅重链抗体，由转基因动物(诸如转基因大鼠或小鼠)产生，特别是由UniRatsTM产生的UniAbsTM，如上所定义。
“嵌合抗体”或“嵌合免疫球蛋白”意指包含来自至少两个不同Ig基因座的氨基酸序列的免疫球蛋白分子，例如，包含由人Ig基因座编码的部分和由大鼠Ig基因座编码的部分的转基因抗体。嵌合抗体包括具有非人Fc区或人工Fc区以及人独特型的转基因抗体。此类免疫球蛋白可以从本发明的动物中分离，这些动物已被工程化以产生此类嵌合抗体。
如本文所用，术语“效应细胞”是指参与免疫应答的效应阶段而非免疫应答的认知和激活阶段的免疫细胞。一些效应细胞表达特定的Fc受体并执行特定的免疫功能。在一些实施例中，效应细胞诸如自然杀伤细胞能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。例如，表达FcR的单核细胞和巨噬细胞参与靶细胞的特异性杀伤，并将抗原呈递给免疫系统的其他组分，或与呈递抗原的细胞结合。在一些实施例中，效应细胞可以吞噬靶抗原或靶细胞。
“人效应细胞”是表达受体诸如T细胞受体或FcR并执行效应子功能的白细胞。优选地，这些细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中NK细胞是优选的。效应细胞可以从其自然来源中分离，例如，从如本文所述的血液或PBMC中分离。
术语“免疫细胞”在本文中以最广泛的意义使用，包括但不限于骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(诸如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、多形核细胞，诸如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。
“抗体效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并且随后引起靶细胞的裂解。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol[免疫学年评]9:457-92(1991)的第464页上的表3中总结。为了评估感兴趣的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的测定。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外，可以在体内，例如在动物模型(诸如Clynes等人，PNAS(USA)[美国国家科学院院刊]95:652-656(1998)中披露的动物模型)中对感兴趣的分子的ADCC活性进行评估。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体存在的情况下裂解靶标的能力。补体激活途径是通过补体系统的第一组分(C1q)与和同源抗原复合的分子(例如，抗体)结合而启动的。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(例如，如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]202:163(1996)中所述)。
“结合亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以表示为解离常数(Kd)。亲和力可以通过本领域已知的常见方法测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持结合。
如本文所用，“Kd”或“Kd值”是指在动力学模式中使用Octet QK384仪器(艾瑞生物公司，门洛帕克，加利福尼亚州(Fortebio Inc.,Menlo Park,CA))通过生物层干涉技术确定的解离常数。例如，向抗小鼠Fc传感器加载小鼠Fc融合抗原，并且然后浸入含有抗体的孔中以测量浓度依赖性缔合速率(kon)。在最后步骤中测量抗体解离速率(koff)，其中将传感器浸入仅含有缓冲液的孔中。Kd是koff/kon的比率。(关于更多细节，参见Concepcion,J等人,Comb Chem High Throughput Screen[组合化学与高通量筛选],12(8),791-800,2009)。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等在本文中通常用于意指获得所期望的药理学和/或生理学作用。作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不良作用而言可以是治疗性的。如本文所用的“治疗”涵盖哺乳动物的疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病发生在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中；(b)抑制该疾病，即阻止其发展；或者(c)缓解该疾病，即引起疾病消退。治疗剂可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用。对正在发生的疾病的治疗是特别令人感兴趣的，其中该治疗稳定或减少患者的不期望的临床症状。这种治疗期望在受影响组织完全丧失功能之前进行。主题治疗可以在疾病的症状阶段期间施用，并且在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用。
“治疗有效量”旨在用于向受试者赋予治疗益处所必需的活性剂的量。例如，“治疗有效量”是诱导、减轻或以其他方式改善与疾病相关联的病理症状、疾病进展或生理状况或提高对疾患的抵抗力的量。
如本文所用的术语“前列腺癌”是指前列腺中腺体起源的恶性肿瘤。
术语“特征在于PSMA的表达”广义上是指其中PSMA表达与疾病或疾患所特有的一种或多种病理过程相关联或涉及该一种或多种病理过程的任何疾病或疾患。此类疾患包括但不限前列腺癌。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指正在评估治疗和/或正在治疗的哺乳动物。在一个实施例中，该哺乳动物是人。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患有癌症的个体、患有自身免疫性疾病的个体、患有病原体感染的个体等。受试者可以是人，但也包括其他哺乳动物，特别是可用作人类疾病的实验室模型的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。
术语“药物配制品”是指呈使得活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对该配制品所施用的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分的配制品。此类配制品是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(媒介物、添加剂)是可以合理地施用于受试哺乳动物以提供有效剂量的所采用的活性成分的那些赋形剂。
“无菌”配制品是无菌的或不含或基本上不含所有活微生物及其孢子。“冷冻”配制品是处于低于0℃的温度下的配制品。
“稳定的”配制品是在储存之后，其中的蛋白质基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的配制品。优选地，配制品在储存之后基本上保留其物理和化学稳定性以及生物活性。储存期通常基于配制品的预期保质期来选择。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的，并且在以下进行综述：例如Peptide and ProteinDrug Delivery[肽和蛋白质药物递送],247-301.Vincent Lee编辑,Marcel Dekker公司，纽约，纽约州(Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.)出版(1991)以及Jones.A.Adv.DrugDelivery Rev.[高级药物递送综述]10:29-90)(1993)。可以在选定的温度下在选定的时间段内测量稳定性。稳定性可以通过各种不同的方式定性和/或定量评价，包括评价聚集体形成(例如，使用尺寸排阻色谱法、测量浊度和/或通过目视检查)；使用阳离子交换色谱法、图像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评价电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；比较还原抗体和完整抗体的SDS-PAGE分析；肽图(例如，胰蛋白酶或LYS-C)分析；评价抗体的生物活性或抗原结合功能；等。不稳定性可以涉及以下中的一种或多种：聚集、脱酰胺(例如Asn脱酰胺)、氧化(例如Met氧化)、异构化(例如Asp异构化)、剪切/水解/片段化(例如铰链区片段化)、琥珀酰亚胺形成、未配对的半胱氨酸、N末端延伸、C末端加工、糖基化差异等。
II.详细描述
抗PSMA抗体
本发明提供了与人PSMA结合的密切相关的抗体家族。该家族的抗体包含一组如本文定义和表1中所示的CDR序列，并且通过所提供的重链CDR1、CDR2和CDR3序列(在表2中列出)以及SEQ ID NO:5和6的重链可变区(VH)序列(在表3中列出)例示。抗体家族提供了许多益处，有助于作为一种或多种临床治疗剂使用。这些抗体包含具有一系列结合亲和力的成员，从而允许选择具有所期望结合亲和力的特定序列。
表1：抗PSMA重链抗体独特CDR氨基酸序列。
表2：抗PSMA重链抗体CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。
表3.抗PSMA重链抗体可变结构域氨基酸序列。
可以从本文提供的抗体中选择合适的抗体用于开发和治疗或其他用途，包括但不限于用作双特异性抗体，或CAR-T结构的一部分(例如，如在图1中所示)。
候选蛋白质的亲和力的确定可以使用本领域已知的方法进行，诸如Biacore测量。抗体家族的成员可以对PSMA具有Kd为从约10-6至大约10-11的亲和力，包括但不限于：从约10-6至大约10-10；从约10-6至大约10-9；从约10-6至大约10-8；从约10-8至大约10-11；从约10-8至大约10-10；从约10-8至大约10-9；从约10-9至大约10-11；从约10-9至大约10-10；或这些范围内的任何值。可以用调节(例如，阻断)PSMA生物活性的生物评估来确认亲和力选择，包括体外测定、临床前模型和临床试验，以及潜在毒性的评估。
本文中的抗体家族成员不与食蟹猴的PSMA蛋白交叉反应，但可以被工程化以提供与食蟹猴的PSMA蛋白或与任何其他动物物种的PSMA(如果期望)的交叉反应性。
本文中的PSMA特异性抗体家族包含VH结构域，该结构域包含在人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列。例如，CDR序列可以分别位于SEQ ID NO:7-8中列出的所提供示例性可变区序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸残基26-33、51-58和97-116附近的区域中。本领域普通技术人员将理解，如果选择不同的框架序列，则CDR序列可能处于不同的位置中，尽管通常序列的顺序将保持不变。
在特定实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:1或4中任一个的CDR1序列。在特定实施例中，CDR1序列包含SEQ ID NO:1。在特定实施例中，CDR1序列包含SEQ ID NO:4。
在特定实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:2或5中任一个的CDR2序列。在特定实施例中，CDR2序列包含SEQ ID NO:2。在特定实施例中，CDR2序列包含SEQ ID NO:5。
在特定实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:3或6中任一个的CDR3序列。在特定实施例中，CDR3序列包含SEQ ID NO:3。在特定实施例中，CDR2序列包含SEQ ID NO:6。
在另一个实施例中，抗PSMA仅重链抗体包含SEQ ID NO:1的CDR1序列；SEQ ID NO:2的CDR2序列；以及SEQ ID NO:3的CDR3序列。
在另一个实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:4的CDR1序列；SEQ ID NO:5的CDR2序列；以及SEQ ID NO:6的CDR3序列。
在另一个实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:7-8的重链可变区氨基酸序列中的任一个(表3)。
在仍另一个实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列。
在仍另一个实施例中，抗PSMA抗体包含SEQ ID NO:8的重链可变区序列。
在一些实施例中，本发明的抗PSMA抗体中的CDR序列包含相对于SEQ ID NO:1-6中任一个中的CDR1、CDR2和/或CDR3序列或CDR1、CDR2和CDR3序列组的一个或两个氨基酸取代(表1、表2)。
在一些实施例中，抗PSMA抗体优选地包含重链可变结构域(VH)并且与PSMA结合，其中CDR3序列在氨基酸水平下与其CDR3序列在表1或表2中提供的任一抗体的CDR3序列具有大于或等于80％，诸如至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。
在一些实施例中，抗PSMA抗体优选地包含重链可变结构域(VH)并且与PSMA结合，其中整组CDR 1、2和3(组合)在氨基酸水平下与其CDR序列在表1或表2中提供的抗体的CDR1、2和3(组合)具有大于或等于百分之八十五(85％)的序列同一性。
在一些实施例中，抗PSMA抗体包含重链可变区序列并且与PSMA结合，该重链可变区序列与SEQ ID NO:7-8(在表3中示出)的任一重链可变区序列具有至少约80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。
在一些实施例中，提供了双特异性或多特异性抗体，其可以具有本文讨论的任何构型，包括但不限于双特异性三链抗体样分子(TCA)。在一些实施例中，多特异性抗体可以包含至少一个对PSMA具有结合特异性的重链可变区，和至少一个对除PSMA之外的蛋白质具有结合特异性的重链可变区。在一些实施例中，多特异性抗体可以包含至少一个与PSMA结合的重链可变区，和至少一个与除PSMA之外的蛋白质结合的重链可变区。在一些实施例中，多特异性抗体可以包含含有至少两个抗原结合结构域的重链可变区，其中每个抗原结合结构域都与PSMA结合。在一些实施例中，多特异性抗体可以包含与第一抗原(例如，CD3)结合的重链/轻链对，以及来自仅重链抗体的重链。在某些实施例中，来自仅重链抗体的重链包含Fc部分，该Fc部分包含CH2和/或CH3和/或CH4结构域，不存在CH1结构域。在一个特定实施例中，双特异性抗体包含与效应细胞上的抗原(例如，T细胞上的CD3蛋白)结合的重链/轻链对，以及来自包含与PSMA结合的抗原结合结构域的仅重链抗体的重链。
在一些实施例中，多特异性抗体包含与轻链可变结构域配对的CD3结合VH结构域。在某些实施例中，该轻链是固定轻链。在一些实施例中，CD3结合VH结构域包含在人VH框架中的SEQ ID NO:9的CDR1序列、SEQ ID NO:10的CDR2序列和SEQ ID NO:11的CDR3序列。在一些实施例中，CD3结合VH结构域包含在人VH框架中的SEQ ID NO:12的CDR1序列、SEQ ID NO:13的CDR2序列和SEQ ID NO:14的CDR3序列。在一些实施例中，固定轻链包含在人VL框架中的SEQ ID NO:15的CDR1序列、SEQ ID NO:16的CDR2序列和SEQ ID NO:17的CDR3序列。共同地，CD3结合VH结构域和轻链可变结构域对CD3具有结合亲和力。在一些实施例中，CD3结合VH结构域包含SEQ ID NO:18的重链可变区序列。在一些实施例中，CD3结合VH结构域包含SEQ ID NO:19的重链可变区序列。在一些实施例中，CD3结合VH结构域包含与SEQ ID NO:18或19的重链可变区序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同一性百分比的序列。在一些实施例中，固定轻链包含SEQ ID NO:20的轻链可变区序列。在一些实施例中，固定轻链包含与SEQ ID NO:20的重链可变区序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同一性百分比的序列。
包含上述CD3结合VH结构域和轻链可变结构域的多特异性抗体具有有利的特性，例如，如公开的PCT申请公开号WO 2018/052503中所述，其披露内容通过援引以其全文并入本文。本文所述的对PSMA具有结合亲和力的任何多特异性抗体和抗原结合结构域均可以与本文中(参见，例如，表4和表5)所述的CD3结合结构域和固定轻链结构域以及另外的序列(诸如表6和表7中提供的那些序列)组合，以产生对一个或多个PSMA表位以及CD3具有结合亲和力的多特异性抗体。
表4.抗CD3重链和轻链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列。
表5.抗CD3重链和轻链可变区氨基酸序列。
表6：人IgG1和IgG4 Fc区序列。
表7：另外的序列。
在一些实施例中，提供了双特异性或多特异性抗体，其可以具有本文讨论的任何构型，包括但不限于双特异性三链抗体样分子(TCA)。在一些实施例中，双特异性抗体可以包含至少一个与PSMA结合的重链可变区，和至少一个与除PSMA之外的蛋白质结合的重链可变区。在一些实施例中，双特异性抗体可以包含与第一抗原结合的重链/轻链对，和来自包含Fc部分的仅重链抗体的重链，该Fc部分包含CH2和/或CH3和/或CH4结构域，不存在CH1结构域，以及与第二抗原的表位或第一抗原的不同表位结合的抗原结合结构域。在一个特定实施例中，双特异性抗体包含与效应细胞上的抗原(例如，T细胞上的CD3蛋白)结合的重链/轻链对，以及来自包含与PSMA结合的抗原结合结构域的仅重链抗体的重链。
在一些实施例中，当本发明的抗体是双特异性抗体时，该抗体的一条臂(一个结合部分或一个结合单位)对人PSMA是特异性的，而另一条臂可以对靶细胞、肿瘤相关抗原、靶向抗原(例如，整联蛋白等)、病原体抗原、检验点蛋白等是特异性的。靶细胞特别地包括癌细胞，包括但不限于与以PSMA的表达为特征的血液恶性肿瘤相关的细胞，以及与以PSMA的表达为特征的自身免疫性疾患相关的病原性B细胞。在一些实施例中，该抗体的一条臂(一个结合部分或一个结合单位)对人PSMA是特异性的，而另一条臂对CD3是特异性的。
在一些实施例中，抗体包含抗CD3轻链多肽，该抗CD3轻链多肽包含SEQ ID NO:32的序列；抗CD3重链多肽，该抗CD3重链多肽包含SEQ ID NO:18或19的序列；和抗PSMA重链多肽，该抗PSMA重链多肽包含与SEQ ID NO:30或31中任一个的序列连接的SEQ ID NO:7或8的序列，呈单价或二价构型。这些序列可以以各种方式组合以产生所期望IgG亚类的双特异性抗体，例如IgG1、IgG4、沉默的IgG1、沉默的IgG4。在一个优选的实施例中，抗体是TCA，其包含含有SEQ ID NO:32的第一多肽、含有SEQ ID NO:33的第二多肽和含有SEQ ID NO:34、35、36、37、38或39的第三多肽。
各种形式的多特异性抗体都在本发明的范围内，包括但不限于单链多肽、二链多肽、三链多肽、四链多肽、及其多种。本文中的多特异性抗体特别地包括与PSMA和CD3结合的T细胞多特异性(例如，双特异性)抗体(抗PSMA x抗CD3抗体)。此类抗体诱导有效的T细胞介导的对表达PSMA的细胞的杀伤。
抗PSMA抗体的制备
本发明的抗体可以通过本领域已知的方法制备。在一个优选实施例中，本文中的抗体由转基因动物(包括转基因小鼠和大鼠，优选大鼠)产生，其中内源性免疫球蛋白基因被敲除或无效。在一个优选实施例中，本文中的重链抗体在UniRatTM中产生。UniRatTM的内源性免疫球蛋白基因被沉默，并且使用人免疫球蛋白重链转座点来表达多样化的自然优化的全人源HCAb库。虽然大鼠中的内源性免疫球蛋白基因座可以使用多种技术来敲除或沉默，但在UniRatTM中，使用锌指(内)核酸酶(ZNF)技术来灭活内源性大鼠重链J基因座、轻链Cκ基因座和轻链Cλ基因座。用于微注射到卵母细胞中的ZNF构建体可以产生IgH和IgL敲除(KO)系。关于细节，参见例如Geurts等人,2009,Science[科学]325:433。Ig重链敲除大鼠的表征已经由Menoret等人,2010,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]40:2932-2941报告。ZNF技术的优点是，非同源末端连接经由高达若干kb的缺失使基因或基因座沉默也可以为同源整合提供靶位点(Cui等人,2011,Nat Biotechnol[自然-生物技术]29:64-67)。UniRatTM中产生的人重链抗体被称为UniAbsTM，并且可以结合常规抗体无法攻击的表位。它们的高特异性、亲和力和小尺寸使其成为单特异性和多特异性应用的理想选择。
除UniAbsTM之外，本文特别地包括缺乏骆驼科VHH框架和突变的仅重链抗体及其功能性VH区。例如，此类仅重链抗体可以在转基因大鼠或小鼠中产生，其包含例如在WO 2006/008548中描述的完全人仅重链基因座，但是也可以使用其他转基因哺乳动物，诸如兔、豚鼠、大鼠，大鼠和小鼠是优选的。仅重链抗体，包括其VHH或VH功能性片段，也可以通过重组DNA技术，通过在合适的真核或原核宿主中表达编码核酸来产生，该宿主例如包括哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)、大肠杆菌或酵母。
仅重链抗体的结构域结合了抗体和小分子药物的优点：可以是单价的或多价的；具有低毒性；并且对于制造是成本有效的。由于其尺寸较小，这些结构域易于施用，包括口服或局部施用，其特征在于高稳定性，包括胃肠道稳定性；并且它们的半衰期可以根据所期望的用途或适应症进行定制。另外，HCAb的VH和VHH结构域可以以成本有效的方式制造。
在特定实施例中，本发明的重链抗体，包括UniAbsTM，在FR4区的第一位置(根据Kabat编号系统的氨基酸位置101)处的天然氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代，该另一个氨基酸残基能够在此位置处破坏包含天然氨基酸或与天然氨基酸残基缔合的表面暴露的疏水贴剂。此类疏水贴剂通常埋在与抗体轻链恒定区的界面中，但在HCAb中暴露在表面，并且至少部分地用于HCAb的不需要的聚集和轻链缔合。经取代的氨基酸残基优选是带电的，并且更优选带正电荷，诸如赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)或组氨酸(His，H)，优选精氨酸(R)。在一个优选实施例中，来源于转基因动物的仅重链抗体在位置101处含有Trp至Arg突变。所得的HCAb优选在聚集不存在的情况下在生理条件下具有高抗原结合亲和力和溶解性。
作为本发明的一部分，鉴定了具有来自UniRatTM动物的独特序列的人IgG抗PSMA重链抗体(UniAbTM)，这些抗体在ELISA蛋白和细胞结合测定中结合人PSMA。所鉴定的重链可变区(VH)序列对于人PSMA蛋白结合和/或与PSMA+细胞的结合呈阳性，并且对于与不表达PSMA的细胞的结合全部呈阴性。
与PSMA蛋白上的非重叠表位结合的重链抗体(例如，UniAbsTM)可以通过竞争结合测定来鉴定，诸如酶联免疫测定(ELISA测定)或流式细胞术竞争结合测定。例如，可以使用与靶抗原结合的已知抗体与感兴趣的抗体之间的竞争。通过使用这种方法，可以将一组抗体分为与参考抗体竞争的抗体和不与参考抗体竞争的抗体。非竞争抗体被鉴定为与不同表位结合，该不同表位不与参考抗体所结合的表位重叠。通常，将一种抗体固定，结合抗原，并且在ELISA测定中测试被标记的(例如，生物素化)第二抗体，以确定其结合捕获的抗原的能力。这也可以通过使用表面等离子体共振(SPR)平台，包括ProteOn XPR36(伯乐公司(BioRad,Inc))、Biacore 2000和Biacore T200(GE医疗生命科学部(GE Healthcare LifeSciences))和MX96 SPR成像仪(Ibis技术私人有限公司(Ibis technologies B.V.))以及在生物层干涉技术平台，诸如Octet Red384和Octet HTX(颇尔公司(ForteBio,Pall Inc))上实现。关于更多细节，参见本文中的实例。
典型地，如果抗体导致参考抗体与靶抗原的结合减少约15％-100％(如通过标准技术，诸如通过以上所述的竞争结合测定确定)，则该抗体与参考抗体“竞争”。在各种实施例中，相对抑制是至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高。
药物组合物、用途和治疗方法
本发明的另一方面提供了药物组合物，其包含与合适的药学上可接受的载剂混合的一种或多种本发明的抗体。如本文所用的药学上可接受的载剂是示例性的，但不限于辅助剂、固体载剂、水、缓冲液或本领域用于容纳治疗组分的其他载剂或其组合。
在一个实施例中，药物组合物包含与PSMA结合的重链抗体(例如，UniAbTM)。在另一个实施例中，药物组合物包含多特异性(包括双特异性)重链抗体(例如，UniAbTM)，其对PSMA蛋白上的两个或更多个非重叠表位具有结合特异性。在一个优选实施例中，药物组合物包含多特异性(包括双特异性和TCA)重链抗体(例如，UniAbTM)，其对PSMA具有结合特异性，并且对效应细胞上的结合靶(例如，T细胞上的结合靶，例如像T细胞上的CD3蛋白)具有结合特异性。在一个优选实施例中，药物组合物包含多特异性(包括双特异性和TCA)重链抗体(例如，UniAbTM)，其与PSMA结合，并且与效应细胞上的结合靶(例如，T细胞上的结合靶，例如像T细胞上的CD3蛋白)结合。
通过将具有所期望纯度的蛋白质与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition[雷明顿药物科学第16版],Osol,A.编辑(1980))混合来制备根据本发明使用的抗体的药物组合物，诸如呈冻干配制品或水溶液的形式。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲液(诸如磷酸盐、柠檬酸盐)和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)；单糖、二糖和其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(诸如EDTA)；糖(诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)；成盐平衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂(诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG))。
用于肠胃外施用的药物组合物优选是无菌且基本上等渗的，并在良好生产规范(GMP)条件下制造。药物组合物可以呈单位剂型(即，用于单次施用的剂量)提供。配制品取决于所选的施用途径。本文中的抗体可以通过静脉内注射或输注或皮下施用。对于注射施用，本文中的抗体可以在水溶液，优选在生理相容的缓冲液中配制，以减少注射部位的不适。该溶液可以含有如上所讨论的载剂、赋形剂或稳定剂。可替代地，抗体可以呈冻干形式，以供在使用之前用合适的媒介物(例如，无菌无热原水)构造。
抗体配制品披露于例如美国专利号9,034,324中。类似的配制品可以用于本发明的重链抗体，包括UniAbsTM。皮下抗体配制品描述于例如US 20160355591和US 20160166689中。
使用方法
本文所述的抗PSMA抗体和药物组合物可以用于治疗特征在于PSMA表达的疾病和病症，包括但不限于本文进一步描述的病症和疾病。
PSMA是在前列腺上皮组织上表达的II型跨膜蛋白，并在前列腺癌和实体瘤的新血管系统中上调。它在例如脑、肾脏和唾液腺的健康组织中也以低水平表达，但它在恶性前列腺组织中过度表达，使其成为前列腺癌治疗性治疗的有吸引力的靶标。鉴于其在恶性新血管系统中高表达，它也可能与实体瘤的治疗或成像相关。靶向PSMA的单克隆抗体、抗体药物缀合物和嵌合抗原受体T细胞已被描述用于治疗转移性前列腺癌(Hernandez-Hoyos等人,2016,PMID:27406985,DiPippo等人,2014,PMID:25327986,Serganova等人,2016,PMID:28345023)。此外，正在研究对PSMA特异性的放射性核素缀合物用于前列腺癌的成像和治疗(例如，Hofman等人,2018PMID:29752180)。
在一方面，本文的抗PSMA抗体(例如，UniAbsTM)和药物组合物可用于治疗特征在于PSMA的表达的疾患，包括但不限于前列腺癌和实体瘤。
在一个实施例中，本文中的抗体可以呈仅重链抗PSMA抗体-CAR结构，即仅重链抗PSMA抗体-CAR转导T细胞结构的形式。
本发明的组合物用于治疗疾病的有效剂量根据许多不同的因素而变化，包括施用手段、靶部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物、以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物，例如，伴侣动物诸如狗、猫、马等，实验室哺乳动物诸如兔、小鼠、大鼠等等。可以调整治疗剂量以优化安全性和有效性。
剂量水平可以由一般熟练的临床医生容易地确定，并且可以根据需要进行修改，例如，根据修改受试者对于疗法的应答的需要。可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量根据所治疗的宿主和具体施用模式而变化。剂量单位形式通常含有从约1mg至约500mg之间的活性成分。
在一些实施例中，该药剂的治疗剂量的范围可以是从约0.0001至100mg/kg，并且更通常0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月施用一次。本发明的治疗实体通常在多个场合施用。单个剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量治疗实体在患者中的血液水平所指示。可替代地，本发明的治疗实体可以作为缓释配制品施用，在这种情况下需要较少的施用频率。剂量和频率根据多肽在患者中的半衰期而变化。
典型地，将组合物制备为注射剂，作为液体溶液或悬浮液；也可以制备适用于在注射之前溶解或悬浮在液体媒介物中的固体形式。本文中的药物组合物适用于直接或在固体(例如，冻干)组合物重构之后静脉内或皮下施用。该制剂还可以乳化或包封在脂质体或微颗粒(诸如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物)中以增强辅助剂作用，如上所讨论的。Langer,Science[科学]249:1527,1990以及Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews[高级药物递送综述]28:97-119,1997。本发明的药剂可以以贮库型注射剂或植入物制剂的形式施用，该形式可以以允许活性成分持续或脉动释放的方式配制。药物组合物通常被配制为无菌的、基本上等渗的，并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)法规。
可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序，例如通过确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和LD100(对群体的100％致死的剂量)来确定本文所述的抗体和抗体结构的毒性。毒性与治疗作用之间的剂量比是治疗指数。可以在配制对于在人类中使用无毒的剂量范围中使用由这些细胞培养测定和动物研究获得的数据。本文所述的抗体的剂量优选在包括有效剂量而具有很小或没有毒性的一系列循环浓度内。该剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径在这个范围内变化。确切配制、施用途径和剂量可以由个别医师根据患者的状况来选择。
用于施用的组合物通常包含溶解在药学上可接受的载剂(优选水性载剂)中的抗体或其他烧蚀剂。可以使用多种水性载剂，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，并且通常不含不期望的物质。这些组合物可以通过常规、熟知的灭菌技术来灭菌。这些组合物可以含有药学上可接受的辅助物质，如近似生理条件所需的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些配制品中活性剂的浓度可以变化很大，并且将主要根据所选择的特定施用模式和患者的需要，基于流体体积、粘度、体重等进行选择(例如，Remington'sPharmaceutical Science[雷明顿药物科学](第15版,1980)和Goodman和Gillman,The Pharmacological Basis of Therapeutics[治疗学的药理学基础](Hardman等人编辑,1996))。
包括本发明的活性剂及其配制品以及使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。试剂盒可以进一步含有至少一种另外的试剂，例如化疗药物等。试剂盒典型地包括指示试剂盒的内容物的预期用途的标签。如本文所用，术语“标签”包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式伴随试剂盒的任何书写或记录材料。
现在正在充分描述本发明，对于本领域普通技术人员而言明显的是，可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下进行各种变化和修改。
实例
实例1：与PSMA结合的分析
使用LNCaP细胞系(ATCC:CRL-1740)通过流式细胞术(Guava easyCyte 8HT，EMD密理博公司(EMD Millipore))评估与PSMA阳性细胞的结合。简而言之，将50,000个靶细胞在4℃用稀释系列的经纯化的UniAbsTM染色30分钟。孵育后，将细胞用流式细胞术缓冲液(1XPBS、1％BSA、0.1％NaN3)洗涤两次，并用与R-藻红蛋白(PE)缀合的山羊F(ab’)2抗人IgG(南方生物技术公司(Southern Biotech)，目录号2042-09)染色来检测细胞结合抗体。在4℃孵育20分钟后，将细胞用流式细胞术缓冲液洗涤两次，并通过流式细胞术测量平均荧光强度(MFI)。单独用二抗染色的细胞的MFI用于确定背景信号，并将每种抗体的结合转化为背景的倍数。LNCaP细胞结合数据总结于图1的表中。
在标准ELISA测定中测试了两种所指示抗体与人PSMA的结合。使用浓度为2μg/mL的人PSMA蛋白捕获50ng/mL的UniAb。使用山羊抗人IgG HRP缀合抗体(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)31413)检测抗体结合。所有抗体均在含有0.05％Tween-20和1％干燥奶粉的1X PBS中稀释。ELISA结合分析的结果总结于图1的表中。
实例2：双特异性抗体通过人T细胞重新定向介导的22Rv1人肿瘤细胞的肿瘤细胞裂解
在激活的人T细胞存在下，将PSMA阳性肿瘤细胞系22Rv1(ATCC:CRL-2505)与增加量的双特异性抗体一起孵育，从而导致特异性肿瘤细胞裂解。简而言之，将PBMC解冻、洗涤并用1μg/mL板包被的OKT3和1ng/mL IL-2激活3天。然后从激活的PBMC中分离出泛T细胞(美天旎公司(Miltenyi Biotec)目录号130-096-535)，并将50,000个泛T细胞与双特异性抗体一起添加到装载有7.5μM钙黄绿素AM(赛默飞世尔公司目录号C1430)的5,000个靶细胞中。孵育2小时后，测量钙黄绿素释放以确定细胞毒性。结果提供于图2中。双特异性抗体由与所指示抗PSMA VH结合结构域配对的抗CD3结合臂组成(克隆ID：325795或325972)。包含不与PSMA结合的VH结合结构域的阴性对照抗体没有表现出特异性裂解。PSMA阴性细胞没有表现出特异性裂解(数据未示出)。
实例3：使用生物层干涉技术(BLI)的结合动力学分析
在Octet QK-384(艾瑞生物公司(ForteBio))仪器上分析克隆ID号325972和325795的抗体结合动力学。简而言之，使用抗Penta HIS捕获(HIS1K)传感器固定抗原重组人PSMA(研究与诊断系统有限公司(R&D Systems)目录号：4234-ZN)120秒。读取基线读数后，将传感器浸入含有测试抗体(克隆ID号325972或325795)的溶液中，并测量缔合和解离速率。使用Octet数据分析HT v11.0(艾瑞生物公司)进行数据分析，并且将数据总结在图3中提供的表中。
实例4：通过人肿瘤细胞进行的CAR-T介导的T细胞激活
通过用抗PSMA CAR和6x NFAT TK纳米荧光素酶报告基因转染Jurkat T淋巴细胞来测量CAR-T细胞活性。将转染的Jurkat与稳定转染以表达人PSMA的PSMA+PC3细胞、LNCaP和22Rv1或PSMA阴性DU145细胞共培养24小时。使用Promega Nano-Glo荧光素酶测定系统(目录号N1110)测量荧光素酶活性，并且将数据归一化至含有CAR转染的Jurkat和PSMA阴性DU145细胞系的共培养物。使用非配对双尾t检验确定统计显著性。结果提供在图4，分图B和C中。
图4，分图A是包含抗PSMA胞外结合结构域的CAR-T结构的示意图，该抗PSMA胞外结合结构域包含根据本发明的实施例的抗体序列。分图B描绘了与前列腺肿瘤细胞系PC3-PSMA(**p＝0.0016)、LNCaP(**p＝0.0011)和22Rv1(****p＝0.000077)肿瘤细胞系共培养的Jurkat的T细胞活性，该Jurkat用T细胞信号传导的NFAT荧光素酶报告基因和抗PSMA325972CAR转染。分图C描绘了与前列腺肿瘤细胞系PC3-PSMA(***p＝0.0004)、LNCaP(****p＝0.00004)和22Rv1(***p＝0.00014)共培养的Jurkat的T细胞活性，该Jurkat用T细胞信号传导的NFAT荧光素酶报告基因和抗PSMA 325795CAR转染。这些结果证明了T细胞激活对PSMA靶标结合具有特异性，因为与PSMA阴性DU145细胞系共培养，或单独孵育经转染的Jurkat，不产生明显的荧光素酶报告基因信号。
实例5：通过CAR-T介导的T细胞激活的肿瘤控制的体内评估
使用鼠异种移植模型，对对应于克隆ID号325795和325972的抗体构建体进行肿瘤生长的临床前评估。将表达CBG99和荧光素酶的LNCaP细胞系(LNCaP-CBG99-Luc)皮下注射到NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/Szj(NSG)小鼠中，以评估VHH嵌合抗原受体(VCAR)的体内抗肿瘤功效。对于体内研究，所有CAR-T细胞均使用VCAR质粒的PiggyBac(PB)递送来产生。用LNCaP在腋下注射小鼠(n＝25，以解决LNCaP“取用”比率差的问题)，并在肿瘤建立(通过卡尺测量为100-300mm3，植入后17天)时进行治疗。将小鼠用几种剂量进行治疗，包括通过IV注射超低剂量(1x 10^6)、“应激”剂量(5x 10^6)和标准剂量(10x 10^6)的P-PSMA-101。
图5，分图A是显示在临床前评估中对于所指示抗体构建体，肿瘤进展作为CAR-T输注后天数的函数的图。通过卡尺测量完成肿瘤体积评估。与未治疗的小鼠相比，包含所指示抗体构建体(克隆ID：325795或325972)的CAR-T细胞显示出强大的肿瘤控制。例如，在第17天治疗后不久，观察到针对克隆ID号325795和325972的肿瘤体积急剧下降。相比之下，未治疗的小鼠的肿瘤体积在第17天后继续攀升，并在第49天左右达到峰值。
图5，分图B是显示对于所指示抗体构建体，在图5，分图A中所显示的图的曲线下面积(AUC)的条形图。与克隆ID号325795和325972相比，未治疗的小鼠示出显著更高的AUC。
实例6：用于CAR-T体内评估的T细胞扩增
使用实例5中描述的相同临床前评估来评估T细胞扩增。图6，分图A是显示对于所指示抗体构建体，血液中体内T细胞计数作为CAR-T输注后天数的函数的图。显示了用包含所指示抗体构建体(克隆ID：325795或325972)的CAR-T细胞治疗的小鼠的稳健P-PSMA8-101CD8+T细胞扩增。在治疗前的第7天和第14天，显示了小鼠具有低的T细胞计数。在第17天用包含所指示抗体构建体(克隆ID：325795或325972)的CAR-T细胞治疗后，与未治疗的小鼠的无变化相比，第21天观察到T细胞计数急剧增加。对于两种治疗，T细胞计数在第28天和第42天均下降。在第63天，对于两种抗体，可以观察到T细胞计数的增加。对于未治疗的小鼠，T细胞计数在研究过程中保持较低且没有变化。
图6，分图B是显示对于所指示抗体构建体，在图6，分图A中所显示的图的曲线下面积(T细胞计数总数)的条形图。与未治疗的小鼠相比，两种抗体构建体的总T细胞计数显著。
尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施例，但对于本领域的技术人员来说将显而易见，此类实施例仅作为实例提供。众多变化、改变和替代在不脱离本发明的情况下现将被本领域技术人员所想到。应理解，本文所述的本发明的实施例的各种替代方案可以用于实践本发明。意图在于，以下权利要求限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。
Claims (40)
1.一种与PSMA结合的抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)在SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列中的任一个中包含两个或更少取代的CDR1序列；和/或
(b)在SEQ ID NO:2或5的氨基酸序列中的任一个中包含两个或更少取代的CDR2序列；和/或
(c)在SEQ ID NO:3或6的氨基酸序列中的任一个中包含两个或更少取代的CDR3序列。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人框架中。
3.如权利要求1所述的抗体，其进一步包含CH1序列不存在的重链恒定区序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体，其包含：
(a)选自由SEQ ID NO:1和4组成的组的CDR1序列；和/或
(b)选自由SEQ ID NO:2和5组成的组的CDR2序列；和/或
(c)选自由SEQ ID NO:3和6组成的组的CDR3序列。
5.如权利要求4所述的抗体，其包含：
(a)选自由SEQ ID NO:1和4组成的组的CDR1序列；和
(b)选自由SEQ ID NO:2和5组成的组的CDR2序列；以及
(c)选自由SEQ ID NO:3和6组成的组的CDR3序列。
6.如权利要求5所述的抗体，其包含：
(a)SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:2的CDR2序列和SEQ ID NO:3的CDR3序列；或
(b)SEQ ID NO:4的CDR1序列、SEQ ID NO:5的CDR2序列和SEQ ID NO:6的CDR3序列。
7.如权利要求1-3中任一项所述的抗体，其包含与SEQ ID NO:7-8中任一序列具有至少95％序列同一性的重链可变区。
8.如权利要求7所述的抗体，其包含选自由SEQ ID NO:7-8组成的组的重链可变区序列。
9.如权利要求8所述的抗体，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列。
10.如权利要求8所述的抗体，其包含SEQ ID NO:8的重链可变区序列。
11.一种与PSMA结合的抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含在人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中这些CDR序列是在选自由SEQ ID NO:1-6组成的组的CDR序列中具有两个或更少取代的序列。
12.如权利要求11所述的抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含在人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中这些CDR序列选自由SEQ ID NO:1-6组成的组。
13.一种与PSMA结合的抗体，其包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)在人VH框架中的SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:2的CDR2序列和SEQ ID NO:3的CDR3序列；或
(b)在人VH框架中的SEQ ID NO:4的CDR1序列、SEQ ID NO:5的CDR2序列和SEQ ID NO:6的CDR3序列。
14.如权利要求1-13中任一项所述的抗体，其是多特异性的。
15.如权利要求14所述的抗体，其是双特异性的。
16.如权利要求15所述的抗体，其与两个不同PSMA蛋白结合。
17.如权利要求15所述的抗体，其与在同一PSMA蛋白上的两个不同表位结合。
18.如权利要求14所述的抗体，其与效应细胞结合。
19.如权利要求14所述的抗体，其与T细胞抗原结合。
20.如权利要求19所述的抗体，其与CD3结合。
21.如权利要求1至20中任一项所述的抗体，其呈CAR-T形式。
22.一种包含CAR的CAR-T细胞，该CAR包含与PSMA结合的胞外抗原结合结构域，该胞外抗原结合结构域包含重链可变区，该重链可变区包含：
(a)SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:2的CDR2序列和SEQ ID NO:3的CDR3序列；或
(b)SEQ ID NO:4的CDR1序列、SEQ ID NO:5的CDR2序列和SEQ ID NO:6的CDR3序列。
23.如权利要求22所述的CAR-T细胞，其中该与PSMA结合的胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:7-8中任一序列具有至少95％序列同一性的重链可变区。
24.如权利要求23所述的CAR-T细胞，其中该与PSMA结合的胞外抗原结合结构域包含选自由SEQ ID NO:7-8组成的组的重链可变区序列。
25.如权利要求24所述的CAR-T细胞，其中该与PSMA结合的胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列。
26.如权利要求24所述的CAR-T细胞，其中该与PSMA结合的胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:8的重链可变区序列。
27.一种药物组合物，其包含如权利要求1-21中任一项所述的抗体或如权利要求22-26中任一项所述的CAR-T细胞。
28.一种用于治疗特征在于PSMA的表达的疾患的方法，其包括向患有所述疾患的受试者施用如权利要求1-21中任一项所述的抗体、如权利要求22-26中任一项所述的CAR-T细胞或如权利要求27所述的药物组合物。
29.如权利要求28所述的方法，其中该疾患是前列腺癌。
30.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-21中任一项所述的抗体或权利要求22-26中任一项所述的CAR-T细胞的CAR。
31.一种载体，其包含如权利要求30所述的多核苷酸。
32.一种细胞，其包含如权利要求31所述的载体。
33.一种产生如权利要求1-21中任一项所述的抗体的方法，该方法包括在允许该抗体表达的条件下使如权利要求32所述的细胞生长，以及从该细胞和/或该细胞在其中生长的细胞培养基中分离该抗体。
34.一种制备如权利要求1-21中任一项所述的抗体的方法，该方法包括用PSMA对UniRat动物进行免疫，以及鉴定PSMA结合重链序列。
35.一种治疗方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的如权利要求1-21中任一项所述的抗体、如权利要求22-26中任一项所述的CAR-T细胞或如权利要求27所述的药物组合物。
36.如权利要求1-21中任一项所述的抗体或如权利要求22-26中任一项所述的CAR-T细胞在制备用于治疗有需要的个体的疾病或疾患的药物中的用途。
37.如权利要求1-21中任一项所述的抗体、如权利要求22-26中任一项所述的CAR-T细胞或权利要求27所述的药物组合物，用于在有需要的个体中的疗法中使用。
38.一种用于治疗有需要的个体的疾病或疾患的试剂盒，其包含如权利要求1-21中任一项所述的抗体、如权利要求22-26中任一项所述的CAR-T细胞或如权利要求27所述的药物组合物、以及使用说明书。
39.如权利要求38所述的试剂盒，其进一步包含至少一种另外的试剂。
40.如权利要求39所述的试剂盒，其中该至少一种另外的试剂包含化疗药物。
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