CN105873953A - 重靶向t细胞的异源二聚免疫球蛋白的产生 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了结合CD3和疾病相关抗原的新的异源二聚免疫球蛋白或其片段。这些异源二聚免疫球蛋白已经被工程化以在表达期间促进异源二聚体形成并且可以经蛋白A差异纯化技术纯化到高程度。

Description

重靶向T细胞的异源二聚免疫球蛋白的产生
技术领域
本发明涉及靶向人CD3抗原的组分和疾病相关抗原的异源二聚免疫球蛋白及其制造方法。
背景技术
在许多治疗领域中，T细胞重定向杀伤是理想的行为模式。各种双特异性抗体形式已经显示出在临床前和临床研究中介导T细胞重定向(May C et al.,(2012)Bi℃hem Pharmacol,84(9):1105-12；Frankel SR&Baeuerle PA,(2013)Curr OpinChem Biol,17(3):385-92)。所有T细胞重靶向双特异性抗体或其片段经工程化以具有至少两个抗原结合位点，其中一个位点结合靶细胞上的表面抗原以及另一个位点结合T细胞表面抗原。在T细胞表面抗原当中，来自TCR蛋白质复合体的人CD3ε亚基对于重定向T细胞杀伤一直是最有针对性的。
许多双特异性抗体形式已经用于重定向T细胞杀伤，这些主要包括基于串联的scFv片段和双抗体的形式，其中仅报道了基于Fc的双特异性抗体形式的几个实例(Moore PA et al.,(2011)Blood,117(17):4542-51；May C et al.,(2012)同上；Frankel SR&Baeuerle PA,(2013)同上)。将包括人Fc区的双特异性形式将具有较长的循环半衰期，这可导致增强的功效和/或较低频率的给药方案。在可能的基于Fc的双特异性形式当中，重定向T细胞杀伤的一个优选的形式是所谓的重链异源二聚体形式。这种形式特别令人关注，因为它不允许人CD3分子的多个拷贝聚集在T细胞表面，从而防止任何T细胞失活(Klein C et al.,(2012)MAbs,4(6):653-63)。
首先描述的用于工程化重链异源二聚体的方法是被称为“杵入臼(knob-into-hole)”的方法(PCT公开号：WO199627011；Merchant AM et al.,(1998)Nat Biotechnol,16(7):677-81)。最近已经报道了被称为FAB-臂交换方法的化学方法，其中两种抗体通过半免疫球蛋白的还原和体外重组而组合成一个双特异性抗体(PCT公开号：WO2008119353(Schuurman J等人)和WO2013060867(Gramer M等人)；Labrijn AF等人，(2013)Pr℃Natl Acad Sci USA,110(13):5145-50)。
这两种方法及其衍生物目前不足以在哺乳动物细胞宿主中产生基于Fc的双特异性抗体形式。当在哺乳动物细胞宿主中表达“杵入臼”重链异源二聚体时，同源二聚体的存在损害双特异性抗体恢复(Jackman J et al.,(2010)J Biol Chem,285(27):20850-9；Klein C等人，同上)。FAB-臂交换法及其衍生方法具有相同的缺点，增加的问题是必须首先分别产生两种“单特异性”抗体。
当通过CD3亚基的接合来开发重定向T细胞杀伤的双特异性抗体时，必不可少的是没有特异于CD3亚基的同源二聚体存在于最终的药物产品中。在靶向CD3ε亚基的情况下，微量的抗人CD3ε抗体物种(对于人CD3ε抗原是单特异性和二价的)可能在导致T细胞凋亡之前触发瞬态T细胞活化和细胞因子释放，从而干扰受控和特异性T细胞活化的目标。有效重定向T细胞杀伤的稳定和安全的基于Fc的双特异性抗体的生产在纯度和产量方面仍然是对制药工业的挑战。
因此，仍然需要一种技术能够有效地产生不包含抗人CD3同源二聚体的基于抗人CD3的重链异源二聚体，其中所分泌的双特异性抗体产物容易从来自重组哺乳动物宿主细胞系的细胞培养物上清液中分离。
基于对试剂的差异亲和性而从同源二聚体纯化重链异源二聚体的技术已被描述。已知的差异亲和性纯化技术的第一个实例涉及使用来自两种不同的动物物种的两条不同的重链，其中一条不结合亲和试剂蛋白A(Lindhofer H et al.,(1995)J Immunol.,155(1):219-225)。同一作者还描述了使用起源于两个不同的人免疫球蛋白同种型(IGHG1和IGHG3)的两条不同的重链，其中的一条不结合亲和性试剂蛋白A(IGHG3；参见US6,551,592Lindhofer H等)。最近，该技术的变型已由Davis S等人报道(PCT公开第WO 2010151792号)并且使用Jendeberg(1997)描述的两种氨基酸取代H435R和Y436F(Jendeberg L.et al.,(1997)J.Immunol.Methods,201(1):25-34)以废除其中一条异源二聚体重链对试剂蛋白A的亲和性。
本发明的优选已知的差异蛋白A亲和性纯化技术对应于这样的技术，在该技术中，所有三个物种(即两种同源二聚物种和所关注的异源二聚体)在它们的蛋白A结合位点的总数方面的区别在于至少一个位点，其中所述两种同源二聚物种中的其中一种不具有蛋白A结合位点，因此不结合蛋白A(如图1所示)。
药物稳定性是成功的药物开发的一个重要方面且基于VH3的免疫球蛋白或其片段对于生物药物产业至关重要。基于VH3亚类的治疗性抗体已被广泛开发，因为这些框架结合蛋白A并在抗体片段格式化成免疫球蛋白之前促进其测试；例如，用于抗体发现的许多合成抗体噬菌体展示库基于VH3亚类。此外，基于VH3的抗体通常由于它们相比于其它已知的重链可变域亚类的良好的表达和稳定性而被选择。
虽然与具有亲和性更强的两个位点的Fc区(Roben PW et al.,(1995)JImmunol,154(12):6437-45)相比，VH3结构域只具有一个亲和性较弱的蛋白A结合位点，但是有足够的亲和性来干扰已知的差异蛋白A亲和性纯化技术。当处理重链的异源二聚体的纯化时，其中在其Fc区工程化以不与蛋白A结合的重链包括一个基于VH3的抗原结合位点，然后通过VH3结构域恢复蛋白A结合，并且图1和以上描述的优选技术不再有用(图2A)。在这种情况下，废除基于VH3的抗原结合位点中的蛋白A结合提供了一种直接的解决方案，并允许保持所期望的异源二聚体的初始结构(图2B)。可替代地，可以重新工程化重链异源二聚体以具有位于在其Fc区中结合蛋白A的重链上的基于VH3的抗原结合位点(图2C；注意相比于Fc单体，VH3结构域具有对蛋白A的弱的亲和性，因此，所关注的异源二聚体仍然在单独的pH值下从其他同源二聚物种洗脱，通常在pH 4下，而结合蛋白A的同源二聚物种现在包括两个额外的蛋白A结合位点并在pH值≤3下洗脱)。
更重要的是，当处理重链的异源二聚体的纯化时，其中两条重链包括基于VH3的抗原结合位点，则上述的重定位策略可能仅是部分地有用(图2D和图15B)。当基于VH3的抗原结合位点中的至少一个(图2E)或两个(图2F)中的蛋白A结合废除时，基于蛋白A的差异纯化才有用。
因此，当进行包括该可变域亚类的重链的异源二聚体生产时，仍然需要废除VH3结构域内的蛋白A结合。
发明内容
本发明提供了一种新的抗人CD3双特异性抗体，其包括能够识别和结合疾病相关抗原的第二结合臂。
在本发明的上下文中，疾病相关抗原是指与病理状态例如致癌标记或一些其他代谢或免疫功能障碍的标记相关的任何抗原或表位。此外，疾病标记也涉及传染性疾病，如致病病毒或细菌。
根据本发明，抗人CD3双特异性抗体的两条结合臂中的每一条都包括免疫球蛋白恒定区，并且其中第一臂或多肽结合蛋白A且第二臂或多肽不结合蛋白A。
根据本发明，第一多肽与蛋白A的结合以及第二多肽与蛋白A的结合的缺乏并不旨在表示第二多肽可能不具有一些残留的与蛋白A的结合而是旨在表示相比于第一臂，第二多肽与蛋白A结合稍逊。
根据本发明，异源二聚免疫球蛋白或其片段的第一和第二多肽包括具有修饰的CH3区的经工程化的免疫球蛋白恒定区，所述经工程化的免疫球蛋白恒定区具有有利于异源二聚体形成超过同源二聚体形成的蛋白质-蛋白质界面。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中第一和第二多肽包括具有蛋白质-蛋白质界面的、带有修饰的CH3结构域的经工程化的免疫球蛋白恒定区，其中第一多肽的蛋白质-蛋白质界面包括从下组中选出的位置上的氨基酸取代：3，5，7，20，22，26，27，79，81，84，84.2，85.1，86，88和90(编号)，并且其中第二多肽的蛋白质-蛋白质界面包括从下组中选出的位置上的氨基酸取代：3，5，7，20，22，26，27，79，81，84，84.2，84.4，85.1，86，88和90(编号)。
优选地，其中第二多肽的蛋白质-蛋白质界面包括在84.4位置上的氨基酸取代和从下组中选出的位置上的至少一个另外的取代：3，5，7，20，22，26，27，79，81，84，84.2，85.1，86，88和90(编号)。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中第一和第二多肽包括具有蛋白质-蛋白质界面的、带有修饰的CH3结构域的经工程化的免疫球蛋白恒定区，其中第一多肽的蛋白质-蛋白质界面包括位置88上的和从下组中选出的位置上的氨基酸取代：3，5，7，20，22，26，27，79，81，84，84.2，85.1，86和90(编号)，并且其中第二多肽的蛋白质-蛋白质界面包括位置85.1和/或86上的，和从下组中选出的位置上的氨基酸取代：3，5，7，20，22，26，27，79，81，84，84.2，84.4，88和90(编号)。
根据本发明的进一步的方面，第一多肽的表位结合区结合CD3蛋白复合体且第二多肽的表位结合区结合疾病相关抗原或其中第一多肽的表位结合区结合疾病相关抗原且第二多肽的表位结合区结合CD3蛋白复合体；以及
其中结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：194的重链CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO：195的重链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：196的重链CDR3，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO：197的轻链CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO：198的轻链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：199的轻链CDR3；或者
其中结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：200的重链CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO：201的重链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：202的CDR3重链以及包含氨基酸序列SEQ ID NO：203的轻链CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO：204的轻链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：205的轻链CDR3；或者
其中结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：352的重链CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO：353的重链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：354的重链CDR3，以及包含氨基酸序列SEQ ID NO：355的轻链CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO：356的轻链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：357的轻链CDR3。
这些新的抗人CD3双特异性抗体的使用并不限定于，而是包括各种人癌症和自身免疫和炎性疾病的治疗。相对于健康细胞和组织，特异性破坏癌细胞代表肿瘤学的首要目标。可以针对肿瘤相关的细胞表面抗原安全地重定向T细胞杀伤的疗法可以提供更好的临床疗效。在肿瘤学上具有临床未满足需求的已知领域包括但不限于：乳腺癌，转移性乳腺癌，卵巢癌，胰腺癌，肺癌，淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在治疗自身免疫和炎性疾病如牛皮癣，多发性硬化和糖尿病方面，致病性T细胞的消除可能会比抑制T细胞分化更有利。
疾病相关抗原的优选集合来自基因产物CD33，TROP2，CD105，GD2，GD3，CEA，VEGFR1，VEGFR2，NCAM，CD133，CD123，ADAM17，MCSP，PSCA，FOLR1，CD19，CD20，CD38，EpCAM，HER2，EGFR，PSMA，IgE，整合素a4b1，CCR5，LewisY，FAP，MUC-1，Wue-1，MSP，EGFRvIII，P糖蛋白，AFP，ALK，BAGE蛋白，CD30，CD40，CTLA4，ErbB3，ErbB4，间皮素，OX40，CA125，CAIX，CD66e，cMet，EphA2，HGF/SF，MUC1，磷脂酰丝氨酸，TAG-72，TPBG，β-连环蛋白，brc-abl，BRCA1，BORIS，CA9，半胱天冬酶-8，CDK4，细胞周期素B1，CYP1B1，ETV6-AML，Fra-1，FOLR1，GAGE-1，GAGE-2，GloboH，磷脂酰肌醇聚糖-3，GM3，gp100，HLA/B-raf，HLA/K-ras，HLA/MAGE-A3，hTERT，LMP2，MAGE1，MAGE2，MAGE3，MAGE4，MAGE6，MAGE12，MART-1，ML-IAP，Muc2，Muc3，Muc4，Muc5，Muc16，MUM1，NA17，NY-BR1，NY-BR62，NY-BR-85，NY-ESO1，p15，p53，PAP PAX3PAX5，PCTA-1，PLAC1，PRLR，PRAME，RAGE蛋白，Ras，RGS5，Rho，SART-1，SART-3，Steap-1，Steap-2，生存素，TAG-72，TGF-β，TMPRSS2，Tn，TRP-1，TRP-2，酪氨酸酶，尿路上皮特异蛋白-3(uroplakin-3)。
根据本发明的异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中结合疾病相关抗原的表位结合区包括分别从下组选出的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列以及轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列：
ⅰ)SEQ ID NO：206-211；
ⅱ)SEQ ID NO：212-217；
ⅲ)SEQ ID NO：218-223；
ⅳ)SEQ ID NO：224-229；
ⅴ)SEQ ID NO：230-235；
ⅵ)SEQ ID NO：236-241；
ⅶ)SEQ ID NO：242-247；
ⅷ)SEQ ID NO：248-253；
ix)SEQ ID NO：254-259；
x)SEQ ID NO：260-265；
xi)SEQ ID NO：266-271；和
ⅹⅱ)SEQ ID NO：272-277；
根据本发明的另一个方面，异源二聚免疫球蛋白或其片段的第二多肽的恒定区包括IgG3CH3区。
根据本发明的另一个方面，异源二聚免疫球蛋白或其片段的第二多肽的恒定区，包括CH3区而不是来自IgG的CH3区，且非IgG3CH3区包括至少一个取代，以便减少/废除蛋白A结合。
根据本发明的另一个方面，异源二聚免疫球蛋白或其片段的第二多肽的表位结合区包括VH3区，其包括减少蛋白A结合的至少一个修饰。
本发明人已经表明，基于VH3的抗原结合位点可以容易地产生，并在单个蛋白A色谱步骤中纯化为具有高纯度。除了其易于产生，这些抗体相对于现有疗法可表现出更高的功效。
本发明还提供用于从重组哺乳动物宿主细胞系生产具有至少一个基于VH3的抗原结合位点的抗人CD3双特异性重链异源二聚体的方法，其中在单个蛋白A色谱步骤之后所述双特异性抗体产物容易地以高纯度分离。
特别地，修饰的VH3区域包括从下组中选出的氨基酸取代：57，65，81，82a和组合19/57/59(Kabat编号)，甚至更优选其中修饰的VH3区包括从下组中选出的氨基酸取代：57A，57E，65S，81E，82aS和组合19G/57A/59A(Kabat编号)。
根据本发明的另一个方面，异源二聚免疫球蛋白或其片段，可以包括进一步的取代，其中重链可变框架区包括从下组中选出的氨基酸取代：I34M，V48I，A49G，R58N/Y，I69L，A71T和T73K(Kabat编号)且轻链可变框架区包括从下组中选出的氨基酸取代：M4L，V33M，A34N，L46R，L47W，T51A，R66G，F71Y及P96F(Kabat编号)；或其中重链可变框架区包括氨基酸取代I34M，A49G和A71T(Kabat编号)且轻链可变框架区包括氨基酸取代M4L，L46R，L47W和F71Y(Kabat编号)。
在进一步的实施方案中，结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括是人VH3亚类的产物或衍生自人VH3亚类的重链可变框架区。优选地，重链可变框架区是人IGHV3-23的产物或衍生自人IGHV3-23。更优选地，重链可变框架区是人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)。重链可变框架区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：60的相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。
在一个优选的实施方案中，结合CD3蛋白复合体的第一多肽的表位结合区包括是人VK1亚类或人VK3亚类的产物或衍生自人VK1亚类或人VK3亚类的轻链可变框架区。优选地，轻链可变框架区是人VK1-39或VK3-20的产物或衍生自人VK1-39或VK3-20。更优选地，轻链可变框架区是人IGKV1-39*01(SEQID NO：23)或IGKV3-20*01(SEQ ID NO：24)的产物或衍生自人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)或IGKV3-20*01(SEQ ID NO：24)。轻链可变框架区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：61的相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。
在一个优选的实施方案中，结合到CD3蛋白复合体的表位结合区包括人源化重链可变域和人源化轻链可变域，所述人源化重链可变域具有从下组中选出的回复突变：I34M，V48I，A49G，R58N/Y，I69L，A71T和T73K(Kabat编号)，并且所述人源化轻链可变域具有从下组中选出的回复突变：M4L，V33M，A34N，L46R，L47W，R66G，F71Y及P96F(Kabat编号)。更优选地，结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括具有回复突变I34M，A49G和A71T(Kabat编号)的人源化重链可变域以及具有回复突变M4L，L46R，L47W和F71Y(Kabat编号)的人源化轻链可变域。
根据本发明的另一个方面，结合异源二聚免疫球蛋白或其片段的CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：48的重链可变区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO：51的轻链可变区；或者
其中结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：49的重链可变区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO：51的轻链可变区；或者
其中结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：358的重链可变区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO：51的轻链可变区；或者
其中结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：101的重链可变区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO：105的轻链可变区；或者
其中结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：103的重链可变区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO：106的轻链可变区；或者
其中结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：104的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO：106的轻链可变区。
CD3蛋白复合体包括多个亚基，例如，δ，ε和γ。在一个优选的实施方案中，结合到CD3蛋白复合体的表位结合区结合到CD3ε亚基。
如本文所述的表位结合区包括一个或多个重链可变域和一个或多个互补的轻链可变域的组合，其一起形成结合位点，这允许异源二聚免疫球蛋白或其片段特异性结合到一个或多个表位。在本发明的一个实施方案中，第一多肽的表位结合区包括FAB且第二多肽的表位结合区包括scFv。可选地，第一多肽的表位结合区包括scFv且第二多肽的表位结合区包括FAB。
在一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合HER2。表位结合区包括重链可变框架区和轻链可变框架区，所述重链可变框架区是人VH3亚类，优选人VH3-23，更优选人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自它们，所述轻链可变框架区是人VK1亚类，优选人VK1-39，更优选人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)的产物或衍生自它们。
在一个优选的实施方案中，结合疾病相关抗原HER2的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：20的重链可变域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变域。在进一步优选的实施方案中，结合HER2的表位结合区可包括通过G4S连接子连接的重链可变域和轻链可变域，从而形成包含氨基酸序列SEQID NO：107的scFv片段。优选地，scFv片段的可变域包括废除与蛋白A的结合的修饰，其中，氨基酸取代是65S(Kabat编号)，并且其中scFv片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：109或其中氨基酸取代是82aS(Kabat编号)，并且其中scFv片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：111。
特别地，其中结合臂包括由SEQ ID NO：20编码的重链可变区和由SEQ ID NO：21编码的轻链可变区。
在另一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合CD38。表位结合区包括是人VH3亚类，优选人VH3-23，更优选人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自它们的重链可变框架区。重链可变框架区包括来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：112或114或122的相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。表位结合区进一步包括是人VK1亚类，优选人VK1-39，更优选人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)的产物或衍生自它们的轻链可变框架区。轻链可变框架区包括来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：113或115或123的相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。
特别地，CD38结合多肽包括由SEQ ID NO：116/117，129/130，133/134和135/136编码的可变重链结构域和可变轻链结构域对。
在一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合OX40。表位结合区包括是人VH3亚类，优选人VH3-23，更优选人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自它们的重链可变框架区。重链可变框架区包括来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：139的相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。表位结合区进一步包括是人VK1亚类，优选人VK1-39，更优选人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)的产物或衍生自它们的轻链可变框架区。轻链可变框架区包括来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：140的相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。
最优选地，人源化重链可变域包括废除与蛋白A的结合的修饰，所述修饰包括取代G65S或取代N82aS(Kabat编号)。
特别地，OX40结合多肽包括由SEQ ID NO：141/142,278/280和279/281编码的可变重链结构域和可变轻链结构域对。
在一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合CD19。表位结合区包括是人VH3亚类，优选人VH3-23，更优选人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自它们的重链可变框架区，并最优选包括氨基酸序列SEQ IDNO：296。表位结合区还包括是人VK1亚类，优选人VK1-39，更优选人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)的产物或衍生自它们的轻链可变框架区，并最优选包括氨基酸序列SEQ ID NO：297。在优选的实施方案中，重链可变域包括废除与蛋白A结合的修饰，所述修饰包括取代G65S或取代N82aS(Kabat的编号)。
特别地，CD19结合多肽包括由SEQ ID NO：296/297编码的可变重链结构域和可变轻链结构域对。
在一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合CD20。表位结合区包括是人VH3亚类，优选人VH3-23，更优选人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自它们的重链可变框架区。重链可变框架区包括来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：143的相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。表位结合区进一步包括是人VK1亚类，优选人VK1-39，更优选人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)的产物或衍生自它们的轻链可变框架区。轻链可变框架区包括来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：144的相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。
最优选地，人源化重链可变域包括废除与蛋白A结合的修饰，所述修饰包括取代G65S或取代N82aS(Kabat编号)。
特别地，EGFR结合多肽包括由SEQ ID NO：143/144,282/284,283/285编码的可变重链结构域和可变轻链结构域对。
在一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合EGFR。表位结合区包括是人VH3亚类，优选人VH3-23，更优选人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自它们的重链可变框架区。重链可变框架区包括来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：145的相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。表位结合区进一步包括是人VK1亚类，优选人VK1-39，更优选人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)的产物或衍生自它们的轻链可变框架区。轻链可变框架区包括来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：146的相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。
最优选地，人源化重链可变域包括废除与蛋白A结合的修饰，所述修饰包括取代G65S或取代N82aS(Kabat编号)。
特别地，CD20结合多肽包括由SEQ ID NO：145/146，286/288，287/289，290/291，292/294编码的可变重链结构域和可变轻链结构域对。
在一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合IgE。表位结合区包括是人VH3亚类，优选人VH3-23，更优选人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自它们的重链可变框架区。重链可变框架区包括来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：298的相应人源化抗体或包含氨基酸序列SEQ ID NO：304的相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。表位结合区还包括是人VK1亚类，优选人VK1-39，更优选人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)产物或衍生自它们的轻链可变框架区。轻链可变框架区包括来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：299的相应人源化抗体或包含氨基酸序列SEQ ID NO：305的相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。
最优选地，重链可变域包括废除与蛋白A结合的修饰，所述修饰包括取代G65S或取代N82aS(Kabat编号)。
特别地，IgE结合多肽包括由SEQ ID NO：298/299，300/302，301/303，304/305，306/308，307/309编码的可变重链结构域和可变轻链结构域对。
已发现抗CD3抗体通过直接和间接的机制来触发毒性。间接机制通过与Fc受体表达免疫细胞作用的CD3抗体的Fc区介导并导致瞬态T细胞活化和细胞因子释放。因此，为了提高如本文所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段的安全性，第一和/或第二多肽的免疫球蛋白恒定区与效应子免疫细胞和/或补体C1q的结合减少或不结合。优选地，所述免疫球蛋白恒定区经工程化以废除较低铰链区中的Fc受体结合。更优选地，第一和/或第二多肽的免疫球蛋白恒定区包括取代L234A和/或L235A(EU编号)。最优选地，第一和/或第二多肽的免疫球蛋白恒定区包括取代L234A和L235A(EU编号)。
在另一个方面，本发明的公开内容还描述了一种异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中所述表位结合区结合CD3蛋白复合体的CD3ε亚基并包括FAB，所述FAB的FAB热稳定性优于包括氨基酸序列为SEQ ID NO：25的重链可变域和氨基酸序列为SEQ ID NO：26的轻链可变域的OKT3嵌合体的FAB热稳定性，如通过差示扫描量热法(DSC)测得的，如图9所示。
在进一步的方面，本发明提供了如本文所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中一个表位结合区结合CD3蛋白复合体的CD3ε亚基以及结合疾病相关抗原的其它表位结合区结合HER2。可以使用流式细胞术(RDL-FACS)或基于比色的方法(RDL-MTS)在体外测定中在表达HER2的细胞系如JIMT-1，BT-474和MDA-MB-231上测量这种异源二聚免疫球蛋白或其片段重定向T细胞杀伤的效力，如实施例中所述。
在一个实施方案中，结合CD3ε和HER2的异源二聚免疫球蛋白或其片段以21pM或更小的效力杀伤JIMT-1细胞。可选择地，该异源二聚免疫球蛋白或其片段也以2pM或更小的效力杀伤BT-474细胞。此外，该异源二聚免疫球蛋白或其片段也以0.2nM或更小的效力杀伤MDA-MB-231细胞。在用人PBMC实施的RDL测定中以10：1的效应子：靶细胞比例测定所有细胞系的细胞毒性超过48小时。此外，该异源二聚免疫球蛋白或其片段显示了有效的抗肿瘤作用，其中在体内在JIMT-1/PBMC异种移植模型中测试。优选地，异源二聚免疫球蛋白或其片段以0.05mg/kg在JIMT-1细胞异种移植物中杀伤JIMT-1细胞。
在一个优选的实施方案中，本发明提供一种异源二聚免疫球蛋白或其片段，其结合：
i)CD3蛋白复合体和HER2，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：159和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：47的轻链并结合CD3ε，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：160并结合HER2；
ii)CD3蛋白复合体和HER2，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：161和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：3的同源轻链并结合HER2，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：162并结合CD3ε；
iii)CD3蛋白复合体和HER2，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：163和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：47的轻链并结合CD3ε，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：164和结合HER2；
iv)CD3蛋白复合体和HER2，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：165和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：166的轻链并结合CD3ε，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：167并结合HER2；
ⅴ)CD3蛋白复合体和HER2，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：168和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：89的轻链并结合CD3ε，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：167并结合HER2；
ⅵ)CD3蛋白复合体和CD38，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：169和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：119的同源轻链并结合CD38，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：162并结合CD3ε；
vii)CD3蛋白复合体和CD38，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：170和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：138的同源轻链并结合CD38，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：171并结合CD3ε；
ⅷ)CD3蛋白复合体和CD38，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：176和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：119的同源轻链并结合CD38，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：177并结合CD3ε；
ⅸ)CD3蛋白复合体和CD38，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：178和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：128的同源轻链并结合CD38，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：179并结合CD3ε；
x)CD3蛋白复合体和OX40，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：172和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：173的同源轻链并结合OX40，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：162并结合CD3ε；
ⅹⅰ)CD3蛋白复合体和EGFR，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：174和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：175的同源轻链并结合EGFR，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：171并结合CD3ε；
ⅹⅱ)CD3蛋白复合体和CD20，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：180和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：181的同源轻链并结合CD20，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：177并结合CD3ε。
在进一步的实施方案中，本发明提供异源二聚免疫球蛋白或其片段，其结合：
CD3蛋白复合体和HER2，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：310和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：3的轻链并结合HER2，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和CD38，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：312和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：132的轻链并结合CD38，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和CD38，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：313和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：138的轻链并结合CD38，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和OX40，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：314和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：315的轻链并结合OX40，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和OX40，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：316和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：317的轻链并结合OX40，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和CD20，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：318和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：319的轻链并结合CD20，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和CD20，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：320和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：321的轻链并结合CD20，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和EGFR，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：322和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：323的轻链并结合EGFR，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和EGFR，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：324和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：325的轻链并结合EGFR，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和EGFR，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：326和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：327的轻链并结合EGFR，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和EGFR，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：328和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：329的轻链并结合EGFR，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和CD19，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：330和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：331的轻链并结合CD19，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和IgE，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：332和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：333的轻链并结合IgE，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和IgE，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：334和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：335的轻链并结合IgE，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和IgE，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：336和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：337的轻链并结合IgE，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和IgE，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：338和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：339的轻链并结合IgE，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和OX40，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：340和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：173的轻链并结合OX40，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和CD20，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：341和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：181的轻链并结合CD20，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和EGFR，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：342和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：175的轻链并结合EGFR，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和EGFR，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：343和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：344的轻链并结合EGFR，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和IgE，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：345和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：346的轻链并结合IgE，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε；
CD3蛋白复合体和IgE，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：347和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：348的轻链并结合IgE，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：311并结合CD3ε。
根据本发明的进一步的方面，一种异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中所述CD3结合多肽包括从下组中选出的重链和轻链可变区中的至少一种或它们的组合：SEQ ID NO：48/51，49/51，101/105，103/106，104/106，358/51，并且其中所述疾病相关抗原结合多肽包括从下组中选出的重链和轻链可变区中的至少一种或它们的组合：SEQ ID NO：20/21，116/117，129/130，133/134，135/136，139/140,141/142，278/280，279/281，143/144，282/284，283/285，296/297，145/146，286/288，287/289，290/291，292/294，293/295，298/299，300/302，301/303，304/305，306/308，307/309。
如以上关于双特异性抗体产生所讨论的，有必要有效地产生不包含抗人CD3同源二聚体的基于抗人CD3的重链异源二聚体，其中所分泌的双特异性抗体产物容易从来自重组哺乳动物宿主细胞系的细胞培养物上清液中分离。为此，基于蛋白A的差异纯化技术可用于分离包括VH3的可变域亚类的异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中，废除在至少一个但优选两个基于VH3的表位结合区中的蛋白A结合位点。因此，在另一个方面，本发明提供了用于生产如本文所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段的体外方法，包括以下步骤：
ia)制备编码第一多肽的重链的DNA载体和编码第二多肽的重链的DNA载体，其中一个或两个DNA载体或第三DNA载体任选地编码共同的轻链或组装有第一或第二多肽的重链的轻链；或者
ib)制备编码第一和第二多肽的重链的一个DNA载体，其中所述DNA载体任选地编码共同轻链或组装有第一或第二多肽的重链的轻链；以及
其中所述DNA载体适合哺乳动物宿主细胞中的瞬时或稳定表达；
ⅱ)在哺乳动物宿主细胞系中转染或共转染来自(i)的DNA载体；
ⅲ)培养转染的细胞系或从中稳定地选定的克隆并收获细胞培养物上清液；
iv)在蛋白A亲和色谱树脂上接触细胞培养物上清液；
ⅴ)洗脱并收集所关注的异源二聚免疫球蛋白。
优选地，在来自步骤(v)的纯化物质中发现的异源二聚免疫球蛋白或其片段为至少95％纯。更优选地，在来自步骤(v)的纯化物质中发现的异源二聚免疫球蛋白或其片段为至少96％纯。甚至更优选地，在来自步骤(v)的纯化物质中发现的异源二聚免疫球蛋白或其片段为至少97％。可通过毛细管电泳测定在纯化物质中发现的异源二聚免疫球蛋白或其片段的纯度。
根据本发明的另一个方面，提供了一种多肽，其包括从下组中选出的至少一个CDR：SEQ ID NO：224-229，230-235和352-357；或从下组中选出的重链可变域和轻链可变域对的组合：SEQ ID NO：122/123，124/125，129/130，135/136，133/134 104/106；或从下组中选出的重和轻链序列对：126/127or 128，131/132，137/138，359/360。
附图说明
图1：优选的使用蛋白A的差异亲和纯化技术的示意图。重链都不包括基于VH3的抗原结合位点。图注：[(A+)]是指功能性蛋白A结合位点且[(A-)]是指非功能性蛋白A结合位点。示出了洗脱的pH值。
图2A-F：表示在使用差异蛋白A色谱法纯化包括一个或多个VH3结构域的重链的异源二聚体时所面临的问题的示意图。示出了以突变异源二聚体的至少一个VH3结构域内的蛋白A结合位点为基础的解决方案的实例。图2A：当重链的异源二聚体包括在其Fc区不与蛋白A结合的重链内的VH3结构域时所面临的问题。图2B：在图2A中描述的纯化问题的解决方案，在其Fc区不结合蛋白A的异源二聚体的重链包括已经突变以废除其蛋白A结合位点的VH3结构域。图2C：图2A中描述的问题的替代解决方案，异源二聚体仅包括一个VH3结构域且所述异源二聚体经工程化以使其VH3结构域位于在其Fc区结合蛋白A的重链上(VH3结构域重定位策略作为解决方案)。图2D：当异源二聚体的两条重链都包括VH3结构域时所面临的问题。图2E：图2D中描述的纯化问题的解决方案，在其Fc区不结合蛋白A的异源二聚体的重链包括已经突变以废除其蛋白A结合位点的VH3结构域。图2F：图2D中描述的纯化问题的替代解决方案，每个VH3结构域使其蛋白A结合位点废除。框起来的物种表示这些物种在差异蛋白A色谱过程中共同洗脱。pH值A和B的差别为约1个pH单位并允许结合蛋白A的物种的有效分离。通常，pH A和pH B的pH值分别为4和3。所有附图的图注：[(A+)]是指功能性蛋白A结合位点且[(A-)]是指非功能性蛋白A结合位点。
图3：Fc 133的蛋白A梯度模式色谱踪迹(HiTrapTM MabSelect SuReTM蛋白A柱)。280nm下的吸光度相对于流动相的总体积的曲线显示为实线。流动相pH和存在于流动相中的洗脱缓冲液(B)的百分比的曲线分别显示为虚线和点划线。
图4A-C：蛋白A梯度模式色谱踪迹。280nm下的吸光度相对于流动相的总体积的曲线显示为实线。流动相pH和存在于流动相中的洗脱缓冲液(B)的百分比的曲线分别显示为虚线和点划线。图4A：抗HER2FAB-Fc 133(HiTrapTMMabSelect SuReTM蛋白A柱)。图4B：抗-HER2scFv-Fc 133(HiTrapTM MabSelectSuReTM蛋白A柱)。图4C：抗HER2FAB(HiTrapTM MabSelect SuReTM蛋白A柱和HiTrapTM MabSelectTM蛋白A柱)。
图5：七种已知的人VH框架亚类中的每一种的代表性氨基酸序列。根据Kabat编号排列序列。以粗体显示与蛋白A的结构域D交互的人VH3-23框架亚类中的位置。
图6A-I：蛋白A梯度模式色谱踪迹(HiTrapTM MabSelectTM蛋白A柱)。280nm下的吸光度相对于流动相的总体积的曲线显示为实线。流动相pH和存在于流动相中的洗脱缓冲液(B)的百分比的曲线分别显示为虚线和点划线。图6A：抗HER2FAB。图6B：抗HER2FAB T57A。图6C：抗HER2FAB T57E。图6D：抗HER2FAB G65S。图6E：抗HER2FAB R66Q。图6F：抗HER2FAB T68V。图6G：抗HER2FAB Q81E。图6H：抗HER2FAB N82aS。图6I：抗HER2FABR19G/T57A/Y59A。
图7：HER2抗原的经选择的抗HER2FAB变体的平衡解离常数(KD)。
图8A-D：蛋白A梯度模式色谱踪迹(HiTrapTM MabSelect SuReTM蛋白A柱)。280nm下的吸光度相对于流动相的总体积的曲线显示为实线。流动相pH和存在于流动相中的洗脱缓冲液(B)的百分比的曲线分别显示为虚线和点划线。图8A：抗HER2scFv(G65S)-Fc 133。图8B：抗HER2scFv(N82aS)-Fc 133。图8C：抗HER2FAB(G65S)-Fc 133。图8D：抗HER2FAB(N82aS)-Fc 133。
图9A-F：这些附图都与稳定的人框架上的OKT3人源化有关。图9A-C：格式化为人IgG1抗体的人源化候选物的汇总。与嵌合型OKT3抗体有关的HPB-ALL染色：(-)表示没有结合，(+)弱的结合，(++)中度结合和(+++)相似的结合。图9D：候选物的选定抗体的DSC曲线。图9E：格式化为scFv-Fc融合的人源化候选物的汇总。与嵌合型OKT3抗体有关的HPB-ALL染色：(-)表示没有结合，(+)弱的结合，(++)中度结合和(+++)相似的结合。图9F：选定的scFv-Fc候选物的DSC曲线。
图10A-B：这些附图都与稳定的人框架上的SP34人源化有关。图10A：格式化为人IgG1抗体的人源化候选物的汇总。图10B：格式化为scFv-Fc融合蛋白的人源化候选物的汇总(人IgG1同种型的Fc)。与用于人和食蟹猴CD3ε1-26_Fc融合蛋白的嵌合SP34抗体有关的SPR数据：(-)表示没有结合，(+)弱的结合，(++)中度结合，强但不类似的结合(+++)和(++++)相似的结合。
图11A-J：这些附图都涉及抗人CD38抗体。
图11A：通过SPR测量的嵌合HB-7抗体和人CD38抗原之间的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价结合蛋白G并且捕获200RU的嵌合HB-7抗体。在HBS-P中以30μl/min的流速以125，31，7.8，3.9，1.9，1和0.5nM注射人CD38蛋白(具有聚组氨酸标签的人CD38胞外结构域)。图11B：通过SPR测量的人源化HB-7最佳拟合抗体和人CD38抗原之间的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价结合蛋白G并捕获200RU的人源化HB-7最佳拟合抗体。在HBS-P中以30μl/min的流速以50，25，12.5，6.25和0.39nM注射人CD38蛋白(具有聚组氨酸标签的人CD38胞外结构域)。图11C：通过SPR测量的人源化9G7最佳拟合抗体和人CD38抗原之间的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价结合蛋白G并捕获200RU的人源化9G7最佳拟合抗体。在HBS-P中以30μl/min的流速以25，12.5，6.25，3.12，1.56，0.78,0.39，0.19和0.1nM注射人CD38蛋白(具有聚组氨酸标签的人CD38胞外结构域)。图11D：通过SPR测量的人源化9G7最佳框架抗体和人CD38抗原之间的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价结合蛋白G并捕获200RU的人源化9G7最佳框架抗体。在HBS-P中以30μl/min的流速以50，25，12.5，6.25，3.12，1.56，0.78,0.39，0.19和0.1nM注射人CD38蛋白(具有聚组氨酸标签的人CD38胞外结构域)。图11E：通过SPR测量的人767抗体和人CD38抗原之间的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价结合蛋白G并捕获200RU的人767抗体。在HBS-P中以30μl/min的流速以500，250，125，62.5，31.25和15.6nM注射人CD38蛋白(具有聚组氨酸标签的人CD38胞外结构域)。根据下列等式从平衡反应(Req)对分析物浓度(C)的曲线图得到亲和性：Req＝KA*C*Rmax/(KA*C*n+1)，50％饱和时的浓度为KD。所有的SPR数据表示为响应单位数(缩写为RU；Y轴)对时间(X轴)。图11F：嵌合HB-7和人源化HB-7最佳拟合抗体的DSC曲线。图11G：嵌合9G7和人源化9G7最佳拟合抗体的DSC曲线。图11H：人源化9G7最佳框架抗体的DSC曲线。图11I：人克隆767抗体的DSC曲线。图11J：9G7人源化抗体的汇总表。
图12A-C：其他形式的BEAT HER2/CD3抗体的示意图。图12A：BEATHER2/CD3-1(形式A)和BEAT HER2/CD3-2(形式B)抗体。图12B：BEAT HER2/CD3-3(形式C)和BEAT HER2/CD3(SP34)(形式D)的抗体。图12C：BEATHER2/CD3(SP34-κ1)(形式E)抗体。图注：[(A+)]是指功能性蛋白A结合位点。[(A-)]是指非功能性蛋白A结合位点。
图13：BEAT HER2/CD3-1抗体的蛋白A纯化曲线(在280nm处的吸收踪迹)。柱：1ml的MabSelect SuRe。流速：1ml/min。运行缓冲液：0.2M NaH2PO4pH 6。洗脱缓冲液1号：20mM醋酸钠pH 4(20ml)。洗脱缓冲液2号：0.1M甘氨酸pH 3(20ml)。中和：1/10体积的1M Tris pH 8。
图14：BEAT HER2/CD3-1抗体制剂的毛细管电泳曲线。
图15A：N82aS取代的BEAT HER2/CD3-1抗体的SDS-PAGE分析。图15B：N82aS不取代的BEAT HER2/CD3-1抗体变体的SDS-PAGE分析。图注：[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点以及[(A-)]表示非功能性蛋白A结合位点。指示出洗脱的pH值。
图16A：通过SPR测量的BEAT HER2/CD3-1抗体和人CD38ε抗原之间的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价结合7400RU的人CD3γ-ε-Fc融合蛋白。在HBS-P中以10μl/min的流速以5000，2500，1250，625，312.5和156.25nM注射BEAT HER2/CD3-1抗体。数据表示为响应单位数(缩写为RU；Y轴)对时间(X轴)。根据下列等式从平衡反应(Req)对分析物浓度(C)的曲线图得到亲和性：Req＝KA*C*Rmax/(KA*C*n+1)，50％饱和时的浓度为KD。图16B：通过SPR测量的BEAT HER2/CD3-1抗体和人HER2抗原之间的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价结合蛋白G并捕获150RU的BEAT HER2/CD3-1抗体。在HBS-P中以30μl/min的流速以1000，333，111，37，12，4.1，1.4，0.5和0.15nM注射HER2-his。数据表示为响应单位数(缩写为RU；Y轴)对时间(X轴)。图16C：BEAT HER2/CD3-1和-2抗体的DSC曲线分别在曲线A和B中显示。
图17A-G：由BEAT HER2/CD3抗体介导的T细胞重定向杀伤的实例。读数：RDL-MTS方法。效应细胞：人PBMC。10:1的效应细胞与靶细胞比。培养48h的三个供体的平均值。以nM表示抗体浓度。图17A：BEAT HER2/CD3-1和BEAT HER2/CD3-2抗体，靶细胞：BT-474。图17B：BEAT HER2/CD3-1和BEAT HER2/CD3-2抗体，靶细胞：JIMT-1。图17C：BEAT HER2/CD3-1和BEATHER2/CD3-2抗体，靶细胞：MDA-MB-231。图17D：BEAT HER2/CD3(SP34)抗体，靶细胞：NCI-N87。图17E：BEAT HER2/CD3(SP34)抗体，靶细胞：HT-1080。图17F：BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体，靶细胞：NCI-N87。图17G：BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体，靶细胞：HT-1080。
图18A-C：具有人PBMC增补的JIMT-1异种移植物。图18A：人PBMC不干扰肿瘤生长。图18B-C：BEAT HER2/CD3-1处理和非处理的小鼠，四个人PBMC供体，五只小鼠群的肿瘤体积(mm3)。
图19：BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3(形式A)和BEATCD38-767/CD3(形式B)抗体的示意图。[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点以及[(A-)]表示非功能性蛋白A结合位点。
图20A：通过SPR测量的BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3抗体和人CD38抗原之间的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价结合蛋白G并捕获200RU的BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3抗体。在HBS-P中以30μl/min的流速以50，25，12.5，6.25和0.39nM注射人CD38蛋白(具有聚组氨酸标签的蛋白)。数据表示为响应单位数(缩写为RU；Y轴)对时间(X轴)。图20B：BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3抗体DSC曲线。
图21：由BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3抗体介导的T细胞重定向杀伤的实例。读数：RDL-FACS方法。效应细胞：纯化的人T细胞。10:1的效应细胞与靶细胞比。培养48h的两个供体的平均值。靶细胞：RPMI 8226。以nM表示抗体浓度。
图22：由BEAT CD38-767/CD3(SP34)抗体介导的T细胞重定向杀伤的实例。读数：RDL-FACS方法。效应细胞：人PBMC。10:1的效应细胞与靶细胞比。培养24h的三个供体的平均值。靶细胞：Daudi。以nM表示抗体浓度。
图23：BEAT OX40/CD3抗体的示意图。图注：[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点。[(A-)]表示非功能性蛋白A结合位点。
图24：由BEAT OX40/CD3抗体介导的T细胞重定向杀伤的实例。读数：RDL-MTS方法。效应细胞：人PBMC。20:1的效应细胞与靶细胞比。培养48h的三个供体的平均值。靶细胞：重组稳定的CHO[OX40]细胞。以nM表示抗体浓度。
图25：BEAT EGFR/CD3抗体的示意图。图注：[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点。[(A-)]表示非功能性蛋白A结合位点。
图26：由BEAT EGFR/CD3抗体介导的T细胞重定向杀伤的实例。读数：RDL-MTS方法。效应细胞：人PBMC。10:1的效应细胞与靶细胞比。培养48h的四个供体的平均值。靶细胞：HT-29细胞。以nM表示抗体浓度。
图27：BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3(SP34)(形式A)和BEAT CD38-9G7最佳拟合/CD3(SP34-κ2)(形式B)抗体的示意图。[(A+)]是指功能性蛋白A结合位点。
图28：由BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3(SP34)抗体介导的T细胞重定向杀伤的实例。读数：RDL-FACS方法。效应细胞：人PBMC。10:1的效应细胞与靶细胞比。培养24h的三个供体的平均值。靶细胞：Daudi细胞。以nM表示抗体浓度。
图29：通过SPR测量的BEAT CD38-9G7最佳拟合/CD3(SP34-κ2)抗体和人CD3ε1-26_Fc融合蛋白之间的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价结合500RU的人CD3ε1-26_Fc融合蛋白。在HBS-P中以30μl/min的流速以50，25，12.5，6.2，3.1，0.8和0.4nM注射BEAT CD38-9G7最佳拟合/CD3(SP34-κ2)抗体。数据表示为响应单位数(缩写为RU；Y轴)对时间(X轴)。
图30：由BEAT CD38/CD3(SP34-κ2)抗体介导的T细胞重定向杀伤的实例。读数：RDL-FACS方法。效应细胞：人PBMC。10:1的效应细胞与靶细胞比。培养24h的三个供体的平均值。靶细胞：Daudi细胞。以nM表示抗体浓度。
图31：BEAT CD20/CD3(SP34)抗体的示意图。[(A+)]是指功能性蛋白A结合位点。
图32：由BEAT CD20/CD3(SP34)抗体介导的T细胞重定向杀伤的实例。读数：RDL-FACS方法。效应细胞：人PBMC。10:1的效应细胞与靶细胞比。培养24h的三个供体的平均值。靶细胞：Daudi细胞。以nM表示抗体浓度。
具体实施方式
本发明大体上涉及结合于CD3蛋白复合体和疾病相关抗原的新的异源二聚免疫球蛋白。此外，这些异源二聚免疫球蛋白降低或消除与蛋白A的结合，因此可以使用亲和色谱纯化至非常高的纯度。
为了解释本说明书，以下定义将适用并且只要适当，以单数使用的术语也包括复数，反之亦然。应理解，本文使用的术语仅用于描述特定的实施例，并不旨在进行限制。
术语“多肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物，其中氨基酸经由肽键组合以形成已经经由脱水合成被连接在一起的氨基酸链。多肽和蛋白质可以通过化学合成或重组表达来合成，并且不限制到最小氨基酸长度。
按照本发明，多肽组包括“蛋白”，只要该蛋白由单个多肽链组成。多肽可进一步形成多聚体，如二聚体、三聚体和更高级的低聚物，即由多于一个的多肽分子组成。形成这种二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同的或不相同的。因此，这些多聚体的相应的更高级结构被称为同源或异源二聚体，同源或异源三聚体等。异源多聚体的一个例子是抗体分子，其在其天然存在的形式中由两条相同的轻多肽链和两条相同的重多肽链组成。术语“多肽”和“蛋白”也指天然修饰的多肽/蛋白，其中所述修饰被例如翻译后修饰影响，所述翻译后修饰如糖基化、乙酰化、磷酸化等。这类修饰是本领域熟知的。此外，为了本发明，“多肽”是指包括修饰的蛋白质，所述修饰例如对天然序列的缺失、添加和替换(其可以是保守性的)。这些修饰可以是故意的，如通过定点诱变，或者可以是偶然的，如通过产生蛋白质的宿主的突变或者PCR扩增导致的错误。
如本文所用的术语“CD3复合体”指的是被称为CD3(分化群3)T细胞共受体的蛋白复合体(Wucherpfennig KW et al.,(2010)Cold Spring Harb PerspectBiol,2(4):a005140)。CD3蛋白复合体由四条不同的链组成。在哺乳动物中，该复合体包含CD3γ链，CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与被称为T细胞受体(TCR)的分子和ζ链联合来产生T淋巴细胞中的激活信号(van der Merwe PA&Dushek O(2011)Nat Rev Immunol,11(1):47-55)。TCR，ζ链和CD3分子一起包括TCR复合体。CD3γ，CD3δ和CD3ε链是包含单个细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3分子的细胞内尾部(intracellular tail)包括称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或简称为ITAM的单个保守基序，其对于TCR的信号传导能力至关重要。因为T细胞活化需要CD3，因此，靶向CD3的药物(通常是单克隆抗体)已经和正在研究作为免疫抑制剂疗法。
如本文所用的术语“疾病相关抗原”是指参与疾病过程的分子。疾病相关抗原的实例存在于广泛的治疗领域中，例如炎症，癌症和自身免疫疾病。在肿瘤学中，疾病相关抗原是可以广泛地用于患者群体内的癌症的筛选和/或监测和/或治疗靶向的分子，例如前列腺癌中的EpCAM抗原。肿瘤抗原可直接由肿瘤或非肿瘤细胞产生作为对肿瘤的存在的响应并且优选的肿瘤抗原是细胞表面分子。炎性疾病相关抗原是已知的，其包括但不限于促炎细胞因子如TNF-α和IL-1。自身免疫疾病相关抗原也是已知的；这些的实例包括但不限于针对全身性红斑狼疮中的双链DNA和阿尔茨海默病中的淀粉样β肽的抗体。
这里提及的术语“免疫球蛋白”可与术语“抗体”互换使用。免疫球蛋白包括全长抗体和任何抗原结合片段或其单链。免疫球蛋白可以是同源二聚体或异源二聚体。免疫球蛋白和特异性天然存在的抗体是作为Y形单元的一个或多个拷贝存在的，由四条多肽链组成的糖蛋白。每个“Y”形状包括两条相同的重(H)链拷贝，和两条相同的轻(L)链拷贝，通过它们的相对分子量进行命名。每条轻链与重链配对，并且每条重链与另一条重链配对。共价链间的二硫键和非共价相互作用将所述链连接在一起。免疫球蛋白和特异性天然存在的抗体包括可变区，它们是两个拷贝的抗原结合位点。木瓜蛋白酶(一种蛋白水解酶)将“Y”形状拆分成三个独立的分子，两个是所谓的“Fab”或“FAB”片段(Fab＝抗原结合片段)，以及一个是所谓的“Fc”片段或“Fc区”(Fc＝可结晶片段)。Fab片段由完整轻链和部分重链组成。该重链包括一个可变区(VH)和三个或四个恒定区(CH1，CH2，CH3和CH4，取决于抗体类别或同种型)。CH1和CH2区之间的区域称为铰链区，并允许在Y形抗体分子的两个Fab臂之间的灵活性，允许它们打开和关闭以适应与由固定的距离分隔的两个抗原决定簇的结合。如这里所指的“铰链区”是6-62个氨基酸长度的，只存在于IgA，IgD和IgG中的序列区，其包括桥接两条重链的半胱氨酸残基。IgA，IgD和IgG的重链各自具有四个区域，即，一个可变区(VH)和三个恒定区(CH1-3)。IgE和IgM在重链上具有一个可变区和四个恒定区(CH1-4)。免疫球蛋白的恒定区可以介导与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和补体系统经典途径的第一组分(C1q)。每条轻链通常通过一个共价二硫键连接到重链。每条轻链包括一个可变区(VL)和一个轻链恒定区。轻链恒定区是本文中命名为IGKC的κ轻链恒定区或本文中命名为IGLC的λ轻链恒定区。本文中使用的IGKC等同于Cκ或CK并且具有相同的含义。本文使用的IGLC等同于Cλ或CL并具有相同的含义。如本文所用的术语“IGLC区”是指所有的λ轻链恒定区，例如，是指从IGLC1，IGLC2，IGLC3，IGLC6和IGLC7组成的组中选择的所有λ轻链恒定区。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更保守的区域，称为框架区(FR或FW)。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，以下述顺序从氨基末端布置到羧基末端：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区包括与抗原相互作用的表位结合区。经工程化的免疫球蛋白可以包括不同的表位结合区形式，如scFv，FAB或dAb片段。这些片段通常通过基因融合到IgG Fc区而组装到抗体样结构中。经工程化的免疫球蛋白可以通过使用或不使用异源二聚化增强技术构建为同源或异源二聚体，并且可具有单或双特异性结合特性。
如本文所用的术语“全长抗体”包括构成抗体的天然生物学形式的结构，包括可变区和恒定区。例如，在大多数哺乳动物中，包括人和小鼠，IgG类的全长抗体为四聚体并由两个相同的两条免疫球蛋白链对组成，每对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包括免疫球蛋白区域VL和轻链恒定区，并且每条重链包括免疫球蛋白区VH，CH1(Cγ1)，CH2(Cγ2)，CH3(Cγ3)和CH4(Cγ4)，取决于抗体类别或同种型。在一些哺乳动物中，例如在骆驼和美洲驼中，IgG抗体可以仅由两条重链组成，每条重链包括连接于Fc区的可变区。
抗体被分成类，也被称为同种型，如通过恒定区从基因上确定的。人恒定轻链被分类为κ(CK)和λ(Cλ)轻链。重链被分类为mu(μ)，delta(δ)，gamma(γ)，alpha(α)或epsilon(ε)，并定义了抗体的同种型分别为IgM，IgD，IgG，IgA和IgE。因此，本文所用的“同种型”是指通过免疫球蛋白的恒定区的化学和抗原特性定义的该免疫球蛋白的任何类和/或亚类。已知的人免疫球蛋白同种型是IGHG1(IgG1)，IGHG2(IgG2)，IGHG3(IgG3)，IGHG4(IgG4)，IGHA1(IgA1)，IGHA2(IgA2)，IGHM(IgM)，IGHD(IgD)，和IGHE(IgE)。所谓的人免疫球蛋白伪伽马IGHGP基因代表了额外的人免疫球蛋白重链恒定区基因，其已经被测序，但由于改变的转换区而不编码蛋白质(Bensmana M et al.,(1988)Nucleic Acids Res,16(7):3108)。尽管具有改变的转换区域，然而人免疫球蛋白伪伽马IGHGP基因具有对所有重链恒定区(CH1-CH3)和铰链区的开放读码框。其重链恒定区的全部开放读码框编码与具有预测的结构特点的全部人免疫球蛋白恒定区匹配良好的蛋白质区。此额外的伪伽马同种型在此被称为IgGP或IGHGP。其他伪免疫球蛋白基因已被报道，例如人免疫球蛋白重链恒定区εP1和P2伪基因(IGHEP1和IGHEP2)。IgG类最常用于治疗目的。在人类中，这个类包括亚类IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。在小鼠中，该类包括亚类IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG2c和IgG3。
如本文所用的术语“免疫球蛋白片段”包括，但不限于(i)包括例如CH1，CH2或CH3区的区域，(ii)由VL，VH，CL或CK和CH1区组成的Fab片段，包括Fab'和Fab'-SH，(ii)由VH和CH1区组成的Fd片段，(iii)dAb片段(WardES et al.,(1989)Nature,341(6242):544-6)，其由单个可变区组成(ⅳ)F(ab')2片段，包括两个连接的Fab片段的二价片段(v)单链Fv片段(scFv)，其中VH区和VL区通过允许两个区域关联以形成抗原结合位点的肽连接子连接(Bird REet al.,(1988)Science,242(4877):423-6；Huston JS et al.,(1988)Pr℃Natl AcadSci U S A,85(16):5879-83)，(ⅵ)“双抗体”或“三抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(Holliger P et al.,(1993)Pr℃Natl Acad Sci U S A,90(14):6444-8；Tomlinson I&Holliger P,(2000)Methods Enzymol,326:461-79)，(ⅶ)scFv，双抗体或融合至Fc区的区域抗体和(ⅷ)融合至相同或不同的抗体的scFv。
术语“可变区”是指介导抗原结合并定义特定抗体对特定抗原的特异性的区域或结构域。在天然存在的抗体中，抗原结合位点由定义特异性的两个可变区组成：一个位于重链中，在此称为重链可变区(VH)和另一个位于轻链中，这里被称为轻链可变区(VL)。在人类中，重链可变区(VH)可分为7个亚组或亚类：VH1，VH2，VH3，VH4，VH5，VH6和VH7。在某些情况下，特异性可以完全地只驻留在两个区域中的一个中，如在骆驼科动物中发现的来自重链抗体的单结构域抗体中。V区通常为约110个氨基酸长，并且由15-30个氨基酸的、称为框架区(FR或“非CDR区”)的相对不变的氨基酸序列段组成，其被7-17个氨基酸长的称为“高变区域”的高度变异性的较短区域分隔。天然重链和轻链的可变域包括四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过三个高变区连接，其形成环路。每条链中的高变区与来自另一条链的高变区通过FR非常接近地保持在一起，促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat EA等人，同上)。如本文所用的术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区一般包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。对于所有的可变区根据Kabat(Kabat EA等人，同上)编号。
本文中使用和包括若干的CDR定义。Kabat定义基于序列变异性并且是最常用的(Kabat EA等人，同上)。而Chothia反而指结构环的位置(Chothia&LeskJ.(1987)Mol.Biol.196:901-917)。AbM定义是Kabat和Chothia定义之间的折衷并被牛津大学分子的AbM抗体建模软件(Martin ACR et al.,(1989)PNAS USA86:9268–9272；Martin ACR et al.,(1991)Methods Enzymol.203:121–153；PedersenJT et al.,(1992)Immunomethods 1:126–136；Rees AR et al.,(1996)In SternbergM.J.E.(ed.),Protein Structure Prediction。Oxford University Press,Oxford,141–172)使用。接触定义最近已经引入(MacCallum RM et al.,(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)并基于在蛋白质数据库中可获得的可用的复杂结构的分析。通过(http://www.imgt.org)的CDR的定义是根据对所有物种的所有免疫球蛋白和T细胞受体V区的IMGT编号( Lefranc MP et al.,(1999)Nucleic Acids Res.27(1):209-12；Ruiz M et al.,(2000)Nucleic Acids Res.28(1):219-21；Lefranc MP(2001)NucleicAcids Res.29(1):207-9；Lefranc MP(2003)Nucleic Acids Res.31(1):307-10；Lefranc MP et al.,(2005)Dev.Comp.Immunol.29(3):185-203；Kaas Q et al.,(2007)Briefings in Functional Genomics&Proteomics,6(4):253-64)。在本发明中提到的所有互补决定区(CDR)优选地定义如下(根据Kabat EA等人的编号，同上)：LCDR1：24-34，LCDR2：50-56，LCDR3：89-98，HCDR1：26-35，HCDR2：50-65，HCDR3：95-102。
可变域的“非CDR区”被称为框架区(FR)。如本文所用的VL区的“非CDR区”包括氨基酸序列：1-23(FR1)，35-49(FR2)，57-88(FR3)和99-107(FR4)。如本文所用的VH区的“非CDR区”包括氨基酸序列：1-25(FR1)，36-49(FR2)，66-94(FR3)和103-113(FR4)。
本发明的CDR可以包括基于前述定义的“扩展的CDR”和具有如下的可变域残基：LCDR1：24-36，LCDR2：46-56，LCDR3：89-97，HCDR1：26-35，HCDR2：47-65，HCDR3：93-102。这些扩展的CDR也根据Kabat等人(同上)编号。如本文所用的VL区的“非扩展的CDR区”包括氨基酸序列：1-23(FR1)，37-45(FR2)，57-88(FR3)和98-约107(FR4)。如本文所用的VH区的“非扩展的CDR区”包括氨基酸序列：1-25(FR1)，37-46(FR2)，66-92(FR3)和103-约113(FR4)。
如本文所用的术语“Fab”或“FAB”或“Fab区”或“FAB区”包括包含VH，CH1，VL和轻链恒定免疫球蛋白区的多肽。Fab可以指孤立的该区域，或在全长抗体或抗体片段背景下的该区域。
如本文所用的术语“Fc”或“Fc区”包括这样的多肽，其包括排除第一恒定区免疫球蛋白区的抗体重链的恒定区。从而Fc是指IgA，IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白区或者IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白区，以及到这些区域的柔性铰链N末端。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包括免疫球蛋白区Cgamma2和Cgamma3(Cγ2和Cγ3)和Cgamma1(Cγl)和Cgamma2(Cγ2)之间的铰链。尽管Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为包括至其羧基末端的残基C226或P230，其中编号依照EU索引。Fc可以指孤立的该区域或在Fc多肽(例如抗体)的背景下的该区域。
如本文所用的术语“免疫球蛋白恒定区”是指来自人或动物物种的免疫球蛋白或抗体重链恒定区并且包括所有的同种型。优选地，免疫球蛋白恒定区是人源的，并从以下组成的组中选择，但不限于：IGHG1CH1，IGHG2CH1，IGHG3CH1，IGHG4CH1，IGHA1CH1，IGHA2CH1，IGHE CH1，IGHEP1CH1，IGHMCH1，IGHD CH1，IGHGP CH1，CH2IGHG1，IGHG2CH2，CH2IGHG3，IGHG4CH2，IGHA1CH2，CH2IGHA2，IGHE CH2，IGHEP1CH2，CH2IGHM，IGHDCH2，IGHGP CH2，CH3IGHG1，IGHG2CH3，CH3IGHG3，IGHG4CH3，IGHA1CH3，CH3IGHA2，IGHE CH3，IGHEP1CH3，CH3IGHM，IGHD CH3，IGHGPCH3，IGHE CH4和IGHM CH4。优选的“免疫球蛋白恒定区”从人IGHE CH2，IGHM CH2，IGHG1CH3，IGHG2CH3，IGHG3CH3，IGHG4CH3，IGHA1CH3，IGHA2CH3，IGHE CH3，IGHM CH3，IGHD CH3和IGHGP CH3组成的组中选择。更优选的“免疫球蛋白恒定区”从人IGHG1CH3，IGHG2CH3，IGHG3CH3，IGHG4CH3，IGHA1CH3，IGHA2CH3，IGHE CH3，IGHM CH3，IGHDCH3和IGHGP CH3组成的组中选择。
术语“表位结合区”包括具有最小氨基酸序列的多肽或其片段以允许免疫球蛋白分子特异性结合到一个或多个表位。天然存在的抗体具有两个表位结合区，它们也称作抗原结合或组合位点或互补位。天然存在的抗体中的表位结合区局限在其中发现氨基酸介导的表位结合的VH和/或VL结构域的CDR区内。除了天然存在的抗体，人工VH结构域或VL结构域或它们的片段以及它们的组合可以被工程化以提供表位结合区(Holt LJ et al.,(2003)Trends Biotechnol,21(11):484-490；Polonelli L et al.,(2008)PLoS ONE,3(6):e2371)。基于非免疫球蛋白的表位结合区的例子可在用作用于工程化表位结合区(Binz HK et al.,(2005)Nat Biotechnol,23(10):1257-1268)或者模拟肽(Murali R&Greene MI(2012)Pharmaceuticals,5(2):209-235)的“支架”的人工蛋白结构域中找到。优选地，术语“表位结合区”包括一个或多个重链可变域和一个或多个互补的轻链可变域的组合，它们一起形成结合位点，所述结合位点允许免疫球蛋白分子与一个或多个表位的特异性结合。本发明中例举的表位结合区的实例包括scFv和FAB。
如本文所用，术语“表位”包括在动物中，优选在哺乳动物中，并且最优选在人类中具有抗原性或免疫原性活性的多肽或蛋白质或非蛋白分子的片段。具有免疫原活性的表位是在动物中引起抗体反应的多肽或蛋白质的片段。具有抗原活性的表位是抗体或多肽与其特异性结合的多肽或蛋白质的片段，如通过本领域的技术人员已知的任何方法确定的，例如通过免疫测定法。抗原性表位不必是免疫原性的。优选地，如本文所用的术语“表位”是指具有至少约3至5个，优选约5至10或15个，和不超过约1000个氨基酸(或之间的任何整数)的多肽序列，其本身限定了一个序列或作为更大序列的一部分，与响应于这样的序列所生成的抗体结合。该片段的长度没有严格的上限，其可以包括几乎蛋白质序列的全长，或者甚至包括一个或多个表位的融合蛋白。在本发明中使用的表位不限于具有亲本蛋白质的部分的确切序列的多肽，该多肽从亲本蛋白质衍生。因此，术语“表位”包括与天然序列相同的序列，以及对天然序列的修饰，例如缺失，添加和替换(通常是保守性的)。蛋白抗原的表位根据它们的结构以及与表位结合位点的相互作用分成两类，构象表位和线性表位(Goldsby R etal.,(2003)―Antigens(Chapter 3)”Immunology(Fifth edition ed.),New York:W.H.Freeman and Company.pp.57—75,ISBN 0-7167-4947-5)。构象表位由抗原的氨基酸序列的不连续部分组成。这些表位与基于抗原的三维表面特征和形状或三级结构的互补位相互作用。大多数表位是构象表位。与此相反，线性表位与基于它们的一级结构的互补位相互作用。线性表位由来自抗原的连续的氨基酸序列形成。
如本文所用的术语“异源二聚免疫球蛋白”或“异源二聚片段”或“异源二聚体”或“重链的异源二聚体”包括至少包括第一和第二多肽(如第一和第二区)的免疫球蛋白分子或部分，其中第二多肽的氨基酸序列与第一多肽不同。优选地，异源二聚免疫球蛋白包括两条多肽链，其中第一条链具有至少一个与第二链不相同的区域，且其中两条链组装，即通过它们的不相同的区域相互作用。更优选地，异源二聚免疫球蛋白，具有针对至少两个不同的配体、抗原或结合位点的结合特异性，即是双特异性的。如本文所用的异源二聚免疫球蛋白包括但不限于全长双特异性抗体，双特异性的Fab，双特异性的F(ab')2，融合到Fc区的双特异性的scFv，融合到Fc区的双抗体和融合到Fc区的结构域抗体。
如本文所用的术语“同源二聚免疫球蛋白”或“同源二聚片段”或“同源二聚体”或“重链的同源二聚体”包括至少包括第一和第二多肽(如第一和第二区)的免疫球蛋白分子或部分，其中第二多肽的氨基酸序列与第一多肽相同。优选地，同源二聚免疫球蛋白包括两条多肽链，其中第一条链具有至少一个与第二条链相同的区域，并且其中两条链组装，即通过它们的相同区域相互作用。优选地，同源二聚免疫球蛋白片段包括至少两个区域，其中第一区域与第二区域相同，并且其中两个区域组装，即通过它们的蛋白质-蛋白质界面相互作用。
对于在本发明中包括的所有的免疫球蛋白恒定区，可以根据(同上)编号。
对于从IGHG1，IGHG2，IGHG3，和IGHG4组成的组中选择的所有的人CH1，CH2，CH3免疫球蛋白重链恒定区，可以按照“EU编号系统”(EdelmanGM et al.,(1969)Pr℃Natl Acad Sci USA,63(1):78-85)编号。对于IGHG1的人CH1，铰链，CH2和CH3恒定区的完整对应可以在IMGT数据库(同上)中找到。
对于人κ免疫球蛋白轻链恒定区(IGKC)，可以按照“EU编号系统”(Edelman GM等人，同上)编号。对人CK区的完整的对应可以在IMGT数据库(同上)中找到。
对于人λ免疫球蛋白轻链恒定区(IGLC1，IGLC2，IGLC3，IGLC6和IGLC7)，可以根据“Kabat编号系统”(Kabat EA等人，同上)编号。人IGLC区的完整的对应可以在IMGT数据库(同上)中找到。
如本文所用的人IGHG1免疫球蛋白重链恒定区具有以下区域边界：CH1区(EU编号：118-215)，铰链γ1区(EU编号：216-230)，CH2区(EU编号：231-340)，和CH3区(EU编号：341-447)。此处所指的人CK区跨越残基108至214(EU编号)。本文所用的人IGLC1，IGLC2，IGLC3，IGLC6和IGLC7区跨越残基108-215(Kabat编号)。
如本文所使用的术语“氨基酸”或“氨基酸残基”包括天然氨基酸和非天然氨基酸。优选地天然氨基酸也包括在内。
本文中的术语“修饰”或“氨基酸修饰”包括多肽序列中的氨基酸取代，插入和/或缺失。如本文所用的术语“取代”或“氨基酸取代”或“氨基酸残基取代”是指氨基酸序列中的第一氨基酸残基被第二氨基酸残基取代，而第一氨基酸残基不同于第二氨基酸残基，即取代的氨基酸残基不同于已经被取代的氨基酸。例如，取代R94K是指一种变异多肽，其中位置94处的精氨酸替换为赖氨酸。例如94K表示位置94由赖氨酸取代。对于本文的目的，多个取代通常由斜线或逗号分开。例如，“R94K/L78V”或“R94K，L78V”是指包括取代R94K和L78V的双变体。如本文所用的“氨基酸插入”或者“插入”是指在亲本多肽序列的特定位置处添加氨基酸。例如，插入-94表示位置94处的插入。如本文所用的“氨基酸缺失”或者“缺失”是指在亲本多肽序列的特定位置处除去氨基酸。例如，R94-表示位置94处的精氨酸的缺失。
在某些实施方案中，术语“降低(decrease)”，“减少(reduce)”，或“减少(reduction)”与蛋白A的结合是指相比于亲本即未修饰的免疫球蛋白或野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG，通过标准技术公知方法(如本文描述的那些)检测出的修饰的免疫球蛋白或其片段与蛋白A的结合整体降低至少25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，97％，或99％直至100％(消除)。在某些实施方案中，这些术语可替换地可以指10倍(即1个对数)，100倍(2个对数)，1000倍(或3个对数)，10000倍(或4个对数)，或100000倍(或5个对数)的整体降低。
术语“消除(eliminate)”，“废除(abrogate)”，“消除(elimination)”或“废除(abrogation)”与蛋白A的结合指的是相比于亲本即未修饰的免疫球蛋白或野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG，通过标准技术已知方法(如本文所述的那些)检测的经修饰的免疫球蛋白或其片段与蛋白A的结合整体降低100％，即经修饰的免疫球蛋白或其片段与蛋白A的结合完全丧失。
类似地，术语“降低(decrease)”，“减少(reduce)”，或“减少(reduction)”与亲和试剂的结合是指相比于亲本即未修饰的免疫球蛋白或野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG，通过标准技术公知的方法(如本文描述的那些)检测出的修饰的免疫球蛋白或其片段与亲和试剂的结合整体降低至少25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，97％，或99％直至100％(消除)。在某些实施方案中，这些术语可替换地可以指10倍(即1个对数)，100倍(2个对数)，1000倍(或3个对数)，10000倍(或4个对数)，或100000倍(或5个对数)的整体降低。
术语“消除(eliminate)”，“废除(abrogate)”，“消除(elimination)”或“废除(abrogation)”与亲和试剂的结合指的是相比于亲本即未修饰的免疫球蛋白或野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG，通过标准技术已知的方法(如本文所述的那些)检测的经修饰的免疫球蛋白或其片段与亲和试剂的结合整体降低100％，即经修饰的免疫球蛋白或其片段与亲和试剂的结合完全丧失。
“双特异性抗体”是指对至少两种不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是相对于亲本抗体在VH区中具有一个或多个氨基酸修饰的双特异性抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体可以是人或人源化抗体。双特异性抗体还可用于将细胞毒性剂定位于表达靶抗原的细胞。这些抗体拥有靶抗原结合臂和结合细胞毒性剂，诸如，例如，皂草素，抗干扰素α，长春花生物碱，蓖麻毒蛋白A链，甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原的臂。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，重组生产双特异性抗体是基于共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein and Cuello,(1983)Nature,305:537-40)。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机组合，这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生潜在的不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确的分子的纯化是相当麻烦的，其通常通过亲和色谱法步骤进行，并且产物产量低。类似的程序在WO 1993/08829及Traunecker et al.,(1991)EMBO J,10:3655-9中公开。根据不同的方法，具有期望的结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)被融合到免疫球蛋白恒定区序列。例如，融合是与免疫球蛋白重链恒定区，其包括至少部分铰链，CH2和CH3区。在某些实施方案中，包括轻链结合所需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物以及免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。当在构建中使用的三种多肽链的不等比例提供最佳产量时，这在实施方案中提供调整三种多肽片段的相互比例的灵活性。然而，当相同比例的至少两种多肽链的表达导致高产量时或者当比例没有特别的意义时，可能在一个表达载体中插入两种或者所有三种多肽链的编码序列。
双特异性抗体包括交联的或“异源偶联(heteroconjugate)”抗体。例如，异源偶联中的其中一种抗体可以偶联至抗生物素蛋白，其它偶联至生物素。已经提出此类抗体，例如，以将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(US4676980)，和用于治疗HIV感染(WO1991/00360，WO1992/00373，和EP03089)。异源偶联抗体可以使用任何方便的交联方法来制备。合适的交联剂连同许多交联技术是本领域众所周知的(参见US4676980)。具有超过两个效价的抗体也可以涉及。例如，可制备三特异性抗体(参见Tutt A et al.(1991)J.Immunol.147:60-9)。
在一些实施方案中，本公开提供了一种双特异性的异源二聚免疫球蛋白或其片段或双特异性的全长抗体，其与CD3和选自下组内的疾病相关抗原结合：肿瘤抗原，细胞因子，血管生长因子和淋巴血管生成生长因子。优选地，所述双特异性异源二聚免疫球蛋白或其片段或双特异性抗体与CD3和选自下组内的疾病相关抗原结合：CD33，TROP2，CD105，GD2，GD3，CEA，VEGFR1，VEGFR2，NCAM，CD133，CD123，ADAM17，MCSP，PSCA，FOLR1，CD19，CD20，CD38，EpCAM，HER2，HER3，EGFR，PSMA，IgE，整合素a4b1，CCR5，LewisY，FAP，MUC-1，Wue-1，MSP，EGFRvIII的，P糖蛋白，AFP，ALK，BAGE蛋白，CD30，CD40，CTLA4，ErbB3，ErbB4，间皮素，OX40，CA125，CAIX，CD66e，cMet，EphA2，HGF/SF，MUC1，磷脂酰丝氨酸，TAG-72，TPBG，β-连环蛋白，brc-abl，BRCA1，BORIS，CA9，半胱天冬酶-8，CDK4，细胞周期素B1，CYP1B1，ETV6-AML，Fra-1，FOLR1，GAGE-1，GAGE-2，GloboH，磷脂酰肌醇聚糖3，GM3，GP100，HLA/B-raf，HLA/K-ras，HLA/MAGE-A3，hTERT，LMP2，MAGE1，MAGE2，MAGE3，MAGE4，MAGE6，MAGE12，MART-1，ML-IAP，Muc2，Muc3，Muc4，Muc5，Muc16，MUM1，NA17，NY-BR1，NY-BR62，NY-BR-85，NY-ESO1，p15，p53，PAP，PAX3PAX5，PCTA-1，PLAC1，PRLR，PRAME，RAGE蛋白，Ras，RGS5，Rho，SART-1，SART-3，Steap-1，Steap-2，存活素，TAG-72，TGF-β，TMPRSS2，Tn，TRP-1，TRP-2，酪氨酸酶，尿路上皮特异性膜蛋白3(uroplakin-3)，PSMA。优选地，所述双特异性异源二聚免疫球蛋白或其片段或双特异性抗体与CD3和HER2或CD3和CD38或CD3和OX40结合。
蛋白A：蛋白A是通过若干由单个多肽链组成的金黄色葡萄球菌菌株产生的细胞壁组分。蛋白A基因产物由通过串联方式与病原体的细胞壁连接的5个同源重复组成。五个结构域大约58个氨基酸长并表示为EDABC，每个均显示免疫球蛋白结合活性(Tashiro M&Montelione GT(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.,5(4):471-481)。五个同源的免疫球蛋白结合结构域折叠成三螺旋束。每个结构域能够结合来自许多哺乳动物物种的蛋白，最显著的是IgG(Hober S et al.,(2007)J.Chromatogr.B Analyt.Technol.Biomed.Life Sci.,848(1):40-47)。人VH3家族的情况下，蛋白A结合在Fc区内的并且也在Fab区内的大多数的免疫球蛋白的重链(Jansson B et al,(1998)FEMS Immunol.Med.Microbiol.,20(1):69-78)。蛋白A结合来自不同的物种(包括人，小鼠，兔，豚鼠)的IgG，但是不结合人IgG3(Hober S等人，(2007)同上)。人IgG3不能结合蛋白A可通过人IgG3Fc区的H435R和Y436F取代(EU编号，Jendeberg et al.,(1997)J.Immunol.Methods,201(1):25-34)解释。除了IgG之外，蛋白A还与IgM和IgA相互作用。
在人VH亚类中，VH3是结合蛋白A的唯一亚类(Graille M et al.,(2000)Pr℃.Natl.Acad.Sci.USA 97(10):5399-5404)，并且蛋白A的所有五个结构域已知结合该可变域亚类(Jansson B et al,(1998)FEMS Immunol.Med.Microbiol.,20(1):69-78)。基于VH3的免疫球蛋白或其片段对于生物技术工业至关重要。因为基于VH3的分子结合蛋白A的能力有利于它们的功能预筛选，因此已经广泛开发基于VH3的分子，而且由此用于抗体开发的许多合成或基于供体的噬菌体展示库或转基因动物技术是基于VH3亚类的。另外，由于基于VH3的分子相对于其它已知的重链可变域亚类具有良好的表达和稳定性，因此通常选择它们。
蛋白A以这种高亲和性与抗体结合的能力是其在生物制药中工业规模应用的驱动力。在生物制药中用于生产抗体的蛋白A通常在大肠杆菌中重组产生并且与天然蛋白A功能基本上相同(Liu HF et al.,(2010)MAbs,2(5):480-499)。最常见的是，重组蛋白A结合于固定相色谱树脂用于抗体的纯化。最佳结合发生在pH8.2，但是在中性或生理条件下(pH 7.0-7.6)也结合良好。洗脱通常是通过朝着酸性pH(甘氨酸-HCl，pH2.5-3.0)的pH变动而实现。这有效地解离大多数的蛋白质-蛋白质和抗体-抗原结合相互作用，而不会永久地影响蛋白质结构。尽管如此，一些抗体和蛋白质被低pH损坏，最好是在回收之后通过加入1/10体积的碱性缓冲液(诸如1M Tris-HCl，pH 8.0)立即中和以尽量减少在低pH条件中的持续时间。
有各种市售的蛋白A色谱树脂。这些介质之间的主要区别是支持基质类型，蛋白A配体修饰，孔径大小和颗粒大小。这些因素的差异引起压缩性，化学和物理稳健性，扩散阻力及吸附剂的结合能力的差别(Hober S等人，(2007)，同上)。蛋白A色谱树脂的实例包括但不限于如在实施例中使用的来自GE医疗集团的MabSelect SuReTM蛋白A树脂和的MabSelectTM蛋白A树脂。
术语“色谱法”是指蛋白液相色谱并且包括快速蛋白液相色谱(FPLC)，它是通常用于分析或纯化蛋白质的混合物的液相色谱形式。如在其他形式的色谱法中，因为混合物的不同组分具有对两种材料(流经多孔固体(固定相)的移动液体(流动相))的不同的亲和性，分离是可能的。在FPLC中，流动相为水溶液，或“缓冲液”。缓冲液流速可以在重力流动下操作，或由通常保持在恒定速率下的正排量泵控制，而缓冲液的组成可以通过从两个或更多个外部容器以不同比例抽出流体而变化。固定相是珠组成的树脂，通常是交联的琼脂糖，填充到圆柱形玻璃或塑料柱中。取决于应用，FPLC树脂可以广泛的珠尺寸和表面配体供使用。
“亲和色谱”的方法包括使用亲和试剂作为配体，其对固定相是交联的，并且对特定分子或一类分子具有结合亲和性。配体可以是生物分子，如蛋白配体或可以是合成的分子。这两种类型的配体往往具有良好的特异性。生产中最常用的蛋白质配体是亲和试剂蛋白A。在亲和色谱中，当溶液(例如包含所关注的蛋白质的粗细胞上清液)被上样到柱时，通常吸附靶蛋白同时允许污染物(其它蛋白质，脂质，糖类，DNA，颜料等)穿过所述柱。吸附剂本身通常填充在色谱柱中；虽然吸附阶段可以以分批结合模式通过将吸附剂用作搅拌浆料来实施。吸附后的下一个阶段是清洗阶段，其中，洗涤所述吸附剂以除去残余的污染物。然后结合的蛋白质以半纯或纯的形式洗脱。洗脱通常通过改变缓冲液或盐组成实现，从而蛋白可以不再与固定的配体相互作用并释放。在某些情况下，所关注的蛋白质可能不结合亲和树脂并且亲和色谱是结合不想要的污染物，因此，未结合的流分被收集以分离所关注的蛋白质。亲和色谱可以在固定床或流化床中进行。
术语“梯度模式色谱”是指这样一种色谱方法，其中“洗脱”缓冲液(缓冲液B)的比例以逐渐或逐步的方式从0％增加到100％。
术语“捕获-洗脱模式色谱”或“捕获-洗脱纯化模式”或“捕获-洗脱纯化”是指这样一种色谱方法，其中“洗脱”缓冲液(缓冲液B)的比例不以逐步或逐步的方式从0％提高到100％，而是在用运行缓冲液(缓冲液A)捕获和任选地洗涤步骤之后直接以100％施加。
靶向CD3的异源二聚免疫球蛋白的开发
本发明提供了结合CD3蛋白复合体的表位结合区，其包括如上文所述的重和轻链CDR并且还包括是人基因IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自其的重链可变框架区。所述重链可变框架区包括包含氨基酸序列SEQ IDNO：18的对应的鼠抗体OKT3的重链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。优选地，所述氨基酸修饰是氨基酸取代。通常情况下，在框架区内进行不超过七个，优选不超过六个，优选不超过五个，优选不超过四个，更优选不超过三个，甚至更优选不超过两个，最优选不超过一个氨基酸修饰。在一些实施方案中，本公开内容提供了结合于CD3蛋白复合体的表位结合区，其中所述重链可变区的框架区的氨基酸修饰包括在从下组选出的氨基酸位置处的氨基酸取代：34，48，49，58，69，71和73并且其中根据Kabat编号指示每个组成员的氨基酸位置。优选地，重链可变区的框架区的氨基酸取代从下组中选出：I34M，V48I，A49G，R58N，R58Y，I69L，A71T和T73K。重链可变区的框架区的优选的氨基酸取代在选自由34，49和71组成的组的氨基酸位置上。重链可变区的框架区的更优选的氨基酸取代选自由I34M，A49G和A71T组成的组。
在进一步的方面，结合CD3蛋白复合体的第一多肽的表位结合区包括是从下组中选出的人基因的产物或衍生自其的轻链可变框架区：IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)和IGKV3-20*01(SEQ ID NO：24)。所述轻链可变框架区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：19的对应的鼠抗体OKT3的轻链可变区的相应框架区的至少一个氨基酸修饰。优选地，所述氨基酸修饰是氨基酸取代。通常情况下，在框架区内进行不超过八个，优选不超过七个，优选不超过六个，优选不超过五个，优选不超过四个，更优选不超过三个，甚至更优选不超过两个，最优选不超过一个氨基酸修饰。在一些实施方案中，本公开内容提供了结合于CD3蛋白复合体的表位结合区，其中所述轻链可变区序列的框架区的氨基酸修饰包括在从下组选出的氨基酸位置上的氨基酸取代：4，33，34，46，47，66，71和96。优选地，轻链可变区的框架区的氨基酸取代从下组中选出：M4L，V33M，A34N，L46R，L47W，R66G，F71Y和P96F。轻链可变区的框架区的优选的氨基酸取代在选自由4，46和47组成的组的氨基酸位置上。轻链可变区的框架区的更优选的氨基酸取代选自由M4L，L46R，L47W和F71Y组成的组。在一些实施方案中，结合于CD3蛋白复合体的第一多肽的表位结合区可以包括如上所述的重链可变区序列的框架区的氨基酸修饰和如上所述的轻链可变区序列的框架区的氨基酸修饰。
本公开还提供了一种结合于CD3蛋白复合体的抗体或其片段，其包括选自由SEQ ID NO：27-38，64-68和359、优选由SEQ ID NO：359组成的组的重链序列。本公开还提供了一种结合于CD3蛋白复合体的抗体或其片段，其包括选自由SEQ ID NO：39-47，69-90和360、优选由SEQ ID NO：360组成的组的轻链序列。
鉴于这些重链和轻链可变区序列中的每一个可以结合CD3蛋白复合体，所述重和轻链可变区序列可以“混合并匹配”，以产生本发明的抗CD3结合分子。可以使用例如在实施例中描述的结合测定法来测试这种“混合并匹配的”抗体的CD3结合。
工程化免疫球蛋白恒定区以促进超过同源二聚体形成的异源二聚体形成
生产异源二聚免疫球蛋白的方法是本领域已知的并且其中一个最简单的方法依赖于在单细胞中表达两条不同的免疫球蛋白链(WO95/33844,Lindhofer H&Thierfelder S)。不经工程化，该简单的方法受限于同源二聚物种的形成超过所关注的异源二聚体的形成(Kufer P et al.,(2004)Trends Biotechnol.,22(5):238-244)。当使用可提高重链异源二聚化的互补技术时(Merchant AM et al.,(1998)Nat.Biotechnol.,16(7):677-681)，可以实现更大的异源二聚体产生但仍导致产生显著量的不希望的同源二聚体(Jackman J et al.,(2010)J Biol Chem.,285(27):20850-9,Klein C et al.,(2012)MAbs,4(6):653-63)。因此，本发明利用技术所描述的方法(PCT公开号：WO2012/131555)，其是基于优于现有技术方法显示出优异的异源二聚化的生物模仿的独特概念。BEAT技术基于自然产生的同源或异源二聚免疫球蛋白结构域对之间的界面交换以创建可用作基于Fc的双特异性抗体的构建块的新的异源二聚体。
在一个方面，本发明提供了一种包括第一和第二多肽的异源二聚免疫球蛋白或其片段，所述第一和第二多肽包括具有蛋白质-蛋白质界面的、具有修饰的CH3结构域的经工程化的免疫球蛋白恒定区，其中第一多肽的蛋白质-蛋白质界面包括从下组中选出的位置上的氨基酸取代：3，5，7，20，22，26，27，79，81，84，84.2，85.1，86，88和90(编号)，并且其中，第二多肽的蛋白质-蛋白质界面包括位置84.4上的氨基酸取代和从下组位置中选出的位置上的氨基酸取代：3，5，7，20，22，26，27，79，81，84，84.2，85.1，86，88和90(编号)。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中第一和第二多肽包括具有蛋白质-蛋白质界面的、具有修饰的CH3结构域的经工程化的免疫球蛋白恒定区，并其中第一多肽的蛋白质-蛋白质界面包括位置88上的氨基酸取代和从下组中选出的位置上的氨基酸取代：3，5，7，20，22，26，27，79，81，84，84.2，85.1，86和90(编号)，并且其中，第二多肽的蛋白质-蛋白质界面包括位置85.1和/或86上的氨基酸取代和从下组位置中选出的位置上的氨基酸取代：3，5，7，20，22，26，27，79，81，84，84.2，84.4，88和90(编号)，其中，在第一工程化免疫球蛋白恒定区中的位置88上取代的氨基酸残基与第二工程化免疫球蛋白恒定区中的位置85.1和/或86上取代的氨基酸残基相互作用，其中，根据编号表示每个组成员的氨基酸位置。
优选地，在第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中在位置88处被取代的氨基酸残基是88W及其保守的氨基酸取代，其中根据编号指示氨基酸位置。更优选地，在第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中在位置88处被取代的氨基酸残基是88W，且在第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中取代的另外的氨基酸残基选自下组：3A，20V，20T，20A，20N，20Q，20E，20S，20K，20W，22A，22G，22T，22L，22I，22V，26R，26Q，26T，26K，26V，26S，26N，26E，79Y，85.1T，85.1M，85.1A，85.1S，85.1R，85.1H，85.1K，85.1F，85.1C，85.1N，85.1W，86S，86I，86T，86H，86Q，86V，86W，86Y，86F和90N，其中根据编号表示氨基酸位置。
优选地，在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中在位置85和86处被取代的氨基酸残基选自下组：85.1A，85.1S，85.1C和86S及其保守的氨基酸取代(编号)。更优选地，在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中被取代的氨基酸残基选自下组：85.1A，85.1S，85.1C和86S且其中在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中取代的另外的氨基酸残基选自下组：3E，5A，7F，20T，22V，26T，81D，84L，84.2E，88R和90R及其保守的氨基酸取代物(编号)。
在一个优选的实施方案中，在第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中在位置88处被取代的氨基酸残基是88W，且其中在第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中取代的另外的氨基酸残基是：3A，20K，22V，26T，79Y，85.1S，86V和90N以及，其中在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中在位置85.1和86上被取代的氨基酸残基是85.1A，85.1S，或85.1A和86S并且其中在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中取代的另外的氨基酸残基是：3E，5A，7F，20T，22V，26T，81D，84L，84.2E，84.4Q，88R和90R(编号)。
在一个替代实施方案中，本发明提供了一种异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中第一和第二多肽包括具有蛋白质-蛋白质界面并具有修饰的CH3结构域的经工程化的免疫球蛋白恒定区，其中第一多肽的蛋白质-蛋白质界面包括位置20上的氨基酸取代和从下组中选出的位置上的氨基酸取代：3，5，7，22，26，27，79，81，84，84.2，85.1，86，88和90，并且其中，第二多肽的蛋白质-蛋白质界面包括位置26上的氨基酸取代和从下组位置中选出的位置上的氨基酸取代：3，22，27，79，81，84，85.1,86和88，其中，在第一工程化免疫球蛋白恒定区中的位置20上取代的氨基酸残基与第二工程化免疫球蛋白恒定区中的位置26上取代的氨基酸残基相互作用，其中，根据编号表示每个组成员的氨基酸位置。
优选地，在第一工程化免疫球蛋白链的蛋白质-蛋白质界面中取代的氨基酸残基包括在位置20和22上的氨基酸残基，和任选地从下组中选出的位置上的另外的氨基酸残基：3，5，7，26，27，79，81，84，84.2，84.4，85.1，86，88和90，并且其中在第二工程化免疫球蛋白链的蛋白质-蛋白质界面中取代的氨基酸残基包括在位置26上的氨基酸残基以及在从下组中选出的另外的位置上的氨基酸残基：3，5，7，20，22，27，79，81，84，84.2，84.4，85.1，86，88和90，其中根据编号表示每个组成员的氨基酸位置。优选地，在第一工程化免疫球蛋白链的蛋白质-蛋白质界面中取代的氨基酸残基包括在位置20和22上的氨基酸残基，以及任选地从下组中选出的位置上的另外的氨基酸残基：3，5，7，26，27，79，81，84，84.2，84.4，85.1，86，88和90以及，其中在第二工程化免疫球蛋白链的蛋白质-蛋白质界面中取代的氨基酸残基包括在位置26和86上的氨基酸残基以及任选地在从3，5，7，20，22，27，79，81，84，84.2，84.4，85.1，88和90组成的组中选出的另外的位置上的氨基酸残基，其中，根据编号表示每个组成员的氨基酸位置。
更优选地，在第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中的位置20上取代的氨基酸残基选自由20V，20T，20A，20N，20Q，20K，20S，20W和20E组成的组，并且其中在第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中取代的另外的氨基酸残基选自由3A，22A，22G，22L，22I，22V，22T，26K，26R，26Q，26T，26V，26S，26N，26E，79Y，85.1W，85.1F，85.1T，85.1M，85.1A，85.1S，85.1R，85.1H，85.1K，85.1C，85.1N，86W，86Y，86S，86I，86H，86Q，86V，86T，86F，88Q，88L，88V，88R，88E，88T，88I，88Y，88K，88W和90N组成的组，并且其中在第二工程化的免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中的位置26上取代的氨基酸残基选自由26T和26E及其保守的氨基酸取代组成的组，其中根据编号表示氨基酸位置。
在一个最优选的实施方案中，在第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中的位置20上取代的氨基酸残基为20K，并且其中，在第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中取代的另外的氨基酸残基是3A，22V，26T，79Y，85.1S，86V，88W和90N以及，其中在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中的位置26上取代的的氨基酸残基是26T，并且其中在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白质-蛋白质界面中取代的另外的氨基酸残基是3E，5A，7F，20T，22V，81D，84L，84.2E，84.4Q，85.1C/S/A，86S，88R和90R(编号)。
开发靶向CD3和疾病相关抗原的异源二聚免疫球蛋白
作为第一步骤(实施例1)，在基于FAB或scFv片段的同源二聚免疫球蛋白中测定减少或消除与蛋白A的结合的取代。已经发现，在具有用于减少或消除与蛋白A的结合的取代的重链内存在VH3亚类的可变重链结构域，妨碍基于蛋白A的任何差异亲和性方法。对于基于蛋白A的差异亲和方法，在减少或者消除蛋白A与VH3亚类的结合的框架取代形式中，发现了这些主要障碍的解决方案。
在第二步骤中(实施例2.1)，通过移植鼠抗CD3抗体的CDR到IGVH3-23和IGVK1或IGVK3人种系框架上来生成靶向人CD3(ε亚基)的人源化抗体。最佳人源化变体具有使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)废除的存在于它们的VH结构域中的蛋白A结合位点。将这些变体格式化为FAB或scFv片段。
在第三步骤中，生成靶向疾病相关抗原的抗体的抗原结合位点。可以将鼠抗体的CDR移植到人种系框架IGVH3-23和IGVK1中(实施例2.3，2.4和2.6-2.10)。可选地，从噬菌体展示库中分离的抗体的CDR可以基于VH3可变域亚类或移植到人种系框架IGVH3-23和IGVK1上(实施例2.5和2.6)。使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)废除表位结合区的VH结构域中的蛋白A结合位点。
在第四步骤中，基于技术产生异源二聚抗体(如在WO2012/131555中描述的)，其中在scFv-FAB形式中使用来自实施例2.1的抗CD3抗体和如实施例2.2-2.10中所描述的疾病相关抗原的表位结合区，反之亦然(实施例3.1)。由于同源和异源二聚物种之间的蛋白A结合位点的数目的差异可以用于通过蛋白A色谱法分离异源二聚物种，因此，本发明的双特异性抗体经工程化以产生不具有蛋白A结合位点从而不与蛋白A树脂结合的两种同源二聚物种中的一种。此外，为了提高BEAT抗体的安全性，通过将两个取代L234A和L235A(EU编号)工程化到Fc区的下铰链区内来减少或消除Fc受体结合。
实施例
材料和方法：
用于瞬时哺乳动物细胞表达的表达载体的构建
部分或全部地编码不同多肽链的cDNA首先由GENEART AG(德国雷根斯堡)基因合成，并使用标准的分子生物学技术进行修饰。用合适的DNA限制性内切酶消化PCR产物，纯化，并连接在预先用相同的DNA限制性内切酶消化的经修饰的pcDNA3.1质粒(Invitrogen AG，瑞士楚格)中，该修饰的pcDNA3.1质粒携带CMV启动子和牛生长激素多聚腺苷酸序列(poly(A))。将所有的多肽链各自连接在该表达载体中，在所述表达载体中，由鼠VJ2C前导肽驱动分泌。
重组蛋白的表达
除非另有说明。如下所述地表达抗体、ScFv-Fc融合蛋白，BEAT抗体和抗原。对于瞬时表达，使用聚乙烯亚胺(PEI；Sigma，瑞士布克斯)将等量的各工程化的链载体共转染到悬浮适应的HEK293-EBNA细胞(ATCC-LGL标准，英国特丁顿；目录号：CRL-10852)中。典型地，用DNA-PEI混合物转染密度为每ml 0.8-1.2百万个细胞的100ml细胞悬浮液。当编码每个工程化的链基因的重组表达载体被导入宿主细胞中时，免疫球蛋白构建体通过进一步培养细胞为期4至5天以允许分泌到培养基(EX-CELL 293，HEK293-无血清培养基(Sigma)，补充有0.1％普朗尼克酸，4mM谷氨酰胺，以及0.25μg/ml遗传霉素)而产生。通过离心然后无菌过滤制备包含分泌的免疫球蛋白的无细胞培养物上清液，并用于进一步的分析。
差异蛋白A亲和色谱(实施例1)
Fc 133片段和同源二聚scFv-Fc免疫球蛋白的纯化
捕获-洗脱模式色谱
在纯化之前用0.1体积(V)的1M Tris-HCl pH8.0调节上清液。将蛋白GSepharoseTM4快速流动(GE医疗集团欧洲有限公司，格拉特布鲁，瑞士，目录号分别为17-0618-01)加入到调制的上清液中。混合物在4℃下孵育过夜。孵育后，结合的蛋白质用10CV的PBS pH7.4洗涤，使用4倍柱体积(CV)的0.1M甘氨酸pH3.0洗脱并用0.1V的Tris-HCl pH 8.0中和。通过SDS-PAGE(NuPAGEBis-Tris 4-12％丙烯酰胺，Invitrogen AG，瑞士巴塞尔)在非还原条件下分析上清液，流通物(flow through)和洗脱流分。
梯度模式色谱
产生后，首先在利用蛋白G SepharoseTM4快速流动(上文)的捕获-洗脱模式色谱中纯化包括Fc 133片段的细胞培养上清液。来自捕获-洗脱模式色谱的洗脱物质随后加载到1ml HiTrapTM MabSelect SuReTM蛋白A柱(蛋白A结合位点突变体)。所述柱在0.2M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH8.0中预平衡以及以1ml/min的流速在色谱系统(柱和仪器都来自GE医疗集团欧洲有限公司；柱目录号是11-0034-93)上操作。利用pH线性梯度联合各种量的两种缓冲液(运行缓冲液(A)：0.2M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH8.0和洗脱缓冲液(B)：0.04M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH3.0实施洗脱。线性梯度以5个柱体积(CV)从0％B变为100％B。用0.1V的1M Tris-HCl pH 8.0中和洗脱的流分。通过SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12％丙烯酰胺，Invitrogen AG，瑞士巴塞尔)在非还原条件下分析上清液，流通物和洗脱流分。
同源二聚FAB-Fc免疫球蛋白和FAB片段的纯化。
产生后，用0.1V的1M Tris-HCl pH 8.0调节细胞培养物上清液。将蛋白L树脂(Genescript，皮斯卡塔韦，USA)加入到经调节的上清液中并在4℃下孵育过夜。孵育后，用10CV的PBS pH7.4洗涤结合的蛋白质，用4CV的0.1M甘氨酸pH3.0洗脱，最后用0.1V的1M Tris-HCl pH8.0中和。为了评估蛋白A结合，将蛋白L纯化的FAB注射于pH8.0(柠檬酸/Na2HPO4缓冲液)下的1ml HiTrapMabSelectTM柱(GE医疗集团欧洲有限公司，格拉特布鲁，瑞士)上。利用pH线性梯度联合各种量的两种缓冲液(运行缓冲液(A)：0.2M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH8.0和洗脱缓冲液(B)：0.04M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH3.0)实施洗脱。线性梯度以5CV从0％B变为100％B。用0.1V的1M Tris-HCl pH 8.0中和洗脱的流分。通过SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12％丙烯酰胺，Invitrogen AG，瑞士巴塞尔)在非还原条件下分析上清液，流通物和洗脱流分。
用于在其Fc和VH3结构域废除蛋白A结合的基于VH3的同源二聚FAB-Fc和scFv-Fc免疫球蛋白的纯化和测试。
纯化方案包括根据上述程序的捕获-洗脱模式色谱，随后是梯度模式色谱。
差异蛋白质A亲和色谱(实施例1&3)
产生后，将无细胞上清液加载到在0.2M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH 6.0中预平衡的1ml HiTrapTMMabSelect SuReTM蛋白A柱上并以1ml/min的流速在色谱系统(均来自GE医疗集团欧洲有限公司；柱目录号：11-0034-93)上操作。运行缓冲液是0.2M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH 6。用20mM柠檬酸钠缓冲液pH 4进行所关注的异源二聚体的洗脱，而用0.1M甘氨酸，pH 3.0洗脱同源二聚物种。洗脱后，在280nm处OD读数；汇集包含所关注的异源二聚体的流分并用0.1体积的1M Tris pH 8.0(Sigma)中和。
通过SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12％丙烯酰胺，Invitrogen AG，瑞士巴塞尔)在非还原条件下分析上清，流通物和洗脱流分。
差示扫描量热法(DSC)
使用量热测量比较抗体的热稳定性。在VP-DSC差示扫描微量热计(Micr℃al-GE医疗集团欧洲有限公司，格拉特布鲁，瑞士)上进行量热测量。细胞体积为0.128ml，加热速率为1℃/min且过量的压力保持在64p.s.i。所有的蛋白质片段以在PBS(pH 7.4)中的1-0.5mg/ml浓度使用。通过与已除去蛋白质的包含相同缓冲液的平行样品比较估计各蛋白质的摩尔热容。使用标准程序分析偏摩尔热容和熔解曲线。进一步分析之前在软件Origin V7.0中利用非二状态模型(Non-Two State model)对热谱图进行基线校正和浓度标准化。
人IgG亚类的预期熔解曲线是已知的(Garber E&Demarest SJ(2007)Bi℃hem Biophys Res Commun,355(3):751-7)且所有曲线已经显示包含对应于CH2，CH3和FAB结构域的独立解折叠的3个解折叠转变(unfolding transition)。在四种人IgG亚类中，IGHG1具有最稳定的CH3结构域(～85℃)；而其他亚类CH3结构域不太稳定，但是已知都不在70℃以下熔解。同样地，对于CH2结构域，已知所有的亚类具有～70℃的熔解温度。
通过毛细管凝胶电泳评估纯度(实施例3.2)
非还原样品制备
40μg脱盐蛋白样品被缓存在含5mM碘乙酰胺(Sigma)的SDS样品缓冲液(Beckman Coulter International S.A.，瑞士尼翁，IgG纯度试剂盒，目录号：A10663)中。将10kDa内标准加入到样品中。在70℃下加热样品混合物10分钟。
毛细管凝胶电泳
样品制备后，在配有设置在220nm的二极管阵列检测器(DAD)的ProteomeLab PA 800(Beckman Coulter International S.A.，尼翁，瑞士)上运行样品。50μm ID×30.2cm裸熔融石英毛细管(到检测器20.2cm有效长度)被用作分离介质。样品注射和分离分别在5和15千伏的恒定电压下，在SDS-分子量凝胶缓冲液中，使用反向极性进行。以2Hz的速率记录数据并且分离过程中的电流是稳定的。毛细管和样品在25℃下是热稳定的。
通过SPR测量亲和性(实施例1)
废除蛋白A结合的FAB片段的SPR测试
将融合到IGHG1Fc片段的编码人HER2胞外区的cDNA克隆到与上述重和轻表达载体类似的表达载体内并且使用PEI方法在HEK293E细胞中瞬时转染(参见PCT公开号：WO2012131555)。用0.1V的1M Tris-HCl pH8.0和通过如实施例1所描述的蛋白A捕获-洗脱色谱法纯化的抗原调节上清液。对于SPR实验，使用单克隆小鼠抗人IgG(Fc)抗体传感器芯片，这允许以正确的方向捕获Fc融合的重组HER2抗原(人抗体捕获试剂盒，目录号BR-1008-39，GE医疗集团欧洲有限公司)。测量结果记录在BIAcoreTM2000仪器(GE医疗集团欧洲有限公司，格拉特布鲁，瑞士)上。抗HER2FAB的不同稀释液(50，25，12.5，6.25，3.13，1.57，0.78，0.39nM)以30μl/min历时4分钟注射到该传感器芯片上。对于每次测量，7分钟的解离后，历时1分钟以30μl/min注射3M MgCl2溶液用于再生。数据(传感图：fc2-fc1)以1:1Langmuir拟合。考虑到在每个测量的开始时，捕捉的HER2-Fc中的实验变异，在所有拟合中将Rmax值设定为本地。测量以一式两份进行，且包括用于参照的零浓度样品。Chi2和残余值都被用于评价实验数据和个体结合模型之间的拟合的质量。
通过SPR测量亲和性(实施例2&3)
使用SPR分析来测量不同的抗体(鼠和人源化抗体)的结合动力学的结合和解离速率常数。在室温下在BIAcore2000仪器(BIAcore-GE医疗集团欧洲有限公司，格拉特布鲁，瑞士)上测量抗体的结合动力学并用BIA评估软件(版本4.1，BIAcore-GE医疗集团欧洲有限公司)分析。
在使用商业胺偶联试剂盒(GE医疗集团欧洲有限公司，目录号：BR-1000-50)与所关注的配体单独偶联的CM5传感器芯片(GE医疗集团欧洲有限公司，目录号：BR-1000-14)上进行测量。蛋白G配体来自Pierce(Thermo FisherScientific-Perbio Science S.A.，瑞士洛桑，目录号：21193)。
如所示，在具有或不具有质量传递的情况下用1:1Langmuir模型拟合数据(传感图：fc2-fc1)。在捕获实验中，考虑到在每个测量的开始的实验变异，在所有拟合中Rmax值设定为本地。解离时间为至少350秒。测量以一式三份进行，并包括用于参照的零浓度样品。Chi2和残余值都被用于评价实验数据和个体结合模型之间的拟合的质量。
通过FACS对HPB-ALL细胞进行亲和性测量
HPB-ALL细胞(DSMZ，布伦瑞克，德国，目录号：ACC483)用作用于FACS染色的CD3阳性细胞系。HPB-ALL保存在补充有10％FCS和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640中。在补充有1％BSA和0.1％叠氮化钠的PBS(称为FACS缓冲液)中，将100μl系列稀释的嵌合型OKT3抗体和人源化变体与4×105个HPB-all细胞在冰上孵育45分钟。不相关人IgG1用作同种型对照并且嵌合型OKT3抗体作为阳性对照。在洗涤后，将细胞在冰上与1/200稀释的抗人Fc-PE(eBioscience，维也纳，奥地利)孵育45分钟。然后将细胞再次洗涤并重悬在200μl FACS缓冲液中。在FACSCalibur(BD Biosciences，阿尔施维尔，瑞士)上测量各样品的相对平均荧光。结果汇总于图9中，作为HBP-ALL相比于嵌合型OKT3抗体的相对染色。
用于体外测定的细胞系
人HER2阳性细胞系
表达HER2抗原的人细胞已经在PCT公开号：WO2010108127中描述。如本文所用的HER2阳性人细胞系如下：
BT474(ATCC-LGL标准；目录号：HTB-20)
培养条件：补充有10％热灭活FBS，1％青霉素-链霉素(Invitrogen AG，目录号10378-016)，1％丙酮酸钠溶液(PAA实验室，帕兴，奥地利；目录号：S11-003)，1％MEM非必需氨基酸(PAA实验室，目录号：M11-00dsmz3)和1％GlutaMAX-1(Invitrogen AG，目录号：35050-038)在150cm2组织培养瓶(TPP，Trasadingen，瑞士；目录号：90150)中的RPMI培养基。细胞每周传代两次。
JIMT-1(DSMZ，布伦瑞克，德国，目录号：ACC589)
培养条件：Dulbeco改良的必需培养基(DMEM(1X))+Glutamax-1(Invitrogen AG，目录号：31966-012)，补充有10％热灭活的FBS，1％青霉素-链霉素(Invitrogen AG，目录号：10378-016)，1％丙酮酸钠溶液(PAA实验室，目录号：S11-003)，1％MEM非必需氨基酸(PAA实验室，目录号：M11-003)和1％GlutaMAX-1(Invitrogen AG，目录号：35050-038)。细胞每周传代2-3次。
MDA-MB-231(ATCC-LGL标准；目录号：HTB-26)。
培养条件：与JIMT-1相同的培养条件。
HT-1080(ATCC-LGL标准；目录号：CCL-121)。
培养条件：HT1080细胞在补充有10％热灭活FBS，1％青霉素-链霉素(Invitrogen AG，目录号：10378-016)和1％谷氨酰胺(Invitrogen AG，目录号：25030-024)的EMEM培养基中培养。以每周分裂三次培养细胞(1/6稀释)。
NCI-N87(ATCC-LGL标准；目录号：CRL-5822)。
培养条件：NCI-N87细胞在含10％热灭活FBS，1％青霉素-链霉素(InvitrogenAG，目录号：10378-016)，1％丙酮酸钠溶液(PAA实验室，帕兴，奥地利；目录号：S11-003)，1％MEM非必需氨基酸(PAA实验室，目录号：M11-00dsmz3)和1％谷氨酰胺(Invitrogen AG，目录号：25030-024)的RPMI 1640培养基中培养。细胞每周分裂两次(1/3稀释)。
人CD38阳性细胞系
表达CD38抗原的人细胞已在PCT公开号WO2005103083，WO2008047242，WO2011154453和WO2012092612中描述。如本文所用的CD38阳性人细胞系如下：
稳定的重组CHO[CD38]细胞
在Source Biosciences(柏林，德国，目录号：IRAU37D11，4309086)订购编码人CD38的基因。使用加入Kozak序列，起始密码子，随后是信号肽(鼠V前导序列)到5'端和NheI限制性位点到3'末端的引物来扩增人CD38。扩增子使用NheⅠ和HindⅢ切割，并克隆到内部开发的pT1，pcDNA3.1(Invitrogen AG)衍生的载体的表达盒内。pT1的表达盒使用多顺反子性的mRNA上的两个IRES(内部核糖体进入位点)将所关注的基因的表达与GFP和PAC(用于嘌呤霉素抗性的基因)的表达关联起来。制备质粒的中量制备(midiprep)并通过DNA测序证实所克隆的CD38开放阅读框。在50ml生物反应器格式(TubeSpin 50生物反应器，TPP，Trasadingen，瑞士)中使用聚乙烯亚胺(Polyplus-转染，伊尔基希，法国)转染悬浮CHO-S细胞(Invitrogen AG)。为了这个目的，在OptiMEM培养基(Invitrogen AG，目录号：31985-047)中接种指数生长的细胞。将DNA复合体加入到细胞中。在摇动(200RPM)下在37℃下用DNA复合体孵育细胞5h进行内吞作用之后，将一个体积的补充有4mMGln的培养基PowerCHO2(Lonza，分配器RUWAG Lifescience，贝特拉赫，瑞士，目录号：BE12-771Q)加入到细胞悬浮液中。然后将细胞在37℃，5％CO2和80％湿度下在摇动平台上孵育。转染一天后，将细胞以不同浓度接种在96孔板中的包含嘌呤霉素(Sigma，目录号：P8833-25mg)的选择性培养基中。在静态条件下经过大约14天的选择，使用TubeSpin 50生物反应器将46个高GFP表达细胞群扩展为悬浮培养物。一旦成功地适应悬浮，即通过FACS分析细胞的CD38。本文选择和使用具有均质的CD38染色谱的稳定的CHO[CD38]克隆。
其他CD38阳性细胞系包括：
NCI-H929(ATCC-LGL标准；目录号：CRL-9068)。
Namalwa(ATCC-LGL标准；目录号：CRL-1432)
U266(ATCC-LGL标准；目录号：TIB-196)。
RPMI 8226(ATCC-LGL标准；目录号：CCL-155)
培养条件：补充有10％热灭活FBS，1％青霉素-链霉素(Invitrogen AG)和1％GlutaMAX-1(Invitrogen AG)的RPMI 1640培养基
Raji(ATCC-LGL标准；目录号：CCL-86)
Daudi(ATCC-LGL标准；目录号：CCL-213)。
人OX40阳性细胞系
表达OX40抗原的人细胞已经在PCT公开号：WO2013008171中描述。
外周血单个核细胞(PBMC)和HBP-ALL是人OX40阳性细胞系的实例。
本文使用稳定的重组CHO[OX40]细胞。使用与上面描述的稳定的重组CHO[CD38]细胞系的方案类似的方案工程化携带编码人OX40的合成cDNA的重组CHO细胞系。
人CD20阳性细胞系
表达CD20抗原的人细胞已在PCT公开号：WO2010095031中描述。CD20+癌细胞的一个实例是Daudi癌细胞系(ATCC-LGL标准；目录号：CCL-213)，这些B淋巴母细胞癌细胞在补充有20％FBS和1％P/S；1％L-Glut；1％Na-Pyr和1％NEAA的RPMI 1640培养基(Sigma)中培养。将细胞在37℃下用5％CO2补充进行培养。
人EGFR阳性细胞系
表达EGFR抗原的人细胞已经在PCT公开号：WO2010108127中描述。EGFR+癌细胞的一个实例是HT-29癌细胞系(ATCC-LGL标准；目录号：HTB-38)，这些结直肠癌细胞在补充有10％FBS和1％P/S；1％L-Glut；1％Na-Pyr和1％NEAA的McCoy's 5A培养基(Sigma)中培养。将细胞在37℃下用5％CO2补充进行培养。
人CD19阳性细胞系
表达CD19抗原的人细胞已经在PCT公开号：WO2010/095031中描述。Namalwa(ATCC-LGL标准；目录号：CRL-1432)和Raji(ATCC-LGL标准；目录号：CCL-86)是人CD20阳性细胞系的实例。
人膜IgE阳性细胞系
PCT公开号：WO2010/033736第71页描述了通过加入白介素-4(IL-4)和抗CD40抗体将人PBMC类别转换成产生IgE的B细胞的方法。
重组靶抗原
人CD3γ-ε-Fc融合蛋白
通过26残基肽连接子(序列：GSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGS；SEQ ID NO：186)融合到人CD3ε胞外区(UniProt登录号：P07766，残基22-118(SEQ ID NO：185))的编码人CD3γ胞外区(UniProt登录号：P09693残基23-103(SEQ ID NO：184)；UniProt Consortium(2013)Nucleic Acids Res.,41(Database issue)：D43-7；Http：//www.uniprot.org/)的cDNA最先由GENEARTAG(德国雷根斯堡)合成。使用标准重叠PCR技术和也从Geneart AG获得的人IgG1Fc cDNA模板将该合成基因融合到人IgG1Fc部分。将所得的cDNA克隆在上面提到的修饰的pcDNA3.1质粒中。
为了瞬时表达CD3γ-ε-Fc蛋白(SEQ ID NO：187)，如上所述地使用聚乙烯亚胺(PEI)将重组载体转染到悬浮适应的HEK-EBNA细胞(ATCC-CRL-10852)内。然后使用重组的Streamline rProtein A media(GE医疗集团欧洲有限公司，格拉特布鲁，瑞士)从不含细胞的上清液纯化该CD3γ-ε-Fc构建体并将其用于进一步的分析。
人和食蟹猴CD3ε1-26_Fc融合蛋白
分别为人类和食蟹猴CD3ε胞外区域从得自Geneart AG的合成cDNA PCR扩增编码人CD3ε肽1-26(UniProt登录号：P07766，氨基酸23-48，SEQ ID NO：188)的cDNA和编码食蟹猴CD3ε肽1-26(UniProt登录号：Q95LI5，氨基酸22-47，SEQ ID NO：189)的cDNA。随后使用标准的重叠PCR技术将扩增产物融合至人IgG1Fc部分。从Geneart AG获得人IgG1Fc cDNA模板。在上述修饰的pcDNA3.1质粒中克隆所得的cDNA。
对于人和食蟹猴CD3ε构建体(分别为SEQ ID NO：190和191)的瞬时表达，如上所述地使用聚乙烯亚胺(PEI)将重组载体转染入悬浮适应的HEK-EBNA细胞(ATCC-CRL-10852)。然后使用重组的Streamline rProtein A media(GE医疗集团欧洲有限公司，格拉特布鲁，瑞士)从不含细胞的上清液纯化所述CD3ε融合构建体，并将其用于进一步的分析。这两种融合蛋白在本文中称为人类和食蟹猴CD3ε1-26_Fc融合蛋白。
人HER2胞外区
HER2可溶性胞外区的制备已在PCT公开号：WO2012131555中描述。制备融合到聚组氨酸标签(在本文中称为HER2-his)或融合到人IgG1Fc区(在本文中称为HER2-Fc)的人HER2可溶性胞外区。
人和食蟹猴CD38胞外区
从Source Biosciences得到人类CD38的cDNA(Erwin-Negelein-Haus，德国，目录号：IRAU37D11，4309086)，其胞外区(UniProt登录号：P28907残基43-300)被PCR扩增并克隆到衍生自pcDNA3.1(Invitrogen AG)的内部表达载体。该表达载体包括Kozak序列和起始密码子，之后是鼠VJ2C前导肽到5'端且6-His-标签到其多克隆位点的3'末端。融合到6-His-标签的人CD38的可溶性胞外区(SEQ ID NO：192)的表达和纯化如下：一个体积的包含HEK细胞，0.1％普朗尼克酸(Invitrogen AG)，表达载体和聚乙烯亚胺(Polyplus-转染，伊尔基希，法国)的RPMI 1640培养基(PAA实验室，目录号：E15-039)在摇瓶中在37℃，5％CO2和80％湿度下孵育。4小时后，将补充有6mM谷氨酰胺的一个体积的ExCell 293培养基加入到该混合物中并进一步继续孵育共5天。产生后，通过离心制备无细胞上清液并使用0.2μm过滤器过滤，使用Tris 1M pH8.7调整pH为7.4(4℃)。将Ni-SepharoseExcell珠(GE医疗集团，目录号：17-3712-03)加入到该溶液中并在4℃下搅拌孵育过夜。将溶液装载在Econo柱(Bio-Rad实验室公司，雷纳克，瑞士，目录号：737-4252)上，用于重力流纯化。在PBS(2x)，20mM咪唑中清洗珠粒并在PBS，500mM咪唑中洗脱蛋白。汇集洗脱流分，并在4℃下通过2个透析步骤用缓冲剂交换PBS。用0.22μm注射器过滤器过滤纯化的人CD38胞外区。
使用上述方法，克隆，表达和纯化融合至6-His-标签的食蟹猴CD38抗原的可溶性胞外区(SEQ ID NO：193)。
人OX40胞外区
制备人OX40的可溶性胞外区的方法已在PCT公开号：WO2013008171中描述。
人EGFR胞外区
EGFR可溶性胞外区抗原制备的一个实例已在PCT公开号：WO2012131555中描述。
体外T细胞重定向杀伤实验
外周血单个核细胞的制备
为了产生外周血单个核细胞(PBMC)，从瑞士拉绍德封的血液采集中心(Centre de Transfusion Sanguine et Laboratoire de Sérologie,rue Sophie-Mairet 29,CH-2300)收集包含人白细胞的血液过滤器。通过反冲洗用60ml的含10U/ml的肝素(liquemin)(Drossapharm AG，卢塞恩，瑞士)的PBS从过滤器除去细胞。然后根据制造商的说明用50ml血液分离过滤管(Brunschwig，巴塞尔，瑞士)纯化PBMC。管在室温下以800g离心20分钟(无制动)，并从接口收集细胞。用无FBS的Roswell Park Memorial Institute(RPMI，PAA实验室，帕兴，奥地利)培养基或磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞3次。将PBMC以10e6个细胞/ml重悬在RDL培养基(补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的RPMI)中，并在测定之前在37℃下在5％CO2培养箱中培养过夜。
制备T细胞
根据制造商的说明，使用pan-T细胞分离试剂盒II(Myltenyi生物技术有限公司，贝尔吉施格拉德巴赫，德国，目录号：130-091-156)在PBMC分离后直接进行T细胞纯化。纯化后，T细胞以10e6个细胞/mL在RDL培养基中重悬并在测定之前在37℃下在5％CO2培养箱中培养过夜。
测定读数
给出了非常类似的结果的两种不同的读数用于量化重定向杀伤。
流式细胞术方法，这里称为RDL-FACS方法，基于荧光流式细胞仪，如Schlereth B等人((2005)Cancer Res,65:2882-2889)，Moore PA等人((2011)Blood,117(17):4542-51)和Friedrich M等人((2012)Mol Cancer Ther,11:2664-2673)所述。收获靶细胞，计数，洗涤一次并在PBS+1μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Sigma)中以5x10e6个细胞/ml重悬。细胞在37℃下孵育15分钟，每5分钟轻轻搅动。CFSE装载细胞用RDL培养基洗涤3次，并以2x10e5个细胞/mL重悬在RDL培养基中。收获PBMC，计数，并在RDL培养基中以2x10e6个细胞/mL重悬。在RDL培养基中制备抗体系列稀释(3x溶液)。靶细胞(50μl/孔)，T细胞(50μl/孔)和3x抗体溶液(50μl/孔)分布在平底96孔板(TPP，Trasadingen，瑞士)中。效应子：靶比为10：1。将平板在5％CO2培养箱中在37℃下培养48小时。孵育后，该板以300g离心3分钟，将上清液通过轻弹板丢弃。将板用200μlPBS洗涤一次，再次离心并将PBS倒掉。加入Accutase(Invitrogen AG)的预温热溶液并在37℃下孵育平板10分钟。加入100μl的RDL培养基之后，通过上下抽吸重悬分离的贴壁细胞。将溶液转移到U型底96孔板(TPP)中。U型底平板以300g离心3分钟，将上清液弃去并且将细胞以1/40稀释重悬于补充有7-AAD(Becton Dickinson AG，阿尔施维尔，瑞士)的200μl的冷的FACS缓冲液(PBS+2％FBS+10％Versene)中。在Guava easyCyteTM流式细胞仪(Millipore AG，Zug，瑞士)上立即获取板。对于每个孔，使用软件(Miltenyi Biotec GmbH，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)通过CFSE阳性7ADD阴性种群上的圈门确定活的靶细胞的绝对数量。使用其中仅靶细胞作为基线被孵育的条件确定每个样品的的特异性细胞毒性的百分比。利用Prism软件(GraphPad软件，拉霍亚，CA，USA)使用非线性可变斜率回归法测定EC50值。通过从加入测试抗体的条件下的特异性细胞毒性的百分比减去无抗体的条件下的特异性细胞毒性的百分比计算特异性重定向裂解(RDL)的百分比。
细胞活力方法，这里称为RDL-MTS法，基于比色法评估细胞活力，如BühlerP等人((2008)Cancer Immunol Immunother,57:43–52,Labrijn AF et al.((2013)Pr℃Natl Acad Sci USA,110(13):5145-50)和PCT公开号：WO2012143524中描述。收获靶细胞，计数，洗涤一次并在RDL培养基中以2x10e5个细胞/ml重悬。收获PBMC，计数并在RDL培养基中以2x10e6个细胞/ml重悬。在RDL培养基中制备抗体系列稀释(3x溶液)。靶细胞(50μl/孔)，T细胞(50μl/孔)和3x抗体溶液(50μl/孔)分布在平底96孔板(TPP)中。效应子：靶比为10：1。将平板在5％CO2培养箱中在37℃下培养48小时。孵育后将上清液丢弃并用200μlPBS洗涤板三次以移除PBMC，然后将100μl的RDL培养基加入每个孔中。根据制造商的说明使用试剂盒(Promega AG，杜本多夫，瑞士)进行读数。简言之，将10-20μl的MTS试剂加入到每个孔中并将平板在37℃下在5％CO2培养箱中孵育2-6h。然后在BioTek协同板读数器(BioTek AG，卢塞恩，瑞士)上读出490nm吸光度。特异性杀伤的百分比的计算公式为：特异性杀伤＝100x[(SD-Sp)/(SD-MD)]。SD是在单独培养靶细胞的自发死亡条件下测定的吸光度。Sp是在每个测试条件下测定的吸光度(靶细胞+PBMC+抗体)。MD是在其中靶细胞通过3次冻融循环裂解的最大死亡条件下测定的吸光度。特异性重定向裂解(RDL)的百分比通过从加入测试抗体的条件下的特异性细胞毒性的百分比减去无抗体的条件下的特异性细胞毒性的百分比计算。使用具有Prism软件(GraphPad软件)的非线性可变斜率回归方法测定EC50值。
异种移植模型
JIMT-1异种移植
细胞系和试剂
从DSMZ获得乳腺癌JIMT-1细胞系(目录号：ACC589)。细胞保持在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)(AMIMED，伦敦，英国，目录号：Z10834P)，1％青霉素-链霉素(Invitrogen AG，目录号：10378-016)，1％丙酮酸钠溶液(PAA实验室，目录号：S11-003)，1％MEM非必需氨基酸(PAA实验室，目录号：M11-003)和1％GlutaMAXTM-1(Invitrogen AG，目录号：35050-038)的具有GlutaMAXTM-1(Invitrogen AG，目录号：31966-021)的DMEM(1X)中。用StemProAccutase(Invitrogen AG，目录号：A11105-01)每周分裂细胞两次。
从来自瑞士拉绍德封的血液采集中心(Centre de Transfusion Sanguine etLaboratoire de Sérologie,rue Sophie-Mairet 29,CH-2300)的包含人白细胞的血液过滤器收集外周血单个核细胞(PBMC)。通过反冲洗用60ml的含10U/ml的肝素(Drossapharm AG，卢塞恩，瑞士)的PBS从过滤器除去细胞。然后根据制造商的说明用50ml血液分离过滤管(Brunschwig，巴塞尔，瑞士)分离PBMC：管在室温下以800g离心20分钟(无制动)，并从接口收集细胞。用无FBS的Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI，Invitrogen AG，目录号：21875-091)洗涤细胞3次。将PBMC以10e6个细胞/ml重悬在补充有10％FBS(AMIMED)，1％青霉素-链霉素(Invitrogen AG)的RPMI培养基中，并在37℃下在5％CO2中培养过夜。收获靶细胞，计数，洗涤一次并以5x10e6个细胞/ml重悬在PBS中。
小鼠和实验条件
在特征为T细胞，B细胞和自然杀伤细胞缺陷的5周龄的免疫缺陷NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)雌性小鼠(Janvier实验室，StBerthevin，法国)中进行体内实验。在无菌和标准化环境条件下将小鼠供养在标准啮齿动物微隔离器笼中(20+/-1℃室温，50±10％相对湿度，12小时光照黑暗节奏)。小鼠接受辐照食品，床上用品和0.22μm过滤的饮用水。所有实验均根据瑞士动物保护法在负责州政府(纳沙泰尔州，瑞士)的允许下进行。根据动物保护法，当肿瘤体积超过2000mm3时小鼠不得不安乐死。通过ANOVA单因素和Bonferroni参数测试完成相应治疗组的平均肿瘤体积相对于空白对照组的平均肿瘤体积的统计分析。
所有小鼠在移植前用VEET霜(Reckitt Benckiser AG，沃尔利瑟伦，瑞士)在右侧腹进行脱毛。在移植的当天以及随后每周一次进行小鼠的拍照和体重测量。对于每只动物，5x10e6个人PBMC与5x10e6个JIMT-1乳腺癌细胞在终体积为0.2ml PBS中混合。四种不同的PBMC供体都包括在内。将PBMC/JIMT-1混合物皮下注射到每只NOD/SCID小鼠的右侧腹内。在终体积0.2ml PBS中具有5x10e6个JIMT-1乳腺癌细胞而没有任何人PBMC的对照组被纳入。对于每组10只JIMT-1/PBMC移植动物(每个PBMC供体一组)，移植后3小时后使用100μl体积以0.05mg/kg用HER2/CD3-1双特异性抗体静脉内处理五只动物。两周内，每隔一天、每周3次，重复处理。每周两次用游标卡尺以两个垂直维度测量肿瘤，并按下列公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝[(宽度2×长度)/2]。
实施例1：确定VH3亚类中的降低或废除与蛋白A的结合的突变。
废除免疫球蛋白恒定区中的蛋白A结合的方法是已知的(Lindhofer H.et al.,(1995)J Immunol,155(1):219-225；US6,551,592；Jendeberg L.et al.,(1997)JImmunol Methods,201(1):25-34；PCT公开号:WO2010151792)。为了评估蛋白A废除方法在全长同源二聚免疫球蛋白中的使用，制备基于混合的IGHG1-IGHG3Fc形式的抗HER2同源二聚免疫球蛋白和对应的Fc133对照片段。抗HER2同源二聚免疫球蛋白的格式化类似于天然存在的抗体并且由具有抗HER2特异性的FAB片段组成，所述FAB片段融合至Fc 133片段(来源于天然存在的人IGHG3同种型的Fc序列，其中铰链序列取代来自天然存在的人IGHG1同种型的整个铰链序列，简写为具有SEQ ID NO：1的Fc 133-其中名称中的编号对应于每个结构域的免疫球蛋白γ同种型亚类，顺序如下：铰链/CH2/CH3；相应的全长抗HER2免疫球蛋白在本文中称为抗HER2FAB-Fc 133；具有SEQ ID NO：2的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)。转染后，根据材料和方法部分中描述的方案通过梯度色谱测定抗HER2FAB-Fc 133同源二聚体和Fc 133片段的蛋白A结合。如图3和图4A所示，Fc 133片段不结合商业MabSelect SuReTM蛋白A树脂(GE医疗集团欧洲有限公司)而抗HER2FAB-Fc 133同源二聚体能够结合。
为了评估FAB恒定结构域的贡献，上述抗HER2同源二聚体被重新格式化为抗HER2scFv-Fc分子，其中所述scFv单元由通过15个氨基酸连接子融合的亲本免疫球蛋白可变域(本文中缩写为抗HER2scFv-Fc 133；具有SEQ ID NO：4的重链)组成。因此，所得抗HER2scFv-Fc 133同源二聚体与亲本抗HER2FAB-Fc 133同源二聚免疫球蛋白相同，但缺乏CH1和CK恒定结构域。如图4B所示，如用亲本抗HER2同源二聚免疫球蛋白观察到的，scFv-Fc 133同源二聚体表现出蛋白A结合。这个发现导致了这样的结论：抗HER2FAB片段的可变域是阻碍废除蛋白A结合的方法在同源二聚免疫球蛋白的Fc部分中的效力的原因。更重要的是，得出的结论是，同源二聚免疫球蛋白的可变域内的蛋白A结合将妨碍基于蛋白A差异纯化技术的异源二聚免疫球蛋白的制备。
已知蛋白A的所有五个结构域均结合来自VH3可变域亚类的可变重链结构域(Jansson B et al,(1998)FEMS Immunol.Med.Microbiol.,20(1):69-78)，这是众所周知的阻碍在整个抗体分子的木瓜蛋白酶消化之后制备基于VH3的FAB片段的特征-因为蛋白A结合基于VH3的FAB和Fc片段两者。在同源二聚抗HER2免疫球蛋白或其scFv-Fc版本中发现的重链可变域属于VH3-23亚类，并解释为什么这些同源二聚分子结合蛋白A，尽管在其工程化的Fc区域内不具有蛋白A结合位点。
基于VH3的免疫球蛋白或其片段对生物技术产业具有重大的意义。基于VH3的分子已被广泛地开发，因为它们结合蛋白A的能力有利于它们的功能预筛选，因此用于抗体发现的许多合成的或基于供体的噬菌体展示库或转基因动物技术是基于VH3结构域亚类的。此外基于VH3的分子通常由于他们的优于其它已知的重链可变域亚类的表达和稳定性而被选择。已经开发了不结合基于VH3的FAB片段的蛋白A的重组版本并且通过GE医疗集团以商标名称MabSelect SuReTM商业化。
由于本文将MabSelect SuReTM树脂用于上述两种同源二聚抗HER2免疫球蛋白的蛋白A结合评价，可以得出结论为MabSelect SuReTM树脂不适合用于使用蛋白A差异纯化技术制备具有至少一个VH3可变域的异源二聚免疫球蛋白-因为在其Fc区中不具有蛋白A结合的同源二聚物种将仍然通过其VH3结构域结合蛋白A。
为了调查将废除或减少基于VH3的同源二聚免疫球蛋白或其片段的蛋白A结合的取代，需要测定基于VH3的FAB变体的蛋白A结合。虽然已知MabSelectSuReTM树脂类型缺乏VH3结构域亚类结合，另一种被称为MabSelectTM的商业蛋白A树脂确实结合VH3结构域亚类(也来自GE医疗集团)并被选为用于分析基于VH3的FAB变体的蛋白A结合。
通过制备自前面所述的已知为是VH3-23可变域亚类的亲本抗HER2同源二聚免疫球蛋白衍生的重组抗HER2FAB片段(本文缩写为抗HER2FAB；具有SEQ ID NO：5的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)，并且测定装载到MabSelectTM和MabSelect SuReTM柱上的所述片段(具有基于VK亚类I的轻链，在MabSelectTM或者MabSelect SuReTM柱上实施蛋白A梯度色谱法之前首先利用蛋白L色谱法以捕获-洗脱模式纯化所述FAB片段，两种柱的方案均遵循材料和方法部分描述的方案)验证MabSelectTM树脂的使用。如图4C所示，基于VH3的抗HER2FAB仅结合到MabSelectTM柱，证实MabSelect SuReTM树脂缺乏与基于VH3的FAB片段的结合；至少就单体的基于VH3的FAB片段而言，并进一步与早先观察到的具有不与蛋白A结合的工程化Fc区的基于VH3的同源二聚免疫球蛋白的结果形成对比。相反地，抗HER2FAB表现出对MabSelectTM柱的强结合，其提供了测定将不具有或者具有减少的蛋白A结合的基于VH3的FAB变体的可能性。
为了废除基于VH3的FAB片段中的蛋白A结合，从与蛋白A的D结构域复合的人FAB片段的晶体结构鉴定VH3结构域中的关键蛋白A结合残基(PDB代码：1DEE；www.pdb.org；Graille M等，Graille M et al.,(2000)Pr℃.Natl.Acad.Sci.USA 97(10):5399-5404)。这种分析被用作合理设计的起始点，其中所进行的取代的性质是基于人起源的蛋白A结合和非蛋白A结合的VH亚类之间的序列比较。图5示出对于每个人重链可变域亚类的一个代表性框架的比对。氨基酸位置15，17，19，57，59，64，65，66，68，70，81，82A，和82b(Kabat编号)被确定为1DEE结构中的蛋白A的D结构域和基于VH3的FAB片段之间的蛋白质-蛋白质相互作用界面的一部分。在人VH亚类中，VH3是结合蛋白A的唯一亚类，选择其他亚类中的等同氨基酸序列位置处的残基作为意在废除或者减少蛋白A结合同时具有潜在地降低的免疫原性的取代源-因为这些取代涉及一个残基用另一个在非蛋白A结合的人VH亚类中发现的相同的等同氨基酸位置处的天然存在的残基的替换。
通过基于标准PCR的突变技术，在前述抗HER2FAB片段的序列中引入突变，进行以下取代：G65S(具有SEQ ID NO：6的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)，R66Q(具有SEQ ID NO：7的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)，T68V(具有SEQ ID NO：8的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)，Q81E(具有SEQ ID NO：9的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)，N82aS(具有SEQ IDNO：10的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)，以及组合R19G/T57A/Y59A(具有SEQ ID NO：11的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)。
此外，进行T57A取代(具有SEQ ID NO：12的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)，和T57E取代(具有SEQ ID NO：13的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)。先前在WO2010075548T57中显示T57A废除蛋白A结合，并设计T57E以引入可以干扰VH3-蛋白A交互的带电荷的残基。具有基于VK亚族I的轻链，FAB突变体首先以捕获-洗脱模式使用蛋白L色谱法进行纯化，并如材料和方法部分中描述的利用梯度模式下操作的MabSelectTM柱进一步测定其蛋白A结合。图6示出只有T57A，T57E，G65S，Q81E，N82aS和组合R19G/T57A/Y59A废除或降低抗HER2FAB与MabSelectTM树脂的结合。当废除基于VH3的FAB片段中的蛋白A结合时，优选取代G65S，Q81E和N82aS，因为这些突变取代非蛋白A结合的VH亚类中发现的序列等同残基从而潜在地降低免疫原性。
抗体亲和性和特异性基本上局限在CDR区，但是，构架取代可能影响抗体特性，如在若干人源化抗体的实例中所示。为了评估上述取代是否可能影响VH3衍生的抗体的特异性和/或亲和性，通过表面等离子体共振(SPR)测定两个优选的FAB突变体与HER2抗原的结合。如在材料和方法部分中描述的进行重组HER2抗原的SPR测定。与原来的FAB分子相比，两个优选的突变体均显示对HER2抗原的相同结合(图7)，表明该取代在特异性或亲和性方面没有影响。因此可以预料，这些取代可以被广泛地用于设计出VH3衍生的抗体分子中的蛋白A结合而不会显著地损失抗原结合。
这些优选的取代中的两个被引入如上所述的抗HER2同源二聚免疫球蛋白和抗HER2scFv-Fc分子中，并且测定变体对MabSelect SuReTM树脂的结合。制备下面的变体：抗HER2scFv(G65S)-Fc 133(具有SEQ ID NO：14的重链)，抗HER2scFv(N82aS)-Fc 133(具有SEQ ID NO：15的重链)，抗HER2FAB(G65S)-Fc 133(具有SEQ ID NO：16的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)，和抗HER2FAB(N82aS)-Fc 133(具有SEQ ID NO：17的重链和具有SEQ IDNO：3的轻链)。
图8示出所有四个突变体的MabSelect SuReTM色谱曲线。所有的变体现在显示与MabSelectTM柱的结合减少至几乎没有，表明用先前确定的取代成功去除蛋白A结合。更重要的是，可以得出结论，当与蛋白A差异纯化技术组合时，废除或者减少基于VH3的FAB对蛋白A的亲和性的取代将允许其中存在至少一个VH3可变域的异源二聚免疫球蛋白的制备。
实施例2：靶向人CD3抗原，肿瘤相关抗原和炎性细胞表面抗原的抗原结合
位点
针对人CD3抗原的抗原结合位点
选择人CD3ε亚基以经由双特异性接合驱动T细胞重定向杀伤。
小鼠OKT3抗体的人源化变体
这里所使用的抗人CD3ε抗原结合位点衍生自小鼠OKT3抗体(莫罗单抗CD3，商品名Orth℃lone OKT3，由Janssen-Cilag销售并随后中止；具有分别为SEQ ID NO：18和19的鼠可变重链和轻链结构域)。OKT3鼠可变结构域是人源化的并格式化为scFv和FAB片段。
按照Jung S&Plückthun A(1997,Protein Eng,10(8):959-66)记载的方法人源化以产生高度稳定的人源化变体，其将适合于FAB和scFv格式化。该方法利用在抗体(rhuMAbHER2，huMAb4D5-8，曲妥单抗或商品名美国专利公开号：5,821,337；分别具有SEQ ID NO：20和21的可变重链和轻链结构域)中发现的高度稳定的VH/VL结构域对并遵循到固定框架上的人源化过程的工作流程(Almagro JC&Fransson J(2008),Front Biosci,13:1619-33)。由于抗体最初从种系框架VH3和VK1的高度稳定的人类家族衍生，来自这两个家族的种系框架可同样地用作固定框架的来源。可选地，人VK3种系轻链框架家族由于也具有良好的稳定性性质因此可以用于代替VK1(Ewert S et al.,(2003)J Mol Biol,325:531-553)。除了小鼠抗体，人抗体可以使用这个固定框架方法来工程化以提高稳定性。优选利用分别具有SEQ ID NO：22，23和24的人种系框架IGHV3-23*04，IGKV1-39*01和IGKV3-20*01(根据引用(国际免疫遗传学信息系统(Lefranc MP et al.(1999)Nucleic AcidsRes,27(1):209-12；Ruiz M et al.(2000)Nucleic Acids Res,28(1):219-21；LefrancMP(2001)Nucleic Acids Res,29(1):207-9；Lefranc MP(2003)Nucleic Acids Res,31(1):307-10；Lefranc MP et al.,(2005)Dev Comp Immunol,29(3):185-203；KaasQ et al.,(2007)Briefings in Functional Genomics&Proteomics,6(4):253-64；http://www.imgt.org)。
为了这个目标，构建第一人源化抗体，其中在抗体的可变域中的CDR分别被来自小鼠OKT3抗体的CDR替换并与小鼠OKT3抗体的嵌合体(可变重链和轻链SEQ ID NO：25和26，并在此称为嵌合型OKT3抗体)进行比较。
原型抗体(可变重链和轻链SEQ ID NO：27和39，并缩写为VH/VL)在瞬时表达试验中具有增加的生产水平以及通过差示扫描量热法测定的增加的FAB稳定性，但不结合HPB-ALL细胞(在FACS实验中由平均荧光强度评估，参见材料和方法部分)，人CD3ε阳性T细胞肿瘤系(图9A)。
基于第一原型可变域对的3D模型，选定和测试回复突变的子集(从CDR移植的原型到小鼠OKT3序列)：可变重链结构域中的I34M，V48I，A49G，R58N，R58Y，I69L，A71T和T73K以及可变轻链中的M4L，V33M，A34N，L46R，L47W，R66G，F71Y和P96F(Kabat编号)。注意，R58N取代对应于CDR移植的原型到小鼠OKT3突变而R58Y取代对应于CDR移植的原型到人IGHV3-23*04种系取代。关于取代的组合的工程化策略是基于不同的取代在它们对CDR区和/或可变域包装(variable domainpacking)和/或免疫原性的假定影响方面的互补性。
在第一种方法中，将所有候选物格式化为人IgG1抗体。根据表达水平，FAB片段热稳定性以及通过FACS检测的结合HPB-ALL细胞的能力选择最佳变体。最佳人源化变体具有使用G65S或N82aS取代废除的在它们的VH结构域内存在的蛋白A结合位点。需要该工程化步骤以进一步生产不含有抗CD3同源二聚体的安全T细胞重定向BEAT抗体。
VH中的回复突变：I34M，A49G和A71T以及VL中的回复突变：M4L，L46R，L47W和F71Y恢复亲和性。可变域的最佳组合是VH8/VL4，VH8/VL8，VH11/VL4和VH11/VL8，因为这些保留了大部分的亲本细胞结合(图9A-C)。此外，组合VH8/VL8(分别具有SEQ ID NO：48和51的可变域)和VH11/VL8(分别具有SEQ ID NO：49和51的可变域)具有增强的FAB稳定性和(分别+2.8℃和+1.6℃，图9D)。
最后，最佳人源化的变体也被重新格式化为scFv-Fc融合物并瞬时表达。该形式的变体按照它们在瞬时转染中的相对亲和性，稳定性，表达水平进行排列(图9E)。scFv-Fc融合形式的可变域的最佳组合类似于抗体形式中所确定的组合：VH8-VL4(具有SEQ ID NO：58的scFv片段)和VH8-VL8(具有SEQ IDNO：59的scFv片段)。具有scFv-Fc融合形式的这两个scFv片段热稳定性好(图9F)。
小鼠SP34抗体的人源化变体
小鼠抗体SP34在1985年(Pessano S et al.,(1985)EMBO J,4(2):337-44)首次描述。它是通过从小鼠得到的杂交瘤产生，所述小鼠用来自HPB-ALL细胞的变性蛋白质提取物免疫，该抗体具有人特异性以及与食蟹猴的交叉反应性。人和食蟹猴CD3ε亚基上的SP34表位是已知的。
按照本实施例上文所述的方法和工作流程，将具有SEQ ID NO：60VH结构域和SEQ ID NO：61VL结构域的鼠SP34抗体的人源化的VH和VL结构域通过CDR移植分别工程化到VH3-23和VK3种系框架上。所得到的基于VH3的可变域可以取决于它们在BEAT抗体形式中的用途使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步废除蛋白A结合。
为了这个目标，构建第一人源化抗体，其中具有种系VH3重链结构域和种系VK3轻链结构域的人抗体的可变域中的CDR分别由来自小鼠SP34抗体的CDR替换。所得的人源化抗体用于进一步的亲和性改善的起点并且与SP34抗体的嵌合体(分别为SEQ ID NO：62和63的重链和轻链，并且在此称为嵌合SP34抗体)进行比较。
原型抗体(具有SEQ ID NO：64和69的可变重链和轻链，且缩写为VH1/VL1)具有与人CD3ε1-26_Fc融合蛋白的低结合(通过SPR评估，参见材料和方法部分和图10A)。
基于第一原型可变域对的3D模型，选择对应于CDR移植的人种系VH3/VK3原型和小鼠SP34序列之间的任一回复突变的取代的子集(人到鼠或鼠到人取代)或合理设计的氨基酸改变。以各种组合进行下列改变并测试：在可变重链结构域中的W100eF和W100eY和可变轻链中的A2I，S25A，T27A，G27aA，V27cA，T28A，T29A，S30A，N31A，Y32A，E38Q，F44P，G46L，T51A，N52A，K53A，R54A，P56A，L66G，D69T，F87Y，Q89A，W91F，Y92A，S93A，N94A和Q100G(Kabat编号；参见图10A)。关于取代的组合的工程化策略是基于不同的取代在它们对CDR区和/或可变域包装和/或免疫原性和/或对在哺乳动物细胞中的瞬时表达的影响的假定影响方面的互补性。
在第一种方法中，将所有候选物格式化为人IgG1抗体并随后进一步以scFv-Fc融合蛋白形式测试(图10B)，其中一些变体具有使用G65S废除的、存在于它们的VH结构域内的蛋白A结合位点。根据表达水平以及通过SPR结合人和食蟹猴的CD3ε1-26_Fc融合蛋白的能力选择最佳人源化候选物。
关于抗原结合和重组表达，重链和轻链可变域的优选组合如下：与轻链结构域VL21(SEQ ID NO：105)和VL32(SEQ ID NO：106)配对的VH1(SEQID NO：101)或VH2(SEQ ID NO：102)或VH3(SEQ ID NO：103)或VH5(SEQ ID NO：104)。
HER2
可重定向T细胞以杀伤HER2阳性癌细胞的双特异性抗体可用于治疗不同形式的人乳腺癌。抗HER2抗体已被描述(Blumenthal GM et al.,(2013)ClinCancer Res,19(18):4911-6)并且目前一些用于临床或目前正在进行针对人类的临床研究(Tsang RY&Finn RS(2012)Br J Cancer,106(1):6-13)。
如本文所使用的抗HER2抗原结合位点源自格式化为FAB片段(具有SEQID NO：5的FAB重链片段和轻链SEQ ID NO：3)或scFv片段(SEQ ID NO：107)的重组人源化抗HER2抗体(参见1.1节)。在一些形式中，使用G65S取代(具有重链SEQ ID NO：108和轻链SEQ ID NO：3的FAB片段或具有SEQ ID NO：109的scFv片段)或N82aS取代(具有SEQ ID NO：110重链和轻链SEQ ID NO：3的FAB片段或具有SEQ ID NO：111的scFv片段)废除存在于人源化抗HER2抗体4D5的VH结构域(VH3结构域亚类)中的蛋白A结合。
CD38
CD38是通常在造血细胞和实体组织中发现的一种II型跨膜糖蛋白。CD38也在各种恶性血液病中表达。将重定向T细胞以杀伤CD38阳性癌细胞的双特异性抗体将用于治疗各种恶性血液疾病，包括多发性骨髓瘤，B细胞慢性淋巴细胞性白血病，B细胞急性淋巴细胞性白血病，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，原发性全身性淀粉样变，套细胞淋巴瘤，幼淋巴细胞/髓细胞性白血病(pro-lymphocytic/myelocytic leukaemia)，急性髓性白血病，慢性粒细胞白血病，滤泡性淋巴瘤，NK细胞白血病和血浆细胞白血病。若干抗-CD38抗体已经被描述为研究试剂或治疗候选物(PCT公开号：WO2006099875)。其中最佳表征的抗人CD38抗体是OKT-10和HB-7小鼠杂交瘤(Hoshino S et al.,(1997)J Immunol,158(2):741-7)。
在第一种方法中，抗人CD38抗原结合位点可以源自可进一步格式化为FAB或scFv片段的小鼠杂交瘤OKT10(序列分别为SEQ ID NO：112和113的可变重链和轻链)或HB-7(序列分别为SEQ ID NO：114和115的可变重链和轻链)及其人源化版本。根据实施例2.1中描述的方法和工作流程，HB-7杂交瘤的人源化VH和VL结构域可以经由CDR移植分别工程化到VH3-23和VK1种系框架上。
在第二种方法中，按照由Almagro JC&Fransson(Front Biosci,(2008)13:1619-33)描述的所谓的最佳拟合人源化方法，HB-7杂交瘤的最佳拟合的人源化VH和VL结构域通过CDR移植分别工程化到人IGHV4-59*03和IGKV1-NL1*01种系框架上(根据引用，同上)。经由电脑模拟(in silico)研究具有不同程度的回复突变的人源化VH和VL变体并且人源化VH和VL的一个优选的选择经瞬时表达为人IgG1格式且在此称为人源化的HB-7最佳拟合VH(SEQID NO：116)和VL(SEQ ID NO：117)结构域。引入下面的小鼠回复突变：(VH)S35H，I37V，I48L，V67L，V71K，T73N，F78V，Y91F和(VL)：M4L，L48I，Y49S，T69K(Kabat编号)。
人源化的HB-7最佳拟合抗体(重链SEQ ID NO：118和轻链SEQ ID NO：119)通过FACS染色CHO[CD38]重组细胞(数据未显示)。当通过SPR(KD分别为3.6和2.5nM；图11A(嵌合)和图11B(人源化))测定时，人源化的HB-7最佳拟合抗体对CD38胞外区的结合亲和性类似于嵌合HB-7抗体的结合亲和性(重链SEQ ID NO 120和轻链SEQ ID NO：121)。出人意料的是，人源化的HB-7最佳拟合抗体显示出比嵌合HB-7抗体显著增强(+14.6℃)的FAB片段稳定性，如从量热曲线判断的(76.4℃(嵌合)对91.0℃(人源化)，图11F)。
在第三种方法中，用人CD38胞外结构域和人CD38+细胞免疫的小鼠用于产生针对人CD38的新颖的杂交瘤候选物。生成杂交瘤的方法是已知的并且本文所使用的方法类似于在PCT公开号：WO2013008171中公开的方法。9G7小鼠抗体候选物具有对人类和食蟹猴CD38(序列分别为SEQ ID NO：122和123的可变重链和轻链)的高亲和性。根据本实施例上文所述的方法，首先人源化该小鼠抗体。使用最佳拟合方法，选择种系V H框架IGHV2-5*09和VK框架IGKV1-33*01(根据引用，同上)为人源化过程的起点。CDR移植之后，第一抗体原型(格式化为人IgG1同种型，重链SEQ ID NO：124和轻链SEQID NO：125)显示出仅比小鼠亲本抗体低三倍的对人CD38的强结合，如通过SPR判断的(具有重链SEQ ID NO：126和轻链SEQ ID NO：127的嵌合9G7抗体；对于嵌合9G7抗体(数据未显示)和第一人源化原型(数据未示出)KD分别为0.3nM和1nM)。在抗体的可变轻链中引入F36Y回复突变(Kabat编号)时亲和性提高两倍(所得到的抗体在本文中被称为具有重链SEQ ID NO：124和轻链SEQ ID NO：128的人源化9G7最佳拟合抗体；对于人CD38的KD为0.5nM，图11C)。人源化9G7最佳拟合抗体也显示出对食蟹猴CD38抗原的高亲和性(KD为3.2nM，数据未显示)，优于嵌合9G7抗体的增强的FAB热稳定性(来自DSC扫描的FAB Tm)(对于人源化9G7最佳拟合抗体和嵌合9G7抗体分别为94℃对82.2℃；参见图11G)。人源化9G7最佳拟合抗体具有SEQ IDNO：129重链可变域和SEQ ID NO：130轻链可变域。
另外，根据最佳框架方法通过CDR移植将9G7小鼠抗体人源化到VH3-23和VK1种系框架上。经由电脑模拟(in silico)研究具有不同程度的回复突变的人源化VH和VL变体并且人源化VH和VL组合的一个优选的选择经瞬时表达为人IgG1抗体(所得到的抗体在此称为具有重链SEQ ID NO:131和轻链SEQ IDNO:132的人源化9G7最佳框架抗体)。引入下面的小鼠回复突变：(VH)A24F，V37I，V48L，S49A，F67L，R71K，N73T，L78V及K94R和(VL)F36Y(Kabat编号)。该抗体表现出对人CD38和食蟹猴CD38的强结合，其亲和常数类似于人源化9G7最佳拟合抗体的亲和常数(对于人和食蟹猴CD38，KD分别为0.4和1nM；图11D)。FAB热稳定性(来自DSC扫描的FAB Tm)也非常类似于9G7最佳拟合F36Y人源化变体的FAB热稳定性(89.2℃，参见图11H)。图11J汇总了上述不同的人源化9G7抗体。人源化9G7最佳框架抗体具有SEQ ID NO：133的重链可变域和SEQ ID NO：134的轻链可变域。
在第四种方法中，筛选抗体噬菌体库以产生针对人CD38的额外的scFv片段。该库具有基于天然存在的人V基因的多样性。该供体来源的抗体噬菌体展示库使用从源自48个人类供体的血淋巴细胞扩增的cDNA，所述48个人类供体中的70％具有自身免疫性疾病(血管炎，系统性红斑狼疮，椎关节病(spondiloarthropathy)，类风湿关节炎和硬皮病)。库构建根据Schofield等人描述的方案(2007,Genome Biol.,8(11):R254)，具有2.53x10e10个克隆的总多样性。从该供体衍生的噬菌体展示库如下地分离识别人和/或食蟹猴CD38的ScFv片段。在对重组衍生的人和/或食蟹猴CD38抗原的一系列重复选择循环中分离ScFv片段(参见材料和方法部分)。筛选抗体噬菌体展示库的方法是已知的(VitiF et al.,(2000)Methods Enzymol,326:480-505)。简要地说，在用库孵育之后，先前已涂布在塑料免疫管上(以20μg/ml的浓度在PBS中过夜)，或捕获在链霉亲和素珠粒上(当使用抗原的生物素标记形式时，在整个选择过程中抗原以50nM的浓度捕获)的固定化的抗原结合的噬菌体被回收而未结合的噬菌体被洗掉。如Marks等人(Marks JD et al.,(1991)J Mol Biol,222(3):581-97)所描述地解救结合的噬菌体并重复选择过程三次。来自第二和第三轮淘选的超过一千个的克隆被表达并通过ELISA针对人和食蟹猴CD38抗原进行分析。对阳性克隆进行DNA测序并且一些独特的克隆进一步分析其结合表达人CD38的细胞系的能力。在对固定在链酶亲和素珠上的人CD38抗原的生物素标记版本进行第一轮淘选以及对固定在链酶亲和素珠上的食蟹猴CD38抗原的生物素标记版本进行第二轮淘选之后，具有可变重链序列SEQ ID NO：135和可变轻链SEQ ID NO：136的一种优选的scFv片段(克隆号767)由于其结合人类和食蟹猴CD38的能力而被选择。当格式化为人IgG1抗体时，克隆767具有对于人CD38的约300nM的KD(图11E)和对于食蟹猴CD38的约1.2μm的KD(数据未示出)(在本文中将克隆767IgG1抗体称为具有重链SEQ ID NO：137和轻链SEQ ID NO：138的人767抗体)。FAB热稳定性(来自DSC扫描的FAB Tm)是70.2℃(图11I)。克隆767VH结构域属于VH3结构域亚类。
OX40
靶向CD3和OX40的双特异性抗体将允许激活的T淋巴细胞的靶向和消耗。在这样的组合中，同时表达CD3和OX40分子的活化的T淋巴细胞将接合到导致细胞快速消失的相互杀伤过程。通过双特异性抗体共接合人CD3和OX40可以在较短的时间范围内达到致病性T细胞的有效消除。OX40是受体的TNFR超家族的成员，并在1987年被首次鉴定为在来自大鼠的活化的CD4+T细胞上表达的50kDa糖蛋白(Paterson DJ et al.,(1987)Mol.Immunol.24:1281-90)。不同于CD28，OX40不在幼稚T细胞上组成性表达，但在T细胞受体(TCR)接合后诱导。OX40是第二辅刺激分子，在活化后24至72小时之后表达；其配体，OX40L，也不在静息抗原呈递细胞上表达，但在它们的活化之后表达。
在PCT公开号：WO2013008171中公开的小鼠抗人OX40抗体(分别具有SEQ ID NO：139和140的重链和轻链结构域)可用作抗人OX40抗原结合位点的来源。基于最佳拟合人源化方法的该抗体的人源化版本也描述于PCT公开号：WO2013008171中(分别具有SEQ ID NO：141和142的重链和轻链结构域，并且两种抗体都可修改，以重新格式化成BEAT格式。
根据实施例2.1中描述的方法和工作流程，通过CDR移植将抗人OX40杂交瘤的人源化VH和VL结构域分别工程化到VH3-23和VK1种系框架上。使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步废除所得到的基于VH3的可变域的蛋白A结合，取决于它们在BEAT抗体格式中的用途。仅研究了两个人源化VH和VL结构域，其不同在于它们的回复突变的程度不同。从亲本抗体可变域和CDR移植的VH3和VK1之间的序列比对识别回复突变，类似于实施例2.1中描述的第一原型抗体和方法。这些CDR移植的可变域无回复突变并且在本文中被称为最小移植(mingraft)。然后进一步修饰这些序列以包括从先前的比对识别的所有回复突变并导致在本文中称为最大移植(maxgraft)的经修饰的可变域序列。所得的序列汇总如下：
无回复突变的人源化和稳定化的抗OX40VH；简称为人源化的抗OX40/最小移植VH(SEQ ID NO：278)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定化的抗OX40VH；简称为人源化的抗OX40/最大移植VH(SEQ ID NO：279)。
无回复突变的人源化和稳定化的抗OX40VL；简称为人源化的抗OX40/最小移植VL(SEQ ID NO：280)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定化的抗OX40VL；简称为人源化的抗OX40/最大移植VL(SEQ ID NO：281)。
CD20
将重定向T细胞以杀伤表达CD20的B细胞的双特异性抗体可用于治疗不同形式的人淋巴瘤癌症。若干抗人CD20抗体已被描述为研究试剂或治疗候选物。其中最佳表征的抗人CD20抗体是嵌合利妥昔单抗抗体和其人源化变体(嵌合利妥昔单抗抗体，商品名PCT公开号：WO1994011026；具有SEQID NO：143的小鼠VH结构域和具有SEQ ID VL：144的VL结构域)。
根据实施例2.1中描述的方法和工作流程，通过CDR移植将利妥昔单抗嵌合抗体的人源化VH和VL结构域分别工程化到VH3-23和VK1种系框架上。使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步废除所得到的基于VH3的可变域的蛋白A结合，取决于它们在BEAT抗体格式中的用途。仅研究了两个人源化VH和VL结构域，其不同在于它们的回复突变的程度不同。从亲本抗体可变域和CDR移植的VH3和VK1之间的序列比对识别回复突变，类似于实施例2.1中描述的第一原型抗体和方法。这些CDR移植的可变域无回复突变并且在本文中被称为最小移植。然后进一步修饰这些序列以包括从先前的比对识别的所有回复突变并导致在本文中称为最大移植(maxgraft)的经修饰的可变域序列。所得的序列汇总如下：
无回复突变的人源化和稳定化的利妥昔单抗VH；简称为人源化的利妥昔单抗/最小移植VH(SEQ ID NO：282)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定化的利妥昔单抗VH；简称为人源化的利妥昔单抗/最大移植VH(SEQ ID NO：283)。
无回复突变的人源化和稳定化的利妥昔单抗VL；简称为人源化的利妥昔单抗/最小移植VL(SEQ ID NO：284)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定化的利妥昔单抗VL；简称为人源化的利妥昔单抗/最大移植VL(SEQ ID NO：285)。
EGFR
将重定向T细胞以杀伤EGFR阳性癌细胞的双特异性抗体可用于治疗不同形式的人类癌症，优选人类胰腺癌和人类结肠癌。若干抗人类EGFR抗体已被描述为研究试剂或治疗候选物。其中最佳表征的抗人类EGFR抗体是西妥昔单抗嵌合抗体和其人源化变体。(西妥昔单抗嵌合抗体，商品名C225，IMC-C225；PCT公开号：WO199640210；具有SEQ ID NO：145的小鼠VH结构域和具有SEQ ID NO：146的小鼠VL结构域)。
根据实施例2.1中描述的方法和工作流程，通过CDR移植将嵌合抗体的人源化VH和VL结构域分别工程化到VH3-23和VK1种系框架上。使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步废除所得到的基于VH3的可变域的蛋白A结合，取决于它们在BEAT抗体格式中的用途。仅研究了两个人源化VH和VL结构域，其不同在于它们的回复突变的程度不同。从亲本抗体可变域和CDR移植的VH3和VK1之间的序列比对识别回复突变，类似于实施例2.1中描述的第一原型抗体和方法。这些CDR移植的可变域无回复突变并且在本文中被称为最小移植。然后进一步修饰这些序列以包括从先前的比对识别的所有回复突变并导致在本文中称为最大移植的经修饰的可变域序列。所得的序列汇总如下：
无回复突变的人源化和稳定化的Erbitux VH；简称为人源化的Erbitux/最小移植VH(SEQ ID NO：286)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定化的Erbitux VH；简称为人源化的Erbitux/最大移植VH(SEQ ID NO：287)。
无回复突变的人源化和稳定化的Erbitux VL；简称为人源化的Erbitux/最小移植VL(SEQ ID NO：288)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定化的Erbitux VL；简称为人源化的Erbitux/最大移植VL(SEQ ID NO：289)。
另一个充分表征的抗人类EGFR抗体是人帕尼单抗抗体及其人源化变体(人类帕尼单抗抗体，商品名PCT公开号：WO2012138997；具有SEQ IDNO：290的小鼠VH结构域和具有SEQ ID NO：291的小鼠VL结构域)。
根据实施例2.1中描述的方法和工作流程，通过CDR移植将嵌合抗体的人源化VH和VL结构域分别工程化到VH3-23和VK1种系框架上。使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步废除所得到的基于VH3的可变域的蛋白A结合，取决于它们在BEAT抗体格式中的用途。仅研究了两个人源化VH和VL结构域，其不同在于它们的回复突变的程度不同。从亲本抗体可变域和CDR移植的VH3和VK1之间的序列比对识别回复突变，类似于实施例2.1中描述的第一原型抗体和方法。这些CDR移植的可变域无回复突变并且在本文中被称为最小移植。然后进一步修饰这些序列以包括从先前的比对识别的所有回复突变并导致在本文中称为最大移植的经修饰的可变域序列。所得的序列汇总如下：
无回复突变的人源化和稳定化的Vectibix VH；简称为人源化的Vectibix/最小移植VH(SEQ ID NO：292)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定化的Vectibix VH；简称为人源化的Vectibix/最大移植VH(SEQ ID NO：293)。
无回复突变的人源化和稳定化的Vectibix VL；简称为人源化的Vectibix/最小移植VL(SEQ ID NO：294)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定化的Vectibix VL；简称为人源化的Vectibix/最大移植VL(SEQ ID NO：295)。
CD19
将重定向T细胞以杀伤表达CD19的B细胞的双特异性抗体可用于治疗不同形式的人类血液和骨髓癌症。人CD19分子是在人B细胞的表面上表达的结构独特的细胞表面受体，包括但不限于，前B细胞，早期发育期间的B细胞(即，未成熟的B细胞)，通过终端分化成浆细胞的成熟B细胞和恶性B细胞。CD19由多数前B急性淋巴细胞白血病(ALL)，非何杰金氏淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)，幼淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，常见的急性淋巴细胞白血病和一些Null-急性淋巴细胞白血病表达(Nadler LM et al.(1983)J Immunol,131:244-250；Anderson KC et al.,(1984)Blood,63:1424-1433；Loken MR et al.(1987)Blood,70:1316-1324；Uckun FM et al.(1988)Blood,71:13-29；Scheuermann RH&Racila E(1995)Leuk Lymphoma,18:385-397)。CD19在浆细胞上的表达进一步表明它可在分化的B细胞瘤如多发性骨髓瘤，浆细胞瘤，瓦尔登斯特肿瘤上表达(Grossbard ML et al.(1998)Br J Haematol,102:509-15；Treon SP et al.(2003)Semin Oncol,30:248-52)。
在PCT公开号：WO2010/095031中描述的人源化抗人CD19抗体利用VH3-23和VK1可变域框架并且可用于生产如实施例2.1中所述的双特异性抗体。使用具有VH结构域SEQ ID NO：296和VL结构域SEQ ID NO：297的人源化抗人CD19抗体并根据其在BEAT抗体格式中的用途使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步废除其对蛋白A的结合。
IgE
将重定向T细胞以杀伤膜结合IgE阳性B细胞的双特异性抗体可用于治疗不同的炎性疾病如哮喘或纤维化。若干抗人IgE抗体已被描述为研究试剂或治疗候选物。其中最佳表征的抗人IgE抗体是奥马珠单抗抗体(商品名USPTO公开号：US6,761,889，US6,329,509和US20080003218A1；Presta LG etal.,(1993)J lmmunol,151:2623-2632；具有SEQ ID NO：298的人源化VH结构域和具有SEQ ID NO：299的VL结构域)以及它的变体。
根据实施例2.1中描述的方法和工作流程，通过CDR移植将奥马珠单抗抗体的人源化VH和VL结构域分别工程化到VH3-23和VK1种系框架上。使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步废除所得到的基于VH3的可变域的蛋白A结合，取决于它们在BEAT抗体格式中的用途。研究了两个稳定化的VH和VL结构域，其不同在于它们的回复突变的程度不同。从亲本抗体可变域和CDR移植的VH3和VK1之间的序列比对识别回复突变，类似于实施例2.1中描述的第一原型抗体和方法。这些CDR移植的可变域无回复突变并且在本文中被称为最小移植。然后进一步修饰这些序列以包括从先前的比对识别的所有回复突变并导致在本文中称为最大移植的经修饰的可变域序列。所得的序列汇总如下：
无回复突变的稳定化的奥马珠单抗VH；简写为稳定化的奥马珠单抗/最小移植VH(SEQ ID NO：300)。
具有所有可能的回复突变的稳定的奥马珠单抗VH；简写为稳定化的奥马珠单抗/最大移植VH(SEQ ID NO：301)。
无回复突变的稳定化的奥马珠单抗VL；简写为稳定化的奥马珠单抗/最小移植VL(SEQ ID NO：302)。
具有所有可能的回复突变的稳定化的奥马珠单抗VL；简写为稳定化的奥马珠单抗/最大移植VL(SEQ ID NO：303)。
抗人IgE抗体的另一个实例是小鼠抗体Bsw17(Vogel M et al.,(2004)J MolBiol,341(2):477-89；具有SEQ ID NO：304的小鼠VH结构域和具有SEQ ID NO：305的小鼠VL结构域)。
根据实施例2.1中描述的方法和工作流程，通过CDR移植将人源化Bsw17抗体的人源化VH和VL结构域分别工程化到VH3-23和VK1种系框架上。使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步废除所得到的基于VH3的可变域的蛋白A结合，取决于它们在BEAT抗体格式中的用途。研究了两个稳定化的VH和VL结构域，其不同在于它们的回复突变的程度不同。从亲本抗体可变域和CDR移植的VH3和VK1之间的序列比对识别回复突变，类似于实施例2.1中描述的第一原型抗体和方法。这些CDR移植的可变域无回复突变并且在本文中被称为最小移植。然后进一步修饰这些序列以包括从先前的比对识别的所有回复突变并导致在本文中称为最大移植的经修饰的可变域序列。所得的序列汇总如下：
无回复突变的稳定化的Bsw17VH；简写为稳定化的Bsw17/最小移植VH(SEQ ID NO：306)。
具有所有可能的回复突变的稳定化的Bsw17VH；简写为稳定化的Bsw17/最大移植VH(SEQ ID NO：307)。
无回复突变的稳定化的Bsw17VL；简写为稳定化的Bsw17/最小移植VL(SEQ ID NO：308)。
具有所有可能的回复突变的稳定化的Bsw17VL；简写为稳定化的Bsw17/最大移植VL(SEQ ID NO：309)。
实施例3：重靶向T细胞的异源二聚免疫球蛋白的产生
3.1技术和内置纯化系统
BEAT抗体是基于生物模仿的独特概念的重链异源二聚体，其表现出比“杵入臼(knob-into-hole)”技术优异的异源二聚化(PCT公开号：WO2012131555)。BEAT平台基于天然存在的同源或异源二聚免疫球蛋白结构域对之间的3D等效位置处的界面氨基酸的交换，以创造可以用作构建模块用于基于Fc的双特异性抗体的新的异源二聚体。该技术允许使用任何类型的抗原结合支架设计基于Fc的双特异性抗体。本文使用scFv-FAB形式设计基于Fc的双特异性抗体而不需要对两种抗原结合位点开发共同的轻链。
因为BEAT抗体是重链异源二聚体，需要区分该两个不同的重链。这些在本文中称为BTA和BTB链。如本文所用的BTA和BTB链包括抗原结合位点，人IgG1铰链区，起源于人IgG1或IgG3同种型的CH2结构域，和起源于人IgG1或IgG3同种型的修饰的CH3结构域。一些BTA和BTB CH3结构域是PCT公开号：WO2012131555中描述的结构域的相同或修饰的变体。BTA和BTB CH3结构域选自下组：(BTA)SEQ ID NO：147，148，149，153，154和155，和(BTB)SEQ ID NO：150，151，152，156，157和158。优选的BTA-BTB CH3结构域配对选自下组：SEQ ID NO：147与SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：148与SEQID NO：150，SEQ ID NO：149与SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：147与SEQ IDNO：152，和SEQ ID NO：148与SEQ ID NO：152。最优选的BTA-BTB CH3结构域配对选自下组：SEQ ID NO：147与SEQ ID NO：156，SEQ ID NO：148与SEQ ID NO：156，SEQ ID NO：154与SEQ ID NO：150，和SEQ ID NO：154与SEQ ID NO：152。
如上所述，使用来自不具有与蛋白A的结合的免疫球蛋白同种型的亲本结构域可以创造具有与蛋白A的不对称结合的BEAT重链异源二聚体(PCT公开号：WO2012131555)。同源和异源二聚物种之间的蛋白A结合位点的数量的区别特别可用于通过蛋白A色谱分离这些分子物种。为了避免将干扰通过蛋白A色谱进行的物种分离的残留结合，有必要废除在人重链可变域的VH3亚类中天然存在的任何第二蛋白A结合位点。当抗原结合位点起源于VH3家族的时候，可以通过G65S或N82aS取代(Kabat编号)来实现它们的蛋白A结合位点的废除。
当使用VH3起源的一个抗原结合位点和来自非VH3起源的一个抗原结合位点制备本发明包括的双特异性抗体时，需要将VH3起源的抗原结合位点定位于在其Fc区结合蛋白A的重链上。可选地，可以用N82aS取代或G65S取代或其等同取代来取代VH3起源的抗原结合位点以废除蛋白A结合。当使用一对VH3起源的抗原结合位点制备本发明的双特异性抗体时，唯一的可能性是通过上述氨基酸取代废除在至少一个基于VH3的抗原结合位点中的蛋白A结合。优选地，本发明的双特异性抗体经工程化以创造不具有蛋白A结合位点的两个同源二聚体中的一个。更优选地，本发明的双特异性抗体经工程化以创建不具有蛋白A结合位点的一个同源二聚体，以及在其蛋白A结合位点的数量(至少一个蛋白A结合位点，优选两个蛋白A结合位点)方面基本上不同于所关注的异源二聚体的其他同源二聚体。
已经广泛调查了由单特异性抗人CD3ε抗体引发毒性的机制；直接的机制已与抗体的亲和性，表位和效价关联，但也描述了毒性的间接机制。毒性的这些间接机制由与表达Fc受体的免疫细胞相互作用并导致瞬时T细胞活化和细胞因子释放的抗人CD3ε抗体的Fc区介导。为了提高安全性，靶向人CD3ε的BEAT抗体在其较低的铰链区被废除Fc-受体结合。使用被称为LALA取代的L234A和L235A取代(EU编号；Strohl WR et al.,(2009)Curr Opin Biotechnol,20(6):685-91)废除或减少Fc受体结合。
包括蛋白A结合被废除的至少一个VH3结构域的BEAT抗体的实施例
靶向HER2/CD3的BEAT抗体的实施例
抗HER2和抗CD3ε臂可以被格式化为由融合到BEAT链的scFv片段组成的scFv-Fc型重链或由融合到BEAT链的FAB片段组成的重链，类似于天然存在的抗体的重链。基于FAB的重链需要其与它的同源轻链联合以组装成功能性抗原结合位点。
将L234A和L235A取代引入到CH2区域内并在适当的时候使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)废除内部剩余的蛋白A结合。靶向人HER2抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实施例格式化如下：
用实施例2.1和2.2中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人HER2臂的抗原结合位点的组合工程化第一BEAT HER2/CD3抗体。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:47)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：159)组成，所述BEAT重链包括带有N82aS取代(Kabat编号)的可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3结构域亚类，因此，VH结构域被突变以包括N82aS取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人HER2臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：160)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT HER2/CD3-1抗体(图12A形式A)。
用实施例2.1和2.2中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人HER2臂的抗原结合位点的组合工程化第二BEAT HER2/CD3抗体。异源二聚免疫球蛋白的抗人HER2臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:3)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：161)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：162)组成。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3结构域亚类，因此，VH结构域被突变以包括N82aS取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。该双特异性抗体在本文中称为BEATHER2/CD3-2抗体(图12A形式B)。
用实施例2.1和2.2中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人HER2臂的抗原结合位点的组合工程化第三BEAT HER2/CD3抗体。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:47)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：163)组成，所述BEAT重链包括带有G65S取代(Kabat编号)的可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3结构域亚类，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人HER2臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：164)组成。如PCT公开号WO 1994029350所述的，在Kabat位置重链44(G44C)和轻链100(Q100C)处，使用重链和轻链结构域之间的经工程化的二硫键进一步稳定化双特异性抗体的scFv部分。该双特异性抗体在本文中称为BEAT HER2/CD3-3抗体(图12A形式C)。
用实施例2.1和2.2中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人HER2臂的抗原结合位点的组合工程化第四BEAT HER2/CD3抗体。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:166)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：165)组成，所述BEAT重链包括可变重链结构域，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域。该重链和轻链组装包括如PCT公开号：WO2008119565中描述的抗人CD3ε抗体(SP34)的人源化版本。异源二聚免疫球蛋白的抗人HER2臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：167)组成。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3结构域亚类，因此，VH结构域被突变以包括N82aS取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。该双特异性抗体在本文中称为BEAT HER2/CD3(SP34)抗体(图12B形式D)。
用实施例2.1和2.2中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人HER2臂的抗原结合位点的组合工程化第五BEAT HER2/CD3抗体。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:89)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：168)组成，所述BEAT重链包括可变重链结构域，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域。该双特异性抗体的该臂包括如实施例2.1中所述的人源化SP34VH1/VL21抗体的可变域。异源二聚免疫球蛋白的抗人HER2臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：167)组成。该臂等同于上述BEAT HER2/CD3(SP34)抗HER2臂(参见图12B形式D)。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3结构域亚类，因此，VH结构域被突变以包括N82aS取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。该双特异性抗体在本文中称为BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体(图12B形式E)。
对BEAT HER2/CD3-1，BEAT HER2/CD3-2，BEAT HER2/CD3-3，BEATHER2/CD3(SP34)和BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体进行瞬时表达，纯化及体外测试它们对HER2和CD3ε抗原的亲和性，它们的稳定性和它们重定向T细胞杀伤的能力。对于所有的BEAT抗体，瞬时表达产率在5-15mg/l培养物上清液的范围内。重要的是，在单个蛋白A色谱步骤之后，所有的双特异性抗体在它们的制备中显示出非常低水平的同源二聚体污染物。
由于所有这些BEAT抗体被设计为两条臂都包括VH3结构域，只废除至少一个VH3结构域中的蛋白A结合位点允许使用其中一个优选的差异纯化方法容易地纯化所关注的异源二聚体(图2E)。BEAT HER2/CD3-1抗体的差异蛋白A纯化踪迹的实例在图13中示出，并且图14示出纯化的异源二聚体的毛细管电泳图谱。仅边际量(marginal content)的同源二聚污染物可以从该图谱识别。未发现经格式化以带有FAB部分的重链的同源二聚体，因为这些不结合蛋白A。经格式化以带有scFv片段的重链的同源二聚体据发现为边缘比例(2.5％)，从而在单个蛋白A色谱步骤之后产生97％的异源二聚体含量。在单个蛋白A色谱步骤之后，BEAT HER2/CD3-2，BEAT HER2/CD3-3，BEAT HER2/CD3(SP34)和BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体被纯化为相似水平的同质性和纯度。在蛋白A色谱法之后BEAT HER2/CD3-3抗体显示一定比例的二硫键连接的异源二聚体总量(27％)，其通过阳离子交换色谱法去除。
为了进一步证明废除基于VH3的重链异源二聚体内的蛋白A结合极大地影响蛋白A色谱后纯度，在没有上述N82aS取代的情况下工程化BEATHER2/CD3-1抗体。图15A和15B分别显示BEAT HER2/CD3-1和其非N82aS取代版本的洗脱的蛋白A色谱流分的SDS-PAGE分析。在pH4下，非N82aS取代的版本的洗脱流分显示出对应于经格式化以带有FAB臂的重链的同源二聚体的额外带(图15B)而N82aS取代的BEAT HER2/CD3版本则没有(15A),由于经格式化以带有FAB壁的重链在其Fc区(基于人IgG3同种型的Fc区)不具有与蛋白A的结合，只能推断，在该同源二聚物种中发现的基于VH3的可变域负责蛋白A结合。这一结果清楚地表明了废除基于VH3的重链异源二聚体内的蛋白A结合的效用。
BEAT HER2/CD3-1和BEAT HER2/CD3-2抗体对于人HER2和人CD3ε抗原具有类似的KD值。对于人HER2抗原，KD值在0.50-2nM的范围内而对于人CD3ε抗原，KD值为1-2μm(使用人CD3γ-ε-Fc构建体通过SPR测量(参见材料和方法部分)；图16A和16B)。两种双特异性抗体的DSC曲线相似，在这两种情况下，接合人HER2或人CD3ε的scFv部分保留了它们的良好的热稳定性，Tm在68℃的范围内。两种抗体的FAB部分的Tm在82-83℃的范围内(图16C)。
使用人源化VH和VL序列靶向人HER2抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下地格式化：用实施例2.1和2.2中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人HER2抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEATHER2/CD3抗体。
异源二聚免疫球蛋白的抗人HER2臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:3)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：310)组成，所述BEAT重链包括可变重链结构域，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3结构域亚类，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT HER2/CD3(SP34-κ2)抗体。
体外T细胞杀伤测定
BEAT HER2/CD3抗体的作用机制是基于通过桥接细胞毒性T细胞的细胞表面上的CD3抗原和靶细胞上表达的HER2抗原来靶向针对靶细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
使用基于流式细胞仪的方法(在本文中称为RDL-FACS方法)或基于比色法的方法(在本文中称为RDL-MTS方法)测量BEAT HER2/CD3-1和BEATHER2/CD3-2抗体重定向T细胞杀伤的效力。在人PBMC和BEAT HER2/CD3-1或-2抗体的系列稀释或对照抗体的存在下，在48小时内，单独培养高表达HER2细胞系JIMT-1，耐(曲妥单抗)的乳腺癌细胞系，高表达HER2细胞系BT-474，(曲妥单抗)敏感的乳腺癌细胞系和低HER2表达乳腺癌细胞系MDA-MB-231。在这些测定中，来自血液捐赠的人PBMC用作细胞毒性T淋巴细胞的来源。在所有测定中使用10：1的效应子对靶细胞比。以不经抗体处理的样本形式(仅有靶细胞和人PBMC)提供阴性对照。在孵育期后使用RDL-FACS或RDL-MTS方法(参见材料和方法部分)测定细胞毒性。结果表明，对照抗体不触发特异性T细胞介导的细胞毒性。相比之下，BEATHER2/CD3-1和-2抗体诱导非常有效的，剂量依赖性的，肿瘤靶细胞死亡。最大杀伤接近100％。这两种读数方法给出接近的结果。在方法之间，供体与供体变异性导致EC50的约十倍的不同。所测定的EC50与靶细胞系的HER2抗原表达的水平相关。
BT-474细胞表达多数HER2抗原且BEAT HER2/CD3-1和-2抗体的EC50均在亚皮摩尔至皮摩尔范围内(分别为0.6和2pM，图17A)。JIMT-1细胞在其细胞表面具有掩蔽的HER2抗原(Nagy P et al.(2005),Cancer Res,65(2):473-482)，因此尽管具有高HER2表达仍显示出低结合。出人意料的是，如通过RDL-MTS方法所测定的，BEAT HER2/CD3-1和-2抗体针对JIMT-1细胞都具有在皮摩尔范围内的EC50(分别为21和16pM；图17B)。当使用RDL-FACS法测定时，BEAT HER2/CD3-1抗体具有1.4pM的EC50。低HER2表达乳腺癌细胞系MDA-MB-231没有前面的两种细胞系敏感，两种抗体都呈现亚纳摩尔EC50(两个值都接近0.2nM；图17C)。当用RDL-FACS法测定时，BEAT HER2/CD3-1抗体具有0.08nM的EC50。综上，这些结果显示，BEAT HER2/CD3-1和-2抗体在重定向T细胞杀伤各种HER2表达乳腺癌细胞系方面高度有效。
BEAT HER2/CD3(SP34)抗体包括在PCT公开号：WO2008119565中描述的抗人CD3ε抗体(SP34)的人源化版本。体外研究了该BEAT抗体形式重定向T细胞杀伤HER2+细胞的能力。在杀伤测定中使用两种不同的HER2+细胞系，高HER2表达细胞系(NCI-N87)和低HER2表达细胞系(HT-1080)(参见材料和方法部分)。图17D-E显示BEAT HER2/CD3(SP34)抗体分别重定向T细胞杀伤NCI-N87和HT-1080细胞。该测定使用10：1的效应细胞与靶细胞比，以及在48小时孵育期后使用RDL-MTS读出方法(参见材料和方法部分)。结果表明，BEAT HER2/CD3(SP34)抗体在重定向T细胞杀伤HER2+细胞系方面高度有效，当靶向NCI-N87和HT-1080细胞时，EC50分别为0.35和29pM。
BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体包括在实施例2.1中描述的抗人CD3ε抗体(SP34-κ1)VH1/VL21的人源化版本。体外研究了该BEAT抗体格式重定向T细胞杀伤HER2+细胞的能力。在杀伤测定中使用两种不同的HER2+细胞系，高HER2表达细胞系(NCI-N87)和低HER2表达细胞系(HT-1080)(参见材料和方法部分)。图17F-G显示BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体分别重定向T细胞杀伤NCI-N87和HT-1080细胞。该测定使用10：1的效应细胞与靶细胞比，以及在48小时孵育期后使用RDL-MTS读出方法(参见材料和方法部分)。结果表明，BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体在重定向T细胞杀伤HER2+细胞系方面高度有效，当靶向NCI-N87和HT-1080细胞时，EC50分别为0.46和338pM。
体内效力研究
JIMT-1异种移植
使用JIMT-1/PBMC异种移植模型研究BEAT HER2/CD3-1抗体的体内功效。来自血液捐赠的人PBMC用作细胞毒性T淋巴细胞的来源。耐的乳腺癌JIMT-1细胞与非刺激的人PBMC(四个不同的供体)以1：1比例混合并随后在免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中皮下注射。移植之后，两周内动物用BEATHER2/CD3-1抗体每周静脉注射三次地处理。抗体处理在移植后3小时开始，并之后在第2，4，7，9和11天继续。
为了评估无PBMC的肿瘤生长，在不存在人PBMC的情况下用5x10e6个JIMT-1细胞皮下接种五个组群中的一个，而用5x10e6个JIMT-1细胞与来自健康供体的5x10e6个非刺激的人PBMC混合的混合物皮下注射其他的组群。
在不存在抗体的情况下，人PBMC没有显示出对肿瘤生长的负面影响(图18A)。在人效应细胞的存在下，用BEAT HER2/CD3-1抗体处理，在大多数动物中诱导肿瘤生长的完全抑制(18/20肿瘤，图18B-C)。治疗的最后一天之后的18天，只有11％的肿瘤(2/18)开始再次增长。这些数据非常清楚地显示了BEAT HER2/CD3-1抗体的强效抗肿瘤功效。
靶向CD38/CD3的BEAT抗体的实施例
抗CD38和抗CD3ε臂可以被格式化为由融合到BEAT链的scFv片段组成的scFv-Fc型重链或由融合到BEAT链的FAB片段组成的重链，类似于天然存在的抗体的重链。基于FAB的重链需要其与它的同源轻链联合以组装成功能性抗原结合位点。
将L234A和L235A取代引入到CH2区域内并在适当的时候使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)废除内部剩余的蛋白A结合。靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实施例格式化如下：
使用人源化的HB7最佳拟合VH和VL序列靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的第一实施例格式化如下：用实施例2.1和2.3中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人CD38臂的抗原结合位点的组合工程化BEAT CD38/CD3抗体。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:119)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：169)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：162)组成。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括N82aS取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。该臂等同于上述BEAT HER2/CD3-2抗CD3ε臂(参见图12A形式B)。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3抗体(图19A形式A)。
对BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3抗体进行瞬时表达，纯化及体外测试其对CD38和CD3ε抗原的亲和性，其稳定性和其重定向T细胞杀伤的能力。对于人CD38抗原，KD值为3.2nM(通过SPR测量；图20A)。该双特异性抗体的DSC曲线显示良好的热稳定性曲线，对于scFv部分Tm为大约68℃。FAB部分的Tm为大约91℃(图20B)。
CD38表达细胞系(参见材料和方法部分)用于在类似于实施例3.2.1中所描述的测定法中评估重定向T细胞杀伤。图21显示了使用BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3抗体来重定向T细胞杀伤RPMI 8226骨髓瘤细胞。注意，所述测定法使用纯化的T细胞作为效应细胞，效应细胞与靶细胞比为10：1。当用RDL-FACS法测定时，BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3抗体具有2.2pM的EC50(2个供体的平均值，48小时孵育)。
使用人克隆767VH和VL序列靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的第二实施例格式化如下：用实施例2.1和2.3中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人CD38臂的抗原结合位点的组合工程化BEAT CD38/CD3抗体。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:138)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：170)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEATCH3结构域。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：171)组成。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD38-767/CD3抗体(图19形式B)。
对BEAT CD38-767/CD3抗体进行瞬时表达，纯化及体外测试其对CD38和CD3ε抗原的亲和性，其稳定性和其重定向T细胞杀伤的能力。CD38表达细胞系(参见材料和方法部分)用于在类似于实施例3.2.1中所描述的测定法中评估重定向T细胞杀伤。图22显示了使用BEAT CD38-767/CD3抗体来重定向T细胞杀伤Daudi细胞。注意，所述测定法使用人PBMC作为效应细胞，效应细胞与靶细胞比为10：1。当用RDL-FACS法测定时，BEAT CD38-767/CD3抗体具有244pM的EC50(3个供体的平均值，24小时孵育)。
使用人源化的9G7最佳框架VH和VL序列靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：用实施例2.1和2.3中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人CD38抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEATCD38/CD3抗体。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:132)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：312)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD38-9G7最佳框架/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人克隆767VH和VL序列靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：用实施例2.1和2.3中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人CD38抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEAT CD38/CD3抗体。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:138)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：313)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD38-767/CD3(SP34-κ2)抗体。
靶向OX40/CD3的BEAT抗体的实施例
抗OX40和抗CD3ε臂可以被格式化为由融合到BEAT链的scFv片段组成的scFv-Fc型重链或由融合到BEAT链的FAB片段组成的重链，类似于天然存在的抗体的重链。基于FAB的重链需要其与它的同源轻链联合以组装成功能性抗原结合位点。
将L234A和L235A取代引入到CH2区域内并在适当的时候使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)废除内部剩余的蛋白A结合。靶向人OX40抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实施例格式化如下：
用实施例2.1和2.4中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人OX40臂的抗原结合位点的组合工程化BEAT OX40/CD3抗体的实例。异源二聚免疫球蛋白的抗人OX40臂使用PCT公开号：WO2013008171中公开的人源化抗人OX40抗体的可变域(分别具有SEQ ID NO:141和142的可变重链和轻链结构域)并且由与其同源的轻链(SEQ ID NO:173)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：172)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：162)组成。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括N82aS取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。该臂等同于上述BEAT HER2/CD3-2抗CD3ε臂(参见图12A形式B)。该双特异性抗体在本文中称为BEAT OX40/CD3抗体(图23)。
体外研究了BEAT OX40/CD3抗体重定向T细胞杀伤OX40+细胞的能力。稳定的重组CHO[OX40]细胞系在杀伤测定法中使用。图24显示BEATOX40/CD3抗体重定向T细胞杀伤稳定的重组CHO[OX40]细胞。该测定使用人PBMC作为效应细胞，效应细胞与靶细胞比为20：1，以及在48小时孵育期后使用RDL-MTS读出方法(参见材料和方法部分)。结果表明，BEAT OX40/CD3抗体在重定向T细胞杀伤稳定的重组CHO[OX40]细胞方面高度有效，EC50为0.5nM(3个供体的平均值)。
使用人源化的抗OX40/最大移植VH和VL序列靶向人OX40抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：用实施例2.1和2.4中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人OX40抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEATOX40/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人OX40臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:315)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：314)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT OX40最大移植/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人源化的抗OX40/最小移植VH和VL序列靶向人OX40抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：用实施例2.1和2.4中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人OX40抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEATOX40/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人OX40臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:317)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：316)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT OX40最小移植/CD3(SP34-κ2)抗体。
靶向CD20/CD3的BEAT抗体的实施例
使用小鼠利妥昔单抗抗体VH和VL序列靶向人CD20抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实施例格式化如下：用实施例2.1和2.5中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人CD20臂的抗原结合位点的组合工程化BEAT CD20/CD3。
使用人源化的利妥昔单抗/最大移植VH和VL序列靶向人CD20抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实施例格式化如下：用实施例2.1和2.5中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人CD20抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEATCD20/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD20臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:319)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：318)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD20最大移植/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人源化的利妥昔单抗/最小移植VH和VL序列靶向人CD20抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：用实施例2.1和2.5中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人CD20抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEAT CD20/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD20臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:321)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：320)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD20最小移植/CD3(SP34-κ2)抗体。
靶向EGFR/CD3的BEAT抗体的实施例
抗EGFR和抗CD3ε臂可以被格式化为由融合到BEAT链的scFv片段组成的scFv-Fc型重链或由融合到BEAT链的FAB片段组成的重链，类似于天然存在的抗体的重链。基于FAB的重链需要其与它的同源轻链联合以组装成功能性抗原结合位点。
将L234A和L235A取代引入到CH2区域内并在适当的时候使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)废除内部剩余的蛋白A结合。靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实施例格式化如下：
靶向人EGFR和人CD3ε抗原的BEAT抗体的实施例如下地格式化：用实施例2.1和2.6中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR臂的抗原结合位点的组合工程化BEAT EGFR/CD3抗体。异源二聚免疫球蛋白的抗人EGFR臂由基于小鼠Erbitux抗体可变域(分别具有SEQ ID NO:145和146的小鼠可变重链和轻链结构域)的BEAT重链(SEQ ID NO：174)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域，并与其同源的轻链(SEQ ID NO:175)组装。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEATCH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：171)组成。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。该臂等同于上述BEAT CD38-767/CD3抗CD3ε臂(参见图19形式B)。该双特异性抗体在本文中称为BEAT EGFR/CD3抗体(图25)。
对BEAT EGFR/CD3抗体进行瞬时表达，纯化和体外测试其重定向T细胞杀伤人EGFR+细胞系的能力。在杀伤测定中使用HT-29细胞系。图26显示由BEAT EGFR/CD3抗体介导的T细胞重定向杀伤HT-29细胞。该测定使用人PBMC作为效应细胞，效应细胞与靶细胞比为10：1，以及在48小时孵育期后使用RDL-MTS读出方法(参见材料和方法部分)。结果表明，BEAT EGFR/CD3抗体在重定向T细胞杀伤HT-29细胞方面高度有效，EC50为70.6pM(4个供体的平均值)。
使用人源化Erbitux/最大移植VH和VL序列靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：用实施例2.1和2.6中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEATEGFR/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人EGFR臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:323)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：322)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT EGFRcetux最大移植/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人源化Erbitux/最小移植VH和VL序列靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：用实施例2.1和2.6中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEATEGFR/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人EGFR臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:325)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：324)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT EGFRcetux-最小移植/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人源化Vectibix/最大移植VH和VL序列靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：用实施例2.1和2.6中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEATEGFR/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人EGFR臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:327)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：326)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEATCH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT EGFRpani最大移植/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人源化Vectibix/最小移植VH和VL序列靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：用实施例2.1和2.6中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEATEGFR/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人EGFR臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:329)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：328)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEATCH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT EGFRpani最小移植/CD3(SP34-κ2)抗体。
CD19/CD3BEAT抗体的实施例
抗CD19和抗CD3重链可以被格式化为由融合到第一BEAT链的scFv片段组成的scFv-Fc型重链或由融合到第一BEAT链的FAB片段组成的重链，类似于天然存在的抗体的重链。基于FAB的重链需要其与它的同源轻链联合以组装成功能性抗原结合位点。将L234A和L235A取代引入到CH2区域内并在适当的时候使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)废除内部剩余的蛋白A结合。使用在WO2010095031中描述的抗CD-19VH和VL序列靶向人CD19抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实施例格式化如下：
用实施例2.1和2.7中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人CD19抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEAT CD19/CD3的实例。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD19臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:331)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：330)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD19/CD3(SP34-κ2)抗体。
在PCT公开号：WO2010/095031中描述的表达CD19的细胞系用于在与实施例3.2.1中描述的测定法类似的测定法中评估重定向T细胞杀伤。
IgE/CD3BEAT抗体的实施例
抗IgE和抗CD3重链可以被格式化为由融合到第一BEAT链的scFv片段组成的scFv-Fc型重链或由融合到第一BEAT链的FAB片段组成的重链，类似于天然存在的抗体的重链。基于FAB的重链需要其与它的同源轻链联合以组装成功能性抗原结合位点。将L234A和L235A取代引入到CH2区域内并在适当的时候使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)废除内部剩余的蛋白A结合。
用实施例2.1和2.8中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人IgE抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEAT IgE/CD3抗体。
在它们的细胞表面表达IgE的细胞系在PCT公开号：WO2010/033736中描述并可用于在类似于实施例3.2.1中描述的测定法的测定法中评估重定向T细胞杀伤。
使用稳定化的奥马珠单抗/最大移植VH/VL序列靶向人IgE抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实施例格式化如下：
异源二聚免疫球蛋白的抗人IgE臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:333)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：332)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT IgE奥马珠-最大移植/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用稳定化的奥马珠单抗/最小移植VH/VL序列靶向人IgE抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：
异源二聚免疫球蛋白的抗人IgE臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:335)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：334)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT IgE奥马珠-最小移植/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用稳定化的Bsw17/最大移植VH/VL序列的靶向人IgE抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：异源二聚免疫球蛋白的抗人IgE臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:337)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：336)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT IgEbsw17最大移植/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用稳定化的Bsw17/最小移植VH/VL序列的靶向人IgE抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：异源二聚免疫球蛋白的抗人IgE臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:339)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：338)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包括人IgG3Fc区的一部分，因此没有与蛋白A的结合，但是由于本文所用的重链的重链可变域起源于VH3框架，因此，VH结构域被突变以包括G65S取代，从而消除重链中的任何额外的蛋白A结合位点。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT IgEbsw17最小移植/CD3(SP34-κ2)抗体。
仅包括一个VH3结构域的BEAT抗体的实施例
靶向CD38/CD3的BEAT抗体的实施例
使用人源化的HB7/最佳拟合VH和VL序列的靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实施例格式化如下：用实施例2.1和2.3中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人CD38臂的抗原结合位点的组合工程化BEAT CD38/CD3抗体。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:119)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：176)组成，所述BEAT重链包括可变重链结构域，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。由于该重链包括人IgG3Fc区的一部分并且其重链可变域起源于非VH3结构域亚类，因此没有与蛋白A的结合。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：177)组成。如PCT公开号：WO2008119565中所描述的，该重链和轻链组装包括抗人CD3ε抗体(SP34)的人源化版本。该BEAT抗体形式在本文中称为BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3(SP34)抗体(图27形式A)。
体外研究BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3(SP34)抗体重定向T细胞杀伤CD38+细胞的能力。CD38+B淋巴母细胞系Daudi用于杀伤测定。图28显示了由BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3(SP34)抗体介导的T细胞重定向杀伤Daudi细胞。所述测定使用人PBMC作为效应细胞，效应细胞与靶细胞比为10：1，以及在24h孵育期之后使用RDL-FACS读出方法(参见材料和方法部分)。结果显示，BEAT CD38-HB7最佳拟合/CD3(SP34)抗体在重定向T细胞杀伤DaudiCD38+细胞系方面高度有效，EC50为1.8pM(3个供体的平均值)。
使用人源化的9G7最佳拟合VH和VL序列的靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的第二实施例格式化如下：用实施例2.1和2.3中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人CD38臂的抗原结合位点的组合工程化BEAT CD38/CD3抗体。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:128)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：178)组成，所述BEAT重链包括可变重链结构域，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。由于该重链包括人IgG3Fc区的一部分并且其重链可变域起源于非VH3结构域亚类，因此没有与蛋白A的结合。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：179)组成。该双特异性抗体的臂包括实施例2.1中描述的人源化SP34VH5/VL32抗体的可变域。该BEAT抗体形式在本文中称为BEAT CD38-9G7最佳拟合/CD3(SP34-κ2)抗体(图27形式B)。对于人CD31-26_Fc融合蛋白，CD38-9G7最佳拟合/CD3(SP34-κ2)抗体具有18nM的KD值。
体外研究BEAT CD38-9G7最佳拟合/CD3(SP34-κ2)抗体重定向T细胞杀伤CD38+细胞的能力。CD38+B淋巴母细胞系Daudi用于杀伤测定。图30显示了由BEAT CD38-9G7最佳拟合/CD3(SP34-κ2)抗体介导的T细胞重定向杀伤Daudi细胞。所述测定使用人PBMC作为效应细胞，效应细胞与靶细胞比为10：1，以及在24h孵育期之后使用RDL-FACS读出方法(参见材料和方法部分)。结果显示，BEAT CD38-9G7最佳拟合/CD3(SP34-κ2)抗体在重定向T细胞杀伤Daudi CD38+细胞系方面高度有效，EC50为2pM(3个供体的平均值)。
靶向OX40/CD3的BEAT抗体的实施例
使用人源化的抗OX40抗体VH和VL序列(PCT公开号：WO2013008171)的靶向人OX40抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例格式化如下：
用实施例2.1和2.4中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人OX40抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEAT OX40/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人OX40臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:173)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：340)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。由于该重链包括人IgG3Fc区的一部分并且其重链可变域起源于非VH3结构域亚类，因此没有与蛋白A的结合。异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT OX40/CD3(SP34-κ2)抗体。
上述人OX40表达细胞系用于在与实施例3.2.4中描述的测定法类似的测定法中评估重定向T细胞杀伤。
靶向CD20/CD3的BEAT抗体的实施例
使用小鼠利妥昔单抗抗体VH和VL序列的靶向人CD20抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实施例格式化如下：
用实施例2.1和2.5中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人CD20臂的抗原结合位点的组合工程化BEAT CD20/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD20臂由基于小鼠利妥昔单抗抗体可变域(分别具有SEQ ID NO:143和144的小鼠可变重和轻链结构域)的BEAT重链(SEQID NO：180)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域，并与其同源的轻链(SEQ ID NO:181)组装。由于该重链包括人IgG3Fc区的一部分并且其重链可变域起源于非VH3结构域亚类，因此没有与蛋白A的结合。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEATCH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：177)组成。该臂等同于上述BEATCD38-HB7最佳拟合/CD3抗CD3ε臂(参见图27形式A)。该scFv片段包括PCT公开号：WO2008119565中描述的抗人CD3εSP34抗体的人源化版本(分别具有SEQ ID NO：182和183的VH和VL结构域)。该BEAT抗体形式在本文中称为BEAT CD20/CD3(SP34)抗体(图31)。
对BEAT CD20/CD3(SP34)抗体进行瞬时表达，纯化和体外测试其重定向T细胞杀伤CD20+细胞系的能力。CD38+B淋巴母细胞系Daudi用于杀伤测定。图32显示了通过BEAT CD20/CD3(SP34)抗体介导的T细胞重定向杀伤Daudi细胞。所述测定使用人PBMC作为效应细胞，效应细胞与靶细胞比为10：1，以及在24h孵育期之后使用RDL-FACS读出方法(参见材料和方法部分)。结果显示，BEAT CD20/CD3(SP34)抗体在重定向T细胞杀伤Daudi细胞方面高度有效，EC50为25pM(3个供体的平均值)。
使用利妥昔单抗嵌合抗体VH和VL序列的靶向人CD20抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：
用实施例2.1和2.5中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人CD20抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEAT EGFR/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD20臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:181)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：341)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。由于该重链包括人IgG3Fc区的一部分并且其重链可变域起源于非VH3结构域亚类，因此没有与蛋白A的结合。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEATCH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD20/CD3(SP34-κ2)抗体。
靶向EGFR/CD3的BEAT抗体的实施例
使用小鼠爱必妥抗体VH和VL序列的靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实施例格式化如下：用实施例2.1和2.6中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEAT EGFR/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人EGFR臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:175)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：342)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。由于该重链包括人IgG3Fc区的一部分并且其重链可变域起源于非VH3结构域亚类，因此没有与蛋白A的结合。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEATCH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT EGFRcetux/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人Vectibix抗体VH和VL序列的靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：用实施例2.1和2.6中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEAT EGFR/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人EGFR臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:344)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：343)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。由于该重链包括人IgG3Fc区的一部分并且其重链可变域起源于非VH3结构域亚类，因此没有与蛋白A的结合。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEATCH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT EGFRpani/CD3(SP34-κ2)抗体。
靶向IgE/CD3的BEAT抗体的实施例
使用人源化奥马珠单抗抗体VH和VL序列的靶向人IgE抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实施例格式化如下：用实施例2.1和2.8中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人IgE抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEAT IgE/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人IgE臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:346)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：345)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。由于该重链包括人IgG3Fc区的一部分并且其重链可变域起源于非VH3结构域亚类，因此没有与蛋白A的结合。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEATCH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT IgEomali/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用小鼠Bsw17抗体VH和VL序列的靶向人IgE抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一实施例格式化如下：用实施例2.1和2.8中描述的分别用于抗人CD3ε和抗人IgE抗原结合位点的抗原结合位点的组合工程化BEAT IgE/CD3。
异源二聚免疫球蛋白的抗人IgE臂由与其同源的轻链(SEQ ID NO:348)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：347)组成，所述BEAT重链包括可变重链区，CH1γ1区，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区，和基于γ3的BEAT CH3结构域。由于该重链包括人IgG3Fc区的一部分并且其重链可变域起源于非VH3结构域亚类，因此没有与蛋白A的结合。
异源二聚免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包括scFv片段，CH1γ1区域，γ1铰链区，带有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区，和基于γ1的BEATCH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT IgEbsw17/CD3(SP34-κ2)抗体。
所描述的膜IgE表达细胞系用于在与上述测定法类似的测定法中评估重定向T细胞杀伤。
序列表

Claims (14)

1.一种异源二聚免疫球蛋白或其片段，其包括：
(a)结合蛋白A的第一多肽，其包括结合第一表位的表位结合区和免疫球蛋白恒定区；和
(b)不结合蛋白A的第二多肽，其包括结合第二表位的表位结合区和免疫球蛋白恒定区；
其中，第一和第二多肽包括具有蛋白质-蛋白质界面的、带有修饰的CH3结构域的经工程化的免疫球蛋白恒定区，其中第一多肽的蛋白质-蛋白质界面包括从下组中选出的位置上的氨基酸取代：3，5，7，20，22，26，27，79，81，84，84.2，85.1，86，88和90并且其中第二多肽的蛋白质-蛋白质界面包括从下组中选出的位置上的氨基酸取代：3，5，7，20，22，26，27，79，81，84，84.2，84.4，85.1，86，88和90
其中，第一多肽的表位结合区结合CD3蛋白复合体且第二多肽的表位结合区结合疾病相关抗原或其中第一多肽的表位结合区结合疾病相关抗原且第二多肽的表位结合区结合CD3蛋白复合体；以及
其中结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：194的重链CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO：195的重链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：196的重链CDR3，和包含氨基酸序列SEQ ID NO：197的轻链CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO：198的轻链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：199的轻链CDR3；或者
其中结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：200的重链CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO：201的重链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：202的CDR3重链，和包含氨基酸序列SEQ ID NO：203的轻链CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO：204的轻链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：205的轻链CDR3；或者
其中，结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：352的重链CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO：353的重链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：354的重链CDR3，和包含氨基酸序列SEQ ID NO：355的轻链CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO：356的轻链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：357的轻链CDR3。
2.权利要求1所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中结合疾病相关抗原的表位结合区包括分别从下组选出的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列以及轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列：
ⅰ)SEQ ID NO：206-211；
ⅱ)SEQ ID NO：212-217；
ⅲ)SEQ ID NO：218-223；
ⅳ)SEQ ID NO：224-229；
ⅴ)SEQ ID NO：230-235；
ⅵ)SEQ ID NO：236-241；
ⅶ)SEQ ID NO：242-247；
ⅷ)SEQ ID NO：248-253；
ix)SEQ ID NO：254-259；
x)SEQ ID NO：260-265；
xi)SEQ ID NO：266-271；和
ⅹⅱ)SEQ ID NO：272–277。
3.权利要求1或2所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中所述第二多肽的恒定区包括IgG3CH3区。
4.权利要求1，2或3所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中第二多肽的所述蛋白质-蛋白质界面包括在位置84.4上的氨基酸取代和从下组中选出的位置上的至少一个另外的氨基酸取代：3，5，7，20，22，26，27，79，81，84，84.2，85.1，86，88和90
5.权利要求1至4中的任一项所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：27的重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：39的轻链可变区；或其中结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：64的重链可变区，和包含氨基酸序列SEQ ID NO：69的轻链可变区；或其中结合CD3蛋白复合体的表位结合区包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：104的重链可变区和包含氨基酸序列SEQID NO：106的轻链可变区。
6.权利要求1至5中的任一项所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中所述第二多肽的所述表位结合区包括VH3区并且其中所述第二多肽的所述VH3区包括减少或废除所述第二多肽与蛋白A的结合的修饰。
7.根据权利要求6所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中，修饰的VH3区域包括从下组中选出的氨基酸取代：57，65，81，82a和组合19/57/59(Kabat编号)。
8.根据权利要求6或7所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中，修饰的VH3区包括从下组中选出的氨基酸取代：57A，57E，65S，81E，82aS和组合19G/57A/59A(Kabat编号)。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中，所述重链可变框架区包括从下组中选出的氨基酸取代：I34M，V48I，A49G，R58N/Y，I69L，A71T和T73K(Kabat编号)且轻链可变框架区包括从下组中选出的氨基酸取代：M4L，V33M，A34N，L46R，L47W，R66G，F71Y及P96F(Kabat编号)；或其中重链可变框架区包括氨基酸取代I34M，A49G和A71T(Kabat编号)和轻链可变框架区包括氨基酸取代M4L，L46R，L47W和F71Y(Kabat编号)。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中，重链可变区包括从下组中选出的氨基酸取代：W100eF和W100eY(Kabat编号)以及轻链可变区包括从下组中选出的氨基酸取代：A2I，S25A，T27A，G27aA，V27cA，T28A，T29A，S30A，N31A，Y32A，E38Q，F44P，G46L，T51A，N52A，K53A，R54A，P56A，L66G，D69T，F87Y，Q89A，W91F，Y92A，S93A，N94A和Q100G(Kabat编号)；或者其中重链可变区包括氨基酸取代W100eY(Kabat编号)以及轻链可变区包括氨基酸取代A2I，T29A，S30A，T51A，F87Y，Q89A和W91F(Kabat编号)或轻链可变区包括氨基酸取代A2I，E38Q，F87Y和Q89A。
11.根据前述权利要求中的任一项所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段，其中，第一多肽的表位结合区是FAB且第二多肽的表位结合区是scFv，或者其中第一多肽的表位结合区是scFV并且第二多肽的表位结合区是FAB。
12.一种异源二聚免疫球蛋白或其片段，其结合：
i)CD3蛋白复合体和HER2，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：159和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：47的轻链并结合CD3ε，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：160并结合HER2；
ii)CD3蛋白复合体和HER2，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：161和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：3的同源轻链并结合HER2，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：162并结合CD3ε；
iii)CD3蛋白复合体和HER2，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：163和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：47的轻链并结合CD3ε，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：164和结合HER2；
iv)CD3蛋白复合体和HER2，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：165和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：166的轻链并结合CD3ε，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：167并结合HER2；
ⅴ)CD3蛋白复合体和HER2，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：168和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：89的轻链并结合CD3ε，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：167并结合HER2；
ⅵ)CD3蛋白复合体和CD38，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：169和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：119的同源轻链并结合CD38，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：162并结合CD3ε；
vii)CD3蛋白复合体和CD38，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：170和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：138的同源轻链并结合CD38，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：171并结合CD3ε；
ⅷ)CD3蛋白复合体和CD38，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：176和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：119的同源轻链并结合CD38，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：177并结合CD3ε；
ⅸ)CD3蛋白复合体和CD38，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：178和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：128的同源轻链并结合CD38，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：179并结合CD3ε；
x)CD3蛋白复合体和OX40，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：172和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：173的同源轻链并结合OX40，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：162并结合CD3ε；
ⅹⅰ)CD3蛋白复合体和EGFR，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：174和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：175的同源轻链并结合EGFR，且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：171并结合CD3ε；
ⅹⅱ)CD3蛋白复合体和CD20，其中第一多肽具有氨基酸序列SEQ IDNO：180和组装有氨基酸序列为SEQ ID NO：181的同源轻链并结合CD20，并且其中第二多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：177并结合CD3ε。
13.一种用于产生前述权利要求中的任一项所述的异源二聚免疫球蛋白或其片段的体外方法，其包括以下步骤：
ia)制备编码第一多肽的重链的DNA载体和编码第二多肽的重链的DNA载体，其中一个或两个DNA载体或第三DNA载体任选地编码共同的轻链或组装有第一或第二多肽的重链的轻链；或者
ib)制备编码第一和第二多肽的重链的一个DNA载体，其中所述DNA载体任选地编码共同轻链或组装有第一或第二多肽的重链的轻链；以及
其中所述DNA载体适合在哺乳动物宿主细胞中瞬时或稳定表达；
ⅱ)在哺乳动物宿主细胞系中转染或共转染来自(ia)或(ib)的DNA载体；
ⅲ)培养转染的细胞系或从中稳定地选定的克隆并收获细胞培养物上清液；
iv)在蛋白A亲和色谱树脂上接触细胞培养物上清液；以及
ⅴ)洗脱并收集所关注的异源二聚免疫球蛋白。
14.权利要求13所述的方法，其中，根据毛细管电泳所测定的，在来自步骤(v)的纯化物质中发现的异源二聚免疫球蛋白或其片段为至少95％纯。
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