JP6994942B2 - T細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン - Google Patents
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Description
したがって、分泌された二重特異性抗体生成物が組換え哺乳動物宿主細胞株由来の細胞培養上清から容易に単離されるような、抗ヒトCD3ホモ二量体を含まない抗ヒトCD3ベースの重鎖ヘテロ二量体を効率的に製造する技術に対するニーズが、依然として存在する。
CD3タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号352のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号353のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号354のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、並びに配列番号355のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号356のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号357のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む。
疾患を引き起こすT細胞の排除は、乾癬、多発性硬化症、及び糖尿病などの自己免疫及び炎症性疾患の治療において、T細胞分化を阻害するよりも有益であり得る。
i) 配列番号206-211;
ii) 配列番号212-217;
iii) 配列番号218-223;
iv) 配列番号224-229;
v) 配列番号230-235;
vi) 配列番号236-241;
vii) 配列番号242-247;
viii) 配列番号248-253;
ix) 配列番号254-259;
x) 配列番号260-265;
xi) 配列番号266-271;及び
xii) 配列番号272-277
からなる群よりそれぞれ選択される重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列、並びに軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3アミノ酸配列を含む、本発明によるヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片。
配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号105のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか;又は
配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号106のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか;又は
配列番号104のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号106のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか;又は
配列番号104のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号401のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか;又は
配列番号104のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号402のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
a) 配列番号60及び61によりコードされる重又は軽可変ドメイン内の残基の少なくとも一を修飾すること;
b) 工程a)からの修飾構築物の発現を発現させること;
c) 修飾構築物の発現レベルを、配列番号60及び配列番号61又は配列番号62及び配列番号63又は配列番号64及び配列番号69によりコードされる重/軽可変ドメインを含むscFvと比較すること;
d) 前記修飾構築物が配列番号60及び配列番号61又は配列番号62及び配列番号63又は配列番号64及び配列番号69によりコードされる重/軽可変ドメインを含むscFvよりも多く発現される場合、それを選択すること
を含む方法が提供される。
i) 第一のポリペプチドが配列番号359を含む群から選択されるアミノ酸配列を有し、配列番号399又は400のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、CD3イプシロンに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号167のアミノ酸配列を有し、HER2に結合する、CD3タンパク質複合体及びHER2;
ii) 第一のポリペプチドが配列番号359を含む群から選択されるアミノ酸配列を有し、配列番号399又は400のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、CD3イプシロンに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号167のアミノ酸配列を有し、HER2に結合する、CD3タンパク質複合体及びHER2;
iii) 第一のポリペプチドが配列番号359を含む群から選択されるアミノ酸配列を有し、配列番号399又は400のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、CD3イプシロンに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号162のアミノ酸配列を有し、CD38に結合する、CD38タンパク質複合体及びCD3イプシロン;
iv) 第一のポリペプチドが配列番号170のアミノ酸配列を有し、配列番号138のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、CD38に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396のアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38;
v) 第一のポリペプチドが配列番号176のアミノ酸配列を有し、配列番号119のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、CD38に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396のアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38;
vi) 第一のポリペプチドが配列番号178のアミノ酸配列を有し、配列番号128のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、CD38に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396のアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38;
vii) 第一のポリペプチドが配列番号359を含む群から選択されるアミノ酸配列を有し、配列番号399又は400のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、OX40に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号162のアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びOX40;
viii) 第一のポリペプチドが配列番号174のアミノ酸配列を有し、配列番号175のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、EGFRに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396のアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びEGFR;
ix) 第一のポリペプチドが配列番号180のアミノ酸配列を有し、配列番号181のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、CD20に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396のアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD20。
第一のポリペプチドが配列番号310のアミノ酸配列を有し、配列番号3のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、HER2に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びHER2;
第一のポリペプチドが配列番号312又は404のアミノ酸配列を有し、配列番号132のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、CD38に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38;
第一のポリペプチドが配列番号313のアミノ酸配列を有し、配列番号138のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、CD38に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38;
第一のポリペプチドが配列番号314のアミノ酸配列を有し、配列番号315のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、OX40に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びOX40;
第一のポリペプチドが配列番号316のアミノ酸配列を有し、配列番号317のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、OX40に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びOX40;
第一のポリペプチドが配列番号318のアミノ酸配列を有し、配列番号319のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、CD20に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD20;
第一のポリペプチドが配列番号320のアミノ酸配列を有し、配列番号321のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、CD20に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD20;
第一のポリペプチドが配列番号322のアミノ酸配列を有し、配列番号323のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、EGFRに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びEGFR;
第一のポリペプチドが配列番号324のアミノ酸配列を有し、配列番号325のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、EGFRに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びEGFR;
第一のポリペプチドが配列番号326のアミノ酸配列を有し、配列番号327のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、EGFRに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びEGFR;
第一のポリペプチドが配列番号328のアミノ酸配列を有し、配列番号329のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、EGFRに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びEGFR;
第一のポリペプチドが配列番号330のアミノ酸配列を有し、配列番号331のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、CD19に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD19;
第一のポリペプチドが配列番号332のアミノ酸配列を有し、配列番号333のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、IgEに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びIgE;
第一のポリペプチドが配列番号334のアミノ酸配列を有し、配列番号335のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、IgEに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びIgE;
第一のポリペプチドが配列番号336のアミノ酸配列を有し、配列番号337のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、IgEに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びIgE;
第一のポリペプチドが配列番号338のアミノ酸配列を有し、配列番号339のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、IgEに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びIgE;
第一のポリペプチドが配列番号340のアミノ酸配列を有し、配列番号173のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、OX40に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びOX40;
第一のポリペプチドが配列番号341のアミノ酸配列を有し、配列番号181のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、CD20に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD20;
第一のポリペプチドが配列番号342のアミノ酸配列を有し、配列番号175のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、EGFRに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びEGFR;
第一のポリペプチドが配列番号343のアミノ酸配列を有し、配列番号344のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、EGFRに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びEGFR;
第一のポリペプチドが配列番号345のアミノ酸配列を有し、配列番号346のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、IgEに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びIgE;
第一のポリペプチドが配列番号347のアミノ酸配列を有し、配列番号348のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、IgEに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びIgE。
ia) 第一のポリペプチドの重鎖をコードするDNAベクター及び第二のポリペプチドの重鎖をコードするDNAベクターを調製する工程であって、一方若しくは両方のDNAベクター又は第三のDNAベクターが共通の軽鎖又は第一若しくは第二のポリペプチドの重鎖と共に組み立てられる軽鎖を任意選択的にコードする工程;又は
ib) 第一及び第二のポリペプチドの重鎖をコードする一のDNAベクターを調製する工程であって、DNAベクターが共通の軽鎖又は第一若しくは第二のポリペプチドの重鎖と共に組み立てる軽鎖を任意選択的にコードし;かつ
前記DNAベクターが哺乳動物宿主細胞において一過性の又は安定的な発現に適している工程;
ii) 哺乳動物宿主細胞株において、(i)のDNAベクターをトランスフェクト又はコトランスフェクトする工程;
iii) トランスフェクトされた細胞株又はそれから安定的に選択されたクローンを培養し、細胞培養上清を回収する工程;
iv) プロテインAアフィニティークロマトグラフィー樹脂上で細胞培養上清を接触させる工程;
v) 目的のヘテロ二量体免疫グロブリンを溶出して回収する工程
を含む、本明細書に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片のインビトロでの製造方法を提供する。
操作された免疫グロブリンは、scFv、FAB又はdAb断片などの異なるエピトープ結合領域フォーマットを包含し得る。これらの断片は、通常、IgG Fc領域との遺伝的融合によって抗体様構造に組み立てられる。操作された免疫グロブリンは、ヘテロ二量体化増強技術の使用の有無にかかわらず、ホモ又はヘテロ二量体として構築することができ、単一又は二重特異性結合特性を有し得る。
最も一般的には、組換えプロテインAは、抗体精製用の固定相クロマトグラフィー樹脂に結合される。最適な結合はpH8.2で生ずるが、中性又は生理学的状態(pH7.0-7.6)においても結合は良好である。溶出は、酸性pH(グリシン-HCl、pH2.5-3.0)に対してpHを変化させることにより通常達成される。この溶出法は、タンパク質構造に永久的な影響を及ぼすことなく、ほとんどのタンパク質-タンパク質及び抗体-抗原結合相互作用を効率的に解離させる。それにもかかわらず、一部の抗体及びタンパク質は、低pHにより損傷を受けることもあり、低pH条件に置かれる時間を最低限に抑えるために、回収直後に1/10容量のアルカリ性バッファー、例えば1Mトリス-HCl、pH8.0を添加することにより中和するのが最善である。
本発明は、上記のような重及び軽鎖CDRを含み、かつヒト遺伝子IGHV3-23*04(配列番号22)の産物であるか又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域をさらに含むCD3タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域を提供する。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号18のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体OKT3の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。好ましくは、アミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。一般的に、7以下、好ましくは6以下、好ましくは5以下、好ましくは4以下、より好ましくは3以下、なお一層好ましくは2以下、最も好ましくは1以下のアミノ酸修飾が、フレームワーク領域内で実施される。いくつかの実施態様において、本開示は、CD3タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域を提供するが、この場合重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸修飾は34、48、49、58、69、71、及び73からなる群より選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置はKabat番号付けに基づいて示される。好ましくは、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸置換は、I34M、V48I、A49G、R58N、R58Y、I69L、A71T、及びT73Kからなる群より選択される。重鎖可変領域のフレームワーク領域の好ましいアミノ酸置換は、34、49、及び71からなる群より選択されるアミノ酸位置にある。重鎖可変領域のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸置換は、I34M、A49G、及びA71Tからなる群より選択される。
ヘテロ二量体免疫グロブリンを製造する方法は、当該技術分野において知られており、最も単純な方法の一つは、単一細胞内での二の異なる免疫グロブリン鎖の発現を利用することである(国際公開第95/33844号、Lindhofer H & Thierfelder S)。操作を用いないこの単純な方法は、目的のヘテロ二量体よりもホモ二量体種が形成されることにより制限される(Kufer P et al., (2004) Trends Biotechnol., 22(5): 238-244)。重鎖のヘテロ二量化を強化する補完的な技術(Merchant AM et al., (1998) Nat. Biotechnol., 16(7): 677-681)を用いると、より多くのヘテロ二量体の製造が実現し得るが、なおも相当量の望ましくないホモ二量体の製造を引き起こす(Jackman J et al., (2010) J Biol Chem., 285(27):20850-9, Klein C et al., (2012) MAbs, 4(6):653-63)。それゆえ本発明は、BEAT(登録商標)法に記載されている方法を利用するが(PCT公開番号:国際公開第2012/131555号)、同方法は先行技術の方法よりも優れたヘテロ二量体化を示すバイオミミクリーという独自の概念に基づく。BEAT法は、天然ホモ又はヘテロ二量体免疫グロブリンドメイン対間の界面交換に基づき、Fcベースの二重特異性抗体の構成要素として利用可能な新規のヘテロ二量体を作り出す。
ここで各群メンバーのアミノ酸位置は、IMGT(登録商標)番号付けに従って示される。
第一の工程(実施例1)として、プロテインAとの結合を低減又は除去する置換を、FAB又はscFv断片に基づくホモ二量体免疫グロブリン中でアッセイした。プロテインAとの結合を低減又は無くすための置換を有する、重鎖内のVH3サブクラスの可変重鎖ドメインの存在がプロテインAに基づくあらゆるディファレンシャルアフィニティー法を妨害することが、見出された。このような大きな妨害に対する解決策は、プロテインAに基づくディファレンシャルアフィニティー法のために、VH3サブクラスと結合するプロテインAを低減又は除去するフレームワーク置換の形で見出された。
哺乳動物細胞の一過性発現のための発現ベクターの構築
異なるポリペプチド鎖を一部又は全部コードするcDNAをGENEART AG(ドイツ、レーゲンスブルク)によって最初に遺伝子合成し、これを標準的な分子生物学技法を用いて修飾した。PCR産物を、適切なDNA制限酵素で消化し、精製し、同じDNA制限酵素で予め消化しておいたウシホルモンポリアデニル化物(bovine hormone poly-adenylation)(ポリ(A))とCMVプロモーターとを有する修飾pcDNA3.1プラスミド(スイス、ツークのInvitrogen AG)にライゲートした。すべてのポリペプチド鎖を、この発現ベクターに独立にライゲートした。この場合、分泌は、マウスVJ2Cリーダーペプチドによって引き起こされた。
抗体、ScFv-Fc融合タンパク質、BEAT抗体、及び抗原は、別途明示しない限り、以下に記載のように発現した。一過性発現の場合、操作された各鎖と等量のベクターを、ポリエチレンイミン(PEI;スイス、ブーフスのSigma)を用いて、懸濁適合HEK293-EBNA細胞(英国、テディントンのATCC-LGL標準品;カタログ番号:CRL-10852)にコトランスフェクトした。一般的に、1ml当たり細胞0.8-1.2百万個の密度で懸濁状態の細胞100mlを、DNA-PEI混合物と共にトランスフェクトする。操作された各鎖の遺伝子をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞に導入すると、該細胞を4から5日間さらに培養することにより免疫グロブリン構築物が生成されて、培地(0.1%プルロニック酸、4mM グルタミン、及び0.25μg/mlジェネテシンを補充した、EX-CELL 293、HEK293-無血清培地(Sigma))中への分泌が可能となる。分泌された免疫グロブリンを含有する無細胞培養上清を、遠心分離とその後の滅菌濾過により調製し、さらなる分析で用いた。
Fc 133断片及びホモ二量体scFv-Fc免疫グロブリンの精製
捕捉溶出モード(capture-elution mode)クロマトグラフィー
精製前に、上清を0.1容量(V)の1M トリス-HCl(pH8.0)で条件付けした。Protein G SepharoseTM 4 Fast Flow(スイス、グラットブルックのGE Healthcare Europe GmbH;カタログ番号17-0618-01)を、条件付けした上清に添加した。混合物を、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、結合したタンパク質を、10CVのPBS(pH7.4)で洗浄し、4カラム容量(CV)の0.1M グリシン(pH3.0)で溶出し、0.1Vの1M トリス-HC(pH8.0)で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画をSDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12%アクリルアミド、スイス、バーセルのInvitrogen AG)により非還元条件下で分析した。
生成後、Fc 133断片を含有する細胞培養上清を、Protein G SepharoseTM 4 Fast Flow(上記)を用いて、捕捉溶出モードクロマトグラフィーで最初に精製した。次に、捕捉溶出モードクロマトグラフィーから得られた溶出物質を、1mlのHiTrapTM MabSelect SuReTMプロテインAカラム(プロテインA結合部位突然変異体)に充填した。カラムを0.2M リン酸クエン酸バッファー(pH8.0)中で事前に平衡化し、AKTApurifierTMクロマトグラフィーシステム(カラム及び装置はいずれもGE Healthcare Europe GmbH製;カラムカタログ番号:11-0034-93)で、流速1ml/分で稼働させた。様々な量の二のバッファー(ランニングバッファー(A):0.2M リン酸クエン酸バッファー(pH8.0)及び溶出バッファー(B):0.04M リン酸クエン酸バッファー(pH3.0))を組み合わせたpH直線勾配で溶出を実施した。直線勾配を、B0%からB100%まで5カラム容量(CV)で実施した。溶出分画を0.1Vの1M トリス-HCl(pH8.0)で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画をSDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12%アクリルアミド、スイス、バーセルのInvitrogen AG)により非還元条件下で分析した。
生成後、細胞培養上清を、0.1Vの1M トリス-HCl(pH8.0)で条件付けした。プロテインL樹脂(米国、ピスカタウェイのGenescript)を条件付けした上清に添加し、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、結合したタンパク質を10CVのPBS(pH7.4)で洗浄し、4CVの0.1M グリシン(pH3.0)で溶出し、最後に0.1Vの1M トリス-HCl(pH8.0)で中和した。プロテインA結合を評価するために、プロテインL精製後のFABを、1mlのHiTrap MabSelectTMカラム(スイス、グラットブルックのGE Healthcare Europe GmbH)に、pH8.0(クエン酸/Na2HPO4バッファー)にて注入した。様々な量の二のバッファー(ランニングバッファー(A):0.2M リン酸クエン酸バッファー(pH8.0)及び溶出バッファー(B):0.04M リン酸クエン酸バッファー(pH3.0))を組み合わせたpH直線勾配で溶出を実施した。直線勾配を、B0%からB100%まで5CVで実施した。溶出分画を0.1Vの1M トリス-HCl(pH8.0)で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画をSDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12%アクリルアミド、スイス、バーセルのInvitrogen AG)により非還元条件下で分析した。
精製スキームには、上記手順に従い、捕捉溶出モードクロマトグラフィーと、その後の勾配モードクロマトグラフィーが含まれた。
生成後、0.2M リン酸クエン酸バッファー(pH6.0)中で事前に平衡化した1mlのHiTrapTM MabSelect SuReTMプロテインAカラム上に無細胞上清を充填し、AKTApurifierTMクロマトグラフィーシステム(いずれもGE Healthcare Europe GmbH製;カラムカタログ番号:11-0034-93)で、流速1ml/分で稼働させた。ランニングバッファーは、0.2M リン酸クエン酸バッファー(pH6)であった。目的のヘテロ二量体の溶出を、20mM クエン酸ナトリウムバッファー(pH4)を用いて実施する一方、ホモ二量体種を0.1M グリシン(pH3.0)で溶出した。
溶出後、280nmでのOD読み取りを行い、目的のヘテロ二量体を含有する画分をプールし、0.1容量の1M トリス(pH8.0)(Sigma)で中和した。
上清、通過画分、及び溶出分画をSDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12%アクリルアミド、スイス、バーセルのInvitrogen AG)により非還元条件下で分析した。
熱量測定法を用い、抗体の熱安定性を比較した。熱量測定を、VP-DSC示差走査式マイクロカロリメーター(differential scanning microcalorimeter)(スイス、グラットブルックのGE Healthcare Europe GmbH)で実施した。細胞容積は0.128mlであり、加熱速度は1℃/分であった。また、過剰圧力は64p.s.iに保った。タンパク質断片はすべて、PBS(pH7.4)中1-0.5mg/mlの濃度で用いた。各タンパク質のモル熱容量を、同一のバッファーを含有するがタンパク質が省略された重複試料との比較により見積もった。部分的なモル熱容量及び融解曲線を、標準手順を用いて分析した。サーモグラムは、ベースライン補正し、濃度を正規化した後、Origin v7.0ソフトウェア内の非二状態モデル(Non-Two State model)を用いてさらに分析した。
非還元試料調製
40μgの脱塩したタンパク質試料を、5mMのヨードアセトアミド(Sigma)を含有するSDS試料バッファー(スイス、ニヨンのBeckman Coulter International S.A.;IgG Purity Kit、カタログ番号:A10663)中で緩衝した。10kDaの内部標準をこの試料に添加した。試料混合物を、70℃で10分間加熱した。
試料調製後、220nmに設定したフォトダイオードアレイ検出器(DAD)が取り付けられたProteomeLab PA 800(スイス、ニヨンのBeckman Coulter International S.A.)で、試料を測定した。ID50μm×30.2cm(検出器までの有効長さ20.2cm)のベア溶融シリカキャピラリー(bare-fused silica capillary)を分離メディウムとして用いた。試料注入及び分離を、SDS-分子量ゲルバッファー中にて、逆極性で、それぞれ5及び15kVの定電圧で実施した。2Hzの速度でデータを記録し、電流は分離の間中、安定であった。キャピラリー及び試料を25℃にサーモスタット制御した。
プロテイAに対する結合を除去されたFAB断片のSPR試験
IGHG1 Fc断片と融合したヒトHER2細胞外領域をコードするcDNAを、上記の重及び軽発現ベクターと同様の発現ベクターにクローニングし、PEI法(PCT公開番号:国際公開第2012131555号参照)を用いてHEK293E細胞に一過的にトランスフェクトした。上清を、0.1Vの1M トリス-HCl(pH8.0)で条件付けし、実施例1に記載したように抗原をプロテインA捕捉-溶出クロマトグラフィーにより精製した。SPR実験のために、モノクローナルマウス抗ヒトIgG(Fc)抗体センサーチップを用いた。これは、Fcと融合した組換えHER2抗原を正しい向きで捕捉することを可能にした(Human Antibody Capture Kit、カタログ番号BR-1008-39、GE Healthcare Europe GmbH)。測定は、BIAcoreTM2000装置(スイス、グラットブルックのGE Healthcare Europe GmbH)で記録した。異なる希釈の抗HER2 FAB(50、25、12.5、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39nM)をセンサーチップ上に4分間注入した。各測定について、7分間の解離の後に、3M MgCl2溶液を1分間、30μl/分にて再生のために注入した。データ(センサグラム:fc2-fc1)を、1:1ラングミュアを用いてフィットさせた。各測定の開始時に、捕捉されたHER2-Fcの実験変動を考慮して、すべてのフィッティングにおいてRmax値をローカルに設定した。測定は2連で実施し、参照のためにゼロ濃度試料を含めた。カイ2及び残差の値をともに用いて、実験データと個別の結合モデルとの間のフィッティングの質を評価した。
SPR分析を用いて、異なる抗体(マウス及びヒト化抗体)の結合反応速度に関する結合及び解離速度定数を測定した。抗体の結合反応速度は、BIAcore 2000装置(スイス、グラットブルックのGE Healthcare Europe GmbH)で室温で測定し、BiaEvaluationソフトウェア(バージョン4.1、BIAcore-GE Healthcare Europe GmbH)を用いて分析した。
測定は、市販のアミンカップリングキット(GE Healthcare Europe GmbH、カタログ番号:BR-1000-50)を使用して、目的のリガンドと個々に結合したCM5センサーチップ(GE Healthcare Europe GmbH、カタログ番号:BR-1000-14)で実施した。プロテインGリガンドは、Pierce(スイス、ローザンヌのThermo Fisher Scientific-Perbio Science S.A、カタログ番号:21193)からのものであった。
HPB-ALL細胞(ドイツ、ブラウンシュワイクのDSMZ、カタログ番号:ACC483)を、FACS染色用のCD3陽性細胞株として用いた。HPB-ALLを、10%FCS、100U/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシンを補充したRPMI 1640中で維持した。キメラOKT3抗体及びヒト化バリアントの100μl希釈系列を、氷上で45分間(FACSバッファとしてで参照)、1%BSA及び0.1%アジ化ナトリウム(FACSバッファーという)を補充したPBS中の4×105HPB-ALL細胞とともにインキュベートした。無関係のヒトIgG1をアイソタイプコントロールとして、またキメラOKT3抗体をポジティブコントロールとして使用した。洗浄後、細胞を氷上で45分間、抗ヒトFc-PE(オーストリア、ウィーンのEBioscience)の1/200希釈物とともにインキュベートした。次いで、細胞を再び洗浄し、200μlのFACSバッファーに再懸濁した。各試料の相対平均蛍光発光を、FACSCalibur
(スイス、アルシュヴィルのBD Biosciences)で測定した。結果を、キメラOKT3抗体と比較したHBP-ALLの相対的染色として、図1に要約する。
ヒトHER2陽性細胞株
HER2抗原を発現するヒト細胞は、PCT公開番号:国際公開第2010108127号に記載されている。本明細書で使用されるHER2陽性ヒト細胞株は以下の通りであった。
BT474(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:HTB-20)
培養条件:150cm2の組織培養フラスコ(スイス、トラザーディンゲンのTPP;カタログ番号:90150)に、10%熱不活性化FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG、カタログ番号:10378-016)、1%ピルビン酸ナトリウム溶液(オーストリア、パッシングのPAA Laboratories;カタログ番号:S11-003)、1%MEM 非必須アミノ酸(PAA Laboratories、カタログ番号:M11-00dsmz3)、及び1%GlutaMAX-1(Invitrogen AG、カタログ番号:35050-038)を補充したRPMI培地。細胞は、1週間に2回継代した。
JIMT-1(ドイツ、ブラウンシュワイクのDSMZ、カタログ番号:ACC589)
培養条件:10%熱不活性化FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG、カタログ番号:10378-016)、1%ピルビン酸ナトリウム溶液(PAA Laboratories、カタログ番号:S11-003)、1%MEM非必須アミノ酸(PAA Laboratories、カタログ番号:M11-003)、及び1%GlutaMAX-1(Invitrogen AG、カタログ番号:35050-038)を補充したダルベッコ改変必須培地(DMEM(1X))+GlutaMAX-1(Invitrogen AG、カタログ番号:31966-012)。細胞は、1週間に2-3回継代した。
MDA-MB-231(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:HTB-26)。
培養条件:JIMT-1と同じ培養条件。
HT-1080(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CCL-121)。
培養条件:HT1080細胞を、10%熱不活化FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG、カタログ番号:10378-016)、及び1%グルタミン(Invitrogen AG、カタログ番号:25030-024)を補充したEMEM培地で培養する。週3回、細胞を分散培養する(6分の1希釈)。
NCI-N87(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CRL-5822)。
培養条件:NCI-N87細胞を、10%熱不活性化FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG、カタログ番号:10378-016)、1%ピルビン酸ナトリウム溶液(オーストリア、パッシングのPAA Laboratories;カタログ番号:S11-003)、1%MEM 非必須アミノ酸(PAA Laboratories、カタログ番号:M11-00dsmz3)、及び1%グルタミン(Invitrogen AG、カタログ番号:25030-024)を含んだRPMI 1640培地で培養する。週2回、細胞を分散させた(3分の1希釈)。
CD38抗原を発現するヒト細胞は、PCT公開番号:国際公開第2005103083号、国際公開第2008047242号、国際公開第2011154453号、及び国際公開第2012092612号に記載されている。本明細書で使用されるCD38陽性ヒト細胞株は以下の通りであった。
安定な組換えCHO[CD38]細胞
Source Biosciences(ドイツのベルリン、カタログ番号:IRAU37D11、4309086)で注文したヒトCD38をコードする遺伝子。ヒトCD38は、コザック配列、開始コドン、それに続いてシグナルペプチド(マウスのVリーダー)を5’末端に、NheI制限部位3’末端に付加したプライマーを用いて増幅させた。アンプリコンを、NheI及びHindIIIを用いて切断し、自社で開発したpcDNA3.1(Invitrogen AG)由来のベクターであるpT1の発現カセットにクローニングした。pT1の発現カセットは、多シストロン性mRNA上の二のIRES(内部リボソーム侵入部位)を用い、目的の遺伝子の発現をGFP及びPAC(ピューロマイシン耐性のための遺伝子)の発現と結び付ける。プラスミドのミディプレップを調製した。また、クローンCD38のオープンリーディングフレームをDNA配列決定により確認した。懸濁CHO-S細胞(Invitrogen AG)を、50mLバイオリアクター式(TubeSpin50バイオリアクター、スイス、トラザーディンゲンのTPP)中でポリエチレンイミン(JetPEI(登録商標)、フランス、イルキーチュのPolyplus-transfection)を用いてトランスフェクトした。この目的のために、指数増殖細胞をOptiMEM培地(Invitrogen AG、カタログ番号:31985-047)に播種した。これらの細胞にJetPEI(登録商標):DNA複合体を添加した。エキソサイトーシスのために振とう(200 RPM)下37℃でJetPEI(登録商標):DNA複合体とともに5時間インキュベートした後、4mM Glnを補充した1容量の培地PowerCHO2(スイス、ベットラッハのLonza、販売店RUWAG Lifescience、カタログ番号:BE12-771Q)を細胞懸濁液に添加した。次いで、細胞を37℃、5%CO2及び80%湿度の振とうプラットフォーム上でインキュベートした。トランスフェクションの1日後、ピューロマイシン(Sigma、カタログ番号:P8833-25mg)を含有する選択培地中に異なる濃度で、細胞を96ウェルプレートに播種した。静状態で約14日間の選択後、TubeSpin 50バイオリアクターを用いて、46個の高GFP発現細胞プールを懸濁培養物として増やした。懸濁液にうまく適合したら、細胞のCD38についての分析をFACSにより行った。均一なCD38染色プロフィールを有する安定なCHO[CD38]クローンを選択し、ここで使用した。
その他のCD38陽性細胞株は以下を含む。
NCI-H929(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CRL-9068)。
Namalwa(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CRL-1432)。
U266(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:TIB-196)
RPMI 8226(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CCL-155)。
培養条件:10%熱不活性化FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG)、及び1%GlutaMAX-1(Invitrogen AG)を補充したRPMI 1640培地
Raji(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CCL-86)
Daudi(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CCL-213)
OX40抗原を発現するヒト細胞は、PCT公開番号:国際公開第2013008171号に記載されている。
末梢血単核細胞(PBMC)及びHBP-ALLは、ヒトOX40陽性細胞株の例である。
ここでは、安定な組換えCHO[OX40]細胞を使用した。ヒトOX40をコードする合成cDNAを有する組換えCHO細胞株を、上記の安定な組換えCHO[CD38]細胞株のプロトコールと同様のプロトコールを用いて操作した。
CD20抗原を発現するヒト細胞は、PCT公開番号:国際公開第2010095031号に記載されている。CD20+がん細胞の例は、Daudiがん細胞株(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CCL-213)であり、これらのBリンパ芽球がん細胞は、20%FBS並びに1%P/S;1%L-Glut;1%Na-Pyr、及び1%NEAAを補充したRPMI 1640培地(Sigma)で培養する。該細胞を、5%CO2を補給して37℃で培養する。
EGFR抗原を発現するヒト細胞は、PCT公開番号:国際公開第2010108127号に記載されている。EGFR+がん細胞の例は、HT-29がん細胞株(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:HTB-38)であり、これらの結腸直腸がん細胞は、10%FBS並びに1%P/S;1%L-Glut;1%Na-Pyr、及び1%NEAAを補充したマッツコイ5A培地(Sigma)で培養する。該細胞を、5%CO2を補給して37℃で培養する。
CD19抗原を発現するヒト細胞は、PCT公開番号:国際公開第2010/095031号に記載されている。Namalwa(ATCC-LGL標準品;カタログ番号CRL-1432)及びRaji(ATCC-LGL標準品;カタログ番号CCL-86)は、ヒトCD20陽性細胞株の例である。
PCT公開番号:国際公開第2010/033736号の71頁には、インターロイキン-4(IL-4)及び抗CD40抗体を添加することによって、ヒトPBMCをIgE産生B細胞にクラススイッチするための方法が記載されている。
ヒトCD3ガンマ-イプシロン-Fc融合タンパク質
26残基ペプチドリンカー(配列:GSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGS;配列番号186)によりヒトCD3イプシロン細胞外領域(UniProtアクセッション番号:P07766、残基22-118(配列番号185))と融合した、ヒトCD3ガンマ細胞外領域をコードするcDNA(UniProtアクセッション番号:P09693 残基23-103(配列番号184);UniProt Consortium(2013) Nucleic Acids Res., 41(データべース特集号(Database issue)):D43-7; http://www.uniprot.org/)を、GENEART AG(ドイツ、レーゲンスブルク)により最初に合成した。この合成遺伝子を、標準的なオーバーラップPCR法を用いてヒトIgG1 Fc部分と融合させ、ヒトIgG1 Fc cDNAテンプレートもGeneart AGから入手した。得られたcDNAを上記修飾pcDNA3.1プラスミドにクローニングした。
ヒトCD3イプシロンペプチド1-26をコードするcDNA(UniProtアクセッション番号:P07766、アミノ酸23-48、配列番号188)及びカニクイザルCD3イプシロンペプチド1-26(UniProtアクセッション番号:Q95LI5、アミノ酸22-47、配列番号189)をコードするcDNAを、ヒト及びカニクイザルCD3イプシロン細胞外領域それぞれについて、GENEART AGから入手した合成cDNAからPCR増幅させた。続いて、増幅された産物を、標準的なオーバーラップPCR法を用いてヒトIgG1 Fc部分と融合させた。ヒトIgG1 Fc cDNAテンプレートは、Geneart AGから入手した。得られたcDNAを上記修飾pcDNA3.1プラスミドにクローニングした。
HER2可溶性細胞外領域の調製は、PCT公開番号:国際公開第2012131555号に記載されている。ポリヒスチジンタグと融合したヒトHER2可溶性細胞外領域(本明細書ではHER2-hisと称する)又はヒトIgG1 Fc領域と融合したヒトHER2可溶性細胞外領域((本明細書ではHER2-Fcと称する)を調製した。
ヒトCD38のcDNAをSource Biosciences(ドイツのErwin-Negelein-Haus、カタログ番号:IRAU37D11、4309086)から得、その細胞外領域(UniProtアクセッション番号:P28907 残基43-300)をPCR増幅し、pcDNA3.1(Invitrogen Ag)由来の自社製発現ベクターにクローニングした。この発現ベクターは、コザック配列及び開始コドン、それに続いて、多重クローニング部位の5’末端に対するマウスVJ2Cリーダーペプチド及び3’末端に対する6-His-タグを包含した。6-His-タグと融合したヒトCD38の可溶性細胞外領域(配列番号192)は、次のように発現させ、精製した:HEK細胞、0.1%プルロニック酸(Invitrogen AG)、発現ベクター、及びポリエチレンイミン(JetPEI(登録商標)、フランス、イルキーチュのPolyplus-transfection)を含有する1容量のRPMI1640培地(PAA Laboratories、カタログ番号E15-039)を37℃、5%CO2及び80%湿度の振とうフラスコ中でインキュベートした。6mMのグルタミンを補充した1容量のExCell293培地を4時間後に混合物に添加し、さらに5日間インキュベーションを続けた。ポストプロダクション、無細胞上清を遠心分離により調製し、0.2μmフィルターを用いて濾過し、1M トリス(pH8.7)を用いてpHを7.4(4℃)に調整した。Ni-Sepharose Excellビーズ(GE Healthcare、カタログ番号:17-3712-03)を溶液に添加し、撹拌しながら4℃で一晩インキュベートした。自然流下による精製(gravity-flow purification)のために、その溶液をEcono-Column(スイス、ライナハのBio-Rad Laboratories AG、カタログ番号:737-4252)に充填した。ビーズをPBS(2×)、20mM イミダゾールで洗浄し、タンパク質をPBS、500mM イミダゾール中で溶出させた。溶出画分をプールし、4℃で2回の透析工程によりバッファーをPBSと交換した。精製したヒトCD38細胞外領域を、0.22μmシリンジフィルターを用いて濾過した。
上記の方法を用いて、6-His-tag(配列番号193)と融合したカニクイザルCD38抗原の可溶性細胞外領域をクローニングし、発現させ、精製した。
ヒトOX40の可溶性細胞外領域を調製する方法は、PCT公開番号:国際公開第2013008171号に記載されている。
EGFR可溶性細胞外領域抗原調製の例は、PCT公開番号:国際公開第2012131555号に記載されている。
末梢血単核細胞の調製
末梢血単核細胞(PBMC)を製造するために、ヒト白血球含有血液フィルターをスイス、La Chaux-de-Fondsの血液採集センター(Blood Collection Centre)(Centre de Transfusion Sanguine et Laboratoire de Serologie,rue Sophie-Mairet 29,CH-2300)から集めた。10U/mlのリケミン(liquemin)(スイス、ルツェルンのDrossapharm AG)を含有する60mlのPBSとともにバックフラッシングすることにより、細胞をフィルターから除去した。次いで、50mLのBlood-Sep-Filter Tube(スイス、バーゼルのBrunschwig)を用い、製造者の指示通りにPBMCを精製した。室温で800gで20分間、管を遠心分離し(ブレーキなし)、細胞を界面から回収した。FBS又はリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を含まないロズウェルパーク記念研究所(RPMI、オーストリア、パッシングのPAA Laboratories)培地で細胞を3回洗浄した。RDL培地(10%熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS)及びペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI)中に10e6細胞/mLでPBMCを再懸濁させ、アッセイ前に5%CO2インキュベーター内で37℃で一晩培養した。
T細胞精製は、pan-T細胞単離キットII(ドイツ、ベルギッヒグラヂバッハのMyltenyi Biotec GmbH、カタログ番号130-091-156)を使用し、製造業者の指示通りにPBMC単離後すぐに行った。精製後、T細胞をRDL培地中に10e6細胞/mLで再懸濁させ、アッセイ前に5%CO2インキュベーター内で37℃で一晩培養した。
かなり類似した結果の二の異なる読み取りを使用して、リダイレクトキリングを定量化した。
フローサイトメトリー法は、本明細書ではRDL-FACS法と称され、Schlereth Bら((2005) Cancer Res, 65: 2882-2889), Moore PA et al. ((2011) Blood, 117(17): 4542-51)及びFriedrich M et al. ((2012) Mol Cancer Ther, 11: 2664-2673)に記載されるように蛍光サイトメトリーに基づく。標的細胞を回収し、計数し、1回洗浄し、PBS+1μMのカルボキシフルオレセイン スクシンイミジルエステル(CFSE、Sigma)に5×10e6細胞/mlで再懸濁させた。細胞を、5分毎に穏やかに攪拌しながら37℃で15分間インキュベートした。CFSE負荷細胞をRDL培地で3回洗浄し、RDL培地に2×10e5細胞/mLで再懸濁させた。PBMCを回収し、計数し、2×10e6細胞/mL RDL培地に再懸濁させた。抗体の段階希釈液(3×溶液)をRDL培地中で調製した。標的細胞(50μL/ウェル)、T細胞(50μL/ウェル)、及び3×抗体溶液(50μl/ウェル)を平底96ウェルプレート(スイス、トラザーディンゲンのTPP)に分配した。エフェクター:標的比は、10:1であった。プレートを37℃、5%CO2インキュベーター内で48時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを300gで3分間遠心分離し、プレートをフリックすることにより上清を捨てた。プレートを200μlのPBSで1回洗浄し、再び遠心分離し、PBSは捨てた。予め加温したAccutase溶液(Invitrogen AG)を添加し、プレートを37℃で10分間インキュベートした。100μlのRDL培地の添加後に上下にピペッティングすることにより、剥離、接着細胞を再懸濁させた。溶液をU底96ウェルプレート(TPP)に移した。U底プレートを300gで3分間遠心分離し、上清を捨て、1/40希釈で7-AAD(スイス、アルシュヴィルのBecton Dickinson AG)を補充した冷FACSバッファー(PBS+2%FBS+10%バーゼン液)200μlに細胞を再懸濁させた。プレートは、Guava easyCyteTM Flow Cytometer(スイス、ツークのMillipore AG)ですぐに得られた。各ウェルについて、Flowjo(登録商標)ソフトウェア(ドイツ、ベルギッヒグラヂバッハのMiltenyi Biotec GmbH)を用いてCFSE陽性7ADD陰性集団をゲーティングすることにより、生存標的細胞の絶対数を決定した。標的細胞のみをベースラインとしてインキュベートした条件を用いて、各試料の特異的細胞傷害性のパーセンテージを決定した。EC50値は、Prismソフトウェア(米国、カリフォルニア州ラホヤのGraphPad Software)を用いた非線形変動傾き回帰法(nonlinear variable slope regression method)を用いて決定した。特定のリダイレクト溶解(RDL)のパーセンテージは、試験抗体が添加された状態に対する抗体のない状態の特異的細胞傷害性のパーセンテージを差し引くことによって計算した。
RDL-MTS法と本明細書で称される細胞生存率法は、Buhler Pら((2008) Cancer Immunol Immunother, 57: 43-52)、Labrijn AFら((2013) Proc Natl Acad Sci USA, 110(13): 5145-50)、及びPCT公開番号:国際公開第2012143524号に記載されているような、細胞生存率を評価するための比色法に基づく。標的細胞を回収し、計数し、1回洗浄し、RDL培地に2×10e5細胞/mlで再懸濁させた。PBMCを回収し、計数し、2×10e6細胞/mL RDL培地に再懸濁させた。抗体の段階希釈液(3×溶液)をRDL培地中で調製した。標的細胞(50μL/ウェル)、T細胞(50μL/ウェル)、及び3×抗体溶液(50μl/ウェル)を平底96ウェルプレート(TPP)に分配した。エフェクター:標的比は、10:1であった。プレートを37℃、5%CO2インキュベーター内で48時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を捨て、プレートを200μLのPBSで3回洗浄してPBMCを除去し、次いで100μlのRDL培地を各ウェルに添加した。読み取りは、CellTiter96(登録商標)キット(ドイツ、ジューベンドルフのPromega AG)を用い、製造者の指示に従って行った。簡潔には、10-20μlのMTS試薬を各ウェルに添加し、プレートを37℃で5%CO2インキュベーター内で2-6時間インキュベートした。次いで、490nmの吸光度をBioTek Synergy プレートリーダー(スイス、ルツェルンのBioTek AG)で読み取った。式:特異的殺傷率=100×[(SD-Sp)/(SD-MD)]を用いて特異的殺傷率を算出した。SDは、標的細胞を単独でインキュベートした自然死状態で測定した吸光度である。Spは、各試験条件(標的細胞+PBMC+抗体)で測定された吸光度である。MDは、標的細胞を3回の凍結及び融解サイクルにより溶解させた最大死状態で測定した吸光度である。特定のリダイレクト溶解(RDL)のパーセンテージは、試験抗体が添加された状態に対する抗体のない状態の特異的細胞傷性パーセンテージを差し引くことによって計算した。EC50値は、Prismソフトウェア(GraphPad Software)を用いた非線形変動傾き回帰法を用いて決定した。
JIMT-1異種移植片
細胞株及び試薬
乳がんJIMT-1細胞株をDSMZ(カタログ番号:ACC589)から入手した。10%熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)(英国、ロンドンのAMIMED、カタログ番号:Z10834P)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG、カタログ番号:10378-016)、1%ピルビン酸ナトリウム溶液(PAA Laboratories、カタログ番号:S11-003)、1%MEM非必須アミノ酸(PAA Laboratories、カタログ番号:M11-003)、及び1%GlutaMAXTM-1(Invitrogen AG、カタログ番号:35050-038)を補充したGlutaMAXTM-1(Invitrogen AG、カタログ番号:31966-021)含有DMEM(1X)に細胞を維持した。StemPro Accutase(Invitrogen AG、カタログ番号:A11105-01)を用い、週に2回に細胞を分散させた。
スイス、La Chaux-de-Fondsの血液採集センター(Blood Collection Centre)(Centre de Transfusion Sanguine et Laboratoire de Serologie,rue Sophie-Mairet 29,CH-2300)からのヒト白血球含有血液フィルターより、末梢血単核細胞(PBMC)を回収した。10U/mLのリケミン(liquemin)(スイス、ルツェルンのDrossapharm AG)を含有する60mlのPBSとともにバックフラッシングすることにより、細胞をフィルターから除去した。次いで、50mlのBlood-Sep-Filter Tube(スイス、バーゼルのBrunschwig)を用い、製造者の指示に従ってPBMCを単離し、管を800gで室温で20分間遠心分離し(ブレーキなし)、細胞を界面から回収した。細胞は、FBS(RPMI、Invitrogen AG、カタログ番号:21875-091)なしのロズウェルパーク記念研究所培地で3回洗浄した。PBMCを10%FBS(AMIMED)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG)を補充したRPMI培地に10e6細胞/mlで再懸濁させ、37℃、5%CO2下で一晩培養した。標的細胞を回収し、計数し、1回洗浄し、PBSに5×10e6細胞/mlで再懸濁させた。
インビボ実験は、5週齢の免疫不全
NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)雌マウスであって、T細胞、B細胞、及びナチュラルキラー細胞欠損によって特徴付けられたマウス(フランス、サン=ベルトヴァンのJanvier Labs)で実施した。前記マウスは、標準的なげっ歯類マイクロアイソレーターケージ内で、無菌かつ標準化された環境条件(20±1℃の室温、50~10%の相対湿度、12時間の明暗リズム)で維持した。放射線照射食物、寝床、及び0.22μmの濾過飲料水をマウスに与えた。すべての実験は、管轄州当局(スイス、ヌーシャテル州)から許可を得て、スイスの動物保護法(Swiss Animal Protection Law)に従って行った。動物保護法に従い、腫瘍体積が2000mm3を超えると、マウスを安楽死させなければならなかった。対応する治療群対ビヒクルコントロール群の平均腫瘍体積の統計分析を、ANOVA一方向分析及びボンフェローニのパラメトリック検定によって行った。
移植前に、すべてのマウスの右脇腹を、VEETクリーム(スイス、ワリゼレンのReckitt Benckiser AG)を使って脱毛した。移植日及びその後週に1回、マウスの写真撮影及び体重測定を行った。各動物について、5×10e6ヒトPBMCを、最終容積0.2mlのPBS中5×10e6のJIMT-1乳がん細胞と混合した。4の異なるPBMCドナーを含めた。PBMC/JIMT-1混合物を各NOD/SCIDマウスの右脇腹に皮下注射した。ヒトPBMCを全く含まない最終容量0.2mlのPBS中5×10e6のJIMT-1乳癌細胞を有するコントロール群を含めた。10匹のJIMT-1/PBMC移植動物(1PBMCドナーにつき1群)の各群について、移植の3時間後、5匹の動物にHER2/CD3-1二重特異性抗体を0.05mg/kgで静脈内治療した(容量100μlを使用)。治療は、2週間の間、週に3回、2日に1回繰り返された。腫瘍を、週に2回、ノギスを用い二つの垂直寸法で測定し、腫瘍体積を次式:腫瘍体積=[(幅2×長さ)/2]に従って計算した。
免疫グロブリン定常領域におけるプロテインA結合を除去する方法は、既知である(Lindhofer H. et al., (1995) J Immunol, 155(1): 219-225; US6,551,592; Jendeberg L. et al., (1997) J Immunol Methods, 201(1): 25-34; PCT公開番号:国際公開第2010151792号)。完全長ホモ二量体免疫グロブリンにおけるプロテインA除去法の使用を評価するために、混合IGHG1-IGHG3 Fcフォーマットに基づく抗HER2ホモ二量体免疫グロブリン及び対応するFc 133コントロール断片を調製した。抗HER2ホモ二量体免疫グロブリンは、天然抗体と同様にフォーマットされ、Fc 133断片と融合した抗HER2特異性を有するFAB断片からなる(天然のヒトIGHG3アイソタイプ由来のFc配列であって、ヒンジ配列が天然のヒトIGHG1アイソタイプ由来のヒンジ配列全体に置換されており、Fc 133は配列番号1と略記されている。ここで、名称にある数字は、ヒンジ/CH2/CH3の順で各ドメインの免疫グロブリンガンマアイソタイプサブクラスに対応し;対応する全長抗HER2免疫グロブリンは、本明細書で抗HER2 FAB-Fc133と称され;重鎖は配列番号2を有し、軽鎖は配列番号3を有する)。トランスフェクション後、材料及び方法のセクションに記載したプロトコールに従い、勾配クロマトグラフィーにより、抗HER2 FAB-Fc 133ホモ二量体及びFc 133断片のプロテインA結合についてアッセイした。図3及び図4Aに示すように、抗HER2 FAB-Fc 133ホモ二量体が結合することができる一方で、Fc 133断片は、市販のMabSelect SuReTMプロテインA樹脂(GE Healthcare Europe GmbH)に結合しなかった。
ヒトCD3抗原に対する抗原結合部位
ヒトCD3イプシロンサブユニットは、二重特異性の関与を介してT細胞リダイレクトキリングを引き起こすように選択された。
本明細書で使用される抗ヒトCD3イプシロン抗原結合部位は、マウスOKT3抗体(Janssen-Cilagにより市販され、その後販売中止されたMuromonab-CD3、商品名Orthoclone OKT3;それぞれ配列番号18及び19を有するマウス可変重鎖及び軽鎖ドメイン)。OKT3マウス可変ドメインをヒト化し、scFv及びFAB断片トとしてフォーマットした。
マウス抗体SP34は、1985年に最初に記述された(Pessano S et al., (1985) EMBO J, 4(2):337-44)。それは、HPB-ALL細胞からの変性タンパク質抽出物で免疫したマウスから得られたハイブリドーマによって産生され、該抗体はヒト特異性及びカニクイザルに対する交差反応性を有する。ヒト及びカニクイザルCD3イプシロンサブユニット上のSP34エピトープが知られている(それぞれ配列番号195及び196)。
T細胞をリダイレクトしてHER2陽性がん細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、様々な種類のヒト乳がんを治療するのに有用である。抗HER2抗体は、記載されており(Blumenthal GM et al., (2013) Clin Cancer Res, 19(18): 4911-6)、現在臨床で使用されているものもあれば、現在ヒトでの臨床検査中であるものもある(Tsang RY & Finn RS (2012) Br J Cancer, 106(1): 6-13)。
CD38は、造血細胞及び固形組織に通常見られるII型膜貫通糖タンパク質である。CD38は、様々な悪性血液病においても発現する。T細胞をリダイレクトしてCD38陽性がん細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、多発性骨髄腫、B細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞急性リンパ球性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、前リンパ球性/骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、濾胞性リンパ腫、NK細胞白血病、及び形質細胞白血病を含む様々な悪性血液病を治療するのに有用であろう。いくつかの抗CD38抗体は、研究試薬又は治療薬候補として記述されている(PCT公開番号:国際公開第2006099875号)。最もよく特徴がわかっている抗ヒトCD38抗体の中には、OKT-10及びHB-7マウスハイブリドーマがある(Hoshino S et al., (1997) J Immunol, 158(2): 741-7)。
CD3及びOX40を標的とする二重特異性抗体は、活性化Tリンパ球の標的化及び枯渇を可能にする。この組み合わせにおいて、CD3及びOX40分子の両方を発現する活性化Tリンパ球は、迅速な細胞消失をもたらす相互殺傷プロセスに関与する。二重特異性抗体によるヒトCD3とOX40の同時関与は、短期間で病原性T細胞を効果的に排除することができる。OX40は、受容体のTNFRスーパーファミリーのメンバーであり、ラットからの活性化CD4+T細胞上に発現される50kDaの糖タンパク質として1987年に最初に同定された(Paterson DJ et al., (1987) Mol. Immunol. 24: 1281-90)。CD28とは異なり、OX40は、ナイーブT細胞上に恒常的には発現しないが、T細胞受容体(TCR)の関与の後に誘導される。OX40は、活性化後24時間から72時間後に発現する二次共刺激分子である。そのリガンドであるOX40Lもまた、休止中の抗原提示細胞上では発現しないが、抗原提示細胞の活性化後に発現する。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化された抗OX40 VH;ヒト化抗OX40/最小移植VH(配列番号278)と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化された抗OX40 VH;ヒト化抗OX40/最大移植VH(配列番号279)と略記される。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化された抗OX40 VL;ヒト化抗OX40/最小移植VL(配列番号280)と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化された抗OX40 VL;ヒト化抗OX40/最大移植VL(配列番号281)と略記される。
T細胞をリダイレクトしてCD20発現B細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、様々な種類のヒトリンパ腫がんを治療するのに有用であり得る。いくつかの抗ヒトCD20抗体は、研究試薬又は治療薬候補として記述されている。最もよく特徴がわかっている抗ヒトCD20抗体の中には、キメラリツキシマブ抗体及びそのヒト化バリアントがある(キメラリツキシマブ抗体、商品名リツキサン(登録商標)、PCT公開番号:国際公開第1994011026号;配列番号143のマウスVHドメイン及び配列番号144のVLドメイン)。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化されたリツキシマブ VH;ヒト化リツキシマブ/最小移植VH(配列番号282)と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化されたリツキシマブ VH;ヒト化リツキシマブ/最大移植VH(配列番号283)と略記される。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化されたリツキシマブ VL;ヒト化リツキシマブ/最小移植VL(配列番号284)と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化されたリツキシマブ VL;ヒト化リツキシマブ/最大移植VL(配列番号285)と略記される。
T細胞をリダイレクトしてEGFR陽性がん細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、様々な種類のヒトのがん、好ましくはヒト膵臓がん及びヒト結腸がんを治療するのに有用であり得る。いくつかの抗ヒトEGFR抗体は、研究試薬又は治療薬候補として記述されている。最もよく特徴がわかっている抗ヒトEGFR抗体の中には、キメラセツキシマブ抗体及びそのヒト化バリアントがある(キメラセツキシマブ抗体、商品名アービタックス(登録商標)、C225、IMC-C225;PCT公開番号:国際公開第199640210号;配列番号145のマウスVHドメイン及び配列番号146のマウスVLドメイン)。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化されたアービタックス VH;ヒト化アービタックス/最小移植VH(配列番号286)と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化されたアービタックス VH;ヒト化アービタックス/最大移植VH(配列番号287)と略記される。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化されたアービタックス VL;ヒト化アービタックス/最小移植VL(配列番号288)と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化されたアービタックス VL;ヒト化アービタックス/最大移植VL(配列番号289)と略記される。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化されたベクティビックス VH;ヒト化ベクティビックス/最小移植VH(配列番号292)と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化されたベクティビックス VH;ヒト化ベクティビックス/最大移植VH(配列番号293)と略記される。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化されたベクティビックス VL;ヒト化ベクティビックス/最小移植VL(配列番号294)と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化されたベクティビックス VL;ヒト化ベクティビックス/最大移植VL(配列番号295)と略記される。
T細胞をリダイレクトしてCD19発現B細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、様々な種類のヒトの血液及び骨髄のがんを治療するのに有用であろう。ヒトCD19分子は、ヒトB細胞の表面に発現する構造的に異なる細胞表面受容体であり、限定されないが、プレB細胞、発生初期のB細胞(すなわち未成熟B細胞)、形質細胞及び悪性B細胞への最終分化を経た成熟B細胞を含む。CD19は、大部分はプレB急性リンパ芽球性白血病(ALL)、非ホジキンリンパ腫、B細胞慢性リンパ球性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、好発急性リンパ球性白血病及びいくつかのヌル急性リンパ芽球性白血病により発現される(Nadler LM et al. (1983) J Immunol, 131: 244-250; Anderson KC et al., (1984) Blood, 63: 1424-1433; Loken MR et al. (1987) Blood, 70: 1316-1324; Uckun FM et al. (1988) Blood, 71: 13-29; Scheuermann RH & Racila E (1995) Leuk Lymphoma, 18: 385-397)。血漿細胞上でのCD19の発現は、それが多発性骨髄腫、形質細胞腫、ワルデンシュトレーム腫瘍等の分化したB細胞腫瘍上で発現され得ることをさらに示唆する(Grossbard ML et al. (1998) Br J Haematol, 102: 509-15; Treon SP et al. (2003) Semin Oncol, 30: 248-52)。
T細胞をリダイレクトして膜結合IgE陽性B細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、喘息又は線維症などの様々な炎症性疾患を治療するのに有用であり得る。いくつかの抗ヒトIgE抗体は、研究試薬又は治療薬候補として記述されている。最もよく特徴がわかっている抗ヒトIgE抗体の中には、オマリズマブ抗体(商品名ソレア(登録商標)、USPTO公開番号:US6761889、US6329509、及びUS20080003218A1;Presta LG et al., (1993) J lmmunol, 151: 2623-2632;配列番号298を有するヒト化VHドメイン及び配列番号299を有するVLドメイン)及びその変異体バリアントがある。
逆突然変異を有しない、安定化されたオマリズマブ VH;安定化されたオマリズマブ/最大移植VH(配列番号300)と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有する、安定化されたオマリズマブ VH;安定化されたオマリズマブ/最小移植VH(配列番号301)と略記される。
逆突然変異を有しない、安定化されたオマリズマブ VL;安定化されたオマリズマブ/最大移植VL(配列番号302)と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有する、安定化されたオマリズマブ VL;安定化されたオマリズマブ/最小移植VL(配列番号303)と略記される。
逆突然変異を有しない、安定化されたBsw17 VH;安定化されたBsw17/最大移植VH(配列番号306)と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有する、安定化されたBsw17 VH;安定化されたBsw17/最小移植VH(配列番号307)と略記される。
逆突然変異を有しない、安定化されたBsw17 VL;安定化されたBsw17/最大移植VL(配列番号308)と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有する、安定化されたBsw17 VL;安定化されたBsw17/最小移植VL(配列番号309)と略記される。
3.1 BEAT(登録商標)法及び内蔵精製システム
BEAT抗体は、「ノブ・イントゥー・ホール」技術と比較して、優れたヘテロダイマー化を示すバイオミミクリーのユニークな概念に基づく重鎖ヘテロ二量体である(PCT公開番号:国際公開第2012131555号)。BEATプラットフォームは、天然ホモ又はヘテロ二量体免疫グロブリンドメイン対間の3D同等位置における接触アミノ酸の交換に基づき、Fcベースの二重特異性抗体の構成要素として利用可能な新規のヘテロ二量体を作り出す。この技術は、任意のタイプの抗原結合スカフォールドを用いた、Fcベースの二重特異性抗体の設計を可能にする。scFv-FABフォーマットは、本明細書において、両方の抗原結合部位のための共通の軽鎖を開発する必要なしに、Fcベースの二重特異性抗体を設計するために使用される。
HER2/CD3標的化BEAT抗体の例
抗HER2及び抗CD3イプシロンアームは、BEAT鎖と融合したscFv断片からなるscFv-Fc型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似のBEAT鎖と融合したFAB断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。FABベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。
L234A及びL235A置換をCH2領域に導入し、また適切な場合にはG65S又はN82aS置換(Kabat番号付け)を使用して、残留プロテインA結合を除去した。ヒトHER2抗原及びヒトCD3イプシロンの両方を標的とするBEAT抗体の例を以下のようにフォーマットした。
これらすべてのBEAT抗体はVH3ドメインを包含する両アームで設計されているため、少なくとも一のVH3ドメインにおけるプロテインA結合の除去だけで、好ましい特異的な精製法の一を用いて目的のヘテロ二量体を容易に精製することができた(図2E参照)。BEAT HER2/CD3-1抗体の特異的なプロテインA精製結果の一例を図13に示し、図14には、精製ヘテロ二量体のキャピラリー電気泳動プロファイルを示す。わずかな含有量のヘテロ二量体汚染物質しか、このプロファイルからは確認することができない。FAB部分を有するようにフォーマットされた重鎖のホモ二量体は、プロテインAに結合しないため、見出されない。scFv断片を有するようにフォーマットされた重鎖のホモ二量体は、わずかな割合(2.5%)で見出され、一工程のプロテインAクロマトグラフィー後にヘテロ二量体含量が97%という結果をもたらした。BEAT HER2/CD3-2、BEAT HER2/CD3-3、BEAT HER2/CD3(SP34)、及びBEAT HER2/CD3(SP34-カッパ1)抗体を、一工程のプロテインAクロマトグラフィー後に、同レベルの均一性及び純度に精製した。BEAT HER2/CD3-3抗体は、プロテインAクロマトグラフィー後に、カチオン交換クロマトグラフィーにより除去された、ある割合のジスルフィド結合ヘテロ二量体凝集体(27%)を示した。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトHER2アームは、可変重鎖領域、CH1 y1領域、y1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するy3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号3)と組み立てられた、y3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号310)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
BEAT HER2/CD3抗体の作用機序は、細胞傷害性T細胞の細胞表面上のCD3抗原と標的細胞上に発現されるHER2抗原とを架橋することにより、標的細胞関して細胞傷害性T細胞キリングを目的とすることに基づく。
ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)耐性乳癌細胞株である高発現HER2細胞株JIMT-1、高発現HER2細胞株BT-474、ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)感受性乳癌細胞株、及び低HER2発現乳腺癌細胞株MDA-MB-231を、BEAT HER2/CD3-1又は-2抗体又はコントロール抗体の連続希釈液及びヒトPBMCの存在下で、48時間の間に個々に培養した。
これらのアッセイにおいて、献血由来のヒトPBMCを細胞傷害性Tリンパ球の供給源として使用した。すべてのアッセイにおいて、10:1のエフェクター対標的細胞比を使用した。陰性コントロールは、抗体処理のない試料(標的細胞及びヒトPBMCのみ)の形態で提供された。インキュベーション時間後にRDL-FACS又はRDL-MTS法を用い、細胞傷害性を測定した(材料及び方法のセクションを参照)。結果は、コントロール抗体が特異的なT細胞媒介細胞傷害性を誘発しなかったことを示した。対照的に、BEAT HER2/CD3-1及び-2抗体は、非常に効力のある、用量依存性の腫瘍標的細胞死を誘導した。最大殺傷は、100%に近かった。どちらの読み取り方法も近い結果をもたらした。ドナー間の変動性が、これらの方法の間でEC50が約10倍異なることの主な原因となった。測定したEC50は、標的細胞株によるHER2抗原発現のレベルと相関した。
JIMT-1異種移植片
BEAT HER2/CD3-1抗体のインビボ有効性を、JIMT-1/PBMC異種移植モデルを用いて調べた。献血由来のヒトPBMCを細胞傷害性Tリンパ球の供給源として使用した。ハーセプチン(登録商標)耐性乳癌JIMT-1細胞を非刺激ヒトPBMC(4の異なるドナー)と1:1の比で混合し、その後免疫不全(NOD/SCID)マウスに皮下注射した。移植後、動物をBEAT HER2/CD3-1抗体で2週間、週3回静脈内治療した。抗体治療は、移植の3時間後に開始し、その後2日目、4日目、7日目、9日目、及び11日目に続けた。
抗CD38及び抗CD3イプシロンアームは、BEAT鎖と融合したscFv断片からなるscFv-Fc型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似のBEAT鎖と融合したFAB断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。FABベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。
L234A及びL235A置換をCH2領域に導入し、また適切な場合にはG65S又はN82aS置換(Kabat番号付け)を使用して、残留プロテインA結合を除去した。ヒトCD38抗原及びヒトCD3イプシロンの両方を標的とするBEAT抗体の例を以下のようにフォーマットした。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD38アームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号132)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号312又は404)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT CD38-9G7ベストフレームワーク/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD38アームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号138)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号313)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT CD38-767/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
抗OX40及び抗CD3イプシロンアームは、BEAT鎖と融合したscFv断片からなるscFv-Fc型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似のBEAT鎖と融合したFAB断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。FABベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。
L234A及びL235A置換をCH2領域に導入し、また適切な場合にはG65S又はN82aS置換(Kabat番号付け)を使用して、残留プロテインA結合を除去した。ヒトOX40抗原及びヒトCD3イプシロンの両方を標的とするBEAT抗体の例を以下のようにフォーマットした。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトOX40アームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号315)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号314)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、BEAT OX40最大移植/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトOX40アームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号317)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号316)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT OX40最小移植/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
マウスリツキシマブ抗体VH及びVL配列を用いてヒトCD20抗原及びヒトCD3イプシロンの両方を標的とするBEAT抗体の例を次のようにフォーマットした:
抗ヒトCD3イプシロン及び抗ヒトCD20アームに対する抗原結合部位(それぞれ実施例2.1及び2.5に記載)の組合せを用いて、BEAT CD20/CD3を操作した。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD20アームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号319)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号318)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT CD20最大移植/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD20アームは、可変重鎖領域、CH1 y1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号321)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号320)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT CD20最小移植/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
抗EGFR及び抗CD3イプシロンアームは、BEAT鎖と融合したscFv断片からなるscFv-Fc型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似のBEAT鎖と融合したFAB断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。FABベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。
L234A及びL235A置換をCH2領域に導入し、また適切な場合にはG65S又はN82aS置換(Kabat番号付け)を使用して、残留プロテインA結合を除去した。ヒトEGFR抗原及びヒトCD3イプシロンの両方を標的とするBEAT抗体の例を以下のようにフォーマットした。
抗ヒトCD3イプシロン及び抗ヒトEGFRに対する抗原結合部位(それぞれ実施例2.1及び2.6に記載)の組合せを用いて、BEAT EGFR/CD3を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトEGFRアームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号323)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号322)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT EGFRcetux-最大移植/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
抗ヒトCD3イプシロン及び抗ヒトEGFRに対する抗原結合部位(それぞれ実施例2.1及び2.6に記載)の組合せを用いて、BEAT EGFR/CD3を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトEGFRアームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号325)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号324)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロン部分は、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT EGFRcetux-最小移植/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトEGFRアームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号327)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号326)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトEGFRアームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号329)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号328)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT EGFRpani-最小移植/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
抗CD19及び抗CD3重鎖は、第一のBEAT鎖と融合したscFv断片からなるscFv-Fc型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似の第一のBEAT鎖と融合したFAB断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。FABベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。L234A及びL235A置換をCH2領域に導入し、また適切な場合にはG65S又はN82aS置換(Kabat番号付け)を使用して、残留プロテインA結合を除去した。国際公開第2010095031号に記載の抗CD19VH及びVL配列を用いてヒトCD19抗原及びヒトCD3イプシロンの両方を標的とするBEAT抗体の例を以下のようにフォーマットする:
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD19アームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するy3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号331)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号330)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するy1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT CD19/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
抗IgE及び抗CD3重鎖は、第一のBEAT鎖と融合したscFv断片からなるscFv-Fc型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似の第一のBEAT鎖と融合したFAB断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。FABベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。L234A及びL235A置換をCH2領域に導入し、また適切な場合にはG65S又はN82aS置換(Kabat番号付け)を使用して、残留プロテインA結合を除去した。
抗ヒトCD3イプシロン及び抗ヒトIgEに対する抗原結合部位(それぞれ実施例2.1及び2.8に記載)の組合せを用いて、BEAT IgE/CD3を操作する。
PCT公開番号:国際公開第2010/033736号に記載の、細胞表面でIgEを発現する細胞株を使用し、実施例3.2.1に記載のものと同様のアッセイにおいてリダイレクトT細胞キリングを評価した。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトIgEアームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号333)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号332)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT IgEomali-最大移植/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトIgEアームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号335)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号334)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT IgEomali-最小移植/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトIgEアームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号337)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号336)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT IgEbsw17-最大移植/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトIgEアームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号339)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号338)から構成される。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、VHドメインをG65S置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT IgE bsw17-最小移植/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
CD38/CD3標的化BEAT抗体の例
ヒト化HB7/ベストフィット VH及びVL配列を用いてヒトCD38抗原及びヒトCD3イプシロンの両方を標的とするBEAT抗体の例は、次のようにフォーマットされた:抗ヒトCD3イプシロン及び抗ヒトCD38アームに対する抗原結合部位(それぞれ実施例2.1及び2.3に記載)の組み合わせを用いて、BEAT CD38/CD3を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD38アームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号119)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号176)から構成された。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、非VH3ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したため、プロテインAへの結合を有しなかった。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号177)から構成された。この重鎖及び軽会合体は、PCT公開番号:国際公開第2008119565号に記載されているような抗ヒトCD3イプシロン抗体(SP34)のヒト化バージョンを包含した。このBEAT抗体フォーマットは、本明細書ではBEAT CD38-HB7ベストフィット/CD3(SP34)抗体という(図27 フォーマットA)。
抗OX40抗体VH及びVL配列(国際公開第2013008171号に記載)を用いてヒトOX40抗原及びヒトCD3イプシロンの両方を標的とするBEAT抗体の例を以下のようにフォーマットする:
抗ヒトCD3イプシロン及び抗ヒトOX40に対する抗原結合部位(それぞれ実施例2.1及び2.4に記載)の組合せを用いて、BEAT OX40/CD3を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトOX40アームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号173)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号340)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、非VH3ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有するため、プロテインAへの結合を有しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT OX40/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
マウスリツキシマブ抗体VH及びVL配列を用いてヒトCD20抗原及びヒトCD3イプシロンの両方を標的とするBEAT抗体の例を次のようにフォーマットした:
抗ヒトCD3イプシロン及び抗ヒトCD20アームに対する抗原結合部位(それぞれ実施例2.1及び2.5に記載)の組合せを用いて、BEAT CD20/CD3を操作した。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号177)から構成された。このアームは、上記のBEAT CD38-HB7ベストフィット/CD3抗CD3イプシロンアームにあたる(図27のフォーマットA参照)。このscFv断片は、PCT公開番号:国際公開第2008119565号(それぞれ、配列番号182及び183を有するVH及びVLドメイン)に記載されているような抗ヒトCD3イプシロンSP34抗体のヒト化バージョンを包含した。このBEAT抗体フォーマットは、本明細書ではBEAT CD20/CD3(SP34)抗体という(図31)。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD20アームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号181)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号341)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、非VH3ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有するため、プロテインAへの結合を有しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT CD20/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
マウスアービタックス抗体VH及びVL配列を用いてヒトEGFR抗原及びヒトCD3イプシロンの両方を標的とするBEAT抗体の例は、次のようにフォーマットされる:抗ヒトCD3イプシロン及び抗ヒトEGFRに対する抗原結合部位(それぞれ実施例2.1及び2.6に記載)の組み合わせを用いて、BEAT EGFR/CD3を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトEGFRアームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号175)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号342)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、非VH3ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有するため、プロテインAへの結合を有しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトEGFRアームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号344)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号343)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、非VH3ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有するため、プロテインAへの結合を有しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT EGFRpani/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
ヒト化オマリズマブ抗体VH及びVL配列を用いてヒトIgE抗原及びヒトCD3イプシロンの両方を標的とするBEAT抗体の例は、次のようにフォーマットされる:抗ヒトCD3イプシロン及び抗ヒトIgEに対する抗原結合部位(それぞれ実施例2.1及び2.8に記載)の組み合わせを用いて、BEAT EGFR/CD3を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトIgEアームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号346)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号345)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、非VH3ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有するため、プロテインAへの結合を有しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT IgEomali/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトIgEアームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号348)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号347)から構成される。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、非VH3ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有するため、プロテインAへの結合を有しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号311)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT IgEbsw17/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
- 二重特異性CD38×CD3抗体
種々のSP34 scFvを、その発現を改善するように行った修飾が機能的特性、すなわちCD3の結合にも影響を与えたかどうかを決定するために、CD38×CD3二重特異性に関して試験した。FABとして存在するCD38結合アームは、配列番号133によってコードされる重鎖可変領域と、配列番号134によってコードされる軽鎖可変領域とを含む。CD3結合アームは、scFv(配列番号403)として再フォーマットされた元のマウスSP34、又は重/軽鎖組み合わせH1/L21(配列番号361)、H5/L32(配列番号311)、H5/L65(配列番号394)、及びH5/L67(配列番号396)を含む修飾ヒト化SP34 scFvを含む。
H5/L65の重鎖/軽鎖組み合わせ(配列番号394)を含むSP34 scFvの特性も、CD20 FAB結合アーム、リツキシマブ、それぞれ配列番号282及び283を有するVH及びVLドメインと共に試験した。
○ アービタックス/CD3
KRAS突然変異を有する患者は、モノクローナル抗体セツキシマブ(商品名アービタックス)(Karapetis C et al., N Engl J Med 359: 1757 (2008))による治療からの恩恵を何も示さない。
改良型SP34 scFvの特性をさらに評価するため、また高EGFR発現細胞株を殺傷し、ScFvとしてのFAB-hSP34 BEAT(配列番号394)のような二重特異性ベクティビックス(VL 配列番号291及びVH 配列番号290)でKRAS耐性機序を取り除くことが可能であることを実証するために、高EGFR発現肺がん細胞株HCC827(肺)の他、KRAS突然変異肺がん細胞株A549並びに結腸直腸がんKRAS陽性細胞株HCT116及びSW480で、インビトロのリダイレクトT細胞溶解アッセイを実施した。
ベクティビックス/hSP34 BEATの場合、エフェクター:標的細胞比10:1を使用し、データを4ドナーの平均として提示する。
Claims (6)
- ヒトCD3に結合し、かつ配列番号101、配列番号102、配列番号103、及び配列番号104を含む群から選択される重鎖可変ドメインと、配列番号105、配列番号106、配列番号401、及び配列番号402を含む群から選択される軽鎖可変ドメインを少なくとも含み、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片である、エピトープ結合タンパク質又はその断片。
- 配列番号101と配列番号105、配列番号104と配列番号106、配列番号104と配列番号401、配列番号104と配列番号402を含む群から選択される、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの対を含む、請求項1に記載のエピトープ結合タンパク質又はその断片。
- 配列番号359と配列番号399、配列番号359と配列番号400を含む群から選択される、重鎖と軽鎖との対を含む、請求項1に記載のエピトープ結合タンパク質又はその断片。
- 前記ヘテロ二量体免疫グロブリン又は断片が第二のエピトープに結合する、請求項1に記載のエピトープ結合タンパク質又はその断片。
- 第一のポリペプチドのエピトープ結合領域がFABであり、第二のポリペプチドのエピトープ結合領域がscFvであるか、又は第一のポリペプチドのエピトープ結合領域がscFvであり、第二のポリペプチドのエピトープ結合領域がFABである、請求項1又は4に記載のエピトープ結合タンパク質又はその断片。
- scFvがヒトCD3に結合し、配列番号361、配列番号311、配列番号394、及び配列番号396の群から選択される配列を含む、請求項5に記載のエピトープ結合タンパク質又はその断片。
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