ES2616316T3 - Composiciones que comprenden anticuerpos específicos para diferentes especies y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para el tratamiento de un paciente humano, que comprende un anticuerpo monocatenario biespecífico que comprende (i) un primer dominio de unión que se une con un CD3 de primate distinto de chimpancé, y (ii) un segundo dominio de unión que se une con un antígeno de superficie celular, en el que dicho dominio de unión se une con un epítopo de CD3 épsilon humano y de primate distinto de chimpancé, en el que el epítopo comprende la secuencia de aminoácidos "FSEXE" (SEQ ID NO. 204), en la que "X" representa L (leucina) o M (metionina), y en el que el CD3-épsilon de primate distinto de chimpancé comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 135 o 136.

Description

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expertos en la materia. El segundo dominio de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico que muestra especificidad para diferentes especies como se describe en el presente documento puede derivarse por ejemplo de dichos anticuerpos monoclonales específicos para diferentes especies mediante técnicas recombinantes descritas en los siguientes ejemplos.

5 La expresión “evaluar la seguridad y/o actividad in vivo y/o el perfil farmacocinético” del anticuerpo monocatenario biespecífico como se usa en el presente documento puede entenderse como se expone posteriormente. Antes de poder comercializar un nuevo medicamento candidato este debe pasar por ensayos rigurosos, que pueden subdividirse aproximadamente en ensayos preclínicos en animales y fases clínicas en pacientes humanos. El objetivo del ensayo preclínico en animales es demostrar que el candidato farmacológico es seguro y eficaz (véase, por ejemplo, the Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16,1997).

La expresión “fármaco”, “candidato farmacológico” o “composición farmacéutica” como se usa en el presente 15 documento se refiere a anticuerpos monocatenarios biespecíficos definidos en el presente documento.

La actividad biológica del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento puede determinarse por ejemplo mediante ensayos de citotoxicidad, como se describe en los siguientes ejemplos, en el documento WO 99/54440 o en Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 -12). “Eficacia” o “eficacia in vivo" como se usa en el presente documento se refiere a la respuesta a terapia por el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento, usando, por ejemplo, criterios de respuesta de NCI normalizados. El éxito o eficacia in vivo de la terapia usando un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento se refiere a la eficacia del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento para su fin pretendido, es decir, capacidad del anticuerpo biespecífico para provocar su 25 efecto deseado, es decir, agotamiento de células patológicas, por ejemplo, células tumorales. La eficacia in vivo puede supervisarse por métodos convencionales establecidos para las entidades de enfermedad respectivas incluyendo, pero sin limitación, recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación de células activadas por fluorescencia, aspiración de médula ósea. Además, pueden usarse diversos parámetros clínicos específicos de enfermedad y otros métodos convencionales establecidos. Además, puede usarse tomografía asistida por ordenador, rayos X, tomografía por resonancia magnética nuclear (por ejemplo, para evaluación de respuesta basada en criterios del Instituto Nacional del Cáncer [Cheson BD, Homing SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. Abr 1999;

35 17(4): 1244]), exploración por tomografía de emisión de positrones, recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación de células activadas por fluorescencia, aspiración de medula ósea, biopsias/histologías de ganglios linfáticos y diversos parámetros clínicos químicos de linfoma (por ejemplo, lactato deshidrogenasa) y otros métodos convencionales establecidos.

Otro reto importante en el desarrollo de fármacos es la modulación predecible de las propiedades farmacocinéticas. Para este fin, se establece un perfil farmacocinético del candidato farmacológico, es decir, un perfil de los parámetros farmacocinéticos que afectan a la capacidad de un fármaco particular para tratar una afección dada. Los parámetros farmacocinéticos del fármaco que influyen en la capacidad de un fármaco para tratar una determinada entidad de enfermedad incluyen, pero sin limitación: semivida, volumen de distribución, metabolismo de primer pase

45 hepático y el grado de unión en suero sanguíneo. La eficacia de un agente farmacológico dado puede estar influida por cada uno de los parámetros mencionados anteriormente.

“Semivida” significa el tiempo en el que se elimina el 50 % de un fármaco administrado mediante procesos biológicos, por ejemplo, metabolismo, excreción, etc.

Por “metabolismo de primer pase hepático” se entiende la propensión de un fármaco para metabolizarse tras su primer contacto con el hígado, es decir, durante su primer pase a través del hígado.

“Volumen de distribución” significa el grado de retención de un fármaco a lo largo de los diversos compartimentos del

55 cuerpo, como por ejemplo espacios intracelulares y extracelulares, tejidos y órganos, etc. y la distribución del fármaco dentro de estos compartimentos.

“Grado de unión en suero sanguíneo" significa la propensión de un fármaco a interaccionar con y unirse con proteínas del suero sanguíneo, tales como albúmina, que conducen a una reducción o pérdida de la actividad biológica del fármaco.

Los parámetros farmacocinéticos también incluyen biodisponibilidad, tiempo de retardo (Tlag), Tmáx, velocidades de absorción, más aparición y/o Cmáx para una cantidad dada de fármaco administrado.

65 "Biodisponibilidad" significa la cantidad de un fármaco en el compartimento sanguíneo.

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"Tiempo de retardo" significa el retardo temporal entre la administración del fármaco y su detección y capacidad de medición en sangre o plasma.

“Tmáx" es el tiempo después del cual se alcanza la concentración sanguínea máxima del fármaco y "Cmáx" es la

5 concentración en la sangre obtenida de forma máxima con un fármaco dado. El tiempo hasta alcanzar una concentración en sangre o tejido del fármaco que se requiere para su efecto biológico está influido por todos los parámetros. Los parámetros farmacocinéticos de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos que muestran especificidad para diferentes especies que pueden determinarse en ensayos animales preclínicos y en primates distintos de chimpancé como se ha perfilado anteriormente también se exponen, por ejemplo en la publicación de Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 -12).

El término "toxicidad" como se usa en el presente documento se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco manifestado en acontecimientos adversos o acontecimientos adversos graves. Estos acontecimientos secundarios podrían referirse a una falta de tolerabilidad del fármaco en general y/o una falta de tolerancia local después de la

15 administración. La toxicidad también podría incluir efectos teratogénicos y carcinogénicos causados por el fármaco.

La expresión "seguridad", "seguridad in vivo" o "tolerabilidad" como se usa en el presente documento define la administración de un fármaco sin inducir acontecimientos adversos graves directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un periodo más largo de aplicación del fármaco. Puede evaluarse la "seguridad", "seguridad in vivo" o "tolerabilidad", por ejemplo a intervalos regulares durante el tratamiento y el período de seguimiento. Las mediciones incluyen la evaluación clínica, por ejemplo manifestaciones orgánicas, y exploración de anomalías de laboratorio. Puede llevarse a cabo evaluación clínica y registrarse/codificarse desviación con respecto a hallazgos normales según los patrones de NCI-CTC y/o MedDRA. Las manifestaciones orgánicas pueden incluir criterios tales como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardíaca,

25 coagulación y similares, como se expone, por ejemplo, en Common Terminology Criteria for adverse events v3.0 (CTCAE). Los parámetros de laboratorio que pueden ensayarse incluyen por ejemplo hematología, química clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y examen de otros fluidos corporales tales como suero, plasma, líquido linfoide o cefalorraquídeo, licor y similares. La seguridad puede evaluarse por lo tanto por ejemplo mediante examen físico, técnicas de captura de imágenes (es decir, ultrasonidos, rayos x, exploraciones de TC, captura de imágenes por resonancia magnética (IRM), otras medidas con dispositivos técnicos (es decir, electrocardiograma), signos vitales, midiendo parámetros de laboratorio y registrando acontecimientos adversos. Por ejemplo, los acontecimientos adversos en primates distintos de chimpancé en los usos y métodos de acuerdo con la invención pueden examinarse por métodos histopatológicos y/o histoquímicos.

35 La expresión “dosis eficaz y no tóxica” como se usa en el presente documento se refiere a una dosis tolerable del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento que es suficientemente alta para provocar el agotamiento de células patológicas, eliminación de tumores, encogimiento de tumores o estabilización de enfermedad sin o esencialmente sin efectos tóxicos importantes. Dichas dosis eficaces y no tóxicas pueden determinarse por ejemplo por estudios de cambio de escala descritos en la técnica y deberían estar por debajo de la dosis que induzca acontecimientos secundarios adversos graves (toxicidad limitante de dosis, TLD).

También se hace referencia a las expresiones anteriores, por ejemplo, en la Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997.

45 Se ha descubierto sorprendentemente que es posible generar productos terapéuticos basados en anticuerpos biespecíficos para seres humanos en los que la molécula idéntica también puede usarse en ensayos animales preclínicos. Esto se debe a la identificación inesperada de anticuerpos monocatenarios biespecíficos que, además de unirse con antígenos humanos (y debido a la similitud genética probable con homólogos de chimpancé), también se unen con los homólogos de dichos antígenos de primates distintos de chimpancé, tales como macacos. Por lo tanto, desaparece la necesidad de construir un anticuerpo monocatenario biespecífico sustituto para ensayar en una especie filogenéticamente distante (de los seres humanos). Como resultado, puede usarse el mismo anticuerpo monocatenario biespecífico en ensayos preclínicos animales que se pretende administrar a seres humanos en ensayos clínicos así como después de la aprobación del mercado. La capacidad de usar la misma molécula para

55 ensayos animales preclínicos que en administración posterior a seres humanos elimina prácticamente, o al menos reduce en gran medida, el peligro de que los datos obtenidos en ensayos animales preclínicos no sean aplicables al caso humano. Brevemente, la obtención de datos de seguridad preclínicos en animales usando la misma molécula que se administrará realmente a seres humanos hace mucho para asegurar la aplicabilidad de los datos a un escenario relevante para seres humanos. Por el contrario, en enfoques convencionales que usan moléculas sustitutas, dichos anticuerpos sustitutos tienen que adaptarse molecularmente al sistema de ensayo animal usado para la evaluación de la seguridad preclínica. Por lo tanto, el anticuerpo sustituto para usar en terapia humana difiere de hecho en secuencia y también probablemente en estructura del usado en ensayos preclínicos en parámetros farmacocinéticos y/o actividad biológica, con la consecuencia de que los datos obtenidos en ensayos animales preclínicos tienen una aplicabilidad/transferibilidad limitada al caso humano. El uso de moléculas sustitutas requiere

65 la construcción, producción, purificación y caracterización de una construcción de anticuerpo completamente nueva. Esto conduce a costes y tiempo de desarrollo adicionales necesarios para obtener esa molécula. En resumen, tienen

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biespecífico, en el que dicho anticuerpo monocatenario biespecífico se administrara a un primate distinto de chimpancé y se mide la actividad in vivo.

Preferentemente, dicha actividad in vivo es activación de linfocitos T, agotamiento de células diana tumorales, 5 citotoxicidad, toxicidad, aparición de efectos secundarios adversos, y/o liberación de citocinas. Se exponen métodos para la determinación de dicha actividad in vivo, por ejemplo, en el documento WO 99/54440.

La presente invención en otro aspecto también posibilita una composición farmacéutica para el tratamiento de un paciente humano, que comprende un anticuerpo monocatenario biespecífico que comprende

(i)

un primer dominio de unión que se une con un CD3 de primate distinto de chimpancé, y

(ii)

un segundo dominio de unión que se une con un antígeno de superficie celular,

en el que dicho primer dominio de unión se une con un epítopo de CD3 humano y de primate distinto de chimpancé,

15 en el que el epítopo comprende la secuencia de aminoácidos "FSEXE" (SEQ ID NO. 204), en la que "X" representa L (leucina) o M (metionina), y en el que el CD3-épsilon de primate distinto de chimpancé comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 135 o 136.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a una composición para administración a un paciente, preferentemente un paciente humano. Preferentemente, la composición farmacéutica comprende formulaciones adecuadas de vehículos, estabilizadores y/o excipientes. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende una composición para administración parenteral, transdérmica, intraluminal, intraarterial, intratecal y/o intranasal o mediante inyección directa al tejido. Se prevé en particular que dicha composición se administre a un paciente mediante infusión o inyección. La administración de las composiciones 25 adecuadas puede efectuarse de diferentes maneras, por ejemplo, mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. La composición de la presente invención puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se conocen bien en la técnica ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, liposomas, etc. Pueden formularse composiciones que comprenden dichos vehículos por métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada que puede determinarse por ejemplo mediante estudios de cambio de escala de la dosis por administración de dosis crecientes del anticuerpo monocatenario biespecífico que muestra especificidad para diferentes especies descrito en el presente documento a primates distintos de chimpancé, por ejemplo macacos. Como se ha expuesto anteriormente, el anticuerpo 35 monocatenario biespecífico que muestra especificidad para diferentes especies descrito en el presente documento puede usarse provechosamente en forma idéntica en ensayos preclínicos en primates distintos de chimpancé y como fármaco en seres humanos. Estas composiciones también pueden administrarse en combinación con otros fármacos proteicos y no proteicos. Estos fármacos pueden administrarse simultáneamente con la composición que comprende el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento o por separado antes o después de la administración de dicho anticuerpo biespecífico en intervalos y dosis definidos temporalmente. El régimen de dosificación se determinará por el médico a cargo y los factores clínicos. Como se conoce bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto especial para administrar, el sexo, el momento y vía de administración, la salud general y otros fármacos que se administren simultáneamente. Las preparaciones 45 para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como etil oleato. Los vehículos líquidos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medio tamponado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reforzadores de líquidos y nutrientes, reforzadores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Además, la composición de la presente invención podría comprender vehículos proteicos, como, por ejemplo, albúmina de suero

o inmunoglobulina, preferentemente de origen humano. Se prevé que la composición de la invención podría

55 comprender, además del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento, agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso pretendido de la composición. Dichos agentes podrían ser fármacos que actúen en el sistema gastrointestinal, fármacos que actúen como citostáticos, fármacos que eviten la hiperuricemia, fármacos que inhiban inmunorreacciones (por ejemplo corticosteroides), fármacos que modulen la respuesta inflamatoria, fármacos que actúen en el sistema circulatorio y/o agentes tales como citocinas conocidas en la técnica.

El primer dominio de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento de la composición farmacéutica de la invención se une con un epítopo de CD3 humano y de primate distinto de chimpancé que comprende la secuencia de aminoácidos "FSE" como se define en las reivindicaciones. El epítopo 65 mínimo comprende la secuencia de aminoácidos "FSEXE" (SEQ ID NO. 202 y 204; en la que "X" corresponde a una leucina (L) o a una metionina (M)) o epítopos no adyacentes como se define en el presente documento son

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preferentemente de 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 restos de aminoácidos de longitud. Preferentemente, dichos epítopos son de 13 restos de aminoácidos de longitud. Aún más preferentemente, el epítopo con el motivo "FSEXE" (SEQ ID NO. 202 y 204, en la que "X" corresponde a una leucina (L) o a una metionina (M)) comprende la secuencia de aminoácidos "EFSELEQSGYYVC" (SEQ ID NO. 195) de CD3 épsilon 5 humano. En CD3 épsilon de cynomolgus, el epítopo correspondiente tiene la secuencia "EFSEMEQSGYYVC" (SEQ ID NO. 201). La sustitución de metionina por leucina es una substitución de aminoácidos conservada entre dos restos de aminoácidos neutros, no polares. La secuencia correspondiente del epítopo preferido: "EFSEXEQSGYYVC" en la que X representa L (leucina) o M (metionina) se representa en SEQ ID NO. 207. Como se representa en los siguientes ejemplos, el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento no solamente se une con este epítopo, sino también con tramos de aminoácidos no adyacentes a dicho epítopo mínimo. Por ejemplo, el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento además del epítopo central mínimo puede unirse simultáneamente con un epítopo o epítopos de CD3 épsilon humano contenido en dicha cadena de CD3 épsilon. En consecuencia, dicho epítopo puede comprender adicionalmente la secuencia de aminoácidos "QYPGSEILWQHND" (SEQ ID NO. 203). Además pueden detectarse

15 epítopos adicionales (u otros) de CD3 épsilon de cynomolgus contenidos en dicha cadena por la molécula de unión o molécula que comprende los dominios de unión como se define en la misma. Estas secuencias adicionales u otras pueden comprender la secuencia de aminoácidos "QDGNEEMGSITQT" (SEQ ID NO. 199) y "YYVSYPRGSNPED" (SEQ ID NO. 200).

Por lo tanto, el epítopo mínimo es más probablemente parte de un epítopo discontinuo o un epítopo conformacional. Como resulta evidente para un experto en la materia, el alcance de la presente invención incluye anticuerpos monocatenarios biespecíficos que no solamente se unen con este epítopo (central) mínimo, sino también con uno, dos o incluso más tramos de secuencias de aminoácidos no adyacentes dentro de CD3 (preferentemente CD3 épsilon). Basándose en los resultados mostrados en los siguientes ejemplos se concluye que los anticuerpos 25 específicos para diferentes especies anti-CD3 entran en contacto con CD3 épsilon en el área de los restos de aminoácidos 57-61 de CD3 épsilon tanto de cynomolgus como humano que comprenden los tramos de aminoácidos FSEME (SEQ ID NO. 206) y FSELE (SEQ ID NO. 205) de CD3 épsilon de cynomolgus y humano, respectivamente, formando el motivo FSE el centro del epítopo. Este resultado, aunque es plausible debido a la accesibilidad del bucle E-F (aminoácidos 56-62) de CD3 épsilon humano (Kjer-Nielsen et al., PNAS 101 (2004), p. 7675-80) que comprende los aminoácidos FSELE (SEQ ID NO. 205) o FSEME (SEQ ID NO. 206), es sorprendente, ya que no hay ningún solapamiento de este epítopo de nueva definición con el epítopo conocido de la cadena de CD3 épsilon de anticuerpos anti-CD3 OKT-3 y UCHT-1 (Kjer-Nielsen et al., en el lugar citado; Arnett et al., PNAS 101 (2004), p. 16268-73) que se han considerado hasta la fecha representativos de todos los anticuerpos anti-CD3 que se creía que formaban una única familia con el mismo epítopo o uno muy similar. En resumen, los epítopos "FSE"y "FSEXE"

35 (SEQ ID NO. 204) son distintos de los epítopos reconocidos por UCHT-1 u OKT-3 (Kjer-Nielsen et al., PNAS 101 (2004), p. 7675-80; Arnett et al., PNAS 101 (2004), p. 16268-73) y son únicos de anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies que se unen con CD3 humano y de macaco. Preferentemente, el epítopo mínimo comprende la secuencia de aminoácidos "FSEXE" (SEQ ID NO. 204), en la que X representa L (leucina) o M (metionina) y significa una sustitución de restos de aminoácidos neutros, no polares.

Se prevé que en la composición farmacéutica de la invención, dicho primer dominio de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico de la composición farmacéutica de la invención se localiza en dirección C terminal del segundo dominio de unión. Sin embargo, también es parte de la presente invención una construcción biespecífica, en la que el "primer dominio de unión para un CD3 de primate distinto de chimpancé" se localiza en dirección N

45 terminal del "segundo dominio de unión para un antígeno de superficie celular" definido en el presente documento.

Como se muestra en los siguientes ejemplos, las ventajas como se ha descrito anteriormente en el presente documento son realizables no solamente cuando el primer dominio de unión (que se une a CD3) se localiza en dirección C terminal del segundo dominio de unión, es decir, más cerca del extremo C terminal del anticuerpo monocatenario biespecífico que el segundo dominio de unión, sino también cuando el primer dominio de unión (que se une a CD3) se localiza en dirección N terminal del segundo dominio de unión, es decir más cerca del extremo N terminal del anticuerpo monocatenario biespecífico que el segundo dominio de unión. La disposición de los dominios de unión en el anticuerpo monocatenario biespecífico definido en el presente documento puede por lo tanto ser una en la que el primer dominio de unión se localiza en dirección C terminal del segundo dominio de unión. La 55 disposición de las cadenas V puede ser VH(antígeno de superficie celular)-VL(antígeno de superficie celular)-VL(CD3)-VH(CD3), VH(antígeno de superficie celular)-VL(antígeno de superficie celular)-VH(CD3)-VL(CD3), VL(antígeno de superficie celular)-VH(antígeno de superficie celular)-VL(CD3)-VH(CD3) o VL(antígeno de superficie celular)-VH(antígeno de superficie celular)-VH(CD3)-VL(CD3). Para una disposición en la que el primer dominio de unión se localiza en dirección N terminal del segundo dominio de unión, son posibles los siguientes órdenes: VH(CD3)-VL(CD3)-VL(antígeno de superficie celular)-VH(antígeno de superficie celular), VH(CD3)-VL(CD3)VH(antígeno de superficie celular) -VL(antígeno de superficie celular), VL(CD3)-VH(CD3)-VL(antígeno de superficie celular) -VH(antígeno de superficie celular) o VL(CD3)-VH(CD3)-VH(antígeno de superficie celular)-VL(antígeno de superficie celular). Como se usa en el presente documento, "en dirección N terminal de" o "en dirección C terminal de" y variantes gramaticales de las mismas indican la localización relativa dentro de la secuencia de aminoácidos 65 primaria en lugar de la colocación en el extremo N o C absoluto del anticuerpo monocatenario biespecífico. Por lo tanto, como ejemplo no limitante, un primer dominio de unión que se "localiza en dirección C terminal del segundo

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ID NO. 166. La región VL del primer dominio de unión puede comprender por lo tanto una, dos o las tres de las CDR mencionadas. Las CDR anteriormente indicadas se incluyen por ejemplo en la región VL mostrada en SEQ ID NO. 8.

Preferentemente, el primer dominio de unión comprende CDR-L1 (SEQ ID NO. 118), CDR-L2 (SEQ ID NO. 117) y 5 CDR-L3 (SEQ ID NO. 116) y CDR-H1 (SEQ ID NO. 115), CDR-H2 (SEQ ID NO. 114) y CDR-H3 (SEQ ID NO. 112) o CDR-H3* que comprende la secuencia de aminoácidos "VSWFAY" (SEQ ID NO. 113).

Como alternativa, el primer dominio de unión comprende CDR-L1 (SEQ ID NO. 166), CDR-L2 (SEQ ID NO. 165) y CDR-L3 (SEQ ID NO. 164) y CDR-H1 (SEQ ID NO. 121), CDR-H2 (SEQ ID NO. 120) y CDR H3 (SEQ ID NO. 119).

Aún más preferentemente, la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2 y la región VL del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 4; o la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 110 y la región VL del primer dominio de unión 15 comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 148; o la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 110 y la región VL del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 168, o la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 6 y la región VL del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 8. Como alternativa la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2 y la región VL el primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 148. Como alternativa la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 110 y la región VL del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 4.

25 Como alternativa la región VH del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2 y la región VL del primer dominio de unión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 168.

Como se ha expuesto anteriormente, el orden de las regiones variables del primer dominio de unión puede ser VH-VL o VL-VH. Ambas disposiciones están dentro del alcance de la invención. Para un primer dominio de unión que comprende el VH de SEQ ID NO. 2 y el VL de SEQ ID NO. 4, la disposición VH-VL se muestra en SEQ ID NO. 9 y 10, mientras que la disposición VL-VH se representa en SEQ ID NO. 11 y 12.

Para un primer dominio de unión que comprende el VH de SEQ ID NO. 110 y el VL de SEQ ID NO. 148, la

35 disposición VH-VL se muestra en SEQ ID NO. 146 y 147. Para un primer dominio de unión que comprende el VH de SEQ ID NO. 110 y el VL de SEQ ID NO. 168, la disposición VH-VL se muestra en SEQ ID NO. 169 y 170, mientras que la disposición VL-VH se representa en SEQ ID NO. 193 y 194. Para un primer dominio de unión que comprende el VH de SEQ ID NO. 6 y el VL de SEQ ID NO. 8, la disposición VH-VL se muestra en SEQ ID NO. 13 y 14, mientras que la disposición VL-VH se representa en SEQ ID NO. 15 y 16.

De forma similar, el orden de las regiones variables del segundo dominio de unión puede ser VH-VL o VL-VH. Ambas disposiciones están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, la disposición VH-VL de un segundo dominio de unión que muestra especificidad para diferentes especies para EpCAM humana y de cynomolgus se muestra en SEQ ID NO. 53 y 54, mientras que la disposición VL-VH se representa en SEQ ID NO. 55 y 56.

45 En una realización particularmente preferida de la composición farmacéutica de la invención, el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

una secuencia de aminoácidos como se representa en cualquiera de SEQ ID NO. 38, 40, 124, 42 o 44;

(b)

una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NO. 37, 39, 125, 41 o 43; y

(c)

una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que está degradada como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de (b).

55 En la realización anteriormente indicada preferida, solamente el primer dominio de unión (que se une a CD3) muestra especificidad para diferentes especies.

Más preferentemente, el anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos como se representa en cualquiera de SEQ ID NO. 66, 68, 74, 76, 122, 70, 72, 78, 80, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190 o 192;

(b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID 65 NO. 65, 67, 73, 75, 123, 69, 71, 77, 79, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189 o 191; y

(c) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que está degradada como

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relacionadas con los mismos indica modificación del primer y/o segundo dominio de unión frente a una construcción de tipo silvestre original haciendo dicha construcción de tipo silvestre no inmunogénica o menos inmunogénica en seres humanos. Se muestran enfoques de desinmunización por ejemplo en los documentos WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415 o WO 92/10755. El término "desinmunizado" también se refiere a construcciones que 5 muestran propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T. De acuerdo con la presente invención, la expresión "propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T" se refiere a la retirada de epítopos de linfocitos T que conduce a activación de linfocitos T específica. Además, "propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T" significa sustitución de aminoácidos que contribuyen a la formación de epítopos de linfocitos T, es decir, la substitución de aminoácidos que son esenciales para la formación de un epítopo de linfocitos T. En otras palabras, "propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T" se refiere a inmunogenicidad reducida o capacidad reducida de inducir proliferación de linfocitos T independiente de antígeno. La expresión "epítopo de linfocitos T" se refiere a secuencias peptídicas cortas que pueden liberarse durante la degradación de péptidos, polipéptidos o proteínas dentro de células y posteriormente presentarse por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) para desencadenar la activación de linfocitos T; véase entre otros el documento WO 02/066514. Para péptidos 15 presentados por MHC de clase II dicha activación de linfocitos T puede dar lugar después a una respuesta de anticuerpos por estimulación directa de linfocitos T para producir dichos anticuerpos. "Propensión reducida a generar epítopos de linfocitos T" y/o "desinmunización" pueden medirse por técnicas conocidas en este campo. Preferentemente, la desinmunización de proteínas puede ensayarse in vitro mediante ensayo de proliferación de linfocitos T. En este ensayo se exploran PBMC de donantes que representan > 80 % de alelos de HLA-DR en el mundo con respecto a proliferación en respuesta a péptidos de tipo silvestre o desinmunizados. Idealmente la proliferación celular se detecta solamente tras la carga de las células presentadoras de antígenos con péptidos de tipo silvestre. Como alternativa, se puede ensayar la desinmunización expresando tetrámeros de HLA-DR que representan todos los haplotipos. Estos tetrámeros pueden ensayarse con respecto a unión a péptidos o cargarse con péptidos que sustituyen células presentadoras de antígenos en ensayos de proliferación. Para ensayar si se

25 presentan péptidos desinmunizados en haplotipos de HLA-DR, puede medirse la unión de, por ejemplo, péptidos marcados con fluorescencia en PBMC. Además, la desinmunización puede demostrarse determinando si se han formado anticuerpos contra las moléculas desinmunizadas después de la administración en pacientes. Preferentemente, se desinmunizan moléculas derivadas de anticuerpos en las regiones marco conservadas y la mayoría de las regiones CDR no se modifican para generar propensión reducida a inducir epítopos de linfocitos T de modo que la afinidad de unión de las regiones CDR no se ve afectada. Incluso la eliminación de un epítopo de linfocitos T da como resultado inmunogenicidad reducida.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento.

35 La invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico como se ha definido anteriormente. Preferentemente dicho vector comprende además una secuencia reguladora que está unida operativamente a dicha secuencia de ácido nucleico definida anteriormente. Más preferentemente, dicho vector es un vector de expresión.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un hospedador transformado o transfectado con un vector definido anteriormente.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica como se ha definido anteriormente

45 en el presente documento, que comprende además un compuesto proteico capaz de proporcionar una señal de activación para las células efectoras inmunitarias.

Preferentemente, la composición farmacéutica comprende además formulaciones adecuadas de vehículos, estabilizadores y/o excipientes.

En otro aspecto, la invención se refiere a un proceso para la producción de una composición farmacéutica como se ha definido anteriormente, comprendiendo dicho proceso cultivar un hospedador como se ha definido anteriormente en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo monocatenario biespecífico como se ha definido anteriormente en el presente documento y recuperar el anticuerpo monocatenario bisespecífico producido a partir del

55 cultivo.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un uso de un anticuerpo monocatenario biespecífico como se ha definido anteriormente en el presente documento o como se produce por el proceso como se ha definido anteriormente en el presente documento, una molécula de ácido nucleico como se ha definido anteriormente en el presente documento, un vector como se ha definido anteriormente en el presente documento o un hospedador como se ha definido anteriormente en el presente documento para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, el tratamiento o el alivio de una enfermedad. Otro aspecto de la invención se refiere a una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de la invención o como se produce de acuerdo con el proceso expuesto anteriormente para uso en un método para la prevención, el tratamiento o el alivio de una enfermedad en un sujeto

65 que lo necesite.

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antirratón conjugada con peroxidasa de rábano rusticano. (B) Pepspot con anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies I correspondiente a una inmunoglobulina (Ig) que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 2 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 4.

5 Figura 19: Pepspot con anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies II correspondiente a una inmunoglobulina (Ig) que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 6 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 8.

Figura 20: Restos de contacto de OKT-3 y UCHT-1 y epítopo de bucle E-F de anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies I y II a los que se ha hecho referencia en las Fig. 18 y 19, respectivamente, en CD3 épsilon de cynomolgus y humano.

Figura 21: Comparación de secuencias de aminoácidos del VL murino mostrado en SEQ ID NO. 4 con el segmento lambda 7a de línea germinal humana.

15 Figura 22: Unión del scFv murino mostrado en SEQ ID NO. 10 y el scFv de tipo humano mostrado en SEQ ID NO. 170 con células HPB-ALL CD3 positivas humanas.

Figura 23: Panel superior: Unión igual del scFv murino mostrado en SEQ ID NO. 10 y el scFv de tipo humano mostrado en SEQ ID NO. 170 con linfocitos T humanos y de cynomolgus en PBMC. Panel inferior: cuando se preincuba con 10 μg/ml del anticuerpo IgG murino mAb I descrito en el Ejemplo 1 que tiene la misma especificidad de unión que los scFv (es decir, para CD3 épsilon), los desplazamientos de células teñidas con el scFv murino anteriormente mencionado o el scFv de tipo humano se reducen significativamente, subrayando la región de unión similar de los scFv y el anticuerpo murino original mAb I.

25 Figura 24: Pepspots desarrollados por el sistema de detección de fosfatasa alcalina. (A) Pepspot de control con IgG de cabra antirratón conjugado con fosfatasa alcalina. (B) Pepspot con anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies que comprende el VH de tipo humano mostrado en SEQ ID NO. 110 y el VL de tipo humano mostrado en SEQ ID NO. 168 como se describe en el Ejemplo 18.

Figura 25: ensayo de transferencia puntual con el anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies que comprende el VH de tipo humano de SEQ ID NO. 110 y el VL de tipo humano de SEQ ID NO. 168 como se describe en el Ejemplo 19 (A) y el anticuerpo IgG 1 murino anti-CD3 UCHT1 (B) que se une con los péptidos transferidos “biotina-enlazador-EFSELEQSGYYVC” (1) y “EFSELEQSGYYVC-biotina” (2) derivados de CD3 épsilon humano.

35 Figura 26: análisis de unión de FACS de construcción monocatenaria biespecífica específica para diferentes especies CAIX HL x SEQ ID NO. 194 para células HPB-ALL (CD3+ humanas) PBMC de cynomolgus (CD3+ de cynomolgus), A549 (CAIX+ humanas) y CYNOM-K1 (CAIX+ de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con proteína monomérica purificada 1 µg/ml que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 27: análisis de unión de FACS de construcción monocatenaria biespecífica específica para diferentes

45 especies CAIX HL x SEQ ID NO. 170 para células HPB-ALL (CD3+ humanas), PBMC de cynomolgus (CD3+ de cynomolgus), A549 (CAIX+ humanas) y 4MBr-5 (CAIX+ de macaco), respectivamente. La adición de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con 1 µg/ml de proteína monomérica purificada que se incuba posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo antihis y el anticuerpo de detección.

Figura 28: análisis de unión de FACS de construcción monocatenaria biespecífica específica para diferentes especies CAIX LH x SEQ ID NO. 170 para células HPB-ALL (CD3+ humanas), PBMC de cynomolgus (CD3+ de cynomolgus), A549 (CAIX+ humanas) y 4MBr-5 (CAIX+ de macaco), respectivamente. La adición de FACS se

55 realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con 1 µg/ml de proteína monomérica purificada que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 29: análisis de unión de FACS de construcción monocatenaria biespecífica específica para diferentes especies EGFR LH x SEQ ID NO. 170 para células HPB-ALL (CD3+ humanas), PBMC de cynomolgus (CD3+ de cynomolgus), A431 (EGFR+ humanas) y CHO, transfectadas con EGFR de cynomolgus (EGFR+ de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con 1 µg/ml de proteína monomérica purificada que se incubaron posteriormente con el anticuerpo

65 anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

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Figura 30: análisis de unión de FACS de construcción monocatenaria biespecífica específica para diferentes especies EGFR LH x SEQ ID NO. 170 para células HPB-ALL (CD3+ humanas), PBMC de cynomolgus (CD3+ de cynomolgus), A431 (EGFR+ humanas) y CHO, transfectadas con EGFR de cynomolgus (EGFR+ de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa

5 células incubadas con 1 µg/ml de proteína monomérica purificada que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 31: análisis de unión de FACS de construcción monocatenaria biespecífica específica para diferentes especies EGFR HL x SEQ ID NO. 194 para células HPB-ALL (CD3+ humanas), PBMC de cynomolgus (CD3+ de cynomolgus), A431 (EGFR+ humanas) y CHO, transfectadas con EGFR de cynomolgus (EGFR+ de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con 1 µg/ml de proteína monomérica purificada que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células

15 solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 32: análisis de unión de FACS de construcción monocatenaria biespecífica específica para diferentes especies EGFR LH x SEQ ID NO. 194 para células HPB-ALL (CD3+ humanas), PBMC de cynomolgus (CD3+ de cynomolgus), A431 (EGFR+ humanas) y CHO, transfectadas con EGFR de cynomolgus (EGFR+ de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con 1 µg/ml de proteína monomérica purificada que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

25 Figura 33: análisis de unión de FACS de construcción monocatenaria biespecífica específica para diferentes especies SEQ ID NO. 170 x EGFR HL para células HPB-ALL (CD3+ humanas), PBMC de cynomolgus (CD3+ de cynomolgus), A431 (EGFR+ humanas) y CHO, transfectadas con EGFR de cynomolgus (EGFR+ de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con 1 µg/ml de proteína monomérica purificada que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 34: análisis de unión de FACS de construcción monocatenaria biespecífica específica para diferentes especies SEQ ID NO. 170 x EGFR LH para células HPB-ALL (CD3+ humanas), PBMC de cynomolgus (CD3+ de

35 cynomolgus), A431 (EGFR+ humanas) y CHO, transfectadas con EGFR de cynomolgus (EGFR+ de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con 1 µg/ml de proteína monomérica purificada que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 35: análisis de unión de FACS de construcción monocatenaria biespecífica específica para diferentes especies SEQ ID NO. 194 x EGFR HL para células HPB-ALL (CD3+ humanas), PBMC de cynomolgus (CD3+ de cynomolgus), A431 (EGFR+ humanas) y CHO, transfectadas con EGFR de cynomolgus (EGFR+ de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa

45 células incubadas con 1 µg/ml de proteína monomérica purificada que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 36: análisis de unión de FACS de construcción monocatenaria biespecífica específica para diferentes especies SEQ ID NO. 194 x EGFR LH para células HPB-ALL (CD3+ humanas), PBMC de cynomolgus (CD3+ de cynomolgus), A431 (EGFR+ humanas) y CHO, transfectadas con EGFR de cynomolgus (EGFR+ de cynomolgus), respectivamente. La tinción de FACS se realizó como se describe en el Ejemplo 23. La línea gruesa representa células incubadas con 1 µg/ml de proteína monomérica purificada que se incubaron posteriormente con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea de histograma fina refleja el control negativo: células

55 solamente incubadas con el anticuerpo anti-his y el anticuerpo de detección.

Figura 37: actividad citotóxica inducida por construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies de CD3 y CAIX redirigidas a líneas celulares diana indicadas. Se usaron linfocitos T positivos para CD8 estimulados de origen humano y de cynomolgus como células efectoras, respectivamente. El ensayo se realizó como se describe en los ejemplos 24 y 25. En el panel izquierdo de la Figura 37, se ha usado un anticuerpo monocatenario biespecífico con un dominio variable reactivo con CAIX y un dominio variable específico de CD3 humano desinmunizado como un control positivo. En el panel derecho, la misma construcción se ha usado como un control negativo.

65 Figura 38: actividad citotóxica inducida por la construcción de anticuerpo monocatenario biespecífico específico para diferentes especies de CD3 y CAIX CAIX HL x SEQ ID NO. 194 redirigido a la línea celular diana A549. Se usaron

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En resumen, se usaron las siguientes combinaciones de cebadores:

Para anticuerpo scFv VL-VH mostrado en SEQ ID NO. 11 y 12: SEQ ID NO. 17 a 20. Para anticuerpo scFv VH-VL mostrado en SEQ ID NO. 9 y 10: SEQ ID NO. 21 a 24. 5 Para anticuerpo scFv VL-VH mostrado en SEQ ID NO. 15 y 16: SEQ ID NO. 25 a 28. Para anticuerpo scFv VH-VL mostrado en SEQ ID NO. 13 y 14: SEQ ID NO. 29 a 32.

Para generar el anticuerpo monocatenario, se realizaron dos PCR con las combinaciones de cebadores respectivas. Durante esta PCR se introdujeron secuencias complementarias solapantes en los productos de PCR que surgían de los cebadores de enlazadores respectivos que se combinaban para formar la secuencia codificante del enlazador de 15 aminoácidos durante la PCR de fusión posterior. Los dominios VH y VL amplificados se fusionaron en una siguiente PCR en la que solamente se requerían los cebadores externos y ambos productos de PCR. El anticuerpo de scFv resultante está flanqueado en el extremo 5’ con un enlazador Ser(Gly4) Ser pequeño precedido por el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción para BspEI y en extremo 3' con un marcador de afinidad de 6 histidinas 15 seguido de un codón de terminación y del sitio de reconocimiento de enzimas de restricción para Sall. El segundo anticuerpo Fv monocatenario fue uno con especificidad anti-EpCAM humana designado “5-10” que se describe en SEQ ID NO. 33 y 34 del listado de secuencias incluido en la descripción. Para conseguir la fusión de los anticuerpos Fv monocatenarios y para permitir la expresión eucariota, la secuencia codificante de los anticuerpos Fv monocatenarios se clonó después mediante BspEI (5’ del enlazador Ser(Gly4)Ser) SalI en el vector de expresión pEFDHFR (pEFDHFR se describió en Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) que contenía la secuencia codificante para el anticuerpo Fv monocatenario específico de EpCAM humana 5-10 y el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción para BspEI. La secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina murino se describe en SEQ ID NO. 35 y 36 del listado de secuencias incluido en la descripción, precedido de una secuencia consenso de inicio de la traducción de Kozak y el sitio de reconocimiento de enzimas de

25 restricción para EcoRI. Se aislaron clones individuales de las construcciones y se secuenciaron con cebadores complementarios de regiones flanqueantes en el vector de acuerdo con protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York {1989) (2001)). Para experimentos adicionales se seleccionó un clon de cada construcción. Se describen las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para 5-10LHxSEQ ID NO. 12 en SEQ ID NO. 37 y 38, para 510LHxSEQ ID NO. 10 en SEQ ID NO. 39 y 40, para 5-10LHxSEQ ID NO. 16 en SEQ ID NO. 41 y 42 y para 510LHxSEQ ID NO.14 en SEQ ID NO. 43 y 44 del listado de secuencias incluido en la descripción.

EJEMPLO 5: Expresión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos de 5-10LHxSEQ ID NO. 12, 510LHxSEQ ID NO. 10, 5-10LHxSEQ ID NO. 16 y 5-10LHxSEQ ID NO. 14 en células CHO

35 Los plásmidos con las secuencias codificantes de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos se transfectaron en células CHO deficientes en DHFR para expresión eucariota de la construcción como se describe en Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566). Se indujo amplificación génica de la construcción aumentando las concentraciones de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de MTX hasta 500 nM. Las células transfectadas se expandieron después y se produjo 1 litro de sobrenadante. La construcción se purificó finalmente del sobrenadante de cultivo como se describe en Kufer et al. Cancer Immunity Vol. 1, p. 10 (2001).

EJEMPLO 6: Ensayo de FACS para unión de 5-10LHxSEQ ID NO. 12, 5-10LHxSEQ ID NO. 10, 5-10LHxSEQ ID NO. 16 y 5-10LHxSEQ ID NO. 14 con células Kato III o células CHO transfectadas con EpCAM humanas y con

45 células HPB-ALL

Se ensayó la unión de las construcciones bifuncionales para el antígeno de EpCAM en células Kato III humanas que expresan EpCAM (ATCC N.º HTB-103) o en células CHO transfectadas con EpCAM humana y para el antígeno CD3 humano en células HPB-ALL usando un ensayo de FACS. Para ese fin se incubaron 2,5x105 células con 50 µl de sobrenadante de cultivo celular que contenía la construcción. La unión de la construcción se detectó con un anticuerpo anti-His (anticuerpo Penta-His, sin BSA, obtenido de Qiagen GmbH, Hilden, FRG) a 2 µg/ml en 50 µl de PBS con FCS 2 %. Como un reactivo de segunda etapa se usó un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-Ficoeritrina, IgG de cabra antirratón, anticuerpo específico de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en 50 µl de PBS con FCS 2 % (obtenido de Dianova, Hamburgo, FRG). Las muestras se midieron en un FACSscan

55 (BD biosciences, Heidelberg, FRG). La unión a antígeno fue claramente detectable para la especificidad anti EpCAM humana, así como para especificidades anti-CD3 en la línea celular positiva para CD3 humana (véase Figura 3).

EJEMPLO 7: Ensayo de citotoxicidad para 5-10LHxSEQ ID NO. 12, 5-10LHxSEQ ID NO. 10, y 5-10LHxSEQ ID NO. 14 con células Kato III como células diana y PBMC humanas como células efectoras

Se analizó la bioactividad de 5-10LHxSEQ ID NO. 12, 5-10LHxSEQ ID NO. 10, y 5LH-10xSEQ ID NO. 14 por ensayos de citotoxicidad in vitro basados en FACS usando las células Kato III positivas para EpCAM humana y PBMC humanas como células efectoras. Las células diana se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con colorante PKH26 (Sigma-Aldrich, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células diana 65 macadas se lavaron dos veces con RPMI/FCS 10 % y se mezclaron con células efectoras recién aisladas a una relación E:T (Efectoras: Diana) de 10:1. Se añadieron 2x104 células diana y 2x105 células efectoras en un volumen

25

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EJEMPLO 11: Clonación de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos para diferentes especies de EpCAM y CD3

Para generar moléculas de anticuerpos monocatenarios biespecíficos que comprenden la especificidad para

5 diferentes especies de CD3 anteriormente mencionada y la especificidad para diferentes especies de EpCAM anteriormente mencionada, las regiones variables amplificadas del anticuerpo 2G8 tuvieron que modificarse por PCR para obtener los fragmentos de anticuerpo Fv monocatenario correspondientes. Se generaron dos anticuerpos Fv monocatenarios con diferentes disposiciones de las regiones variables de cadena ligera y pesada. Para este fin, se usó una PCR de fusión de dos etapas para amplificar la secuencia codificante de las regiones variables. Se diseñó un conjunto de cebadores apropiados para realizar las etapas de clonación basadas en PCR, dando como resultado finalmente un anticuerpo monocatenario 2G8 que conecta los dos dominios variables con un enlazador de 15 aminoácidos ([Gly4Ser]3) en el orden VH-Enlazador-VL y VL-Enlazador-VH. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se describen en SEQ ID NO. 53 a 56 del listado de secuencias incluido en la descripción, respectivamente.

15 En resumen se usaron las siguientes combinaciones de cebadores:

Para anticuerpo scFv 2G8 VL-VH (designado en lo sucesivo en el presente documento 2G8LH mostrado en SEQ ID NO. 55 y 56): SEQ ID NO. 57 a 60.

Para anticuerpo scFv 2G8 VH-VL (designado en lo sucesivo en el presente documento 2G8HL mostrado en SEQ ID NO. 53 y 54): SEQ ID NO. 61 a 64.

Para generar el anticuerpo monocatenario, se realizaron dos PCR con las combinaciones de cebadores respectivas.

25 Durante esta PCR, se introdujeron secuencias complementarias solapantes en los productos de PCR (que surgen de los cebadores enlazadores respectivos que se combinaron para formar la secuencia codificante del enlazador de 15 aminoácidos durante la PCR de fusión posterior). Los dominios VH y VL amplificados se fusionaron en esta PCR de fusión en la que solamente se requerían los cebadores externos y ambos productos de PCR. El anticuerpo scFv resultante se flanquea en el extremo 5’ con el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción para BsrGI y en el extremo 3’ con el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción para BspEI. La secuencia codificante de los anticuerpos Fv monocatenarios específicos de EpCAM se clonó después mediante BsrGI y BspEI en los vectores de expresión pEFDHFR descritos anteriormente que reemplazan el scFv 5-10LH. Se aislaron clones individuales de las construcciones y se secuenciaron con cebadores complementarios para regiones flanqueantes en el vector de acuerdo con protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

35 Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) (2001)). Para experimentos adicionales se seleccionó un clon de cada construcción. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se describen para 2G8LHxSEQ ID NO. 12 en SEQ ID NO. 65 y 66, para 2G8LHxSEQ ID NO. 10 en SEQ ID NO. 67 y 68, para 2G8LHxSEQ ID NO. 16 en SEQ ID NO. 69 y 70, para 2G8LHxSEQ ID NO. 14 en SEQ ID NO. 71 y 72, para 2G8HLxSEQ ID NO. 12 en SEQ ID NO. 73 y 74, para 2G8HLxSEQ ID NO. 16 en SEQ ID NO. 77 y 78 y para 2G8HLxSEQ ID NO. 14 en SEQ ID NO. 79 y 80 del listado de secuencias incluido en la descripción.

EJEMPLO 12: Expresión de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos 2G8LHxSEQ ID NO. 12, 2G8LHxSEQ ID NO. 10, 2G8LHxSEQ ID NO. 16, 2G8LHxSEQ ID NO. 14, 2G8HLxSEQ ID NO. 12, 2G8HLxSEQ ID NO. 10, 2G8HLxSEQ ID NO. 16 y 2G8HLxSEQ ID NO. 14 en células CHO

45 Los plásmidos con las secuencias que codifican los anticuerpos monocatenarios biespecíficos se transfectaron en células CHO deficientes en DFHR para expresión eucariota de la construcción como se describe en Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566). Se indujo amplificación génica de la construcción aumentando concentraciones de MTX hasta una concentración final de hasta 500 nM de MTX. Las células transfectadas se expandieron después y se produjo 1 litro de sobrenadante. La construcción se purificó finalmente del sobrenadante de cultivo como se describe en Kufer et al. Cancer Immunity Vol. 1, p. 10 (2001).

EJEMPLO 13: Ensayo de FACS para unión de 2G8LHxSEQ ID NO. 12, 2G8LHxSEQ ID NO. 10, 2G8LHxSEQ ID NO. 16, 2G8LHxSEQ ID NO. 14, 2G8HLxSEQ ID NO. 12, 2G8HLxSEQ ID NO. 10, 2G8HLxSEQ ID NO. 16 y

55 2G8HLxSEQ ID NO. 14 en células Kato III o células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus y células HPB-ALL

Se ensayó la unión de las construcciones bifuncionales de sobrenadantes de cultivo celular o unión de construcciones bifuncionales purificadas con el antígeno EpCAM humano en células Kato III o células CHO transfectadas con EpCAM de cynomolgus y con el antígeno CD3 en células HPB-ALL usando un ensayo de FACS. Para ese fin se incubaron 2,5x105 células con 50 l de sobrenadante o con 5 g/ml de las construcciones purificadas en 50 l de PBS con FCS al 2 %. La unión de las construcciones se detectó con un anticuerpo anti-His (Anticuerpo Penta-His, sin BSA, obtenido de Qiagen GmbH, Hilden, FRG) a 2 g/ml en 50 l de PBS con FCS 2 %. Como un reactivo de segunda etapa se usó un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-Ficoeritrina, IgG de 65 cabra anti-ratón, anticuerpo específico de fragmento Fc-gamma, diluido 1:100 en 50 l de PBS con FCS 2% (obtenido de Dianova, Hamburgo, FRG). Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg,

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mostrado en SEQ ID NO. 146 que contiene el VH de tipo humano también muestra clara unión con células CD3 positivas humanas (véase Fig. 13) y de cynomolgus (véase Fig. 14).

4. Determinación de un VL humano equivalente

5 La secuencia de aminoácidos de la cadena de VH murino mostrada en SEQ ID NO. 2 se alineó con el repertorio de secuencias de línea germinal de VL humano (http://vbase.mrc-cep.cam-ac.uk) usando el software de análisis de ADN Vector NTI. Basándose en este análisis, se eligió el segmento 7a de Vlambda humano como una secuencia molde (véase Fig. 21). Las definiciones de CDR y marcos conservados son de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat.

Los restos de aminoácidos correspondientes que difieren entre la cadena de VL murina mostrada en SEQ ID NO. 4 y el segmento 7a de Vlambda humano dentro de las regiones marco conservadas se mutaron en el nivel de ADN hacia los restos humanos. Sin embargo, la construcción conservó restos de marco conservado potencialmente

15 cruciales de la secuencia de Vlambda murina original (de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat): L 36, L 46, L 49, L 57 (véase Fig. 21). De esta manera, se diseñó una secuencia de aminoácidos que era idéntica a la cadena de VL murina mostrada en la secuencia SEQ ID NO. 4 dentro de sus CDR. La secuencia de aminoácidos correspondiente del VL de tipo humano generado se muestra en SEQ ID NO. 168, mientras que la secuencia de ácido nucleico correspondiente se muestra en SEQ ID NO. 167. La secuencia de VL N-terminal se cambió a “EL” para generar un sitio de clonación N terminal adecuado.

5. Síntesis génica y clonación de la región VL de tipo humano

La región VL de tipo humano anteriormente mencionada se sintetizó por gen (Entelechon, Alemania) y se subclonó

25 mediante los sitios de restricción SacI y BsiWI en un vector de expresión bacteriano adecuado. Este vector ya contenía la secuencia codificante de la cadena de VH de tipo humano anteriormente mencionada (secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 110) que se empareja con la región VL de tipo humano (secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 168) seguida de un Flag y un Marcador de His-6 y precedida por una secuencia líder que dirige el scFv funcional a periplasma de E. coli. La disposición de dominio funcional después de clonación fue secuencia Líder-VH(G4S)3-enlazador-VL-marcador Flag-marcador His6.

6. Análisis funcional de construcciones de scFv que tienen el VH de tipo humano mostrado en SEQ ID NO. 110 combinado con el VL de tipo humano mostrado en SEQ ID NO. 168

35 Se transformó ADN plasmídico que codificaba a) el VH (SEQ ID NO. 2) y VL (SEQ ID NO. 4) murino original y b) el VH de tipo humano (SEQ ID NO. 110) combinado con el VL de tipo humano (SEQ ID NO. 168) cada uno en E. coli TG1 de acuerdo con protocolos convencionales. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del scFv VH-VL que comprende el VH (SEQ ID NO. 2) y VL (SEQ ID NO. 4) murino original se muestran en SEQ ID NO. 9 y 10, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del scFv VH-VL que comprende el VH de tipo humano (SEQ ID NO. 110) y el VL de tipo humano (SEQ ID NO. 168) se muestran en SEQ ID NO. 169 y 170, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del scFv VL-VH que comprende el VL de tipo humano (SEQ ID NO. 168) y el VH de tipo humano (SEQ ID NO. 110) se muestran en SEQ ID NO. 193 y 194, respectivamente. Debido a diferentes estrategias de clonación, la secuencia de aminoácidos del scFv VL-VH de SEQ ID NO. 194 muestra tres intercambios de aminoácidos en comparación con la del scFv VH-VL de SEQ ID NO.

45 170, sin embargo, sin afectar a la capacidad de unión y especificidad de dicho scFv.

Se realizó expresión de diferentes clones en E. coli TG-1 en formato de 96 pocillos. Se inocularon 100 l de LB/glucosa al 0,1 % con 10 l de un cultivo de una noche de clones individuales y se cultivó durante 4 h a 37 ºC. Después de la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM, el cultivo se dejó crecer a 30 ºC durante otras 1820 h. Por cada pocillo, se añadieron 40 l de tampón BEL (ácido bórico 400 mM, NaCl 320 mM, EDTA 4 mM, pH 8,0

+ lisozima 2,5 mg/ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Se eliminó el residuo celular por centrifugación y se ensayaron los sobrenadantes en experimentos de citometría de flujo.

La línea de linfocitos T humano HPB-ALL y linfocitos T humanos cynomolgus en células mononucleares de sangre 55 periférica (PMBC) se usaron como células positivas para CD3 humano y CD3 de cynomolgus, respectivamente.

Típicamente se incubaron 100.000 células con 50 l de los sobrenadantes bacterianos que contenían scFv y se incubaron durante 30 min en hielo.

a) Las células HPB-ALL se lavaron tres veces con PBS y se resuspendieron posteriormente en 50 l de PBS que contenía anticuerpo anti-His (Pentahis, Roche) y se incubaron adicionalmente en hielo durante 30 min. Después las células se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con un anticuerpo anti IgG de ratón marcado con PE durante 30 min más en hielo. Después de lavar las células una vez las células se resuspendieron en un tampón adecuado y se determinó la positividad de la construcción de anticuerpo unido a célula en un citómetro de flujo (FACScalibur) y

65 se analizó.

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b) PBMC humanas y de cynomolgus (que contenían linfocitos T) se lavaron tres veces con PBS y posteriormente se resuspendieron en 50 l de PBS que contenía anticuerpo anti-His biotinilado (Pentahis biotinilado, Roche) y se incubaron adicionalmente en hielo durante 30 min. Después las células se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con Estreptavidina marcada con PE durante 30 min más en hielo. En esta etapa, se coincubaron PBMC

5 con FITC anti-CD2 para identificar los linfocitos T en la mezcla de PBMC.

Después de lavar las células de a) o b) una vez las células se resuspendieron en un tampón adecuado y se determinó la positividad de la construcción de anticuerpo unido a célula en un citómetro de flujo (FACScalibur) y se analizó.

10 El scFv de control de SEQ ID NO. 10 (VH murino de SEQ ID NO. 4 -VL murino de SEQ ID NO. 2) muestra un claro desplazamiento en células CD3 positivas humanas como se representa en la Figura 22. El desplazamiento en linfocitos T humanos y de cynomolgus es menos pronunciado, más probablemente debido al sistema de detección menos sensible (Fig. 23).

15 El scFv de tipo humano de SEQ ID NO. 170 (VH de tipo humano de SEQ ID NO. 110 -VL de tipo humano de SEQ ID NO. 168) muestra un desplazamiento positivo en células HPB-ALL (Fig. 22) y claros desplazamientos en linfocitos T humanos así como de cynomolgus (Fig. 23, panel superior).

20 Cuando se preincuba con 10 μg/ml del anticuerpo IgG murino mAb I descrito en el Ejemplo 1 que tiene la misma especificidad que los scFv (es decir, para CD3 épsilon), los desplazamientos de células teñidas con el scFv murino anteriormente mencionado o el scFv de tipo humano se reducen significativamente, subrayando la región de unión similar de los scFv y el anticuerpo murino original; véase Fig. 23 panel inferior.

25 Ejemplo 17: Determinación de un epítopo para anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies que se unen a CD3 épsilon tanto humano como de cynomolgus

Para determinar el epítopo de CD3 épsilon humano y de cynomolgus que se une con anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies, se llevó a cabo mapeo de epítopos con anticuerpo I (Ig que comprende la 30 cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 2 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 4) y el anticuerpo II (Ig que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 6 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 8), que se unen ambos con CD3 épsilon humano y de cynomolgus; véase también Figura 1. Para el análisis de aplicación puntual de péptidos ("pepspot"), se unieron covalentemente péptidos de 13 unidades solapantes derivados de las secuencias de aminoácidos de CD3 épsilon humano y de cynomolgus (véase Figura 15) a una membrana de celulosa -β-alanina 35 Whatman 50 mediante el extremo C terminal mientras que el extremo N terminal acetilado permaneció libre. En los péptidos, el aminoácido cisteína, siempre que aparezca en la secuencia de CD3 épsilon correspondiente se intercambió por el aminoácido serina. Los péptidos de 13 unidades individuales generados (mediante JPT Peptide Technologies GmbH) se muestran en las Figuras 16 y 17. Para CD3 épsilon de cynomolgus, se han ensayado 43 puntos, mientras que para el CD3 épsilon humano se han ensayado 47 puntos. Se ha establecido que la longitud de

40 la secuencia solapante de dos péptidos adyacentes es de 11 aminoácidos.

Los experimentos de pepspot se realizaron de la siguiente manera. De acuerdo con el protocolo del fabricante, la membrana se aclaró con metanol durante 1 min, se lavó con TBS 1x y se bloqueó con TBS 1x/reactivo de bloqueo 1 % (p/v) (BM Chemiluminescence Blotting Substrate (POD) of Roche Diagnostics GmbH) durante 3 h. Todas las 45 etapas de incubación y lavado se realizaron en un agitador orbital a temperatura ambiente, excepto por la incubación durante una noche del anticuerpo primario. Directamente después de descartar la solución de bloqueo, las membranas se incubaron durante una noche con 5 o 3 μg/ml de anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies como se ha expuesto anteriormente en TBS 1x/reactivo de bloqueo 0,5 % (p/v) a 4 °C en un agitador orbital. Después de lavar 4 veces con TBS 1x/Tween 0,05 % durante 15 min, se consiguió detección de anticuerpo 50 anti-CD3 unido mediante incubación durante 2 h con un anticuerpo anti-IgG (específico de F(ab)2) conjugado con peroxidasa de rábano rusticano disponible en el mercado o un anticuerpo anti-IgG marcado con fosfatasa alcalina (diluido según la recomendación del fabricante en TBS 1x/reactivo de bloqueo 0,5 %, respectivamente). Posteriormente, las membranas se lavaron 6 veces con TBS 1x/Tween 0,05 % durante 15 minutos. La peroxidasa de rábano rusticano se visualizó mediante quimioluminiscencia potenciada (solución de sustrato de luminiscencia A y

55 solución de partida B mezcladas 100: 1; sustrato de transferencia de quimioluminiscencia BM (POD) de Roche Diagnostics GmbH) y una película BioMax (Kodak). Se visualizó fosfatasa alcalina usando sistema de sustrato líquido de 5-bromo-4-cloro-indolil fosfato/nitro azul tetrazolio (Sigma).

Para excluir la unión no específica de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano rusticano, la 60 membrana se incubó solamente con anticuerpo secundario. Todas las otras etapas se realizaron como en el experimento anterior.

El ensayo de pepspot de control (véase la figura 18(A)) mostró señales en los puntos 33 y 42 de CD3 épsilon de cynomolgus y en los puntos 37, 39 y 46 de CD3 épsilon humano. Estas señales se consideran inespecíficas y no se 65 mencionarán adicionalmente.

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1. Anticuerpo anti-CD3 I (Ig que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 2 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 4)

(i) Unión con CD3 épsilon de cynomolgus

5 Se detectaron fuertes señales de unión de anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies I (Ig que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 2 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 4) con péptidos derivados de CD3 épsilon de cynomolgus en el punto 1, así como en el tramo de puntos peptídicos 24-29 (Figura 18(B)). Este último corresponde a los restos de aminoácidos 47-69 de CD3 épsilon de cynomolgus (véase Figura 15). Todos los péptidos de 13 unidades que abarcan esta región contienen un motivo de aminoácidos mínimo 5659 (EFSE). El punto 1 corresponde a los restos de aminoácidos 1-13 (QDGNEEMGSITQT) de CD3 épsilon de cynomolgus.

(ii) Unión con CD3 épsilon humano El anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies I se unió con los puntos peptídicos 15, 28, 32, 33 y 40 derivados de CD3 épsilon humano (véase Figura 18(B)). El tramo de puntos peptídicos 28 a 33 corresponde a

15 los restos de aminoácidos 47-69 de CD3 épsilon humano y comprende el motivo de aminoácidos mínimo 57-59 (FSE). Los puntos 15 y 40 corresponden a restos de aminoácidos 30-42 (QYPGSEILWQHND) y 71-83 (RGSKPEDANFYLY), respectivamente.

2. Anticuerpo anti-CD3 II (Ig que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 6 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 8)

(i) Unión con CD3 épsilon de cynomolgus El análisis de pepspot con anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies II (Ig que comprende la cadena VH mostrada en SEQ ID NO. 6 y la cadena VL mostrada en SEQ ID NO. 8) mostró fuertes señales para

25 CD3 épsilon de cynomolgus en el tramo de puntos peptídicos 27-29 así como en el punto 33 (véase Figura 19). El tramo que abarca los puntos 27 y 29 corresponde a los restos de aminoácido 53-69 de CD3 épsilon de cynomolgus (véase Figura 15), en el que los péptidos de 13 unidades tienen el tramo mínimo de aminoácidos 5761 (FSEME) en común. El punto 33 se correlaciona con los restos de aminoácidos 65-77 (YYVSYPRGSNPED).

(ii) Unión con CD3 épsilon humano El anticuerpo anti-CD3 con reacción cruzada II se unió con los puntos peptídicos 15, 19, 32 y 33, 37, 39 y 40 de CD3 épsilon humano (véase Figura 19). El punto 19 corresponde a los restos de aminoácidos 38-46d (WQHNDKNIGGDED) de CD3 épsilon humano (véase Figura 15). El tramo pequeño de puntos 32 a 33 corresponde a los restos de aminoácidos 55-69 que contienen el péptido mínimo FSELE (aminoácidos 57-61). Los puntos 37 y 39 coinciden con los restos de aminoácidos 65-77 (YYVSYPRGSKPED) y 69-81

35 (YPRGSKPEDANFY) de CD3 épsilon humano, respectivamente. Las correlaciones de los puntos 15 y 40 ya se han mencionado anteriormente.

En resumen, ambos anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies reconocen epítopos discontinuos en CD3 épsilon humano y de cynomolgus. Con respecto a CD3 épsilon de cynomolgus ambos anticuerpos anti-CD3 específicos para diferentes especies reconocieron un claro tramo solapante de puntos peptídicos 27-29 (véase Figura 16). Todos los péptidos de 13 unidades que abarcan esta región contienen un péptido mínimo FSEME (restos de aminoácidos 57-61 de CD3 épsilon de cynomolgus). La intersección peptídica en CD3 épsilon humano con la que se unían ambos anticuerpos puede determinarse para los puntos 32 y 33 (véase Figura 17). Esta sección contiene el péptido mínimo FSELE correspondiente a los restos 57-61 de CD3 épsilon humano.

45 Basándose en estos resultados se concluye que fragmentos de anticuerpo de CD3 específicos para diferentes especies entra en contacto con CD3 épsilon en el área de los restos de aminoácidos 57-61 de CD3 épsilon tanto de cynomolgus como humano que comprende los tramos de aminoácidos FSEME y FSELE de CD3 épsilon de cynomolgus y humano, respectivamente, formando el motivo FSE el núcleo epitópico. Este resultado, aunque es plausible debido a la accesibilidad del bucle E-F (aminoácidos 56-62; véase Figura 15) de CD3 épsilon humano (Kjer-Nielsen et al., PNAS 101 (2004), p. 7675-80) que comprende los aminoácidos FSELE o FSEME, es no obstante sorprendente ya que no hay ningún solapamiento de este epítopo recién definido con el epítopo conocido en la cadena de CD3 épsilon de anticuerpos anti-CD3 OKT3 y UCHT1 (véase la Figura 17; Kjer-Nielsen et al., en el lugar citado; Amett et al., PNAS 101 (2004), p. 16268-73) que se han considerado hasta la fecha representativos de

55 todos los anticuerpos anti-CD3 que se cree que forman una única familia con el mismo epítopo o uno muy similar.

Ejemplo 18: Determinación del epítopo para el anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies de tipo humano que se une con CD3 épsilon tanto humano como de cynomolgus

El mapeo epitópico del fragmento de anticuerpo anti-CD3 específico para diferentes especies de tipo humano descrito en el Ejemplo 16 (SEQ ID NO. 170) se llevó a cabo por análisis de puntos peptídicos ("pepspot") como se describe en el Ejemplo 17. Para este fin, se convirtió dicho fragmento Fv monocatenario mostrado en SEQ ID NO. 170 en un anticuerpo IgG completo con una cadena pesada gamma1 murina que comprendía la región VH como se muestra en SEQ ID NO. 110 y una cadena ligera kappa que comprendía la región VL como se muestra en SEQ ID

65 NO. 168. El procedimiento del experimento pepspot fue idéntico al protocolo usado en el Ejemplo 17.

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Claims (1)

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