TW201940518A - 針對ｍｕｃ１７和ｃｄ３之雙特異性抗體構建體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了雙特異性抗體構建體，其特徵在於包含與MUC17結合的第一結構域、與人和獼猴CD3ε鏈的細胞外表位結合的第二結構域以及視需要第三結構域，該第三結構域係特異性Fc模式。此外，本發明提供了編碼該抗體構建體的多核苷酸、包含這種多核苷酸的載體、表現該構建體的宿主細胞以及包含該抗體構建體的藥物組成物。

Description

針對MUC17和CD3之雙特異性抗體構建體
本發明涉及生物技術的產品和方法，具體地涉及雙特異性抗體構建體、其製備及其用途。
最快速且最有前景開發的治療劑之一係基於蛋白質的藥物，這些基於蛋白質的藥物已經在幾乎每個醫學領域中發揮重要作用並且是臨床（前）開發中和作為商業產品增長最快的治療劑之一（Leader, Nature Reviews Drug Discovery [自然綜述：藥物發現] 2008年1月7日, 21-39）。與小化學藥物相比，蛋白質藥物在相對低的濃度下具有高特異性和活性，並且典型地提供高影響疾病，諸如各種癌症、自身免疫疾病和代謝性病症的療法（Roberts, Trends Biotechnol. [生物技術趨勢] 2014年7月;32(7):372-80；Wang, Int J Pharm. [國際藥學雜誌] 1999年8月20日;185(2):129-88）。
此類新的基於蛋白質的藥物包括，例如，雙特異性（單株）抗體，這些抗體典型地可以同時與兩種不同類型的抗原結合。它們以若干種結構形式已知，並且目前已經探究了用於癌症免疫療法和藥物遞送的應用（Fan, Gaowei; Wang, Zujian; Hao, Mingju; Li, Jinming (2015). "Bispecific antibodies and their applications [雙特異性抗體及其應用]". Journal of Hematology & Oncology. [血液學與腫瘤學雜誌] 8: 130）。
雙特異性抗體可以是IgG樣的，即全長雙特異性抗體，或者係為非全長抗體構建體的非IgG樣雙特異性抗體。全長雙特異性抗體典型地保留具有兩個Fab臂和一個Fc區的傳統單株抗體（mAb）結構，不同的是兩個Fab位點結合不同抗原。非全長雙特異性抗體可以缺乏整個Fc區。這些包括化學連接的Fab、僅由Fab區組成、以及各種類型的二價和三價單鏈可變片段（scFv）。還存在模擬兩種抗體的可變結構域的融合蛋白。這種形式的實例係雙特異性T細胞接合器（BiTE® ）（Yang, Fa; Wen, Weihong; Qin, Weijun (2016). "Bispecific Antibodies as a Development Platform for New Concepts and Treatment Strategies [作為用於新的理念和治療策略的開發平台的雙特異性抗體]". International Journal of Molecular Sciences [國際分子科學雜誌]. 18 (1): 48）。
雙特異性抗體衍生的分子諸如BiTE® 抗體構建體係由兩個柔性連接的抗體衍生的結合結構域製備的重組蛋白質構建體。BiTE® 抗體構建體的一個結合結構域對靶細胞上選擇的腫瘤相關表面抗原係特異性的；第二結合結構域對CD3（即T細胞上T細胞受體複合物的亞基）係特異性的。藉由其特殊設計，BiTE® 抗體構建體獨特地適合於將T細胞與靶細胞暫態連接，並且同時強有力地激活T細胞對靶細胞的固有細胞溶解潛力。對作為AMG 103和AMG 110開發到臨床中的第一代BiTE® 抗體構建體（參見WO 99/54440和WO 2005/040220）的重要的進一步開發係提供與CD3ε鏈的N末端處的背景獨立表位結合的雙特異性抗體構建體（WO 2008/119567）。與該選擇的表位結合的BiTE® 抗體構建體不僅顯示出對人和獼猴，或白鬢狨 （Callithrix jacchus ）、棉冠獠狨（Saguinus oedipus ）或松鼠猴（Saimiri sciureus ）CD3ε鏈的跨物種特異性，而且由於識別該特異性表位（而不是先前描述的雙特異性T細胞接合分子中CD3結合物的表位）而未展示出與對於前一代T細胞接合抗體所觀察到的程度相同的T細胞的非特異性活化。T細胞激活的這種減少與患者中較少或減少的T細胞再分佈相關，後者被鑒定為副作用的風險，例如，在帕索妥昔單抗（pasotuximab）中。
如WO 2008/119567中所述的抗體構建體的特徵在於從身體快速清除；因此，雖然它們能夠快速到達身體的大部分部位，但它們的體內應用可能受到其在體內的持久性短的限制。另一方面，它們在體內的濃度可以在短時間內進行調整和微調。因為這種小的單鏈分子的體內半衰期短，所以使用藉由連續靜脈內輸注的長期給予來實現治療效果。然而，現在可獲得具有更有利的藥物動力學特性（包括更長的半衰期）的雙特異性抗體構建體。增加的半衰期通常在免疫球蛋白、特別是抗體並且最特別是小尺寸的抗體片段或構建體的體內應用中是有用的，例如為求患者順應性。
黏蛋白已被鑒定為炎症和癌症疾病的令人感興趣的標誌物。黏蛋白係高分子量糖蛋白，其特徵在於串聯重複結構域內絲胺酸和蘇胺酸殘基處的高水平O-糖基化（Johansson和Hansson, Nat. Rev. Immunology [自然綜述：免疫學] 2016）。存在至少20個黏蛋白家族成員，包括分泌蛋白和跨膜蛋白，它們由不同組織中的上皮細胞表現（Corfield, Biochim. Biophys. Acta [生物化學與生物物理學學報] 2013）。黏蛋白的主要功能在於黏膜層的結構和黏膜層的調控，該黏膜層在上皮細胞與環境之間形成保護性屏障（Hollingsworth和Swanson, Nat. Rev. Cancer [自然綜述：癌症] 2004；Hattrup和Gendler, Annu. Rev. Physiol. [生理學年評] 2008）。跨膜黏蛋白也在細胞傳訊（對包括增殖和細胞凋亡的調控），以及在腫瘤發生中起作用（Hollingsworth和Swanson, Nat. Rev. Cancer [自然綜述：癌症] 2004）。在黏蛋白中，黏蛋白17（MUC17）係最初藉由其與MUC3的同源性鑒定的跨膜黏蛋白（Gum等人, Biochem. Biophys. Res. Comm. [生物化學與生物物理研究通訊] 2002）。
對MUC17的完整編碼序列的分析揭示，它具有由61個串聯重複序列的中心區構成的大的細胞外結構域、表皮生長因子（EGF）結構域、海膽精子蛋白、腸激酶和集聚蛋白（SEA）結構域，以及第二EGF結構域。SEA結構域含有在其他黏蛋白中保守的推定的裂解位點（Moniaux等人, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 2006）。MUC17係單次跨膜蛋白，具有在細胞內的80個胺基酸的胞質尾（Moniaux等人, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 2006）。MUC17在健康成人中的表現局限於內襯於腸的腸上皮細胞或成熟吸收性上皮細胞的頂端表面（Moniaux等人, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 2006；Johanasson和Hansson, Nat. Rev. Immunology [自然綜述：免疫學] 2016）。MUC17也由胃和胰腺表現（Moniaux等人, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 2006；Moehle等人, J. Mol. Med. [分子醫學雜誌] 2006）。MUC17的生物學功能被認為係維持腸道中的黏膜屏障完整性，諸如藉由黏膜恢復（Luu等人, Int. J. Biochem. Cell Biol. [國際生物化學與細胞生物學雜誌] 2010；Resta-Lenert等人, Am. J. Physiology [美國生理學雜誌] 2011；Johanasson和Hansson, Nat. Rev. Immunology [自然綜述：免疫學] 2016）。
MUC17在一些癌症中異常表現。顯示MUC17 mRNA在一種胰腺癌細胞系和三種結腸癌細胞系中表現（Gum等人 2002）。免疫組織化學研究確認了MUC17蛋白在胰腺癌中的表現（Moniaux等人 2006）。然而，在結腸癌中，MUC17蛋白表現顯示出降低（Senapati等人, J. Clin. Pathol. [臨床病理學雜誌] 2010）。雖然如此，MUC17的表現模式使其成為用於治療不同形式的惡性腫瘤的潛在靶標。
鑒於文獻中關於作為其病理病狀的潛在靶標的MUC17的相矛盾的結論，本發明之目的是清楚地鑒定與MUC17上調相關的特定病狀並且提供雙特異性抗體構建體，諸如T細胞銜接分子，這些雙特異性抗體構建體特別適合於結合MUC17相關病狀中的MUC17，較佳的是用於在所述特定病狀的治療中使用。因此，本發明提供了抗體構建體，其特徵在於包含與MUC17結合的第一結構域、與人和非人（例如獼猴）CD3ε鏈的細胞外表位結合的第二結構域、以及較佳的第三結構域，該第三結構域係特異性Fc模式。此外，本發明提供了編碼該抗體構建體的多核苷酸、包含這種多核苷酸的載體、和表現該構建體的宿主細胞以及包含該抗體構建體的藥物組成物。
在第一方面，在本發明的背景下設想提供一種抗體構建體，該抗體構建體包含：
• 第一結構域，該第一結構域與MUC17結合，以及
• 第二結構域，該第二結構域與人和獼猴CD3ε鏈的細胞外表位結合。
在所述方面內，在本發明的背景下進一步設想，該抗體構建體包含第三結構域，該第三結構域包含兩個多肽單體，每個多肽單體包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域，其中所述兩個多肽單體經由肽接頭彼此融合。
在所述方面內，在本發明的背景下進一步設想提供一種抗體構建體，該抗體構建體係單鏈抗體構建體。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中所述第三結構域按胺基至羧基順序包含：鉸鏈-CH2-CH3-接頭-鉸鏈-CH2-CH3。
在所述方面內，在本發明的背景下進一步設想提供一種抗體構建體，其中所述多肽單體中的每一種具有與選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群組的序列至少90%相同的胺基酸序列。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中所述多肽單體中的每一種具有選自SEQ ID NO: 17-24的胺基酸序列。
在所述方面內，在本發明的背景下進一步設想提供一種抗體構建體，其中該CH2結構域包含結構域內半胱胺酸二硫橋。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中
(i) 該第一結構域包含兩個抗體可變結構域並且該第二結構域包含兩個抗體可變結構域；
(ii) 該第一結構域包含一個抗體可變結構域並且該第二結構域包含兩個抗體可變結構域；
(iii) 該第一結構域包含兩個抗體可變結構域並且該第二結構域包含一個抗體可變結構域；或者
(iv) 該第一結構域包含一個抗體可變結構域並且該第二結構域包含一個抗體可變結構域。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中該第一結構域和該第二結構域經由肽接頭與該第三結構域融合。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中該抗體構建體按胺基至羧基順序包含：
(a) 該第一結構域；
(b) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 1-3組成之群組的胺基酸序列；
(c) 該第二結構域。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中該抗體構建體除了 (a) 至 (c) 之外按胺基至羧基順序包含：
(d) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 1、2、3、9、10、11和12組成之群組的胺基酸序列；
(e) 該第三結構域的該第一多肽單體；
(f) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 5、6、7和8組成之群組的胺基酸序列；以及
(g) 該第三結構域的該第二多肽單體。
在所述方面內，在本發明的背景下進一步設想提供一種抗體構建體，其中該抗體構建體的該第一結構域與MUC17內對應於SEQ ID NO. 528（根據uniprot Q685J3編號的aa 4171至4296）的表位結合。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中該抗體構建體的該第一結構域與MUC17內對應於SEQ ID NO. 529（根據uniprot Q685J3編號的aa 4184至4291）的表位結合。
在所述方面內，在本發明的背景下進一步設想提供一種抗體構建體，其中該抗體構建體的該第一結構域與MUC17內對應於SEQ ID NO. 530（根據uniprot Q685J3編號的aa 4131至4243）的表位結合。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中該抗體構建體的該第一結構域與MUC17內對應於SEQ ID NO. 531（根據uniprot Q685J3編號的aa 4244至4389）的表位結合。
在所述方面內，在本發明的背景下進一步設想提供一種抗體構建體，其中該抗體構建體的該第一結構域與MUC17內對應於SEQ ID NO. 530（根據uniprot Q685J3編號的aa 4131至4243）的表位結合，但不與MUC17內對應於SEQ ID NO. 531（根據uniprot Q685J3編號的aa 4244至4389）的表位結合。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中該抗體構建體的該第一結構域與MUC17內對應於SEQ ID NO. 532（根據uniprot Q685J3編號的aa 4171至4390）或SEQ ID NO. 533（根據uniprot Q685J3編號的aa 4184至4390）的表位結合，但不與MUC17內對應於SEQ ID NO. 534（根據uniprot Q685J3編號的aa 4291至4390）的表位或MUC17內對應於SEQ ID NO. 535（根據uniprot Q685J3編號的aa 4341至4390）的表位結合。
在所述方面內，在本發明的背景下進一步設想提供一種抗體構建體，其中該VH VL安排的特徵為4λ3。該命名在本領域中是已知的。
在所述方面內，在本發明的背景下進一步設想提供一種抗體構建體，其中細胞毒性與結合親和力之間的比率（EC50 /KD ）* 1000低於250，其中該細胞毒性以pM指示並且在將NUGC-4細胞作為靶細胞並且將huPBMC作為效應細胞中進行測定，並且其中該結合親和力以nM指示並且藉由表面電漿共振（SPR）測定諸如Biacore測定來測定。考慮到典型的EC50 與KD 值之間的不同量綱，為了更好的可讀性，引入了係數1000。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中細胞毒性與結合親和力之間的比率（EC50 /KD ）* 1000低於125，其中該細胞毒性以pM指示並且例如在將NUGC-4細胞作為靶細胞並且將huPBMC作為效應細胞中進行測定，並且其中該結合親和力以nM指示並且例如藉由基於表面電漿共振的測定來測定。
在所述方面內，在本發明的背景下進一步設想提供一種抗體構建體，其中細胞毒性與結合親和力之間的比率（EC50 /KD ）* 1000低於21，其中該細胞毒性以pM指示並且例如在將NUGC-4細胞作為靶細胞並且將huPBMC作為效應細胞中進行測定，並且其中該結合親和力以nM指示並且藉由基於表面電漿共振的測定來測定。較佳的是，細胞毒性（EC50 ）＜ 100 pM並且該結合親和力（KD ）＜ 25 nM。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中該第一結合結構域包含含有選自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH區：
(a) 如SEQ ID NO. 33中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 34中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 35中繪示的CDR-H3；
(b) 如SEQ ID NO. 44中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 45中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 46中繪示的CDR-H3；
(c) 如SEQ ID NO. 55中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 56中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 57中繪示的CDR-H3；
(d) 如SEQ ID NO. 66中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 67中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 68中繪示的CDR-H3；
(e) 如SEQ ID NO. 77中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 78中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 79中繪示的CDR-H3；
(f) 如SEQ ID NO. 88中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 89中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 90中繪示的CDR-H3；
(g) 如SEQ ID NO. 99中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 100中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 101中繪示的CDR-H3；
(h) 如SEQ ID NO. 110中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 111中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 112中繪示的CDR-H3；
(i) 如SEQ ID NO. 121中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 122中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 123中繪示的CDR-H3；
(j) 如SEQ ID NO. 132中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 133中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 134中繪示的CDR-H3；
(k) 如SEQ ID NO. 143中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 144中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 145中繪示的CDR-H3；
(l) 如SEQ ID NO. 154中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 155中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 156中繪示的CDR-H3；
(m) 如SEQ ID NO. 165中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 166中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 167中繪示的CDR-H3；
(n) 如SEQ ID NO. 176中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 177中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 178中繪示的CDR-H3；
(o) 如SEQ ID NO. 187中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 188中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 189中繪示的CDR-H3；
(p) 如SEQ ID NO. 198中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 199中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 200中繪示的CDR-H3；
(q) 如SEQ ID NO. 209中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 210中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 211中繪示的CDR-H3；
(r) 如SEQ ID NO. 220中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 221中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 222中繪示的CDR-H3；
(s) 如SEQ ID NO. 231中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 232中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 233中繪示的CDR-H3；
(t) 如SEQ ID NO. 242中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 243中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 244中繪示的CDR-H3；
(u) 如SEQ ID NO. 253中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 254中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 255中繪示的CDR-H3；
(v) 如SEQ ID NO. 264中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 265中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 266中繪示的CDR-H3；
(w) 如SEQ ID NO. 275中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 276中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 276中繪示的CDR-H3；
(x) 如SEQ ID NO. 286中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 287中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 288中繪示的CDR-H3；
(y) 如SEQ ID NO. 297中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 298中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 299中繪示的CDR-H3；
(z) 如SEQ ID NO. 308中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 309中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 310中繪示的CDR-H3；
(aa) 如SEQ ID NO. 319中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 320中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 321中繪示的CDR-H3；
(ab) 如SEQ ID NO. 330中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 331中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 332中繪示的CDR-H3；
(ac) 如SEQ ID NO. 341中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 342中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 343中繪示的CDR-H3；
(ad) 如SEQ ID NO. 352中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 353中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 354中繪示的CDR-H3；
(ae) 如SEQ ID NO. 363中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 364中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 365中繪示的CDR-H3；
(af) 如SEQ ID NO. 374中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 375中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 376中繪示的CDR-H3；
(ag) 如SEQ ID NO. 385中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 386中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 386中繪示的CDR-H3；
(ah) 如SEQ ID NO. 396中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 397中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 398中繪示的CDR-H3；
(ai) 如SEQ ID NO. 407中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 408中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 409中繪示的CDR-H3；
(aj) 如SEQ ID NO. 418中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 419中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 420中繪示的CDR-H3；
(ak) 如SEQ ID NO. 429中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 430中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 431中繪示的CDR-H3；
(al) 如SEQ ID NO. 440中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 441中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 442中繪示的CDR-H3；
(am) 如SEQ ID NO. 451中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 452中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 453中繪示的CDR-H3；
(an) 如SEQ ID NO. 462中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 463中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 464中繪示的CDR-H3；
(ao) 如SEQ ID NO. 473中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 474中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 475中繪示的CDR-H3；
(ap) 如SEQ ID NO. 484中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 485中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 486中繪示的CDR-H3；
(aq) 如SEQ ID NO. 495中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 496中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 497中繪示的CDR-H3；
(ar) 如SEQ ID NO. 506中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 507中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 508中繪示的CDR-H3；以及
(as) 如SEQ ID NO. 517中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 518中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 519中繪示的CDR-H3；其中較佳的是
(c) 如SEQ ID NO. 55中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 56中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 57中繪示的CDR-H3；
(n) 如SEQ ID NO. 176中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 177中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 178中繪示的CDR-H3；
(ac) 如SEQ ID NO. 341中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 342中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 343中繪示的CDR-H3；以及
(aj) 如SEQ ID NO. 418中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 419中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 420中繪示的CDR-H3。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中該第一結合結構域包含含有選自以下的CDR-H1、CDR-L2和CDR-L3的VL區：
(a) 如SEQ ID NO. 36中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 37中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 38中繪示的CDR-L3；
(b) 如SEQ ID NO. 47中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 48中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 49中繪示的CDR-L3；
(c) 如SEQ ID NO. 58中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 59中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 60中繪示的CDR-L3；
(d) 如SEQ ID NO. 69中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 70中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 71中繪示的CDR-L3；
(e) 如SEQ ID NO. 80中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 81中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 82中繪示的CDR-L3；
(f) 如SEQ ID NO. 91中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 92中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 93中繪示的CDR-L3；
(g) 如SEQ ID NO. 102中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 103中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 104中繪示的CDR-L3；
(h) 如SEQ ID NO. 113中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 114中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 115中繪示的CDR-L3；
(i) 如SEQ ID NO. 124中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 125中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 126中繪示的CDR-L3；
(j) 如SEQ ID NO. 135中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 136中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 137中繪示的CDR-L3；
(k) 如SEQ ID NO. 146中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 147中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 148中繪示的CDR-L3；
(l) 如SEQ ID NO. 157中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 158中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 159中繪示的CDR-L3；
(m) 如SEQ ID NO. 168中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 169中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 170中繪示的CDR-L3；
(n) 如SEQ ID NO. 179中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 180中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 181中繪示的CDR-L3；
(o) 如SEQ ID NO. 190中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 191中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 192中繪示的CDR-L3；
(p) 如SEQ ID NO. 201中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 202中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 203中繪示的CDR-L3；
(q) 如SEQ ID NO. 212中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 213中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 214中繪示的CDR-L3；
(r) 如SEQ ID NO. 223中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 224中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 225中繪示的CDR-L3；
(s) 如SEQ ID NO. 234中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 235中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 236中繪示的CDR-L3；
(t) 如SEQ ID NO. 245中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 246中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 247中繪示的CDR-L3；
(u) 如SEQ ID NO. 256中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 257中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 258中繪示的CDR-L3；
(v) 如SEQ ID NO. 267中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 268中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 269中繪示的CDR-L3；
(w) 如SEQ ID NO. 278中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 279中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 280中繪示的CDR-L3；
(x) 如SEQ ID NO. 289中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 290中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 291中繪示的CDR-L3；
(y) 如SEQ ID NO. 300中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 301中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 302中繪示的CDR-L3；
(z) 如SEQ ID NO. 311中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 312中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 313中繪示的CDR-L3；
(aa) 如SEQ ID NO. 322中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 323中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 324中繪示的CDR-L3；
(ab) 如SEQ ID NO. 333中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 334中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 335中繪示的CDR-L3；
(ac) 如SEQ ID NO. 344中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 345中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 346中繪示的CDR-L3；
(ad) 如SEQ ID NO. 355中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 356中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 357中繪示的CDR-L3；
(ae) 如SEQ ID NO. 366中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 367中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 368中繪示的CDR-L3；
(af) 如SEQ ID NO. 377中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 378中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 379中繪示的CDR-L3；
(ag) 如SEQ ID NO. 388中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 389中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 390中繪示的CDR-L3；
(ah) 如SEQ ID NO. 399中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 400中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 401中繪示的CDR-L3；
(ai) 如SEQ ID NO. 410中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 411中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 412中繪示的CDR-L3；
(aj) 如SEQ ID NO. 421中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 422中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 423中繪示的CDR-L3；
(ak) 如SEQ ID NO. 432中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 433中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 434中繪示的CDR-L3；
(al) 如SEQ ID NO. 443中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 444中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 445中繪示的CDR-L3；
(am) 如SEQ ID NO. 454中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 455中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 456中繪示的CDR-L3；
(an) 如SEQ ID NO. 465中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 466中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 467中繪示的CDR-L3；
(ao) 如SEQ ID NO. 476中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 477中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 478中繪示的CDR-L3；
(ap) 如SEQ ID NO. 487中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 488中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 489中繪示的CDR-L3；
(aq) 如SEQ ID NO. 498中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 499中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 500中繪示的CDR-L3；
(ar) 如SEQ ID NO. 509中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 510中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 511中繪示的CDR-L3；以及
(as) 如SEQ ID NO. 520中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 521中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 522中繪示的CDR-L3；其中較佳的是
(c) 如SEQ ID NO. 58中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 59中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 60中繪示的CDR-L3；
(n) 如SEQ ID NO. 179中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 180中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 181中繪示的CDR-L3；
(ac) 如SEQ ID NO. 344中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 345中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 346中繪示的CDR-L3；以及
(aj) 如SEQ ID NO. 421中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 422中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 423中繪示的CDR-L3。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中該第一結合結構域包含選自以下群組的VL區和VH區，該群組由以下項組成：
(a) 如SEQ ID NO. 40中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 39中繪示的VH區；
(b) 如SEQ ID NO. 51中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 50中繪示的VH區；
(c) 如SEQ ID NO. 62中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 61中繪示的VH區；
(d) 如SEQ ID NO. 73中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 72中繪示的VH區；
(e) 如SEQ ID NO. 84中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 83中繪示的VH區；
(f) 如SEQ ID NO. 95中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 94中繪示的VH區；
(g) 如SEQ ID NO. 106中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 105中繪示的VH區；
(h) 如SEQ ID NO. 117中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 116中繪示的VH區；
(i) 如SEQ ID NO. 128中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 127中繪示的VH區；
(j) 如SEQ ID NO. 139中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 138中繪示的VH區；
(k) 如SEQ ID NO. 150中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 149中繪示的VH區；
(l) 如SEQ ID NO. 161中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 160中繪示的VH區；
(m) 如SEQ ID NO. 172中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 171中繪示的VH區；
(n) 如SEQ ID NO. 183中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 182中繪示的VH區；
(o) 如SEQ ID NO. 194中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 193中繪示的VH區；
(p) 如SEQ ID NO. 205中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 204中繪示的VH區；
(q) 如SEQ ID NO. 216中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 215中繪示的VH區；
(r) 如SEQ ID NO. 227中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 226中繪示的VH區；
(s) 如SEQ ID NO. 238中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 237中繪示的VH區；
(t) 如SEQ ID NO. 249中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 248中繪示的VH區；
(u) 如SEQ ID NO. 260中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 259中繪示的VH區；
(v) 如SEQ ID NO. 271中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 270中繪示的VH區；
(w) 如SEQ ID NO. 282中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 281中繪示的VH區；
(x) 如SEQ ID NO. 293中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 292中繪示的VH區；
(y) 如SEQ ID NO. 304中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 303中繪示的VH區；
(z) 如SEQ ID NO. 315中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 314中繪示的VH區；
(aa) 如SEQ ID NO. 326中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 325中繪示的VH區；
(ab) 如SEQ ID NO. 337中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 336中繪示的VH區；
(ac) 如SEQ ID NO. 348中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 347中繪示的VH區；
(ad) 如SEQ ID NO. 359中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 358中繪示的VH區；
(ae) 如SEQ ID NO. 370中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 369中繪示的VH區；
(af) 如SEQ ID NO. 381中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 380中繪示的VH區；
(ag) 如SEQ ID NO. 392中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 391中繪示的VH區；
(ah) 如SEQ ID NO. 403中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 402中繪示的VH區；
(ai) 如SEQ ID NO. 414中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 413中繪示的VH區；
(aj) 如SEQ ID NO. 425中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 424中繪示的VH區；
(ak) 如SEQ ID NO. 436中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 435中繪示的VH區；
(al) 如SEQ ID NO. 447中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 446中繪示的VH區；
(am) 如SEQ ID NO. 458中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 457中繪示的VH區；
(an) 如SEQ ID NO. 469中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 468中繪示的VH區；
(ao) 如SEQ ID NO. 480中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 479中繪示的VH區；
(ap) 如SEQ ID NO. 491中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 490中繪示的VH區；
(aq) 如SEQ ID NO. 502中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 501中繪示的VH區；
(ar) 如SEQ ID NO. 513中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 512中繪示的VH區；以及
(as) 如SEQ ID NO. 524中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 523中繪示的VH區。
在所述方面內，在本發明的背景下進一步設想提供一種抗體構建體，其中該抗體構建體包含選自如以下任一者中繪示的胺基酸序列的序列：SEQ ID NO: 41、52、63、74、85、96、107、118、129、140、151、162、173、184、195、206、217、228、239、250、261、272、283、294、305、316、327、338、349、360、371、382、393、404、415、426、437、448、459、470、481、492、503、514和525。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中該抗體構建體按胺基至羧基順序包含：
(a) 該第一結構域，該第一結構域具有選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下項組成：SEQ ID NO: 41、52、63、74、85、96、107、118、129、140、151、162、173、184、195、206、217、228、239、250、261、272、283、294、305、316、327、338、349、360、371、382、393、404、415、426、437、448、459、470、481、492、503、514和525；
(b) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 1-3組成之群組的胺基酸序列；
(c) 該第二結構域，該第二結構域具有選自以下群組或如SEQ ID NO: 15中繪示的胺基酸序列，該群組由以下項組成：WO 2008/119567的SEQ ID NO: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187；以及
(d) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 1、2、3、9、10、11和12組成之群組的胺基酸序列；
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，其中該抗體構建體除了 (a) 至 (d) 之外按胺基至羧基順序進一步包含：
(e) 該第三結構域的該第一多肽單體，該第一多肽單體具有選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群組的多肽序列；
(f) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 5、6、7和8組成之群組的胺基酸序列；以及
(g) 該第三結構域的該第二多肽單體，該第二多肽單體具有選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群組的多肽序列。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想提供一種抗體構建體，該抗體構建體具有選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下項組成：SEQ ID NO: 42、43、53、54、64、65、75、76、86、87、97、98、108、109、119、120、130、131、141、142、152、153、163、164、174、175、185、186、196、197、207、208、218、219、229、230、240、241、251、252、262、263、273、274、284、285、295、296、306、307、317、318、328、329、339、340、350、351、361、362、372、373、383、384、394、395、405、406、416、417、427、428、438、439、449、450、460、461、471、472、482、483、493、494、504、505、515、516、526和527。
在第二方面，在本發明的背景下進一步設想提供一種多核苷酸，該多核苷酸編碼本發明的抗體構建體。
在第三方面，在本發明的背景下還設想提供一種載體，該載體包含本發明的多核苷酸。
在第四方面，在本發明的背景下進一步設想提供一種宿主細胞，該宿主細胞用本發明的多核苷酸或載體轉化或轉染。
在第五方面，在本發明的背景下還設想提供一種用於產生本發明的抗體構建體之方法，所述方法包括在允許表現該抗體構建體的條件下培養本發明的宿主細胞並且從該培養中回收所產生的抗體構建體。
在第六方面，在本發明的背景下進一步設想提供一種藥物組成物，該藥物組成物包含本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想該藥物組成物在約-20°C下穩定至少四週。
在本發明的背景下進一步設想提供本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體，用於在選自增殖性疾病、腫瘤性疾病、癌症或免疫學病症的疾病的預防、治療或緩解中使用。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想該疾病係胃腸癌（例如胃癌、食道癌、胃食道癌或結腸直腸癌）或胰腺癌。
在所述方面內，在本發明的背景下還設想該疾病係胃癌。
在第七方面，在本發明的背景下進一步設想提供一種用於治療或緩解增殖性疾病、腫瘤性疾病、癌症或免疫學病症之方法，該方法包括向有需要的受試者給予本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體的步驟，其中該疾病較佳的是胃腸癌或胰腺癌、最較佳的是胃癌。
在第八方面，在本發明的背景下還設想提供一種套組（kit），該套組包含本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體、本發明的多核苷酸、本發明的載體、和/或本發明的宿主細胞。
在第九方面，在本發明的背景下進一步設想提供一種用於治療或緩解胃腸癌之方法，該方法包括向有需要的受試者給予針對MUC17和CD3的雙特異性抗體構建體的步驟。
在第十方面，在本發明的背景下進一步設想提供針對MUC17和CD3的雙特異性抗體構建體，用於在胃腸癌的治療或緩解中使用。
在本發明的背景下，提供了一種特異性靶向與惡性腫瘤相關的MUC17的雙特異性抗體構建體。為此，首先將MUC17鑒定為相對於正常組織表現在胃腫瘤中上調的基因。在這方面，根據本領域常用的免疫組織化學方法顯示MUC17蛋白在40%-77%的胃腫瘤中表現。藉由流式細胞術還證明，除了一些胰腺癌細胞系和結腸直腸癌細胞系之外，MUC17蛋白在胃癌細胞系和食道癌細胞系的細胞表面上表現。甚至已經顯示，這種表現在中國患者的胃腫瘤中特別高。因此，將MUC17鑒定為與胃腸癌，即胃癌、小腸癌和大腸癌（結腸癌）、食道癌和胰腺癌相關的有效靶標。
在本發明的背景下令人驚訝的發現係，根據本發明的雙特異性抗體構建體較佳的是靶向攜帶MUC17的癌細胞，諸如胃癌細胞和胃腸癌細胞，並且相比之下，較少地靶向非癌細胞。MUC17通常在非癌腸上皮細胞的頂端表面（即，位於對應細胞的基部的對面）上表現，並且形成黏膜層的一部分。然而，MUC 17在胃癌和胃腸癌中過表現，並且在這種情況下不限於頂端表面，而是也在非頂端表面上表現。不希望受理論束縛，認為頂端表面上的MUC17較不易於為根據本發明的雙特異性抗體構建體所接近，而在癌細胞中的非頂端表面上表現的MUC17更易於接近。因此，根據本發明的雙特異性抗體構建體較佳的是靶向MUC17相關癌細胞並且較少地靶向非癌細胞。當比較健康動物中的良好耐受性與體內癌症模型中的高抗腫瘤功效時，已經令人驚訝地發現了這一點。詳細地，儘管免疫組織化學確認了在從探究性毒理學研究中評價的猴取樣的胃腸組織（諸如小腸）的頂端表面上的MUC17表現，但有利地，在表現MUC17的組織中沒有組織病理學變化。同樣在體外確認了非癌細胞對根據本發明的雙特異性抗體構建體的良好耐受性。相比之下，當與對照組中的安慰劑治療的小鼠相比時，用根據本發明的雙特異性抗體構建體靜脈內治療攜帶腫瘤小鼠導致統計學上顯著且劑量依賴性的腫瘤生長抑制。因此，根據本發明的雙特異性抗體構建體較佳的是被患者耐受，並且特徵在於先前未針對任何MUC17定址劑描述的較佳的是便於控制的治療窗。
在本發明的背景下提供了針對MUC17蛋白的EGF-SEA-EGF區的雙特異性抗體構建體。有利地，靶向蛋白質的該區提供相對於最近家族成員（MUC3A、MUC3B、MUC12；例如，Hollingsworth和Swanson, Nat. Rev. Cancer [自然綜述：癌症] 2004）的選擇性，以及結合細胞膜相關MUC17的能力。與其他跨膜黏蛋白一樣，MUC17在SEA結構域內含有潛在的裂解位點。
因此，在此設想了靶向MUC17 EGF-SEA-EGF區和CD3並具有單鏈Fc形式以延長半衰期靶向的雙特異性抗體構建體。有利地，本發明的雙特異性抗體構建體較佳的是具有高的針對攜帶MUC17靶標的靶細胞的親和力（單數位nM KD ）和效能（＜50 pM EC50），以允許靶向感興趣的腫瘤細胞中的低或非均勻水平的MUC17。
設想根據本發明的雙特異性抗體構建體與例如食蟹猴MUC17（除了人MUC17之外）具有交叉反應性，以實現非臨床毒理學研究。本文首次提出了食蟹猴MUC17的EGF-SEA-EGF結構域的序列細節的重要性。
在本發明的背景下，設想雙特異性抗體構建體表現出結合親和力、強有力的細胞毒活性，並且是對於SEA結構域最穩定的圖譜。
在本發明的背景下，設想雙特異性抗體構建體在靶標結合物中具有半胱胺酸夾鉗，即分子內二硫鍵，以改善穩定性。
在本發明的背景下，設想具有作為半衰期延長（HLE）部分並且針對MUC17的單鏈Fc（scFc）的雙特異性抗體構建體旨在用於在胃腸癌，包括胃癌、胃食道癌、食道癌、胰腺癌和結腸直腸癌的治療中使用。
此外，在本發明的背景下，視需要但有利地設想scFc即HLE抗體構建體能夠靜脈內給藥，該靜脈內給藥每週僅施用一次、每兩週施用一次、每三週施用一次或甚至每四週施用一次，或更不頻繁地施用。
在本發明的背景下，藉由首先消除MUC17的串聯重複序列（因為它們係高度糖基化的並且在序列上係重複的）來鑒定有待治療靶向的較佳的表位。這導致例如376 aa未定義區和177 aa EGF樣/SEA結構域區。有利地，靶向EGF樣/SEA結構域允許相對於最近家族成員諸如MUC3的選擇性、與食蟹猴MUC17的交叉反應性以及與細胞膜相關MUC17的結合。隨後我們生成用於評價結合、T細胞重定向溶解、激活和細胞介素釋放的試劑和測定。使用這些測定來確認較佳的雙特異性抗體構建體在親和力、細胞毒活性和構建體穩定性方面滿足預定義的候選產物特徵。
為了確定針對MUC17的較佳的雙特異性抗體構建體的一個或多個表位，如本文所述那樣進行表位定位。較佳的雙特異性抗體構建體針對包含SEA結構域的表位E2。E2表位包含在本文中表徵為SEQ ID NO: 528的胺基酸（aa）序列。根據uniprot Q685J3編號，該胺基酸序列基本上對應於MUC17的aa 4171至4296。一般來講，在本發明的背景下的MUC17 aa編號總是參考或旨在參考MUC17的uniprot Q685J3編號產生。相反，靶向MUC17的E1表位（即SEA結構域的N末端表位（參見圖1））的雙特異性抗體構建體令人驚訝地顯示出與MUC3A和MUC3B的不期望的交叉反應性，這將導致脫靶活性並且最終導致副作用風險增加。此外，針對位於SEA結構域C末端的表位E3和E4（參見圖1）的雙特異性抗體構建體出乎意料地不與食蟹猴MUC17交叉反應。因此，設想根據本發明的雙特異性抗體構建體特異性地且排他地結合MUC17的E2表位。
這種根據本發明的較佳的雙特異性抗體構建體可以根據它們的結構或它們獨特的詳細表位結合特徵進一步詳細說明。根據本發明的較佳的雙特異性抗體構建體可以藉由計算如本文提供的細胞毒性與親和力的新穎指示比率來確定。例如，所述比率（EC50 /KD ）* 1000較佳的是 ＜（低於）250。這種比率典型地指示與表位E2的截短變體，即TR2（幹體（trunk）2：SEQ ID NO 532）和TR3（幹體3：SEQ ID NO: 533）的良好結合，而比率 ＞（高於）250典型地更加表明與TR2但不與TR3良好結合。詳細地，最較佳的構建體典型地結合表位簇E2/E5A/部分5B和/或TR2/TR3。它們顯示出例如低於約21的（EC50 : KD ）* 1000比率並且屬於相關序列家族（例如優化（OPT）文庫命名4a、4b、5a和10）。它們的VH/VL安排較佳的是在本文中的特徵為4λ3或“4I3”）。在本發明的背景下，將此類構建體鑒定為例如，8-A7、8-B7、8-B8、8-C7、8-H8、8-D7、4-E7、8-F9、1-A6、8-H9、1-B6、8-F11和5-H1。還較佳的是與表位簇E2/E5A/部分5B和/或TR2/TR3結合並且顯示EC50 : KD 比率低於約125且屬於序列家族（OPT文庫命名）1a、1c和9的構建體。它們的VH/VL安排的特徵為3λ3或“3I3”。在本發明的背景下鑒定了此類構建體，例如，2-D11、8-E3、32-G6、2-C2、9-C2、1-B10、4-B1、4-F6、4-G4、4-A8、4-B10、4-H11和4-H2。較佳的是但相比於前述兩個序列家族次較佳的是結合表位簇E2/部分E5A/部分5B和/或TR2/部分TR3且顯示出（EC50 /KD ）* 1000比率低於約1500，典型地在250與1450之間，且屬於序列家族（OPT文庫命名）6、7和8的結合物。它們的VH/VL安排的特徵為2k3或“3k3”。本文特別較佳的是構建體32-G6（SEQ ID NO: 65）、1-B6（SEQ ID NO: 483）、2-C2（SEQ ID NO: 428）和8-B7（SEQ ID NO: 186）。在本發明的背景下，通常藉由SPC（諸如BiacoreB分析）測量親和力，並且典型地將結果以nM給出。典型地，使用NUGC-4細胞作為MUC17靶細胞並且使用未刺激的人PBMC作為CD3效應細胞來測定細胞毒活性。
在本發明的背景下設想，較佳的雙特異性抗體構建體不僅顯示出有利的細胞毒性與親和力的比率，而且另外還顯示出足夠的穩定性特徵，以便有助於配製、儲存和給予所述構建體的實際操作。例如，足夠的穩定性的特徵在於標準製備後的高單體含量（即非聚集的和/或非締合的天然分子），諸如如藉由製備型尺寸排阻層析法（SEC）測定的至少65%、更多較佳的是至少70%並且甚至更較佳的是至少75%。另外，例如在濃度為2.5 mg/ml下以340 nm作為光學吸收測量的濁度應該較佳的是等於或低於0.025、更較佳的是0.020，例如，以便得出基本上不存在不希望的聚集體的結論。有利地，在應激條件（諸如冷凍/解凍）下孵育或在37°C或40°C下孵育之後保持高單體含量。
因此，本發明提供了一種抗體構建體，該抗體構建體包含：
• 第一結構域，該第一結構域與MUC17結合，
• 第二結構域，該第二結構域與人和獼猴CD3ε鏈的細胞外表位結合；以及視需要
• 第三結構域，該第三結構域包含兩個多肽單體，每個多肽單體包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域，其中所述兩個多肽單體經由肽接頭彼此融合。
在一個實施方式中，本發明提供了包含所有三個這樣的結構域的雙特異性抗體構建體。
術語“抗體構建體”係指其中結構和/或功能是基於抗體，例如全長或整個免疫球蛋白分子的結構和/或功能的分子。因此，抗體構建體能夠結合其特異性靶標或抗原並且/或者從抗體或其片段的可變重鏈（VH）和/或可變輕鏈（VL）結構域中提取。此外，將根據本發明與其結合配偶體結合的結構域在本文中理解為根據本發明的抗體構建體的結合結構域。典型地，根據本發明的結合結構域包含允許靶結合的抗體的最小結構要求。這種最小要求可以例如藉由至少三個輕鏈CDR（即VL區的CDR1、CDR2和CDR3）和/或三個重鏈CDR（即VH區的CDR1、CDR2和CDR3）、較佳的是全部六個CDR的存在來定義。定義抗體的最小結構要求的替代方法係分別定義特異性靶標結構內的抗體表位、構成表位區（表位簇）的靶蛋白的蛋白結構域或藉由參考與所定義抗體的表位競爭的特異性抗體。根據本發明的構建體所基於的抗體包括例如單株抗體、重組抗體、嵌合抗體、去免疫抗體、人源化抗體和人抗體。
根據本發明的抗體構建體的結合結構域可以例如包含上文提及的CDR組。較佳的是，那些CDR包含在抗體輕鏈可變區（VL）和抗體重鏈可變區（VH）的框架中；然而，它不一定包含兩者。例如，Fd片段具有兩個VH區並且通常保留完整抗原結合結構域的一些抗原結合功能。抗體片段、抗體變體或結合結構域的形式的另外實例包括 (1) Fab片段，一種具有VL、VH、CL和CH1結構域的單價片段；(2) F(ab')2 片段，一種具有由二硫橋在鉸鏈區連接的兩個Fab片段的雙價片段；(3) 具有兩個VH和CH1結構域的Fd片段；(4) 具有抗體的單一臂的VL和VH結構域的Fv片段；(5) 具有VH結構域的dAb片段（Ward等人, (1989) Nature [自然] 341 :544-546）；(6) 分離的互補決定區（CDR），以及(7) 單鏈Fv（scFv），後者係較佳的（例如，衍生自scFV文庫）。根據本發明的抗體構建體的實施方式的實例例如描述於以下中：WO 00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、WO 2014/144722、WO 2014/151910和WO 2015/048272。
另外，在“結合結構域”或“結合的結構域”的定義內係全長抗體的片段，諸如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab’、F(ab')2或“r IgG”（“半抗體”）。根據本發明的抗體構建體還可以包含抗體的修飾片段（也稱為抗體變體），諸如scFv、二-scFv或二(雙)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉鍊、scFab、Fab2 、Fab3 、雙抗體、單鏈雙抗體、串聯雙抗體（Tandab’s）、串聯二-scFv、串聯三-scFv、“多抗體”（諸如三抗體或四抗體），以及單結構域抗體（諸如奈米抗體）或僅包含一個可變結構域的單一可變結構域抗體，該一個可變結構域可以是獨立於其他V區或結構域而特異性結合抗原或表位的VHH、VH或VL。
如本文使用的，術語“單鏈Fv”、“單鏈抗體”或“scFv”係指單一多肽鏈抗體片段，這些抗體片段包含來自重鏈和輕鏈的可變區，但缺乏恒定區。一般來講，單鏈抗體進一步包含在VH與VL結構域之間的多肽接頭，該多肽接頭使得它形成所希望的將允許抗原結合的結構。單鏈抗體詳細論述於以下中：Pluckthun，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies [單株抗體的藥理學]中, 第113卷, Rosenburg和Moore編輯 Springer-Verlag [施普林格出版社], 紐約, 第269-315頁 (1994)。產生單鏈抗體的各種方法係已知的，包括以下中所描述的那些：美國專利案號4,694,778和5,260,203；國際專利申請公開案號WO 88/01649；Bird (1988) Science [科學] 242:423-442；Huston等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 85:5879-5883；Ward等人 (1989) Nature [自然] 334:54454；Skerra等人 (1988) Science [科學] 242:1038-1041。在具體的實施方式中，單鏈抗體還可以是雙特異性的、多特異性的、人和/或人源化的和/或合成的。
此外，術語“抗體構建體”的定義包括單價、二價和多價（polyvalent/multivalent）構建體，並且因此包括僅與兩個抗原結構特異性結合的雙特異性構建體，以及藉由不同的結合結構域特異性結合超過兩個（例如三個、四個或更多個）抗原結構的多特異性構建體。此外，術語“抗體構建體”的定義包括僅由一條多肽鏈組成的分子以及由超過一條多肽鏈組成的分子，這些鏈可以是相同的（同源二聚體、同源三聚體或同源寡聚物）或不同的（異源二聚體、異源三聚體或異源寡聚物）。上文鑒定的抗體及其變體或衍生物的實例尤其描述於以下中：Harlow和Lane, Antibodies a laboratory manual [抗體：實驗室手冊], CSHL Press [冷泉港實驗室出版社] (1988)和Using Antibodies: a laboratory manual [使用抗體：實驗室手冊], CSHL Press [冷泉港實驗室出版社] (1999)；Kontermann和Dübel, Antibody Engineering [抗體工程], Springer [施普林格], 第2版 2010和Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy [用於免疫療法的重組抗體], Cambridge University Press [劍橋大學出版社] 2009。
如本文使用的，術語“雙特異性”係指“至少雙特異性”的抗體構建體，即該抗體構建體至少包含第一結合結構域和第二結合結構域，其中第一結合結構域與一種抗原或靶標（此處：MUC17MUC17）結合，並且第二結合結構域與另一抗原或靶標（此處：CD3）結合。因此，根據本發明的抗體構建體包含針對至少兩種不同抗原或靶標的特異性。例如，第一結構域較佳的是不與如本文所述的物種中的一種或多種的CD3ε的細胞外表位結合。術語“靶細胞表面抗原”係指由細胞表現並且存在於細胞表面以使得為如本文所述的抗體構建體所接近的抗原結構。它可以是蛋白質，較佳的是蛋白質的細胞外部分；或碳水化合物結構，較佳的是蛋白質的碳水化合物結構，諸如糖蛋白。它較佳的是腫瘤抗原。術語本發明的“雙特異性抗體構建體”還涵蓋多特異性抗體構建體，諸如三特異性抗體構建體，後者包括三個結合結構域，或具有超過三種（例如四種、五種......）特異性的構建體。
鑒於根據本發明的抗體構建體係（至少）雙特異性的，它們不是天然存在的並且與天然存在的產物明顯不同。因此，“雙特異性”抗體構建體或免疫球蛋白係具有至少兩個具有不同特異性的不同結合側的人工雜交抗體或免疫球蛋白。雙特異性抗體構建體可以藉由多種方法產生，包括雜交瘤的融合或Fab'片段的連接。參見，例如Songsivilai和Lachmann, Clin. Exp. Immunol.[臨床實驗免疫學] 79:315-321 (1990)。
本發明的抗體構建體的至少兩個結合結構域和可變結構域（VH/VL）可以包含或可以不包含肽接頭（間隔肽）。根據本發明，術語“肽接頭”包含這樣的胺基酸序列：藉由該胺基酸序列，本發明的抗體構建體的一個（可變和/或結合）結構域和另一（可變和/或結合）結構域的胺基酸序列彼此連接。肽接頭也可以用於將第三結構域與本發明的抗體構建體的其他結構域融合。這種肽接頭的基本技術特徵在於它不包含任何聚合活性。合適的肽接頭係在美國專利4,751,180和4,935,233或WO 88/09344中描述的那些。肽接頭也可用於將其他結構域或模組或區（諸如半衰期延長結構域）連接到本發明的抗體構建體。
本發明的抗體構建體較佳的是為“體外產生的抗體構建體”。這個術語係指根據上述定義的抗體構建體，其中在非免疫細胞選擇，例如體外噬菌體展示、蛋白質晶或其中可以測試候選序列與抗原結合的能力的任何其他方法中產生可變區（例如，至少一個CDR）的全部或一部分。因此，這個術語較佳的是排除僅由動物中免疫細胞中基因組重排產生的序列。“重組抗體”係藉由使用重組DNA技術或基因工程製得的抗體。
如本文使用的，術語“單株抗體”（mAb）或單株抗體構建體係指獲得自實質上均質的抗體群體的抗體，即除了可以少量存在的可能天然存在的突變和/或翻譯後修飾（例如，異構化、醯胺化）外，構成該群體的單獨抗體係相同的。與典型地包括針對不同決定簇（或表位）的不同抗體的常規（多株）抗體製劑相比，單株抗體針對抗原上的單一抗原側或決定簇具有高度特異性。除了它們的特異性之外，單株抗體還在它們藉由雜交瘤培養物合成，因此不被其他免疫球蛋白污染方面係有優勢的。修飾語“單株”指示獲得自實質上均質的抗體群體的抗體的特徵，並且不應理解為要求藉由任何特定方法產生抗體。
對於單株抗體的製備，可以使用提供由連續細胞系培養物產生的抗體的任何技術。例如，有待使用的單株抗體可以藉由Koehler等人, Nature [自然], 256: 495 (1975)首次描述的雜交瘤方法，或可以藉由重組DNA方法（參見，例如美國專利案號4,816,567）製備。用於產生人單株抗體的另外技術的實例包括三源雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術（Kozbor, Immunology Today [今日免疫學] 4 (1983), 72）和EBV-雜交瘤技術（Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy [單株抗體和癌症治療], Alan R. Liss公司 (1985), 77-96）。
然後可以使用標準方法（諸如酶聯免疫吸附測定（ELISA）和表面電漿共振分析例如Biacore™篩選雜交瘤以鑒定一種或多種產生與指定抗原特異性結合的抗體的雜交瘤。任何形式的相關抗原均可以用作免疫原，例如重組抗原、天然存在形式、其任何變體或片段以及其抗原肽。如在Biacore系統中採用的表面電漿共振可以用於增加與靶細胞表面抗原的表位結合的噬菌體抗體的效率（Schier, Human Antibodies Hybridomas [人抗體雜交瘤] 7 (1996), 97-105；Malmborg, J. Immunol. Methods [免疫學方法雜誌] 183 (1995), 7-13）。
另一種製備單株抗體的示例性方法包括篩選蛋白質表現文庫，例如噬菌體展示或核糖體展示文庫。噬菌體展示例如描述於以下中：Ladner等人, 美國專利案號5,223,409；Smith (1985) Science [科學] 228:1315-1317；Clackson等人, Nature [自然], 352: 624-628 (1991)和Marks等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 222: 581-597 (1991)。
除了使用展示文庫之外，還可以使用相關抗原來免疫非人動物，例如齧齒動物（諸如小鼠、倉鼠、兔或大鼠）。在一個實施方式中，非人動物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，有可能用人Ig（免疫球蛋白）基因座的大片段來工程化小鼠抗體產生缺陷的小鼠品系。使用雜交瘤技術，可以產生並選擇衍生自具有所希望的特異性的基因的抗原特異性單株抗體。參見，例如XENOMOUSE™；Green等人 (1994) Nature Genetics [自然遺傳學] 7:13-21；US 2003-0070185；WO 96/34096和WO 96/33735。
單株抗體也可以獲得自非人動物，並且然後使用本領域中已知的重組DNA技術進行修飾，例如人源化、去免疫、呈現嵌合等。修飾的抗體構建體的實例包括非人抗體的人源化變體、“親和力成熟”抗體（參見，例如Hawkins等人 J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 254, 889-896 (1992)和Lowman等人, Biochemistry [生物化學] 30, 10832- 10837 (1991)）和具有改變的一種或多種效應子功能的抗體突變體（參見，例如美國專利5,648,260；Kontermann和Dübel (2010), 上述引文和Little (2009),上述引文）。
在免疫學中，親和力成熟係這樣的過程：藉由該過程，在免疫應答的過程中B細胞產生與抗原的親和力增加的抗體。由於反復暴露於相同的抗原，宿主會產生依次更大親和力的抗體。如天然原型一樣，體外親和力成熟係基於突變和選擇的原則。體外親和力成熟已經成功地用於優化抗體、抗體構建體和抗體片段。使用輻射、化學誘變劑或易錯PCR在CDR內引入隨機突變。此外，遺傳多樣性可以藉由鏈改組（chain shuffling）來增加。使用展示方法（如噬菌體展示）進行兩輪或三輪突變和選擇通常產生具有在低納莫耳範圍內的親和力的抗體片段。
抗體構建體的胺基酸取代變化的較佳的類型涉及取代親本抗體（例如人源化或人抗體）的一個或多個超變區殘基。一般來講，選擇用於進一步開發的一種或多種所得變體相對於產生它們的親本抗體將具有改善的生物特性。用於產生此類取代變體的便利方式涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡而言之，將若干個超變區側（例如6-7個側）突變以在每側產生所有可能的胺基酸取代。由此產生的抗體變體以單價方式從絲狀噬菌體顆粒展示為與每個顆粒內包裝的M13的基因III產物的融合物。然後如本文所揭露那樣篩選噬菌體展示的變體的生物活性（例如結合親和力）。為了鑒定用於修飾的候選超變區側，可以進行丙胺酸掃描誘變以鑒定對抗原結合有顯著貢獻的超變區殘基。可替代地或另外，分析抗原-抗體複合物的晶體結構以鑒定結合結構域與例如人MUC17之間的接觸點可能是有利的。根據本文闡述的技術，此類接觸殘基和相鄰殘基係用於取代的候選者。一旦產生了此類變體，就如本文所述對這組變體進行篩選，並且可以選擇在一種或多種相關測定中具有優異特性的抗體用於進一步的開發。
本發明的單株抗體和抗體構建體具體地包括“嵌合”抗體（免疫球蛋白），其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列一致或同源，而一個或多個鏈的其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列一致或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現出所希望的生物活性即可（美國專利案號4,816,567；Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 81: 6851-6855 (1984)）。本文感興趣的嵌合抗體包括“靈長類化”抗體，這些抗體包含衍生自非人靈長類動物（例如，舊大陸猴、猿等）的可變結構域抗原結合序列和人恒定區序列。已經描述了多種用於製備嵌合抗體的方法。參見，例如Morrison等人, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. [美國國家科學院院刊] 81:6851 , 1985；Takeda等人, Nature [自然] 314:452, 1985；Cabilly等人, 美國專利案號4,816,567；Boss等人, 美國專利案號4,816,397；Tanaguchi等人, EP 0171496；EP 0173494；和GB 2177096。
抗體、抗體構建體、抗體片段或抗體變體還可以藉由例如WO 98/52976或WO 00/34317中揭露的方法特定地缺失人T細胞表位（稱為“去免疫”的方法）來進行修飾。簡而言之，可以針對與II類MHC結合的肽分析抗體的重鏈和輕鏈可變結構域；這些肽代表潛在的T細胞表位（如WO 98/52976和WO 00/34317中所定義）。為了檢測潛在T細胞表位，可以應用稱為“肽穿線”的電腦建模方法，並且此外針對VH和VL序列中存在的基序，可以搜索人MHC II類結合肽的數據庫，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。這些基序與18種主要的MHC II類DR同種異型中的任一種結合，並且因此構成潛在T細胞表位。檢測到的潛在T細胞表位可以藉由取代可變結構域中的少量胺基酸殘基，或者較佳的是藉由單個胺基酸取代來消除。典型地，進行保守取代。通常但不排他地，可以使用人種系抗體序列中的位置共有的胺基酸。人種系序列例如揭露於以下中：Tomlinson等人 (1992) J. MoI. Biol. [分子生物學雜誌] 227:776-798；Cook, G.P.等人 (1995) Immunol. Today [今日免疫學] 第16卷 (5): 237-242；和Tomlinson等人 (1995) EMBO J. [歐洲分子生物學學會雜誌] 14: 14:4628-4638。V BASE目錄提供了人免疫球蛋白可變區序列的綜合目錄（由Tomlinson, LA.等人編輯 MRC Centre for Protein Engineering [醫學研究理事會蛋白質工程中心], Cambridge, UK [英國劍橋]）。這些序列可以用作人序列的來源，例如用於框架區和CDR。也可以使用共有的人框架區，例如如美國專利案號6,300,064中所述。
“人源化”抗體、抗體構建體、其變體或片段（諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其他抗原結合子序列）係主要人序列的抗體或免疫球蛋白，這些主要人序列含有一種或多種衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。對於大部分來說，人源化抗體係人免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受體的高變區（也稱為CDR）的殘基被來自非人（例如齧齒動物）物種（供體抗體）（諸如小鼠、大鼠、倉鼠或兔）的具有所希望的特異性、親和力和能力的高變區的殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區（FR）殘基被相應的非人類殘基替換。此外，如本文使用的，“人源化抗體”還可以包括在受體抗體或供體抗體中均未發現的殘基。進行這些修飾以進一步改進和優化抗體性能。人源化抗體還可以包含典型地是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定區（Fc）的至少一部分。對於更多的細節，參見Jones等人 Nature [自然], 321: 522-525 (1986)；Reichmann等人, Nature [自然], 332: 323-329 (1988)；和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. [結構生物學新見], 2: 593-596 (1992)。
人源化抗體或其片段可以藉由用人Fv可變結構域的等效序列替換不直接參與抗原結合的Fv可變結構域的序列來產生。用於產生人源化抗體或其片段的示例性方法由以下提供：Morrison (1985) Science [科學] 229:1202-1207；Oi等人 (1986) BioTechniques [生物技術] 4:214；以及US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；和US 6,407,213。那些方法包括分離、操縱和表現編碼來自重鏈或輕鏈中的至少一者的全部或部分免疫球蛋白Fv可變結構域的核酸序列。此類核酸可以獲得自如上所述的產生針對預定靶標的抗體的雜交瘤，以及其他來源。然後可以將編碼人源化抗體分子的重組DNA選殖到合適的表現載體中。
人源化抗體還可以使用轉基因動物（諸如表現人重鏈和輕鏈基因但不能表現內源性小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的小鼠）產生。Winter描述了可用於製備本文所述的人源化抗體的示例性CDR移植方法（美國專利案號5,225,539）。特定人抗體的全部CDR可以用至少一部分非人CDR替換，或者僅一些CDR可以用非人CDR替換。僅需要替換用於將人源化抗體與預定抗原結合所希望的CDR數量。
可以藉由引入保守取代、共有序列取代、種系取代和/或回復突變來優化人源化抗體。此類改變的免疫球蛋白分子可以藉由本領域中已知的若干種技術中的任一種來製得（例如，Teng等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊], 80: 7308-7312, 1983；Kozbor等人, Immunology Today [今日免疫學], 4: 7279, 1983；Olsson等人, Meth. Enzymol. [酶學方法], 92: 3-16, 1982和EP 239 400）。
術語“人抗體”、“人抗體構建體”和“人結合結構域”包括具有抗體區的抗體、抗體構建體和結合結構域，這些抗體區諸如實質上對應於本領域中已知的人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區或結構域，包括例如由Kabat等人 (1991)（上述引文）描述的那些。本發明的人抗體、抗體構建體或結合結構域可以包含例如CDR中且特別是CDR3中不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基（例如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變引入的突變）。人抗體、抗體構建體或結合結構域可以具有至少1個、2個、3個、4個、5個或更多個被不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基替換的位置。然而，如本文使用的人抗體、抗體構建體和結合結構域的定義還涵蓋“完全人抗體”，這些完全人抗體僅包含非人工和/或遺傳改變的人抗體序列，如可藉由使用諸如Xenomouse技術或系統衍生的那些。較佳的是，“完全人抗體”不包含不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基。
在一些實施方式中，本發明的抗體構建體係“分離的”或“實質上純的”抗體構建體。當用於描述本文揭露的抗體構建體時，“分離的”或“實質上純的”意指抗體構建體已從其產生環境的組分中鑒定、分離和/或回收。較佳的是，抗體構建體不與或實質上不與來自其產生環境的所有其他組分締合。其產生環境的污染組分，諸如由重組轉染細胞產生的污染組分，係典型地干擾多肽的診斷或治療用途的物質，並且可能包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。抗體構建體可以例如占給定樣品中總蛋白質的按重量計至少約5%或至少約50重量%。應理解，根據情況，分離的蛋白質可以占總蛋白質含量的按重量計5%至99.9%。藉由使用誘導型啟動子或高表現啟動子，可以以顯著更高的濃度製備多肽，以使得它以增加的濃度水平製備。該定義包括在本領域中已知的多種生物體和/或宿主細胞中產生抗體構建體。在較佳的實施方式中，抗體構建體 (1) 藉由使用旋杯式序列分析儀純化至足以獲得至少15個N末端或內部胺基酸序列的殘基的程度，或 (2) 可以藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍（Coomassie blue）或較佳的是銀染色純化至均質。然而，通常藉由至少一個純化步驟來製備分離的抗體構建體。
術語“結合結構域”關於本發明表徵了（特異性地）與靶分子（抗原）（此處：分別為MUC17和CD3）上的給定靶表位或給定靶側結合/相互作用/識別該給定靶表位或給定靶側的結構域。第一結合結構域（識別MUC17）的結構和功能以及較佳的是還有第二結合結構域（識別CD3）的結構和/或功能是基於抗體，例如全長或完整免疫球蛋白分子的結構和/或功能，並且/或者係從抗體或其片段的可變重鏈（VH）和/或可變輕鏈（VL）結構域中提取。較佳的是，第一結合結構域的特徵在於三個輕鏈CDR（即VL區的CDR1、CDR2和CDR3）和/或三個重鏈CDR（即VH區的CDR1、CDR2和CDR3）的存在。第二結合結構域較佳的是還包含允許靶結合的抗體的最小結構要求。更較佳的是，第二結合結構域包含至少三個輕鏈CDR（即VL區的CDR1、CDR2和CDR3）和/或三個重鏈CDR（即VH區的CDR1、CDR2和CDR3）。設想第一結合結構域和/或第二結合結構域係藉由噬菌體展示或文庫篩選方法產生或可獲得的，而不是藉由將來自預先存在的（單株）抗體的CDR序列移植到支架中產生或可獲得的。
根據本發明，結合結構域呈一種或多種多肽的形式。此類多肽可以包括蛋白質部分和非蛋白質部分（例如化學接頭或化學交聯劑，諸如戊二醛）。蛋白質（包括其片段、較佳的是生物活性片段和通常具有少於30個胺基酸的肽）包含經由共價肽鍵彼此偶聯的兩個或更多個胺基酸（產生胺基酸鏈）。
如本文使用的，術語“多肽”描述了一組分子，這些分子通常由超過30個胺基酸組成。多肽可以進一步形成多聚體，諸如二聚體、三聚體和更高級的寡聚物，即由多於一個多肽分子組成。形成此類二聚體、三聚體等的多肽分子可以是相同的或不相同的。因此，此類多聚體的相應的更高級結構稱為同源二聚體或異源二聚體、同源三聚體或異源三聚體等。異源多聚體的實例係在其天然形式下由兩條相同的輕鏈多肽鏈和兩條相同的重鏈多肽鏈組成的抗體分子。術語“肽”、“多肽”和“蛋白質”也是指天然修飾的肽/多肽/蛋白質，其中修飾係例如藉由翻譯後修飾（如糖基化、乙醯化、磷酸化等）來實現。當在本文中提及時，“肽”、“多肽”或“蛋白質”也可以是化學修飾的，諸如聚乙二醇化的。此類修飾在本領域中是熟知的並且在下文描述。
較佳的是，與MUC17結合的結合結構域和/或與CD3ε結合的結合結構域係人結合結構域。包含至少一個人結合結構域的抗體和抗體構建體避免了與具有非人（諸如齧齒動物（例如鼠類、大鼠、倉鼠或兔））可變區和/或恒定區的抗體或抗體構建體相關的一些問題。此類齧齒動物衍生的蛋白質的存在可以導致抗體或抗體構建體快速清除或可以導致患者產生針對抗體或抗體構建體的免疫應答。為了避免使用齧齒動物衍生的抗體或抗體構建體，可以藉由將人抗體功能引入到齧齒動物中以使齧齒動物產生完全人抗體來產生人或完全人抗體/抗體構建體。
在酵母人工染色體YAC中選殖和重構兆鹼基大小的人基因座並將它們引入到小鼠種系中的能力為闡明非常大或粗略定位的基因座的功能組分以及產生有用的人疾病模型提供了強有力的方法。此外，使用這種技術將小鼠基因座取代為其人等效物可以提供關於人基因產物在發育過程中的表現和調控、其與其他系統的通信以及其參與疾病誘導和進展的獨特見解。
這種策略的重要實際應用係小鼠體液免疫系統的“人源化”。將人免疫球蛋白（Ig）基因座引入到其中內源性Ig基因已經失活的小鼠中提供了研究抗體的程式化表現和組裝的根本機制以及其在B細胞發育中的作用的機會。此外，這種策略可以為完全人單株抗體（mAb）的產生提供理想來源-這係有助於實現抗體療法在人疾病中的前景的重要里程碑。預期完全人抗體或抗體構建體將小鼠或小鼠衍生的mAb所固有的免疫原性和變應性應答最小化，並且由此增加給予的抗體/抗體構建體的功效和安全性。可以預期使用完全人抗體或抗體構建體可以在治療需要重複給予化合物的慢性和復發性人疾病（諸如炎症、自體免疫和癌症）中提供顯著的優勢。
實現這一目標的一種方法係用人Ig基因座的大片段工程化小鼠抗體產生缺陷的小鼠品系，預期這種小鼠在不存在小鼠抗體的情況下將產生大的人抗體組庫。大的人Ig片段將保持大的可變基因多樣性以及對抗體產生和表現的適當調控。藉由利用小鼠機構實現抗體多樣化和選擇以及缺乏對人蛋白質的免疫耐受性，在這些小鼠品系中再生的人抗體組庫應產生針對任何感興趣的抗原（包括人抗原）的高親和力抗體。使用雜交瘤技術，可以容易地產生和選擇具有所希望特異性的抗原特異性人mAb。結合第一種XenoMouse小鼠品系的產生證明了這個一般策略（參見Green等人 Nature Genetics [自然遺傳學] 7:13-21 (1994)）。用含有人重鏈基因座和k輕鏈基因座的分別245 kb和190 kb大小的種系構型片段的YAC工程化XenoMouse品系，這些種系構型片段含有核心可變區和恒定區序列。證明含有人Ig的YAC與小鼠系統相容以重排和表現抗體，並且這些YAC能夠取代失活的小鼠Ig基因。這藉由其誘導B細胞發育、產生完全人抗體的成人樣人組庫和產生抗原特異性人mAb的能力來證明。這些結果還表明，引入含有更多數量的V基因、額外的調控元件和人Ig恒定區的更大部分的人Ig基因座可以實質上再現作為對感染和免疫的人體液應答的特徵的完整組庫。Green等人的工作最近擴展到藉由分別引入兆鹼基大小的人重鏈基因座和k輕鏈基因座的種系構型YAC片段來引入大於約80%的人抗體組庫。參見Mendez等人 Nature Genetics [自然遺傳學] 15:146-156 (1997)和美國專利申請序號08/759,620。
XenoMouse動物的產生進一步論述和描繪於以下中：美國專利申請序號07/466,008、序號07/610,515、序號07/919,297、序號07/922,649、序號08/031,801、序號08/112,848、序號08/234,145、序號08/376,279、序號08/430,938、序號08/464,584、序號08/464,582、序號08/463,191、序號08/462,837、序號08/486,853、序號08/486,857、序號08/486,859、序號08/462,513、序號08/724,752和序號08/759,620；和美國專利案號6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598以及日本專利案號3 068 180 B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2。還參見Mendez等人 Nature Genetics [自然遺傳學] 15:146-156 (1997)和Green和Jakobovits J. Exp. Med. [實驗醫學雜誌] 188:483-495 (1998)、EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310和WO 03/47336。
在一個替代性方法中，包括真藥物國際公司（GenPharm International, Inc.）的其他公司利用了“微基因座”方法。在微基因座方法中，藉由包含來自Ig基因座的碎片（單獨的基因）來模擬外源性Ig基因座。因此，將一個或多個VH基因、一個或多個DH基因、一個或多個JH基因、mu恒定區和第二恒定區（較佳的是γ恒定區）形成為用於插入到動物中的構建體。該方法描述於以下中：授予Surani等人的美國專利案號5,545,807和各自授予Lonberg和Kay的美國專利案號5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458；授予Krimpenfort和Berns的美國專利案號5,591,669和6,023.010；授予Berns等人的美國專利案號5,612,205、5,721,367和5,789,215；和授予Choi和Dunn的美國專利案號5,643,763，以及真藥物國際公司美國專利申請序號07/574,748、序號07/575,962、序號07/810,279、序號07/853,408、序號07/904,068、序號07/990,860、序號08/053,131、序號08/096,762、序號08/155,301、序號08/161,739、序號08/165,699、序號08/209,741。還參見EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美國專利案號5,981,175。進一步參見Taylor等人 (1992)、Chen等人(1993)、Tuaillon等人 (1993)、Choi等人(1993)、Lonberg等人 (1994)、Taylor等人 (1994)和Tuaillon等人 (1995)、Fishwild等人 (1996)。
Kirin也展示了從藉由微細胞融合引入大段染色體或整個染色體的小鼠產生人抗體。參見歐洲專利申請案號773 288和843 961。Xenerex Biosciences正在開發用於人抗體的潛在產生的技術。在這種技術中，用人淋巴細胞（例如B和/或T細胞）重構SCID小鼠。然後將小鼠用抗原免疫並且可產生針對抗原的免疫應答。參見美國專利案號5,476,996、5,698,767和5,958,765。
人抗小鼠抗體（HAMA）應答已經導致該行業製備嵌合或其他人源化抗體。然而，預期特別是在抗體的長期或多劑量利用中會觀察到某些人抗嵌合抗體（HACA）應答。因此，期望提供抗體構建體，這些抗體構建體包含針對MUC17的人結合結構域和針對CD3ε的人結合結構域以便消除HAMA或HACA應答的問題和/或效應。
術語“與......（特異性）結合”、“（特異性）識別”、“（特異性）針對”和“與......（特異性）反應”意指根據本發明，結合結構域與靶分子（抗原）（此處：分別為MUC17和CD3ε）上的給定表位或給定靶側相互作用或特異性相互作用。
術語“表位”係指結合結構域（諸如抗體或免疫球蛋白，或抗體或免疫球蛋白的衍生物、片段或變體）特異性結合的抗原上的一側。“表位”係抗原性的，並且因此術語表位在本文中有時也稱為“抗原結構”或“抗原決定簇”。因此，結合結構域係“抗原相互作用側”。所述結合/相互作用也被理解為定義“特異性識別”。
“表位”可以藉由連續的胺基酸或藉由蛋白質的三級折疊並置的非連續胺基酸形成。“線性表位”係這樣的表位，其中胺基酸一級序列構成所識別表位。線性表位典型地在獨特的序列中包含至少3個或至少4個、且更通常地至少5個或至少6個或至少7個，例如約8個至約10個胺基酸。
與線性表位相反，“構象表位”係這樣的表位，其中構成表位的胺基酸的一級序列不是所識別表位的唯一限定組分（例如，其中胺基酸的一級序列不一定被結合結構域識別的表位）。典型地，構象表位包含相對於線性表位增加數量的胺基酸。關於構象表位的識別，結合結構域識別抗原、較佳的是肽或蛋白質或其片段的三維結構（在本發明的背景下，一個結合結構域的抗原結構包括於靶細胞表面抗原蛋白質內）。例如，當蛋白質分子折疊以形成三維結構時，形成構象表位的某些胺基酸和/或多肽骨架並置，使得抗體能夠識別表位。確定表位構象的方法包括但不限於x射線晶體學、二維核磁共振（2D-NMR）光譜學和定點自旋標記和電子順磁共振（EPR）光譜學。
以下描述了用於表位定位的方法：當人MUC17蛋白中的區（連續胺基酸拉伸物）與其非人和非靈長類動物MUC17（例如小鼠MUC17，但其他如雞、大鼠、倉鼠、兔等也是可能的）的相應區交換/替換時，預期發生結合結構域結合的降低，除非結合結構域對於所使用的非人、非靈長類動物MUC17具有交叉反應性。相比於與人MUC17蛋白中的對應區的結合，所述降低較佳的是為至少10%、20%、30%、40%或50%；更較佳的是至少60%、70%或80%，並且最較佳的是90%、95%或甚至100%，由此將與人MUC17蛋白中對應區的結合設定為100%。設想前述人MUC17/非人MUC17嵌合體在CHO細胞中表現。還設想人MUC17/非人MUC17嵌合體與不同膜結合蛋白（諸如EpCAM）的跨膜結構域和/或細胞質結構域融合。
在用於表位定位的替代或額外的方法中，可以產生若干種截短型式的人MUC17細胞外結構域以便確定由結合結構域識別的特異性區。在這些截短型式中，不同的細胞外MUC17結構域/亞結構域或區從N末端開始逐步缺失。設想截短的MUC17型式可以在CHO細胞中表現。還設想截短的MUC17型式可以與不同膜結合蛋白（諸如EpCAM）的跨膜結構域和/或細胞質結構域融合。還設想截短的MUC17型式可以在其N末端涵蓋訊號肽結構域，例如衍生自小鼠IgG重鏈訊號肽的訊號肽。此外設想，截短的MUC17型式可以在其N末端（在訊號肽後）涵蓋v5結構域，這允許驗證其在細胞表面上的正確表現。預期對不再涵蓋由結合結構域識別的MUC17區的那些截短的MUC17型式發生結合的減少或喪失。結合減少較佳的是為至少10%、20%、30%、40%、50%；更較佳的是至少60%、70%、80%，並且最較佳的是90%、95%或甚至100%，由此將與整個人MUC17蛋白（或其細胞外區或結構域）的結合設定為100。
確定MUC17的特定殘基對抗體構建體或結合結構域的識別的貢獻的另一種方法係丙胺酸掃描（參見，例如Morrison KL和Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. [化學生物學新見] 2001年6月; 5(3):302-7），其中有待分析的每個殘基例如經由定點誘變被丙胺酸替換。丙胺酸的使用係因為其具有非巨大的、化學惰性的甲基官能基，但仍然模仿許多其他胺基酸所具有的二級結構參考。在需要保守突變殘基的大小的情形下，有時可以使用巨大的胺基酸（諸如纈胺酸或亮胺酸）。丙胺酸掃描係一項已經使用了很長一段時間的成熟技術。
結合結構域與表位或包含表位的區之間的相互作用意味著結合結構域對特定蛋白或抗原（此處：分別為MUC17和CD3）上的表位/包含表位的區表現出可觀的親和力，並且通常與MUC17或CD3以外的蛋白質或抗原不表現出顯著反應性。“可觀的親和力”包括以約10-6 M（KD）或更強的親和力結合。較佳的是，當結合親和力為約10-12 至10-8 M、10-12 至10-9 M、10-12 至10-10 M、10-11 至10-8 M，較佳的是約10-11 至10-9 M時，認為該結合具有特異性。可以尤其藉由比較結合結構域與靶蛋白或抗原的反應與所述結合結構域與MUC17或CD3以外的蛋白質或抗原的反應容易地測試所述結合結構域與靶標是否特異性反應或結合。較佳的是，本發明的結合結構域基本上或實質上不與MUC17或CD3以外的蛋白質或抗原結合（即，第一結合結構域不能與MUC17以外的蛋白質結合，並且第二結合結構域不能與CD3以外的蛋白質結合）。設想根據本發明的抗體構建體的特徵為與其他HLE形式相比具有優異的親和力特徵。因此，這種優異的親和力表明體內半衰期延長。根據本發明的抗體構建體的更長的半衰期可以減少典型地有助於改善患者順應性的給予的持續時間和頻率。這係特別重要的，因為本發明的抗體構建體對高度虛弱的或甚至多重性癌症患者特別有益。
術語“基本上/實質上不結合”或“不能結合”意指本發明的結合結構域不結合MUC17或CD3以外的蛋白質或抗原，即與MUC17或CD3以外的蛋白質或抗原不顯示超過30%、較佳的是不超過20%、更較佳的是不超過10%、特別較佳的是不超過9%、8%、7%、6%或5%的反應性，由此將與MUC17或CD3的結合分別設定為100%。
據信特異性結合係藉由結合結構域和抗原的胺基酸序列中的特定基序實現的。因此，由於其一級、二級和/或三級結構以及所述結構的二次修飾的結果，實現了結合。抗原相互作用側與其特異性抗原的特異性相互作用可以導致所述側與抗原的簡單結合。此外，抗原相互作用側與其特異性抗原的特異性相互作用可以可替代地或另外地導致訊號的引發，例如由於誘導抗原構象的變化、抗原的寡聚化等。
術語“可變”係指抗體或免疫球蛋白結構域表現出其序列可變性並且參與確定特定抗體的特異性和結合親和力的部分（即“一個或多個可變結構域”）。可變重鏈（VH）和可變輕鏈（VL）的配對一起形成單一抗原結合位點。
可變性在整個抗體的可變結構域中並不均勻分佈；它集中在重鏈可變區和輕鏈可變區中的每一個的子結構域中。這些子結構域稱為“超變區”或“互補決定區”（CDR）。可變結構域的更保守的（即非超變）部分稱為“框架”區（FRM或FR），並且為三維空間中的六個CDR提供支架以形成抗原結合表面。天然存在的重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FRM區（FR1、FR2、FR3和FR4），這四個FRM區主要採用β-片層構型，藉由三個超變區連接，這三個超變區形成連接β-片層結構的環，並且在一些情況下形成β-片層結構的一部分。每條鏈中的超變區藉由FRM緊密靠近在一起，並與來自另一條鏈的超變區一起有助於抗原結合側的形成（參見Kabat等人，上述引文）。
術語“CDR”及其複數“CDR”係指其中三個構成輕鏈可變區（CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3）的結合特徵並且三個構成重鏈可變區（CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3）的結合特徵的互補決定區。CDR含有大部分負責抗體與抗原特異性相互作用的殘基，並且因此有助於抗體分子的功能活性：它們係抗原特異性的主要決定因素。
準確定義的CDR邊界和長度受制於不同的分類和編號系統。因此，CDR可以藉由Kabat、Chothia、contact或任何其他邊界定義（包括本文所述的編號系統）來引用。儘管有不同的邊界，但這些系統中的每一者在構成可變序列內所謂的“超變區”的方面具有一定程度的重疊。因此，根據這些系統的CDR定義可以在相對於相鄰框架區的長度和邊界區域中不同。參見，例如Kabat（一種基於跨物種序列變異性的方法）、Chothia（一種基於抗原-抗體複合物的晶體學研究的方法）和/或MacCallum（Kabat等人, 上述引文；Chothia等人, J. MoI. Biol [分子生物學雜誌], 1987, 196: 901-917；和MacCallum等人, J. MoI. Biol [分子生物學雜誌], 1996, 262: 732）。表徵抗原結合側的還另一標準係由牛津大學分子公司（Oxfbrd Molecular）的AbM抗體建模軟體使用的AbM定義。參見，例如Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains [抗體可變結構域的蛋白質序列和結構分析], 在Antibody Engineering Lab Manual [抗體工程實驗室手冊]中（編輯：Duebel, S.和Kontermann, R.，Springer-Verlag[施普林格出版社]，Heidelberg [海德爾堡]）。就兩種殘基鑒定技術定義重疊區而非相同區而言，可以將它們組合以定義雜合CDR。然而，根據所謂的Kabat系統進行編號係較佳的。
典型地，CDR形成可以分類為規範結構的環結構。術語“規範結構”係指由抗原結合（CDR）環所採用的主鏈構象。從比較結構研究中，已經發現六個抗原結合環中的五個僅具有有限的可用構象組庫。每個規範結構可以藉由多肽骨架的扭轉角來表徵。因此，抗體之間的對應環可能具有非常相似的三維結構，但環的大多數部分具有高的胺基酸序列可變性（Chothia和Lesk, J. MoI. Biol. [分子生物學雜誌], 1987, 196: 901；Chothia等人, Nature [自然], 1989, 342: 877；Martin和Thornton, J. MoI. Biol [分子生物學雜誌], 1996, 263: 800）。此外，所採用的環結構與其周圍的胺基酸序列之間存在關係。特定規範類別的構象由環的長度和位於環內關鍵位置以及保守框架內（即，環外）的胺基酸殘基決定。因此，可以基於這些關鍵胺基酸殘基的存在對特定的規範類別進行分配。
術語“規範（canonical）結構”還可以包括關於抗體的線性序列的考慮因素，例如，如藉由Kabat（Kabat等人, 上述引文）編目的。Kabat編號方案（系統）係以一致方式對抗體可變結構域的胺基酸殘基進行編號的廣泛採用的標準，並且是本發明應用的較佳的方案，也如本文其他地方所提及。另外的結構考慮因素也可以用於確定抗體的規範結構。例如，Kabat編號未完全反映的那些差異可以藉由Chothia等人的編號系統來描述，並且/或者藉由其他技術（例如結晶學和二維或三維計算建模）來揭示。因此，可以將給定的抗體序列置於規範的類別中，該類別尤其允許鑒定適當的基礎結構（chassis）序列（例如，基於在文庫中包括多種規範結構的期望）。文獻中描述了抗體胺基酸序列的Kabat編號和如由Chothia等人, 上述引文所述的結構考慮因素以及其參與解釋抗體結構的規範方面。不同類別免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型在本領域中是熟知的。關於抗體結構的綜述，參見Antibodies: A Laboratory Manual [抗體：實驗室手冊], Cold Spring Harbor Laboratory [冷泉港實驗室], Harlow等人編輯, 1988。
輕鏈的CDR3以及特別是重鏈的CDR3可以構成輕鏈可變區和重鏈可變區內抗原結合中最重要的決定簇。在一些抗體構建體中，重鏈CDR3似乎構成抗原與抗體之間主要的接觸區域。其中單獨改變CDR3的體外選擇方案可以用於改變抗體的結合特性或確定哪些殘基有助於抗原的結合。因此，CDR3典型地是抗體結合側內分子多樣性的最大來源。例如，H3可以短至兩個胺基酸殘基或多於26個胺基酸。
在經典的全長抗體或免疫球蛋白中，每條輕（L）鏈藉由一個共價二硫鍵與重（H）鏈連接，而兩條H鏈藉由一個或多個二硫鍵彼此連接，這取決於H鏈同種型。最靠近VH的CH結構域通常命名為CH1。恒定（“C”）結構域不直接參與抗原結合，但表現出各種效應子功能，諸如抗體依賴性、細胞介導的細胞毒性和補體激活。抗體的Fc區包括在重鏈恒定結構域內，並且例如能夠與位於細胞表面的Fc受體相互作用。
組裝和體細胞突變後的抗體基因的序列高度改變，並且估計這些改變的基因編碼1010 種不同抗體分子（Immunoglobulin Genes [免疫球蛋白基因], 第2版, Jonio 等人編輯, Academic Press [學術出版社], San Diego, CA [加利福尼亞州聖地牙哥], 1995）。因此，免疫系統提供了免疫球蛋白組庫。術語“組庫”係指完全或部分衍生自至少一種編碼至少一種免疫球蛋白的序列的至少一種核苷酸序列。一種或多種序列可以藉由重鏈的V、D和J區段以及輕鏈的V和J區段的體內重排來產生。可替代地，一種或多種序列可以回應於發生重排、例如體外刺激而從細胞產生。可替代地，一種或多種序列的一部分或全部可以藉由DNA剪接、核苷酸合成、誘變和其他方法獲得，參見例如美國專利5,565,332。組庫可以僅包括一種序列或可以包括多種序列，包括遺傳多樣性集合中的序列。
術語“Fc部分”或“Fc單體”關於本發明意指包含至少一個具有CH2結構域功能的結構域和至少一個具有免疫球蛋白分子的CH3結構域功能的結構域的多肽。如從術語“Fc單體”清楚的，包含那些CH結構域的多肽係“多肽單體”。Fc單體可以是至少包含排除重鏈的第一恒定區免疫球蛋白結構域（CH1）的免疫球蛋白恒定區的片段，但至少保持一個CH2結構域的功能部分和一個CH3結構域的功能部分的多肽，其中CH2結構域在CH3結構域的胺基末端。在這個定義的較佳的方面，Fc單體可以是包含Ig-Fc鉸鏈區、CH2區和CH3區的一部分的多肽恒定區，其中鉸鏈區在CH2結構域的胺基末端。設想本發明的鉸鏈區促進二聚化。例如但不限於，此類Fc多肽分子可以藉由木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白區（當然產生兩個Fc多肽的二聚體）獲得。在這個定義的另一方面，Fc單體可以是包含CH2區和CH3區的一部分的多肽區。例如但不限於，此類Fc多肽分子可以藉由胃蛋白酶消化免疫球蛋白分子獲得。在一個實施方式中，Fc單體的多肽序列實質上與下列Fc多肽序列相似：IgG1 Fc區、IgG2 Fc區、IgG3 Fc區、IgG4 Fc區、IgM Fc區、IgA Fc區、IgD Fc區和IgE Fc區。（參見，例如Padlan, Molecular Immunology [分子免疫學], 31(3), 169-217 (1993)）。因為免疫球蛋白之間存在一些變化，並且僅為了清楚起見，所以Fc單體係指IgA、IgD和IgG的最後兩個重鏈恒定區免疫球蛋白結構域，以及IgE和IgM的最後三個重鏈恒定區免疫球蛋白結構域。如上所提及，Fc單體還可以包括在這些結構域的N末端的柔性鉸鏈。對於IgA和IgM，Fc單體可以包括J鏈。對於IgG，Fc部分包含免疫球蛋白結構域CH2和CH3以及前兩個結構域與CH2之間的鉸鏈。儘管Fc部分的邊界可以改變，但包含功能鉸鏈、CH2和CH3結構域的人IgG重鏈Fc部分的實例可以定義為例如包含殘基D231（鉸鏈結構域的殘基-對應於下表1中的D234）至CH3結構域的羧基末端的P476，分別地L476（對於IgG4 ），其中編號係根據Kabat的。經由肽接頭彼此融合的兩個Fc部分或Fc單體定義本發明的抗體構建體的第三結構域，該第三結構域也可以被定義為scFc結構域。
在本發明的一個實施方式中，設想如本文揭露的scFc結構域、分別地彼此融合的Fc單體僅包括在抗體構建體的第三結構域中。
與本發明一致，IgG鉸鏈區可以藉由使用如表1中示出的Kabat編號的模擬來鑒定。與上述一致，設想對於本發明的鉸鏈結構域/區，最小要求包含對應於根據Kabat編號的D231 D234至P243的IgG1序列拉伸物的胺基酸殘基。同樣設想，本發明的鉸鏈結構域/區包含IgG1鉸鏈序列DKTHTCPPCP（SEQ ID NO: 477）（對應於如下表1所示的拉伸物D234至P243-也設想所述序列的變體，前提係鉸鏈區仍然促進二聚化）或由該IgG1鉸鏈序列組成。在本發明的較佳的實施方式中，藉由N314X取代去除抗體構建體的第三結構域中CH2結構域的Kabat位置314處的糖基化位點，其中X係除Q之外的任何胺基酸。所述取代較佳的是為N314G取代。在一個更較佳的實施方式中，所述CH2結構域另外包含以下取代（根據Kabat的位置）：V321C和R309C（這些取代在Kabat位置309和321處引入結構域內半胱胺酸二硫橋）。
還設想本發明的抗體構建體的第三結構域按胺基至羧基順序包含以下或由以下組成：DKTHTCPPCP（SEQ ID NO: 477）（即鉸鏈）-CH2-CH3-接頭-DKTHTCPPCP（SEQ ID NO: 477）（即鉸鏈）-CH2-CH3。在一個較佳的實施方式中，上述抗體構建體的肽接頭的特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly4Ser（SEQ ID NO: 1），或其聚合物，即(Gly4Ser)x，其中x為5或更大的整數（例如5、6、7、8等或更大），較佳的是為6（(Gly4Ser)6）。所述構建體可以進一步包含上述取代N314X、較佳的是N314G和/或另外的取代V321C和R309C。在如前文定義的本發明抗體構建體的較佳的實施方式中，設想第二結構域與人和/或獼猴CD3ε鏈的細胞外表位結合。
[表1]：鉸鏈區的胺基酸殘基的Kabat編號
在本發明的另外實施方式中，鉸鏈結構域/區包含以下或由以下組成：IgG2亞型鉸鏈序列ERKCCVECPPCP（SEQ ID NO: 478）、IgG3亞型鉸鏈序列ELKTPLDTTHTCPRCP（SEQ ID NO: 479）或ELKTPLGDTTHTCPRCP（SEQ ID NO: 486）和/或IgG4亞型鉸鏈序列ESKYGPPCPSCP（SEQ ID NO: 480）。IgG1亞型鉸鏈序列可以是以下的一種：EPKSCDKTHTCPPCP（如表1和SEQ ID NO: 487中所示）。這些核心鉸鏈區因此也在本發明的背景下設想。
IgG CH2和IgG CD3結構域的位置和序列可以藉由使用如表2中示出的Kabat編號進行模擬鑒定：
[表2]：IgG CH2和CH3區的胺基酸殘基的Kabat編號
在本發明的一個實施方式中，使第一或兩個Fc單體的CH3結構域中粗體強調的胺基酸殘基缺失。
第三結構域的多肽單體（“Fc部分”或“Fc單體”）彼此融合的肽接頭較佳的是包含至少25個胺基酸殘基（25、26、27、28、29、30等）。更較佳的是，這個肽接頭包含至少30個胺基酸殘基（30、31、32、33、34、35等）。還較佳的是，接頭包含至多40個胺基酸殘基、更較佳的是至多35個胺基酸殘基、最較佳的是恰好30個胺基酸殘基。該肽接頭的較佳的實施方式的特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly4 Ser（SEQ ID NO: 1），或其聚合物，即(Gly4 Ser)x，其中x為5或更大的整數（例如6、7或8）。較佳的是，整數為6或7，更較佳的是整數為6。
在使用接頭來將第一結構域融合至第二結構域或將第一結構域或第二結構域融合至第三結構域的情況下，該接頭較佳的是具有足以確保第一結構域和第二結構域中的每一者均可以彼此獨立地保留其差異結合特異性的長度和序列。對於連接本發明的抗體構建體中的至少兩個結合結構域（或兩個可變結構域）的肽接頭，僅包含少數量的胺基酸殘基（例如12個胺基酸殘基或更少）的那些肽接頭係較佳的。因此，12、11、10、9、8、7、6或5個胺基酸殘基的肽接頭係較佳的。設想的具有少於5個胺基酸的肽接頭包含4、3、2或1個胺基酸，其中富含Gly的接頭係較佳的。用於融合第一結構域和第二結構域的肽接頭的較佳的實施方式在SEQ ID NO:1中繪示。用於融合第二結構域和第三結構域的肽接頭的較佳的接頭實施方式係(Gly)4 -接頭，也稱為G4 -接頭。
在上述“肽接頭”之一的背景下特別較佳的“單一”胺基酸係Gly。因此，所述肽接頭可以由單一胺基酸Gly組成。在本發明的較佳的實施方式中，肽接頭的特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly4 Ser（SEQ ID NO: 1），或其聚合物，即(Gly4 Ser)x，其中x為1或更大的整數（例如2或3）。較佳的接頭在SEQ ID NOs: 1至12中繪示。所述肽接頭的特徵包括不存在二級結構的促進、係本領域中已知的並且描述於例如Dall’Acqua等人（Biochem. [生物化學] (1998) 37, 9266-9273）、Cheadle等人（Mol Immunol [分子免疫學] (1992) 29, 21-30）和Raag和Whitlow（FASEB [美國實驗生物學聯合會會誌] (1995) 9(1), 73-80）中。此外不促進任何二級結構的肽接頭係較佳的。所述結構域彼此的連接可以例如藉由基因工程提供，如實例中所述。用於製備融合的且可操作地連接的雙特異性單鏈構建體並在哺乳動物細胞或細菌中表現它們的方法係本領域中熟知的（例如WO 99/54440或Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊], Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], Cold Spring Harbor [冷泉港], 紐約, 2001）。
在本發明的抗體構建體的較佳的實施方式中，第一結構域和第二結構域以選自以下群組的形式形成抗體構建體，該群組由以下項組成：(scFv)2 、scFv-單結構域mAb、雙抗體和這些形式中的任一種的寡聚物。
根據特別較佳的實施方式，並如所附實例所記載，本發明抗體構建體的第一結構域和第二結構域係“雙特異性單鏈抗體構建體”、更較佳的是雙特異性“單鏈Fv”（scFv）。儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由獨立的基因編碼，但使用重組方法可以將這兩個結構域藉由合成接頭接合，如上文所述，該合成接頭使它們能夠製得為單條蛋白質鏈，其中VL和VH區配對以形成單價分子；參見，例如Huston等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA [美國國家科學院院刊] 85:5879-5883。使用熟悉該項技術者已知的常規技術獲得這些抗體片段，並且按照與完整或全長抗體相同的方式評價片段的功能。因此，單鏈可變片段（scFv）係免疫球蛋白的重鏈（VH）和輕鏈（VL）可變區的融合蛋白，通常利用約10至約25個胺基酸、較佳的是約15至20個胺基酸的短接頭肽酸連接。為了靈活性，接頭通常富含甘胺酸，以及為了溶解性通常富含絲胺酸或蘇胺酸，並且可以連接VH的N末端和VL的C末端，或反之亦然。儘管去除了恒定區並引入了接頭，但該蛋白質保留了原始免疫球蛋白的特異性。
雙特異性單鏈抗體構建體在本領域中是已知的並描述於以下中：WO 99/54440；Mack, J. Immunol. [免疫學雜誌] (1997), 158, 3965-3970；Mack, PNAS [美國國家科學院院刊], (1995), 92, 7021-7025；Kufer, Cancer Immunol. Immunother. [癌症免疫學免疫治療], (1997), 45, 193-197；Löffler, Blood [血液], (2000), 95, 6, 2098-2103；Brühl, Immunol. [免疫學], (2001), 166, 2420-2426；Kipriyanov, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], (1999), 293, 41-56。描述的用於產生單鏈抗體的技術（尤其參見美國專利4,946,778；Kontermann和Dübel (2010), 上述引文和Little (2009), 上述引文）可以適用於產生特異性識別一種或多種所選擇的靶標的單鏈抗體構建體。
二價（bivalent）（也稱為雙價（divalent））或雙特異性單鏈可變片段（具有形式(scFv)2 的聯-scFv或二-scFv）可以藉由連接兩個scFv分子（例如利用如上文所述的接頭）來工程化。如果這兩個scFv分子具有相同的結合特異性，則所得(scFv)2 分子將較佳的是稱為二價的（即，對於相同的靶表位具有兩個價）。如果兩個scFv分子具有不同的結合特異性，則所得(scFv)2 分子將較佳的是稱為雙特異性。連接可以藉由產生具有兩個VH區和兩個VL區的單一肽鏈從而產生串聯scFv來進行（參見，例如Kufer P.等人, (2004) Trends in Biotechnology [生物技術趨勢] 22(5):238-244）。另一種可能性係產生具有接頭肽的scFv分子，這些接頭肽對於兩個可變區來說太短以致於不能折疊在一起（例如約五個胺基酸），從而迫使scFv二聚化。這種類型被稱為雙抗體（參見，例如Hollinger, Philipp等人, (1993年7月) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [美國國家科學院院刊] 90 (14): 6444-8）。
與本發明一致，第一結構域、第二結構域或第一結構域和第二結構域可以包含單結構域抗體、分別地單結構域抗體的可變結構域或至少CDR。單結構域抗體僅包含一個（單體）抗體可變結構域，該抗體可變結構域能夠獨立於其他V區或結構域而選擇性結合特定抗原。第一單結構域抗體係從駱駝中發現的重鏈抗體工程化而來，並且這些被稱為VH H片段。軟骨魚類也具有重鏈抗體（IgNAR），可以從這些重鏈抗體中獲得稱為VNAR 片段的單結構域抗體。替代方法係將來自常見免疫球蛋白，例如來自人或齧齒動物的二聚體可變結構域分裂成單體，因此獲得作為單結構域Ab的VH或VL。儘管對單結構域抗體的大多數研究目前都是基於重鏈可變結構域，但衍生自輕鏈的奈米抗體也顯示出與靶表位特異性結合。單結構域抗體的實例係所謂的sdAb、奈米抗體或單一可變結構域抗體。
因此，(單結構域mAb)2 係由（至少）兩個單結構域單株抗體構成的單株抗體構建體，該兩個單結構域單株抗體單獨地選自由VH 、VL 、VH H和VNAR 組成之群組。接頭較佳的是呈肽接頭的形式。類似地，“scFv-單結構域mAb”係由至少一個如上所述的單結構域抗體和一個如上所述的scFv分子構成的單株抗體構建體。同樣，接頭較佳的是呈肽接頭的形式。
抗體構建體是否與另一給定抗體構建體競爭結合可以在競爭測定（諸如競爭性ELISA或基於細胞的競爭測定）中測量。也可以使用抗生物素蛋白偶聯的微粒（珠粒）。與抗生物素蛋白塗覆的ELISA板類似，當與生物素化蛋白質反應時，這些珠粒中的每一個都可用作可在其上進行測定的底物。將抗原塗覆在珠粒上，並且然後用第一抗體預塗覆。添加第二抗體並且確定任何額外的結合。讀出的可能手段包括流式細胞術。
T細胞或T淋巴細胞係在細胞介導的免疫中發揮核心作用的一類淋巴細胞（其本身係一類白細胞）。有若干個T細胞亞組，每個亞組具有不同的功能。T細胞可以藉由細胞表面上存在T細胞受體（TCR）而與其他淋巴細胞（諸如B細胞和NK細胞）區分開。TCR負責識別與主要組織相容性複合體（MHC）分子結合的抗原，並且由兩種不同的蛋白質鏈構成。在95%的T細胞中，TCR由阿爾法（α）和貝塔（β）鏈組成。當TCR與抗原肽和MHC（肽/MHC複合物）接合時，T淋巴細胞藉由一系列由相關酶、共受體、專門化銜接子分子和激活或釋放的轉錄因子介導的生物化學事件而被激活。
CD3受體複合物係一種蛋白質複合物，並且由四條鏈構成。在哺乳動物中，複合物含有CD3γ（伽馬）鏈、CD3δ（德爾塔）鏈和兩條CD3ε（伊蒲賽龍）鏈。這些鏈與T細胞受體（TCR）和所謂的ζ（截塔）鏈締合以形成T細胞受體CD3複合物並在T淋巴細胞中生成激活訊號。CD3γ（伽馬）、CD3δ（德爾塔）和CD3ε（伊蒲賽龍）鏈係含有單一細胞外免疫球蛋白結構域的免疫球蛋白超家族的高度相關的細胞表面蛋白。CD3分子的細胞內尾含有對於TCR的傳訊能力所必需的單一保守基序，稱為基於免疫受體酪胺酸的激活基序或簡稱ITAM。CD3ε分子係一種多肽，該多肽在人中由位於染色體11上的CD3E 基因編碼。CD3ε的最較佳的表位包括在人CD3ε細胞外結構域的胺基酸殘基1-27內。設想根據本發明的抗體構建體典型地並且有利地顯示出更少的非特異性T細胞激活，該非特異性T細胞激活在特異性免疫療法中是不需要的。這意味著副作用的風險降低。
經由多特異性、至少雙特異性抗體構建體募集T細胞對靶細胞的重定向溶解涉及溶細胞突觸形成以及穿孔素和顆粒酶的遞送。接合的T細胞能夠連續靶細胞溶解，並且不受干擾肽抗原加工和呈遞或選殖T細胞分化的免疫逃逸機制的影響；參見，例如WO 2007/042261。
可以以各種方式測量由本發明的抗體構建體介導的細胞毒性。效應細胞可以是例如刺激的富集的（人）CD8陽性T細胞或未刺激的（人）外周血單核細胞（PBMC）。如果靶細胞係獼猴起源的或表現的或用由第一結構域結合的獼猴MUC17轉染，則效應細胞也應係獼猴起源的，諸如獼猴T細胞系，例如4119LnPx。靶細胞應表現MUC17（例如人或獼猴MUC17）（至少其細胞外結構域）。靶細胞可以是用MUC17（例如人或獼猴MUC17）穩定或暫態轉染的細胞系（諸如CHO）。對於在細胞表面表現更高水平的MUC17的靶細胞系，預期EC50 值通常更低。效應細胞與靶細胞（E:T）比率通常為約10 : 1，但也可改變。MUC17雙特異性抗體構建體的細胞毒活性可以在51 Cr-釋放測定（約18小時的孵育時間）或在基於FACS的細胞毒性測定（約48小時的孵育時間）中測量。也可以對測定孵育時間（細胞毒性反應）進行修改。其他測量細胞毒性的方法對熟悉該項技術者來說係熟知的，並且包括MTT或MTS測定、基於ATP的測定（包括生物發光測定）、磺基玫瑰紅B（SRB）測定、WST測定、選殖生成測定和ECIS技術。
較佳的是在基於細胞的細胞毒性測定中測量由本發明的MUC17xCD3雙特異性抗體構建體介導的細胞毒活性。它也可以在51 Cr-釋放測定中測量。它由EC50 值表示，該值對應於半數最大有效濃度（誘導在基線與最大值之間的中途的細胞毒性應答的抗體構建體的濃度）。較佳的是，MUC17xCD3雙特異性抗體構建體的EC50 值≤ 5000 pM或≤ 4000 pM、更較佳的是≤ 3000 pM或≤ 2000 pM、甚至更較佳的是≤ 1000 pM或≤ 500 pM、甚至更較佳的是≤ 400 pM或≤ 300 pM、甚至更較佳的是≤ 200 pM、甚至更較佳的是≤ 100 pM、甚至更較佳的是≤ 50 pM、甚至更較佳的是≤ 20 pM或≤ 10 pM，並且最較佳的是≤ 5 pM。
上述給定的EC50 值可以在不同的測定中測量。熟悉該項技術者知道，當使用刺激/富集的CD8+ T細胞作為效應細胞時，與未刺激的PBMC相比，可以預期EC50 值較低。此外可以預期，與低靶標表現大鼠相比，當靶細胞表現高數量的MUC17時，EC50 值較低。例如，當使用刺激/富集的人CD8+ T細胞作為效應細胞（並且使用MUC17轉染的細胞諸如CHO細胞或MUC17陽性人細胞系作為靶細胞）時，MUC17xCD3雙特異性抗體構建體的EC50 值較佳的是≤ 1000 pM、更較佳的是≤ 500 pM、甚至更較佳的是≤ 250 pM、甚至更較佳的是≤ 100 pM、甚至更較佳的是≤ 50 pM、甚至更較佳的是≤ 10 pM，並且最較佳的是≤ 5 pM。當使用人PBMC作為效應細胞時，MUC17xCD3雙特異性抗體構建體的EC50 值較佳的是≤ 5000 pM或≤ 4000 pM（特別是當靶細胞係MUC17陽性人細胞系時）、更較佳的是≤ 2000 pM（特別是當靶細胞係MUC17轉染的細胞諸如CHO細胞時）、更較佳的是≤ 1000 pM或≤ 500 pM、甚至更較佳的是≤ 200 pM、甚至更較佳的是≤ 150 pM，甚至更較佳的是≤ 100 pM，並且最較佳的是≤ 50 pM或更低。當使用獼猴T細胞系諸如LnPx4119作為效應細胞並且使用獼猴MUC17轉染的細胞系諸如CHO細胞作為靶細胞系時，MUC17xCD3雙特異性抗體構建體的EC50 值較佳的是≤ 2000 pM或≤ 1500 pM、更較佳的是≤ 1000 pM或≤ 500 pM、甚至更較佳的是≤ 300 pM或≤ 250 pM、甚至更較佳的是≤ 100 pM，並且最較佳的是≤ 50 pM。
較佳的是，本發明的MUC17xCD3雙特異性抗體構建體不誘導/介導溶解或基本上不誘導/介導MUC17陰性細胞諸如CHO細胞的溶解。術語“不誘導溶解”、“基本上不誘導溶解”、“不介導溶解”或“基本不介導溶解”意指本發明的抗體構建體不誘導或介導超過30%、較佳的是不超過20%、更較佳的是不超過10%、特別較佳的是不超過9%、8%、7%、6%或5%的MUC17陰性細胞的溶解，由此將MUC17陽性人細胞系的溶解設定為100%。這通常適用於濃度高達500 nM的抗體構建體。熟悉該項技術者知道如何毫不費力地測量細胞溶解。此外，本說明書教導了如何測量細胞溶解的具體說明。
單個的MUC17xCD3雙特異性抗體構建體的單體與二聚體同種型之間細胞毒性活性的差異稱為“效能間隙”。該效能間隙可以例如計算為分子的單體與二聚體形式的EC50 值之間的比率。本發明的MUC17xCD3雙特異性抗體構建體的效能間隙較佳的是≤ 5、更較佳的是≤ 4、甚至更較佳的是≤ 3、甚至更較佳的是≤ 2，並且最較佳的是≤ 1。
本發明的抗體構建體的第一結合結構域和/或第二結合結構域（或任何其他）結合結構域較佳的是對於靈長類哺乳動物目的成員具有跨物種特異性。跨物種特異性CD3結合結構域例如描述於WO 2008/119567中。根據一個實施方式，除了分別與人MUC17和人CD3結合之外，第一結合結構域和/或第二結合結構域還將與靈長類動物的MUC17/CD3結合，靈長類動物包括（但不限於）新大陸靈長類動物（諸如狨毛猴、棉冠獠狨或松鼠猴）、舊大陸靈長類動物（諸如狒狒和獼猴）、長臂猿和非人類人亞科。
在本發明的抗體構建體的一個實施方式中，第一結構域與人MUC17結合並且進一步與獼猴MUC17（諸如食蟹猴的MUC17）結合，並且更較佳的是與細胞，例如諸如CHO或293細胞表面上表現的獼猴MUC17結合。第一結構域對MUC17、較佳的是對人MUC17的親和力較佳的是≤ 100 nM或≤ 50 nM、更較佳的是≤ 25 nM或≤ 20 nM、更較佳的是≤ 15 nM或≤ 10 nM、甚至更較佳的是≤ 5 nM、甚至更較佳的是≤ 2.5 nM或≤ 2 nM、甚至更較佳的是≤ 1 nM，甚至更較佳的是≤ 0.6 nM、甚至更較佳的是≤ 0.5 nM，並且最較佳的是≤ 0.4 nM。親和力可以例如在BIAcore測定或Scatchard測定中測量。測定親和力的其他方法也是熟悉該項技術者熟知的。第一結構域對獼猴MUC17的親和力較佳的是≤ 15 nM、更較佳的是≤ 10 nM、甚至更較佳的是≤ 5 nM、甚至更較佳的是≤ 1 nM、甚至更較佳的是≤ 0.5 nM、甚至更較佳的是≤ 0.1 nM，並且最較佳的是≤ 0.05 nM或甚至≤ 0.01 nM。
較佳的是，根據本發明的抗體構建體對結合獼猴MUC17對人MUC17 [ma MUC17: hu MUC17]的親和力間隙（如例如藉由BiaCore或藉由Scatchard分析測定）＜ 100、較佳的是＜ 20、更較佳的是＜ 15、進一步較佳的是＜ 10、甚至更較佳的是＜ 8、更較佳的是＜ 6，並且最較佳的是＜ 2。根據本發明的抗體構建體對結合獼猴MUC17對人MUC17的親和性間隙的較佳的範圍在0.1與20之間、更較佳的是在0.2與10之間、甚至更較佳的是在0.3與6之間、甚至更較佳的是在0.5與3之間或在0.5與2.5之間，並且最較佳的是在0.5與2之間或在0.6與2之間。
本發明的抗體構建體的第二結構域與人CD3ε和/或獼猴CD3ε結合。在一個較佳的實施方式中，第二結構域進一步與狨毛猴、棉冠獠狨或松鼠猴CD3ε結合。狨毛猴和棉冠獠狨兩者均係屬於狨亞科（Callitrichidae ）的新大陸靈長類動物，而松鼠猴係屬於懸猴科（Cebidae ）的新大陸靈長類動物。
對於本發明的抗體構建體較佳的是，與人和/或獼猴CD3ε鏈的細胞外表位結合的第二結構域包含含有選自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL區：
(a) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 27中繪示的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 28中繪示的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 29中繪示的CDR-L3；
(b) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 117中繪示的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 118中繪示的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 119中繪示的CDR-L3；以及
(c) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 153中繪示的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 154中繪示的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 155中繪示的CDR-L3。
在本發明的抗體構建體的進一步較佳的實施方式中，與人和/或獼猴CD3ε鏈的細胞外表位結合的第二結構域包含含有選自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH區：
(a) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 12中繪示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 13中繪示的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 14中繪示的CDR-H3；
(b) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 30中繪示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 31中繪示的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 32中繪示的CDR-H3；
(c) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 48中繪示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 49中繪示的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 50中繪示的CDR-H3；
(d) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 66中繪示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 67中繪示的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 68中繪示的CDR-H3；
(e) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 84中繪示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 85中繪示的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 86中繪示的CDR-H3；
(f) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 102中繪示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 103中繪示的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 104中繪示的CDR-H3；
(g) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 120中繪示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 121中繪示的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 122中繪示的CDR-H3；
(h) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 138中繪示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 139中繪示的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 140中繪示的CDR-H3；
(i) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 156中繪示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 157中繪示的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 158中繪示的CDR-H3；以及
(j) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 174中繪示的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 175中繪示的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 176中繪示的CDR-H3。
在本發明的抗體構建體的較佳的實施方式中，將上述三組VL CDR與第二結合結構域內的上述十組VH CDR組合形成（30）組，每組包含1-3個CDR-L和1-3個CDR-H。
較佳的是，對於本發明的抗體構建體，與CD3結合的第二結構域包含選自以下群組的VL區，該群組由以下項組成：WO 2008/119567的SEQ ID NO: 17、21、35、39、53、57、71、75、89、93、107、111、125、129、143、147、161、165、179或183中繪示的或如根據本發明的SEQ ID NO: 13中繪示的那些。
還較佳的是，與CD3結合的第二結構域包含選自以下群組的VH區，該群組由以下項組成：WO 2008/119567的SEQ ID NO: 15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181中繪示的或如SEQ ID NO: 14中繪示的那些。
最較佳的是，本發明的抗體構建體的特徵在於與CD3結合的第二結構域包含選自以下群組的VL區和VH區，該群組由以下項組成：
(a) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO. 17或21中繪示的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 15或19中繪示的VH區；
(b) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO. 35或39中繪示的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 33或37中繪示的VH區；
(c) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO. 53或57中繪示的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 51或55中繪示的VH區；
(d) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO. 71或75中繪示的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 69或73中繪示的VH區；
(e) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO. 89或93中繪示的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 87或91中繪示的VH區；
(f) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO. 107或111中繪示的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 105或109中繪示的VH區；
(g) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO. 125或129中繪示的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 123或127中繪示的VH區；
(h) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO. 143或147中繪示的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 141或145中繪示的VH區；
(i) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO. 161或165中繪示的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 159或163中繪示的VH區；以及
(j) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO. 179或183中繪示的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 177或181中繪示的VH區。
關於本發明的抗體構建體還較佳的是，與CD3結合的第二結構域包含如SEQ ID NO: 13中繪示的VL區和如SEQ ID NO: 14中繪示的VH區。
根據本發明的抗體構建體的較佳的實施方式，第一結構域和/或第二結構域具有以下形式：VH區和VL區的對係呈單鏈抗體（scFv）的形式。VH和VL區以VH-VL或VL-VH的順序安排。較佳的是，VH區位於接頭序列的N末端，並且VL區位於接頭序列的C末端。
上述的本發明的抗體構建體的較佳的實施方式的特徵在於，與CD3結合的第二結構域包含選自以下群組或如SEQ ID NO: 15中繪示的胺基酸序列，該群組由以下項組成：WO 2008/119567的SEQ ID NO: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187。
還設想，本發明的抗體構建體的第一結合結構域包含含有選自以下群組的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL區和含有選自以下群組的CDR-H1、CDR-H2和CDR-3的VH區，該群組由以下項組成：
(a) 如SEQ ID NO. 36中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 37中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 38中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 33中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 34中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 35中繪示的CDR-H3；
(b) 如SEQ ID NO. 47中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 48中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 49中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 44中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 45中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 46中繪示的CDR-H3；
(c) 如SEQ ID NO. 58中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 59中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 60中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 55中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 56中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 57中繪示的CDR-H3；
(d) 如SEQ ID NO. 69中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 70中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 71中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 66中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 67中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 68中繪示的CDR-H3；
(e) 如SEQ ID NO. 80中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 81中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 82中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 77中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 78中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 79中繪示的CDR-H3；
(f) 如SEQ ID NO. 91中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 92中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 93中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 88中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 89中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 90中繪示的CDR-H3；
(g) 如SEQ ID NO. 102中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 103中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 104中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 99中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 100中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 101中繪示的CDR-H3；
(h) 如SEQ ID NO. 113中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 114中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 115中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 110中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 111中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 112中繪示的CDR-H3；
(i) 如SEQ ID NO. 124中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 125中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 126中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 121中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 122中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 123中繪示的CDR-H3；
(j) 如SEQ ID NO. 135中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 136中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 137中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 132中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 133中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 134中繪示的CDR-H3；
(k) 如SEQ ID NO. 146中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 147中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 148中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 143中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 144中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 145中繪示的CDR-H3；
(l) 如SEQ ID NO. 157中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 158中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 159中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 154中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 155中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 156中繪示的CDR-H3；
(m) 如SEQ ID NO. 168中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 169中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 170中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 165中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 166中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 167中繪示的CDR-H3；
(n) 如SEQ ID NO. 179中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 180中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 181中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 176中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 177中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 178中繪示的CDR-H3；
(o) 如SEQ ID NO. 190中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 191中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 192中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 187中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 188中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 189中繪示的CDR-H3；
(p) 如SEQ ID NO. 201中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 202中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 203中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 198中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 199中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 200中繪示的CDR-H3；
(q) 如SEQ ID NO. 212中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 213中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 214中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 209中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 210中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 211中繪示的CDR-H3；
(r) 如SEQ ID NO. 223中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 224中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 225中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 220中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 221中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 222中繪示的CDR-H3；
(s) 如SEQ ID NO. 234中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 235中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 236中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 231中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 232中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 233中繪示的CDR-H3；
(t) 如SEQ ID NO. 245中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 246中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 247中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 242中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 243中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 244中繪示的CDR-H3；
(u) 如SEQ ID NO. 256中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 257中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 258中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 253中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 254中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 255中繪示的CDR-H3；
(v) 如SEQ ID NO. 267中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 268中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 269中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 264中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 265中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 266中繪示的CDR-H3；
(w) 如SEQ ID NO. 278中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 279中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 280中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 275中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 276中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 276中繪示的CDR-H3；
(x) 如SEQ ID NO. 289中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 290中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 291中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 286中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 287中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 288中繪示的CDR-H3；
(y) 如SEQ ID NO. 300中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 301中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 302中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 297中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 298中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 299中繪示的CDR-H3；
(z) 如SEQ ID NO. 311中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 312中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 313中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 308中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 309中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 310中繪示的CDR-H3；
(aa) 如SEQ ID NO. 322中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 323中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 324中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 319中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 320中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 321中繪示的CDR-H3；
(ab) 如SEQ ID NO. 333中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 334中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 335中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 330中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 331中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 332中繪示的CDR-H3；
(ac) 如SEQ ID NO. 344中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 345中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 346中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 341中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 342中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 343中繪示的CDR-H3；
(ad) 如SEQ ID NO. 355中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 356中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 357中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 352中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 353中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 354中繪示的CDR-H3；
(ae) 如SEQ ID NO. 366中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 367中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 368中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 363中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 364中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 365中繪示的CDR-H3；
(af) 如SEQ ID NO. 377中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 378中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 379中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 374中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 375中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 376中繪示的CDR-H3；
(ag) 如SEQ ID NO. 388中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 389中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 390中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 385中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 386中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 386中繪示的CDR-H3；
(ah) 如SEQ ID NO. 399中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 400中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 401中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 396中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 397中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 398中繪示的CDR-H3；
(ai) 如SEQ ID NO. 410中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 411中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 412中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 407中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 408中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 409中繪示的CDR-H3；
(aj) 如SEQ ID NO. 421中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 422中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 423中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 418中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 419中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 420中繪示的CDR-H3；
(ak) 如SEQ ID NO. 432中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 433中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 434中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 429中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 430中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 431中繪示的CDR-H3；
(al) 如SEQ ID NO. 443中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 444中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 445中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 440中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 441中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 442中繪示的CDR-H3；
(am) 如SEQ ID NO. 454中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 455中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 456中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 451中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 452中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 453中繪示的CDR-H3；
(an) 如SEQ ID NO. 465中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 466中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 467中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 462中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 463中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 464中繪示的CDR-H3；
(ao) 如SEQ ID NO. 476中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 477中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 478中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 473中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 474中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 475中繪示的CDR-H3；
(ap) 如SEQ ID NO. 487中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 488中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 489中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 484中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 485中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 486中繪示的CDR-H3；
(aq) 如SEQ ID NO. 498中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 499中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 500中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 495中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 496中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 497中繪示的CDR-H3；
(ar) 如SEQ ID NO. 509中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 510中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 511中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 506中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 507中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 508中繪示的CDR-H3；以及
(as) 如SEQ ID NO. 520中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 521中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 522中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 517中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 518中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 519中繪示的CDR-H3；其中較佳的是，例如，
(c) 如SEQ ID NO. 58中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 59中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 60中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 55中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 56中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 57中繪示的CDR-H3；
(n) 如SEQ ID NO. 179中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 180中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 181中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 176中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 177中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 178中繪示的CDR-H3；
(ac) 如SEQ ID NO. 344中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 345中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 346中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 341中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 342中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 343中繪示的CDR-H3；以及
(aj) 如SEQ ID NO. 421中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 422中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 423中繪示的CDR-L3以及如SEQ ID NO. 418中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 419中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 420中繪示的CDR-H3。
進一步設想，本發明的抗體構建體的第一結合結構域包含選自以下群組的VL區和VH區，該群組由以下項組成：
(a) 如SEQ ID NO. 40中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 39中繪示的VH區；
(b) 如SEQ ID NO. 51中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 50中繪示的VH區；
(c) 如SEQ ID NO. 62中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 61中繪示的VH區；
(d) 如SEQ ID NO. 73中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 72中繪示的VH區；
(e) 如SEQ ID NO. 84中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 83中繪示的VH區；
(f) 如SEQ ID NO. 95中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 94中繪示的VH區；
(g) 如SEQ ID NO. 106中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 105中繪示的VH區；
(h) 如SEQ ID NO. 117中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 116中繪示的VH區；
(i) 如SEQ ID NO. 128中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 127中繪示的VH區；
(j) 如SEQ ID NO. 139中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 138中繪示的VH區；
(k) 如SEQ ID NO. 150中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 149中繪示的VH區；
(l) 如SEQ ID NO. 161中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 160中繪示的VH區；
(m) 如SEQ ID NO. 172中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 171中繪示的VH區；
(n) 如SEQ ID NO. 183中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 182中繪示的VH區；
(o) 如SEQ ID NO. 194中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 193中繪示的VH區；
(p) 如SEQ ID NO. 205中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 204中繪示的VH區；
(q) 如SEQ ID NO. 216中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 215中繪示的VH區；
(r) 如SEQ ID NO. 227中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 226中繪示的VH區；
(s) 如SEQ ID NO. 238中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 237中繪示的VH區；
(t) 如SEQ ID NO. 249中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 248中繪示的VH區；
(u) 如SEQ ID NO. 260中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 259中繪示的VH區；
(v) 如SEQ ID NO. 271中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 270中繪示的VH區；
(w) 如SEQ ID NO. 282中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 281中繪示的VH區；
(x) 如SEQ ID NO. 293中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 292中繪示的VH區；
(y) 如SEQ ID NO. 304中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 303中繪示的VH區；
(z) 如SEQ ID NO. 315中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 314中繪示的VH區；
(aa) 如SEQ ID NO. 326中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 325中繪示的VH區；
(ab) 如SEQ ID NO. 337中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 336中繪示的VH區；
(ac) 如SEQ ID NO. 348中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 347中繪示的VH區；
(ad) 如SEQ ID NO. 359中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 358中繪示的VH區；
(ae) 如SEQ ID NO. 370中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 369中繪示的VH區；
(af) 如SEQ ID NO. 381中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 380中繪示的VH區；
(ag) 如SEQ ID NO. 392中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 391中繪示的VH區；
(ah) 如SEQ ID NO. 403中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 402中繪示的VH區；
(ai) 如SEQ ID NO. 414中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 413中繪示的VH區；
(aj) 如SEQ ID NO. 425中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 424中繪示的VH區；
(ak) 如SEQ ID NO. 436中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 435中繪示的VH區；
(al) 如SEQ ID NO. 447中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 446中繪示的VH區；
(am) 如SEQ ID NO. 458中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 457中繪示的VH區；
(an) 如SEQ ID NO. 469中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 468中繪示的VH區；
(ao) 如SEQ ID NO. 480中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 479中繪示的VH區；
(ap) 如SEQ ID NO. 491中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 490中繪示的VH區；
(aq) 如SEQ ID NO. 502中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 501中繪示的VH區；
(ar) 如SEQ ID NO. 513中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 512中繪示的VH區；以及
(as) 如SEQ ID NO. 524中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 523中繪示的VH區。
進一步設想，本發明的抗體構建體的第一結合結構域包含選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下項組成：SEQ ID NO: 41、52、63、74、85、96、107、118、129、140、151、162、173、184、195、206、217、228、239、250、261、272、283、294、305、316、327、338、349、360、371、382、393、404、415、426、437、448、459、470、481、492、503、514和525中繪示的那些，或者具有與所述序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
本發明進一步提供了一種抗體構建體，該抗體構建體包含或具有選自以下群組的胺基酸序列（完全雙特異性抗體構建體），該群組由以下項組成：SEQ ID NO: 42、43、53、54、64、65、75、76、86、87、97、98、108、109、119、120、130、131、141、142、152、153、163、164、174、175、185、186、196、197、207、208、218、219、229、230、240、241、251、252、262、263、273、274、284、285、295、296、306、307、317、318、328、329、339、340、350、351、361、362、372、373、383、384、394、395、405、406、416、417、427、428、438、439、449、450、460、461、471、472、482、483、493、494、504、505、515、516、526和527，或者具有與所述序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
抗體構建體的共價修飾也包括在本發明的範圍內，並且通常但不總是在翻譯後進行。例如，藉由使抗體構建體的特定胺基酸殘基與能夠與選擇的側鏈或N或C末端殘基反應的有機衍生劑反應，將抗體構建體的若干種類型的共價修飾引入到分子中。
半胱胺醯殘基最常見地與α-鹵代乙酸酯（和相應的胺），諸如氯乙酸或氯乙醯胺反應，以得到羧甲基或羧醯胺甲基衍生物。半胱胺醯殘基還可以藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙醯酯、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應來衍生出。
組胺醯殘基係藉由在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應衍生出，因為這種劑對組胺醯側鏈相對具有特異性。對溴苯甲醯甲基溴也是有用的；該反應較佳的是在pH 6.0的0.1 M二甲胂酸鈉中進行。賴胺醯殘基和胺基末端殘基與琥珀酸酐或其他羧酸酐反應。用這些劑衍生化具有逆轉賴胺醯殘基的電荷的效應。用於衍生含α-胺基的殘基的其他合適試劑包括亞胺酸酯，諸如甲基吡啶亞胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；硼氫化氯；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2,4-戊二酮；以及轉胺酶催化的與乙醛酸鹽的反應。
精胺醯殘基藉由與一種或多種常規試劑（其中苯甲醯甲醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮和茚三酮）反應而被修飾。由於胍官能基的高pKa，精胺酸殘基的衍生化要求反應在鹼性條件下進行。此外，這些試劑可以與賴胺酸基團以及精胺酸ε-胺基基團反應。
可以對酪胺醯殘基進行特定修飾，特別感興趣的是藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入到酪胺醯殘基中。最常見地，將N-乙醯基咪唑和四硝基甲烷分別用於形成O-乙醯基酪胺醯物質和3-硝基衍生物。使用125 I或131 I碘化酪胺醯殘基以製備用於放射免疫測定的標記蛋白質，上述氯胺T法係合適的。
羧基側基團（天冬胺醯基或穀胺醯基）藉由與碳二亞胺（R'—N=C=N--R'）反應而選擇性地修飾，其中R和R'視需要為不同的烷基基團，諸如1-環己基-3-(2-啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外，天冬胺醯殘基和穀胺醯殘基藉由與銨離子反應轉化為天冬醯胺醯殘基和穀胺醯胺醯殘基。
用雙功能劑衍生化可用於將本發明的抗體構建體交聯到水不溶性載體基質或表面以用於多種方法中。常用的交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯（例如與4-疊氮基水楊酸的酯）、同雙官能亞胺酸酯（包括二琥珀醯亞胺酯，諸如3,3'-二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)，和雙官能馬來醯亞胺，諸如雙-N-馬來醯亞胺-1,8-辛烷）。衍生劑諸如3-[(對疊氮基苯基)二硫代]丙醯亞胺酸甲基酯產生能夠在光存在下形成交聯的可光活化中間體。可替代地，將如美國專利案號3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440中所述的反應性水不溶性基質諸如溴化氰活化的碳水化合物和反應性底物用於蛋白質固定化。
穀胺醯胺醯殘基和天冬醯胺醯殘基通常分別脫醯胺成相應的穀胺醯殘基和天冬胺醯殘基。可替代地，這些殘基在弱酸性條件下脫醯胺。這些殘基的任一形式都屬於本發明的範圍。
其他修飾包括對脯胺酸和賴胺酸的羥基化、對絲胺醯或蘇胺醯殘基的羥基基團的磷酸化、對賴胺酸、精胺酸和組胺酸側鏈的α-胺基基團的甲基化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties [蛋白質：結構和分子特性], W. H. Freeman & Co. [W.H.弗裡曼公司], San Francisco [三藩市], 1983, 第79-86頁）、對N末端胺的乙醯化和對任何C末端羧基基團的醯胺化。
包括在本發明範圍內的抗體構建體的另一種類型的共價修飾包括改變蛋白質的糖基化模式。如本領域中已知的，糖基化模式可以取決於蛋白質的序列（例如，下文論述的特定糖基化胺基酸殘基的存在或不存在）或其中產生蛋白質的宿主細胞或生物體。下面論述特定的表現系統。
多肽的糖基化典型地是N-連接或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基的側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸和天冬醯胺-X-蘇胺酸（其中X為除脯胺酸以外的任何胺基酸）係將碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺側鏈的識別序列。因此，在多肽中這些三肽序列中的任一者的存在產生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化係指將糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種連接至羥基胺基酸，最常見的是絲胺酸或蘇胺酸，但是也可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基賴胺酸。
藉由改變胺基酸序列以使得它含有上述三肽序列中的一者或多者而方便地完成向抗體構建體添加糖基化位點（用於N-連接的糖基化位點）。還可以藉由向起始序列添加一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或由一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代來作出改變（用於O-連接的糖基化位點）。為了方便起見，抗體構建體的胺基酸序列較佳的是藉由DNA水平的變化來改變，特別是藉由在預選鹼基處突變編碼多肽的DNA，以使得產生將翻譯成所希望胺基酸的密碼子。
增加抗體構建體上的碳水化合物部分的數量的另一種手段係藉由將糖苷化學或酶促偶聯至蛋白質。這些程序的有利之處在於它們不需要在具有用於N-和O-連接的糖基化的糖基化能力的宿主細胞中產生蛋白質。取決於所使用的偶聯方式，一種或多種糖可連接至 (a) 精胺酸和組胺酸，(b) 游離羧基基團，(c) 游離巰基基團，諸如半胱胺酸的那些，(d) 游離羥基基團，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸的那些，(e) 芳香族殘基，諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸的那些，或 (f) 穀胺醯胺的醯胺基團。這些方法描述於WO 87/05330以及Aplin和Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem. [CRC生物化學關鍵評論], 第259-306頁中。
存在於起始抗體構建體上的碳水化合物部分的去除可以化學或酶促方式完成。化學去糖基化要求將蛋白質暴露於化合物三氟甲磺酸，或等效化合物。該處理導致除連接糖（N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺）以外的大多數或所有糖裂解，同時使多肽保持完整。化學去糖基化由Hakimuddin等人, 1987,Arch. Biochem. Biophys. [生物化學與生物物理學集刊] 259:52和Edge等人, 1981,Anal. Biochem. [分析生物化學] 118:131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以藉由使用多種內切糖苷酶和外切糖苷酶實現，如由Thotakura等人, 1987, Meth. Enzymol. [酶學方法] 138:350所述的。可以藉由使用化合物衣黴素預防潛在糖基化位點處的糖基化，如由Duskin等人, 1982, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 257:3105所述的。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷鍵的形成。
本文還考慮抗體構建體的其他修飾。例如，抗體構建體的另一種類型的共價修飾包括以美國專利案號4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中示出的方式將抗體構建體連接至各種非蛋白質聚合物，包括但不限於各種多元醇，諸如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。此外，如本領域中已知的，可以在抗體構建體內的不同位置進行胺基酸取代，例如以有利於添加聚合物諸如PEG。
在一些實施方式中，本發明的抗體構建體的共價修飾包括添加一個或多個標記。標記基團可以經由各種長度的間隔臂與抗體構建體偶聯以減少潛在的空間位阻。用於標記蛋白質的各種方法在本領域中是已知的並且可以用於進行本發明。術語“標記”或“標記基團”係指任何可檢測的標記。一般來講，標記屬於多種類別，這取決於將檢測它們的測定-以下實例包括但不限於：
a) 同位素標記，這些同位素標記可以是放射性同位素或重同位素，諸如放射性同位素或放射性核素（例如3 H、14 C、15 N、35 S、89 Zr、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I）
b) 磁性標記（例如磁性顆粒）
c) 氧化還原活性部分
d) 光學染料（包括但不限於，生色團、磷光體和螢光團），諸如螢光基團（例如FITC、玫瑰紅、鑭系元素磷光體）、化學發光基團和螢光團，這些螢光團可以是“小分子”螢光劑或蛋白質螢光劑
e) 酶促基團（例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶）
f) 生物素化基團
g) 由第二報導基因識別的預定多肽表位（例如，亮胺酸拉鍊對序列、第二抗體的結合側、金屬結合結構域、表位標籤等）
“螢光標記”意指可以經由其固有的螢光特性檢測到的任何分子。合適的螢光標記包括但不限於螢光素、玫瑰紅、四甲基玫瑰紅、伊紅、赤蘚紅、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石綠、二苯乙烯、螢光黃、瀑布藍J、德克薩斯紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC紅640、Cy5、Cy5.5、LC紅705、俄勒岡綠、Alexa-Fluor染料（Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680）、瀑布藍、瀑布黃和R-藻紅蛋白（PE）（俄勒岡州尤金市的分子探針公司（Molecular Probes, Eugene, OR））、FITC、玫瑰紅和德克薩斯紅（伊利諾州羅克福德的皮爾斯公司（Pierce, Rockford, IL））、Cy5、Cy5.5、Cy7（賓夕法尼亞州匹茲堡市的阿默舍姆生命科學公司（Amersham Life Science, Pittsburgh, PA））。合適的光學染料（包括螢光團）描述於Richard P. Haugland的Molecular Probes Handbook [分子探針手冊]中。
合適的蛋白質螢光標記還包括但不限於綠色螢光蛋白，包括海腎（Renilla）、海筆（Ptilosarcus）或水母（Aequorea）物種的GFP（Chalfie等人, 1994,Science [科學] 263:802-805）；EGFP（克羅泰克實驗室有限公司（Clontech Laboratories, Inc.），基因庫登錄號U55762）、藍色螢光蛋白（BFP，量子生物科技有限公司（Quantum Biotechnologies, Inc.），加拿大魁北克省蒙特利爾（Montreal, Quebec, Canada）邁松納夫大道西部（de Maisonneuve Blvd. West）1801，第8層，H3H 1J9）；Stauber, 1998,Biotechniques [生物技術] 24:462-471；Heim等人, 1996,Curr. Biol. [當代生物學] 6:178-182）、增強型黃色螢光蛋白（EYFP，克羅泰克實驗室有限公司）、螢光素酶（Ichiki等人, 1993,J. Immunol. [免疫學雜誌] 150:5408-5417）、β半乳糖苷酶（Nolan等人, 1988,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A . [美國國家科學院院刊] 85:2603-2607）和海腎（WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利案號5,292,658、5,418,155、5,683,888、5,741,668、5,777,079、5,804,387、5,874,304、5,876,995、5,925,558）。
本發明的抗體構建體還可以包含另外的結構域，這些結構域例如有助於分離分子或涉及分子的適應性藥物動力學曲線。有助於分離抗體構建體的結構域可以選自肽基序或輔助性地引入的部分，這些部分可以在分離方法（例如分離柱）中捕獲。此類另外的結構域的非限制性實施方式包括稱為Myc-標籤、HAT-標籤、HA-標籤、TAP-標籤、GST-標籤、幾丁質結合結構域（CBD-標籤）、麥芽糖結合蛋白（MBP-標籤）、Flag-標籤、Strep-標籤以及其變體（例如StrepII-標籤）和His標籤的肽基序。本文揭露的所有抗體構建體都可以包含His-標籤結構域，該His-標籤結構域通常稱為分子的胺基酸序列中的較佳的是5個、且更較佳的是6個His殘基（六組胺酸）的連續His殘基重複序列。His-標籤可以位於例如抗體構建體的N或C末端，較佳的是它位於C末端。最較佳的是，六組胺酸標籤（HHHHHH）（SEQ ID NO:16）經由肽鍵連接至根據本發明的抗體構建體的C末端。另外，PLGA-PEG-PLGA的軛合系統可以與聚組胺酸標籤組合用於緩釋應用和改善的藥物動力學曲線。
還考慮了本文所述的抗體構建體的胺基酸序列修飾。例如，可能需要改善抗體構建體的結合親和力和/或其他生物特性。藉由將適當核苷酸變化引入到抗體構建體核酸或藉由肽合成來製備抗體構建體的胺基酸序列變體。所有下面描述的胺基酸序列修飾均應產生仍然保留未修飾的親本分子的所希望生物活性（與MUC17和CD3結合）的抗體構建體。
術語“胺基酸”或“胺基酸殘基”典型地是指具有其本領域公認的定義的胺基酸，諸如選自以下群組的胺基酸，該群組由以下項組成：丙胺酸（Ala或A）；精胺酸（Arg或R）；天冬醯胺（Asn或N）；天冬胺酸（Asp或D）；半胱胺酸（Cys或C）；穀胺醯胺（Gln或Q）；麩胺酸（Glu或E）；甘胺酸（Gly或G）；組胺酸（His或H）；異亮胺酸（He或I）；亮胺酸（Leu或L）；賴胺酸（Lys或K）；甲硫胺酸（Met或M）；苯丙胺酸（Phe或F）；脯胺酸（Pro或P）；絲胺酸（Ser或S）；蘇胺酸（Thr或T）；色胺酸（Trp或W）；酪胺酸（Tyr或Y）；以及纈胺酸（Val或V），但可以根據需要使用修飾的、合成的或稀有的胺基酸。通常，胺基酸可以分組為具有非極性側鏈（例如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val）；具有帶負電的側鏈（例如Asp、Glu）；具有帶正電的側鏈（例如Arg、His、Lys）；或具有不帶電的極性側鏈（例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr）。
胺基酸修飾包括例如抗體構建體的胺基酸序列內的殘基的缺失和/或插入和/或取代。進行缺失、插入和取代的組合以達到最終構建體，條件係最終的構建體具有所希望的特徵。胺基酸變化還可以改變抗體構建體的翻譯後過程，諸如改變糖基化位點的數目或位置。
例如，可以在每個CDR中插入、取代或缺失1、2、3、4、5或6個胺基酸（當然，取決於其長度），而可以在每個FR中插入、取代或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸。較佳的是，胺基酸序列插入到抗體構建體中包括長度範圍為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基範圍的胺基和/或羧基末端融合物插入到含有100個或更多個殘基的多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。也可以在本發明的抗體構建體的第三結構域內進行相應的修飾。本發明的抗體構建體的插入變體包括與酶的抗體構建體的N末端或C末端的融合或與多肽的融合。
取代誘變最感興趣的位點包括（但不限於）重鏈和/或輕鏈的CDR，特別是超變區，但也考慮重鏈和/或輕鏈的FR改變。取代較佳的是如本文所述的保守取代。較佳的是，可以在CDR中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸，而可以在框架區（FR）中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸，這取決於CDR或FR的長度。例如，如果CDR序列包含6個胺基酸，則設想這些胺基酸中的1個、2個或3個被取代。類似地，如果CDR序列包含15個胺基酸，則設想這些胺基酸中的1個、2個、3個、4個、5個或6個被取代。
用於鑒定作為較佳的誘變位置的抗體構建體的某些殘基或區的有用方法稱為“丙胺酸掃描誘變”，如Cunningham和Wells於Science [科學], 244: 1081-1085 (1989)中所述的。在此，鑒定了抗體構建體內的殘基或靶標殘基組（例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys和glu）並且用中性或帶負電的胺基酸（最較佳的是丙胺酸或聚丙胺酸）替換以影響胺基酸與表位的相互作用。
然後藉由在取代位點處或為取代位點引入進一步的或其他變體來精煉那些展示對取代的功能敏感性的胺基酸位置。因此，雖然用於引入胺基酸序列變化的位點或區係預定的，但突變本身的性質無需預定。例如，為了分析或優化給定位點處突變的性能，可以在靶密碼子或區處進行丙胺酸掃描或隨機誘變，並且篩選所表現的抗體構建體變體以獲得所希望活性的最優組合。用於在具有已知序列的DNA中的預定位點進行取代突變的技術係熟知的，例如，M13引物誘變和PCR誘變。使用抗原結合活性（諸如MUC17或CD3結合）的測定來篩選突變體。
一般來講，如果胺基酸在重鏈和/或輕鏈的一個或多個或所有CDR中被取代，則較佳的是，之後獲得的“取代的”序列與“初始”CDR序列至少60%或65%、更較佳的是70%或75%、甚至更較佳的是80%或85%並且特別較佳的是90%或95%相同。這意指該取代取決於CDR與“取代”序列的相同程度的長度。例如，具有5個胺基酸的CDR較佳的是與其取代序列80%相同，以便取代至少一個胺基酸。因此，抗體構建體的CDR可以與其取代的序列具有不同程度的同一性，例如CDRL1可以具有80%，而CDRL3可以具有90%。
較佳的取代（或替換）係保守取代。然而，只要抗體構建體保留其經由第一結構域與MUC17結合並且經由第二結構域與CD3ε結合的能力並且/或者其CDR與之後取代的序列具有同一性（與“原始”CDR序列至少60%或65%、更較佳的是70%或75%、甚至更較佳的是80%或85%並且特別較佳的是90%或95%相同），則設想出任何取代（包括非保守取代或來自下表3中列出的“示例性取代”的一個或多個）。
保守取代示於表3中“較佳的取代”標題之下。如果此類取代導致生物活性變化，則可以將在表3中命名為“示例性取代”的、或如在下文進一步參考胺基酸類別所述的更多實質性變化引入，並且篩選所希望的特徵。
[表3]：胺基酸取代
本發明的抗體構建體的生物特性的實質性修飾係藉由選擇在保持以下的效應方面顯著不同的取代來完成：(a) 取代區域中的多肽骨架的結構，例如呈片層或螺旋構象，(b) 分子在靶位點的電荷或疏水性，或 (c) 側鏈的大部分。基於共同的側鏈特性將天然存在的殘基分組：(1) 疏水性：正亮胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2) 中性親水性：cys、ser、thr、asn、gln(3) 酸性：asp、glu；(4) 鹼性：his、lys、arg；(5) 影響鏈取向的殘基：gly、pro；和 (6) 芳香族：trp、tyr、phe。
非保守性取代將需要將這些類別之一成員換成另一類別。任何不參與維持抗體構建體的適當構象的半胱胺酸殘基通常可以被絲胺酸取代以改善分子的氧化穩定性並防止異常交聯。相反，可以將一個或多個半胱胺酸鍵添加至抗體以改善其穩定性（特別是在抗體係抗體片段（諸如Fv片段）的情況下）。
對於胺基酸序列，序列同一性和/或相似性係藉由使用本領域中已知的標準技術來確定，包括但不限於Smith和Waterman, 1981,Adv. Appl. Math. [先進應用數學] 2:482的局部序列同一性演算法；Needleman和Wunsch, 1970,J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 48:443的序列同一性比對演算法；Pearson和Lipman, 1988,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 85:2444的相似性搜索方法；這些演算法的電腦實現方式（遺傳學電腦組（Genetics Computer Group）的威斯康辛遺傳學套裝軟體（Wisconsin Genetics Software Package）中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，科學驅動路575號（575 Science Drive）, 威斯康辛州麥迪森（Madison, Wis.））；由Devereux等人, 1984,Nucl. Acid Res. [核酸研究] 12:387-395描述的最佳擬合序列程式，較佳的是使用預設設置，或藉由檢查來進行。較佳的是，藉由FastDB基於以下參數計算同一性百分比：錯配罰分為1；空位罰分為1；空位大小罰分為0.33；以及連接罰分為30，“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis [序列比較和分析的當前方法]”, Macromolecule Sequencing and Synthesis [大分子測序與合成], Selected Methods and Applications [所選擇的方法與應用], 第127-149頁 (1988), Alan R. Liss公司。
有用的演算法的實例係PILEUP。PILEUP使用漸進式成對比對從一組相關序列中創建多序列比對。它還可以繪製顯示用於創建比對的聚類關係的樹狀圖。PILEUP使用Feng和Doolittle, 1987,J. Mol. Evol. [分子進化雜誌] 35:351-360的漸進式比對方法的簡單化；該方法類似於Higgins和Sharp, 1989,CABIOS 5:151-153所述的方法。有用的PILEUP參數包括3.00的默認空位權重、0.10的默認空位長度權重和加權末端空位。
有用的演算法的另一實例係BLAST演算法，描述於以下中：Altschul等人, 1990,J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 215:403-410；Altschul等人, 1997,Nucleic Acids Res. [核酸研究] 25:3389-3402；和Karin等人, 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 90:5873-5787。特別有用的BLAST程式係從Altschul等人, 1996,Methods in Enzymology [酶學方法] 266:460-480獲得的WU-BLAST-2程式。WU-BLAST-2使用多個搜索參數，其中大部分都設定為預設值。可調參數設定為以下值：重疊間隔＝1，重疊分數＝0.125，字碼閾值（T）＝II。HSP S和HSP S2參數係動態值，並且由程式本身根據特定序列的組成和特定數據庫的組成來確立，根據該特定數據庫來搜索感興趣的序列；然而，可以調整這些值以提高靈敏度。
另外有用的演算法係由Altschul等人, 1993,Nucl. Acids Res. [核酸研究] 25:3389-3402報導的空位BLAST。空位BLAST使用BLOSUM-62取代評分；閾值T參數設定為9；觸發非空位擴展的按兩下方法，對k的空位長度收取10+k的成本；Xu設定為16，並且Xg設定為40（用於數據庫搜索階段）以及67（用於演算法的輸出階段）。空位比對由對應於約22比特的評分觸發。
一般來講，各個變體CDR或VH/VL序列之間的胺基酸同源性、相似性或同一性與本文繪示的序列係至少60%，並且更典型地具有至少65%或70%、更較佳的是至少75%或80%、甚至更較佳的是至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和幾乎100%的較佳的是增加的同源性或同一性。以相似的方式，相對於本文中鑒定的結合蛋白的核酸序列的“百分比（%）核酸序列同一性”被定義為候選序列中與抗體構建體的編碼序列中的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比。具體方法係利用設定為默認參數的WU-BLAST-2的BLASTN模組，重疊間隔和重疊分數分別設定為1和0.125。
一般來講，編碼各個變體CDR或VH/VL序列的核苷酸序列與本文繪示的核苷酸序列之間的核酸序列同源性、相似性或同一性係至少60%，並且更典型地具有至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%和幾乎100%的較佳的是增加的同源性或同一性。因此，“變體CDR”或“變體VH/VL區”係與本發明的親本CDR/VH/VL具有指定的同源性、相似性或同一性，並且共用生物功能，包括但不限於親本CDR或VH/VL的特異性和/或活性的至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
在一個實施方式中，根據本發明的抗體構建體對人種系的同一性百分比≥ 70%或≥ 75%，更較佳的是≥ 80%或≥ 85%，甚至更較佳的是≥ 90%，並且最較佳的是≥ 91%、≥ 92%、≥ 93%、≥ 94%、≥ 95%或甚至≥ 96%。與人抗體種系基因產物的同一性被認為係降低治療期間治療性蛋白引發患者中針對藥物的免疫應答的風險的重要特徵。Hwang和Foote（“Immunogenicity of engineered antibodies [工程化抗體的免疫原性]”; Methods [方法] 36 (2005) 3-10）證明了藥物抗體構建體的非人部分的減少導致治療期間患者中誘導抗藥物抗體的風險降低。藉由比較無數臨床評價的抗體藥物和對應的免疫原性數據，顯示以下趨勢：抗體的V區的人源化使得蛋白質免疫原性（平均5.1%的患者）比攜帶未改變的非人V區的抗體（平均23.59%的患者）更低。因此，呈抗體構建體形式的基於V區的蛋白質治療劑需要與人序列具有較高程度的同一性。出於確定種系同一性的目的，可以使用Vector NTI軟體將VL的V區與人種系V區段和J區段（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）的胺基酸序列進行比對並且藉由將相同的胺基酸殘基除以VL的胺基酸殘基總數計算胺基酸序列（以百分比計）。對於VH區段（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）同樣適用的，只是由於VH CDR3的高度多樣性和缺少現有人種系VH CDR3比對配偶體，可以排除VH CDR3。然後可以使用重組技術來增加與人抗體種系基因的序列同一性。
在又一實施方式中，本發明的雙特異性抗體構建體在標準研究規模條件下，例如在標準的兩步純化過程中表現出高單體產率。較佳的是，根據本發明的抗體構建體的單體產率為≥ 0.25 mg/L上清液、更較佳的是≥ 0.5 mg/L、甚至更較佳的是≥ 1 mg/L，並且最較佳的是≥ 3 mg/L上清液。
同樣地，可以確定抗體構建體的二聚體抗體構建體同種型的產率，並由此確定單體百分比（即，單體:(單體+二聚體)）。單體和二聚體抗體構建體的生產率和計算的單體百分比可以例如在對來自在滾瓶中標準化研究規模生產的培養物上清液的SEC純化步驟中獲得。在一個實施方式中，抗體構建體的單體百分比≥ 80%、更較佳的是≥ 85%、甚至更較佳的是≥ 90%，並且最較佳的是≥ 95%。
在一個實施方式中，抗體構建體的較佳的血漿穩定性（具有血漿的EC50與無血漿的EC50的比率）≤ 5或≤ 4、更較佳的是≤ 3.5或≤ 3、甚至更較佳的是≤ 2.5或≤ 2，並且最較佳的是≤ 1.5或≤ 1。抗體構建體的血漿穩定性可以藉由將構建體在37°C下在人血漿中孵育24小時、之後在51 鉻釋放細胞毒性測定中測定EC50來測試。細胞毒性測定中的效應細胞可以為刺激的富集的人CD8陽性T細胞。靶細胞可以是例如用人MUC17轉染的CHO細胞。效應細胞與靶細胞（E:T）比率可以選擇為10 : 1或5 : 1。用於此目的的人血漿庫來源於由EDTA塗覆的注射器收集的健康供體的血液。藉由離心去除細胞組分，並且收集上層血漿相並隨後彙集。作為對照，在RPMI-1640培養基中的細胞毒性測定之前立即稀釋抗體構建體。血漿穩定性計算為EC50（血漿孵育後）與EC50（對照）的比率。
此外較佳的是，本發明的抗體構建體的單體到二聚體的轉化較低。可以在不同條件下測量轉化並且藉由高性能尺寸排阻層析法進行分析。例如，抗體構建體的單體同種型的孵育可以在37°C以及例如100 μg/ml或250 μg/ml的濃度下在孵育箱中進行7天。在這些條件下，較佳的是，本發明的抗體構建體顯示出≤ 5%、更較佳的是≤ 4%、甚至更較佳的是≤ 3%、甚至更較佳的是≤ 2.5%、甚至更較佳的是≤ 2%、甚至更較佳的是≤ 1.5%並且最較佳的是≤ 1%或≤ 0.5%或甚至0%的二聚體百分比。
還較佳的是，本發明的雙特異性抗體構建體在多個冷凍/解凍循環後以非常低的二聚體轉化存在。例如，將抗體構建體單體在例如通用配製緩衝液中調整至濃度為250 μg/ml，並且進行三個冷凍/解凍循環（在-80°C下冷凍30 min，之後在室溫下解凍30 min），之後進行高性能SEC以確定已經轉化成二聚體抗體構建體的最初單體抗體構建體的百分比。較佳的是，例如在三個冷凍/解凍循環之後，雙特異性抗體構建體的二聚體百分比較佳的是≤ 5%，更較佳的是≤ 4%，甚至更較佳的是≤ 3%，甚至更較佳的是≤ 2.5%，甚至更較佳的是≤ 2%，甚至更較佳的是≤ 1.5%，並且最較佳的是≤ 1%或甚至≤ 0.5%。
本發明的雙特異性抗體構建體較佳的是顯示出聚集溫度≥ 45°C或≥ 50°C、更較佳的是≥ 52°C或≥ 54°C、甚至更較佳的是≥ 56°C或≥ 57°C，並且最較佳的是≥ 58°C或≥ 59°C的有利熱穩定性。熱穩定性參數可以根據抗體聚集溫度如下確定：將濃度為250 μg/ml的抗體溶液轉移到一次性比色杯中並置於動態光散射（DLS）裝置中。將樣品以0.5°C/min的加熱速率從40°C加熱至70°C，恒定獲取測量的半徑。使用指示蛋白質和聚集物熔融的半徑增加來計算抗體的聚集溫度。
可替代地，可以藉由差示掃描量熱法（DSC）確定溫度熔融曲線以確定抗體構建體的固有生物物理學蛋白質穩定性。這些實驗使用微凱爾有限公司（MicroCal LLC）（美國麻塞諸塞州的北安普頓（Northampton, MA, U.S.A））VP-DSC裝置進行。從20°C至90°C記錄與僅含有配製緩衝液的樣品相比含有抗體構建體的樣品的能量攝取。例如在SEC運行緩衝液中將抗體構建體調整至終濃度為250 μg/ml。為了記錄對應的熔融曲線，逐步升高整個樣品溫度。在每個溫度T下記錄樣品和配製緩衝液參考物的能量吸收。將樣品的能量吸收Cp（千卡/莫耳/°C）減去參考物的差針對對應的溫度作圖。熔融溫度被定義為第一次最大能量吸收時的溫度。
還設想本發明的MUC17xCD3雙特異性抗體構建體具有≤ 0.2、較佳的是≤ 0.15、更較佳的是≤ 0.12、甚至更較佳的是≤ 0.1並且最較佳的是≤ 0.08的濁度（如在將純化的單體抗體構建體濃縮至2.5 mg/ml並過夜孵育後藉由OD340測量的）。
在另一個實施方式中，根據本發明的抗體構建體在生理的或稍低的pH值、即約pH 7.4至6.0下係穩定的。抗體構建體在非生理pH值（諸如約pH 6.0）下表現出的耐受性越大，從離子交換柱洗脫的抗體構建體相對於載入蛋白質的總量的回收率就越高。從約pH 6.0的離子（例如陽離子）交換柱的抗體構建體的回收率較佳的是≥ 30%、更較佳的是≥ 40%、更較佳的是≥ 50%、甚至更較佳的是≥ 60%、甚至更較佳的是≥ 70%、甚至更較佳的是≥ 80%、甚至更較佳的是≥ 90%、甚至更較佳的是≥ 95%，並且最較佳的是≥ 99%。
此外設想，本發明的雙特異性抗體構建體表現出治療功效或抗腫瘤活性。這可以例如在以下晚期人腫瘤異種移植模型的一般化實例中揭露的研究中評估：
在研究的第1天，將人靶細胞抗原（此處：MUC17）陽性癌細胞系的5×106 個細胞皮下注射在雌性NOD/SCID小鼠的右背側中。當平均腫瘤體積達到約100 mm3 時，藉由將約2 × 107 個細胞注射到動物的腹腔中將體外擴增的人CD3陽性T細胞移植到小鼠中。媒介物對照組1的小鼠不接受效應細胞並用作與媒介物對照組2（接受效應細胞）比較的未移植對照，以監測單獨的T細胞對腫瘤生長的影響。當平均腫瘤體積達到約200 mm3 時開始抗體治療。治療開始當天每個治療組的平均腫瘤大小與任何其他組均不應有統計學差異（方差分析）。藉由靜脈內快速濃注用0.5 mg/kg/天的MUC17xCD3雙特異性抗體構建體對小鼠進行治療，持續約15至20天。在研究期間藉由卡尺測量腫瘤並且藉由腫瘤體積（TV）的組間比較評價進展。藉由將TV計算為T/C% = 100×(分析組的中值TV)/(對照組2的中值TV)來確定腫瘤生長抑制T/C[%]。
熟悉該項技術者知道如何修改或調整該研究的某些參數，諸如注射的腫瘤細胞的數量、注射位點、移植的人T細胞的數量、有待給予的雙特異性抗體構建體的量以及時間線，同時仍然獲得有意義且可再現的結果。較佳的是，腫瘤生長抑制T/C[%]≤ 70或≤ 60、更較佳的是≤ 50或≤ 40、甚至更較佳的是≤ 30或≤ 20並且最較佳的是≤ 10或≤ 5或甚至≤ 2.5。腫瘤生長抑制較佳的是接近於100%。
在本發明的抗體構建體的較佳的實施方式中，抗體構建體係單鏈抗體構建體。
另外，在本發明的抗體構建體的較佳的實施方式中，所述第三結構域按胺基至羧基順序包含：
鉸鏈-CH2-CH3-接頭-鉸鏈-CH2-CH3。
在本發明的一個實施方式中，第三結構域的所述多肽單體中的每一個具有與選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群組的序列至少90%相同的胺基酸序列。在本發明的較佳的實施方式中，所述多肽單體中的每一個具有選自SEQ ID NO: 17-24的胺基酸序列。
另外，在本發明的一個實施方式中，第三結構域的一個或較佳的是每個（兩個）多肽單體的CH2結構域包含結構域內半胱胺酸二硫橋。如本領域中已知的，術語“半胱胺酸二硫橋”係指具有一般結構R–S–S–R 的官能基。該鍵聯也稱為SS鍵或二硫橋，並且藉由半胱胺酸殘基的兩個硫醇基團的偶聯來衍生。對於本發明的抗體構建體特別較佳的是，將成熟抗體構建體中形成半胱胺酸二硫橋的半胱胺酸引入到對應於309和321（Kabat編號）的CH2結構域的胺基酸序列中。
在本發明的一個實施方式中，去除CH2結構域的Kabat位置314中的糖基化位點。較佳的是，藉由N314X取代實現糖基化位點的去除，其中X係除Q之外的任何胺基酸。所述取代較佳的是為N314G。在一個更較佳的實施方式中，所述CH2結構域另外包含以下取代（根據Kabat的位置）：V321C和R309C（這些取代在Kabat位置309和321處引入結構域內半胱胺酸二硫橋）。
假定與本領域中已知的雙特異性異源Fc抗體構建體相比（圖1b）本發明的抗體構建體的較佳的特徵例如可以尤其涉及在CH2結構域中引入上述修飾。因此，對於本發明的構建體較佳的是，本發明的抗體構建體的第三結構域中的CH2結構域在Kabat位置309和321處包含結構域內半胱胺酸二硫橋並且/或者Kabat位置314處的糖基化位點被去除、較佳的是藉由N314G取代去除。
在本發明的另一個較佳的實施方式中，本發明的抗體構建體的第三結構域中的CH2結構域在Kabat位置309和321處包含結構域內半胱胺酸二硫橋並且Kabat位置314處的糖基化位點藉由N314G取代去除。最較佳的是，本發明的抗體構建體的第三結構域的多肽單體具有選自由SEQ ID NO: 17和18組成之群組的胺基酸序列。
在一個實施方式中，本發明提供了一種抗體構建體，其中：
(i) 該第一結構域包含兩個抗體可變結構域並且該第二結構域包含兩個抗體可變結構域；
(ii) 該第一結構域包含一個抗體可變結構域並且該第二結構域包含兩個抗體可變結構域；
(iii) 該第一結構域包含兩個抗體可變結構域並且該第二結構域包含一個抗體可變結構域；或者
(iv) 該第一結構域包含一個抗體可變結構域並且該第二結構域包含一個抗體可變結構域。
因此，第一結構域和第二結構域可以是各自包含兩個抗體可變結構域（諸如VH和VL結構域）的結合結構域。此類包含兩個抗體可變結構域的結合結構域的實例在上文進行了描述並且包括例如上文所述的Fv片段、scFv片段或Fab片段。可替代地，這些結合結構域中的一個或兩個可以僅包含單一可變結構域。這種單結構域結合結構域的實例在上文進行了描述並且包括例如奈米抗體或僅包含一個可變結構域的單一可變結構域抗體，該一個可變結構域可以是獨立於其他V區或結構域特異性結合抗原或表位的VHH、VH或VL。
在本發明的抗體構建體的較佳的實施方式中，第一結構域和第二結構域經由肽接頭與第三結構域融合。較佳的肽接頭已在上文描述並且特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly4 Ser（SEQ ID NO: 1），或其聚合物，即(Gly4 Ser)x，其中x為1或更大的整數（例如2或3）。用於第一結構域和第二結構域與第三結構域融合的特別較佳的接頭在SEQ ID NO: 1中繪示。
在一個較佳的實施方式中，本發明的抗體構建體的特徵在於按胺基至羧基順序包含：
(a) 該第一結構域；
(b) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 1-3組成之群組的胺基酸序列；
(c) 該第二結構域；
(d) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 1、2、3、9、10、11和12組成之群組的胺基酸序列；
(e) 該第三結構域的該第一多肽單體；
(f) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 5、6、7和8組成之群組的胺基酸序列；以及
(g) 該第三結構域的該第二多肽單體。
本發明的抗體構建體包含與MUC17、較佳的是與MUC17的細胞外結構域（ECD）結合的第一結構域。應理解，在本發明的上下文中，術語“與MUC17的細胞外結構域結合”意味著結合結構域與在靶細胞表面上表現的MUC17結合。因此，當MUC17由天然表現細胞或細胞系和/或由用MUC17轉化或（穩定/暫態）轉染的細胞或細胞系表現時，根據本發明的第一結構域較佳的是與MUC17結合。在一個較佳的實施方式中，當MUC17在體外結合測定（諸如BIAcore或Scatchard）中用作“靶”或“配位基”分子時，第一結合結構域也與MUC17結合。“靶細胞”可以是在其表面上表現MUC17的任何原核或真核細胞；較佳的是，靶細胞係作為人體或動物體的一部分的細胞，諸如表現特定MUC17的癌症或腫瘤細胞。
較佳的是，第一結合結構域與人MUC17/MUC17 ECD結合。在另一個較佳的實施方式中，它與獼猴MUC17/MUC17 ECD結合。根據最較佳的實施方式，它與人和獼猴MUC17/MUC17 ECD結合。“MUC17細胞外結構域”或“MUC17 ECD”係指基本上不含MUC17的跨膜和細胞質結構域的MUC17區或序列。熟悉該項技術者應理解，根據本領域常規使用的用於鑒定該疏水結構欄位型別的標準鑒定針對本發明的MUC17多肽所鑒定的跨膜結構域。跨膜結構域的確切邊界可以改變，但最有可能的是在本文具體提及的結構域的任一末端改變不超過約5個胺基酸。
與MUC17結合的較佳的是結合結構域揭露於WO 2010/037836和WO 2011/121110中。這些申請中描述的用於MUC17的任何結合結構域可以在本發明的背景下使用。
在本發明的一方面，抗體構建體按胺基至羧基順序包含：
(a) 該第一結構域，該第一結構域具有選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下項組成：SEQ ID NO: 50、56、68、74、86、92、104、110、122、128、140、146、158、164、176、182、194、200、212、218、230、236、248、254、266、272、284、290、302、308、320、335、350、365、380、395、410、425、440、455、470；
(b) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 1-3組成之群組的胺基酸序列；
(c) 該第二結構域，該第二結構域具有選自以下群組或如SEQ ID NO: 15中繪示的胺基酸序列，該群組由以下項組成：WO 2008/119567的SEQ ID NO: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187；
(d) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 1、2、3、9、10、11和12組成之群組的胺基酸序列；
(e) 該第三結構域的該第一多肽單體，該第一多肽單體具有選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群組的多肽序列；
(f) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 5、6、7和8組成之群組的胺基酸序列；以及
(g) 該第三結構域的該第二多肽單體，該第二多肽單體具有選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群組的多肽序列。
與該較佳的實施方式一致，經由肽接頭與單鏈多肽融合的第一結構域和第二結構域包含選自以下群組的序列，該群組由以下項組成：SEQ ID NO: 51、57、69、75、87、93、105、111、123、129、141、147、159、165、177、183、195、201、213、219、231、237、249、255、267、273、285、291、303、309、321、324、336、339、351、354、366、369、381、384、396、399、411、414、426、429、441、444、456、459、471和474。
在一方面，本發明的抗體構建體的特徵在於具有選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下項組成：SEQ ID NO: 52、53、58、59、70、71、76、77、88、89、94、95、106、107、112、113、124、125、130、131、142、143、148、149、160、161、166、167、178、179、184、185、196、197、202、203、214、215、220、221、232、233、238、239、250、251、256、257、268、269、274、275、286、287、292、293、304、305、310、311、322、323、325、326、337、338、340、341、352、353、355、356、367、368、370、371、382、383、385、386、397、398、400、401、412、413、415、416、427、428、430、431、442、443、445、446、457、458、460、461、472、473、475和476。
本發明進一步提供了一種多核苷酸/核酸分子，該多核苷酸/核酸分子編碼本發明的抗體構建體。多核苷酸係由共價鍵合在鏈中的13個或更多個核苷酸單體構成的生物聚合物。DNA（諸如cDNA）和RNA（諸如mRNA）係具有不同生物功能的多核苷酸的實例。核苷酸係充當核酸分子如DNA或RNA的單體或亞單位的有機分子。核酸分子或多核苷酸可以為雙鏈和單鏈的、線性的和圓形的。它較佳的是包括在載體中，該載體較佳的是包括在宿主細胞中。所述宿主細胞例如在用本發明的載體或多核苷酸轉化或轉染後能夠表現抗體構建體。為此目的，將多核苷酸或核酸分子可操作地連接至控制序列。
遺傳密碼係將遺傳物質（核酸）內編碼的資訊翻譯成蛋白質的一組規則。活細胞中的生物解碼係藉由以由mRNA指定的順序連接胺基酸的核糖體、使用tRNA分子攜帶胺基酸並一次讀出mRNA三個核苷酸來完成。該密碼定義了這些核苷酸三聯體的序列（稱為密碼子）如何指定在蛋白質合成期間接下來將添加哪種胺基酸。除了一些例外，核酸序列中的三核苷酸密碼子指定單一胺基酸。因為絕大多數基因都使用完全相同的密碼進行編碼，所以該特定密碼通常稱為規範或標準遺傳密碼。雖然遺傳密碼決定給定編碼區的蛋白質序列，但其他基因組區可能會影響這些蛋白質產生的時間和地點。
此外，本發明提供了一種載體，該載體包含本發明的多核苷酸/核酸分子。載體係用作將（外來）遺傳物質轉移到細胞中的媒介物的核酸分子。術語“載體”涵蓋但不限於質粒、病毒、黏粒和人造染色體。一般來講，工程化載體包含複製起點、多株位點和選擇性標誌物。載體本身通常是核苷酸序列，該核苷酸序列通常是包含插入物（轉基因）和充當載體的“骨架”的更大序列的DNA序列。現代載體除轉基因插入物和骨架外還可涵蓋額外的特徵：啟動子、遺傳標誌物、抗生素抗性、報導基因、靶向序列、蛋白質純化標籤。稱為表現載體（表現構建體）的載體尤其用於在靶細胞中表現轉基因，並且通常具有控制序列。
術語“控制序列”係指在特定宿主生物體中表現可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適用於原核生物的控制序列包括啟動子、視需要的操縱子序列和核糖體結合側。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化訊號和增強子。
當核酸置處於與另一核酸序列的功能關係中時，該核酸係“可操作地連接的”。例如，如果將前序列或分泌前導序列的DNA表現為參與多肽分泌的前蛋白，則該前序列或分泌前導序列的DNA可操作地連接至該多肽的DNA；如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則該啟動子或增強子可操作地連接至該序列；或者如果核糖體結合側被定位成使得有助於翻譯，則該核糖體結合側可操作地連接至編碼序列。通常，“可操作地連接”意指所連接的DNA序列係連續的，並且在分泌性前導序列的情形下係連續的並處於閱讀相（reading phase）中。然而，增強子不必係連續的。連接藉由在方便的限制性位點進行接連接合來完成。如果不存在此類位點，則根據常規實踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
“轉染”係有意將核酸分子或多核苷酸（包括載體）引入到靶細胞中的過程。該術語主要用於真核細胞中的非病毒方法。轉導通常用於描述病毒介導的核酸分子或多核苷酸的轉移。轉染動物細胞典型地涉及打開細胞膜中的暫態孔或“洞”，以允許攝取物質。轉染可以使用磷酸鈣、藉由電穿孔、藉由細胞擠壓或藉由將陽離子脂質與物質混合以產生脂質體（這些脂質體與細胞膜融合並將其貨物存放在內部）來進行。
術語“轉化”用於描述核酸分子或多核苷酸（包括載體）向細菌中，以及向非動物真核細胞（包括植物細胞中的非病毒轉移。因此，轉化係細菌或非動物真核細胞的基因改變，該基因改變係因通過一個或多個細胞膜從其周圍直接攝取並隨後併入外源遺傳物質（核酸分子）而產生。轉化可以藉由人為手段來實現。為了發生轉化，細胞或細菌必須處於感受態，這可能作為對諸如饑餓等環境條件和細胞密度的時間限制應答而發生。
此外，本發明提供了一種宿主細胞，該宿主細胞用本發明的多核苷酸/核酸分子或載體轉化或轉染。如本文使用的，術語“宿主細胞”或“受體細胞”旨在包括可以是或已經係載體、外源性核酸分子和編碼本發明抗體構建體的多核苷酸的受體和/或抗體構建體本身的受體的任何單個細胞或細胞培養物。藉由轉化、轉染等方式將對應的物質引入到細胞中。術語“宿主細胞”還旨在包括單細胞的後代或潛在後代。因為某些改變可能由於天然的、意外的或有意的突變或由於環境影響而在隨後世代中發生，所以這種後代事實上可能不會與親本細胞完全相同（在形態或基因組或全部DNA補體中），但仍包括在本文所用術語的範圍內。合適的宿主細胞包括原核細胞或真核細胞，並且還包括但不限於細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞和動物細胞，諸如昆蟲細胞和哺乳動物細胞，例如鼠類、大鼠、獼猴或人。
本發明的抗體構建體可以在細菌中產生。表現後，將本發明的抗體構建體從大腸桿菌細胞糊中以可溶性級分分離，並且可以藉由例如親和層析法和/或尺寸排除來純化。最終純化可以類似於用於純化例如在CHO細胞中表現的抗體的方法進行。
除了原核生物之外，真核微生物（諸如絲狀真菌或酵母）係本發明的抗體構建體的合適的選殖或表現宿主。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）或普通麵包酵母係低等真核宿主微生物中最常用的。然而，許多其他屬、物種和菌株通常可獲得並且可用於本文中，諸如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）；克魯維酵母屬（Kluyveromyce）宿主，諸如乳酸克魯維酵母（K. lactis ）、脆壁克魯維酵母（K. fragilis ）（ATCC 12424）、保加利亞克魯維酵母（K. bulgaricus ）（ATCC 16045）、威克克魯維酵母（K. wickeramii ）（ATCC 24178）、瓦爾提魯維酵母（K. waltii ）（ATCC 56500）、果蠅克魯維酵母（K. drosophilarum ）（ATCC 36906）、耐熱克魯維酵母（K. thermotolerans ）和馬克斯克魯維酵母（K. marxianus ）；耶氏酵母屬（yarrowia）（EP 402 226）；巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris ）（EP 183 070）；假絲酵母屬（Candida）；裡氏木黴菌（Trichoderma reesia ）（EP 244 234）；粗糙脈孢菌（Neurospora crassa ）；許旺酵母屬（Schwanniomyces），諸如西方許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis ）；和絲狀真菌，諸如脈孢菌屬（Neurospora）、青黴屬（Penicillium）、彎頸黴屬（Tolypocladium）和麯黴屬（Aspergillus）宿主，諸如構巢麯黴（A. nidulans ）和黑麯黴（A. niger ）。
用於表現本發明的糖基化抗體構建體的合適的宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊椎動物細胞的實例包括植物細胞和昆蟲細胞。已經鑒定了來自諸如草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda ）（毛蟲）、埃及伊蚊（Aedes aegypti ）（蚊子）、白紋伊蚊（Aedes albopictus）（蚊子）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster ）（果蠅）和家蠶（Bombyx mori ）的宿主的許多桿狀病毒株和變體以及相應的許可性昆蟲宿主細胞。用於轉染的多種病毒株係公眾可獲得的，例如苜蓿銀紋夜蛾（Autographa californica ）NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5株，並且根據本發明，此類病毒可以用作本文的病毒，特別是用於轉染草地貪夜蛾細胞。
棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、擬南芥和煙草的植物細胞培養物也可以用作宿主。可用於在植物細胞培養物中產生蛋白質的選殖和表現載體係熟悉該項技術者已知的。參見，例如Hiatt等人, Nature [自然] (1989) 342: 76-78；Owen等人 (1992) Bio/Technology [生物/技術] 10: 790-794；Artsaenko等人 (1995) The Plant J [植物雜誌] 8: 745-750和Fecker等人 (1996) Plant Mol Biol [植物分子生物學] 32: 979-986。
然而，對脊椎動物細胞的興趣最大，並且培養物（組織培養物）中脊椎動物細胞的繁殖已成為常規程序。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例係由SV40（COS-7，ATCC CRL 1651）轉化的猴腎CV1系；人胚胎腎系（293細胞或亞選殖用於在懸浮培養物中生長的293細胞，Graham等人, J. Gen Virol. [遺傳病毒學雜誌] 36 : 59 (1977)）；幼倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10）；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR（CHO，Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 77: 4216 (1980)）；小鼠支持細胞（TM4，Mather, Biol. Reprod. [生殖生物學] 23: 243-251 (1980)）；猴腎細胞（CVI ATCC CCL 70）；非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL1587）；人子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2）；犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34）；布法羅（buffalo）大鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人肺細胞（W138，ATCC CCL 75）；人肝細胞（Hep G2,1413 8065）；小鼠乳房腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL5 1）；TRI細胞（Mather等人, Annals N. Y Acad. Sci. [紐約科學院年刊] (1982) 383: 44-68）；MRC 5細胞；FS4細胞；和人肝癌細胞系（Hep G2）。
在另一個實施方式中，本發明提供了一種用於產生本發明的抗體構建體之方法，所述方法包括在允許表現本發明的抗體構建體的條件下培養本發明的宿主細胞並且從該培養中回收所產生的抗體構建體。
如本文使用的，術語“培養”係指細胞在合適的條件下在培養基中的體外維持、分化、生長、增殖和/或繁殖。術語“表現”包括涉及產生本發明的抗體構建體的任何步驟，包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。
當使用重組技術時，抗體構建體可以在周質空間中細胞內產生，或直接分泌到培養基中。如果抗體構建體係在細胞內產生，則作為第一步，例如藉由離心或超濾去除宿主細胞或溶解片段的微粒狀碎片。Carter等人, Bio/Technology [生物/技術] 10: 163-167 (1992)描述了用於分離分泌到大腸桿菌周質空間的抗體的程序。簡而言之，在約30 min內，在乙酸鈉（pH 3.5）、EDTA和苯甲基磺醯氟（PMSF）存在下使細胞糊解凍。可以藉由離心去除細胞碎片。在將抗體分泌到培養基中的情況下，通常首先使用可商購的蛋白質濃縮濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元對來自此類表現系統的上清液進行濃縮。任何前述步驟中可以包括蛋白酶抑制劑（諸如PMSF）以抑制蛋白水解，並且可以包括抗生素以防止外來污染物的生長。
可以使用例如羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析和親和層析法回收或純化從宿主細胞製備的本發明的抗體構建體。取決於有待回收的抗體，也可使用其他用於蛋白質純化的技術，諸如在離子交換柱上分級分離、乙醇沈澱、反相HPLC、在二氧化矽上進行的層析法、在肝素上進行的層析法、在陰離子或陽離子交換樹脂（諸如聚天冬胺酸柱）上進行的SEPHAROSETM 層析法、層析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸銨沈澱。在本發明的抗體構建體包含CH3結構域的情況下，Bakerbond ABX樹脂（新澤西州菲力浦斯堡的馬林克羅特貝克有限公司（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）可用於純化。
親和層析法係一種較佳的純化技術。親和配位基所連接的基質最常為瓊脂糖，但其他基質也是可用的。在機械上穩定的基質諸如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允許比用瓊脂糖可以實現的更快的流速和更短的處理時間。
此外，本發明提供了一種藥物組成物，該藥物組成物包含本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體。對於本發明的藥物組成物較佳的是，抗體構建體的均質性≥ 80%，更較佳的是≥ 81%、≥ 82%、≥ 83%、≥ 84%或≥ 85%，進一步較佳的是≥ 86%、≥ 87%、≥ 88%、≥ 89%或≥ 90%，還進一步較佳的是≥ 91%、≥ 92%、≥ 93%、≥ 94%或≥ 95%並且最較佳的是≥ 96%、≥ 97%、≥ 98%或≥ 99%。
如本文使用的，術語“藥物組成物”涉及適合給予至患者、較佳的是人患者的組成物。本發明的特別較佳的藥物組成物包含較佳的是治療有效量的一種或多種本發明的抗體構建體。較佳的是，藥物組成物進一步包含一種或多種（藥學上有效的）載劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑的合適配製物。組成物的可接受成分較佳的是在所採用的劑量和濃度下係對接受者無毒性的。本發明的藥物組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾組成物。
本發明組成物可以包含藥學上可接受的載劑。一般來講，如本文使用的，“藥學上可接受的載劑”意指與藥物給予、特別是腸胃外給予相容的任何和所有的水性和非水性溶液、無菌溶液、溶劑、緩衝液（例如磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）溶液）、水、懸浮液、乳液（諸如油/水乳液）、各種類型的潤濕劑、脂質體、分散介質和包衣。此類介質和劑在藥物組成物中的使用在本領域中是熟知的，並且包含此類載劑的組成物可以藉由熟知的常規方法配製。
某些實施方式提供了藥物組成物，這些藥物組成物包含本發明的抗體構建體和另外一種或多種賦形劑，諸如在本部分和本文其他地方說明性描述的那些賦形劑。在這方面，賦形劑在本發明中可用於多種目的，諸如調整配製物的物理、化學或生物特性，諸如調整黏度和/或本發明的方法以改善有效性和/或穩定此類配製物和方法，以防止由於例如在製造、運輸、存儲、使用前準備、給予和之後過程中發生的壓力而導致的降解和腐壞。
在某些實施方式中，藥物組成物可以含有用於改變、保持或保存組成物的以下方面的目的的配製物質：例如pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附性或滲透性（參見REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明登氏藥學全書], 第18"版, (A.R. Genrmo編輯), 1990, Mack Publishing Company [馬克出版公司]）。在此類實施方式中，合適的配製物質可以包括但不限於：
• 胺基酸，諸如甘胺酸、丙胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、蘇胺酸、脯胺酸、2-苯丙胺酸，包括帶電荷的胺基酸，較佳的是賴胺酸、乙酸賴胺酸、精胺酸、麩胺酸鹽和/或組胺酸
• 抗微生物劑，諸如抗細菌劑和抗真菌劑
• 抗氧化劑，諸如抗壞血酸、甲硫胺酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉；
• 緩衝液、緩衝系統和緩沖劑，用於將組成物保持在生理pH值或稍低的pH值，較佳的是4.0至6.5的較低pH下；緩衝液的實例係硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸、琥珀酸鹽、磷酸鹽和組胺酸；例如約pH 7.0-8.5的Tris緩衝液；
• 非水性溶劑，諸如丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油和可注射用有機酯諸如油酸乙酯；
• 水性載劑包括水、醇/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝的介質；
• 生物可降解聚合物，諸如聚酯；
• 增積劑，諸如甘露醇或甘胺酸；
• 螯合劑，諸如乙二胺四乙酸（EDTA）；
• 等滲劑和吸收延遲劑；
• 錯合劑，諸如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精）
• 填充劑；
• 單糖、二糖和其他碳水化合物，（諸如葡萄糖、甘露糖或糊精）；碳水化合物可以是非還原糖，較佳的是海藻糖、蔗糖、八硫酸鹽、山梨醇或木糖醇；
• （低分子量）蛋白質、多肽或蛋白質載劑，諸如人或牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白，較佳的是人來源的；
• 著色劑和調味劑；
• 含硫還原劑，諸如谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、[α]-一硫代甘油和硫代硫酸鈉
• 稀釋劑；
• 乳化劑；
• 親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮）
• 成鹽抗衡離子，諸如鈉；
• 防腐劑，諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等；□ □實例係：苯紮氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫）；
• 金屬錯合物，諸如Zn-蛋白質錯合物；
• 溶劑和共溶劑（諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇）；
• 糖和糖醇，諸如海藻糖、蔗糖、八硫酸鹽、甘露醇、山梨醇或木糖醇水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖（myoinisitose）、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌肉肌醇（myoinisitol）、半乳糖醇、甘油、環多醇（例如肌醇）、聚乙二醇；和多元糖醇；
• 懸浮劑；
• 表面活性劑或潤濕劑，諸如普朗尼克（pluronics）、PEG、脫水山梨醇酯、聚山梨醇酯諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、曲拉通（triton）、胺基丁三醇、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊（tyloxapal）；表面活性劑可以是洗滌劑，較佳的是分子量＞ 1.2 KD，和/或聚醚，較佳的是分子量＞ 3 KD；較佳的洗滌劑的非限制性實例係吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80和吐溫85；較佳的聚醚的非限制性實例係PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000和PEG 5000；
• 穩定性增強劑，諸如蔗糖或山梨醇；
• 張力增強劑，諸如鹼金屬鹵化物，較佳的是氯化鈉或氯化鉀、甘露醇山梨醇；
• 腸胃外遞送媒介物，包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發性油；
• 靜脈內遞送媒介物，包括流體和營養補充物、電解質補充物（諸如基於林格氏右旋糖的那些）。
在本發明的背景下，較佳的是液體組成物或可以是藉由凍乾獲得的固體組成物或可以是重構的液體組成物的藥物組成物包含
(a) 含有至少三個結構域的抗體構建體，其中：
• 第一結構域與靶細胞表面抗原結合並且具有在4至9,5範圍內的等電點（pI）；
• 第二結構域與第二抗原結合；並且具有在8至10、較佳的是8.5至9.0範圍內的pI；以及
• 視需要第三結構域，該第三結構域包含兩個多肽單體，每個多肽單體包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域，其中所述兩個多肽單體經由肽接頭彼此融合；
(b) 至少一種緩衝劑；
(c) 至少一種糖；以及
(d) 至少一種表面活性劑；
並且其中該藥物組成物的pH在3.5至6的範圍內。
在本發明的背景下進一步設想至少一種緩衝劑以5至200 mM的濃度範圍、更較佳的是以10至50 mM的濃度範圍存在。在本發明的背景下設想至少一種糖選自以下群組，該群組由以下項組成：單糖、二糖、環狀多糖、糖醇、線性支鏈葡聚糖或線性非支鏈葡聚糖。在本發明的背景下還設想二糖選自以下群組，該群組由以下項組成：蔗糖、海藻糖和甘露糖醇、山梨醇及其組合。在本發明的背景下進一步設想糖醇為山梨醇。在本發明的背景下設想至少一種糖以1%至15%（m/V）的濃度範圍、較佳的是以9%至12%（m/V）的濃度範圍存在。
在本發明的背景下還設想至少一種表面活性劑選自以下群組，該群組由以下項組成：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、普朗尼克F68、曲拉通X-100、聚氧乙烯（polyoxyethylen）、PEG 3350、PEG 4000及其組合。在本發明的背景下進一步設想至少一種表面活性劑以0.004%至0.5%（m/V）的濃度範圍、較佳的是以0.001%至0.01%（m/V）的範圍存在。在本發明的背景下設想該組成物的pH在4.0至5.0的範圍內，較佳的是4.2。在本發明的背景下還設想該藥物組成物具有在150至500 mOsm範圍內的滲透壓。在本發明的背景下進一步設想該藥物組成物進一步包含選自以下群組的賦形劑，該群組由以下項組成：一種或多種多元醇和一種或多種胺基酸。在本發明的背景下設想所述一種或多種賦形劑以0.1%至15%（w/V）的濃度範圍存在。
在本發明的背景下還設想該藥物組成物包含
(a) 如上文論述的抗體構建體，
(b) 10 mM麩胺酸鹽或乙酸鹽，
(c) 9%（m/V）蔗糖或6%（m/V）蔗糖和6%（m/V）羥丙基-β-環糊精，
(d) 0.01%（m/V）聚山梨醇酯80
並且其中該液體藥物組成物的pH為4.2。
在本發明的背景下進一步設想該抗體構建體以0.1至8 mg/ml、較佳的是0.2-2.5 mg/ml、更較佳的是0.25-1.0 mg/ml的濃度範圍存在。
對於熟悉該項技術者來說明顯的是，例如，藥物組成物的不同成分（例如，上文列出的那些）可以具有不同的效應，並且胺基酸可以充當緩衝液、穩定劑和/或抗氧化劑；甘露醇可以充當增積劑和/或張力增強劑；氯化鈉可以充當遞送媒介物和/或張力增強劑；等等。
設想除了本文定義的本發明的多肽之外，本發明的組成物可以包含另外的生物活性劑，這取決於組成物的預期用途。此類劑可以是作用於胃腸系統的藥物、充當細胞抑制劑的藥物、預防高尿酸血症的藥物、抑制免疫反應的藥物（例如皮質類固醇）、調節炎症應答的藥物、作用於循環系統的藥物和/或本領域中已知的劑諸如細胞介素。還設想將本發明的抗體構建體應用於共療法中，即與另一種抗癌藥物組合。
在某些實施方式中，最佳藥物組成物將由熟悉該項技術者根據例如預期給予途徑、遞送形式和所希望劑量來確定。參見，例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明登氏藥學全書]，同上。在某些實施方式中，此類組成物可以影響本發明的抗體構建體的物理狀態、穩定性、體內釋放速率和體內清除速率。在某些實施方式中，藥物組成物中的主要媒介物或載劑本質上可以是水性的或非水性的。例如，合適的媒介物或載劑可以是注射用水、生理鹽水溶液或人造腦脊液，可能補充有用於腸胃外給予的組成物中常見的其他物質。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水係另外的示例性媒介物。在某些實施方式中，本發明抗體構建體組成物可以藉由將具有所希望純度的選擇成分與視需要配製劑（REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明登氏藥學全書]，同上）以凍乾餅或水性溶液的形式混合來製備用於儲存。此外，在某些實施方式中，可以使用合適的賦形劑（諸如蔗糖）將本發明的抗體構建體配製成凍乾物。
當考慮腸胃外給予時，用於本發明的治療組成物可以以無熱原的腸胃外可接受的水性溶液的形式提供，該水性溶液包含在藥學上可接受的媒介物中的本發明的所希望抗體構建體。用於腸胃外注射的特別合適的媒介物係無菌蒸餾水，其中將本發明的抗體構建體配製成適當保存的無菌等滲溶液。在某些實施方式中，該製備可以涉及用可以提供產物（該產物可以經由儲庫注射來遞送）的受控或持續釋放的劑（諸如可注射微球體、生物可侵蝕顆粒、聚合物化合物（諸如聚乳酸或聚乙醇酸）、珠粒或脂質體）配製所希望分子。在某些實施方式中，也可以使用透明質酸，該透明質酸具有促進循環持續時間的作用。在某些實施方式中，可植入藥物遞送裝置可用於引入所希望的抗體構建體。
另外的藥物組成物對於熟悉該項技術者將是明顯的，包括涉及將本發明的抗體構建體製成持續或控制遞送/釋放配製物的配製物。用於配製各種其他持續或控制遞送方式的技術（諸如脂質體載劑、生物可侵蝕微粒或多孔珠粒和儲庫注射）也是熟悉該項技術者已知的。參見，例如國際專利申請案號PCT/US93/00829，其描述了用於遞送藥物組成物的多孔聚合物微粒的控制釋放。持續釋放製劑可以包括呈成型製品（例如膜或微膠囊）形式的半透性聚合物基質。持續釋放基質可以包括聚酯、水凝膠、聚丙交酯（如美國專利案號3,773,919和歐洲專利申請公開案號EP 058481中所揭露）、L-麩胺酸和γ-L-麩胺酸乙酯的共聚物（Sidman等人, 1983, Biopolymers [生物聚合物] 2:547-556）、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)（Langer等人, 1981, J. Biomed. Mater. Res. [生物醫學材料研究雜誌] 15:167-277和Langer, 1982, Chem. Tech. [化學技術] 12:98-105）、乙烯乙酸乙烯酯（Langer等人, 1981, 同上）或聚-D(-)-3-羥基丁酸（歐洲專利申請公開案號EP 133,988）。持續釋放組成物還可以包括可以藉由本領域中已知的若干種方法中的任一種製備的脂質體。參見，例如Eppstein等人, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 82:3688-3692；歐洲專利申請公開案號EP 036,676、EP 088,046和EP 143,949。
也可以將抗體構建體包埋在例如藉由凝聚技術或藉由介面聚合製備的微膠囊（例如分別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊）中，包埋在膠體藥物遞送系統（例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒和奈米膠囊）中或包埋在粗滴乳狀液中。此類技術揭露於Remington's Pharmaceutical Sciences [雷明登氏藥學全書], 第16版, Oslo, A.編輯, (1980)中。
用於體內給予的藥物組成物典型地作為無菌製劑提供。滅菌可以通過無菌濾膜過濾完成。當組成物凍乾時，可以在凍乾和重構之前或之後進行使用該方法的滅菌。用於腸胃外給予的組成物可以以凍乾形式或於溶液中儲存。通常將腸胃外組成物置入具有無菌輸液港的容器（例如具有可由皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶）中。
本發明的另一方面包括自緩衝的本發明抗體構建體配製物，這些配製物可用作藥物組成物，如國際專利申請WO 06138181A2（PCT/US2006/022599）中所述。在這方面有用的蛋白質穩定和配製物質和方法，可以獲得各種各樣的說明，諸如Arakawa等人, “Solvent interactions in pharmaceutical formulations [藥物配製物中的溶劑相互作用],” Pharm Res. [藥物研究] 8(3): 285-91 (1991)；Kendrick等人, “Physical stabilization of proteins in aqueous solution [水性溶液中蛋白質的物理穩定化]” 在RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE [穩定蛋白質配製物的合理設計：理論與實踐]中, Carpenter和Manning編輯 Pharmaceutical Biotechnology [藥物生物技術] 13: 61-84 (2002)和Randolph等人, “Surfactant-protein interactions [表面活性劑-蛋白質相互作用]”, Pharm Biotechnol. [藥物生物技術] 13: 159-75 (2002)，特別參見關於根據本發明的自緩衝蛋白質配製物的相關賦形劑和方法的相關部分，尤其是關於用於獸醫和/或人醫學用途的蛋白質藥物產品和方法。
根據本發明的某些實施方式，可以使用鹽以例如調整配製物的離子強度和/或等滲性和/或改善根據本發明的組成物的蛋白質或其他成分的溶解度和/或物理穩定性。眾所周知，離子可以藉由與蛋白質表面上的帶電荷的殘基結合並藉由遮罩蛋白質中的帶電荷基團和極性基團並降低其靜電相互作用、吸引和排斥相互作用的強度來穩定蛋白質的天然狀態。離子還可以藉由特別地與蛋白質的變性肽鍵（--CONH）結合來穩定蛋白質的變性狀態。此外，與蛋白質中的帶電荷基團和極性基團的離子相互作用還可以減少分子間靜電相互作用，並且從而防止或減少蛋白質聚集和不溶解。
離子物種對蛋白質的作用顯著不同。已經開發了多種對可用於配製根據本發明的藥物組成物的離子及其對蛋白質的作用的分類評級。一個實例係Hofmeister系列，該系列藉由對溶液中蛋白質的構象穩定性的作用來對離子和極性非離子溶質進行評級。穩定溶質稱為“親液的”。不穩定溶質稱為“離液的”。通常使用高濃度的親液劑（例如，＞1莫耳硫酸銨）以從溶液中沈澱蛋白質（“鹽析”）。通常使用離液劑來使蛋白質變性和/或溶解（“鹽溶”）。離子對“鹽溶”和“鹽析”的相對有效性限定了其在Hofmeister系列中的位置。
根據本發明的各種實施方式，游離胺基酸可用於本發明抗體構建體配製物中以作為增積劑、穩定劑和抗氧化劑以及其他標準用途。賴胺酸、脯胺酸、絲胺酸和丙胺酸可用於穩定配製物中的蛋白質。甘胺酸可用於凍乾以確保正確的餅結構和特性。在液體配製物和凍乾配製物兩者中，精胺酸均可用於抑制蛋白質聚集。蛋胺酸可用作抗氧化劑。
多元醇包括糖，例如甘露醇、蔗糖和山梨醇以及多元醇，諸如例如甘油和丙二醇，並且出於本文論述的目的，包括聚乙二醇（PEG）和相關物質。多元醇係親液的。它們係液體配製物和凍乾配製物兩者中有用的穩定劑，以保護蛋白質免受物理和化學降解過程的影響。多元醇也可用於調整配製物的張力。在本發明的選擇實施方式中有用的多元醇係甘露醇，甘露醇通常用於確保在凍乾配製物中餅的結構穩定性。它確保了餅的結構穩定性。它通常與凍乾保護劑（例如蔗糖）一起使用。山梨醇和蔗糖係用於調整張力且作為穩定劑以防止在運輸過程中的冷凍-解凍應力或防止在製造過程中製備團塊的較佳的試劑。還原糖（含有游離醛或酮基團），諸如葡萄糖和乳糖，可以使表面賴胺酸和精胺酸殘基糖基化。因此，它們通常不是根據本發明使用的較佳的是多元醇。此外，在這方面，形成此類反應性物質的糖也不是本發明較佳的多元醇，該糖諸如蔗糖，蔗糖在酸性條件下水解為果糖和葡萄糖並因此產生糖基化。PEG可用於穩定蛋白質並用作冷凍保護劑，並且在這方面可以用於本發明。
本發明抗體構建體配製物的實施方式進一步包含表面活性劑。蛋白質分子可易於吸附在表面上，並且變性以及隨後在空氣-液體、固體-液體和液體-液體介面處聚集。這些效應通常與蛋白質濃度成反比。這些有害的相互作用通常與蛋白質濃度成反比，並且典型地因物理振盪（諸如在產品運輸和處理過程中產生的物理振盪）而加劇。常規使用表面活性劑來防止、最小化或減少表面吸附。在這方面，本發明中有用的表面活性劑包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脫水山梨醇聚乙氧基化物的其他脂肪酸酯、以及泊洛沙姆188。表面活性劑也常用於控制蛋白質構象穩定性。在這方面使用表面活性劑係蛋白質特異性的，因為任何給定的表面活性劑典型地會穩定一些蛋白質並使其他蛋白質不穩定。
聚山梨醇酯易於氧化降解，並且通常在應時含有足夠量的過氧化物以引起蛋白質殘基側鏈、尤其是甲硫胺酸的氧化。因此，應謹慎使用聚山梨醇酯，並且在使用時應以其最低有效濃度採用。在這方面，聚山梨醇酯例示了賦形劑應以其最低有效濃度使用的一般規則。
本發明抗體構建體配製物的實施方式進一步包含一種或多種抗氧化劑。藉由保持適當水平的環境氧氣和溫度並避免暴露於光下，可以在某種程度上防止藥物配製物中蛋白質的有害氧化。也可以使用抗氧化賦形劑來防止蛋白質的氧化降解。在這方面，有用的抗氧化劑係還原劑、氧/自由基清除劑和螯合劑。用於根據本發明的治療性蛋白質配製物中的抗氧化劑較佳的是水溶性的並且在整個產品的儲存壽命內保持其活性。在這方面，EDTA係根據本發明的較佳的抗氧化劑。抗氧化劑可以破壞蛋白質。例如，還原劑，諸如特別是谷胱甘肽，可以破壞分子內二硫鍵。因此，用於本發明的抗氧化劑尤其被選擇用於消除或足夠降低其本身破壞配製物中的蛋白質的可能性。
根據本發明的配製物可以包含金屬離子，這些金屬離子係蛋白質輔助因子並且是形成蛋白質配位錯合物所必需的，諸如形成某些胰島素懸浮液所必需的鋅。金屬離子也可以抑制一些降解蛋白質的過程。然而，金屬離子也催化降解蛋白質的物理和化學過程。鎂離子（10-120 mM）可用於抑制天冬胺酸異構化為異天冬胺酸。Ca+2 離子（高達100 mM）可以增加人去氧核糖核酸酶的穩定性。然而，Mg+2 、Mn+2 和Zn+2 可以使重組人類去氧核糖核酸酶（rhDNase）不穩定。類似地，Ca+2 和Sr+2 可以穩定因子VIII，它可以被Mg+2 、Mn+2 和Zn+2 、Cu+2 和Fe+2 去穩定，並且其聚集可以由Al+3 離子增加。
本發明抗體構建體配製物的實施方式進一步包含一種或多種防腐劑。當開發涉及從同一容器提取超過一次的多劑量腸胃外配製物時，防腐劑係必需的。其主要功能是抑制微生物生長並確保在藥物產品的整個儲放壽命或使用期限內的產品無菌性。常用的防腐劑包括苯甲醇、苯酚和間甲酚。儘管防腐劑在小分子腸胃外使用方面有著悠久的歷史，但包含防腐劑的蛋白質配製物的開發可能具有挑戰性。防腐劑幾乎總是對蛋白質具有不穩定效應（聚集），並且這已成為限制其在多劑量蛋白質製劑中使用的主要因素。迄今為止，大部分蛋白質藥物僅配製用於一次性使用。然而，當多劑量配製物係可能時，它們具有使患者方便的附加優勢和增加的可銷售性。一個良好的實例係人生長激素（hGH），其中防腐配製物的開發已經導致更方便、多次使用的注射筆展示的商業化。至少四種含有hGH的防腐配製物的此類筆裝置目前可在市場上獲得。Norditropin（液體，諾和諾德公司（Novo Nordisk））、Nutropin AQ（液體，基因泰克公司（Genentech））和Genotropin（凍乾的--雙室藥筒，法瑪西亞普強公司（Pharmacia & Upjohn））含有苯酚，而Somatrope（禮來公司（Eli Lilly））用間-甲酚進行配製。在防腐劑型的配製和開發期間需要考慮若干個方面。必須優化藥物產品中有效的防腐劑濃度。這需要以賦予抗微生物有效性而不損害蛋白質穩定性的濃度範圍測試劑型中給定的防腐劑。
正如可以預期的那樣，含有防腐劑的液體配製物的開發比凍乾配製物更具挑戰性。冷凍乾燥的產品可以在沒有防腐劑的情況下凍乾，並且在使用時用含有防腐劑的稀釋劑重構。這縮短了防腐劑與蛋白質接觸的時間，從而顯著最小化相關的穩定性風險。在液體配製物的情況下，應在整個產品儲放壽命（約18至24個月）內保持防腐劑有效性和穩定性。要指出的重要點係，防腐劑有效性應在含有活性藥物和所有賦形劑組分的最終配製物中得到證實。
本文揭露的抗體構建體也可以配製為免疫脂質體。“脂質體”係由各種類型的脂質、磷脂和/或表面活性劑構成的小囊泡，該小囊泡可用於將藥物遞送至哺乳動物。脂質體的組分通常是以雙層形式安排的，類似於生物膜的脂質安排。含有抗體構建體的脂質體係藉由本領域已知的方法製備，諸如Epstein等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 82: 3688 (1985)；Hwang等人 , Proc. Natl Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 77: 4030 (1980)；美國專利案號4,485,045和4,544,545；以及W0 97/38731中所述。具有延長的循環時間的脂質體揭露於美國專利案號5,013,556中。特別有用的脂質體可以藉由反相蒸發方法用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG衍生化磷脂醯乙醇胺（PEG-PE）的脂質組成物產生。使脂質體擠出通過具有限定孔徑的濾器以產生具有所希望的直徑的脂質體。本發明的抗體構建體的Fab’片段可以與脂質體經由二硫鍵交換反應軛合，如Martin等人 J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 257: 286-288 (1982)中所述。化學治療劑視需要包含在脂質體內。參見Gabizon等人 J. National Cancer Inst. [國家癌症研究所雜誌] 81 (19) 1484 (1989)。
一旦配製了藥物組成物，可以將它作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體或作為脫水或凍乾粉末儲存在無菌小瓶中。此類配製物可以以即用形式或以在給予前重構的形式（例如凍乾形式）儲存。
本文定義的藥物組成物的生物活性可以例如藉由細胞毒性測定來確定，如在以下實例、WO 99/54440中或由Schlereth等人（Cancer Immunol. Immunother. [癌症免疫學免疫治療] 20 (2005), 1-12）所述的。如本文使用的，“功效”或“體內功效”係指使用例如標準化NCI應答標準對本發明的藥物組成物治療的應答。使用本發明的藥物組成物的療法的成功或體內功效係指組成物對於其預期用途的有效性，即組成物引起其所希望效應，即耗盡病理細胞（例如腫瘤細胞）的能力。體內功效可以藉由已建立的對應疾病實體的標準方法進行監測，這些方法包括但不限於白細胞計數、差異、螢光激活細胞分選法、骨髓抽吸。另外，可以使用各種疾病特異性臨床化學參數和其他建立的標準方法。此外，可以使用電腦輔助斷層攝影術、X射線、核磁共振斷層攝影術（例如，用於基於國家癌症研究所標準的應答評估[Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas [標準化非霍奇金淋巴瘤應答標準的國際研討會報告]. NCI Sponsored International Working Group [NCI資助的國際工作組]. J Clin Oncol. [臨床腫瘤學雜誌] 1999年4月;17(4):1244]）、正電子發射斷層攝影術掃描、白細胞計數、差異、螢光激活細胞分選法、骨髓抽吸、淋巴結活組織檢查/組織學和各種淋巴瘤特異性臨床化學參數（例如乳酸鹽脫氫酶）和其他已建立的標準方法。
開發藥物（諸如本發明的藥物組成物）的另一主要挑戰係藥物動力學特性的可預測調節。為此，可以建立候選藥物的藥物動力學曲線，即影響特定藥物治療給定病狀的能力的藥物動力學參數的曲線。影響藥物治療某一疾病實體的能力的藥物的動力學參數包括但不限於：半衰期、分佈體積、肝臟首過代謝和血清結合的程度。給定藥物劑的功效可以受到上文提及的每個參數的影響。本發明的抗體構建體的設想特徵提供有它們包含的特定FC模式，例如藥物動力學行為的差異。根據本發明的半衰期延長的靶向抗體構建體與所述抗體構建體的“規範的”非HLE型式相比較佳的是顯示體內滯留時間令人驚訝地增加。
“半衰期”意指藉由生物過程（例如代謝、排泄等）消除50%的給予藥物的時間。“肝臟首過代謝”意指藥物在首次與肝臟接觸時，即在首次通過肝臟期間代謝的傾向。“分佈體積”意指藥物在身體各個隔室（例如細胞內和細胞外空間、組織和器官等）中的滯留程度，以及藥物在這些隔室內的分佈。“血清結合程度”意指藥物與血清蛋白（諸如白蛋白）相互作用並結合從而導致藥物生物活性降低或喪失的傾向。
藥物動力學參數還包括對於給予的給定量藥物的生體可用率、滯後時間（T滯後）、Tmax、吸收速率、起效時間和/或Cmax。“生體可用率”意指血液隔室中藥物的量。“滯後時間”意指藥物給予與其在血液或血漿中的檢測和可測量性之間的時間延遲。“Tmax”係藥物達到最大血液濃度之後的時間，並且“Cmax”係用給定藥物最大獲得的血液濃度。達到其生物效應所需的藥物的血液或組織濃度的時間受到所有參數的影響。表現出跨物種特異性的雙特異性抗體構建體的藥物動力學參數（其可以在如上所概述的非黑猩猩靈長類動物的臨床前動物測試中確定）也示於例如Schlereth等人（Cancer Immunol. Immunother. [癌症免疫學免疫治療] 20 (2005), 1-12）中。
在本發明的較佳的方面，藥物組成物在約-20°C下穩定至少四週。從附加實施方式中明顯的，本發明的抗體構建體的品質相對於相應先前技術抗體構建體的品質可以使用不同的系統進行測試。這些測試被理解為符合“ICH Harmonised Tripartite Guideline:Stability Testing of Biotechnological/Biological Products Q5C andSpecifications: Test procedures and Acceptance Criteria for Biotech Biotechnological/Biological Products Q6B [ICH三方協調指南：生物技術/生物產品的穩定性測試Q5C 和規格：生物技術/生物產品的測試程序和驗收準則Q6B ]”，並且因此被選擇以提供穩定性指示曲線，從而確定檢測到產品的屬性、純度和效力的變化。人們普遍接受術語純度係相對術語。由於糖基化、脫醯胺或其他異質性的效應，生物技術/生物產品的絕對純度典型地應藉由超過一種的方法進行評估，並且所導出的純度值取決於方法。出於穩定性測試的目的，純度測試應集中在確定降解產物的方法上。
為了評估包含本發明的抗體構建體的藥物組成物的品質，可以例如藉由分析溶液中可溶性聚集物的含量（根據尺寸排除的HMWS）來分析。較佳的是，在約-20°C下穩定至少四週的特徵在於小於1.5% HMWS、較佳的是小於1% HMWS的含量。
作為藥物組成物的抗體構建體的較佳的配製物可以例如包含如下所述的配製物的組分：
• 配製物：
磷酸鉀、L-精胺酸鹽酸鹽、海藻糖二水合物、聚山梨醇酯80，在pH 6.0下
在所附實例4-12中提供了用於評估呈藥物組成物形式的本發明的抗體構建體的穩定性的其他實例。在那些實例中，關於不同藥物配製物中的不同應力條件測試本發明的抗體構建體的實施方式，並且將結果與本領域已知的雙特異性T細胞接合抗體構建體的其他半衰期延長（HLE）形式進行比較。一般來講，設想與具有不同HLE形式和不具有任何HLE形式的抗體構建體（即“規範的”抗體構建體）相比，根據本發明的提供有特定FC模式的抗體構建體在寬範圍的應力條件（諸如溫度和光應力）下典型地更穩定。所述溫度穩定性可以涉及降低的溫度（低於室溫，包括冷凍）和升高的溫度（高於室溫，包括高達或高於體溫的溫度）兩者。正如熟悉該項技術者將會認識到，在臨床實踐中難以避免的這種關於應力的改善穩定性使得抗體構建體更安全，這係因為在臨床實踐中會出現較少的降解產物。結果，所述增加的穩定性意味著安全性增加。
一個實施方式提供了本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體，用於在與MUC17表現或MUC17過表現相關的癌症，諸如前列腺癌的預防、治療或緩解中使用。
本文所述的配製物可作為藥物組成物用於在有需要的患者中治療、緩解和/或預防如本文所述的病理醫學病狀。術語“治療”係指治療性治療和預防性（prophylactic或preventative）措施兩者。治療包括將配製物施用或給予至患有疾病/病症、具有疾病/病症的症狀或具有患疾病/病症的傾向的患者的體內、分離的組織或細胞，目的是治癒、痊癒、緩和、減輕、改變、補救、緩解、改善或影響該疾病、該疾病症狀或患該疾病的傾向。
如本文使用的，術語“緩解”係指藉由將根據本發明的抗體構建體給予至有需要的受試者而對具有如下文所指定的疾病的患者的疾病狀態的任何改善。這種改善也可以看作係患者疾病進展的減慢或停止。如本文使用的，術語“預防”意指藉由將本發明的抗體構建體給予至有需要的受試者來避免患有如下文所指定的腫瘤或癌症或轉移性癌症的患者發生或復發。
術語“疾病”係指將受益於用本文所述的抗體構建體或藥物組成物治療的任何病狀。這包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳動物易患所考慮疾病的病理狀況。
“贅生物”係組織的異常生長，通常但不總是形成腫塊。當也形成腫塊時，通常稱之為“腫瘤”。贅生物或腫瘤可以是良性的、潛在惡性的（癌前）、或惡性的。惡性贅生物通常稱為癌症。它們通常侵入並破壞周圍組織，並可能形成轉移，即它們擴散到身體的其他部位、組織或器官。因此，術語“轉移性癌症”涵蓋轉移到原始腫瘤的組織或器官除外的其他組織或器官。淋巴瘤和白血病係淋巴贅生物。出於本發明的目的，它們也被術語“腫瘤”或“癌症”涵蓋。
術語“病毒性疾病”描述了作為受試者病毒感染的結果的疾病。
如本文使用的，術語“免疫學病症”描述了符合這個術語的常見定義的免疫學病症，諸如自體免疫疾病、超敏反應、免疫缺陷。
在一個實施方式中，本發明提供了一種用於治療或緩解與MUC17表現或MUC17過表現相關的癌症之方法，該方法包括向有需要的受試者給予本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體的步驟。MUC17xCD3雙特異性單鏈抗體對於癌症、較佳的是實體腫瘤、更較佳的是癌和前列腺癌的療法特別有利。
術語“有需要的受試者”或“需要治療的那些”包括已經患有病症的那些以及有待預防病症的那些。有需要的受試者或“患者”包括接受預防性或治療性治療的人和其他哺乳動物受試者。
本發明的抗體構建體通常將針對特定給予途徑和方法、特定給予劑量和頻率、特定疾病的特定治療、生體可用率和持久性範圍等來設計。組成物的物質較佳的是以對於給予位點可接受的濃度配製。
因此可以根據本發明設計配製物和組成物以藉由任何合適的給予途徑遞送。在本發明的背景下，給予途徑包括但不限於
• 局部途徑（諸如表皮、吸入、鼻、眼、耳（auricular/aural）、陰道、黏膜）；
• 腸內途徑（諸如口服、胃腸道、舌下、唇下部、經頰、直腸）；以及
• 腸胃外途徑（諸如靜脈內、動脈內、骨內、肌內、腦內、腦室內、硬膜外、鞘內、皮下、腹膜內、羊膜外、關節內、心內、真皮內、病灶內、子宮內、膀胱內、玻璃體內、經皮、鼻內、經黏膜、滑膜內、管腔內）。
本發明的藥物組成物和抗體構建體特別可用於腸胃外給予，例如皮下或靜脈內遞送，例如藉由注射諸如快速濃注，或藉由輸注諸如連續輸注。藥物組成物可以使用醫療裝置來給予。用於給予藥物組成物的醫療裝置的實例描述於美國專利案號4,475,196、4,439,196、4,447,224、4,447,233、4,486,194、4,487,603、4,596,556、4,790,824、4,941,880、5,064,413、5,312,335、5,312,335、5,383,851和5,399,163中。
特別地，本發明提供了合適的組成物的不間斷給予。作為非限制性實例，可以藉由患者佩戴的用於計量治療劑進入患者體內的流入的小型泵系統來實現不間斷或實質上不間斷（即連續）的給予。包含本發明的抗體構建體的藥物組成物可以藉由使用所述泵系統給予。此類泵系統在本領域中通常是已知的，並且通常依賴於含有待輸注的治療劑的藥筒的定期更換。當更換這種泵系統中的藥筒時，可能導致原本不間斷地流入患者體內的治療劑的暫時中斷。在這種情況下，藥筒替換之前的給予階段和藥筒替換之後的給予階段仍將被認為在藥物手段的含義內，並且本發明的方法一起構成這種治療劑的一次“不間斷給予”。
本發明的抗體構建體的連續或不間斷給予可以藉由流體遞送裝置或小型泵系統進行靜脈內或皮下給予，該流體遞送裝置或小型泵系統包括用於將流體驅出儲器的流體驅動機構和用於致動驅動機構的致動機構。用於皮下給予的泵系統可以包括用於穿透患者皮膚並將合適的組成物遞送到患者體內的針或套管。所述泵系統可以獨立於靜脈、動脈或血管而直接固定或連接到患者皮膚，從而允許泵系統與患者皮膚直接接觸。泵系統可以連接到患者皮膚上24小時至數天。泵系統可能尺寸較小，具有小容積的儲器。作為非限制性實例，待給予的合適的藥物組成物的儲器容積可以在0.1與50 ml之間。
連續給予也可以藉由佩戴在皮膚上的貼片經皮給予，並且以一定間隔進行更換。熟悉該項技術者知道適用於該目的的用於藥物遞送的貼片系統。值得注意的是，經皮給予尤其適合於不間斷給予，因為第一用盡的貼片的更換可以有利地與在將新的第二貼片放置在例如緊鄰第一用盡的貼片的皮膚表面上的同時並在即將移除第一耗盡的貼片之前來完成。不會出現流動中斷或電池故障的問題。
如果藥物組成物已被凍乾，則在給予之前首先將凍乾物質在適當液體中重構。可以將凍乾物質在例如抑菌注射用水（BWFI）、生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）或與冷凍乾燥前蛋白質所處於的相同配製物中重構。
本發明的組成物可以合適的劑量給予至受試者，該劑量可以例如藉由向非黑猩猩靈長類動物（例如獼猴）給予增加劑量的表現出本文所述的種間特異性的本發明的抗體構建體藉由劑量遞增研究來測定。如上所述，表現出本文所述的種間特異性的本發明的抗體構建體可以有利地以相同形式用於非黑猩猩靈長類動物的臨床前測試並且作為藥物用於人類中。劑量方案將由主治醫師和臨床因素決定。如在醫學領域中熟知的，任何一個患者的劑量取決於許多因素，包括患者體型、體表面積、年齡、有待給予的具體化合物、性別、給予時間和途徑、一般健康狀況和同時給予的其他藥物。
術語“有效劑量（effective dose或effective dosage）”定義為足以實現或至少部分實現所希望效應的量。術語“治療有效劑量”定義為足以治癒或至少部分阻止已罹患疾病的患者的疾病及其併發症的量。對此用途有效的量或劑量將取決於有待治療的病狀（適應症）、遞送的抗體構建體、治療背景和目標、疾病的嚴重程度、先前療法、患者的臨床病史和對治療劑的應答、給予途徑、患者的體型（體重、體表或器官大小）和/或病狀（年齡和一般健康狀況）以及患者自體免疫系統的一般狀態。可以根據主治醫生的判斷調整適當的劑量，以使得它可以一次給予至患者或經一系列給予而給予至患者，並且以便獲得最佳治療效應。
根據上文提及的因素，典型的劑量範圍可以為從約0.1 μg/kg至高達約30 mg/kg或更多。在具體的實施方式中，劑量範圍可以為從1.0 μg/kg至約20 mg/kg、視需要從10 μg/kg至約10 mg/kg或從100 μg/kg至約5 mg/kg。
本發明的抗體構建體的治療有效量較佳的是導致疾病症狀嚴重程度降低、無疾病症狀期的頻率或持續時間增加或預防由於疾病折磨而產生的損害或殘疾。為了治療如上所述的與MUC17表現相關的疾病，治療有效量的本發明的抗體構建體（此處：抗MUC17/抗CD3抗體構建體）相對於未治療的患者較佳的是抑制細胞生長或腫瘤生長達至少約20%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。可以在預測功效的動物模型中評價化合物抑制腫瘤生長的能力。
藥物組成物可以作為單獨的治療劑或與額外的療法（諸如視需要的抗癌療法，例如其他蛋白質和非蛋白質藥物）組合給予。這些藥物可以與包含如本文定義的本發明的抗體構建體的組成物同時給予，或者在給予所述抗體構建體之前或之後以時間限定間隔和劑量分開給予。
如本文使用的，術語“有效且無毒的劑量”係指本發明抗體構建體的可耐受劑量，該可耐受劑量足夠高以引起病理性細胞消耗、腫瘤消除、腫瘤縮小或疾病穩定，而沒有或基本上沒有主要毒性效應。這種有效且無毒的劑量可以例如藉由本領域中描述的劑量遞增研究來測定，並且應低於誘導嚴重不利副作用的劑量（劑量限制毒性，DLT）。
如本文使用的，術語“毒性”係指在不良事件或嚴重不良事件中表現的藥物的毒性效應。這些副作用可能是指給予後對藥物缺乏全身性耐受性和/或缺乏局部耐受性。毒性還可能包括由藥物引起的致畸或致癌效應。
如本文使用的，術語“安全性”、“體內安全性”或“耐受性”定義了藥物的給予而在給予後未立即誘導嚴重不良事件（局部耐受性）以及在藥物的較長施用時段期間未誘導嚴重不良事件。例如，可以在治療和隨訪期期間以有規律的間隔評價“安全性”、“體內安全性”或“耐受性”。測量包括臨床評價，例如器官表現，以及實驗室異常的篩選。可以進行臨床評價，並且根據NCI-CTC和/或MedDRA標準記錄/編碼與正常發現的偏差。器官表現可以包括諸如過敏/免疫學、血液/骨髓、心律失常、凝血等的標準，如例如不良事件的通用術語標準v3.0（CTCAE）中所述的。可以測試的實驗室參數包括例如血液學、臨床化學、凝血曲線和尿液分析以及其他體液（諸如血清、血漿、淋巴或脊髓液、液體等）的檢查。因此安全性可以藉由例如身體檢查、成像技術（即超音波、x射線、CT掃描、磁共振成像（MRI）、其他具有技術裝置的措施（即心電圖術））、生命體征、藉由測量實驗室參數和記錄不良事件來評估。例如，根據本發明的用途和方法中非黑猩猩靈長類動物中的不良事件可以藉由組織病理學和/或組織化學方法進行檢查。
上述術語也在以下中提及：例如Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6 [生物技術衍生藥物的臨床前安全性評價S6]；ICH Harmonised Tripartite Guideline [ICH三方協調指南]；ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997 [1997年7月16日的ICH指導委員會會議]。
最後，本發明提供了一種套組，該套組包含本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體、本發明的藥物組成物、本發明的多核苷酸、本發明的載體和/或本發明的宿主細胞。
在本發明的背景下，術語“套組”意指兩種或更多種組分（其中一種對應於本發明的抗體構建體、藥物組成物、載體或宿主細胞）一起包裝在容器、接受器或其他中。因此，套組可以被描述為足以實現某一目標的一組產品和/或器具，其可以作為單一單元銷售。
套組可以包括一個或多個具有任何適當形狀、大小和材料（較佳的是防水的，例如塑膠或玻璃）的接受器（諸如小瓶、安瓿、容器、注射器、小瓶、袋），該一個或多個接收器含有適於給予的劑量的本發明的抗體構建體或藥物組成物（參見上文）。套組可以另外含有使用說明（例如呈小冊子或說明手冊的形式）、用於給予本發明的抗體構建體的手段（諸如注射器、泵、輸注器等）、用於重構本發明的抗體構建體的手段和/或用於稀釋本發明的抗體構建體的手段。
本發明還提供了用於單劑量給予單元的套組。本發明的套組還可以含有包含乾燥/凍乾的抗體構建體的第一接受器和包含水性配製物的第二接受器。在本發明的某些實施方式中，提供了含有單室和多室預填充注射器（例如液體注射器和凍乾注射器）的套組。
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應指出的是，除非上下文另有明確指明，否則單數形式“一種（a）”、“一種（an）”和以及“該”包括複數個指示物。因此，例如，對“一種試劑”的提及包括此類不同試劑中的一種或多種，並且對“該方法”的提及包括提及熟悉該項技術者已知的可以修改或取代本文所述的方法的等效步驟和方法。
除非另外指明，否則在一系列元素前面的術語“至少”應被理解為指該系列中的每一個元素。熟悉該項技術者僅使用常規實驗就將認識到或能夠確定本文所述的本發明的具體實施方式的許多等效物。此類等效物旨在由本發明所涵蓋。
術語“和/或”在本文使用時包括“和”、“或”和“由所述術語連接的要素的全部或任何其他組合”的含義。
如本文使用的，術語“約”或“大約”意指在給定值或範圍的20%內、較佳的是在10%內，並且更較佳的是在5%內。然而，它也包括明確數字，例如約20包括20。
術語“小於”或“大於”包括明確數字。例如，小於20意指小於或等於。類似地，多於或大於分別意指多於或等於、或大於或等於。
貫穿本說明書及其後的申請專利範圍，除非上下文另有要求，否則字詞“包含（comprise）”以及變型諸如“包含（comprises）”或“包含（comprising）”應當被理解成隱含包括所陳述的整體或步驟或者整體或步驟的組，但不排除任何其他整體或步驟或者整體或步驟的組。當在本文中使用時，術語“包含（comprising）”可以用術語“含有”或“包括（including）”來取代，或者有時在本文中使用時用術語“具有”取代。
如本文使用的“由......組成”排除了在申請專利範圍要素中未指定的任何要素、步驟或成分。如本文使用的，“基本上由......組成”並不排除不實質性地影響申請專利範圍的基本和新穎特徵的材料或步驟。
在本文的每種情況下，術語“包含”、“基本上由......組成”和“由......組成”中的任一者都可以用另外兩個術語中的任一者來替環。
應理解，本發明不限於本文所述的特定方法、方案、材料、試劑和物質等，並且因此可以變化。本文使用的術語僅用於描述特定實施方式的目的，而不打算限制僅由申請專利範圍限定的本發明的範圍。
本說明書全文中引用的所有出版物和專利（包括所有專利、專利申請、科學出版物、製造商的說明書、說明書等），無論是上文還是下文，均據此藉由引用整體併入。本文沒有任何內容應解釋為承認本發明無權由於先前發明而早於這些揭露內容。藉由引用併入的材料在一定程度上與本說明書發生衝突或不一致時，本說明書將替代任何此類材料。
將從以下實例中獲得對本發明及其優點的更好理解，這些實例僅用於說明目的。這些實例並不打算以任何方式限制本發明的範圍。
實例
實例1：對MUC17細胞表面表現的評價。
使用QIFIkit（達科公司（Dako））藉由流式細胞術測定MUC17的細胞表面水平。使用非酶促細胞解離緩衝液（Cellstripper，康寧公司（Corning））提取貼壁細胞，並且然後用抗MUC17抗體4C11染色。4C11抗體係用包含MUC17的EGF-SEA-EGF區（aa 4131-4493）的DNA構建體免疫B6小鼠而產生的單株抗體。藉由與軛合至FITC的二抗一起孵育並藉由流式細胞術分析來檢測MUC17。使用套組中提供的珠粒樣品作為標準品，藉由QIFIkit（達科公司）測定相對抗體結合能力。將結果繪示於圖3(A)中。癌細胞系中的MUC17基因表現水平藉由定量聚合酶鏈式反應（qPCR）使用來自應用生物系統公司（Applied Biosystems）/賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher）的方法和探針測定。從癌細胞系中分離RNA，並且然後轉錄至cDNA。使用qPCR，用MUC17特異性探針擴增MUC17 cDNA。將MUC17的基因表現水平標準化為組成型表現基因的基因表現水平並且繪示於圖3(B)中。
實例2：對MUC17雙特異性抗體構建體體外功效的評價
在T細胞依賴性細胞毒性（TDCC）測定中評價MUC17 HLE抗體構建體的細胞活性。效應細胞獲得自商業來源，諸如澳賽爾斯公司（AllCells）或Cepheus Biosciences有限公司。在一定劑量範圍的抗體構建體存在下將人pan-T細胞、人PBMC或來自食蟹猴的PBMC以10 : 1或5 : 1與表現人或食蟹猴MUC17的靶細胞一起溫育。孵育48 h後，使用發光測定（Cell T-glo或Steady-glo（普洛麥格公司（Promega）））或高內涵成像（Cellomics ArrayScan）作為細胞的細胞毒性的讀取來評估細胞的細胞毒性。將結果繪示於圖4和圖5中。
實例3：用於評價MUC17雙特異性抗體構建體的體內功效的異種移植研究
異種移植物研究的目的是在雌性NOD/SCID小鼠中的人胃癌的晚期皮下GSU-luc異種移植模型中評估半衰期延長的MUC17/CD3雙特異性抗體構建體靜脈內給予後的抗腫瘤活性。
用於接種的靶細胞和效應細胞的製備
靶細胞：
將用載體LV417-Luc慢病毒轉導以穩定表現螢火蟲螢光素酶（GSU-luc）的人胃癌細胞GSU收穫、離心、用冷DPBS洗滌、計數並調整至5×107 個細胞/mL的濃度。將總共5×106 個細胞/小鼠皮下（SC）注射到雌性NOD/SCID小鼠（供應商：Envigo公司）的右背側中，最終體積為100 μL。
效應細胞：
從健康供體（＃0801）的新鮮血液中分離人T細胞，使用Pan T細胞分離套組（＃130-096-535）針對CD3+ T細胞進行富集，並且使用人T細胞激活/擴增套組（#130-091-441，兩者均為美天旎公司（Miltenyi Biotec））根據製造商的說明書進行體外激活和擴增。
在注射當天，對T細胞進行計數、從珠粒分離並用冷DPBS洗滌2次。將細胞數調整至1 × 108 個細胞/mL並儲存在冰上直至注射。將總共2 × 107 個細胞/小鼠注射到腹膜腔（IP）中，最終體積為200 μL。在注射之前將細胞儲存在冰上。實驗設計
藉由靜脈內（IV）快速濃注（進入尾靜脈）使動物接受MUC17雙特異性抗體構建體或對照項。根據表4治療小鼠。
[表4] 研究設計 功效研究


研究順序：
第1天：將腫瘤細胞（GSU-luc）皮下注射到雌性NOD/Scid小鼠的右側背側中（參見上文）。研究開始時動物為6週齡。
第7天：抗唾液酸治療。
為了耗盡剩餘的NK細胞/NK細胞活性，用單劑量的多株（兔抗小鼠）抗脫唾液酸GM1抗體治療小鼠。根據製造商的說明書重構抗脫唾液酸GM1抗體，並且將50 μl用蒸餾H2 O的1 : 2.5稀釋液IV注射到側尾靜脈中。
第8天：將CD3+ T細胞注射到小鼠的腹膜腔中（參見上文）。
第11、18和25天：FcR阻斷。
使測試項的Fc區突變以防止與Fcγ-受體結合。然而，由於NOD/Scid小鼠缺乏B細胞，導致免疫球蛋白水平低，因此進行FcR阻斷以避免抗體依賴性細胞介導的細胞毒性導致CD3+ 效應細胞的潛在減少。在第11、18和25天，藉由腹膜內快速濃注使小鼠接受2.4G2抗FcγR抗體（8 mg/kg）和Kiovig（400 mg/kg）的混合物，每次注射每隻小鼠最終體積為200 μl。
第12、19和26天：用測試項或對照項治療（參見表4）。
根據表4，在第12、19和26天藉由靜脈內（IV）快速濃注到側尾靜脈中使動物接受測試項（MUC17/CD3雙特異性抗體構建體）或對照項（媒介物）。每次注射，將劑量體積保持恒定至每隻小鼠總共100 μl。
將測試項以1.04 mg/ml的原液濃度配製在10 mM L-麩胺酸、9%（w/v）蔗糖、0.01%（w/v）PS80；pH 4.2中，並且根據最近確定的組平均體重（BW）在媒介物（在0.9%（w/v）氯化鈉pH 7.0中的25 mM L-賴胺酸單鹽酸鹽、0.002%（w/v）聚山梨醇酯80）中稀釋。劑量濃度（c）使用下式計算：

第33天：研究結束
實驗研究和計算。
在研究過程中，每天觀察所有動物的一般外觀、活動、行為和存活。所有發現和評論均在研究文件的相應表格中注明。在整個研究過程中每週測定體重3次。藉由使用外部卡尺測量腫瘤高度和寬度來確定腫瘤生長的進展。每週測定腫瘤生長3次並且使用下式計算腫瘤體積（TV）：，其中寬度定義為兩個測量值中較小者並且高度定義為兩個測量值中較大者。
所有測量的原始數據都下載到電腦並自動導入VIVO Manager軟體以進行進一步的數據管理。不是由VIVO計算程式計算的值係使用MS Excel試算表程式或針對Windows的GraphPad Prism計算的。
將圖形結果在圖6中表示為組平均值±平均值的標準誤差。藉由單因素方差分析（ANOVA）分析數據，並且藉由Dunnett的事後檢驗評估腫瘤生長的實驗結果的差異，以與對照組2進行比較。
藉由將第n天的組平均腫瘤體積除以治療開始前一天（第11天）的組平均腫瘤體積來計算相對腫瘤體積（RTV）。
根據下式定量針對第20天（即對照組中的所有動物存活時的最後一天）的腫瘤生長抑制：
結果
當與對照組2中的媒介物治療的小鼠相比時，用MUC17/CD3雙特異性抗體構建體（測試項：SEQ ID NO: 186）靜脈內治療攜帶GSU-luc腫瘤的小鼠導致統計學上顯著且劑量依賴性的腫瘤生長抑制。在第12天開始治療後，在第18天和第20天實現p ＜ 0.01（在0.25 mg/kg下）或p ＜ 0.001（在2.5 mg/kg下）的值。由於對照組中的大多數動物（6/10）必須終止，因此在第20天後未進行統計學分析。在第20天觀察到的腫瘤生長抑制為24%（0.025 mg/kg）、58%（0.25 mg/kg）和77%（2.5 mg/kg）。第20天的相對腫瘤體積（RTV）的比較顯示，雖然在媒介物治療的小鼠中生長的腫瘤相對於治療開始前一天體積平均大4.2倍，但是測試項治療的組中的RTV係3.4（0.025 mg/kg），2.4（0.25 mg/kg）和1.0（2.5 mg/kg）。在以2.5 mg/kg治療後，RTV ＜ 2.0直至第29天。
兩種載體治療的對照組的比較顯示，在不存在測試項下，T細胞對GSU-luc細胞的生長沒有影響。由於小鼠係非相關物種，因此測試項耐受性良好，並且既未預期也未觀察到與藥物相關的不良事件。
總結：以2.5或0.25 mg/kg靜脈內給予根據本發明的雙特異性抗體構建體（測試項SEQ ID NO: 186）導致雌性NOD/Scid小鼠中皮下GSU-luc腫瘤生長的統計學上顯著且劑量依賴性抑制。
實例4：在食蟹猴中的探究性毒理學研究
在食蟹猴中的探究性毒理學研究中評價了MUC17 HLE BiTE抗體構建體（SEQ ID: 186，構建體8-B7）。在研究的第1天和第8天藉由靜脈內注射向三隻猴給予100 μg/kg或1000 μg/kg的MUC17 scFc雙特異性抗體構建體。MUC17 scFc雙特異性抗體構建體（SEQ ID NO 186）在兩種劑量下均具有良好的耐受性，沒有相關的臨床體征或體重變化。在100 μg/kg和1000 μg/kg下記錄到體溫的暫態增加。在來自用MUC17 scFc雙特異性抗體構建體治療的猴的血液樣品中觀察到MUC17 scFc雙特異性抗體構建體活性（淋巴細胞再分佈、嗜中性粒細胞和單核細胞增加、c-反應蛋白增加、細胞介素輕微增加）的一些標誌。儘管免疫組織化學確認了在從本探究性毒理學研究中評價的猴取樣的小腸的頂端表面上的MUC17表現，但在表現MUC17的組織中沒有組織病理學變化。
MUC17 scFc雙特異性抗體構建體在食蟹猴中的毒代動力學參數
在取自在探究性毒理學研究中評價的猴的血液樣品中評價MUC17 scFc雙特異性抗體構建體（SEQ ID NO 186）的毒代動力學參數。在給藥前和每次給藥後0.083、4、8、24、48、96和168小時收集血液樣品。藉由免疫測定測定MUC17 scFc雙特異性抗體構建體的血清濃度，使用針對MUC17的釕化鼠類抗人IgG Fc 1.35.1 mAb捕獲抗體構建體並且使用針對Fc部分的抗體檢測構建體。在第一次給藥後分析的所有時間點檢測MUC17 scFc雙特異性抗體構建體的血清水平。將數據擬合至兩室模型。圖8(B)示出了單個數據（點）和平均值（線）。評估了若干個藥物動力學參數，包括全身清除率（CL）、隔室間清除率（Q）、中央隔室的血清體積/體積（Vp）、組織隔室的組織體積/體積（Vt）、終末半衰期（t½），以及對於第二劑量1000 mcg/kg劑量的平均最大濃度（Cmax）和血清濃度-時間下面積（AUCinf ）。
實例5：正常腸細胞中的T細胞依賴性細胞毒性測定
為了進一步檢驗MUC17定位於人和食蟹猴的正常腸細胞頂端表面不易於為MUC17 scFc雙特異性抗體構建體（SEQ ID NO 186）的細胞毒活性所接近的觀點，在體外正常細胞中評價MUC17表現和MUC17 scFc雙特異性抗體構建體活性。藉由螢光激活細胞分選法評估MUC17細胞表面表現。在T細胞依賴性細胞毒性（TDCC）測定中評價MUC17 scFc雙特異性抗體構建體的細胞毒活性，其中將MUC17 scFc雙特異性抗體構建體與MUC17陽性靶細胞和人或猴效應細胞（即T細胞或外周血單核細胞）一起孵育並且然後評估細胞的存活力。最初使用標準二維細胞培養測試這些實驗。然而，為了更好地觀察MUC17向頂端表面的定位，以保持上皮細胞極性的方式（諸如在細胞外基質上或在有機體培養物中生長）培養正常細胞。MUC17 scFc雙特異性抗體構建體相對於正常，即非癌腸細胞沒有顯示出顯著增加的TDCC。
[表5]：序列表
[圖1]：圖1示出了MUC17的表位聚簇。標出了表位E1、E2、E3、E4、E5A和5B以及E2的截短型式（分別為TR2、TR3、TR4和TR5）。對其中將人MUC17（褐色/灰色）被非功能性小鼠MUC3替換的構建體的實驗揭示出對應的表位。鑒定出覆蓋表位空間E2（包含SEA結構域）的45種MUC17-scFc雙特異性抗體構建體。
[圖2]：藉由MUC17-scFc雙特異性抗體構建體針對表現人/小鼠嵌合構建體的細胞的細胞上結合進行MUC17表位定位。藉由螢光激活細胞分選法（FACS）評估細胞上結合，其中與嵌合構建體的結合的喪失表明對應的（突變型）結構域對於MUC17-scFc雙特異性抗體構建體結合係必需的。例如，E2在突變時顯示出結合的喪失。因此，E2對於所有四種檢查的雙特異性抗體構建體的結合係必需的。
[圖3]：MUC17在胃癌、胰腺癌和結腸直腸癌細胞系中表現。藉由活細胞的流式細胞術測定MUC17細胞表面蛋白表現並且繪示為FACS讀取（A）。藉由定量的聚合酶鏈式反應（qPCR）測定癌細胞系中的MUC17 mRNA水平。將值標準化為組成型表現基因的那些值（B）。
[圖4]：對具有不同MUC17表現、攜帶三種不同的MUC17的細胞系的細胞毒性測定。測試的構建體為1 = 32-G6；2 = 1-B6；3 = 2-C2和4 = 8-B7。構建體8-B7在細胞毒性方面略微有利。
[圖5]：將可溶性MUC17蛋白（sMUC17，aa 4131-4243 Uniprot）以0-1000 ng/ml添加到TDCC測定中，並且在孵育48 h後評估MUC17-scFc雙特異性抗體構建體的活性（靶細胞GSU或NUGC-4，10 : 1的人T細胞比靶細胞，藉由Steady Glo讀取）。sMUC17的添加不影響雙特異性抗體構建體的細胞毒活性。
[圖6]：MUC17-scFc抗體構建體8-B7在結腸直腸癌的異種移植模型中抑制腫瘤生長。向雌性NOD/SCID小鼠植入2 × 106 個Ls174T結腸直腸癌細胞。在第15天，藉由腹膜內（IP）注射給予2 × 107 個擴增的激活T細胞。在第16天和第22天，IP給予MUC17-scFc抗體構建體。用卡尺測量腫瘤大小。
[圖7]：對根據本發明的較佳的雙特異性抗體構建體調查了群碼（優化文庫）、分子名稱、對應構建體結合的表位簇、依據SPR、以[nM]計的親和力（KD ）、以[pM]計的NUGC-4細胞中細胞毒活性（EC50）、其比率（EC50 /KD ）* 1000以及VH VL安排。
[圖8]：MUC17-scFc抗體構建體8-B7在食蟹猴中具有延長的半衰期（A）。暴露水平與預測暴露一致。（B）在0 h和168 h時向食蟹猴（每組n = 3）給予100 mg/kg或1000 mg/kg MUC17 HLE BiTE®。在所指示的時間點處收集血清並且使用基於抗CD3抗體或抗MUC17抗體的ELISA分析該血清中MUC17 scFc雙特異性抗體構建體的存在。將數據擬合至兩室模型。該圖示出了單個數據（點）和平均值（線）。

Claims (40)

  1. 一種雙特異性抗體構建體，該雙特異性抗體構建體包含： 第一結構域，該第一結構域與MUC17結合，以及 第二結構域，該第二結構域與人和獼猴CD3ε鏈的細胞外表位結合。
  2. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，該雙特異性抗體構建體進一步包含第三結構域，該第三結構域包含兩個多肽單體，每個多肽單體包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域，其中所述兩個多肽單體經由肽接頭彼此融合。
  3. 如請求項1或2之雙特異性抗體構建體，其中該抗體構建體係單鏈抗體構建體。
  4. 如請求項2或3之雙特異性抗體構建體，其中所述第三結構域按胺基至羧基順序包含： 鉸鏈-CH2-CH3-接頭-鉸鏈-CH2-CH3。
  5. 如請求項4之雙特異性抗體構建體，其中該第三結構域的所述多肽單體中的每一個具有與選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群組的序列至少90%相同的胺基酸序列。
  6. 如請求項4或5之雙特異性抗體構建體，其中所述多肽單體中的每一個具有選自SEQ ID NO: 17-24的胺基酸序列。
  7. 5或6之雙特異性抗體構建體，其中該CH2結構域包含結構域內半胱胺酸二硫橋。
  8. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中 (i) 該第一結構域包含兩個抗體可變結構域並且該第二結構域包含兩個抗體可變結構域； (ii) 該第一結構域包含一個抗體可變結構域並且該第二結構域包含兩個抗體可變結構域； (iii) 該第一結構域包含兩個抗體可變結構域並且該第二結構域包含一個抗體可變結構域；或者 (iv) 該第一結構域包含一個抗體可變結構域並且該第二結構域包含一個抗體可變結構域。
  9. 2、3、4、5、6、7或8之雙特異性抗體構建體，其中該第一結構域和該第二結構域經由肽接頭與該第三結構域融合。
  10. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中該抗體構建體按胺基至羧基順序包含： (a) 該第一結構域； (b) 肽接頭，該肽接頭較佳的是具有選自由SEQ ID NO: 1-3組成之群組的胺基酸序列； (c) 該第二結構域。
  11. 如請求項10之雙特異性抗體構建體，其中該抗體構建體按胺基至羧基順序進一步包含： (d) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 1、2、3、9、10、11和12組成之群組的胺基酸序列； (e) 該第三結構域的該第一多肽單體； (f) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 5、6、7和8組成之群組的胺基酸序列；以及 (g) 該第三結構域的該第二多肽單體。
  12. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中該抗體構建體的該第一結構域與MUC17內對應於SEQ ID NO. 528（根據uniprot Q685J3編號的aa 4171至4296）的表位結合。
  13. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中該抗體構建體的該第一結構域與MUC17內對應於SEQ ID NO. 529（根據uniprot Q685J3編號的aa 4184至4291）的表位結合。
  14. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中該抗體構建體的該第一結構域與MUC17內對應於SEQ ID NO. 530（根據uniprot Q685J3編號的aa 4131至4243）的表位結合。
  15. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中該抗體構建體的該第一結構域與MUC17內對應於SEQ ID NO. 531（根據uniprot Q685J3編號的aa 4244至4389）的表位結合。
  16. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中該抗體構建體的該第一結構域與MUC17內對應於SEQ ID NO. 530（根據uniprot Q685J3編號的aa 4131至4243）的表位結合，但不與對應於SEQ ID NO. 531（根據uniprot Q685J3編號的aa 4244至4389）的MUC17內的表位結合。
  17. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中該抗體構建體的該第一結構域與MUC17內對應於SEQ ID NO. 532（根據uniprot Q685J3編號的aa 4171至4390）或SEQ ID NO. 533（根據uniprot Q685J3編號的aa 4184至4390）的表位結合，但不與MUC17內對應於SEQ ID NO. 534（根據uniprot Q685J3編號的aa 4291至4390）的表位或MUC17內對應於SEQ ID NO. 535（根據uniprot Q685J3編號的aa 4341至4390）的表位結合。
  18. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中細胞毒性與結合親和力之間的比率（EC50 /KD ）* 1000低於250，其中該細胞毒性在將NUGC-4細胞作為靶細胞並且將huPBMC作為效應細胞中進行測定，並且其中該結合親和力藉由基於表面電漿共振的測定來測定。
  19. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中細胞毒性與結合親和力之間的比率（EC50 /KD ）* 1000低於125，其中該細胞毒性在將NUGC-4細胞作為靶細胞並且將huPBMC作為效應細胞中進行測定，並且其中該結合親和力藉由基於表面電漿共振的測定來測定。
  20. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中細胞毒性與結合親和力之間的比率（EC50 /KD ）* 1000低於21，其中該細胞毒性在將NUGC-4細胞作為靶細胞並且將huPBMC作為效應細胞中進行測定，並且其中該結合親和力藉由基於表面電漿共振的測定來測定。
  21. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中該第一結合結構域包含含有選自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH區： (a) 如SEQ ID NO. 33中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 34中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 35中繪示的CDR-H3； (b) 如SEQ ID NO. 44中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 45中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 46中繪示的CDR-H3； (c) 如SEQ ID NO. 55中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 56中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 57中繪示的CDR-H3； (d) 如SEQ ID NO. 66中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 67中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 68中繪示的CDR-H3； (e) 如SEQ ID NO. 77中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 78中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 79中繪示的CDR-H3； (f) 如SEQ ID NO. 88中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 89中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 90中繪示的CDR-H3； (g) 如SEQ ID NO. 99中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 100中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 101中繪示的CDR-H3； (h) 如SEQ ID NO. 110中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 111中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 112中繪示的CDR-H3； (i) 如SEQ ID NO. 121中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 122中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 123中繪示的CDR-H3； (j) 如SEQ ID NO. 132中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 133中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 134中繪示的CDR-H3； (k) 如SEQ ID NO. 143中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 144中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 145中繪示的CDR-H3； (l) 如SEQ ID NO. 154中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 155中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 156中繪示的CDR-H3； (m) 如SEQ ID NO. 165中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 166中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 167中繪示的CDR-H3； (n) 如SEQ ID NO. 176中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 177中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 178中繪示的CDR-H3； (o) 如SEQ ID NO. 187中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 188中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 189中繪示的CDR-H3； (p) 如SEQ ID NO. 198中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 199中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 200中繪示的CDR-H3； (q) 如SEQ ID NO. 209中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 210中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 211中繪示的CDR-H3； (r) 如SEQ ID NO. 220中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 221中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 222中繪示的CDR-H3； (s) 如SEQ ID NO. 231中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 232中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 233中繪示的CDR-H3； (t) 如SEQ ID NO. 242中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 243中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 244中繪示的CDR-H3； (u) 如SEQ ID NO. 253中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 254中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 255中繪示的CDR-H3； (v) 如SEQ ID NO. 264中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 265中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 266中繪示的CDR-H3； (w) 如SEQ ID NO. 275中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 276中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 276中繪示的CDR-H3； (x) 如SEQ ID NO. 286中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 287中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 288中繪示的CDR-H3； (y) 如SEQ ID NO. 297中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 298中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 299中繪示的CDR-H3； (z) 如SEQ ID NO. 308中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 309中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 310中繪示的CDR-H3； (aa) 如SEQ ID NO. 319中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 320中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 321中繪示的CDR-H3； (ab) 如SEQ ID NO. 330中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 331中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 332中繪示的CDR-H3； (ac) 如SEQ ID NO. 341中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 342中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 343中繪示的CDR-H3； (ad) 如SEQ ID NO. 352中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 353中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 354中繪示的CDR-H3； (ae) 如SEQ ID NO. 363中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 364中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 365中繪示的CDR-H3； (af) 如SEQ ID NO. 374中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 375中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 376中繪示的CDR-H3； (ag) 如SEQ ID NO. 385中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 386中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 386中繪示的CDR-H3； (ah) 如SEQ ID NO. 396中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 397中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 398中繪示的CDR-H3； (ai) 如SEQ ID NO. 407中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 408中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 409中繪示的CDR-H3； (aj) 如SEQ ID NO. 418中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 419中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 420中繪示的CDR-H3； (ak) 如SEQ ID NO. 429中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 430中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 431中繪示的CDR-H3； (al) 如SEQ ID NO. 440中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 441中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 442中繪示的CDR-H3； (am) 如SEQ ID NO. 451中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 452中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 453中繪示的CDR-H3； (an) 如SEQ ID NO. 462中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 463中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 464中繪示的CDR-H3； (ao) 如SEQ ID NO. 473中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 474中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 475中繪示的CDR-H3； (ap) 如SEQ ID NO. 484中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 485中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 486中繪示的CDR-H3； (aq) 如SEQ ID NO. 495中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 496中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 497中繪示的CDR-H3； (ar) 如SEQ ID NO. 506中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 507中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 508中繪示的CDR-H3；以及 (as) 如SEQ ID NO. 517中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 518中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 519中繪示的CDR-H3；其中較佳的是 (c) 如SEQ ID NO. 55中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 56中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 57中繪示的CDR-H3； (n) 如SEQ ID NO. 176中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 177中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 178中繪示的CDR-H3； (ac) 如SEQ ID NO. 341中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 342中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 343中繪示的CDR-H3；以及 (aj) 如SEQ ID NO. 418中繪示的CDR-H1、如SEQ ID NO. 419中繪示的CDR-H2和如SEQ ID NO. 420中繪示的CDR-H3。
  22. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中該第一結合結構域包含含有選自以下的CDR-H1、CDR-L2和CDR-L3的VL區： (a) 如SEQ ID NO. 36中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 37中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 38中繪示的CDR-L3； (b) 如SEQ ID NO. 47中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 48中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 49中繪示的CDR-L3； (c) 如SEQ ID NO. 58中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 59中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 60中繪示的CDR-L3； (d) 如SEQ ID NO. 69中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 70中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 71中繪示的CDR-L3； (e) 如SEQ ID NO. 80中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 81中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 82中繪示的CDR-L3； (f) 如SEQ ID NO. 91中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 92中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 93中繪示的CDR-L3； (g) 如SEQ ID NO. 102中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 103中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 104中繪示的CDR-L3； (h) 如SEQ ID NO. 113中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 114中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 115中繪示的CDR-L3； (i) 如SEQ ID NO. 124中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 125中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 126中繪示的CDR-L3； (j) 如SEQ ID NO. 135中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 136中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 137中繪示的CDR-L3； (k) 如SEQ ID NO. 146中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 147中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 148中繪示的CDR-L3； (l) 如SEQ ID NO. 157中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 158中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 159中繪示的CDR-L3； (m) 如SEQ ID NO. 168中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 169中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 170中繪示的CDR-L3； (n) 如SEQ ID NO. 179中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 180中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 181中繪示的CDR-L3； (o) 如SEQ ID NO. 190中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 191中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 192中繪示的CDR-L3； (p) 如SEQ ID NO. 201中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 202中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 203中繪示的CDR-L3； (q) 如SEQ ID NO. 212中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 213中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 214中繪示的CDR-L3； (r) 如SEQ ID NO. 223中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 224中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 225中繪示的CDR-L3； (s) 如SEQ ID NO. 234中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 235中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 236中繪示的CDR-L3； (t) 如SEQ ID NO. 245中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 246中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 247中繪示的CDR-L3； (u) 如SEQ ID NO. 256中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 257中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 258中繪示的CDR-L3； (v) 如SEQ ID NO. 267中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 268中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 269中繪示的CDR-L3； (w) 如SEQ ID NO. 278中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 279中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 280中繪示的CDR-L3； (x) 如SEQ ID NO. 289中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 290中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 291中繪示的CDR-L3； (y) 如SEQ ID NO. 300中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 301中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 302中繪示的CDR-L3； (z) 如SEQ ID NO. 311中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 312中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 313中繪示的CDR-L3； (aa) 如SEQ ID NO. 322中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 323中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 324中繪示的CDR-L3； (ab) 如SEQ ID NO. 333中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 334中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 335中繪示的CDR-L3； (ac) 如SEQ ID NO. 344中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 345中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 346中繪示的CDR-L3； (ad) 如SEQ ID NO. 355中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 356中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 357中繪示的CDR-L3； (ae) 如SEQ ID NO. 366中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 367中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 368中繪示的CDR-L3； (af) 如SEQ ID NO. 377中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 378中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 379中繪示的CDR-L3； (ag) 如SEQ ID NO. 388中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 389中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 390中繪示的CDR-L3； (ah) 如SEQ ID NO. 399中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 400中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 401中繪示的CDR-L3； (ai) 如SEQ ID NO. 410中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 411中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 412中繪示的CDR-L3； (aj) 如SEQ ID NO. 421中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 422中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 423中繪示的CDR-L3； (ak) 如SEQ ID NO. 432中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 433中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 434中繪示的CDR-L3； (al) 如SEQ ID NO. 443中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 444中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 445中繪示的CDR-L3； (am) 如SEQ ID NO. 454中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 455中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 456中繪示的CDR-L3； (an) 如SEQ ID NO. 465中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 466中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 467中繪示的CDR-L3； (ao) 如SEQ ID NO. 476中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 477中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 478中繪示的CDR-L3； (ap) 如SEQ ID NO. 487中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 488中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 489中繪示的CDR-L3； (aq) 如SEQ ID NO. 498中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 499中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 500中繪示的CDR-L3； (ar) 如SEQ ID NO. 509中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 510中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 511中繪示的CDR-L3；以及 (as) 如SEQ ID NO. 520中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 521中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 522中繪示的CDR-L3；其中較佳的是 (c) 如SEQ ID NO. 58中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 59中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 60中繪示的CDR-L3； (n) 如SEQ ID NO. 179中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 180中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 181中繪示的CDR-L3； (ac) 如SEQ ID NO. 344中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 345中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 346中繪示的CDR-L3；以及 (aj) 如SEQ ID NO. 421中繪示的CDR-L1、如SEQ ID NO. 422中繪示的CDR-L2和如SEQ ID NO. 423中繪示的CDR-L3。
  23. 如前述請求項中任一項之雙特異性抗體構建體，其中該第一結合結構域包含選自以下群組的VL區和VH區，該群組由以下項組成： (a) 如SEQ ID NO. 40中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 39中繪示的VH區； (b) 如SEQ ID NO. 51中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 50中繪示的VH區； (c) 如SEQ ID NO. 62中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 61中繪示的VH區； (d) 如SEQ ID NO. 73中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 72中繪示的VH區； (e) 如SEQ ID NO. 84中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 83中繪示的VH區； (f) 如SEQ ID NO. 95中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 94中繪示的VH區； (g) 如SEQ ID NO. 106中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 105中繪示的VH區； (h) 如SEQ ID NO. 117中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 116中繪示的VH區； (i) 如SEQ ID NO. 128中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 127中繪示的VH區； (j) 如SEQ ID NO. 139中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 138中繪示的VH區； (k) 如SEQ ID NO. 150中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 149中繪示的VH區； (l) 如SEQ ID NO. 161中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 160中繪示的VH區； (m) 如SEQ ID NO. 172中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 171中繪示的VH區； (n) 如SEQ ID NO. 183中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 182中繪示的VH區； (o) 如SEQ ID NO. 194中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 193中繪示的VH區； (p) 如SEQ ID NO. 205中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 204中繪示的VH區； (q) 如SEQ ID NO. 216中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 215中繪示的VH區； (r) 如SEQ ID NO. 227中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 226中繪示的VH區； (s) 如SEQ ID NO. 238中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 237中繪示的VH區； (t) 如SEQ ID NO. 249中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 248中繪示的VH區； (u) 如SEQ ID NO. 260中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 259中繪示的VH區； (v) 如SEQ ID NO. 271中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 270中繪示的VH區； (w) 如SEQ ID NO. 282中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 281中繪示的VH區； (x) 如SEQ ID NO. 293中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 292中繪示的VH區； (y) 如SEQ ID NO. 304中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 303中繪示的VH區； (z) 如SEQ ID NO. 315中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 314中繪示的VH區； (aa) 如SEQ ID NO. 326中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 325中繪示的VH區； (ab) 如SEQ ID NO. 337中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 336中繪示的VH區； (ac) 如SEQ ID NO. 348中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 347中繪示的VH區； (ad) 如SEQ ID NO. 359中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 358中繪示的VH區； (ae) 如SEQ ID NO. 370中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 369中繪示的VH區； (af) 如SEQ ID NO. 381中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 380中繪示的VH區； (ag) 如SEQ ID NO. 392中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 391中繪示的VH區； (ah) 如SEQ ID NO. 403中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 402中繪示的VH區； (ai) 如SEQ ID NO. 414中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 413中繪示的VH區； (aj) 如SEQ ID NO. 425中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 424中繪示的VH區； (ak) 如SEQ ID NO. 436中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 435中繪示的VH區； (al) 如SEQ ID NO. 447中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 446中繪示的VH區； (am) 如SEQ ID NO. 458中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 457中繪示的VH區； (an) 如SEQ ID NO. 469中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 468中繪示的VH區； (ao) 如SEQ ID NO. 480中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 479中繪示的VH區； (ap) 如SEQ ID NO. 491中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 490中繪示的VH區； (aq) 如SEQ ID NO. 502中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 501中繪示的VH區； (ar) 如SEQ ID NO. 513中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 512中繪示的VH區；以及 (as) 如SEQ ID NO. 524中繪示的VL區和如SEQ ID NO. 523中繪示的VH區。
  24. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中該抗體構建體包含選自如以下任一者中繪示的胺基酸序列的序列：SEQ ID NO: 41、52、63、74、85、96、107、118、129、140、151、162、173、184、195、206、217、228、239、250、261、272、283、294、305、316、327、338、349、360、371、382、393、404、415、426、437、448、459、470、481、492、503、514和525。
  25. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，其中該抗體構建體按胺基至羧基順序包含： (a) 該第一結構域，該第一結構域具有選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下項組成：SEQ ID NO: 41、52、63、74、85、96、107、118、129、140、151、162、173、184、195、206、217、228、239、250、261、272、283、294、305、316、327、338、349、360、371、382、393、404、415、426、437、448、459、470、481、492、503、514和525； (b) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 1-3組成之群組的胺基酸序列； (c) 該第二結構域，該第二結構域具有選自以下群組或如SEQ ID NO: 15中繪示的胺基酸序列，該群組由以下項組成：WO 2008/119567的SEQ ID NO: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187。
  26. 如請求項25之雙特異性抗體構建體，其中該抗體構建體按胺基至羧基順序進一步包含： (d) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 1、2、3、9、10、11和12組成之群組的胺基酸序列； (e) 該第三結構域的該第一多肽單體，該第一多肽單體具有選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群組的多肽序列； (f) 肽接頭，該肽接頭具有選自由SEQ ID NO: 5、6、7和8組成之群組的胺基酸序列；以及 (g) 該第三結構域的該第二多肽單體，該第二多肽單體具有選自由SEQ ID NO: 17-24組成之群組的多肽序列。
  27. 如請求項1之雙特異性抗體構建體，該雙特異性抗體構建體具有選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下項組成： SEQ ID NO: 42、43、53、54、64、65、75、76、86、87、97、98、108、109、119、120、130、131、141、142、152、153、163、164、174、175、185、186、196、197、207、208、218、219、229、230、240、241、251、252、262、263、273、274、284、285、295、296、306、307、317、318、328、329、339、340、350、351、361、362、372、373、383、384、394、395、405、406、416、417、427、428、438、439、449、450、460、461、471、472、482、483、493、494、504、505、515、516、526和527，或者具有與所述序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸。
  28. 一種多核苷酸，該多核苷酸編碼如請求項1中所定義的抗體構建體。
  29. 一種載體，該載體包含如請求項28中所定義的多核苷酸。
  30. 一種宿主細胞，該宿主細胞用如請求項28中所定義的多核苷酸或用如請求項29中所定義的載體轉化或轉染。
  31. 一種用於產生如請求項1至27之雙特異性抗體構建體之方法，所述方法包括在允許表現如請求項1至27中所定義的抗體構建體的條件下培養如請求項30中所定義的宿主細胞並且從該培養中回收所產生的抗體構建體。
  32. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含如請求項1至27之雙特異性抗體構建體，或如請求項31之方法產生的雙特異性抗體構建體。
  33. 如請求項32之藥物組成物，該藥物組成物在約 -20°C下穩定至少四週。
  34. 如請求項1至27之雙特異性抗體，或如請求項31之方法產生的雙特異性抗體構建體，用於在選自增殖性疾病、腫瘤性疾病、癌症或免疫學病症的疾病的預防、治療或緩解中使用。
  35. 如請求項34使用的雙特異性抗體構建體，其中該疾病為胃腸癌或胰腺癌。
  36. 如請求項34使用的雙特異性抗體構建體，其中該疾病為胃癌。
  37. 一種如請求項1至27中所述之雙特異性抗體構建體用於生產藥物之用途，該藥物用於治療或緩解增殖性疾病、腫瘤性疾病、癌症或免疫學病症，其中該疾病較佳的是胃腸癌或胰腺癌、最較佳的是胃癌。
  38. 一種套組，該套組包含如請求項1至27之雙特異性抗體構建體或如請求項31之方法產生的雙特異性抗體構建體、如請求項28中所定義的多核苷酸、如請求項29中所定義的載體、和/或如請求項30中所定義的宿主細胞。
  39. 一種針對MUC17和CD3的雙特異性抗體構建體用於生產藥物之用途，該藥物用於治療或緩解胃腸癌。
  40. 一種針對MUC17和CD3的雙特異性抗體構建體，用於在胃腸癌的治療或緩解中使用。
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