TW202027788A

TW202027788A - 雙特異性抗體構建體之下游加工

Info

Publication number: TW202027788A
Application number: TW108136957A
Authority: TW
Inventors: 皮克陳; 帕佛邦達倫可; 尼爾舒伊斯
Original assignee: 美商安進公司
Priority date: 2018-10-11
Filing date: 2019-10-14
Publication date: 2020-08-01
Also published as: MX2021003976A; IL281788A; CL2021000874A1; CN112789058A; US20210395298A1; CA3114802A1; JP2022512636A; SG11202103275YA; WO2020077212A1; AU2019356564A1; AR117650A1; EP3863670A1

Abstract

本發明提供了一種用於生產雙特異性抗體產物的改善之製造方法，該等雙特異性抗體產物包含至少兩個結合結構域。該方法至少包括以下方法：該方法包括重折疊構建體的步驟，其中一個或多個結構域包含二硫鍵，並且其中使該構建體與重折疊緩衝劑接觸以將該構建體重折疊到其天然形式，該緩衝劑包含 (i) 濃度為至少0.1 mM的氧化還原和/或氧化劑，和 (ii) 濃度＞ 1 M的離液劑，並且其中該重折疊緩衝劑的pH對應於該第一結構域的pI值的 +/- 4.5或該整個構建體的pI值的 +/- 4.0。

Description

雙特異性抗體構建體之下游加工

本發明係關於生物技術之方法，特別是關於用於製造雙特異性抗體構建體之下游製造方法。

數年來，基於蛋白質的藥物係最快速且最有前景開發的治療劑之一，該等基於蛋白質的藥物已經在幾乎每個醫學領域中發揮重要作用並且是臨床（前）開發中和作為商業產品增長最快的治療劑之一（Leader, Nature Reviews Drug Discovery [自然綜述：藥物發現] 2008年1月7日, 21-39）。與小化學藥物相比，蛋白質藥物在相對低的濃度下具有高特異性和活性，並且典型地提供高影響疾病，例如各種癌症、自身免疫疾病和代謝性病症的療法（Roberts, Trends Biotechnol. [生物技術趨勢] 2014年7月;32(7):372-80；Wang, Int J Pharm. [國際藥學雜誌] 1999年8月20日;185(2):129-88）。

由於商業規模純化方法的進步，因此現在可以在首次製造時以高純度獲得基於蛋白質的藥物，例如重組蛋白質。然而，蛋白質僅臨界穩定（marginally stable）並且甚至在上游製造過程中，極易受到化學和物理降解二者的影響。化學降解係指涉及共價鍵的修飾，例如脫醯胺化、氧化、裂解或形成新的二硫橋鍵、水解、異構化或去糖基化。物理降解包括蛋白質去折疊、對表面的不希望的吸附、和聚集。處理該等物理和化學不穩定性係蛋白質藥物開發中最具挑戰性的任務之一（Chi等人, Pharm Res [藥物研究], 第20卷，第9期, 2003年9月, 第1325-1336頁, Roberts, Trends Biotechnol.[生物技術趨勢] 2014年7月；32(7):372-80）。

因此，儘管製造方面取得了進步，但是新的基於蛋白質的藥物仍需要創新的新製造方法，以避免例如蛋白質聚集的產品品質影響。這會影響上游製造、下游製造、儲存和應用。

這種新的基於蛋白質的藥物包括例如雙特異性（單株）抗體。雙特異性抗體係可以同時結合兩種不同類型抗原的人工蛋白。它們以若干種結構形式已知，並且目前已經探究了用於癌症免疫療法和藥物遞送的應用（Fan, Gaowei; Wang, Zujian; Hao, Mingju; Li, Jinming (2015).「Bispecific antibodies and their applications [雙特異性抗體及其應用]」. Journal of Hematology & Oncology. [血液學與腫瘤學雜誌] 8: 130）。

一般來講，雙特異性抗體可以是IgG樣的，即全長雙特異性抗體，或者係為非全長抗體構建體的非IgG樣雙特異性抗體。全長雙特異性抗體典型地保留具有兩個Fab臂和一個Fc區的傳統單株抗體（mAb）結構，不同的是兩個Fab位點結合不同抗原。非全長雙特異性抗體缺乏整個Fc區。該等包括化學連接的Fab、僅由Fab區組成、以及各種類型的二價和三價單鏈可變片段（scFv）。還存在模擬兩種抗體的可變結構域的融合蛋白。該等更新形式中最可能進一步開發的是雙特異性T細胞接合劑（BiTE^® ）（Yang, Fa; Wen, Weihong; Qin, Weijun (2016). 「Bispecific Antibodies as a Development Platform for New Concepts and Treatment Strategies [作為用於新的理念和治療策略的開發平台的雙特異性抗體]」. International Journal of Molecular Sciences [國際分子科學雜誌]. 18 (1): 48）。

雙特異性分子例如BiTE^® 抗體構建體係由兩個柔性連接的抗體衍生的結合結構域製備的重組蛋白質構建體。BiTE^® 抗體構建體的一個結合結構域對靶細胞上選擇的腫瘤相關表面抗原係特異性的；第二結合結構域對CD3（T細胞上T細胞受體複合物的亞基）係特異性的。藉由其特殊設計，BiTE^® 抗體構建體獨特地適合於將T細胞與靶細胞暫態連接，並且同時強有力地激活T細胞對靶細胞的固有細胞溶解潛力。對作為AMG 103和AMG 110開發到臨床中的第一代BiTE^® 抗體構建體（參見WO 99/54440和WO 2005/040220）的重要的進一步開發係提供與CD3ε鏈的N末端處的背景獨立表位結合的雙特異性抗體構建體（WO 2008/119567）。與該選擇的表位結合的BiTE^® 抗體構建體不僅顯示出對人和絨毛猴（Callithrix jacchus）、絨頂檉柳猴（Saguinus oedipus ）或松鼠猴（Saimiri sciureus）CD3ε鏈的跨物種特異性，而且由於識別該特異性表位（而不是先前描述的雙特異性T細胞接合分子中CD3結合物的表位）而不會非特異性地激活T細胞至與對於前一代T細胞接合抗體所觀察到的程度相同的程度。T細胞激活的這種減少與患者中較少或減少的T細胞再分佈相關，這被鑒定為副作用的風險。

當前，約25%（m/m）或更多的雙特異性抗體構建體，例如藉由工業哺乳動物CHO細胞培養物（表現，分泌，從生物反應器收集並純化，例如藉由蛋白質A柱）生產的與單鏈Fc軛合的雙特異性T細胞接合劑（BiTE®）分子（ScFc-BiTE®），可以以聚集形式獲得，這降低了產率並增加了生產成本。下一個下游純化步驟（典型地是陽離子交換層析法（CEX））去除聚集物。因此，需要在下游減少聚集。

傳統上，氧化還原重折疊係在微生物系統（大腸桿菌）產生聚集在包涵體中的蛋白質後進行的。在該等情況下，典型地需要高濃度的變性劑（6M胍、尿素等）。使用氧化劑（銅、溶解氧等）以形成二硫鍵，或使用氧化還原試劑（半胱胺酸/胱胺酸、半胱胺酸/胱胺等）以改組加擾的二硫鍵。儘管通常認為工業哺乳動物細胞表現具有期望的，正確的高階結構（折疊）和二硫鍵連接的蛋白質，實際上並非總是如此。

在文獻中已經描述了一些情況，其中對哺乳動物細胞中產生的蛋白質和抗體進一步處理，其目的是重折疊蛋白質並產生或改組二硫鍵。將TNF-Fc融合蛋白（依那西普（etanercept））用半胱胺酸/胱胺酸氧化還原處理，以形成並改組加擾的二硫鍵，從而將後來洗脫的HIC級分最小化（Sassenfeld, H. M., Remmele, R. L., & McCoy, R. E. 2007，Increased recovery of active proteins[增加的活性蛋白的回收], US 7157557；Sassenfeld, H. M., Remmele, R. L., & McCoy, R. E. 2009, Increased recovery of active proteins (antibodies)[增加的活性蛋白（抗體）的回收], US 7544874 B2）。在另一種情況下，在IgG1抗體的Fab區觀察到高百分比（16%）的開放二硫鍵（Chaderjian, W.B., Chin, E.T., Harris, R.J., & Etcheverry, T.M. 2005. Effect of copper sulfate on performance of a serum-free CHO cell culture process and the level of free thiol in the recombinant antibody expressed[硫酸銅對無血清CHO細胞培養方法的性能和表現的重組抗體中游離硫醇的水平的影響]. Biotechnol.Prog.[生物技術進展], 21, (2) 550-553）。藉由向生物反應器中添加50-100 uM硫酸銅來氧化完成二硫鍵的形成（Chaderjian, Chin, Harris, & Etcheverry 2005）。使IgG2抗體進行氧化還原重折疊以富集所需的IgG2A或IgG2B二硫化物同種型（Dillon, T.M., Speed-Ricci, M., Vezina, C., Flynn, G.C., Liu, Y.D., Rehder, D.S., Plant, M., Henkle, B., Li, Y., Varnum, B., Wypych, J., Balland, A., & Bondarenko, P.V. 2008. Structural and functional characterization of disulfide isoforms of the human IgG2 subclass[人IgG2亞類的二硫化物同種型的結構和功能表征]. J.Biol.Chem.[生物化學雜誌], 283, 16206-16215, Dillon, T.M., Rehder, D.S., Bondarenko, P.V., Ricci, M., Gadgil, H.S., Banks, D., Zhou, J., Lu, Y., Goetze, A., & Zhang, Y. 2011. Methods for refolding of recombinant antibodies[用於重組抗體的重折疊的方法].專利US7928205）。還對固定在蛋白質A柱上的IgG2分子進行了氧化還原重折疊和氧化還原處理，以富集所需的IgG2二硫化物同種型（Zhou, J. & Hong, T. 2006, Method for refolding polypeptides[用於重折疊多肽的方法], WO 2006/060083）。將更弱的變性條件用於包含1M尿素的單鏈Fv抗體（Chen, L.H., Huang, Q., Wan, L., Zeng, L.Y., Li, S.F., Li, Y.P., Lu, X.F., & Cheng, J.Q. 2006. Expression, purification, and in vitro refolding of a humanized single-chain Fv antibody against human CTLA4 (CD152)[針對人CTLA4（CD152）的人源化單鏈Fv抗體的表現、純化、和體外重折疊]. Protein Expr.Purif.[蛋白質表現和純化], 46, (2) 495-502）。然而，先前沒有描述可適用的重折疊條件來重折疊聚集的雙特異性抗體構建體，例如BiTE®抗體構建體，它允許快速，通用和資源高效的步驟，該步驟可包括在常規下游加工中以增加總體產量。甚至更多的更大的包含例如半衰期延長結構域並且典型地大小至少為100 kDa的雙特異性抗體構建體在下游加工中甚至更具處理挑戰性。例如，單鏈Fc(ScFc)BiTE®抗體構建體的大小典型地是大的（約105 kDa），並包含因蛋白質工程工作而設計的長連接子（linker）。相比之下，幾乎沒有任何單鏈天然哺乳動物蛋白（小於5%）大於100 kDa。在這方面，技術人員認為標準IgG抗體由兩條約50 kDa的重鏈和兩條約25 kDa的輕鏈組成，它們主要分開折疊然後結合在一起。相比之下，單鏈抗體構建體例如scFc BiTE®抗體構建體僅折疊為一條重工程鏈。因此，對於重工程單鏈抗體構建體，需要完善對下游加工的先前學習，對於那些非天然高分子量的構建體，則需要進一步完善。

令人驚訝地，可以提供一種下游方法，其確保改善的雙特異性抗體構建體產品品質，因此增加了產物產率，並可整合到現有的下游加工步驟中。

因此，在一方面，在本發明的上下文中設想提供一種純化雙特異性抗體構建體的下游方法，該構建體包含： • 與靶，較佳的是腫瘤靶結合的pI為5.0至9.5的第一結構域； • 第二結構域，所述第二結構域與人和獼猴CD3ε鏈的細胞外表位結合；以及 • 視需要第三結構域，該第三結構域包含兩個多肽單體，每個多肽單體包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域，其中所述兩個多肽單體藉由肽連接子彼此融合，其中所述構建體包含至少一個開放的二硫鍵，該方法包括重折疊構建體的步驟，其中一個或多個結構域包含二硫鍵，並且其中使該構建體與重折疊緩衝劑接觸以將該構建體重折疊到其天然形式，該緩衝劑包含 (i) 濃度為至少0.1 mM的氧化還原和/或氧化劑，和 (ii) 濃度＞ 1M的離液劑，並且其中重折疊緩衝劑的pH對應於第一結構域的pI值的 +/- 4.5或整個構建體的pI值的 +/- 4.0。

根據所述方面，還設想氧化劑選自由以下組成之群組：銅(II)、溶解氧和(L)-去氫抗壞血酸（DHA），較佳的是銅(II)。

根據所述方面，還設想氧化劑係硫酸銅(II)。

根據所述方面，還設想氧化劑以0.1至10mM，較佳的是0.1至1 mM的濃度存在。

根據所述方面，還設想氧化還原劑選自由以下組成之群組：還原型麩胱甘肽 /氧化型麩胱甘肽、半胱胺酸/胱胺酸、半胱胺酸/半胱胺、半胱胺酸/胱胺、二硫蘇糖醇（DTT）、β-巰基乙醇和麩胱甘肽。

根據所述方面，還設想氧化還原劑以0.1至10 mM，較佳的是0.1至1 mM的濃度存在。

根據所述方面，還設想重折疊緩衝劑包含氧化劑但不包含氧化還原劑。

根據所述方面，還設想離液劑選自由以下組成之群組：精胺酸、尿素、二甲基尿素、甲基脲、乙基脲、有機溶劑、洗滌劑、高溫（較佳的是超過40°C、50°C、60°C、70°C或80°C）和胍（或其質子化形式鈲），較佳的是鈲。

根據所述方面，還設想離液劑以1.2至2M的範圍內的濃度存在。

根據所述方面，還設想pH值至少為4.9，較佳的是在pH 5.0至9.5的範圍內，較佳的是約5.0至6.0或6.5至9.0，更較佳的是5.0或7.0至8.0。

根據所述方面，還設想第一結構域結合CD33、CDH19、MSLN、FLT3、BCMA、CD19、MUC17、EpCAM、EGFRviii、DLL3、CLDN 18、CDH3、和/或PSMA。

根據所述方面，還設想，與氧化還原重折疊前的單體含量相比，在施加重折疊緩衝劑後例如藉由尺寸排阻層析法（單體峰百分比）測定的構建體的單體含量增加至少25%，並且較佳的量達至少40%、更較佳的是至少60%、65%、至少70%或甚至至少85%的單體含量。

根據所述方面，還設想該方法在室溫（約25°C）下進行。

根據所述方面，還設想該方法的孵育時間為1至24 h，較佳的是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 h，更較佳的是4 h。

根據所述方面，還設想使構建體與重折疊緩衝劑的接觸 (i) 在下游純化步驟中的加工流體（池）中或 (ii) 在下游純化步驟中的層析柱上進行。

根據所述方面，還設想構建體 (i) 在液體池中的濃度為0.5 mg/ml至15 mg/ml，較佳的是0.7 mg/ml至12 mg/ml或 (ii) 在層析柱上的濃度為5 mg/ml至15 mg/ml，較佳的是10 mg/ml至15 mg/ml。

根據所述方面，還設想所述液體池係收穫的細胞培養液（HCCF）、層析洗脫液池、蛋白A、蛋白L或蛋白G親和層析洗脫液池、過濾的病毒失活池、陽離子交換層析法（CEX）單體池和CEX高分子量峰後池。

根據所述方面，還設想，本發明的方法較佳的是包括以下步驟 (a) 提供收穫的細胞培養液（HCCF），其包含哺乳動物細胞分泌的所述雙特異性抗體構建體； (b) 在適合於所述構建體與所述分離基質締合的條件下，使所述HCCF與第一分離基質接觸以進行層析純化，其中所述分離基質係選自由以下組成之群組的親和樹脂：蛋白A、蛋白G、蛋白L和合成模擬親和樹脂； (c) 洗滌所述第一分離基質； (d) 從所述第一分離基質洗脫所述構建體； (e) 使包含所述構建體的洗脫液中的病毒失活； (f) 在適合於所述構建體與所述分離基質締合的條件下，使包含所述構建體的洗脫液與第二分離基質接觸以進行層析精製，其中所述分離基質為陽離子交換層析基質； (g) 洗滌所述第二分離基質； (h) 從所述第二分離基質洗脫所述構建體，其中將所述構建體分成兩種級分：(i)包含構建體單體的單體池和 (ii) 包含構建體聚集物的高分子量池， (i) 藉由過濾從包含級分 (i) 的所述洗脫液中分離病毒；以及 (j) 視需要將洗脫液進行進一步的超濾和/或滲濾步驟，其中在收穫前的細胞培養基中或在步驟 (a) 的HCCF中，使該構建體與重折疊緩衝劑接觸以將該構建體重折疊到其天然形式。

根據所述方面，可替代地，在如上所述的步驟 (b) 或 (f) 中的至少一個中，在分離基質上（在柱上），使該構建體與重折疊緩衝劑接觸以將該構建體重折疊到其天然形式。

根據所述方面，可替代地，在如上所述的步驟 (d)、(e) 或 (h) 中的至少一個中，在加工流體（池）中，使該構建體與重折疊緩衝劑接觸以將該構建體重折疊到其天然形式。

根據所述方面，還設想，構建體的第一結合結構域包含含有選自由以下組成之群組的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH區和含有選自由以下組成之群組的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL區： (a) 如SEQ ID NO: 4中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 5中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 6中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 1中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 2中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 3中所描繪的CDR-L3， (b) 如SEQ ID NO: 29中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 30中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 31中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 34中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 35中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 36中所描繪的CDR-L3， (c) 如SEQ ID NO: 42中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 43中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 44中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 45中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 46中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 47中所描繪的CDR-L3， (d) 如SEQ ID NO: 53中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 54中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 55中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 56中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 57中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 58中所描繪的CDR-L3， (e) 如SEQ ID NO: 65中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 66中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 67中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 68中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 69中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 70中所描繪的CDR-L3； (f) 如SEQ ID NO: 83中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 84中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 85中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 86中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 87中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 88中所描繪的CDR-L3， (g) 如SEQ ID NO: 94中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 95中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 96中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 97中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 98中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 99中所描繪的CDR-L3， (h) 如SEQ ID NO: 105中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 106中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 107中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 109中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 110中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 111中所描繪的CDR-L3， (i) 如SEQ ID NO: 115中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 116中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 117中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 118中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 119中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 120中所描繪的CDR-L3， (j) 如SEQ ID NO: 126中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 127中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 128中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 129中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 130中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 131中所描繪的CDR-L3， (k) 如SEQ ID NO: 137中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 138中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 139中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 140中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 141中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 142中所描繪的CDR-L3， (l) 如SEQ ID NO: 152中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 153中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 154中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 155中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 156中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 157中所描繪的CDR-L3， (m) 如SEQ ID NO: 167中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 168中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 169中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 170中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 171中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 172中所描繪的CDR-L3， (n) 如SEQ ID NO: 203中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 204中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 205中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 206中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 207中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 208中所描繪的CDR-L3； (o) 如SEQ ID NO: 214中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 215中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 216中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 217中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 218中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 219中所描繪的CDR-L3； (p) 如SEQ ID NO: 226中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 227中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 228中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 229中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 230中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 231中所描繪的CDR-L3；以及 (q) 如SEQ ID NO: 238中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 239中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 240中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 241中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 242中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 243中所描繪的CDR-L3。

根據所述方面，還設想將所述方法應用於藉由上游連續製造方法生產的構建體。

根據另一方面，還設想一種執行本發明的方法的設備。

根據另一方面，還設想提供了藉由本發明的方法純化的雙特異性抗體構建體。

較佳的是，本文描述了為雙特異性抗體構建體提供優化的氧化還原重折疊條件的下游方法，該雙特異性抗體構建體較佳的是單鏈抗體構建體，例如雙特異性T細胞接合劑（BiTE®）抗體構建體，尤其是scFc BiTE®抗體構建體，其有利地改善抗體構建體產物品質，這包括減少聚集、增加單體抗體構建體的產量和/或減少同種型的發生，由此改善總體過程經濟學。可以將該方法通用地添加到若干個標準的下游加工步驟中，例如層析純化、病毒失活、陽離子交換層析、病毒過濾和或超濾/滲濾。令人驚訝地發現，特定的氧化還原重折疊條件可有效地降低雙特異性抗體構建體的聚集並增加其單體產物的產量，該條件包括例如胍，本文也被稱為質子化形式鈲的離液劑濃度，其特定濃度高於文獻中的會預期的濃度，以及低濃度的氧化還原劑，較佳的是氧化劑，例如銅(II)和/或低濃度的氧化還原試劑（如半胱胺酸/胱胺酸）。在某些實施方式中，氧化劑係較佳的。

發現典型地高百分比量，例如超過25%或甚至超過50%或70%的雙特異性抗體構建體，例如藉由工業哺乳動物CHO細胞（表現，分泌，從生物反應器收集並藉由蛋白質A柱純化）生產的與單鏈Fc軛合的BiTE®抗體構建體（ScFc-BiTE®），在下游不利地以聚集形式獲得，這大大降低了產率並增加了生產成本。聚集物典型地藉由下一個下游純化步驟（典型地是陽離子交換層析法（CEX））去除。然而，在由哺乳動物細胞（或微生物系統）生產雙特異性抗體構建體（例如ScFc-BiTE®）的方法中，氧化還原重折疊方法作為另外的下游加工步驟，其包括如本文所述的氧化還原重折疊步驟，增加所需的單體蛋白質產物（雙特異性抗體構建體）的產量以及減少聚集物。已經對雙特異性抗體構建體評估了含有或不含有還原/氧化（氧化還原）試劑的眾多重折疊條件。

較佳的是，文中描述了加工上游產生的抗體構建體、較佳的是雙特異性抗體構建體（例如ScFc-BiTE®抗體構建體）的下游方法，該方法包括使已經由哺乳動物細胞或微生物系統生產的蛋白質與離液劑和氧化還原劑在較佳的pH下接觸，該pH取決於雙特異性抗體構建體的pI。在一個實施方式中，較佳的pH取決於雙特異性抗體構建體的靶結構域的pI，並且典型地在pH 5至8的範圍內。這樣的pH值對應於雙特異性抗體構建體的下游加工中池中或柱上條件下環境的典型pH值。評價了若干種離液劑（變性，去折疊），包括胍、精胺酸和升高的溫度。胍和精胺酸作為離液劑係較佳的，最較佳的是胍。例如，示例性評估的胍濃度在0.5至2.5的範圍內，其中在高於1 M的離液劑的濃度下，較佳的是1.2至2 M的範圍內的濃度下，觀察到單體含量顯著增加。更高的離液劑濃度典型地具有增加產物聚集機會的風險。相反，低於1 M的量典型地並不顯示為顯著的重折疊作用。

根據本發明，離液劑，例如鈲，尤其是如果與氧化還原劑，例如銅II組合，令人驚訝地減少了下游雙特異性構建體聚集的發生，並且較佳的是另外減少了同種型和/或異源抗體構建體的發生。這典型地藉由在尺寸排阻層析中更小的肩峰證明，其中肩峰應當理解為與典型地高斯曲線樣形狀的峰的偏差，例如藉由峰的部分變寬或拖尾。相應地，根據本發明，在導致根據本發明的抗體構建體的總體更有效製造方法的下游加工中，非聚集的，即單體雙特異性抗體的發生會顯著增加。典型地，相對於施加本發明之前的單體百分比，代表希望的產物級分的單體含量增加了至少25%、較佳的是至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，或甚至大於100%。例如，在其中單體含量（每次尺寸排阻層析的單體峰）從約25%增加至約50%的情況下，相對於施加本發明之前的單體含量，已經實現了約100%的單體含量的增加。可以實現的按百分比計的實際最終單體含量可以取決於具體分子。然而，對於通常如本文所述的抗體構建體，典型地觀察到單體含量的至少25%、典型地至少約50%的百分比增加。在這方面，為了增加單體的百分比，較佳的是將氧化還原試劑與離液劑（例如胍）一起添加到重折疊緩衝劑中。當在重折疊緩衝劑中半胱胺酸和胱胺酸形成氧化還原劑，該緩衝劑具有在至少1 M，例如1至2.5 M，較佳的是1.2至2 M的範圍內的總氧化還原劑濃度，例如按6 : 1、14 : 1、和33 : 1（Cys : Cyss）的莫耳比，單體的百分比可以從39%（無氧化還原劑）分別增加至52%、61%、和69%，即增加了高達約76%。當與例如1.2 M至2.0 M胍一起使用氧化還原劑，例如氧化試劑，例如銅(II)硫酸鹽或去氫抗壞血酸鹽，例如0.5 mM硫酸銅(II)時，令人驚訝地觀察到高達約90%的高度重折疊作用增加的單體含量。還用去氫抗壞血酸鹽增加了單體的百分比，例如按以下範圍內的濃度：0.1 M至1 M、較佳的是0.5%至高達約73%，伴隨以下範圍內的離液劑，約1.2 M至2 M，例如約1.2 M至2.0 M胍。然而，例如對於scFc-BiTE® CEX後峰池，本文描述的重折疊程序也適合更早的下游純化。待有效純化的此類更早的下游產物純化可以包括蛋白A池，例如其中蛋白A FVIP樣本含有大約73%單體和27%聚集的抗體構建體。如果進行根據本發明的重折疊，例如用2.0 M胍，在約pH 5.0至pH 8.0的範圍內的pH下，單體的百分比可以增加高達約94%。

在本發明的上下文中，已經令人驚訝地實現了限定pH範圍，其中將重折疊步驟整合到下游加工方法中較佳的是有效的。所述pH範圍取決於結合（腫瘤）靶的第一結合結構域的pI和/或整個抗體構建體的pI。如本文所述的抗體構建體的第一結構域典型地具有至少4.9的pI。例如，關於第一結構域，即靶結合結構域，如本文所述的CD33xCD3抗體構建體具有約4.9的pI。對於如本文所述的CD19xCD3抗體構建體，其他pI值典型地是約6.0，對於如本文所述的BCMAxCD3抗體構建體係約6.4，對於如本文所述的CD19xCD3抗體構建體係約8.7，對於如本文所述的MSLNxCD3抗體構建體係約9.4，以及對於如本文所述的FLT3xCD3抗體構建體係約9.2。因此，重折疊緩衝劑的pH至少應對應於典型地但不一定係4.9的本發明的抗體構建體的第一結合結構域的典型地最低pI。因此，例如，在本發明的上下文中，約pH 5的重折疊緩衝劑通常是適合的。

在本發明的上下文中，根據本發明的抗體構建體的第二結合結構域，即CD3ε結合結構域的pI，典型地具有比靶結合結構域更高的pI，例如至少9的pI，典型地9.3。在根據本發明存在第三結構域的情況下，pI典型地是至少7，典型地7.2。因此，整個抗體構建體的pI將高於第一結合結構域的pI。典型地，整個抗體構建體的pI係約7.0至9.0，即在中性範圍內。因此，在本發明的上下文中，其中發生重折疊的重折疊緩衝劑或環境的中性pH，例如pH 7.0至9.0，例如8.0係較佳的。例如，如本文所述的CD33xCD3抗體構建體具有約7.2的pI。對於如本文所述的CD19xCD3抗體構建體，其他pI值典型地是約8.0，對於如本文所述的BCMAxCD3抗體構建體係約8.0，對於如本文所述的CD19xCD3抗體構建體係約8.6，對於如本文所述的MSLNxCD3抗體構建體係約8.8，以及對於如本文所述的FLT3xCD3抗體構建體係約8.8。

在本發明中，「池」被理解為係一種下游處理流體，其包含加工產物（即雙特異性抗體構建體），並且不與基質（例如柱）締合。根據本發明的方法，可以將重折疊緩衝劑應用於若干個不同的池或柱上。池例如包括蛋白A純化後的過濾病毒失活池（FVIP）或藉由緩衝劑交換的CEX後或與過濾病毒失活步驟一致的高分子量（HMW）池。

雙特異性抗體構建體的濃度範圍可以為0.5至10 mg/ml內，較佳的是接近1 mg/ml。持續時間可以是幾小時，例如2至48小時，較佳的是長達24小時，更較佳的是約10、9、8、7、6、5、4、3或2小時，例如4小時。

根據本發明的方法，溫度範圍可以為4°C至40°C，例如10°C至30°C，較佳的是約20°C至約25°C，例如室溫約25°C。這樣的溫度選擇既避免了不受控制的和不希望的聚集，又確保了適合的反應時間。

在本發明的上下文中，可以使用若干種氧化劑和氧化還原劑。重折疊緩衝劑中較佳的是使用包括銅（即，銅(II)）、去氫抗壞血酸、溶解氧的「氧化劑」。較佳的濃度範圍係0.1至10mM，較佳的是0.5至1mM，其高於本領域關於封閉開放的二硫鍵所教導的濃度範圍。更低的氧化劑濃度（例如銅(II)）典型地會增加氧化，即二硫鍵的重建所需的時間。更高的氧化劑（例如銅(II)）濃度可能會不利地導致蛋胺酸殘基的氧化和截斷。如果蛋胺酸的氧化和截斷在對功能而言至關重要的蛋白質區域，則應將其降至最低。一般來講，選擇根據本發明的氧化劑（例如銅(II)）濃度作為殘留的開放二硫鍵與截斷之間的折衷方案。銅濃度還應藉由蛋白質濃度測定。先前，更低的銅濃度已在本領域中進行了描述，例如Harris等人2005中硫酸銅為0.005至0.1 mM，Treuheit等人、US 6808902、US 7723490中分別約0.01 mM。然而，本發明係關於包含0.1 mM至10 mM氧化劑，較佳的是0.5 mM至1mM氧化劑，例如銅(II)（較佳的是硫酸銅(II)）的方法，該方法導致藉由使用的根據本發明的離液劑能夠更快地重建二硫鍵的反應。不希望受理論的束縛，不使用離液劑，僅表面暴露的開放，即還原的二硫化物可被氧化劑或氧化還原劑觸及，以封閉（即氧化）二硫化物以恢復鍵和三級結構，從而有利地減少聚集物的量。

可以另外或替代使用若干種「氧化還原劑」，包括以下對：半胱胺酸/胱胺酸、半胱胺酸/胱胺、還原型麩胱甘肽 /氧化型麩胱甘肽。也可以單獨使用半胱胺酸或還原型麩胱甘肽，因為它們會例如在接近中性pH下產生氧化形式。令人驚訝地發現，半胱胺酸和胱胺酸的使用顯著減少了聚集物。然而，使用半胱胺酸和胱胺酸時，觀察到兩個半胱胺酸（一個開放的二硫鍵）的半胱胺酸化。較佳的是，胱胺酸濃度為約1 mM，並且半胱胺酸濃度相對於半胱胺酸濃度高n倍。例如，胱胺酸濃度可以在0.1 mM-10 mM的範圍內，較佳的是1 mM。半胱胺酸：胱胺酸比率可以為1: 1至33 : 1的任何值，較佳的是約20 : 1。可以以相當的濃度和比率使用胱胺代替胱胺酸。還原型和氧化型麩胱甘肽也可以以類似的濃度和比率使用。

將根據本發明的氧化劑如銅或去氫抗壞血酸與離液劑一起添加有利地減少了不希望的產物聚集物的量。典型地，可以實現聚集的顯著減少，例如，藉由重折疊可實現蛋白質A FVIP池中CD33xCD3雙特異性抗體構建體從26%到6%。較佳的條件可以包括，例如，使聚集物與pH 5.1的重折疊緩衝劑（乙酸鹽緩衝劑）和2.0 M胍在室溫下接觸4小時。在CEX HMW池中也可以實現聚集的顯著減少，例如藉由施用包含2.0 M胍和0.5 mM銅(II)的pH 8.0下的重折疊緩衝劑，或例如包含2.0 M胍和0.5 mM去氫抗壞血酸的pH 8.0下的重折疊緩衝劑。

本發明還係關於可以有利地用於根據本發明的方法的重折疊緩衝劑。

根據本發明的重折疊緩衝劑也適用於在下游層析柱（例如蛋白A柱）上重折疊。一般來講，本文所述的氧化還原重折疊方法可以在容器中、在柱上、在收穫後在細胞培養液中或在收穫前在生物反應器中的細胞培養基中藉由添加上述氧化還原和離液劑來進行。

根據本發明的雙特異性抗體構建體例如ScFc-BiTE®分子典型地含有Fc區，其大小，pI和疏水性與IgG抗體的相應區域類似。IgG抗體從宿主細胞蛋白（HCP）、其他生物反應器雜質和試劑、高分子量（HMW）物質或聚集物、低分子量物質或剪切物中的一般下游加工係本領域已知的（Shukla等人2006）。此類下游加工已適於純化雙特異性抗體構建體，例如scFc-BITE®，其典型地包括以下步驟：細胞培養物收穫；蛋白A層析法；過濾病毒失活；第二柱層析精製步驟或兩個，例如CEX；病毒過濾；UF/DF。上游獲得（例如在連續製造過程中）的雙特異性抗體構建體材料典型地藉由應用圖1中所示的步驟進行純化。根據本發明的實現氧化還原重折疊的方法可以在上面列出的任何收穫和純化步驟中進行，通常含有很大百分比的不希望的聚集。例如，氧化還原重折疊可以在蛋白質A層析法後在容器中進行，該蛋白質A層析法純化出宿主細胞蛋白質和試劑，但仍含有聚集物。可以將變性試劑添加到蛋白質A池中，或可以將蛋白質A池經緩衝劑交換進入變性重折疊緩衝劑中。還可以藉由用離液劑（例如胍、精胺酸、尿素）沖洗並孵育固定在柱上的蛋白質，從而在蛋白A柱上進行重折疊。也可以添加氧化試劑（例如銅或去氫抗壞血酸）或氧化還原試劑以進行柱上重折疊。

在本發明的上下文中，「離液劑（chaotrope）」或「離液劑（chaotrope agent）」應理解為變性劑或去折疊劑，例如胍、精胺酸、尿素、極端pH、有機溶劑例如醇和/或去污劑（例如SDS），其會破壞大分子（例如雙特異性抗體構建體）的氫鍵網路和凡得瓦相互作用。這增加了大分子的熵，這與大分子的動能或運動的增加相關。在根據本發明較佳施用的低濃度下，離液劑可以部分或暫態中斷蛋白質三級外部結構。對於全長單株抗體（mAb），Mehta等人2014年之前已經藉由使用不同的光譜技術、尺寸排阻層析法（SEC）和分析超離心法研究了濃度為0 M至2 M的離液劑胍鹽酸鹽（GdnHCl）的作用。在第0天，檢測到mAb三級結構的中度擾動。在第1天（在37°C下24小時後），在離液劑濃度高於1.2 M，尤其高於1.8 M時，觀察到三級結構的主要擾動。這導致在孵育6天和11天後，高分子量（HMW）物質增加。在高於1.2 M胍下，僅在誘導部分去折疊的溶液中檢測到mAb的聚集。Mehta等人2014指出，「差示掃描量熱法研究表明，抗體的CH2結構域在以1.2 M和更高濃度的GuHCl孵育的抗體分子中去折疊。該等結果表明，CH2結構域的去折疊導致聚集」。

基於本領域的教導，當應防止聚集時，技術人員將不願意使用濃度高於1 M的離液劑例如1.2 M胍來處理抗體或雙特異性抗體構建體。因此，令人驚訝的是，在本發明的方法中，出於重折疊目的，用離液劑濃度高於1M處理本發明的雙特異性抗體，並且仍然得到非聚集產物。然而，本發明的雙特異性抗體構建體在三個結合結構域的任一個中分別包含至少一個額外的二硫鍵，即在靶結合結構域、CD3結合結構域或scFc結合結構域中分別至少一個。較佳的是，在第三結構域的CH2中存在額外的二硫鍵，其使得雙特異性抗體構建體更穩定，即，比糖基化mAb的CH2更穩定。作為支持特徵，本發明的方法較佳的是施用更溫和的反應條件，即，反應時間短於24小時，例如4小時，溫度低於37°C，例如25°C。不希望受理論的束縛，根據如本文所要求保護的特殊性，施用根據本發明的方法不會導致三級結構的主要擾動，這最終將導致聚集。取而代之的是，經受本發明方法的聚集的雙特異性抗體構建體藉由離液劑的部分和過渡去折疊允許氧化劑和/或氧化還原劑到達「開放」的二硫鍵並再次將它們「封閉」。

在本發明的上下文中，「封閉」係指-S-S-二硫鍵的共價鍵的重建。因此，雙特異性抗體構建體的三級結構被重建並且先前的聚集被消除或至少減少。結果，提高了施用本發明的方法的下游加工的產物產率。

在本發明的上下文中，「細胞培養」或「培養」係指細胞在多細胞生物或組織外的生長和繁殖。哺乳動物細胞的適合培養條件係本領域已知的。參見例如Animal cell culture: A Practical Approach[動物細胞培養：一種實用方法], D. Rickwood編輯, Oxford University Press[牛津大學出版社], 紐約(1992)。哺乳動物細胞可以懸浮培養或附著在固體底物上培養。

術語「哺乳動物細胞」係指來自或源自任何哺乳動物（例如，人、倉鼠、小鼠、綠猴、大鼠、豬、牛或兔）的任何細胞。例如，哺乳動物細胞可以是永生化細胞。在一些實施方式中，哺乳動物細胞係分化細胞。在一些實施方式中，哺乳動物細胞係未分化細胞。本文描述了哺乳動物細胞的非限制性實例。哺乳動物細胞的另外實例係本領域已知的。

如本文所用，術語「細胞培養基（cell culturing medium）」（也稱為「培養基（culture medium）」、「細胞培養基（cell culture media）」、「組織培養基」）係指用於生長細胞（例如動物或哺乳動物細胞）的任何營養液，並且其通常提供以下至少一種或多種組分：能源（通常為碳水化合物，例如葡萄糖的形式）；所有必需胺基酸中的一種或多種，通常是二十種鹼性胺基酸，再加上半胱胺酸；典型地以低濃度需要的維生素和/或其他有機化合物；脂質或游離脂肪酸；和痕量元素，例如無機化合物或天然存在的元素，其典型地以極低濃度（通常在微莫耳範圍內）需要。

細胞培養基包括那些典型地用於和/或已知可用於任何細胞培養方法的培養基，例如但不限於分批、延長分批、補料分批和/或灌注或連續培養細胞。

「生長」細胞培養基或補料培養基係指典型地在指數生長時期（「生長階段」）用於細胞培養，並且在此階段期間足夠完整以支持細胞培養的細胞培養基。生長細胞培養基還可以含有賦予摻入到宿主細胞系中的可選擇標記抗性或存活性的選擇劑。這樣的選擇劑包括但不限於遺傳黴素(G4118)、新黴素、潮黴素B、嘌呤黴素、博來黴素、蛋胺酸亞磺醯亞胺、胺甲喋呤、無麩醯胺酸的細胞培養基、缺少甘胺酸的細胞培養基、次黃嘌呤和胸苷、或單獨的胸苷。

「生產」細胞培養基或補料培養基係指典型地在指數生長結束時的過渡期間以及在蛋白質生產接替時的後續過渡和/或生產階段期間用於細胞培養的細胞培養基。這樣的細胞培養基足夠完整以在該階段期間維持所需的細胞密度、生存力和/或產物滴度。

「灌注」細胞培養基或補料培養基係典型地用於藉由灌注或連續培養方法來維持的細胞培養的細胞培養基，並且其足夠完整以在此過程中支持細胞培養。灌注細胞培養基配製物可以比基礎細胞培養基配製物更豐富或更濃，以適應用於去除用過的培養基的方法。灌注細胞培養基可在生長階段和生產階段期間使用。

術語「培養」或「細胞培養」係指在一組受控的物理條件下維持或增殖哺乳動物細胞。

術語「哺乳動物細胞的培養」係指在一組受控的物理條件下維持或增殖的含有多個哺乳動物細胞的液體培養基。

術語「液體培養基」係指含有足夠營養以允許細胞（例如哺乳動物細胞）在體外生長或增殖的流體。例如，液體培養基可以含有以下一種或多種：胺基酸（例如20種胺基酸）、嘌呤（例如次黃嘌呤）、嘧啶（例如胸苷）、膽鹼、肌醇、硫胺素、葉酸、生物素、鈣、菸鹼醯胺、吡哆醇、核黃素、胸腺嘧啶、氰鈷胺、丙酮酸、硫辛酸、鎂、葡萄糖、鈉、鉀、鐵、銅、鋅和碳酸氫鈉。在一些實施方式中，液體培養基可以含有來自哺乳動物的血清。在一些實施方式中，液體培養基不含有來自哺乳動物的血清或另一種提取物（確定的液體培養基）。在一些實施方式中，液體培養基可含有痕量金屬、哺乳動物生長激素和/或哺乳動物生長因子。液體培養基的另一個實例係基本培養基（例如，僅含有無機鹽、碳源和水的培養基）。本文描述了液體培養基的非限制性實例。液體培養基的另外實例係本領域已知的並且可商購。液體培養基可以含有任何密度的哺乳動物細胞。例如，如本文所用，從生物反應器中去除的一定體積的液體培養基可以基本上不含哺乳動物細胞。

第二液體培養基可以與第一液體培養基相同。在分批補料培養的一些實例中，第二液體培養基係第一液體培養基的濃縮形式。在分批補料培養的一些實例中，第二液體培養基作為乾粉添加。

術語「抗體產物」係指「分泌的蛋白」或「分泌的重組蛋白」，並且是指在哺乳動物細胞中翻譯時最初含有至少一個分泌訊號序列，並且至少部分地藉由酶促切割哺乳動物細胞中的分泌訊號序列，將其至少部分地分泌到細胞外空間（例如，液體培養基）中的蛋白（例如重組蛋白）。熟練的從業人員將理解，「分泌的」蛋白質無需完全從細胞中解離，就可以認為係分泌的蛋白。

術語雙特異性抗體產物涵蓋雙特異性抗體，例如全長例如基於IgG的抗體及其片段，在本文中典型地稱為雙特異性抗體構建體。

術語「抗體構建體」係指其中結構和/或功能基於抗體（例如全長或完整免疫球蛋白分子）的結構和/或功能和/或從抗體或其片段的可變重鏈（VH）和/或可變輕鏈（VL）結構域中提取的分子。因此，抗體構建體能夠與其特異性靶或抗原結合。此外，根據本發明的抗體構建體的結合結構域包含允許靶結合的抗體的最小結構要求。這種最小要求可以例如藉由至少三個輕鏈CDR（即VL區的CDR1、CDR2和CDR3）和/或三個重鏈CDR（即VH區的CDR1、CDR2和CDR3），較佳的是全部六個CDR的存在來定義。定義抗體的最小結構要求的可替代方法係分別定義特異性靶結構內的抗體表位、構成表位區（表位簇）的靶蛋白的蛋白結構域或藉由參考與所定義抗體的表位競爭的特異性抗體。根據本發明的構建體所基於的抗體包括例如單株抗體、重組抗體、嵌合抗體、去免疫抗體、人源化抗體和人抗體。

根據本發明的抗體構建體的結合結構域可以例如包含上文提及的CDR組。較佳的是，那些CDR包含在抗體輕鏈可變區（VL）和抗體重鏈可變區（VH）的框架中；然而，它不一定包含兩者。例如，Fd片段具有兩個VH區並且通常保留完整抗原結合結構域的一些抗原結合功能。抗體片段、抗體變體或結合結構域的形式的另外實例包括 (1) Fab片段，一種具有VL、VH、CL和CH1結構域的單價片段；(2) F(ab')₂ 片段，一種具有由二硫橋在鉸鏈區連接的兩個Fab片段的二價片段；(3) 具有兩個VH和CH1結構域的Fd片段；(4) 具有抗體單臂的VL和VH結構域的Fv片段；(5) 具有VH結構域的dAb片段（Ward等人, (1989) Nature [自然] 341 :544-546）；(6) 分離的互補決定區（CDR）；和 (7) 單鏈Fv（scFv），後者係較佳的（例如，衍生自scFV文庫）。根據本發明的抗體構建體的實施方式的實例例如描述於以下中：WO 00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、WO 2014/144722、WO 2014/151910和WO 2015/048272。

另外，在「結合結構域」或「結合的結構域」的定義內係全長抗體的片段，如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab’、F(ab')2或「r IgG」（「半抗體」）。根據本發明的抗體構建體還可以包含抗體的修飾片段（也稱為抗體變體），如scFv、二-scFv或二(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉鍊、scFab、Fab₂ 、Fab₃ 、雙抗體、單鏈雙抗體、串聯雙抗體（Tandab’s）、串聯二-scFv、串聯三-scFv、「多抗體」（如三抗體或四抗體）、以及單結構域抗體如奈米抗體或僅包含一個可變結構域的單可變結構域抗體，該可變結構域可以是獨立於其他V區或結構域而特異性結合抗原或表位的VHH、VH或VL。

如本文使用的，術語「單鏈Fv」、「單鏈抗體」或「scFv」係指單多肽鏈抗體片段，該等抗體片段包含來自重鏈和輕鏈的可變區，但缺乏恒定區。一般來講，單鏈抗體在VH與VL結構域之間進一步包含多肽連接子，該多肽連接子使得其形成所希望的將允許抗原結合的結構。單鏈抗體詳細論述於以下中：Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies [單株抗體的藥理學]中, 第113卷, Rosenburg和Moore編輯 Springer-Verlag [施普林格出版社], 紐約, 第269-315頁 (1994)。產生單鏈抗體的各種方法係已知的，該等方法包括以下中所描述的那些：美國專利案號4,694,778和5,260,203；國際專利申請公開號WO 88/01649；Bird (1988) Science [科學] 242:423-442；Huston等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 85:5879-5883；Ward等人 (1989) Nature [自然] 334:54454；Skerra等人 (1988) Science [科學] 242:1038-1041。在具體的實施方式中，單鏈抗體還可以是雙特異性的、多特異性的、人和/或人源化的和/或合成的。

此外，術語「抗體構建體」的定義包括單價、二價和多價（polyvalent/multivalent）構建體，並且因此包括僅與兩個抗原結構特異性結合的雙特異性構建體，以及藉由不同的結合結構域特異性結合超過兩個（例如三個、四個或更多個）抗原結構的多特異性（polyspecific/multispecific）構建體。此外，術語「抗體構建體」的定義包括僅由一條多肽鏈組成的分子以及由超過一條多肽鏈組成的分子，該等鏈可以是相同的（同源二聚體、同源三聚體或同源寡聚物）或不同的（異源二聚體、異源三聚體或異源寡聚物）。上文鑒定的抗體及其變體或衍生物的實例尤其描述於以下中：Harlow和Lane, Antibodies a laboratory manual [抗體：實驗室手冊], CSHL Press [冷泉港實驗室出版社] (1988)和Using Antibodies: a laboratory manual [使用抗體：實驗室手冊], CSHL Press [冷泉港實驗室出版社] (1999)；Kontermann和Dübel, Antibody Engineering [抗體工程], Springer [施普林格], 第2版 2010和Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy [用於免疫療法的重組抗體], Cambridge University Press [劍橋大學出版社] 2009。

如本文使用的，術語「雙特異性」係指「至少雙特異性」的抗體構建體，即其至少包含第一結合結構域和第二結合結構域，其中第一結合結構域與一種抗原或靶（例如靶細胞表面抗原）結合，並且第二結合結構域與另一抗原或靶（例如CD3）結合。因此，根據本發明的抗體構建體包含針對至少兩種不同抗原或靶的特異性。例如，第一結構域較佳的是不與本文所述的物種中的一種或多種的CD3ε的細胞外表位結合。術語「靶細胞表面抗原」係指由細胞表現並且存在於細胞表面以使得為如本文所述的抗體構建體所接近的抗原結構。其可以是蛋白質，較佳的是蛋白質的細胞外部分，或碳水化合物結構，較佳的是蛋白質的碳水化合物結構，如糖蛋白。其較佳的是係腫瘤抗原。本發明的術語「雙特異性抗體構建體」還涵蓋多特異性抗體構建體，如三特異性抗體構建體，後者包括三個結合結構域，或具有超過三種（例如四種、五種……）特異性的構建體。

鑒於根據本發明的抗體構建體係（至少）雙特異性的，它們不是天然存在的並且與天然存在的產物明顯不同。因此，「雙特異性」抗體構建體或免疫球蛋白係具有至少兩個具有不同特異性的不同結合側端的人工雜交抗體或免疫球蛋白。雙特異性抗體構建體可以藉由多種方法產生，該等方法包括雜交瘤的融合或Fab'片段的連接。參見，例如Songsivilai和Lachmann, Clin. Exp. Immunol.[臨床實驗免疫學] 79:315-321 (1990)。

本發明的抗體構建體的至少兩個結合結構域和可變結構域（VH/VL）可以包含或可以不包含肽連接子（間隔肽）。根據本發明，術語「肽連接子」包含這樣的胺基酸序列：藉由該胺基酸序列，本發明的抗體構建體的一個（可變和/或結合）結構域和另一（可變和/或結合）結構域的胺基酸序列彼此連接。肽連接子也可以用於將第三結構域與本發明的抗體構建體的其他結構域融合。這種肽連接子的基本技術特徵在於它不包含任何聚合活性。適合的肽連接子係在美國專利4,751,180和4,935,233或WO 88/09344中描述的那些。肽連接子也可用於將其他結構域或模組或區（如半衰期延長結構域）連接到本發明的抗體構建體。

本發明的抗體構建體較佳的是為「體外產生的抗體構建體」。這個術語係指根據上述定義的抗體構建體，其中在非免疫細胞選擇，例如體外噬菌體展示、蛋白質晶片或其中可以測試候選序列與抗原結合的能力的任何其他方法中產生可變區（例如，至少一個CDR）的全部或一部分。因此，這個術語較佳的是排除僅由動物免疫細胞中的基因組重排產生的序列。「重組抗體」係藉由使用重組DNA技術或基因工程製得的抗體。

如本文使用的，術語「單株抗體」（mAb）或單株抗體構建體係指獲自實質上均質的抗體群體的抗體，即除了可能少量存在的可能天然存在的突變和/或翻譯後修飾（例如，異構化、醯胺化）外，包含該群體的單獨抗體係相同的。與典型地包括針對不同決定簇（或表位）的不同抗體的常規（多株）抗體製劑相比，單株抗體針對抗原上的單一抗原側或決定簇具有高度特異性。除了它們的特異性之外，單株抗體還在它們藉由雜交瘤培養合成，因此不被其他免疫球蛋白污染方面係有優勢的。修飾語「單株」指示獲自實質上均質的抗體群體的抗體的特徵，並且不應理解為要求藉由任何特定方法產生抗體。

對於單株抗體的製備，可以使用提供由連續細胞系培養物產生的抗體的任何技術。例如，將要使用的單株抗體可以藉由Koehler等人, Nature [自然], 256: 495 (1975)首次描述的雜交瘤方法，或可以藉由重組DNA方法（參見，例如美國專利案號4,816,567）製備。用於產生人單株抗體的另外技術的實例包括三源雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術（Kozbor, Immunology Today [今日免疫學] 4 (1983), 72）和EBV-雜交瘤技術（Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy [單株抗體和癌症治療], Alan R. Liss公司 (1985), 77-96）。

然後可以使用標準方法(如酶聯免疫吸附測定（ELISA）和表面電漿共振（BIACORE™）分析）篩選雜交瘤，以鑒定一種或多種產生與指定抗原特異性結合的抗體的雜交瘤。任何形式的相關抗原均可以用作免疫原，例如重組抗原、天然存在形式、其任何變體或片段以及其抗原肽。如在BIAcore系統中使用的表面電漿共振可以用於增加與靶細胞表面抗原的表位結合的噬菌體抗體的效率（Schier, Human Antibodies Hybridomas [人抗體雜交瘤] 7 (1996), 97-105；Malmborg, J. Immunol. Methods [免疫學方法雜誌] 183 (1995), 7-13）。

另一種製備單株抗體的示例性方法包括篩選蛋白質表現文庫，例如噬菌體展示或核糖體展示文庫。噬菌體展示例如描述於以下中：Ladner等人, 美國專利案號5,223,409；Smith (1985) Science [科學] 228:1315-1317、Clackson等人, Nature [自然], 352: 624-628 (1991)和Marks等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], 222: 581-597 (1991)。

除了使用展示文庫之外，還可以使用相關抗原來免疫非人動物，例如齧齒動物（如小鼠、倉鼠、兔或大鼠）。在一個實施方式中，非人動物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可能利用人Ig（免疫球蛋白）基因座的大片段來工程化小鼠抗體產生缺陷的小鼠品系。使用雜交瘤技術，可以產生並選擇衍生自具有所希望的特異性的基因的抗原特異性單株抗體。參見，例如，XENOMOUSE™、Green等人 (1994) Nature Genetics [自然遺傳學] 7:13-21、US 2003-0070185、WO 96/34096和WO 96/33735。

單株抗體也可以獲自非人動物，並且然後使用本領域中已知的重組DNA技術進行修飾，例如人源化、去免疫、呈現嵌合等。修飾的抗體構建體的實例包括非人抗體的人源化變體、「親和力成熟」抗體（參見，例如Hawkins等人 J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 254, 889-896 (1992) 和Lowman等人, Biochemistry [生物化學] 30, 10832- 10837 (1991)）和具有改變的一種或多種效應子功能的抗體突變體（參見，例如美國專利5,648,260、Kontermann和Dübel (2010), 上述引文和Little (2009), 上述引文）。

在免疫學中，親和力成熟係這樣的過程：藉由該過程，在免疫應答的過程中B細胞產生對抗原的親和力增加的抗體。反復暴露於相同的抗原後，宿主會產生親和力依次更大的抗體。如天然原型一樣，體外親和力成熟基於突變和選擇的原理。體外親和力成熟已經成功地用於優化抗體、抗體構建體和抗體片段。使用輻射、化學誘變劑或易錯PCR在CDR內引入隨機突變。此外，遺傳多樣性可以藉由鏈改組來增加。使用展示方法（如噬菌體展示）進行兩輪或三輪突變和選擇通常產生具有在低納莫耳範圍內的親和力的抗體片段。

抗體構建體的胺基酸取代變化的較佳的類型涉及取代親本抗體（例如人源化或人抗體）的一個或多個高變區殘基。一般來講，選擇用於進一步開發的一種或多種所得變體相對於產生它們的親本抗體將具有改善的生物特性。用於產生此類取代變體的便利方式涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡而言之，將若干個高變區側端（例如6-7個側端）突變以在每個側端產生所有可能的胺基酸取代。由此產生的抗體變體以單價方式從絲狀噬菌體顆粒展示為與每個顆粒內包裝的M13的基因III產物的融合物。然後如本文所揭露那樣篩選噬菌體展示的變體的生物活性（例如結合親和力）。為了鑒定用於修飾的候選高變區側端，可以進行丙胺酸掃描誘變以鑒定對抗原結合有顯著貢獻的高變區殘基。可替代地或另外，分析抗原-抗體複合物的晶體結構以鑒定結合結構域與例如人靶細胞表面抗原之間的接觸點可能是有利的。根據本文闡述的技術，此類接觸殘基和相鄰殘基係用於取代的候選者。一旦產生了此類變體，就如本文所述對這組變體進行篩選，並且可以選擇在一種或多種相關測定中具有優異特性的抗體用於進一步的開發。

本發明的單株抗體和抗體構建體具體地包括「嵌合」抗體（免疫球蛋白），其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列一致或同源，而一個或多個鏈的其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列一致或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現出所希望的生物活性即可（美國專利案號4,816,567；Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 81: 6851-6855 (1984)）。本文感興趣的嵌合抗體包括「靈長類化」抗體，該等抗體包含衍生自非人靈長類動物（例如，舊大陸猴、猿等）的可變結構域抗原結合序列和人恒定區序列。已經描述了多種用於製備嵌合抗體的方法。參見，例如，Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. [美國國家科學院院刊] 81:6851 , 1985；Takeda等人, Nature [自然] 314:452, 1985；Cabilly等人, 美國專利案號4,816,567；Boss等人, 美國專利案號4,816,397；Tanaguchi等人, EP 0171496；EP 0173494；和GB 2177096。

抗體、抗體構建體、抗體片段或抗體變體還可以藉由例如WO 98/52976或WO 00/34317中揭露的方法特定地缺失人T細胞表位（稱為「去免疫」的方法）來進行修飾。簡而言之，可以對與MHC II類結合的肽分析抗體的重鏈和輕鏈可變結構域；該等肽代表潛在的T細胞表位（如WO 98/52976和WO 00/34317中所定義）。為了檢測潛在T細胞表位，可以應用稱為「肽穿線」的電腦建模方法，並且此外可以搜索人MHC II類結合肽的數據庫以查找VH和VL序列中存在的模體，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。該等模體與18種主要的MHC II類DR同種異型中的任一種結合，並且因此構成潛在T細胞表位。檢測到的潛在T細胞表位可以藉由取代可變結構域中的少量胺基酸殘基，或者較佳的是藉由單個胺基酸取代來消除。典型地，進行保守取代。通常但不排他地，可以使用與人種系抗體序列中的位置共有的胺基酸。人種系序列例如揭露於以下中：Tomlinson等人 (1992) J. MoI. Biol. [分子生物學雜誌] 227:776-798；Cook, G.P.等人 (1995) Immunol. Today [當代免疫]第16 (5)卷: 237-242；和Tomlinson等人 (1995) EMBO J. [歐洲分子生物學學會雜誌] 14: 14:4628-4638。V BASE目錄提供了人免疫球蛋白可變區序列的綜合目錄（由Tomlinson, LA.等人編輯 MRC Centre for Protein Engineering [醫學研究理事會蛋白質工程中心], Cambridge, UK [英國劍橋]）。該等序列可以用作人序列的來源，例如用於框架區和CDR。也可以使用共有的人框架區，例如如美國專利案號6,300,064中所述。

「人源化」抗體、抗體構建體、其變體或片段（如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其他抗原結合子序列）係主要人序列的抗體或免疫球蛋白，其含有一種或多種衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。對於大部分來說，人源化抗體係人免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受體的高變區（也稱為CDR）的殘基被來自非人（例如齧齒動物）物種（供體抗體）（如小鼠、大鼠、倉鼠或兔）的具有所希望的特異性、親和力和能力的高變區的殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區（FR）殘基被相應的非人類殘基替換。此外，如本文使用的，「人源化抗體」還可以包括在受體抗體或供體抗體中均未發現的殘基。進行該等修飾以進一步改善和優化抗體性能。人源化抗體還可以包含典型地是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定區（Fc）的至少一部分。關於進一步的細節，參見Jones等人, Nature [自然], 321: 522-525 (1986)；Reichmann等人, Nature [自然], 332: 323-329 (1988)；和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. [結構生物學新見], 2: 593-596 (1992)。

人源化抗體或其片段可以藉由用人Fv可變結構域的等效序列替換不直接參與抗原結合的Fv可變結構域的序列來產生。用於產生人源化抗體或其片段的示例性方法由以下提供：Morrison (1985) Science [科學] 229:1202-1207；Oi等人 (1986) BioTechniques [生物技術] 4:214；以及US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；和US 6,407,213。那些方法包括分離、操縱和表現編碼來自重鏈或輕鏈中的至少一者的全部或部分免疫球蛋白Fv可變結構域的核酸序列。此類核酸可以獲自如上所述的產生針對預定靶的抗體的雜交瘤，以及其他來源。然後可以將編碼人源化抗體分子的重組DNA選殖到適當的表現載體中。

人源化抗體還可以使用轉基因動物（如表現人重鏈和輕鏈基因但不能表現內源性小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的小鼠）產生。Winter描述了可用於製備本文所述的人源化抗體的示例性CDR移植方法（美國專利案號5,225,539）。特定人抗體的全部CDR可以用至少一部分非人CDR替換，或者僅一些CDR可以用非人CDR替換。僅需要替換用於將人源化抗體與預定抗原結合所需的CDR數量。

可以藉由引入保守取代、共有序列取代、種系取代和/或回復突變來優化人源化抗體。此類改變的免疫球蛋白分子可以藉由本領域已知的幾種技術中的任何一種來製備（例如，Teng等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.[美國國家科學院院刊], 80: 7308-7312, 1983；Kozbor等人, Immunology Today [今日免疫學], 4: 7279, 1983；Olsson等人, Meth. Enzymol.[酶學方法], 92: 3-16, 1982，以及EP 239 400）。

術語「人抗體」、「人抗體構建體」和「人結合結構域」包括具有抗體區的抗體、抗體構建體和結合結構域，該等抗體區如實質上對應於本領域中已知的人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區或結構域，包括例如由Kabat等人 (1991)（上述引文）描述的那些。本發明的人抗體、抗體構建體或結合結構域可以在例如CDR中且特別是CDR3中包含不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基（例如藉由體外隨機或側端特異性誘變或藉由體內體細胞突變引入的突變）。人抗體、抗體構建體或結合結構域可以具有至少1個、2個、3個、4個、5個或更多個被不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基替換的位置。然而，如本文使用的人抗體、抗體構建體和結合結構域的定義還涵蓋「完全人抗體」，該等完全人抗體僅包含非人工和/或遺傳改變的人抗體序列，如可藉由使用如Xenomouse技術或系統衍生的那些。較佳的是，「完全人抗體」不包含不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基。

在一些實施方式中，本發明的抗體構建體係「分離的」或「實質上純的」抗體構建體。當用於描述本文揭露的抗體構建體時，「分離的」或「實質上純的」意指抗體構建體已從其產生環境的組分中鑒定、分離和/或回收。較佳的是，抗體構建體不與或實質上不與來自其產生環境的所有其他組分締合。其產生環境的污染組分，如由重組轉染細胞產生的污染組分，係典型地干擾多肽的診斷或治療用途的物質，並且可以包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。抗體構建體可以例如占給定樣本中總蛋白質的至少約5重量%或至少約50重量%。應理解，根據情況，分離的蛋白質可以占總蛋白質含量的5重量%至99.9重量%。藉由使用誘導型啟動子或高表現啟動子，能以顯著更高的濃度製備多肽，以使得它以增加的濃度水平製備。該定義包括在本領域中已知的多種生物體和/或宿主細胞中產生抗體構建體。在較佳的實施方式中，抗體構建體 (1) 藉由使用旋杯式序列分析儀純化至足以獲得至少15個N末端或內部胺基酸序列的殘基的程度，或 (2) 藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍或較佳的是銀染色純化至均質。然而，通常藉由至少一個純化步驟來製備分離的抗體構建體。

術語「結合結構域」關於本發明表徵了（特異性地）結合/相互作用/識別靶分子（抗原）（例如分別為CD33和CD3）上的給定靶表位或給定靶側端的結構域。第一結合結構域（識別例如CD33）的結構和功能以及較佳的是還有第二結合結構域（例如識別CD3）的結構和/或功能係基於抗體，例如全長或完整免疫球蛋白分子的結構和/或功能，和/或係從抗體或其片段的可變重鏈（VH）和/或可變輕鏈（VL）結構域中提取。較佳的是，第一結合結構域的特徵在於存在三個輕鏈CDR（即VL區的CDR1、CDR2和CDR3）和/或三個重鏈CDR（即VH區的CDR1、CDR2和CDR3）。第二結合結構域較佳的是還包含允許靶結合的抗體的最小結構要求。更較佳的是，第二結合結構域包含至少三個輕鏈CDR（即VL區的CDR1、CDR2和CDR3）和/或三個重鏈CDR（即VH區的CDR1、CDR2和CDR3）。設想第一結合結構域和/或第二結合結構域係藉由噬菌體展示或文庫篩選方法產生或可獲得的，而不是藉由將CDR序列從預先存在的（單株）抗體移植到支架中產生或可獲得的。

根據本發明，結合結構域呈一種或多種多肽的形式。此類多肽可以包括蛋白質部分和非蛋白質部分（例如化學連接子或化學交聯劑，如戊二醛）。蛋白質（包括其片段、較佳的是生物活性片段和通常具有少於30個胺基酸的肽）包含經由共價肽鍵彼此偶聯的兩個或更多個胺基酸（產生胺基酸鏈）。

如本文使用的，術語「多肽」描述了一組分子，該等分子通常由超過30個胺基酸組成。多肽可以進一步形成多聚體，如二聚體、三聚體和更高級的寡聚物，即由多於一個多肽分子組成。形成此類二聚體、三聚體等的多肽分子可以是相同的或不相同的。因此，此類多聚體的相應的更高級結構稱為同源二聚體或異源二聚體、同源三聚體或異源三聚體等。異源多聚體的實例係在其天然形式下由兩條相同的輕鏈多肽鏈和兩條相同的重鏈多肽鏈組成的抗體分子。術語「肽」、「多肽」和「蛋白質」還是指天然修飾的肽/多肽/蛋白質，其中該修飾係藉由例如翻譯後修飾（如糖基化、乙醯化、磷酸化等）來實現。當在本文中提及時，「肽」、「多肽」或「蛋白質」也可以是化學修飾的，如聚乙二醇化。此類修飾在本領域中是熟知的並且在下文描述。

較佳的是，結合靶細胞表面抗原的結合結構域和/或結合CD3ε的結合結構域係人結合結構域。包含至少一個人結合結構域的抗體和抗體構建體避免了與具有非人（如齧齒動物（例如鼠、大鼠、倉鼠或兔））可變區和/或恒定區的抗體或抗體構建體相關的一些問題。此類齧齒動物衍生的蛋白質的存在可以導致抗體或抗體構建體的快速清除或可以導致患者產生針對抗體或抗體構建體的免疫應答。為了避免使用齧齒動物衍生的抗體或抗體構建體，可以藉由將人抗體功能引入到齧齒動物中以使齧齒動物產生完全人抗體來產生人或完全人抗體/抗體構建體。

在YAC中選殖和重組兆鹼基大小的人基因座並將它們引入到小鼠種系中的能力為闡明非常大或粗略定位的基因座的功能組分以及產生有用的人疾病模型提供了強有力的方法。此外，使用這種技術將小鼠基因座取代為其人等效物可以提供關於人基因產物在發育過程中的表現和調控、其與其他系統的通信以及其參與疾病誘導和進展的獨特見解。

這種策略的重要實際應用係小鼠體液免疫系統的「人源化」。將人免疫球蛋白（Ig）基因座引入到其中內源性Ig基因已經失活的小鼠中提供了研究抗體的程序化表現和組裝的根本機制以及其在B細胞發育中的作用的機會。此外，這種策略可以為完全人單株抗體（mAb）的產生提供理想來源-這係有助於實現抗體療法在人疾病中的前景的重要里程碑。預期完全人抗體或抗體構建體將小鼠或小鼠衍生的mAb所固有的免疫原性和變應性應答最小化，並且由此增加施用的抗體/抗體構建體的功效和安全性。可以預期使用完全人抗體或抗體構建體在治療需要重複施用化合物的慢性和復發性人疾病（如炎症、自體免疫和癌症）中提供顯著的優勢。

實現這一目標的一種方法係用人Ig基因座的大片段工程化小鼠抗體產生缺陷的小鼠品系，預期這種小鼠在不存在小鼠抗體的情況下將產生大的人抗體組庫。大的人Ig片段將保持大的可變基因多樣性以及對抗體產生和表現的適當調控。藉由利用小鼠機構實現抗體多樣化和選擇以及缺乏對人蛋白質的免疫耐受性，在該等小鼠品系中再生的人抗體組庫應產生針對任何感興趣的抗原（包括人抗原）的高親和力抗體。使用雜交瘤技術，可以容易地產生和選擇具有所希望特異性的抗原特異性人mAb。結合第一種XenoMouse小鼠品系的產生證明了這個一般策略（參見Green等人 Nature Genetics [自然遺傳學] 7:13-21 (1994))。XenoMouse品系用分別含有人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的245 kb和190 kb大小的種系構型片段的酵母人工染色體（YAC）工程化，該等種系構型片段含有核心可變區和恒定區序列。證明含有人Ig的YAC與小鼠系統相容以重排和表現抗體，並且能夠取代失活的小鼠Ig基因。這藉由其誘導B細胞發育、產生完全人抗體的成人樣人組庫和產生抗原特異性人mAb的能力來證明。該等結果還表明，引入含有更多數量的V基因、另外的調控元件和人Ig恒定區的更大部分的人Ig基因座可以實質上再現作為對感染和免疫的人體液應答的特徵的完整組庫。Green等人的工作最近擴展到藉由分別引入兆鹼基大小的人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的種系構型YAC片段來引入大於大約80%的人抗體組庫。參見Mendez等人 Nature Genetics [自然遺傳學] 15:146-156 (1997) 和美國專利申請案序號08/759,620。

XenoMouse小鼠的產生進一步論述和描繪於以下中：美國專利申請案序號07/466,008、序號07/610,515、序號07/919,297、序號07/922,649、序號08/031,801、序號08/112,848、序號08/234,145、序號08/376,279、序號08/430,938、序號08/464,584、序號08/464,582、序號08/463,191、序號08/462,837、序號08/486,853、序號08/486,857、序號08/486,859、序號08/462,513、序號08/724,752和序號08/759,620；和美國專利案號6,162,963；6,150,584；6,114,598；6,075,181和5,939,598以及日本專利案號3 068 180 B2、3 068 506 B2、和3 068 507 B2。還參見Mendez等人 Nature Genetics [自然遺傳學] 15:146-156 (1997)以及Green和Jakobovits J. Exp. Med. [實驗醫學雜誌] 188:483-495 (1998)、EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310和WO 03/47336。

在一個可替代的方法中，包括真藥物國際公司（GenPharm International, Inc.）的其他公司利用了「微基因座」方法。在微基因座方法中，藉由包含來自Ig基因座的碎片（單獨的基因）來模擬外源性Ig基因座。因此，將一個或多個VH基因、一個或多個DH基因、一個或多個JH基因、mu恒定區和第二恒定區（較佳的是γ恒定區）形成為用於插入到動物中的構建體。該方法描述於以下中：Surani等人的美國專利案號5,545,807和美國專利案號5,545,806；5,625,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；5,770,429；5,789,650；5,814,318；5,877,397；5,874,299；和6,255,458（各自為Lonberg和Kay）、Krimpenfort和Berns的美國專利案號5,591,669和6,023.010、Berns等人的美國專利案號5,612,205；5,721,367；和5,789,215、以及Choi和Dunn的美國專利案號5,643,763、以及真藥物（GenPharm）國際美國專利申請案序號07/574,748、序號07/575,962、序號07/810,279、序號07/853,408、序號07/904,068、序號07/990,860、序號08/053,131、序號08/096,762、序號08/155,301、序號08/161,739、序號08/165,699、序號08/209,741。還參見EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美國專利案號5,981,175。進一步參見Taylor等人(1992)、Chen等人 (1993)、Tuaillon等人(1993)、Choi等人 (1993)、Lonberg等人(1994)、Taylor等人 (1994)、和Tuaillon等人 (1995)、Fishwild等人 (1996)。

Kirin也展示了從藉由微細胞融合引入大段染色體或整個染色體的小鼠產生人抗體。參見歐洲專利申請號773 288和843 961。Xenerex Biosciences正在開發用於人抗體的潛在產生的技術。在這種技術中，用人淋巴細胞（例如B和/或T細胞）重組SCID小鼠。然後將小鼠用抗原免疫並且可產生針對抗原的免疫應答。參見美國專利案號5,476,996；5,698,767；和5,958,765中。

人抗小鼠抗體（HAMA）應答已經導致該行業製備嵌合或其他人源化抗體。然而，預期特別是在抗體的長期或多劑量利用中會觀察到某些人抗嵌合抗體（HACA）應答。因此，期望提供包含針對靶細胞表面抗原的人結合結構域和針對CD3ε的人結合結構域的抗體構建體，以消除HAMA或HACA應答的問題和/或效應。

術語「與……（特異性）結合」、「（特異性）識別」、「（特異性）針對」和「與……（特異性）反應」意指根據本發明，結合結構域與靶分子（抗原）（此處：分別為靶細胞表面抗原和CD3ε）上的給定表位或給定靶側端相互作用或特異性相互作用。

術語「表位」係指結合結構域（如抗體或免疫球蛋白，或抗體或免疫球蛋白的衍生物、片段或變體）特異性結合的抗原上的一側。「表位」係抗原性的，並且因此術語表位在本文中有時也稱為「抗原結構」或「抗原決定簇」。因此，結合結構域係「抗原相互作用側」。所述結合/相互作用也被理解為定義「特異性識別」。

「表位」可以藉由連續的胺基酸或藉由蛋白質的三級折疊並置的非連續胺基酸形成。「線性表位」係這樣的表位，其中胺基酸一級序列包含所識別表位。線性表位典型地在獨特的序列中包括至少3個或至少4個、且更通常地至少5個或至少6個或至少7個，例如約8個至約10個胺基酸。

與線性表位相反，「構象表位」係這樣的表位，其中構成表位的胺基酸的一級序列不是所識別表位的唯一限定組分（例如，其中胺基酸的一級序列不一定被結合結構域識別的表位）。典型地，構象表位包含相對於線性表位增加數量的胺基酸。關於構象表位的識別，結合結構域識別抗原、較佳的是肽或蛋白質或其片段的三維結構（在本發明的上下文下，一個結合結構域的抗原結構包括於靶細胞表面抗原蛋白質內）。例如，當蛋白質分子折疊以形成三維結構時，形成構象表位的某些胺基酸和/或多肽骨架並置，使得抗體能夠識別表位。確定表位構象的方法包括但不限於x射線晶體學、二維核磁共振（2D-NMR）光譜學和定點自旋標記和電子順磁共振（EPR）光譜學。

以下描述了用於表位定位的方法：當人靶細胞表面抗原蛋白中的區（連續胺基酸拉伸物）用非人和非靈長類動物靶細胞表面抗原（例如，小鼠靶細胞表面抗原，但是其他如雞、大鼠、倉鼠、兔等也是可能的）的其相應區交換/替換時，預期發生結合結構域結合的降低，除非結合結構域對於所用的非人、非靈長類動物靶細胞表面抗原具有交叉反應性。相比於與人靶細胞表面抗原蛋白中的相應區的結合，所述降低較佳的是為至少10%、20%、30%、40%或50%；更較佳的是至少60%、70%或80%，並且最較佳的是90%、95%或甚至100%，由此將與人靶細胞表面抗原蛋白中相應區的結合設定為100%。設想上述人靶細胞表面抗原/非人靶細胞表面抗原嵌合體在CHO細胞中表現。還設想人靶細胞表面抗原/非人靶細胞表面抗原嵌合體與不同膜結合蛋白（如EpCAM）的跨膜結構域和/或細胞質結構域融合。

在用於表位定位的可替代或另外的方法中，可以產生若干種截短形式的人靶細胞表面抗原細胞外結構域，以確定由結合結構域識別的特定區域。在該等截短形式中，從N末端開始逐步缺失不同的細胞外靶細胞表面抗原結構域/亞結構域或區域。設想截短的靶細胞表面抗原形式可以在CHO細胞中表現。還設想截短的靶細胞表面抗原形式可以與不同膜結合蛋白（如EpCAM）的跨膜結構域和/或細胞質結構域融合。還設想截短的靶細胞表面抗原形式可在其N末端涵蓋訊息肽結構域，例如衍生自小鼠IgG重鏈訊息肽的訊息肽。進一步設想，截短的靶細胞表面抗原形式可以在其N末端（在訊息肽後）涵蓋v5結構域，其允許驗證它們在細胞表面上的正確表現。預期不再涵蓋由結合結構域識別的靶細胞表面抗原區域的那些截短的靶細胞表面抗原形式發生結合的降低或喪失。結合降低較佳的是為至少10%、20%、30%、40%、50%；更較佳的是至少60%、70%、80%，並且最較佳的是90%、95%或甚至100%，由此將與整個人靶細胞表面抗原蛋白（或其細胞外區域或結構域）的結合設定為100。

確定靶細胞表面抗原的特定殘基對抗體構建體或結合結構域的識別的貢獻的另一種方法係丙胺酸掃描（參見，例如Morrison KL和Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. [化學生物學新見] 2001年6月;5(3):302-7），其中待分析的每個殘基例如經由定點誘變被丙胺酸替換。丙胺酸的使用係因為其具有非巨大的、化學惰性的甲基官能基，但仍然模仿許多其他胺基酸所具有的二級結構參考。在需要保守突變殘基的大小的情形下，有時可以使用巨大的胺基酸（如纈胺酸或亮胺酸）。丙胺酸掃描係一項已經使用了很長一段時間的成熟技術。

結合結構域與表位或包含表位的區域之間的相互作用意味著結合結構域對特定蛋白或抗原（此處：分別為靶細胞表面抗原和CD3）上的表位/包含表位的區域表現出可觀的親和力，並且通常與靶細胞表面抗原或CD3以外的蛋白質或抗原不表現出顯著反應性。「可觀的親和力」包括以約10^-6 M(KD)或更強的親和力結合。較佳的是，當結合親和力為約10^-12 至10^-8 M、10^-12 至10^-9 M、10^-12 至10^-10 M、10^-11 至10^-8 M，較佳的是約10^-11 至10^-9 M時，認為結合係特異性的。尤其藉由將所述結合結構域與靶蛋白或抗原的反應與所述結合結構域與除靶細胞表面抗原或CD3以外的蛋白質或抗原的反應進行比較，可以容易地測試結合結構域是否與靶特異性反應或結合。較佳的是，本發明的結合結構域基本上或實質上不結合除靶細胞表面抗原或CD3以外的蛋白質或抗原（即，第一結合結構域較佳的是不能結合除靶細胞表面抗原以外的蛋白質，並且第二結合結構域不能結合除CD3以外的蛋白質）。設想根據本發明的抗體構建體的特徵為與其他HLE形式相比具有優異的親和力特徵。因此，這種優異的親和力表明體內半衰期延長。根據本發明的抗體構建體的更長的半衰期可以減少典型地有助於改善患者順應性的施用的持續時間和頻率。這係特別重要的，因為本發明的抗體構建體對高度虛弱的或甚至多重性癌症患者特別有益。

術語「基本上/實質上不結合」或「不能結合」意指本發明的結合結構域不結合除靶細胞表面抗原或CD3以外的蛋白質或抗原，即與除靶細胞表面抗原或CD3以外的蛋白質或抗原不顯示超過30%，較佳的是不超過20%，更較佳的是不超過10%，特別較佳的是不超過9%、8%、7%、6%或5%的反應性，由此將與靶細胞表面抗原或CD3的結合分別設定為100%。

據信特異性結合係藉由結合結構域和抗原的胺基酸序列中的特定模體實現的。因此，由於其一級、二級和/或三級結構以及所述結構的二次修飾，因此實現了結合。抗原相互作用側端與其特異性抗原的特異性相互作用可以導致所述側端與抗原的簡單結合。此外，抗原相互作用側端與其特異性抗原的特異性相互作用可以可替代地或另外地導致訊號的引發，例如由於誘導抗原構象的變化、抗原的寡聚化等。

術語「可變」係指抗體或免疫球蛋白結構域表現出其序列可變性並且參與確定特定抗體的特異性和結合親和力的部分（即「一個或多個可變結構域」）。可變重鏈（VH）和可變輕鏈（VL）的配對一起形成單個抗原結合側端。

可變性在整個抗體的可變結構域中並不均勻分佈；它集中在重鏈可變區和輕鏈可變區中的每一個的子結構域中。該等子結構域被稱為「高變區」或「互補決定區」（CDR）。可變結構域的更保守的（即非高變）部分被稱為「框架」區（FRM或FR），並且為三維空間中的六個CDR提供支架以形成抗原結合表面。天然存在的重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FRM區域（FR1、FR2、FR3和FR4），這四個FRM區域主要使用β-折疊構型，藉由三個高變區連接，這三個高變區形成連接β-折疊結構的環，並且在一些情況下形成β-折疊結構的一部分。每條鏈中的高變區藉由FRM緊密靠近在一起，並與來自另一條鏈的高變區一起有助於抗原結合側端的形成（參見Kabat等人, 上述引文）。

術語「CDR」及其複數「CDR」係指其中三個構成輕鏈可變區的結合特徵（CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3）並且三個構成重鏈可變區的結合特徵（CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3）的互補決定區。CDR含有大部分負責抗體與抗原特異性相互作用的殘基，並且因此有助於抗體分子的功能活性：它們係抗原特異性的主要決定簇。

準確定義的CDR邊界和長度受制於不同的分類和編號系統。因此，CDR可以藉由Kabat、Chothia、contact或任何其他邊界定義（包括本文所述的編號系統）來引用。儘管有不同的邊界，但該等系統中的每一者在構成可變序列內所謂的「高變區」的方面具有一定程度的重疊。因此，根據該等系統的CDR定義可以相對於相鄰框架區在長度和邊界區域方面不同。參見例如Kabat（基於跨物種序列變異性的方法）、Chothia（基於抗原-抗體複合物的晶體學研究的方法）、和/或MacCallum（Kabat等人, 上述引文；Chothia等人, J. MoI. Biol[分子生物學雜誌], 1987, 196: 901-917；和MacCallum等人, J. MoI. Biol[分子生物學雜誌], 1996, 262: 732）。表徵抗原結合側端的又另一標準係由牛津大學分子公司（Oxfbrd Molecular）的AbM抗體建模軟體使用的AbM定義。參見例如，Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains [抗體可變結構域的蛋白質序列和結構分析]在：Antibody Engineering Lab Manual [抗體工程實驗室手冊]（編輯：Duebel, S.和Kontermann, R.，施普林格出版社（Springer-Verlag），海德爾堡）。就兩種殘基鑒定技術定義重疊區而非相同區而言，可以將它們組合以定義雜合CDR。然而，根據所謂的Kabat系統進行編號係較佳的。

典型地，CDR形成可以分類為規範結構的環結構。術語「規範結構」係指由抗原結合（CDR）環所使用的主鏈構象。從比較結構研究中，已經發現六個抗原結合環中的五個僅具有有限的可用構象組庫。每個規範結構可以藉由多肽骨架的扭轉角來表徵。因此，抗體之間的對應環可具有非常類似的三維結構，但環中大部分具有高胺基酸序列變異性（Chothia和Lesk, J. MoI. Biol.[分子生物學雜誌], 1987, 196: 901；Chothia等人, Nature[自然], 1989, 342: 877；Martin和Thornton, J. MoI. Biol[分子生物學雜誌], 1996, 263: 800）。此外，所使用的環結構與其周圍的胺基酸序列之間存在關係。特定規範類別的構象由環的長度和位於環內以及保守框架內（即，環外）關鍵位置的胺基酸殘基決定。因此，可以基於該等關鍵胺基酸殘基的存在來進行對特定規範類別的分配。

術語「規範結構」還可以包括關於抗體的線性序列的考慮因素，例如，如藉由Kabat（Kabat等人, 上述引文）編目的。Kabat編號方案（系統）係以一致方式對抗體可變結構域的胺基酸殘基進行編號的廣泛使用的標準，並且是本發明應用的較佳的方案，也如本文其他地方所提及。另外的結構考慮因素也可以用於確定抗體的規範結構。例如，Kabat編號未完全反映的那些差異可以藉由Chothia等人的編號系統來描述，和/或藉由其他技術（例如結晶學和二維或三維計算建模）來揭示。因此，可以將給定的抗體序列置於規範類別中，該類別尤其允許鑒定適當的基礎結構（chassis）序列（例如，基於在文庫中包括多種規範結構的期望）。文獻中描述了抗體胺基酸序列的Kabat編號和如由Chothia等人，上述引文所述的結構考慮因素以及其對解釋抗體結構的規範方面的意義。不同類別的免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型在本領域中是熟知的。有關抗體結構的綜述，參見Antibodies: A Laboratory Manual [抗體：實驗室手冊], Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港實驗室], Harlow等人編輯, 1988。

輕鏈的CDR3以及特別是重鏈的CDR3可以構成輕鏈可變區和重鏈可變區內抗原結合中最重要的決定簇。在一些抗體構建體中，重鏈CDR3似乎構成抗原與抗體之間主要的接觸區域。其中單獨改變CDR3的體外選擇方案可以用於改變抗體的結合特性或確定哪些殘基有助於抗原的結合。因此，CDR3典型地是抗體結合側端內分子多樣性的最大來源。例如，H3可以短至兩個胺基酸殘基或多於26個胺基酸。

在經典的全長抗體或免疫球蛋白中，每條輕（L）鏈藉由一個共價二硫鍵與重（H）鏈連接，而兩條H鏈藉由一個或多個二硫鍵彼此連接，這取決於H鏈同種型。最靠近VH的CH結構域通常命名為CH1。恒定（「C」）結構域不直接參與抗原結合，但表現出各種效應子功能，如抗體依賴性、細胞介導的細胞毒性和補體激活。抗體的Fc區包括在重鏈恒定結構域內，並且例如能夠與位於細胞表面的Fc受體相互作用。

組裝和體細胞突變後的抗體基因的序列高度改變，並且估計該等改變的基因編碼10¹⁰ 種不同抗體分子（Immunoglobulin Genes [免疫球蛋白基因], 第2版, Jonio 等人編輯, Academic Press [學術出版社], San Diego, CA [加利福尼亞州聖地牙哥], 1995）。因此，免疫系統提供了免疫球蛋白組庫。術語「組庫」係指完全或部分衍生自至少一種編碼至少一種免疫球蛋白的序列的至少一種核苷酸序列。一種或多種序列可以藉由重鏈的V、D和J區段以及輕鏈的V和J區段的體內重排來產生。可替代地，一種或多種序列可以響應於發生重排，例如體外刺激而從細胞產生。可替代地，一種或多種序列的一部分或全部可以藉由DNA剪接、核苷酸合成、誘變和其他方法獲得，參見例如美國專利5,565,332。組庫可以僅包括一種序列或可以包括多種序列，包括遺傳多樣性集合中的序列。

術語「Fc部分」或「Fc單體」關於本發明意指包含至少一個具有CH2結構域功能的結構域和至少一個具有免疫球蛋白分子的CH3結構域功能的結構域的多肽。從術語「Fc單體」顯而易見，包含那些CH結構域的多肽係「多肽單體」。Fc單體可以是至少包含排除重鏈的第一恒定區免疫球蛋白結構域（CH1）的免疫球蛋白恒定區的片段，但至少保持一個CH2結構域的功能部分和一個CH3結構域的功能部分的多肽，其中CH2結構域在CH3結構域的胺基末端。在這個定義的較佳的方面中，Fc單體可以是包含Ig-Fc鉸鏈區、CH2區和CH3區的一部分的多肽恒定區，其中鉸鏈區在CH2結構域的胺基末端。設想本發明的鉸鏈區促進二聚化。例如但不限於，此類Fc多肽分子可以藉由木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白區（當然產生兩個Fc多肽的二聚體）獲得。在這個定義的另一方面中，Fc單體可以是包含CH2區和CH3區的一部分的多肽區。例如但不限於，此類Fc多肽分子可以藉由胃蛋白酶消化免疫球蛋白分子獲得。在一個實施方式中，Fc單體的多肽序列基本上類似於以下的Fc多肽序列：IgG₁ Fc區、IgG₂ Fc區、IgG₃ Fc區、IgG₄ Fc區、IgM Fc區、IgA Fc區、IgD Fc區和IgE Fc區。（參見，例如Padlan, Molecular Immunology [分子免疫學], 31(3), 169-217 (1993)）。因為免疫球蛋白之間存在一些變化，並且僅為了清楚起見，所以Fc單體係指IgA、IgD和IgG的最後兩個重鏈恒定區免疫球蛋白結構域，以及IgE和IgM的最後三個重鏈恒定區免疫球蛋白結構域。如上所提及，Fc單體還可以包括在該等結構域的N末端的柔性鉸鏈。對於IgA和IgM，Fc單體可以包括J鏈。對於IgG，Fc部分包含免疫球蛋白結構域CH2和CH3以及前兩個結構域與CH2之間的鉸鏈。儘管Fc部分的邊界可以改變，但包含功能鉸鏈、CH2和CH3結構域的人IgG重鏈Fc部分的實例可以定義為例如包含殘基D231（鉸鏈結構域的殘基-對應於下表1中的D234）至CH3結構域的羧基末端的P476，分別地L476（對於IgG₄ ），其中根據Kabat編號。經由肽連接子彼此融合的兩個Fc部分或Fc單體定義本發明的抗體構建體的第三結構域，該第三結構域也可以被定義為scFc結構域。

在本發明的一個實施方式中，設想如本文揭露的scFc結構域，分別地彼此融合的Fc單體僅包括在抗體構建體的第三結構域中。根據本發明，可以使用表1中列出的Kabat編號藉由類推來鑒定IgG鉸鏈區。根據上述，設想本發明的鉸鏈結構域/區域包含根據Kabat編號的對應於D234至P243的IgG₁ 序列拉伸物的胺基酸殘基。同樣設想，本發明的鉸鏈結構域/區域包含或由IgG1鉸鏈序列DKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 182）組成（對應於如下表1所示的拉伸物D234至P243-也設想所述序列的變異，只要鉸鏈區仍然促進二聚化）。在本發明的較佳的實施方式中，藉由N314X取代去除抗體構建體的第三結構域中CH2結構域的Kabat位置314處的糖基化位點，其中X係除Q之外的任何胺基酸。所述取代較佳的是N314G取代。在更較佳的實施方式中，所述CH2結構域另外包含以下取代（根據Kabat的位置）：V321C和R309C（該等取代在Kabat位置309和321處引入結構域內半胱胺酸二硫橋）。還設想本發明的抗體構建體的第三結構域按胺基至羧基順序包含或由以下組成：DKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 182)(即鉸鏈)-CH2-CH3-連接子-DKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 182)(即鉸鏈)-CH2-CH3。在較佳的實施方式中，上述抗體構建體的肽連接子的特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly₄ Ser(SEQ ID NO: 187)，或其聚合物，即(Gly₄ Ser)x，其中x為5或更大的整數（例如5、6、7、8等或更大），較佳的是6((Gly4Ser)6)。所述構建體可以進一步包含上述取代N314X，較佳的是N314G和/或另外的取代V321C和R309C。在如前文定義的本發明抗體構建體的較佳的實施方式中，設想第二結構域與人和/或獼猴CD3ε鏈的細胞外表位結合。 [表1]：鉸鏈區的胺基酸殘基的Kabat編號

鉸鏈的 IMGT 編號	IgG₁ 胺基酸翻譯	Kabat 編號
1	I	226
2	P	227
3	K	228
4	S	232
5	C	233
6	D	234
7	K	235
8	T	236
9	H	237
10	T	238
11	C	239
12	P	240
13	P	241
14	C	242
15	P	243

在本發明的另外實施方式中，鉸鏈結構域/區域包含或由以下組成：IgG2亞型鉸鏈序列ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO: 183)、IgG3亞型鉸鏈序列ELKTPLDTTHTCPRCP(SEQ ID NO: 184)或ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO: 185)和/或IgG4亞型鉸鏈序列ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO: 186)。IgG1亞型鉸鏈序列可以是以下一種EPKSCDKTHTCPPCP（如表1和SEQ ID NO: 183中所示）。因此，在本發明的上下文中也設想了該等核心鉸鏈區。

IgG CH2和IgG CD3結構域的位置和序列可以使用表2中列出的Kabat編號藉由類推來鑒定： [表2]：IgG CH2和CH3區域的胺基酸殘基的Kabat編號

IgG 亞型	CH2 aa 翻譯	CH2 Kabat 編號	CH3 aa 翻譯	CH3 Kabat 編號
IgG₁	APE … …KA K	244… …360	GQP……P GK	361… …478
IgG₂	APP … …KT K	244… …360	GQP……P GK	361… …478
IgG₃	APE … …KT K	244… …360	GQP……P GK	361… …478
IgG₄	APE … …KA K	244… …360	GQP……L GK	361… …478

在本發明的一個實施方式中，使第一或兩個Fc單體的CH3結構域中粗體強調的胺基酸殘基缺失。

第三結構域的多肽單體（「Fc部分」或「Fc單體」）彼此融合的肽連接子較佳的是包含至少25個胺基酸殘基（25、26、27、28、29、30等）。更較佳的是，這個肽連接子包含至少30個胺基酸殘基（30、31、32、33、34、35等）。還較佳的是，連接子包含至多40個胺基酸殘基、更較佳的是至多35個胺基酸殘基、最較佳的是恰好30個胺基酸殘基。該肽連接子的較佳的實施方式的特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly₄ Ser(SEQ ID NO: 187)，或其聚合物，即(Gly₄ Ser)x，其中x為5或更大的整數（例如6、7或8）。較佳的是，整數為6或7，更較佳的是整數為6。

在使用連接子來將第一結構域與第二結構域融合或將第一結構域或第二結構域與第三結構域融合的情況下，該連接子較佳的是具有足以確保第一結構域和第二結構域中的每一者均可以彼此獨立地保留其差異結合特異性的長度和序列。對於連接本發明的抗體構建體中的至少兩個結合結構域（或兩個可變結構域）的肽連接子，僅包含少數量的胺基酸殘基（例如12個胺基酸殘基或更少）的那些肽連接子係較佳的。因此，12、11、10、9、8、7、6或5個胺基酸殘基的肽連接子係較佳的。設想的具有少於5個胺基酸的肽連接子包含4、3、2或1個胺基酸，其中富含Gly的連接子係較佳的。用於融合第一結構域和第二結構域的肽連接子的較佳的實施方式在SEQ ID NO: 1中描繪。用於融合第二結構域和第三結構域的肽連接子的較佳的連接子實施方式係(Gly)₄ -連接子，分別為G₄ -連接子。

在上述一種「肽連接子」的上下文中特別較佳的「單一」胺基酸係Gly。因此，所述肽連接子可以由單一胺基酸Gly組成。在本發明的較佳的實施方式中，肽連接子的特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly₄ Ser(SEQ ID NO: 187)，或其聚合物，即(Gly₄ Ser)x，其中x為1或更大的整數（例如2或3）。較佳的連接子在SEQ ID No: 1至12中描繪。包括不促進二級結構的所述肽連接子的特徵係本領域中已知的並且描述於例如Dall’Acqua等人（Biochem. [生物化學] (1998) 37, 9266-9273）、Cheadle等人（Mol Immunol [分子免疫學] (1992) 29, 21-30）以及Raag和Whitlow（FASEB [美國實驗生物學聯合會會誌] (1995) 9(1), 73-80）中。此外不促進任何二級結構的肽連接子係較佳的。所述結構域彼此的連接可以例如藉由基因工程提供，如實例中所述。用於製備融合的且可操作地連接的雙特異性單鏈構建體並在哺乳動物細胞或細菌中表現它們的方法係本領域中熟知的（例如WO 99/54440或Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊], Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], Cold Spring Harbor [冷泉港], 紐約, 2001）。

在本發明的抗體構建體的較佳的實施方式中，第一結構域和第二結構域以選自由以下組成之群組的形式形成抗體構建體：(scFv)₂ 、scFv-單結構域mAb、雙抗體和該等形式中的任一種的寡聚物。

根據特別較佳的實施方式，並如所附實例所記載，本發明抗體構建體的第一結構域和第二結構域係「雙特異性單鏈抗體構建體」、更較佳的是雙特異性「單鏈Fv」（scFv）。儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由獨立的基因編碼，但使用重組方法可以將他們藉由合成連接子接合，如上文所述，該合成連接子使它們能夠製得為單條蛋白質鏈，其中VL和VH區配對以形成單價分子；參見，例如Huston等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA [美國國家科學院院刊] 85:5879-5883。使用熟悉該項技術者已知的常規技術獲得該等抗體片段，並且按照與完整或全長抗體相同的方式評價片段的功能。因此，單鏈可變片段（scFv）係免疫球蛋白的重鏈（VH）和輕鏈（VL）可變區的融合蛋白，通常利用約10至約25個胺基酸，較佳的是約15至20個胺基酸的短連接子肽連接。連接子通常富含甘胺酸以獲得柔韌性，以及富含絲胺酸或蘇胺酸以獲得溶解性，並且可以連接VH的N末端和VL的C-末端，或反之亦然。儘管去除了恒定區並引入了連接子，但該蛋白質保留了原始免疫球蛋白的特異性。

雙特異性單鏈抗體構建體在本領域中是已知的並描述於以下中：WO 99/54440、Mack, J. Immunol. [免疫學雜誌] (1997), 158, 3965-3970、Mack, PNAS [美國國家科學院院刊], (1995), 92, 7021-7025、Kufer, Cancer Immunol. Immunother. [癌症免疫學免疫治療], (1997), 45, 193-197、Löffler, Blood [血液], (2000), 95, 6, 2098-2103、Brühl, Immunol. [免疫學], (2001), 166, 2420-2426、Kipriyanov, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], (1999), 293, 41-56。描述的用於產生單鏈抗體的技術（尤其參見美國專利4,946,778；Kontermann和Dübel (2010), 上述引文和Little (2009), 上述引文）可以適用於產生特異性識別一種或多種所選擇的靶的單鏈抗體構建體。

二價（bivalent）（也稱為雙價（divalent））或雙特異性單鏈可變片段（具有形式(scFv)₂ 的二-scFv或雙-scFv）可以藉由連接兩個scFv分子（例如利用如上文所述的連接子）來工程化。如果這兩個scFv分子具有相同的結合特異性，則所得(scFv)₂ 分子將較佳的是稱為二價的（即，對於相同的靶表位具有兩個價）。如果兩個scFv分子具有不同的結合特異性，則所得(scFv)₂ 分子將較佳的是稱為雙特異性的。連接可以藉由產生具有兩個VH區和兩個VL區的單一肽鏈從而產生串聯scFv來進行（參見，例如Kufer P.等人, (2004) Trends in Biotechnology [生物技術趨勢] 22(5):238-244）。另一種可能性係產生具有連接子肽的scFv分子，該等連接子肽對於兩個可變區來說太短以致於不能折疊在一起（例如約五個胺基酸），從而迫使scFv二聚化。這物種型被稱為雙抗體（參見，例如Hollinger, Philipp等人, (1993年7月) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [美國國家科學院院刊] 90 (14): 6444-8）。

根據本發明，第一結構域、第二結構域或第一結構域和第二結構域可以包含單結構域抗體，分別地單結構域抗體的可變結構域或至少CDR。單結構域抗體僅包含一個（單體）抗體可變結構域，該抗體可變結構域能夠獨立於其他V區或結構域而選擇性結合特定抗原。第一單結構域抗體係從駱駝中發現的重鏈抗體工程化而來，並且該等被稱為V_H H片段。軟骨魚類也具有重鏈抗體（IgNAR），可以從該等重鏈抗體中獲得稱為V_NAR 片段的單結構域抗體。可替代的方法係將來自常見免疫球蛋白，例如來自人或齧齒動物的二聚體可變結構域分裂成單體，因此獲得作為單結構域Ab的VH或VL。儘管對單結構域抗體的大多數研究目前都是基於重鏈可變結構域，但是也已經顯示衍生自輕鏈的奈米抗體特異性結合靶表位。單結構域抗體的實例係所謂的sdAb、奈米抗體或單可變結構域抗體。

因此，(單結構域mAb)₂ 係由（至少）兩個單結構域單株抗體構成的單株抗體構建體，該兩個單結構域單株抗體單獨地選自下組，該組包括：V_H 、V_L 、V_H H和V_NAR 。連接子較佳的是呈肽連接子的形式。類似地，「scFv-單結構域mAb」係由至少一個如上所述的單結構域抗體和一個如上所述的scFv分子構成的單株抗體構建體。同樣，連接子較佳的是呈肽連接子的形式。

抗體構建體是否與另一給定抗體構建體競爭結合可以在競爭測定（如競爭性ELISA或基於細胞的競爭測定）中測量。也可以使用抗生物素蛋白偶聯的微粒（珠粒）。與抗生物素蛋白塗覆的ELISA板類似，當與生物素化蛋白質反應時，該等珠粒中的每一個都可用作可在其上進行測定的底物。將抗原塗覆在珠粒上，並且然後用第一抗體預塗覆。添加第二抗體並且確定任何另外的結合。用於讀出的可能手段包括流式細胞術。

T細胞或T淋巴細胞係在細胞介導的免疫中發揮核心作用的一類淋巴細胞（其本身係一類白血球）。存在若干個T細胞亞組，每個亞組具有不同的功能。T細胞可以因細胞表面上存在T細胞受體（TCR）而與其他淋巴細胞（如B細胞和NK細胞）區分開。TCR負責識別與主要組織相容性複合物（MHC）分子結合的抗原，並且由兩種不同的蛋白質鏈構成。在95%的T細胞中，TCR由阿爾法(α)和貝塔(β)鏈組成。當TCR與抗原肽和MHC（肽/MHC複合物）接合時，T淋巴細胞藉由一系列由相關酶、共受體、專門化銜接子分子和激活或釋放的轉錄因子介導的生物化學事件而被激活。

CD3受體複合物係一種蛋白質複合物，並且由四條鏈構成。在哺乳動物中，複合物含有CD3γ（伽馬）鏈、CD3δ（德爾塔）鏈和兩條CD3ε（伊蒲賽龍）鏈。該等鏈與T細胞受體（TCR）和所謂的ζ(截塔)鏈締合以形成T細胞受體CD3複合物並在T淋巴細胞中生成激活訊號。CD3γ（伽馬）、CD3δ（德爾塔）和CD3ε（伊蒲賽龍）鏈係含有單一細胞外免疫球蛋白結構域的免疫球蛋白超家族的高度相關的細胞表面蛋白。CD3分子的細胞內尾含有對於TCR的傳訊能力所必需的單一保守模體，稱為基於免疫受體酪胺酸的激活模體或簡稱ITAM。CD3ε分子係一種多肽，該多肽在人中由位於染色體11上的CD3E 基因編碼。CD3ε的最較佳的表位包括在人CD3ε細胞外結構域的胺基酸殘基1-27內。設想根據本發明的抗體構建體典型地並且有利地顯示出更少的非特異性T細胞激活，這在特異性免疫療法中是不需要的。這意味著副作用的風險降低。

經由多特異性（至少雙特異性）抗體構建體募集T細胞對靶細胞的再定向溶解涉及溶細胞突觸形成以及穿孔素和顆粒酶的遞送。所接合的T細胞能夠連續靶細胞溶解，並且不受干擾肽抗原加工和呈遞或選殖T細胞分化的免疫逃逸機制的影響；參見，例如WO 2007/042261。

能以各種方式測量由本發明的抗體構建體介導的細胞毒性。效應細胞可以是例如刺激的富集的（人）CD8陽性T細胞或未刺激的（人）外周血單核細胞（PBMC）。如果靶細胞係獼猴起源的或表現的或用第一結構域結合的獼猴靶細胞表面抗原轉染，則效應細胞也應係獼猴起源的，如獼猴T細胞系，例如4119LnPx。靶細胞應表現靶細胞表面抗原（至少細胞外結構域），例如人或獼猴靶細胞表面抗原。靶細胞可以是用靶細胞表面抗原（例如人或獼猴靶細胞表面抗原）穩定或暫態轉染的細胞系（如CHO）。可替代地，靶細胞可以是靶細胞表面抗原陽性天然表現細胞系。對於在細胞表面上表現較高水平的靶細胞表面抗原的靶細胞系，預期EC₅₀ 值通常較低。效應細胞與靶細胞（E : T）比率通常為約10 : 1，但也可以改變。靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的細胞毒活性可以在⁵¹ Cr-釋放測定（約18小時的孵育時間）或在基於FACS的細胞毒性測定（約48小時的孵育時間）中測量。也可能對測定孵育時間（細胞毒性反應）進行修改。其他測量細胞毒性的方法對熟悉該項技術者來說係熟知的，並且包括MTT或MTS測定、基於ATP的測定（包括生物發光測定）、磺基玫瑰紅B(SRB)測定、WST測定、選殖生成測定和ECIS技術。

較佳的是在基於細胞的細胞毒性測定中測量由本發明的靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體介導的細胞毒活性。其也可以在⁵¹ Cr-釋放測定中測量。其由EC₅₀ 值表示，該值對應於半數最大有效濃度（誘導在基線與最大值之間的中途的細胞毒性應答的抗體構建體的濃度）。較佳的是，靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的EC₅₀ 值 ≤ 5000 pM或 ≤ 4000 pM、更較佳的是 ≤ 3000 pM或 ≤ 2000 pM、甚至更較佳的是 ≤ 1000 pM或 ≤ 500 pM、甚至更較佳的是 ≤ 400 pM或 ≤ 300 pM、甚至更較佳的是 ≤ 200 pM、甚至更較佳的是 ≤ 100 pM、甚至更較佳的是 ≤ 50 pM、甚至更較佳的是 ≤ 20 pM或 ≤ 10 pM、並且最較佳的是 ≤ 5 pM。

上述給定的EC₅₀ 值可以在不同的測定中測量。熟悉該項技術者知道，當使用刺激/富集的CD8⁺ T細胞作為效應細胞時，與未刺激的PBMC相比，可以預期EC₅₀ 值較低。此外可以預期，與低靶表現大鼠相比，當靶細胞表現大量靶細胞表面抗原時，EC₅₀ 值較低。例如，當使用刺激/富集的人CD8⁺ T細胞作為效應細胞（並且使用靶細胞表面抗原轉染的細胞如CHO細胞或靶細胞表面抗原陽性人細胞系作為靶細胞）時，靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的EC₅₀ 值較佳的是 ≤ 1000 pM、更較佳的是 ≤ 500 pM、甚至更較佳的是 ≤ 250 pM、甚至更較佳的是 ≤ 100 pM、甚至更較佳的是 ≤ 50 pM、甚至更較佳的是 ≤ 10 pM、並且最較佳的是 ≤ 5 pM。當使用人PBMC作為效應細胞時，靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的EC₅₀ 值較佳的是 ≤ 5000 pM或 ≤ 4000 pM（特別是當靶細胞係靶細胞表面抗原陽性人細胞系時）、更較佳的是 ≤ 2000 pM（特別是當靶細胞係靶細胞表面抗原轉染的細胞如CHO細胞時）、更較佳的是 ≤ 1000 pM或 ≤ 500 pM、甚至更較佳的是 ≤ 200 pM、甚至更較佳的是 ≤ 150 pM、甚至更較佳的是 ≤ 100 pM、並且最較佳的是 ≤ 50 pM或更低。當使用獼猴T細胞系如LnPx4119作為效應細胞並且使用獼猴靶細胞表面抗原轉染的細胞系如CHO細胞作為靶細胞系時，靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的EC₅₀ 值較佳的是 ≤ 2000 pM或 ≤ 1500 pM、更較佳的是 ≤ 1000 pM或 ≤ 500 pM、甚至更較佳的是 ≤ 300 pM或 ≤ 250 pM、甚至更較佳的是 ≤ 100 pM、並且最較佳的是 ≤ 50 pM。

較佳的是，本發明的靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體不誘導/介導溶解或基本上不誘導/介導靶細胞表面抗原陰性細胞如CHO細胞的溶解。術語「不誘導溶解」、「基本上不誘導溶解」、「不介導溶解」或「基本不介導溶解」意指本發明的抗體構建體不誘導或介導超過30%，較佳的是不超過20%，更較佳的是不超過10%，特別較佳的是不超過9%、8%、7%、6%或5%的靶細胞表面抗原陰性細胞的溶解，由此將靶細胞表面抗原陽性人細胞系的溶解設定為100%。這通常適用於濃度高達500 nM的抗體構建體。熟悉該項技術者知道如何毫不費力地測量細胞溶解。此外，本說明書教導了如何測量細胞溶解的具體說明。

單個的靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的單體與二聚體同種型之間細胞毒活性的差異稱為「效能間隙」。該效能間隙可以例如計算為分子的單體與二聚體形式的EC₅₀ 值之間的比率。本發明的靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的效能間隙較佳的是 ≤ 5、更較佳的是 ≤ 4、甚至更較佳的是 ≤ 3、甚至更較佳的是 ≤ 2、並且最較佳的是 ≤ 1。

本發明的抗體構建體的第一結合結構域和/或第二（或任何其他）結合結構域較佳的是對於靈長類哺乳動物目的成員具有跨物種特異性。跨物種特異性CD3結合結構域例如描述於WO 2008/119567中。根據一個實施方式，除了分別與人靶細胞表面抗原和人CD3結合之外，第一結合結構域和/或第二結合結構域還將與靈長類動物的靶細胞表面抗原/CD3結合，該等靈長類動物包括（但不限於）新大陸靈長類動物（如狨毛猴、絨頂檉柳猴或松鼠猴）、舊大陸靈長類動物（如狒狒和獼猴）、長臂猿和非人類人亞科。

在本發明的抗體構建體的一個實施方式中，第一結構域結合人靶細胞表面抗原並進一步結合獼猴靶細胞表面抗原（如食蟹獼猴的靶細胞表面抗原），並且更較佳的是，結合在表面獼猴細胞上表現的獼猴靶細胞表面抗原。第一結合結構域對獼猴靶細胞表面抗原的親和力較佳的是 ≤ 15 nM、更較佳的是 ≤ 10 nM、甚至更較佳的是 ≤ 5 nM，甚至更較佳的是 ≤ 1 nM、甚至更較佳的是 ≤ 0.5 nM、甚至更較佳的是 ≤ 0.1 nM、並且最較佳的是 ≤ 0.05 nM或甚至 ≤ 0.01 nM。

較佳的是，根據本發明的抗體構建體對結合獼猴靶細胞表面抗原對人靶細胞表面抗原[ma靶細胞表面抗原:hu靶細胞表面抗原]的親和力間隙（如例如藉由BiaCore或藉由Scatchard分析確定）＜ 100、較佳的是＜ 20、更較佳的是＜ 15、進一步較佳的是＜ 10、甚至更較佳的是＜ 8、更較佳的是＜ 6並且最較佳的是＜ 2。根據本發明的抗體構建體對結合獼猴靶細胞表面抗原對人靶細胞表面抗原的親和性間隙的較佳的範圍在0.1與20之間、更較佳的是在0.2與10之間、甚至更較佳的是在0.3與6之間、甚至更較佳的是在0.5與3之間或在0.5與2.5之間、並且最較佳的是在0.5與2之間或在0.6與2之間。

本發明的抗體構建體的第二（結合）結構域與人CD3ε和/或獼猴CD3ε結合。在較佳的實施方式中，第二結構域進一步與絨毛猴、絨頂檉柳猴或松鼠猴CD3ε結合。狨毛猴和絨頂檉柳猴兩者均係屬於狨亞科（Callitrichidae ）的新大陸靈長類動物，而松鼠猴係屬於懸猴科（Cebidae ）的新大陸靈長類動物。

對於本發明的抗體構建體較佳的是，與人和/或獼猴CD3的細胞外表位結合的第二結構域包含含有選自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL區： (a) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 27中所描繪的CDR-L1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 28中所描繪的CDR-L2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 29中所描繪的CDR-L3； (b) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 117中所描繪的CDR-L1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 118中所描繪的CDR-L2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 119中所描繪的CDR-L3；以及 I 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 153中所描繪的CDR-L1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 154中所描繪的CDR-L2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 155中所描繪的CDR-L3。

在本發明的抗體構建體的同樣較佳的實施方式中，與人和/或獼猴CD3ε鏈的細胞外表位結合的第二結構域包含含有選自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH區： (a) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 12中所描繪的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 13中所描繪的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 14中所描繪的CDR-H3； (b) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 30中所描繪的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 31中所描繪的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 32中所描繪的CDR-H3； I 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 48中所描繪的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 49中所描繪的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 50中所描繪的CDR-H3； (d) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 66中所描繪的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 67中所描繪的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 68中所描繪的CDR-H3； I 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 84中所描繪的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 85中所描繪的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 86中所描繪的CDR-H3； (f) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 102中所描繪的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 103中所描繪的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 104中所描繪的CDR-H3； (g) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 120中所描繪的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 121中所描繪的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 122中所描繪的CDR-H3； (h) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 138中所描繪的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 139中所描繪的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 140中所描繪的CDR-H3； (i) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 156中所描繪的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 157中所描繪的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 158中所描繪的CDR-H3；以及 (j) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 174中所描繪的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 175中所描繪的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 176中所描繪的CDR-H3。

在本發明的抗體構建體的較佳的實施方式中，將上述三組VL CDR與上述十組VH CDR在第二結合結構域內組合以形成（30）組，每組包含CDR-L 1-3和CDR-H 1-3。

對於本發明的抗體構建體較佳的是，與CD3結合的第二結構域包含選自由以下組成之群組的VL區：如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 17、21、35、39、53、57、71、75、89、93、107、111、125、129、143、147、161、165、179或183中所描繪的或SEQ ID NO: 200中所描繪的VL區。

同樣較佳的是，與CD3結合的第二結構域包含選自由以下組成之群組的VH區：如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181中所描繪的或SEQ ID NO: 201中所描繪的VH區。

最較佳的是，本發明的抗體構建體的特徵在於與CD3結合的第二結構域包含選自由以下組成之群組的VL區和VH區： (a) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 17或21中所描繪的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 15或19中所描繪的VH區； (b) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 35或39中所描繪的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 33或37中所描繪的VH區； I 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 53或57中所描繪的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 51或55中所描繪的VH區； (d) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 71或75中所描繪的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 69或73中所描繪的VH區； I 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 89或93中所描繪的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 87或91中所描繪的VH區； (f) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 107或111中所描繪的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 105或109中所描繪的VH區； (g) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 125或129中所描繪的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 123或127中所描繪的VH區； (h) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 143或147中所描繪的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 141或145中所描繪的VH區； (i) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 161或165中所描繪的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 159或163中所描繪的VH區；以及 (j) 如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 179或183中所描繪的VL區和如WO 2008/119567的SEQ ID NO: 177或181中所描繪的VH區。

關於本發明的抗體構建體還較佳的是，與CD3結合的第二結構域包含如SEQ ID NO: 200中所描繪的VL區和如SEQ ID NO: 201中所描繪的VH區。

根據本發明的抗體構建體的較佳的實施方式，第一結構域和/或第二結構域具有以下形式：VH區和VL區的對係呈單鏈抗體（scFv）的形式。VH和VL區以VH-VL或VL-VH的順序排列。較佳的是，VH區位於連接子序列的N末端，並且VL區位於連接子序列的C末端。

本發明的上述抗體構建體的較佳的實施方式的特徵在於結合CD3的第二結構域包含選自由以下組成之群組的胺基酸序列：WO 2008/119567的SEQ ID NO: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187或在SEQ ID NO: 202中所描繪的。

抗體構建體的共價修飾也包括在本發明的範圍內，並且通常但不總是在翻譯後進行。例如，藉由使抗體構建體的特定胺基酸殘基與能夠與選擇的側鏈或N或C末端殘基反應的有機衍生劑反應，將抗體構建體的若干物種型的共價修飾引入到分子中。

半胱胺醯殘基最常見地與α-鹵代乙酸酯（和相應的胺），如氯乙酸或氯乙醯胺反應，以得到羧甲基或羧醯胺甲基衍生物。半胱胺醯殘基還可以藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙醯酯、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應來衍生出。

組胺醯殘基係藉由在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應衍生出，因為這種製劑對組胺醯側鏈具有相對特異性。對溴苯甲醯甲基溴也是有用的；該反應較佳的是在pH 6.0下在0.1 M二甲胂酸鈉中進行。賴胺醯殘基和胺基末端殘基與琥珀酸酐或其他羧酸酐反應。用該等藥劑衍生化具有逆轉賴胺醯殘基的電荷的效應。用於衍生含α-胺基的殘基的其他適合試劑包括亞胺酸酯，如甲基吡啶亞胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；硼氫化氯；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2,4-戊二酮；以及轉胺酶催化的與乙醛酸鹽的反應。

精胺醯殘基藉由與一種或若干種常規試劑（其中苯甲醯甲醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮和茚三酮）反應而被修飾。由於胍官能基的高pKa，因此精胺酸殘基的衍生化要求反應在鹼性條件下進行。此外，該等試劑可以與離胺酸基團以及精胺酸ε-胺基基團反應。

可以對酪胺醯殘基進行特定修飾，特別感興趣的是藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入到酪胺醯殘基中。最常見地，將N-乙醯基咪唑和四硝基甲烷分別用於形成O-乙醯基酪胺醯物質和3-硝基衍生物。使用¹²⁵ I或¹³¹ I碘化酪胺醯殘基以製備用於放射免疫測定的標記蛋白質，上述氯胺T法係適合的。

羧基側基團（天冬胺醯基或穀胺醯基）藉由與碳二亞胺（R’—N=C=N–R’）反應而選擇性地修飾，其中R和R'視需要為不同的烷基基團，例如1-環己基-3-(2-啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外，天冬胺醯殘基和穀胺醯殘基藉由與銨離子反應轉化為天冬醯胺醯殘基和麩醯胺酸醯殘基。

用雙功能劑衍生化可用於將本發明的抗體構建體交聯到水不溶性載體基質或表面以用於多種方法中。常用的交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯（例如與4-疊氮基水楊酸的酯）、同雙官能亞胺酸酯，包括二琥珀醯亞胺酯，如3,3'-二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)、和雙官能馬來醯亞胺，如雙-N-馬來醯亞胺-1,8-辛烷。衍生劑如3-[(對疊氮基苯基)二硫代]丙醯亞胺酸甲酯產生能夠在光存在下形成交聯的可光活化中間體。可替代地，反應性水不溶性基質如溴化氰活化的碳水化合物和反應性底物，如美國專利案號3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440所述，用於蛋白質固定。

麩醯胺酸醯殘基和天冬醯胺醯殘基通常分別脫醯胺成相應的穀胺醯殘基和天冬胺醯殘基。可替代地，該等殘基在弱酸性條件下脫醯胺。該等殘基的任一形式都屬於本發明的範圍。

其他修飾包括對脯胺酸和離胺酸的羥基化、對絲胺醯或蘇胺醯殘基的羥基的磷酸化、對離胺酸、精胺酸和組胺酸側鏈的α-胺基的甲基化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties [蛋白質：結構和分子特性], W. H. Freeman & Co. [W.H.弗裡曼公司], San Francisco [三藩市], 1983, 第79-86頁）、對N末端胺的乙醯化和對任何C末端羧基的醯胺化。

包括在本發明範圍內的抗體構建體的另一物種型的共價修飾包括改變蛋白質的糖基化模式。如本領域中已知的，糖基化模式可以取決於蛋白質的序列（例如，下文論述的特定糖基化胺基酸殘基的存在或不存在）或其中產生蛋白質的宿主細胞或生物體。下面論述特定的表現系統。

多肽的糖基化典型地是N-連接或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基的側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸和天冬醯胺-X-蘇胺酸（其中X為除脯胺酸以外的任何胺基酸）係將碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺側鏈的識別序列。因此，在多肽中該等三肽序列中的任一個的存在產生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化係指將糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種連接至羥基胺基酸，最常見的是絲胺酸或蘇胺酸，儘管也可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。

藉由改變胺基酸序列以使得它含有上述三肽序列中的一者或多者（對於N-連接的糖基化位點），而方便地完成向抗體構建體添加糖基化位點。還可以藉由向起始序列（對於O-連接的糖基化位點）添加或取代為一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基來作出改變。為了方便起見，抗體構建體的胺基酸序列較佳的是藉由DNA水平的變化來改變，特別是藉由在預選鹼基處突變編碼多肽的DNA，以使得產生將翻譯成所希望胺基酸的密碼子。

增加抗體構建體上的碳水化合物部分的數量的另一種手段係藉由將糖苷化學或酶促偶聯至蛋白質。該等程序的有利之處在於它們不需要在具有用於N-和O-連接的糖基化的糖基化能力的宿主細胞中產生蛋白質。取決於所使用的偶聯方式，一種或多種糖可連接至 (a) 精胺酸和組胺酸，(b) 游離羧基，(c) 游離巰基，如半胱胺酸的那些，(d) 游離羥基，如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸的那些，I 芳香族殘基，如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸的那些，或 (f) 麩醯胺酸的醯胺基團。該等方法描述於WO 87/05330以及Aplin和Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem. [CRC生物化學關鍵評論], 第259-306頁中。

存在於起始抗體構建體上的碳水化合物部分的去除可以藉由化學或酶促方式完成。化學去糖基化要求將蛋白質暴露於化合物三氟甲磺酸，或等效化合物。該處理導致除連接糖（N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺）以外的大多數或所有糖裂解，同時使多肽保持完整。化學去糖基化由Hakimuddin等人, 1987,Arch. Biochem. Biophys. [生物化學與生物物理學集刊] 259:52和Edge等人, 1981,Anal. Biochem. [分析生物化學] 118:131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以藉由使用多種內切糖苷酶和外切糖苷酶實現，如由Thotakura等人, 1987, Meth. Enzymol. [酶學方法] 138:350所述的。可以藉由使用化合物衣黴素防止潛在糖基化位點處的糖基化，如由Duskin等人, 1982,J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 257:3105所述的。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷鍵的形成。

本文還考慮抗體構建體的其他修飾。例如，抗體構建體的另一種類型的共價修飾包括以美國專利案號4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中示出的方式將抗體構建體連接至各種非蛋白質聚合物，包括但不限於各種多元醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。此外，如本領域中已知的，可以在抗體構建體內的不同位置進行胺基酸取代，例如以有利於添加聚合物如PEG。

在一些實施方式中，本發明的抗體構建體的共價修飾包括添加一個或多個標記。標記基團可以經由各種長度的間隔臂與抗體構建體偶聯以減少潛在的空間位阻。用於標記蛋白質的各種方法在本領域中是已知的並且可以用於進行本發明。術語「標記」或「標記基團」係指任何可檢測的標記。一般來講，標記屬於多種類別，這取決於將檢測它們的測定 - 以下實例包括但不限於： a) 同位素標記，該等同位素標記可以是放射性同位素或重同位素，如放射性同位素或放射性核素（例如³ H、¹⁴ C、¹⁵ N、³⁵ S、⁸⁹ Zr、⁹⁰ Y、⁹⁹ Tc、¹¹¹ In、¹²⁵ I、¹³¹ I） b) 磁性標記（例如磁性顆粒） c) 氧化還原活性部分 d) 光學染料（包括但不限於，生色團、磷光體和螢光團），如螢光基團（例如FITC、玫瑰紅、鑭系元素磷光體）、化學發光基團和螢光團，該等螢光團可以是「小分子」螢光劑或蛋白質螢光劑 e) 酶促基團（例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶） f) 生物素化基團 g) 由第二報導子識別的預定多肽表位（例如，亮胺酸拉鍊對序列、第二抗體的結合側、金屬結合結構域、表位標籤等）

「螢光標記」意指可以經由其固有的螢光特性檢測到的任何分子。適合的螢光標記包括但不限於螢光素、玫瑰紅、四甲基玫瑰紅、伊紅、伊紅、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石綠、二苯乙烯、螢光黃、瀑布藍J、德克薩斯紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC紅640、Cy5、Cy5.5、LC紅705、俄勒岡綠、Alexa-Fluor染料（Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680）、瀑布藍、瀑布黃和R-藻紅蛋白（PE）（俄勒岡州尤金市的分子探針公司（Molecular Probes, Eugene, OR））、FITC、玫瑰紅和德克薩斯紅（伊利諾州羅克福德的皮爾斯公司（Pierce, Rockford, IL））、Cy5、Cy5.5、Cy7（賓夕法尼亞州匹茲堡市的阿默舍姆生命科學公司（Amersham Life Science, Pittsburgh, PA））。適合的光學染料（包括螢光團）描述於Richard P. Haugland的Molecular Probes Handbook [分子探針手冊]中。

適合的蛋白質螢光標記還包括但不限於綠色螢光蛋白，包括海腎（Renilla）、海筆（Ptilosarcus）或水母（Aequorea）物種的GFP（Chalfie等人, 1994, Science [科學] 263:802-805）；EGFP（克羅泰克實驗室有限公司（Clontech Laboratories, Inc.），基因庫登錄號U55762）、藍色螢光蛋白（BFP，量子生物科技有限公司（Quantum Biotechnologies, Inc.），加拿大魁北克省蒙特利爾（Montreal, Quebec, Canada）邁松納夫大道西部（de Maisonneuve Blvd. West）1801，第8層，H3H 1J9）；Stauber, 1998, Biotechniques [生物技術] 24:462-471；Heim等人, 1996, Curr. Biol. [當代生物學] 6:178-182）、增強型黃色螢光蛋白（EYFP，克羅泰克實驗室有限公司）、螢光素酶（Ichiki等人, 1993, J. Immunol. [免疫學雜誌] 150:5408-5417）、β半乳糖苷酶（Nolan等人, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 85:2603-2607）和海腎（WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利案號5,292,658、5,418,155、5,683,888、5,741,668、5,777,079、5,804,387、5,874,304、5,876,995、5,925,558）。

本發明的抗體構建體還可以包含另外的結構域，該等結構域例如有助於分離分子或涉及分子的適應性藥物動力學分佈。有助於分離抗體構建體的結構域可以選自肽模體或輔助性地引入的部分，該等部分可以在分離方法（例如分離柱）中捕獲。此類另外的結構域的非限制性實施方式包括稱為Myc-標籤、HAT-標籤、HA-標籤、TAP-標籤、GST-標籤、幾丁質結合結構域（CBD-標籤）、麥芽糖結合蛋白（MBP-標籤）、Flag-標籤、Strep-標籤以及其變體（例如StrepII-標籤）和His-標籤的肽模體。以鑒定的CDR為特徵的本文揭露的所有抗體構建體都可以包含His-標籤結構域，該His-標籤結構域通常稱為分子的胺基酸序列中的連續His殘基重複序列、較佳的是5個、且更較佳的是6個His殘基(六組胺酸)。His-標籤可以位於例如抗體構建體的N或C末端，較佳的是它位於C末端。最較佳的是，六組胺酸標籤(HHHHHH)（SEQ ID NO: 199）經由肽鍵連接至根據本發明的抗體構建體的C末端。另外，PLGA-PEG-PLGA的軛合物（conjugate）系統可以與聚組胺酸標籤組合用於緩釋應用和改善的藥物動力學分佈。

還考慮了本文所述的抗體構建體的胺基酸序列修飾。例如，可能需要改善抗體構建體的結合親和力和/或其他生物特性。藉由將適當核苷酸變化引入到抗體構建體核酸或藉由肽合成來製備抗體構建體的胺基酸序列變體。所有下面描述的胺基酸序列修飾均應產生仍然保留未修飾的親本分子的所希望生物活性（與靶細胞表面抗原和CD3結合）的抗體構建體。

術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」典型地是指具有其本領域公認的定義的胺基酸，如選自由以下組成之群組的胺基酸：丙胺酸（Ala或A）；精胺酸（Arg或R）；天冬醯胺（Asn或N）；天冬胺酸（Asp或D）；半胱胺酸（Cys或C）；麩醯胺酸（Gin或Q）；麩胺酸（Giu或E）；甘胺酸（Giy或G）；組胺酸（His或H）；異亮胺酸 (He或I)；亮胺酸（Leu或L）；離胺酸（Lys或K）；蛋胺酸（Met或M）；苯丙胺酸（Phe或F）；脯胺酸(Pro或P)；絲胺酸（Ser或S）；蘇胺酸（Thr或T）；色胺酸（Trp或W）；酪胺酸（Tyr或Y）；以及纈胺酸（Val或V），儘管可以根據需要使用修飾的、合成的或稀有的胺基酸。一般來講，胺基酸可以分組為具有非極性側鏈（例如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val）；具有帶負電的側鏈（例如Asp、Giu）；具有帶正電的側鏈（例如Arg、His、Lys）；或具有不帶電的極性側鏈（例如Asn、Cys、Gin、Giy、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr）。

胺基酸修飾包括例如抗體構建體的胺基酸序列內的殘基的缺失和/或插入和/或取代。進行缺失、插入和取代的任何組合以達到最終構建體，條件係最終的構建體具有所希望的特徵。胺基酸變化還可以改變抗體構建體的翻譯後過程，如改變糖基化位點的數目或位置。

例如，可以在每個CDR中插入、取代或缺失1、2、3、4、5或6個胺基酸（當然，取決於其長度），而可以在每個FR中插入、取代或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸。較佳的是，胺基酸序列插入到抗體構建體中包括與含有100個或更多個殘基的多肽的長度範圍為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基的胺基和/或羧基末端融合物，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。也可以在本發明的抗體構建體的第三結構域內進行相應的修飾。本發明的抗體構建體的插入變體包括與酶的抗體構建體的N末端或C末端的融合或與多肽的融合。

取代誘變最感興趣的位點包括（但不限於）重鏈和/或輕鏈的CDR，特別是高變區，但也考慮重鏈和/或輕鏈的FR改變。取代較佳的是係如本文所述的保守取代。較佳的是，可以在CDR中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸，而可以在框架區（FR）中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸，這取決於CDR或FR的長度。例如，如果CDR序列涵蓋6個胺基酸，則設想該等胺基酸中的1個、2個或3個被取代。類似地，如果CDR序列涵蓋15個胺基酸，則設想該等胺基酸中的1個、2個、3個、4個、5個或6個被取代。

用於鑒定作為較佳的誘變位置的抗體構建體的某些殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham和Wells於Science [科學], 244: 1081-1085 (1989)中所述的。在此，鑒定了抗體構建體內的殘基或靶殘基組（例如帶電殘基，如arg、asp、his、lys和glu）並且用中性或帶負電的胺基酸（最較佳的是丙胺酸或聚丙胺酸）替換以影響胺基酸與表位的相互作用。

然後藉由在取代位點處或為取代位點引入進一步的或其他變體來精煉那些展示對取代具有功能敏感性的胺基酸位置。因此，雖然用於引入胺基酸序列變化的位點或區域係預定的，但突變本身的性質無需預定。例如，為了分析或優化給定位點處突變的性能，可以在靶密碼子或區域處進行丙胺酸掃描或隨機誘變，並且篩選所表現的抗體構建體變體以獲得所希望活性的最優組合。用於在具有已知序列的DNA中的預定位點進行取代突變的技術係熟知的，例如，M13引物誘變和PCR誘變。使用抗原結合活性（如靶細胞表面抗原或CD3結合）的測定來篩選突變體。

一般來講，如果胺基酸在重鏈和/或輕鏈的一個或多個或所有CDR中被取代，則較佳的是，之後獲得的「取代的」序列與「初始」CDR序列具有至少60%或65%、更較佳的是70%或75%、甚至更較佳的是80%或85%並且特別較佳的是90%或95%同一性。這意指該取代取決於CDR的長度與「取代」序列的相同程度。例如，具有5個胺基酸的CDR較佳的是與其取代序列80%相同，以便取代至少一個胺基酸。因此，抗體構建體的CDR可以與其取代的序列具有不同程度的同一性，例如CDRL1可以具有80%，而CDRL3可以具有90%。

較佳的取代（或替代）係保守取代。然而，只要抗體構建體保留其經由第一結構域與靶細胞表面抗原結合並且經由第二結構域與CD3，分別地CD3ε結合的能力和/或其CDR與之後取代的序列具有同一性（與「原始」CDR序列具有至少60%或65%，更較佳的是70%或75%，甚至更較佳的是80%或85%並且特別較佳的是90%或95%同一性），則設想出任何取代（包括非保守取代或來自下表3中列出的「示例性取代」的一個或多個）。

保守取代示於表3中「較佳的取代」標題之下。如果此類取代導致生物活性變化，則可以將在表3中命名為「示例性取代」或如在下文參考胺基酸類別進一步所述的更實質性變化引入，並且篩選產物以獲得所希望的特徵。 [表3]：胺基酸取代

原始的	示例性取代	較佳的取代
Ala（A）	val、leu、ile	Val
Arg I	lys、gln、asn	Lys
Asn（N）	gln、his、asp、lys、arg	Gln
Asp（D）	glu、asn	Glu
Cys I	ser、ala	Ser
Gln（Q）	asn、glu	Asn
Glu I	asp、gln	Asp
Gly（G）	Ala	Ala
His（H）	asn、gln、lys、arg	Arg
Ile（I）	leu、val、met、ala、phe	Leu
Leu（L）	正亮胺酸、ile、val、met、ala	Ile
Lys（K）	arg、gln、asn	Arg
Met（M）	leu、phe、ile	Leu
Phe（F）	leu、val、ile、ala、tyr	Tyr
Pro（P）	Ala	Ala
Ser（S）	Thr	Thr
Thr（T）	Ser	Ser
Trp（W）	tyr、phe	Tyr
Tyr（Y）	trp、phe、thr、ser	Phe
Val（V）	ile、leu、met、phe、ala	Leu

本發明的抗體構建體的生物特性的實質性修飾係藉由選擇在保持以下的效應方面顯著不同的取代來完成：(a) 取代區域中的多肽骨架的結構，例如呈折疊或螺旋構象，(b) 分子在靶位點的電荷或疏水性，或 (c) 側鏈的大部分。基於共同的側鏈特性將天然存在的殘基分組：(1) 疏水性：正亮胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2) 中性親水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3) 酸性：asp、gln；(4) 鹼性：his、lys、arg；(5) 影響鏈取向的殘基：gly、pro；以及 (6) 芳香族的：trp、tyr、phe。

非保守性取代將需要將該等類別中一類別的成員換成另一類別。任何不參與維持抗體構建體的適當構象的半胱胺酸殘基通常可以被絲胺酸取代，以改善分子的氧化穩定性並防止異常交聯。相反，可以將一個或多個半胱胺酸鍵添加至抗體以改善其穩定性（特別是在抗體係抗體片段（如Fv片段）的情況下）。

對於胺基酸序列，藉由使用本領域已知的標準技術確定序列同一性和/或相似性，包括但不限於，Smith和Waterman, 1981,Adv. Appl. Math. [高級應用數學] 2:482的局部序列同一性演算法、Needleman和Wunsch, 1970,J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 48:443的序列同一性比對演算法、Pearson和Lipman, 1988,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 85:2444的相似性方法的檢索、該等演算法的電腦化實現（威斯康辛遺傳學套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遺傳學電腦集團，575科學大道，麥德遜，威斯康辛州（Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.））、Devereux等人 , 1984,Nucl. Acid Res.[ 核酸研究 ] 12:387-395所述的最佳匹配序列程序，較佳的是使用預設設置，或藉由檢查。較佳的是，藉由FastDB基於以下參數計算同一性百分比：錯配罰分為1；空位罰分為1；空位大小罰分為0.33；以及連接罰分為30，「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis [序列比較和分析的當前方法]」, Macromolecule Sequencing and Synthesis [大分子測序與合成], Selected Methods and Applications [所選擇的方法與應用], 第127-149頁 (1988), Alan R. Liss公司。

有用的演算法的實例係PILEUP。PILEUP使用漸進式成對比對從一組相關序列中創建多序列比對。它還可以繪製顯示用於創建比對的聚類關係的樹狀圖。PILEUP使用Feng和Doolittle, 1987,J. Mol. Evol. [分子進化雜誌]35:351-360的漸進式比對方法的簡單化；該方法類似於Higgins和Sharp, 1989,CABIOS 5:151-153所述的方法。有用的PILEUP參數包括3.00的預設空位權重、0.10的預設空位長度權重和加權末端空位。

有用的演算法的另一實例係BLAST演算法，描述於以下中：Altschul等人, 1990,J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 215:403-410；Altschul等人, 1997,Nucleic Acids Res. [核酸研究] 25:3389-3402；和Karin等人, 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 90:5873-5787。特別有用的BLAST程式係從Altschul等人, 1996,Methods in Enzymology [酶學方法] 266:460-480獲得的WU-BLAST-2程式。WU-BLAST-2使用若干個搜索參數，其中大部分都設定為預設值。將可調整參數設置為以下值：重疊間隔 = 1，重疊分數 = 0.125，字閾值（T）= II。HSP S和HSP S2參數係動態值，並且由程式本身根據特定序列的組成和特定數據庫的組成來確立，根據該特定數據庫來搜索感興趣的序列；然而，可以調整該等值以增加靈敏度。

另外有用的演算法係由Altschul等人, 1993,Nucl. Acids Res. [核酸研究] 25:3389-3402報導的空位BLAST。空位BLAST使用BLOSUM-62取代評分；閾值T參數設定為9；觸發非空位擴展的按兩下方法，對k的空位長度收取10+k的成本；Xu設定為16，並且Xg設定為40（用於數據庫搜索階段）以及67（用於演算法的輸出階段）。空位比對由對應於約22比特的評分觸發。

一般來講，各個變體CDR或VH/VL序列之間的胺基酸同源性、相似性或同一性與本文描繪的序列係至少60%，並且更典型地具有至少65%或70%，更較佳的是至少75%或80%，甚至更較佳的是至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和幾乎100%的較佳的是增加的同源性或同一性。以類似的方式，相對於本文中鑒定的結合蛋白的核酸序列的「百分比（%）核酸序列同一性」被定義為候選序列中與抗體構建體的編碼序列中的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比。具體方法利用設定為預設參數的WU-BLAST-2的BLASTN模組，重疊間隔和重疊分數分別設定為1和0.125。

一般來講，編碼各個變體CDR或VH/VL序列的核苷酸序列與本文描繪的核苷酸序列之間的核酸序列同源性、相似性或同一性係至少60%，並且更典型地具有至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%和幾乎100%的較佳的是增加的同源性或同一性。因此，「變體CDR」或「變體VH/VL區」係與本發明的親本CDR/VH/VL具有指定的同源性、相似性或同一性，並且共用生物功能，包括但不限於親本CDR或VH/VL的特異性和/或活性的至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

在一個實施方式中，根據本發明的抗體構建體與人種系的同一性百分比為 ≥ 70%或 ≥ 75%，更較佳的是 ≥ 80%或 ≥ 85%，甚至更較佳的是 ≥ 90%，並且最較佳的是 ≥ 91%、≥ 92%、≥ 93%、≥ 94%、≥ 95%或甚至 ≥ 96%。與人抗體種系基因產物的同一性被認為係降低治療期間治療性蛋白引發患者中針對藥物的免疫應答的風險的重要特徵。Hwang和Foote（「Immunogenicity of engineered antibodies [工程化抗體的免疫原性]」; Methods [方法] 36 (2005) 3-10）證明了藥物抗體構建體的非人部分的減少導致治療期間患者中誘導抗藥物抗體的風險降低。藉由比較無數臨床評價的抗體藥物和相應免疫原性數據，顯示以下趨勢：抗體的V區的人源化使得蛋白質免疫原性（平均5.1%的患者）比攜帶未改變的非人V區的抗體（平均23.59%的患者）更低。因此，呈抗體構建體形式的基於V區的蛋白質治療劑需要與人序列具有較高程度的同一性。出於確定種系同一性的目的，可以使用Vector NTI軟體將VL的V區與人種系V區段和J區段（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）的胺基酸序列進行比對並且藉由將相同的胺基酸殘基除以VL的胺基酸殘基總數計算胺基酸序列（以百分比計）。對於VH區段（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）同樣適用的，只是由於VH CDR3的高度多樣性和缺少現有人種系VH CDR3比對配偶體，因此可以排除VH CDR3。然後可以使用重組技術來增加與人抗體種系基因的序列同一性。

在另一實施方式中，本發明的雙特異性抗體構建體在標準研究規模條件下，例如在標準的兩步純化過程中表現出高單體產率。較佳的是，根據本發明的抗體構建體的單體產率為 ≥ 0.25 mg/L上清液、更較佳的是 ≥ 0.5 mg/L、甚至更較佳的是 ≥ 1 mg/L、並且最較佳的是 ≥ 3 mg/L上清液。

同樣地，可以確定抗體構建體的二聚體抗體構建體同種型的產率，並由此確定單體百分比（即，單體:（單體+二聚體））。單體和二聚體抗體構建體的生產率和計算的單體百分比可以例如在來自在滾瓶中標準化研究規模生產的培養物上清液的SEC純化步驟中獲得。在一個實施方式中，抗體構建體的單體百分比為 ≥ 80%、更較佳的是 ≥ 85%、甚至更較佳的是 ≥ 90%、並且最較佳的是 ≥ 95%。

在一個實施方式中，抗體構建體的較佳的血漿穩定性（具有血漿的EC50與無血漿的EC50的比率）為 ≤ 5或 ≤ 4、更較佳的是 ≤ 3.5或 ≤ 3、甚至更較佳的是 ≤ 2.5或 ≤ 2、並且最較佳的是 ≤ 1.5或 ≤ 1。抗體構建體的血漿穩定性可以藉由將構建體在37°C下在人血漿中孵育24小時，之後在⁵¹ 鉻釋放細胞毒性測定中確定EC50來測試。細胞毒性測定中的效應細胞可以為刺激的富集的人CD8陽性T細胞。靶細胞可以是例如用人靶細胞表面抗原轉染的CHO細胞。效應細胞與靶細胞（E : T）比率可以選擇為10 : 1。用於此目的的人血漿庫來源於由EDTA塗覆的注射器收集的健康供體的血液。藉由離心去除細胞組分，並且收集上層血漿相並隨後彙集。作為對照，在RPMI-1640培養基中的細胞毒性測定之前立即稀釋抗體構建體。血漿穩定性計算為EC50（血漿孵育後）與EC50（對照）的比率。

此外較佳的是，本發明的抗體構建體的單體到二聚體的轉化較低。可以在不同條件下測量轉化並且藉由高性能尺寸排阻層析進行分析。例如，抗體構建體的單體同種型的孵育可以在37°C以及例如100 µg/ml或250 µg/ml的濃度下在孵育箱中進行7天。在該等條件下，較佳的是，本發明的抗體構建體顯示出 ≤ 5%、更較佳的是 ≤ 4%、甚至更較佳的是 ≤ 3%、甚至更較佳的是 ≤ 2.5%、甚至更較佳的是 ≤ 2%、甚至更較佳的是 ≤ 1.5%並且最較佳的是 ≤ 1%或 ≤ 0.5%或甚至0%的二聚體百分比。

還較佳的是，本發明的雙特異性抗體構建體在多個冷凍/解凍循環後以非常低的二聚體轉化存在。例如，將抗體構建體單體在例如通用配製緩衝劑中調整至濃度為250 µg/ml，並且進行三個冷凍/解凍循環（在-80°C下冷凍30 min，之後在室溫下解凍30 min），之後進行高性能SEC以確定已經轉化成二聚體抗體構建體的最初單體抗體構建體的百分比。較佳的是，例如在三個冷凍/解凍循環之後，雙特異性抗體構建體的二聚體百分比為 ≤ 5%、更較佳的是 ≤ 4%、甚至更較佳的是 ≤ 3%、甚至更較佳的是 ≤ 2.5%、甚至更較佳的是 ≤ 2%、甚至更較佳的是 ≤ 1.5%、並且最較佳的是 ≤ 1%或甚至 ≤ 0.5%。

本發明的雙特異性抗體構建體較佳的是顯示出聚集溫度 ≥ 45°C或 ≥ 50°C、更較佳的是 ≥ 52°C或 ≥ 54°C、甚至更較佳的是 ≥ 56°C或 ≥ 57°C、並且最較佳的是 ≥ 58°C或 ≥ 59°C的有利熱穩定性。熱穩定性參數可以根據抗體聚集溫度如下確定：將濃度為250 µg/ml的抗體溶液轉移到一次性比色杯中並置於動態光散射（DLS）裝置中。將樣本以0.5°C/min的加熱速率從40°C加熱至70°C，恒定獲取測量的半徑。使用指示蛋白質和聚集物熔融的半徑增加來計算抗體的聚集溫度。

可替代地，可以藉由差示掃描量熱法（DSC）確定溫度熔融曲線以確定抗體構建體的固有生物物理學蛋白質穩定性。該等實驗使用微凱爾有限公司（MicroCal LLC）（美國麻塞諸塞州的北安普頓（Northampton, MA, U.S.A））VP-DSC裝置進行。與僅含有配製緩衝劑的樣本相比，從20°C至90°C記錄含有抗體構建體的樣本的能量攝取。將抗體構建體例如在SEC運行緩衝劑中調整至250 μg/ml的終濃度。為了記錄相應熔融曲線，逐步升高整個樣本溫度。在每個溫度T下，記錄樣本和配製緩衝劑參考物的能量攝取。將樣本的能量攝取Cp（千卡/莫耳/°C）減去參考物的差針對相應溫度作圖。熔融溫度被定義為第一次最大能量攝取時的溫度。

還設想本發明的靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體具有 ≤ 0.2、較佳的是 ≤ 0.15、更較佳的是 ≤ 0.12、甚至更較佳的是 ≤ 0.1並且最較佳的是 ≤ 0.08的濁度（如在將純化的單體抗體構建體濃縮至2.5 mg/ml並過夜孵育後藉由OD340測量的）。

此外設想，本發明的雙特異性抗體構建體表現出治療功效或抗腫瘤活性。這可以例如在以下晚期人腫瘤異種移植模型的實例中揭露的研究中評估：

熟悉該項技術者知道如何修改或調整該研究的某些參數，如注射的腫瘤細胞的數量、注射位點、移植的人T細胞的數量、要施用的雙特異性抗體構建體的量以及時間線，同時仍然獲得有意義且可再現的結果。較佳的是，腫瘤生長抑制T/C[%]為 ≤ 70或 ≤ 60、更較佳的是 ≤ 50或 ≤ 40、甚至更較佳的是 ≤ 30或 ≤ 20並且最較佳的是 ≤ 10或 ≤ 5或甚至 ≤ 2.5。

在本發明的抗體構建體的較佳的實施方式中，抗體構建體係單鏈抗體構建體。

另外，在本發明的抗體構建體的較佳的實施方式中，所述第三結構域按胺基至羧基順序包含：鉸鏈-CH2-CH3-連接子-鉸鏈-CH2-CH3。

另外，在本發明的一個實施方式中，第三結構域的一個或較佳的是每個（兩個）多肽單體的CH2結構域包含結構域內半胱胺酸二硫橋。如本領域所知，術語「半胱胺酸二硫橋」係指具有通式結構R–S–S– R 的官能基。該鍵聯也稱為SS鍵或二硫橋，並且藉由半胱胺酸殘基的兩個硫醇基團的偶聯來衍生。對於本發明的抗體構建體特別較佳的是，將成熟抗體構建體中形成半胱胺酸二硫橋的半胱胺酸引入到對應於309和321（Kabat編號）的CH2結構域的胺基酸序列中。

在本發明的一個實施方式中，去除CH2結構域的Kabat位置314中的糖基化位點。較佳的是，藉由N314X取代實現糖基化位點的去除，其中X係除Q之外的任何胺基酸。所述取代較佳的是N314G取代。在更較佳的實施方式中，所述CH2結構域另外包含以下取代（根據Kabat的位置）：V321C和R309C（該等取代在Kabat位置309和321處引入結構域內半胱胺酸二硫橋）。

假定與例如本領域中已知的雙特異性異源Fc抗體構建體相比（圖1b）本發明的抗體構建體的較佳的特徵可以尤其涉及在CH2結構域中引入上述修飾。因此，對於本發明的構建體較佳的是，本發明的抗體構建體的第三結構域中的CH2結構域在Kabat位置309和321處包含結構域內半胱胺酸二硫橋和/或Kabat位置314處的糖基化位點藉由上述N314X取代去除，較佳的是藉由N314G取代去除。

在本發明的另一個較佳的實施方式中，本發明的抗體構建體的第三結構域中的CH2結構域在Kabat位置309和321處包含結構域內半胱胺酸二硫橋並且Kabat位置314處的糖基化位點藉由N314G取代去除。

在一個實施方式中，本發明提供了抗體構建體，其中： (182) 該第一結構域包含兩個抗體可變結構域，並且該第二結構域包含兩個抗體可變結構域； (ii) 該第一結構域包含一個抗體可變結構域，並且該第二結構域包含兩個抗體可變結構域； (iii) 該第一結構域包含兩個抗體可變結構域，並且該第二結構域包含一個抗體可變結構域；或 (iv) 該第一結構域包含一個抗體可變結構域，並且該第二結構域包含一個抗體可變結構域。

因此，第一結構域和第二結構域可以是各自包含兩個抗體可變結構域（如VH和VL結構域）的結合結構域。此類包含兩個抗體可變結構域的結合結構域的實例在上文進行了描述並且包括例如上文所述的Fv片段、scFv片段或Fab片段。可替代地，該等結合結構域中的一個或兩個可以僅包含單一可變結構域。這種單結構域結合結構域的實例在上文進行了描述並且包括例如奈米抗體或僅包含一個可變結構域的單一可變結構域抗體，該一個可變結構域可以是獨立於其他V區或結構域特異性結合抗原或表位的VHH、VH或VL。

在本發明的抗體構建體的較佳的實施方式中，第一結構域和第二結構域經由肽連接子與第三結構域融合。較佳的肽連接子已在上文描述並且特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly₄ Ser（SEQ ID NO: 187），或其聚合物，即(Gly₄ Ser)x，其中x為1或更大的整數（例如2或3）。用於第一結構域和第二結構域與第三結構域融合的特別較佳的連接子在SEQ ID No: 1中描繪。

在較佳的實施方式中，本發明的抗體構建體的特徵在於按胺基至羧基順序包含： (a) 第一結構域； (b) 肽連接子，該肽連接子具有選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID No: 187-189； I 第二結構域； (d) 肽連接子，該肽連接子具有選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 187、188、189、195、196、197和198； I 第三結構域的第一多肽單體； (f) 肽連接子，該肽連接子具有選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID No: 191、192、193和194；以及 (g) 第三結構域的第二多肽單體。

在本發明的一個方面中，由第一結構域結合的靶細胞表面抗原係腫瘤抗原、對免疫障礙特異的抗原或病毒抗原。如本文使用的術語「腫瘤抗原」可以理解為呈遞在腫瘤細胞上的那些抗原。該等抗原可以呈遞在具有細胞外部分的細胞表面上，該細胞外部分通常與分子的跨膜和細胞質部分組合。該等抗原有時只能由腫瘤細胞呈遞，而從來不能由正常細胞呈遞。與正常細胞相比，腫瘤抗原可以只在腫瘤細胞上表現或者可以代表腫瘤特異性突變。在這種情況下，它們被稱為腫瘤特異性抗原。更常見的是由腫瘤細胞和正常細胞呈遞的抗原，並且它們被稱為腫瘤相關抗原。與正常細胞相比，該等腫瘤相關抗原可以過表現，或者由於腫瘤組織的結構與正常組織相比較不緊密，因此係腫瘤細胞中的抗體結合可接近的。本文使用的腫瘤抗原的非限制性實例係CDH19、MSLN、DLL3、FLT3、EGFRvIII、CD33、CD19、MUC17、CLDN18.2、CDH3、CD70、BCMA和PSMA。

在本發明的上下文中，對免疫障礙特異的其他靶細胞表面抗原包括例如TL1A和TNF-α。所述靶較佳的是藉由本發明的雙特異性抗體構建體解決，其較佳的是全長抗體。在一個非常較佳的實施方式中，本發明的抗體係異源IgG抗體。

在本發明的抗體構建體的較佳的實施方式中，腫瘤抗原，較佳的是腫瘤抗原選自由以下組成之群組：CDH19、MSLN、DLL3、FLT3、EGFRvIII、CD33、CD19、、MUC17、CLDN18.2、CDH3、CD70、BCMA和PSMA。

在本發明的一個方面中，抗體構建體按胺基至羧基順序包含： (a) 第一結構域，該第一結構域具有選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID No: 7、8、17、27、28、37、38、39、40、41、48、49、50、51、52、59、60、61、62、63、64、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、89、90、91、92、93、100、101、102、103、104、113、114、121、122、123、124、125、131、132、133、134、135、136、143、144、145、146、147、148、149、150、151、158、159、160、161、162、163、164、165、166、173、174、175、176、177、178、179、180、181、223、235和246， (b) 肽連接子，該肽連接子具有選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID No: 187-189； I 第二結構域，該第二結構域具有選自由以下組成之群組的胺基酸序列：WO 2008/119567的SEQ ID No: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187或 SEQ ID NO: 202； (d) 肽連接子，該肽連接子具有選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID No: 187、188、189、195、196、197和198； I 第三結構域的第一多肽單體，該第一多肽單體具有選自由以下組成之群組的多肽序列：WO2017/134140的SEQ ID No: 17-24； (f) 肽連接子，該肽連接子具有選自由以下組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID No: 191、192、193和194；以及 (g) 第三結構域的第二多肽單體，該第二多肽單體具有選自由以下組成之群組的多肽序列：WO 2017/134140的SEQ ID No: 17-24。

在一方面，本發明的雙特異性抗體構建體的特徵在於具有選自由以下組成之群組的胺基酸序列並且針對相應靶細胞表面抗原： (a) SEQ ID No: 27、28、37至41； CD33 (b) SEQ ID No: 48至52中的每一個； EGFRvIII (c) SEQ ID No: 59至64中的每一個； MSLN (d) SEQ ID No: 71至82中的每一個 CDH19 (e) SEQ ID No: 100至104中的每一個 DLL3 (f) SEQ ID NO: 7、8、17、113和114 CD19 (g) SEQ ID No: 89至93中的每一個 FLT3 (h) SEQ ID No: 121至125中的每一個 CDH3 (i) SEQ ID No: 132至136中的每一個 BCMA (j) SEQ ID No: 143至151、158至166和173至181中的每一個 PSMA (k) SEQ ID NO:213 MUC17 (l) SEQ ID NO: 225和237中的每一個 CLDN18.2和 (m) SEQ ID No:248 CD70

本發明進一步提供了編碼本發明的抗體構建體的多核苷酸/核酸分子。多核苷酸係由共價鍵合在鏈中的13個或更多個核苷酸單體構成的生物聚合物。DNA（如cDNA）和RNA（如mRNA）係具有不同生物功能的多核苷酸的實例。核苷酸係充當核酸分子如DNA或RNA的單體或亞單位的有機分子。核酸分子或多核苷酸可以為雙股和單股的、線性的和圓形的。它較佳的是包含在載體中，該載體較佳的是包含在宿主細胞中。所述宿主細胞例如在用本發明的載體或多核苷酸轉化或轉染後能夠表現抗體構建體。出於此目的，多核苷酸或核酸分子與控制序列可操作地連接。

遺傳密碼係將遺傳物質（核酸）內編碼的資訊翻譯成蛋白質的一組規則。活細胞中的生物解碼係藉由以由mRNA指定的順序連接胺基酸的核糖體，使用tRNA分子攜帶胺基酸並一次讀出mRNA三個核苷酸來完成。該密碼定義了該等核苷酸三聯體的序列（稱為密碼子）如何指定在蛋白質合成期間接下來將添加哪種胺基酸。除了一些例外，核酸序列中的三核苷酸密碼子指定單一胺基酸。因為絕大多數基因都使用完全相同的密碼進行編碼，所以該特定密碼通常稱為規範或標準遺傳密碼。雖然遺傳密碼決定給定編碼區的蛋白質序列，但其他基因組區可能會影響該等蛋白質產生的時間和地點。

此外，本發明提供了載體，該載體包含本發明的多核苷酸/核酸分子。載體係用作將（外來）遺傳物質轉移到細胞中的媒介物的核酸分子。術語「載體」涵蓋但不限於質體、病毒、黏粒和人造染色體。一般來講，工程化載體包含複製起點、多株位點和選擇性標記。載體本身通常是核苷酸序列，該核苷酸序列通常是包含插入物（轉基因）和充當載體的「骨架」的更大序列的DNA序列。除轉基因插入物和骨架外，現代載體可涵蓋其他特徵：啟動子、遺傳標記、抗生素抗性、報告基因、靶向序列、蛋白質純化標籤。稱為表現載體（表現構建體）的載體尤其用於在靶細胞中表現轉基因，並且通常具有控制序列。

術語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適用於原核生物的控制序列包括啟動子、視需要的操縱子序列和核糖體結合側。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化訊號和增強子。

當核酸與另一核酸序列處於功能關係時，該核酸係「可操作地連接的」。例如，如果將前序列或分泌前導序列的DNA表現為參與多肽分泌的前蛋白，則該前序列或分泌前導序列的DNA可操作地連接至該多肽的DNA；如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則該啟動子或增強子可操作地連接至該序列；或者如果核糖體結合側被定位成使得有助於翻譯，則該核糖體結合側可操作地連接至編碼序列。一般來講，「可操作地連接」意指所連接的DNA序列係連續的，並且在分泌性前導序列的情形下係連續的並處於閱讀相（reading phase）中。然而，增強子不必係連續的。連接藉由在方便的限制性位點進行接合來完成。如果不存在此類位點，則根據常規實踐使用合成的寡核苷酸銜接子或連接子。

「轉染」係有意將核酸分子或多核苷酸（包括載體）引入到靶細胞中的過程。該術語主要用於真核細胞中的非病毒方法。轉導通常用於描述病毒介導的核酸分子或多核苷酸的轉移。動物細胞的轉染典型地涉及打開細胞膜中的暫態孔或「洞」，以允許攝取物質。轉染可以使用磷酸鈣，藉由電穿孔，藉由細胞擠壓或藉由將陽離子脂質與物質混合以產生脂質體（該等脂質體與細胞膜融合並將其貨物存放在內部）來進行。

術語「轉化」用於描述核酸分子或多核苷酸（包括載體）向細菌中，以及向非動物真核細胞（包括植物細胞）中的非病毒轉移。因此，轉化係細菌或非動物真核細胞的基因改變，該基因改變係因藉由一個或多個細胞膜從其周圍直接攝取並隨後併入外源遺傳物質（核酸分子）而產生。轉化可以藉由人為手段來實現。為了使轉化發生，細胞或細菌必須處於感受態，這可能作為對如饑餓和細胞密度的環境條件的時間限制應答而發生。

此外，本發明提供了宿主細胞，該宿主細胞用本發明的多核苷酸/核酸分子或載體轉化或轉染。如本文使用的，術語「宿主細胞」或「受體細胞」旨在包括可以是或已經係載體、外源性核酸分子和編碼本發明抗體構建體的多核苷酸的受體和/或抗體構建體本身的受體的任何單個細胞或細胞培養物。藉由轉化、轉染等方式將相應物質引入到細胞中。術語「宿主細胞」還旨在包括單細胞的後代或潛在後代。因為某些修飾可能由於天然的、意外的或有意的突變或由於環境影響而在後代中發生，所以這種後代事實上可能與親本細胞不完全相同（在形態或基因組或全部DNA補體中），但仍包括在本文所用術語的範圍內。適合的宿主細胞包括原核細胞或真核細胞，並且還包括但不限於細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞和動物細胞，如昆蟲細胞和哺乳動物細胞，例如鼠、大鼠、獼猴或人。

本發明的抗體構建體可以在細菌中產生。表現後，將本發明的抗體構建體從大腸桿菌細胞糊中以可溶性級分分離，並且可以藉由例如親和層析法和/或尺寸排除來純化。最終純化可以類似於用於純化例如在CHO細胞中表現的抗體的方法進行。

除了原核生物之外，真核微生物（如絲狀真菌或酵母）係本發明的抗體構建體的適合的選殖或表現宿主。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）或普通麵包酵母係低等真核宿主微生物中最常用的。然而，許多其他屬、物種和菌株通常可獲得並且可用於本文中，如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、克魯維酵母屬（Kluyveromyce）宿主，如乳酸克魯維酵母（K. lactis）、脆壁克魯維酵母（K. fragilis）（ATCC 12424）、保加利亞克魯維酵母（K. bulgaricus）（ATCC 16045）、威克克魯維酵母（K. wickeramii）（ATCC 24178）、瓦爾提魯維酵母（K. waltii）（ATCC 56500）、果蠅克魯維酵母（K. drosophilarum）（ATCC 36906）、耐熱克魯維酵母（K. thermotolerans）和馬克斯克魯維酵母（K. marxianus）；耶氏酵母屬（EP 402 226）；畢赤酵母（EP 183 070）；假絲酵母屬；瑞氏木黴（EP 244 234）；粗糙脈孢菌；許旺酵母屬（Schwanniomyces），如西方許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）；和絲狀真菌，如脈孢菌屬（Neurospora）、青黴屬（Penicillium）、彎頸黴屬（Tolypocladium）和麯黴屬（Aspergillus）宿主，如構巢麯黴（A. nidulans）和黑麯黴（A. niger）。

用於表現本發明的糖基化抗體構建體的適合的宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊椎動物細胞的實例包括植物細胞和昆蟲細胞。已經鑒定了來自如草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）（毛蟲）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）（蚊子）、白紋伊蚊（Aedes albopictus）（蚊子）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）（果蠅）和家蠶（Bombyx mori）的宿主的許多桿狀病毒株和變體以及相應的許可性昆蟲宿主細胞。用於轉染的多種病毒株係公眾可獲得的，例如苜蓿銀紋夜蛾（Autographa californica）NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5株，並且根據本發明，此類病毒可以用作本文的病毒，特別是用於轉染草地貪夜蛾細胞。

棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、擬南芥和煙草的植物細胞培養物也可以用作宿主。可用於在植物細胞培養物中產生蛋白質的選殖和表現載體係熟悉該項技術者已知的。參見，例如Hiatt等人, Nature [自然] (1989) 342: 76-78；Owen等人 (1992) Bio/Technology [生物/技術] 10: 790-794；Artsaenko等人 (1995) The Plant J [植物雜誌] 8: 745-750和Fecker等人 (1996) Plant Mol Biol [植物分子生物學] 32: 979-986。

然而，對脊椎動物細胞的興趣最大，並且脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中的繁殖已成為常規程序。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例係由SV40（COS-7，ATCC CRL 1651）轉化的猴腎CV1系；人胚胎腎系（293細胞或亞選殖用於在懸浮培養中生長的293細胞，Graham等人, J. Gen Virol.[普通病毒學雜誌]36 : 59 (1977)）；幼倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10）；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR（CHO，Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 77: 4216 (1980)）；小鼠塞托利細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod.[生殖生物學]23: 243-251 (1980)）；猴腎細胞（CVI ATCC CCL 70）；非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL1587）；人宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2）；犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34）；布法羅大鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人肺細胞（W138，ATCC CCL 75）；人肝細胞（Hep G2,1413 8065）；小鼠乳房腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL5 1）；TRI細胞（Mather等人, Annals N. Y Acad. Sci. [紐約科學院年刊] (1982) 383: 44-68）；MRC 5細胞；FS4細胞；和人肝癌細胞系（Hep G2）。

在另一實施方式中，本發明提供了用於產生本發明的抗體構建體的方法，所述方法包括在允許表現本發明的抗體構建體的條件下培養本發明的宿主細胞並且從該培養物中回收所產生的抗體構建體。

如本文使用的，術語「培養」係指細胞在適合的條件下在培養基中的體外維持、分化、生長、增殖和/或繁殖。術語「表現」包括涉及產生本發明的抗體構建體的任何步驟，包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。

當使用重組技術時，抗體構建體可以在周質空間中細胞內產生，或直接分泌到培養基中。如果抗體構建體係在細胞內產生，則作為第一步，例如藉由離心或超濾去除宿主細胞或溶解片段的微粒狀碎片。Carter等人, Bio/Technology [生物/技術] 10: 163-167 (1992)描述了用於分離分泌到大腸桿菌周質空間的抗體的程序。簡而言之，在約30 min內，在乙酸鈉（pH 3.5）、EDTA和苯甲基磺醯氟（PMSF）存在下使細胞糊解凍。可以藉由離心去除細胞碎片。在將抗體分泌到培養基中的情況下，通常首先使用可商購的蛋白質濃縮濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元對來自此類表現系統的上清液進行濃縮。任何前述步驟中可以包括蛋白酶抑制劑（如PMSF）以抑制蛋白水解，並且可以包括抗生素以防止外來污染物的生長。

可以使用例如羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析和親和層析法回收或純化從宿主細胞製備的本發明的抗體構建體。取決於要回收的抗體，也可使用其他用於蛋白質純化的技術，如在離子交換柱上分級分離、乙醇沈澱、反相HPLC、在二氧化矽上進行的層析法、在肝素SEPHAROSE^TM 上進行的層析法、在陰離子或陽離子交換樹脂（如聚天冬胺酸柱）上進行的層析法、層析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸銨沈澱。當本發明的抗體構建體包含CH3結構域時，Bakerbond ABX樹脂（美國貝克，菲力浦斯堡，新澤西州（J.T. Baker，Phillipsburg，NJ））可用於純化。

親和層析法係較佳的純化技術。親和配位基所連接的基質最常為瓊脂糖，但其他基質也是可用的。在機械上穩定的基質如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允許比用瓊脂糖可以實現的更快的流速和更短的處理時間。

此外，本發明提供了藥物組成物，該藥物組成物包含本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體。對於本發明的藥物組成物較佳的是，抗體構建體的均質性為 ≥ 80%，更較佳的是 ≥ 81%、≥ 82%、≥ 83%、≥ 84%或 ≥ 85%，進一步較佳的是 ≥ 86%、≥ 87%、≥ 88%、≥ 89%或 ≥ 90%，還進一步較佳的是 ≥ 91%、≥ 92%、≥ 93%、≥ 94%或 ≥ 95%，並且最較佳的是 ≥ 96%、≥ 97%、≥ 98%或 ≥ 99%。

如本文使用的，術語「藥物組成物」涉及適合施用給患者，較佳的是人患者的組成物。本發明的特別較佳的藥物組成物包含較佳的是治療有效量的一種或多種本發明的抗體構建體。較佳的是，藥物組成物進一步包含一種或多種（藥學上有效的）載劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑的適合配製物。組成物的可接受成分較佳的是在所使用的劑量和濃度下係對接受者無毒性的。本發明的藥物組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾組成物。

本發明組成物可以包含藥學上可接受的載劑。一般來講，如本文使用的，「藥學上可接受的載劑」意指與藥物施用，特別是腸胃外施用相容的任何和所有的水性和非水性溶液、無菌溶液、溶劑、緩衝劑（例如磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）溶液）、水、懸浮液、乳液（如油/水乳液）、各物種型的潤濕劑、脂質體、分散介質和包衣。此類介質和藥劑在藥物組成物中的使用在本領域中是熟知的，並且包含此類載劑的組成物可以藉由熟知的常規方法配製。

某些實施方式提供了藥物組成物，該等藥物組成物包含本發明的抗體構建體和另外一種或多種賦形劑，如在本部分和本文其他地方說明性描述的那些賦形劑。在這方面，賦形劑在本發明中可用於多種目的，如調整配製物的物理、化學或生物特性，如調整黏度和/或本發明的方法以改善有效性和/或穩定此類配製物和方法，以對抗由於例如在製造、運輸、儲存、使用前準備、施用和之後過程中發生的壓力而導致的降解和腐壞。

在某些實施方式中，藥物組成物可以含有用於改變、保持或保存組成物的以下方面的目的的配製物質：例如pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附性或滲透性（參見REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明登氏藥學全書], 第18"版, (A.R. Genrmo編輯), 1990, Mack Publishing Company [馬克出版公司]）。在此類實施方式中，適合的配製物質可以包括但不限於： • 胺基酸，如甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、蘇胺酸、脯胺酸、2-苯丙胺酸，包括帶電荷的胺基酸，較佳的是離胺酸、乙酸離胺酸、精胺酸、麩胺酸鹽和/或組胺酸 • 抗微生物劑，如抗細菌劑和抗真菌劑 • 抗氧化劑，如抗壞血酸、甲硫胺酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉； • 緩衝劑、緩衝系統和緩沖劑，用於將組成物保持在生理pH值或稍更低的pH值；緩衝劑的實例係硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸、琥珀酸鹽、磷酸鹽和組胺酸；例如約pH 7.0-8.5的Tris緩衝劑； • 非水性溶劑，如丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射用有機酯如油酸乙酯； • 水性載劑包括水、醇/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝的介質； • 生物可降解聚合物，如聚酯； • 膨脹劑，如甘露醇或甘胺酸； • 螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）； • 等滲劑和吸收延遲劑； • 錯合劑（如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精）； • 填充劑； • 單糖；二糖；和其他碳水化合物（如葡萄糖、甘露糖或糊精）；碳水化合物可以是非還原糖，較佳的是海藻糖、蔗糖、八硫酸鹽、山梨醇或木糖醇； • （低分子量）蛋白質、多肽或蛋白質載劑，如人或牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白，較佳的是人來源的； • 著色劑和調味劑； • 含硫還原劑，如麩胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、[α]-一硫代甘油和硫代硫酸鈉 • 稀釋劑； • 乳化劑； • 親水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮； • 成鹽抗衡離子，如鈉； • 防腐劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等；實例係：苯紮氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫； • 金屬複合物，如Zn-蛋白質複合物； • 溶劑和共溶劑（如甘油、丙二醇或聚乙二醇）； • 糖和糖醇，如海藻糖、蔗糖、八硫酸鹽、甘露醇、山梨醇或木糖醇水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖（myoinisitose）、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌肉肌醇（myoinisitol）、半乳糖醇、甘油、環多醇（例如肌醇）、聚乙二醇；和多元糖醇； • 懸浮劑； • 表面活性劑或潤濕劑（如普朗尼克（pluronics）、PEG、脫水山梨聚糖、聚山梨醇酯（如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯）、氚核、胺丁三醇、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙星（tyloxapal））；表面活性劑可以是洗滌劑，較佳的是分子量＞ 1.2 KD，和/或聚醚，較佳的是分子量＞ 3 KD；較佳的洗滌劑的非限制性實例係吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80和吐溫85；較佳的聚醚的非限制性實例係PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000和PEG 5000； • 穩定性增強劑，如蔗糖或山梨醇； • 張力增強劑（如鹼金屬鹵化物，較佳的是氯化鈉或氯化鉀、甘露醇山梨醇）； • 腸胃外遞送媒介物，包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發性油； • 靜脈內遞送媒介物，包括流體和營養補充物、電解質補充物（如基於林格氏右旋糖的那些）。

對於熟悉該項技術者來說明顯的是，例如，藥物組成物的不同成分（例如，上文列出的那些）可以具有不同的效應，並且胺基酸可以充當緩衝劑、穩定劑和/或抗氧化劑；甘露醇可以充當膨脹劑和/或張力增強劑；氯化鈉可以充當遞送媒介物和/或張力增強劑；等。

設想除了本文定義的本發明的多肽之外，本發明的組成物可以包含另外的生物活性劑，這取決於組成物的預期用途。此類藥劑可以是作用於胃腸系統的藥物、充當細胞抑制劑的藥物、預防高尿酸血症的藥物、抑制免疫反應的藥物（例如皮質類固醇）、調節炎症應答的藥物、作用於循環系統的藥物和/或本領域中已知的藥劑如細胞因子。還設想將本發明的抗體構建體應用於共療法中，即與另一種抗癌藥物組合。

在某些實施方式中，最佳藥物組成物將由熟悉該項技術者根據例如預期施用途徑、遞送形式和所希望劑量來確定。參見，例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明登氏藥學全書]，同上。在某些實施方式中，此類組成物可以影響本發明的抗體構建體的物理狀態、穩定性、體內釋放速率和體內清除速率。在某些實施方式中，藥物組成物中的主要媒介物或載劑本質上可以是水性的或非水性的。例如，適合的媒介物或載劑可以是注射用水、生理鹽水溶液或人造腦脊液，可能補充有用於腸胃外施用的組成物中常見的其他物質。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水係另外的示例性媒介物。在某些實施方式中，本發明抗體構建體組成物可以藉由將具有所希望純度的選定成分與視需要的配製物（REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明登氏藥學全書]，同上）以凍乾餅或水性溶液的形式混合來製備用於儲存。此外，在某些實施方式中，可以使用適當的賦形劑（如蔗糖）將本發明的抗體構建體配製成凍乾物。

當考慮腸胃外施用時，用於本發明的治療組成物能以無熱原的腸胃外可接受的水性溶液的形式提供，該水性溶液在藥學上可接受的媒介物中包含本發明的所希望抗體構建體。用於腸胃外注射的特別適合的媒介物係無菌蒸餾水，其中將本發明的抗體構建體配製成適當保存的無菌等滲溶液。在某些實施方式中，該製備可以涉及用可以提供產物（該產物可以經由儲庫注射來遞送）的受控或持續釋放的藥劑（如可注射微球體、生物可侵蝕顆粒、聚合物化合物（如聚乳酸或聚乙醇酸）、珠粒或脂質體）配製所希望分子。在某些實施方式中，也可以使用透明質酸，該透明質酸具有促進循環持續時間的作用。在某些實施方式中，可植入藥物遞送裝置可用於引入所希望的抗體構建體。

其他藥物組成物對於熟悉該項技術者來說係顯而易見的，包括在持續或控制遞送/釋放配製物中涉及本發明抗體構建體的配製物。用於配製各種其他持續或控制遞送方式的技術（如脂質體載劑、生物可侵蝕微粒或多孔珠粒和儲庫注射）也是熟悉該項技術者已知的。參見，例如國際專利申請號PCT/US 93/00829，其描述了用於遞送藥物組成物的多孔聚合物微粒的控制釋放。持續釋放製劑可以包括呈成型製品（例如膜或微膠囊）形式的半透性聚合物基質。持續釋放基質可以包括聚酯、水凝膠、聚丙交酯（如美國專利案號3,773,919和歐洲專利申請公開號EP 058481中所揭露）、L-麩胺酸和γ-L-麩胺酸乙酯的共聚物（Sidman等人, 1983, Biopolymers [生物聚合物] 2:547-556）、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)（Langer等人, 1981, J. Biomed. Mater. Res. [生物醫學材料研究雜誌] 15:167-277和Langer, 1982, Chem. Tech. [化學技術] 12:98-105）、乙烯乙酸乙烯酯（Langer等人, 1981, 同上）或聚-D(-)-3-羥基丁酸（歐洲專利申請公開號EP 133,988）。持續釋放組成物還可以包括可以藉由本領域中已知的若干種方法中的任一種製備的脂質體。參見，例如Eppstein等人, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 82:3688-3692；歐洲專利申請公開號EP 036,676；EP 088,046和EP 143,949。

也可以將抗體構建體包埋在例如藉由凝聚技術或藉由介面聚合製備的微膠囊（例如分別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊）中，包埋在膠體藥物遞送系統（例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒和奈米膠囊）中或包埋在粗滴乳狀液中。此類技術揭露於Remington's Pharmaceutical Sciences [雷明登氏藥學全書], 第16版, Oslo, A.編輯, (1980) 中。

用於體內施用的藥物組成物典型地以無菌製劑提供。滅菌可以藉由無菌濾膜過濾完成。當將組成物凍乾時，可以在凍乾和重構之前或之後使用該方法進行滅菌。用於腸胃外施用的組成物能以凍乾形式或於溶液中儲存。通常將腸胃外組成物置入具有無菌進入口的容器（例如具有可由皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶）中。

本發明的另一方面包括自緩衝的本發明抗體構建體配製物，該等配製物可用作藥物組成物，如國際專利申請WO 06138181A2（PCT/US 2006/022599）中所述。在這方面有用的蛋白質穩定和配製材料和方法，可以獲得各種各樣的說明，如Arakawa等人, 「Solvent interactions in pharmaceutical formulations [藥物配製物中的溶劑相互作用],」 Pharm Res. [藥物研究] 8(3): 285-91 (1991)；Kendrick等人, 「Physical stabilization of proteins in aqueous solution [水性溶液中蛋白質的物理穩定化]」在RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE [穩定蛋白質配製物的合理設計：理論與實踐]中, Carpenter和Manning編輯 Pharmaceutical Biotechnology [藥物生物技術] 13: 61-84 (2002)和Randolph等人, 「Surfactant-protein interactions [表面活性劑-蛋白質相互作用]」, Pharm Biotechnol. [藥物生物技術] 13: 159-75 (2002)，特別參見關於根據本發明的自緩衝蛋白質配製物的相關賦形劑和方法的相關部分，尤其是關於用於獸醫和/或人醫學用途的蛋白質藥物產品和方法。

根據本發明的某些實施方式，可以使用鹽以例如調整配製物的離子強度和/或等滲性和/或改善根據本發明的組成物的蛋白質或其他成分的溶解度和/或物理穩定性。眾所周知，離子可以藉由與蛋白質表面上的帶電荷的殘基結合並藉由遮罩蛋白質中的帶電荷基團和極性基團並降低其靜電相互作用、吸引和排斥相互作用的強度來穩定蛋白質的天然狀態。離子還可以藉由特別地與蛋白質的變性肽鍵(--CONH)結合來穩定蛋白質的變性狀態。此外，與蛋白質中的帶電荷基團和極性基團的離子相互作用還可以減少分子間靜電相互作用，並且從而防止或減少蛋白質聚集和不溶解。

離子種類對蛋白質的作用顯著不同。已經開發了多種對可用於配製根據本發明的藥物組成物的離子及其對蛋白質的作用的分類評級。一個實例係Hofmeister系列，該系列藉由對溶液中蛋白質的構象穩定性的作用來對離子和極性非離子溶質進行評級。穩定溶質稱為「親液的」。不穩定溶質稱為「離液的」。通常使用高濃度的親液劑（例如，＞ 1莫耳硫酸銨）以從溶液中沈澱蛋白質（「鹽析」）。通常使用離液劑來使蛋白質變性和/或溶解（「鹽溶」）。離子對「鹽溶」和「鹽析」的相對有效性限定了其在Hofmeister系列中的位置。

根據本發明的各種實施方式，游離胺基酸可在本發明抗體構建體配製物中作為膨脹劑、穩定劑和抗氧化劑以及其他標準用途。離胺酸、脯胺酸、絲胺酸和丙胺酸可用於穩定配製物中的蛋白質。甘胺酸可用於凍乾以確保正確的餅結構和特性。在液體配製物和凍乾配製物兩者中，精胺酸均可用於抑制蛋白質聚集。蛋胺酸可用作抗氧化劑。

多元醇包括糖，例如甘露醇、蔗糖和山梨醇以及多元醇，如例如甘油和丙二醇，並且出於本文論述的目的，包括聚乙二醇（PEG）和相關物質。多元醇係親液的。它們在液體配製物和凍乾配製物兩者中是有用的穩定劑，以保護蛋白質免受物理和化學降解過程的影響。多元醇也可用於調整配製物的張力。在本發明的選擇實施方式中有用的多元醇係甘露醇，甘露醇通常用於確保在凍乾配製物中餅的結構穩定性。它確保了餅的結構穩定性。它通常與凍乾保護劑（例如蔗糖）一起使用。山梨醇和蔗糖係用於調整張力且作為穩定劑以防止在運輸過程中的冷凍-解凍應力或防止在製造過程中製備團塊的較佳的藥劑。還原糖（含有游離醛或酮基團），如葡萄糖和乳糖，可以使表面離胺酸和精胺酸殘基糖基化。因此，它們通常不是根據本發明使用的較佳的多元醇。此外，在這方面，形成此類反應性物質的糖也不是本發明較佳的多元醇，該糖如蔗糖，蔗糖在酸性條件下水解為果糖和葡萄糖並因此產生糖基化。PEG可用於穩定蛋白質並用作冷凍保護劑，並且在這方面可以用於本發明。

本發明抗體構建體配製物的實施方式進一步包含表面活性劑。蛋白質分子可易於吸附在表面上，並且變性以及隨後在空氣-液體、固體-液體和液體-液體介面處聚集。該等效應通常與蛋白質濃度成反比。該等有害的相互作用通常與蛋白質濃度成反比，並且典型地因物理振盪（如在產品運輸和處理過程中產生的物理振盪）而加劇。常規使用表面活性劑來防止、最小化或減少表面吸附。在這方面，本發明中有用的表面活性劑包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脫水山梨醇聚乙氧基化物的其他脂肪酸酯、以及泊洛沙姆188。表面活性劑也常用於控制蛋白質構象穩定性。在這方面使用表面活性劑係蛋白質特異性的，因為任何給定的表面活性劑典型地會穩定一些蛋白質並使其他蛋白質不穩定。

聚山梨醇酯易於氧化降解，並且通常在供應時含有足夠量的過氧化物以引起蛋白質殘基側鏈，尤其是甲硫胺酸的氧化。因此，應謹慎使用聚山梨醇酯，並且在使用時應以其最低有效濃度使用。在這方面，聚山梨醇酯例示了賦形劑應以其最低有效濃度使用的一般規則。

本發明抗體構建體配製物的實施方式進一步包含一種或多種抗氧化劑。藉由保持適當水平的環境氧氣和溫度並避免暴露於光下，可以在某種程度上防止藥物配製物中蛋白質的有害氧化。也可以使用抗氧化賦形劑來防止蛋白質的氧化降解。在這方面，有用的抗氧化劑係還原劑、氧/自由基清除劑和螯合劑。用於根據本發明的治療性蛋白質配製物中的抗氧化劑較佳的是水溶性的並且在整個產品的儲存壽命內保持其活性。在這方面，EDTA係根據本發明的較佳的抗氧化劑。抗氧化劑可以破壞蛋白質。例如，還原劑，如特別是麩胱甘肽，可以破壞分子內二硫鍵。因此，選擇用於本發明的抗氧化劑尤其用於消除或足夠降低其本身破壞配製物中的蛋白質的可能性。

根據本發明的配製物可以包含金屬離子，該等金屬離子係蛋白質輔助因子並且是形成蛋白質配位複合物所必需的，如形成某些胰島素懸浮液所必需的鋅。金屬離子也可以抑制降解蛋白質的一些過程。然而，金屬離子也催化降解蛋白質的物理和化學過程。鎂離子（10-120 mM）可用於抑制天冬胺酸異構化為異天冬胺酸。Ca⁺² 離子（高達100 mM）可以增加人去氧核糖核酸酶的穩定性。然而，Mg⁺² 、Mn⁺² 和Zn⁺² 可以使rhDNase去穩定。類似地，Ca⁺² 和Sr⁺² 可以穩定因子VIII，它可以因Mg⁺² 、Mn⁺² 和Zn⁺² 、Cu⁺² 和Fe⁺² 去穩定，並且其聚集可以藉由Al⁺³ 離子增加。

本發明抗體構建體配製物的實施方式進一步包含一種或多種防腐劑。當開發涉及從同一容器提取超過一次的多劑量腸胃外配製物時，防腐劑係必需的。其主要功能係抑制微生物生長並確保在藥物產品的整個保質期或使用期限內的產品無菌性。常用的防腐劑包括苯甲醇、苯酚和間甲酚。儘管防腐劑在小分子腸胃外使用方面有著悠久的歷史，但包含防腐劑的蛋白質配製物的開發可能具有挑戰性。防腐劑幾乎總是對蛋白質具有不穩定效應（聚集），並且這已成為限制其在多劑量蛋白質配製物中使用的主要因素。迄今為止，大部分蛋白質藥物僅配製用於一次性使用。然而，當多劑量配製物係可能時，它們具有使患者方便的附加優勢和增加的可銷售性。一個良好的實例係人生長激素（hGH），其中防腐配製物的開發已經導致更方便、多次使用的注射筆展示的商業化。至少四種含有hGH的防腐配製物的此類筆裝置目前可在市場上獲得。Norditropin（液體，諾和諾德公司（Novo Nordisk））、Nutropin AQ（液體，基因泰克公司（Genentech））和Genotropin（凍乾的--雙室藥筒，法瑪西亞普強公司（Pharmacia & Upjohn））含有苯酚，而Somatrope（禮來公司（Eli Lilly））用間-甲酚進行配製。在防腐劑型的配製和開發期間需要考慮若干個方面。必須優化藥物產品中有效的防腐劑濃度。這需要以賦予抗微生物有效性而不損害蛋白質穩定性的濃度範圍測試劑型中給定的防腐劑。

正如可以預期的那樣，含有防腐劑的液體配製物的開發比凍乾配製物更具挑戰性。冷凍乾燥的產品可以在沒有防腐劑的情況下凍乾，並且在使用時用含有防腐劑的稀釋劑重構。這縮短了防腐劑與蛋白質接觸的時間，從而顯著最小化相關的穩定性風險。在液體配製物的情況下，應在整個產品保質期（約18至24個月）內保持防腐劑有效性和穩定性。要指出的重要點係，防腐劑有效性應在含有活性藥物和所有賦形劑組分的最終配製物中得到證實。

本文揭露的抗體構建體也可以配製為脂質體。「脂質體」係由各物種型的脂質、磷脂和/或表面活性劑構成的小囊泡，該小囊泡可用於將藥物遞送至哺乳動物。脂質體的組分通常以雙層形式排列，類似於生物膜的脂質排列。含有抗體構建體的脂質體藉由本領域已知的方法製備，如Epstein等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 82: 3688 (1985)；Hwang等人 , Proc. Natl Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 77: 4030 (1980)；美國專利案號4,485,045和4,544,545；以及WO 97/38731中所述。具有延長的循環時間的脂質體揭露於美國專利案號5,013,556中。特別有用的脂質體可以藉由反相蒸發方法用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG衍生化磷脂醯乙醇胺（PEG-PE）的脂質組成物產生。使脂質體擠出藉由具有限定孔徑的濾器以產生具有所希望的直徑的脂質體。本發明的抗體構建體的Fab’片段可以與脂質體經由二硫鍵交換反應軛合，如Martin等人 J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 257: 286-288 (1982) 中所述。化學治療劑視需要包含在脂質體內。參見Gabizon等人 J. National Cancer Inst. [國家癌症研究所雜誌]81 (19) 1484 (1989)。

一旦配製了藥物組成物，可以將它作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體或作為脫水或凍乾粉末儲存在無菌小瓶中。此類配製物能以即用形式或以在施用前重構的形式（例如凍乾形式）儲存。

本文定義的藥物組成物的生物活性可以例如藉由細胞毒性測定來確定，如以下實例、WO 99/54440或由Schlereth等人（Cancer Immunol. Immunother. [癌症免疫學免疫治療] 20 (2005), 1-12）所述。如本文使用的，「功效」或「體內功效」係指使用例如標準化NCI應答標準對本發明的藥物組成物治療的應答。使用本發明的藥物組成物的療法的成功或體內功效係指組成物對於其預期用途的有效性，即組成物引起其所希望效應，即耗盡病理細胞（例如腫瘤細胞）的能力。體內功效可以藉由已建立的相應疾病實體的標準方法進行監測，該等方法包括但不限於白血球計數、差異、螢光激活細胞分選法、骨髓抽吸。另外，可以使用各種疾病特異性臨床化學參數和其他建立的標準方法。此外，可以使用電腦輔助斷層攝影術、X射線、核磁共振斷層攝影術（例如，用於基於國家癌症研究所標準的應答評估[Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas [標準化非霍奇金淋巴瘤應答標準的國際研討會報告]. NCI Sponsored International Working Group [NCI資助的國際工作組]. J Clin Oncol. [臨床腫瘤學雜誌] 1999年4月;17(4):1244]）、正電子發射斷層攝影術掃描、白血球計數、差異、螢光激活細胞分選法、骨髓抽吸、淋巴結活組織檢查/組織學和各種淋巴瘤特異性臨床化學參數（例如乳酸鹽脫氫酶）和其他已建立的標準方法。

開發藥物（如本發明的藥物組成物）的另一主要挑戰係藥物動力學特性的可預測調節。為此，可以建立候選藥物的藥物動力學曲線，即影響特定藥物治療給定病狀的能力的藥物動力學參數的曲線。影響藥物治療某種疾病實體的能力的藥物的藥物動力學參數包括但不限於：半衰期、分佈容量、肝臟首過代謝和血清結合程度。給定藥劑的功效可以受到上文提及的每個參數的影響。本發明的抗體構建體的設想特徵提供有它們包含的特定FC模式，例如藥物動力學行為的差異。根據本發明的半衰期延長的靶向抗體構建體與所述抗體構建體的「規範的」非HLE型式相比較佳的是顯示體內滯留時間令人驚訝地增加。

「半衰期」意指50%的施用藥物藉由生物過程（例如代謝、排泄等）消除的時間。「肝臟首過代謝」意指藥物在首次與肝臟接觸時，即在首次通過肝臟期間代謝的傾向。「分佈體積」意指藥物在身體各個隔室（例如細胞內和細胞外空間、組織和器官等）中的滯留程度，以及藥物在該等隔室內的分佈。「血清結合程度」意指藥物與血清蛋白（如白蛋白）相互作用並結合從而導致藥物生物活性降低或喪失的傾向。

藥物動力學參數還包括對於施用的給定量藥物的生物利用度、滯後時間（T滯後）、Tmax、吸收速率、起效時間和/或Cmax。「生物利用度」意指血液隔室中藥物的量。「滯後時間」意指藥物施用與其在血液或血漿中的檢測和可測量性之間的時間延遲。「Tmax」係藥物達到最大血液濃度之後的時間，並且「Cmax」係用給定藥物獲得的最大血液濃度。達到其生物效應所需的藥物的血液或組織濃度的時間受到所有參數的影響。表現出跨物種特異性的雙特異性抗體構建體的藥物動力學參數（其可以在如上所概述的非黑猩猩靈長類動物的臨床前動物測試中確定）也示於例如Schlereth等人（Cancer Immunol. Immunother. [癌症免疫學免疫治療] 20 (2005), 1-12）的公開中。

在本發明的較佳的方面中，藥物組成物在約-20°C下穩定至少四周。從所附實施方式中顯而易見的是，可以使用不同的系統測試本發明的抗體構建體的品質相比於相應先前技術抗體構建體的品質。該等測試被理解為符合「ICH Harmonised Tripartite Guideline:Stability Testing of Biotechnological/Biological Products Q5C andSpecifications: Test procedures and Acceptance Criteria for Biotech Biotechnological/Biological Products Q6B [ICH三方協調指南：生物技術/生物產品的穩定性測試Q5C和規格：生物技術/生物產品的測試程序和驗收準則Q6B]」，並且因此被選擇以提供穩定性指示曲線，從而確定檢測到產品的屬性、純度和效力的變化。人們普遍接受術語純度係相對術語。由於糖基化、脫醯胺或其他異質性的效應，因此生物技術/生物產品的絕對純度典型地應藉由超過一種的方法進行評估，並且所導出的純度值取決於方法。出於穩定性測試的目的，純度測試應集中在確定降解產物的方法上。

為了評估包含本發明的抗體構建體的藥物組成物的品質，可以例如藉由分析溶液中可溶性聚集物的含量（根據尺寸排除的HMWS）來分析。較佳的是，在約-20°C下穩定至少四周的特徵在於小於1.5% HMWS/較佳的是小於1% HMWS的含量。

作為藥物組成物的抗體構建體的較佳的配製物可以例如包含如下所述的配製物的組分： • 配製物：磷酸鉀、L-精胺酸鹽酸鹽、海藻糖、聚山梨醇酯80，在pH 6.0下

在所附實例4-12中提供了用於評估呈藥物組成物形式的本發明的抗體構建體的穩定性的其他實例。在那些實例中，關於不同藥物配製物中的不同應力條件測試本發明的抗體構建體的實施方式，並且將結果與本領域已知的雙特異性T細胞接合抗體構建體的其他半衰期延長（HLE）形式進行比較。一般來講，設想與具有不同HLE形式和不具有任何HLE形式的抗體構建體（即「規範的」抗體構建體）相比，根據本發明的提供有特定FC模式的抗體構建體在寬範圍的應力條件（如溫度和光應力）下典型地更穩定。所述溫度穩定性可以涉及降低的溫度（低於室溫，包括冷凍）和升高的溫度（高於室溫，包括高達或高於體溫的溫度）兩者。正如熟悉該項技術者將會認識到，在臨床實踐中難以避免的這種關於應力的改善穩定性使得抗體構建體更安全，這係因為在臨床實踐中會出現較少的降解產物。結果，所述增加的穩定性意味著安全性增加。

一個實施方式提供了本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體，其用於預防、治療或緩解增殖性疾病、腫瘤性疾病、病毒性疾病或免疫性障礙。

本文所述的配製物可在有需要的患者中用作治療、緩解和/或預防如本文所述的病理醫學病狀的藥物組成物。術語「治療」係指治療性治療和預防性（prophylactic或preventative）措施兩者。治療包括將配製物施加或施用至患有疾病/障礙、疾病/障礙的症狀或患疾病/障礙的傾向的患者的體內、分離的組織或細胞，目的是治癒、痊癒、緩和、減輕、改變、補救、緩解、改善或影響該疾病，該疾病症狀或患該疾病的傾向。

如本文使用的，術語「緩解」係指藉由將根據本發明的抗體構建體施用至有需要的受試者而對患有如下文所述的腫瘤或癌症或轉移性癌症的患者的疾病狀態的任何改善。這種改善還可以被視為減緩或停止患者的腫瘤或癌症或轉移性癌症的進展。如本文使用的，術語「預防」意指藉由將根據本發明的抗體構建體施用至有需要的受試者來避免患有如下文所指定的腫瘤或癌症或轉移性癌症的患者發生或復發。

術語「疾病」係指將受益於用本文所述的抗體構建體或藥物組成物治療的任何病狀。這包括慢性和急性障礙或疾病，包括那些使哺乳動物易患所考慮疾病的病理病狀。

「贅生物」係組織的異常生長，通常但不總是形成腫塊。當也形成腫塊時，通常稱之為「腫瘤」。贅生物或腫瘤可以是良性的、潛在惡性的（癌前）、或惡性的。惡性贅生物通常稱為癌症。它們通常侵入並破壞周圍組織，並可能形成轉移，即它們擴散到身體的其他部位、組織或器官。因此，術語「轉移性癌症」涵蓋轉移到原始腫瘤的組織或器官除外的其他組織或器官。淋巴瘤和白血病係淋巴贅生物。出於本發明的目的，它們也涵蓋在術語「腫瘤」或「癌症」中。

術語「病毒性疾病」描述了作為受試者病毒感染的結果的疾病。

如本文使用的，術語「免疫學障礙」根據該術語的常見定義描述免疫學障礙，如自體免疫疾病、超敏反應、免疫缺陷。

在一個實施方式中，本發明提供治療或緩解增殖性疾病、腫瘤性疾病、病毒性疾病或免疫障礙的方法，該方法包括向有需要的受試者施用本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體的步驟。

術語「有需要的受試者」或「需要治療的那些」包括已經患有障礙的那些以及要預防障礙的那些。有需要的受試者或「患者」包括接受預防性或治療性治療的人和其他哺乳動物受試者。

本發明的抗體構建體通常將針對特定施用途徑和方法、特定施用劑量和頻率、特定疾病的特定治療、生物利用度和持久性範圍等來設計。組成物的物質較佳的是以對於施用位點可接受的濃度配製。

因此可以根據本發明設計配製物和組成物以藉由任何適合的施用途徑遞送。在本發明的上下文中，施用途徑包括但不限於 • 局部途徑（如表皮、吸入、鼻、眼、耳（auricular/aural）、陰道、黏膜）； • 腸內途徑（如口服、胃腸道、舌下、唇下部、經頰、直腸）；以及 • 腸胃外途徑（如靜脈內、動脈內、骨內、肌內、腦內、腦室內、硬膜外、鞘內、皮下、腹膜內、羊膜外、關節內、心內、真皮內、病灶內、子宮內、膀胱內、玻璃體內、經皮、鼻內、經黏膜、滑膜內、管腔內）。

本發明的藥物組成物和抗體構建體可特別用於腸胃外施用，例如皮下或靜脈內遞送，例如藉由注射如彈丸注射，或藉由輸注如連續輸注。藥物組成物可以使用醫療裝置來施用。用於施用藥物組成物的醫療裝置的實例描述在美國專利案號4,475,196；4,439,196；4,447,224；4,447,233；4,486,194；4,487,603；4,596,556；4,790,824；4,941,880；5,064,413；5,312,335；5,312,335；5,383,851；和5,399,163中。

特別地，本發明提供了適合的組成物的不間斷施用。作為非限制性實例，可以藉由患者佩戴的用於計量治療劑進入患者體內的流入的小型泵系統來實現不間斷或實質上不間斷（即連續）的施用。包含本發明的抗體構建體的藥物組成物可以藉由使用所述泵系統施用。此類泵系統在本領域中通常是已知的，並且通常依賴於含有要輸注的治療劑的藥筒的定期更換。當更換這種泵系統中的藥筒時，可能導致原本不間斷地流入患者體內的治療劑的暫時中斷。在這種情況下，藥筒替換之前的施用階段和藥筒替換之後的施用階段仍將被認為在藥物手段的含義內，並且本發明的方法一起構成這種治療劑的一次「不間斷施用」。

本發明的抗體構建體的連續或不間斷施用可以藉由流體遞送裝置或小型泵系統進行靜脈內或皮下施用，該流體遞送裝置或小型泵系統包括用於將流體驅出儲器的流體驅動機構和用於致動驅動機構的致動機構。用於皮下施用的泵系統可以包括用於穿透患者皮膚並將適合的組成物遞送到患者體內的針或套管。所述泵系統可以獨立於靜脈、動脈或血管而直接固定或連接到患者皮膚，從而允許泵系統與患者皮膚直接接觸。泵系統可以連接到患者皮膚24小時至數天。泵系統可能尺寸較小，具有小容積的儲器。作為非限制性實例，待施用的適合的藥物組成物的儲器容積可以為0.1至50 ml。

連續施用也可以藉由佩戴在皮膚上的貼片經皮施用，並且以一定間隔進行更換。熟悉該項技術者知道適用於該目的的用於藥物遞送的貼片系統。值得注意的是，經皮施用尤其適合於不間斷施用，因為第一用盡的貼片的更換可以有利地與在將新的第二貼片放置在例如緊鄰第一用盡的貼片的皮膚表面上的同時並在即將移除第一用盡的貼片之前來完成。不會出現流動中斷或電池故障的問題。

如果已將藥物組成物凍乾，則在施用之前首先將凍乾物質在適當液體中重構。可以將凍乾物質在例如抑菌注射用水（BWFI）、生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）或與冷凍乾燥前蛋白質所處於的相同配製物中重構。

本發明的組成物能以適合的劑量施用至受試者，該劑量可以例如藉由向非黑猩猩靈長類動物（例如獼猴）施用增加劑量的表現出本文所述的跨物種特異性的本發明的抗體構建體藉由劑量遞增研究來確定。如上所述，表現出本文所述的跨物種特異性的本發明的抗體構建體可以有利地以相同形式用於非黑猩猩靈長類動物的臨床前測試並且作為藥物用於人類中。劑量方案將由主治醫師和臨床因素決定。如在醫學領域中熟知的，任何一個患者的劑量取決於許多因素，包括患者體型、體表面積、年齡、待施用的具體化合物、性別、施用時間和途徑、一般健康狀況和同時施用的其他藥物。

術語「有效劑量（effective dose或effective dosage）」定義為足以實現或至少部分實現所希望效應的量。術語「治療有效劑量」定義為足以治癒或至少部分阻止已罹患疾病的患者的疾病及其併發症的量。對此用途有效的量或劑量將取決於要治療的病狀（適應症）、遞送的抗體構建體、治療背景和目標、疾病的嚴重程度、先前療法、患者的臨床病史和對治療劑的應答、施用途徑、患者的體型（體重、體表或器官大小）和/或病狀（年齡和一般健康狀況）以及患者自體免疫系統的一般狀態。可以根據主治醫生的判斷調整適當的劑量，以使得它可以一次施用至患者或經一系列施用而施用至患者，並且以便獲得最佳治療效應。

根據上文提及的因素，典型的劑量範圍可以為約0.1 µg/kg至高達約30 mg/kg或更多。在具體的實施方式中，劑量範圍可以為1.0 µg/kg至約20 mg/kg、視需要10 µg/kg至約10 mg/kg或100 µg/kg至約5 mg/kg。

本發明的抗體構建體的治療有效量較佳的是導致疾病症狀嚴重程度降低、無疾病症狀期的頻率或持續時間增加或預防由於疾病折磨而產生的損害或殘疾。為了治療表現靶細胞抗原的腫瘤，本發明的抗體構建體的治療有效量，例如抗靶細胞抗原/抗CD3抗體構建體，相對於未治療的患者較佳的是抑制細胞生長或腫瘤生長至少約20%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、或至少約90%。可以在預測功效的動物模型中評價化合物抑制腫瘤生長的能力。

藥物組成物可以作為單獨的治療劑或與另外的療法（如視需要的抗癌療法，例如其他蛋白質和非蛋白質藥物）組合施用。該等藥物可以與包含如本文定義的本發明的抗體構建體的組成物同時施用，或者在施用所述抗體構建體之前或之後以時間限定間隔和劑量分開施用。

如本文使用的，術語「有效且無毒的劑量」係指本發明抗體構建體的可耐受劑量，該可耐受劑量足夠高以引起病理性細胞消耗、腫瘤消除、腫瘤縮小或疾病穩定，而沒有或基本上沒有主要毒性效應。這種有效且無毒的劑量可以例如藉由本領域中描述的劑量遞增研究來確定，並且應低於誘導嚴重不良副作用事件的劑量（劑量限制毒性，DLT）。

如本文使用的，術語「毒性」係指在不良事件或嚴重不良事件中表現的藥物的毒性效應。該等副作用事件可能是指施用後缺乏系統性藥物耐受性和/或缺乏局部耐受性。毒性還可能包括由藥物引起的致畸或致癌效應。

如本文使用的，術語「安全性」、「體內安全性」或「耐受性」定義了藥物的施用而在施用後未立即誘導嚴重不良事件（局部耐受性）以及在藥物的較長施用時段期間未誘導嚴重不良事件。例如，可以在治療和隨訪期期間以例如有規律的間隔評價「安全性」、「體內安全性」或「耐受性」。測量包括臨床評價，例如器官表現，以及實驗室異常的篩選。可以進行臨床評價，並且根據NCI-CTC和/或MedDRA標準記錄/編碼與正常發現的偏差。器官表現可以包括如過敏/免疫學、血液/骨髓、心律失常、凝血等的標準，如例如不良事件的通用術語標準v3.0（CTCAE）中所述的。可以測試的實驗室參數包括例如血液學、臨床化學、凝血曲線和尿液分析以及其他體液（如血清、血漿、淋巴或脊髓液、液體等）的檢查。因此安全性可以藉由例如身體檢查、成像技術（即超音波波、x射線、CT掃描、磁共振成像（MRI）、其他具有技術裝置的措施（即心電圖術））、生命體征、藉由測量實驗室參數和記錄不良事件來評估。例如，根據本發明的用途和方法中非黑猩猩靈長類動物中的不良事件可以藉由組織病理學和/或組織化學方法進行檢查。

上述術語也在以下中提及：例如Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6 [生物技術衍生藥物的臨床前安全性評價S6]；ICH Harmonised Tripartite Guideline [ICH三方協調指南]；ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997 [1997年7月16日的ICH指導委員會會議]。

最後，本發明提供了套組（kit），該套組包含本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體、本發明的藥物組成物、本發明的多核苷酸、本發明的載體和/或本發明的宿主細胞。

在本發明的上下文中，術語「套組」意指兩種或更多種組分（其中一種對應於本發明的抗體構建體、藥物組成物、載體或宿主細胞）一起包裝在容器、接受器或其他中。因此，套組可以被描述為足以實現某一目標的一組產品和/或器具，其可以作為單一單元銷售。

套組可以包括一個或多個具有任何適當形狀、大小和材料（較佳的是防水的，例如塑膠或玻璃）的接受器（如小瓶、安瓿、容器、注射器、小瓶、袋），該一個或多個接收器含有適於施用的劑量的本發明的抗體構建體或藥物組成物（參見上文）。套組可以另外含有使用說明（例如呈小冊子或說明手冊的形式）、用於施用本發明的抗體構建體的手段（如注射器、泵、輸注器等）、用於重構本發明的抗體構建體的手段和/或用於稀釋本發明的抗體構建體的手段。

本發明還提供了用於單劑量施用單元的套組。本發明的套組還可以含有包含乾燥/凍乾的抗體構建體的第一接受器和包含水性配製物的第二接受器。在本發明的某些實施方式中，提供了含有單室和多室預填充注射器（例如液體注射器和凍乾注射器）的套組。

應指出的是，除非上下文另有明確指明，否則如本文所用，單數形式「一種（a）」、「一種（an）」和「該（the）」包括複數個指示物。因此，例如，對「一種試劑」的提及包括此類不同試劑中的一種或多種，並且對「所述方法」的提及包括提及熟悉該項技術者已知的可以修改或取代本文所述的方法的等效步驟和方法。

除非另外指示，否則在一系列元素前面的術語「至少」應被理解為指該系列中的每一個元素。熟悉該項技術者僅使用常規實驗就將認識到或能夠確定本文所述的本發明的具體實施方式的許多等效物。此類等效物旨在涵蓋在本發明中。

術語「和/或」在本文使用時包括「和」、「或」和「由所述術語連接的要素的全部或任何其他組合」的含義。

如本文使用的，術語「約」或「大約」意指在給定值或範圍的20%內、較佳的是在10%內、並且更較佳的是在5%內。然而，它也包括明確數字，例如約20包括20。

術語「小於」或「大於」包括明確數字。例如，小於20意指小於或等於。類似地，多於或大於分別意指多於或等於/或大於或等於。

貫穿本說明書及其後的申請專利範圍，除非上下文另有要求，否則詞語「包含（comprise）」以及變型如「包含（comprises）」或「包含（comprising）」應當被理解成隱含包括該整數或步驟或者整數或步驟的組，但不排除任何其他整數或步驟或者整數或步驟的組。當在本文中使用時，術語「包含」可以用術語「含有」或「包括」來取代，或者有時在本文中使用時用術語「具有」取代。

當在本文中使用時，「由……組成」時，排除了在申請專利範圍要素中未指定的任何要素、步驟或成分。當在本文中使用時，「基本上由……組成」並不排除不實質性地影響申請專利範圍的基本和新穎特徵的材料或步驟。

在本文的每個例子中，術語「包含/包括」、「基本上由……組成」和「由……組成」中的任何一個可以用其他兩個術語中的任一個替代。

應理解，本發明不限於本文所述的特定方法、方案、材料、試劑和物質等，並且因此可以變化。本文使用的術語僅用於描述特定實施方式的目的，而不打算限制僅由申請專利範圍限定的本發明的範圍。

本說明書全文中引用的所有出版物和專利（包括所有專利、專利申請、科學出版物、製造商的說明書、說明書等），無論是上文還是下文，均藉由引用整體併入文中。本文沒有任何內容應解釋為承認本發明無權由於先前發明而早於該等揭露內容。藉由引用併入的材料在一定程度上與本說明書發生衝突或不一致時，本說明書將替代任何此類材料。

將從以下實例中獲得對本發明及其優點的更好理解，該等實例僅用於說明目的。該等實例並不打算以任何方式限制本發明的範圍。

實例 1 ：確定 CD33 x CD3 BiTE® 抗體構建體的最佳重折疊條件

材料和方法：將CD33 x CD3 x scFc雙特異性抗體構建體（ScFc-BiTE®；SEQ ID NO: 41）用於本研究。根據圖1的步驟純化ScFc-BiTE®材料。將蛋白A過濾的病毒失活池（FVIP）和CEX HMW池樣本用於氧化還原重折疊。

將尺寸排阻層析法（SEC）用於測量ScFc-BiTE®的單體和聚集物物質的百分比，包括以下條件：柱：G3000SWxl TOSOH Bioscience，7.8mm ID x 30cm柱（目錄號08541），在室溫下或25°C。流動相：100 mM磷酸鈉，250 mM NaCl，pH 6.8。流速：0.5ml/min。執行時間：35 min。除非另有說明，否則重折疊程序使用Thermo Scientific Slide-A-Lyzer™透析盒（20k MWCO）在室溫下藉由逐步滲析進行。用重折疊緩衝劑處理後，將樣本透析回100 mM NaOAc，pH 5.1，在4°C下過夜。

結果：施用一系列pH和胍濃度以增加ScFc-BiTE®CEX峰後池中單體物質的濃度，該池僅含有25%-27%單體物質。當用對照緩衝劑（100 mM NaOAc，pH 5.1）將ScFc-BiTE®CEX峰後樣本池進行緩衝劑交換時，單體的百分比保持在約25%-27%。然而，當重折疊緩衝劑中包含的胍濃度高於1 M且高達2 M時，ScFc-BiTE®單體的百分比以濃度依賴的方式增加，直至60%單體。重折疊條件的詳細列表和所得單體的百分比列於表4中，胍濃度對重折疊的作用示於圖2的SEC層析圖中。為了評估pH對重折疊的作用，使用乙酸或Tris鹼將含有2.0M和2.5M胍的重折疊緩衝劑調節至pH 4.2、5.1或8.0。在pH 5.1與pH 8.0之間未觀察到顯著差異。然而，當在pH 4.2下孵育時，CEX峰後ScFc-BiTE®樣本聚集（表4）。

為了進一步增加單體的百分比，將氧化還原試劑與胍一起添加到重折疊緩衝劑中。當將半胱胺酸和胱胺酸以6：1、14：1和33：1(Cys：Cyss)莫耳比添加到1.2 M胍重折疊緩衝劑中時，單體的百分比從39%（不含氧化還原劑）分別增加到52%、61%和69%（表4）。因此，用Cys/Cyss進行重折疊處理值得進一步研究。

評估了氧化試劑，例如銅(II)硫酸鹽和去氫抗壞血酸鹽。發現0.5 mM硫酸銅(II)與1.2 M或2.0 M胍一起具有最大的重折疊作用，將單體百分比分別增加至90%和88%（參見表4，圖3）。用0.5 mM去氫抗壞血酸鹽與1.2 M和2.0 M胍處理的單體百分比也分別增加至66%和73%。

為證明上文對scFc-BiTE®CEX峰後池報導的重折疊程序也適用於更早的下游純化，例如蛋白A池，用2.0 M胍對含有大約73%單體和27%聚集物的蛋白A FVIP樣本進行重折疊。在pH 5.1和pH 8.0下，單體的百分比分別增加到94%和89%（表5和圖4）。 [表4].顯示了下游CEX HMW（峰後）池的重折疊條件和結果，其在重折疊處理之前僅含有25%單體和75%高分子量物質，並且在用根據本發明的示例性CD33xCD3雙特異性抗體構建體重折疊處理之後高達89.6%。

重折疊條件
GuHCl, [M]	氧化還原劑	pH	溫度[°C]	孵育時間，Hr	單體峰[%]
N	N	5.1	25	4	26.6
N	N	8.0	25	4	25.4
1.0	N	8.0	25	4	26.3
1.2	N	8.0	25	4	39.6
1.2	Cys: Cyss (6:1)	8.0	25	4	52.9
1.2	Cys: Cyss (17:1)	8.0	25	4	61.0
1.2	Cys: Cyss (33:1)	8.0	25	4	69.0
1.2	硫酸銅(II)（0.5 mM）	8.0	25	4	89.6
1.2	(L)-去氫抗壞血酸（0.5 mM）	8.0	25	4	65.7
2.0	N	4.2	25	4	聚集
2.0	N	5.1	25	4	53.9
2.0	N	8.0	25	4	60.3
2.0	硫酸銅(II)（0.5 mM）	8.0	25	4	87.9
2.0	(L)-去氫抗壞血酸（0.5 mM）	8.0	25	4	72.8
2.5	N	4.2	25	4	聚集
2.5	N	5.1	25	4	43.2
2.5	N	8.0	25	4	52.1

[表5]：ScFc-BiTE®蛋白A FVIP池重折疊的條件和結果。

實驗條件
GuHCl, M	Cys/Cyss比率	pH	溫度，°C	孵育時間，Hr	單體峰%
無	無	5.1	RT	4	73.3
2	無	5.1	RT	4	93.9
2	無	8	RT	4	88.8

實例 2 ：確定 DLL3 x CD3 抗體構建體在柱上的最佳重折疊條件

有效地檢查了DLL3 x CD3 x scFc（SEQ ID NO: 104）雙特異性抗體構建體的柱上氧化還原重折疊。為此，使用具有等度洗脫的ProA柱。負載為10 g/Lr（按照DLL3 x CD3雙特異性抗體構建體方法）HCCF。洗滌緩衝劑條件為：25 mM Tris + 1.2 M胍，2 M胍，1.2 M胍中的硫酸銅(II)*；在25 mM Tris + Arg條件下進行對照*，所有均在pH 8.0下。用2倍柱體積的緩衝劑洗滌；保持2小時；分別收集洗滌池。pH 3.7下洗脫蛋白（按照DLL3xCD3 scFc-BiTE®方法）；樣本。病毒失活：滴定至pH 3.6，保持60分鐘，用2M Tris鹼中和至pH 5.1；樣本。池：洗滌池；pH 3.9下洗脫池；中和的病毒失活池。使用的分析工具為：SEC、CHOP、浸出ProA。

實例 3 ：確定 CD19 和 CLDN 雙特異性抗體構建體的成功重折疊條件 在pH 8.0下，在室溫下，用2.0 M胍和0.5 mM銅(II)將CD19 x CD3 x scFc（SEQ ID NO: 114）和CLND x CD3 x scFc抗體構建體CEX峰後池重折疊4小時，之後將緩衝劑交換回pH 5.1下的乙酸鹽緩衝劑。對於CD19 x CD3 x scFc抗體構建體而言，單體的百分比從24.0%增加至48.7%（即增加了約100%）（參見圖5和表6），並且對於CLND x CD3 x scFc抗體構建體而言，從23.4%增加至38.5%（即增加了約64%）（參見圖6和表7）。對於一些情況，本發明的施加方法顯著減少了聚集物形成並且增加了單體百分比。還觀察到改善的單體結構均質性（減少的單體同種型）。 [表6]： CD19 x CD3 x scFc 分子實驗條件

	實驗條件
CD19 x CD3 x scFC	GuHCl	CuSO₄	pH	溫度，°C	孵育時間，Hr	單體峰%
CEX峰後對照	無	無	5.1	RT	4	24.0 + 11.8同種型
CEX峰後重折疊的	2.0 M	0.5 mM	8.0	RT	4	48.7

[表7]： CLDN x CD3 x scFc 分子實驗條件

	實驗條件
CLDN x CD3 x scFc	GuHCl	CuSO₄	pH	溫度，°C	孵育時間，Hr	單體峰%
CEX峰後對照	無	無	5.1	RT	4	23.4 + 14.1同種型
CEX峰後重折疊的	2.0 M	0.5 mM	8.0	RT	4	38.5

此外，還在pH 7.0下進行重折疊實驗。在pH 7.0下，用2.0 M胍和0.5 mM銅(II)孵育時，單體同種型從10.2%減少至0%（參見表8）。 [表8]： CD19 x CD3 x scFc 分子實驗條件

	實驗條件
CD19 x CD3 x scFc	GuHCl	CuSO₄	pH	溫度，°C	孵育時間，Hr	單體峰%
CEX峰後對照	無	無	5.1	RT	4	25.4 + 10.2同種型
CEX峰後重折疊的	2.0 M	0.5 mM	7.0	RT	4	40.2

[表9]：序列表

1.	CD19 VL CDR1	人工的	aa	KASQSVDYDGDSYLN
2.	CD19 VL CDR2	人工的	aa	DASNLVS
3.	CD19 VL CDR3	人工的	aa	QQSTEDPWT
4.	CD19 VH CDR1	人工的	aa	SYWMN
5.	CD19 VH CDR2	人工的	aa	QIWPGDGDTNYNGKFKG
6.	CD19 VH CDR3	人工的	aa	RETTTVGRYYYAMDY
7.	CD19 VL	人工的	aa	DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK
8.	CD19 VH	人工的	aa	QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSS
9.	CD3 VH CDR1	人工的	aa	RYTMH
10.	CD3 VH CDR2	人工的	aa	YINPSRGYTNYNQKFKD
11.	CD3 VH CDR3	人工的	aa	YYDDHYCLDY
12.	CD3 VL CDR1	人工的	aa	RASSSVSYMN
13.	CD3 VL CDR2	人工的	aa	DTSKVAS
14.	CD3 VL CDR3	人工的	aa	QQWSSNPLT
15.	CD3 VH	人工的	aa	DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGL EWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS

16.	CD3 VL	人工的	aa	VDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
17.	CD19xCD3 scFv包含連接子和his-標籤	人工的	aa	DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH

18.	I2C的CDR-L1	人工的	aa	GSSTGAVTSGNYPN
19.	I2C的CDR-L2	人工的	aa	GTKFLAP
20.	I2C的CDR-L3	人工的	aa	VLWYSNRWV
21.	I2C的CDR-H1	人工的	aa	KYAMN
22.	I2C的CDR-H2	人工的	aa	RIRSKYNNYATYYADSVKD
23.	I2C的CDR-H3	人工的	aa	HGNFGNSYISYWAY
24.	I2C的VH	人工的	aa	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS
25.	I2C的VL	人工的	aa	QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
26.	I2C的VH-VL	人工的	aa	EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL

27.	E11的CD33 ccVH	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQCLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSS
28.	E11的CD33 VH	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSS
29.	E11的CD33 HCDR1	人工的	aa	NYGMN
30.	E11的CD33 HCDR2	人工的	aa	WINTYTGEPTYADKFQG
31.	E11的CD33 HCDR3	人工的	aa	WSWSDGYYVYFDY
32.	E11的CD33 CC VL	人工的	aa	DIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGCGTRLEIK
33.	E11的CD33 VL	人工的	aa	DIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIK
34.	E11的CD33 LCDR1	人工的	aa	KSSQSVLDSSTNKNSLA
35.	E11的CD33 LCDR2	人工的	aa	WASTRES
36.	E11的CD33 LCDR3	人工的	aa	QQSAHFPIT
37.	E11的CD33 HL CC	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQCLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGCGTRLEIK
38.	E11的CD33 HL	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIK
39.	CD33 CC E11 HL x I2C HL雙特異性分子	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQCLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGCGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
40.	CD33 E11 HL x I2C HL	人工的	aa	MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGQGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLHHHHHH

41.

CD33 CC x I2C-scFc雙特異性HLE分子

人工的

aa

QVQLVQSGAEVKKPGESVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQCLEWMGWINTYTGEPTYADKFQGRVTMTTDTSTSTAYMEIRNLGGDDTAVYYCARWSWSDGYYVYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLTVSLGERTTINCKSSQSVLDSSTNKNSLAWYQQKPGQPPKLLLSWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTIDSPQPEDSATYYCQQSAHFPITFGCGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

42.	EGFRvIIIxCD3-scFc VH CDR1	人工的	aa	NYGMH
43.	EGFRvIIIxCD3-scFc VH CDR2	人工的	aa	VIWYDGSDKYYADSVRG
44.	EGFRvIIIxCD3-scFc VH CDR3	人工的	aa	DGYDILTGNPRDFDY
45.	EGFRvIIIxCD3-scFc VL CDR1	人工的	aa	RSSQSLVHSDGNTYLS
46.	EGFRvIIIxCD3-scFc VL CDR2	人工的	aa	RISRRFS
47.	EGFRvIIIxCD3-scFc VL CDR3	人工的	aa	MQSTHVPRT
48.	EGFRvIII_CCxCD3-scFc VH	人工的	aa	QVQLVESGGGVVQSGRSLRLSCAASGFTFRNYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDGSDKYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGYDILTGNPRDFDYWGQGTLVTVSS
49.	EGFRvIII_CCxCD3-scFc VL	人工的	aa	DTVMTQTPLSSHVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLSWLQQRPGQPPRLLIYRISRRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLEISRVEAEDVGVYYCMQSTHVPRTFGCGTKVEIK
50.	EGFRvIII_CCxCD3-scFc scFv	人工的	aa	QVQLVESGGGVVQSGRSLRLSCAASGFTFRNYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDGSDKYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGYDILTGNPRDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMTQTPLSSHVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLSWLQQRPGQPPRLLIYRISRRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLEISRVEAEDVGVYYCMQSTHVPRTFGCGTKVEIK
51.	EGFRvIII_CCxCD3-scFc雙特異性分子	人工的	aa	QVQLVESGGGVVQSGRSLRLSCAASGFTFRNYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDGSDKYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGYDILTGNPRDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMTQTPLSSHVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLSWLQQRPGQPPRLLIYRISRRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLEISRVEAEDVGVYYCMQSTHVPRTFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
52.	EGFRvIII_CCxCD3-scFc雙特異性HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGVVQSGRSLRLSCAASGFTFRNYGMHWVRQAPGKCLEWVAVIWYDGSDKYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGYDILTGNPRDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVMTQTPLSSHVTLGQPASISCRSSQSLVHSDGNTYLSWLQQRPGQPPRLLIYRISRRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLEISRVEAEDVGVYYCMQSTHVPRTFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

53.	MSLN_5 VH CDR1	人工的	aa	DYYMT
54.	MSLN_5 VH CDR2	人工的	aa	YISSSGSTIYYADSVKG
55.	MSLN_5 VH CDR3	人工的	aa	DRNSHFDY
56.	MSLN_5 VL CDR1	人工的	aa	RASQGINTWLA
57.	MSLN_5 VL CDR2	人工的	aa	GASGLQS
58.	MSLN_5 VL CDR3	人工的	aa	QQAKSFPRT
59.	MSLN _5 VH	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSS
60.	MSLN_5 VL	人工的	aa	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPRTFGQGTKVEIK
61.	MSLN_5 scFv	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPRTFGQGTKVEIK
62.	MSLN_5xI2C0雙特異性分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPRTFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL

63.	MSLN_5xCD3-scFc雙特異性HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWLSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRNSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPRTFGQGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
64.	MSLN_5_CCxCD3-scFc雙特異性HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDHYMSWIRQAPGKCLEWFSYISSSGGIIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGSHFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLISAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQAKSFPRTFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
65.	CDH19 65254.007的CDR-H1	人工的	aa	SYGMH
66.	CDH19 65254.007的CDR-H2	人工的	aa	FIWYEGSNKYYAESVKD
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68.	CDH19 65254.007的CDR-L1	人工的	aa	SGDRLGEKYTS
69.	CDH19 65254.007的CDR-L2	人工的	aa	QDTKRPS
70.	CDH19 65254.007的CDR-L3	人工的	aa	QAWESSTVV
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72.	CDH19 65254.007的VL	人工的	aa	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDRLGEKYTSWYQQRPGQSPLLVIYQDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWESSTVVFGGGTKLTVLS
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74.	CDH19 65254.007 x I2C	人工的	aa	QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIWYEGSNKYYAESVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAGIIGTIGYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDRLGEKYTSWYQQRPGQSPLLVIYQDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWESSTVVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLHHHHHH

75.	CDH19 65254.007 x I2C –scFc雙特異性HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIWYEGSNKYYAESVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAGIIGTIGYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDRLGEKYTSWYQQRPGQSPLLVIYQDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWESSTVVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
76.	CDH19 65254.007 x I2C –scFc_delGK雙特異性HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIWYEGSNKYYAESVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAGIIGTIGYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDRLGEKYTSWYQQRPGQSPLLVIYQDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWESSTVVFGGGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
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78.	CDH19 65254.007_CC x I2C –scFc VL	人工的	aa	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDRLGEKYTSWYQQRPGQSPLLVIYQDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWESSTVVFGCGTKLTVL
79.	CDH19 65254.007_CC x I2C –scFc scFv	人工的	aa	QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAFIWYEGSNKYYAESVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAGIIGTIGYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDRLGEKYTSWYQQRPGQSPLLVIYQDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWESSTVVFGCGTKLTVL
80.	CDH19 65254.007_CC x I2C –scFc雙特異性分子	人工的	aa	QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAFIWYEGSNKYYAESVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAGIIGTIGYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDRLGEKYTSWYQQRPGQSPLLVIYQDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWESSTVVFGCGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
81.	CDH19 65254.007_CC x I2C –scFc雙特異性HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAFIWYEGSNKYYAESVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAGIIGTIGYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDRLGEKYTSWYQQRPGQSPLLVIYQDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWESSTVVFGCGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
82.	CDH19 65254.007_CC x I2C –scFc_delGK雙特異性HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAFIWYEGSNKYYAESVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRAGIIGTIGYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDRLGEKYTSWYQQRPGQSPLLVIYQDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWESSTVVFGCGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

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85.	FLT3_7 A8xCD3-scFc VH CDR3	人工的	aa	IVGYGSGWYGFFDY
86.	FLT3_7 A8xCD3-scFc VL CDR1	人工的	aa	RASQGIRNDLG
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89.	FLT3_7 A8xCD3-scFc VH	人工的	aa	QVTLKESGPTLVKPTETLTLTCTLSGFSLNNARMGVSWIRQPPGKCLEWLAHIFSNDEKSYSTSLKNRLTISKDSSKTQVVLTMTNVDPVDTATYYCARIVGYGSGWYGFFDYWGQGTLVTVSS
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91.	FLT3_7 A8xCD3- scFv	人工的	aa	QVTLKESGPTLVKPTETLTLTCTLSGFSLNNARMGVSWIRQPPGKCLEWLAHIFSNDEKSYSTSLKNRLTISKDSSKTQVVLTMTNVDPVDTATYYCARIVGYGSGWYGFFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGCGTKVEIK
92.	FLT3_7 A8xCD3雙特異性分子	人工的	aa	QVTLKESGPTLVKPTETLTLTCTLSGFSLNNARMGVSWIRQPPGKCLEWLAHIFSNDEKSYSTSLKNRLTISKDSSKTQVVLTMTNVDPVDTATYYCARIVGYGSGWYGFFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
93.	FLT3_7 A8xCD3-scFc雙特異性HLE分子	人工的	aa	QVTLKESGPTLVKPTETLTLTCTLSGFSLNNARMGVSWIRQPPGKCLEWLAHIFSNDEKSYSTSLKNRLTISKDSSKTQVVLTMTNVDPVDTATYYCARIVGYGSGWYGFFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
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103.	DLL3_1_CCxCD3_delGK雙特異性分子	人工的	aa	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKCLEWIGYVYYSGTTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASIAVTGFYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERVTLSCRASQRVNNNYLAWYQQRPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDRSPLTFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
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109.	VL CDR1 CD19 97-G1RE-C2	人工的	aa	RSSQSLLHKNAFNYLD
110.	VL CDR2 CD19 97-G1RE-C2	人工的	aa	LGSNRAS
111.	VL CDR3 CD19 97-G1RE-C2	人工的	aa	MQALQTPFT
112.	VL CD19 97-G1RE-C2 CC	人工的	aa	DIVMTQSPLSLPVISGEPASISCRSSQSLLHKNAFNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPFTFGCGTKVDIK
113.	CD19 97-G1RE-C2 CC x I2C0	人工的	aa	MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIVMTQSPLSLPVISGEPASISCRSSQSLLHKNAFNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPFTFGCGTKVDIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVISYEGSNKYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARDRGTIFGNYGLEVWGQGTTVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
114.	CD19 97-G1RE-C2 CC x I2C0-scFc	人工的	aa	MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIVMTQSPLSLPVISGEPASISCRSSQSLLHKNAFNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPFTFGCGTKVDIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVISYEGSNKYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARDRGTIFGNYGLEVWGQGTTVTVSSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
115.	VH CDR1 CDH3 G8A 6-B12	人工的	aa	SYPIN
116.	VH CDR2 CDH3 G8A 6-B12	人工的	aa	VIWTGGGTNYASSVKG
117.	VH CDR3 CDH3 G8A 6-B12	人工的	aa	SRGVYDFDGRGAMDY
118.	VL CDR1 CDH3 G8A 6-B12	人工的	aa	KSSQSLLYSSNQKNYFA
119.	VL CDR2 CDH3 G8A 6-B12	人工的	aa	WASTRES
120.	VL CDR3 CDH3 G8A 6-B12	人工的	aa	QQYYSYPYT
121.	VH CDH3 G8A 6-B12	人工的	aa	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYPINWVRQAPGKGLEWVGVIWTGGGTNYASSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSRGVYDFDGRGAMDYWGQGTLVTVSS
122.	VL CDH3 G8A 6-B12	人工的	aa	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYFAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIK
123.	CDH3 G8A 6-B12 scFv	人工的	aa	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYPINWVRQAPGKGLEWVGVIWTGGGTNYASSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSRGVYDFDGRGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYFAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIK
124.	CDH3 G8A 6-B12 x I2C0雙特異性分子	人工的	aa	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYPINWVRQAPGKGLEWVGVIWTGGGTNYASSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSRGVYDFDGRGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYFAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
125.	CDH3 G8A 6-B12 x I2C0雙特異性分子HLE	人工的	aa	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYPINWVRQAPGKGLEWVGVIWTGGGTNYASSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSRGVYDFDGRGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYFAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
126.	BCMA A7 27-C4-G7 CDR1 VH	人工的	aa	NHIIH
127.	BCMA A7 27-C4-G7 CDR2 VH	人工的	aa	YINPYPGYHAYNEKFQG
128.	BCMA A7 27-C4-G7 CDR3 VH	人工的	aa	DGYYRDTDVLDY
129.	BCMA A7 27-C4-G7 CDR1 VL	人工的	aa	QASQDISNYLN
130.	BCMA A7 27-C4-G7 CDR2 VL	人工的	aa	YTSRLHT
131.	BCMA A7 27-C4-G7 CDR3 VL	人工的	aa	QQGNTLPWT
132.	BCMA A7 27-C4-G7 CC (44/100) VH	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNHIIHWVRQAPGQCLEWMGYINPYPGYHAYNEKFQGRATMTSDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYYRDTDVLDYWGQGTLVTVSS
133.	BCMA A7 27-C4-G7 CC (44/100) VL	人工的	aa	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEPEDIATYYCQQGNTLPWTFGCGTKLEIK
134.	BCMA A7 27-C4-G7 CC (44/100) scFv	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNHIIHWVRQAPGQCLEWMGYINPYPGYHAYNEKFQGRATMTSDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYYRDTDVLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEPEDIATYYCQQGNTLPWTFGCGTKLEIK
135.	BCMA A7 27-C4-G7 CC (44/100) x I2C0雙特異性分子	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNHIIHWVRQAPGQCLEWMGYINPYPGYHAYNEKFQGRATMTSDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYYRDTDVLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEPEDIATYYCQQGNTLPWTFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
136.	BCMA A7 27-C4-G7 CC (44/100) x I2C0-scFc雙特異性分子HLE	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNHIIHWVRQAPGQCLEWMGYINPYPGYHAYNEKFQGRATMTSDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYYRDTDVLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEPEDIATYYCQQGNTLPWTFGCGTKVEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
137.	PM 76-B10.17 CC VH CDR1	人工的	aa	DYYMY
138.	PM 76-B10.17 CC VH CDR2	人工的	aa	IISDAGYYTYYSDIIKG
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140.	PM 76-B10.17 CC VL CDR1	人工的	aa	KASQNVDANVA
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143.	PM 76-B10.17 CC VH	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDAGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSS
144.	PM 76-B10.17 CC VL	人工的	aa	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDANVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIK
145.	PM 76-B10.17 CC scFv	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDAGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDANVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIK
146.	PM 76-B10.17 CC x I2C0雙特異性分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDAGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDANVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
147.	PM 76-B10.17 CC x I2C0-scFc雙特異性 HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDAGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDANVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
148.	PM 76-B10.17 CC x I2C0-scFc_delGK雙特異性 HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDAGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDANVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
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150.	PM 76-B10.17 CC x I2C0 CC (103/43)-scFc雙特異性 HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDAGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDANVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYCGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQCPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
151.	PM 76-B10.17 CC x I2C0 CC (103/43)-scFc_delGK雙特異性 HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDAGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDANVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYCGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQCPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
152.	PM 76-B10.11 CC VH CDR1	人工的	aa	DYYMY
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160.	PM 76-B10.11 CC scFv	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGGGTKLEIK
161.	PM 76-B10.11 CC x I2C0雙特異性分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGGGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
162.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc雙特異性 HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGGGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
163.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc_delGK雙特異性 HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGGGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
164.	PM 76-B10.11 CC x I2C0 CC (103/43)-scFc雙特異性分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGGGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYCGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQCPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
165.	PM 76-B10.11 CC x I2C0 CC (103/43)-scFc雙特異性 HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGGGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYCGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQCPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
166.	PM 76-B10.11 CC x I2C0 CC (103/43)-scFc_delGK雙特異性 HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGGGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYCGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQCPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
167.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VH CDR1	人工的	aa	DYYMY
168.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VH CDR2	人工的	aa	IISDGGYYTYYSDIIKG
169.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VH CDR3	人工的	aa	GFPLLRHGAMDY
170.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VL CDR1	人工的	aa	KASQNVDTNVA
171.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VL CDR2	人工的	aa	SASYVYW
172.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VL CDR3	人工的	aa	QQYDQQLIT
173.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VH	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSS
174.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VL	人工的	aa	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIK
175.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc scFv	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIK
176.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc雙特異性分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
177.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc雙特異性 HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
178.	PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc_delGK雙特異性 HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
179.	PM 76-B10.11 CC x I2C0 CC (103/43)-scFc雙特異性分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYCGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQCPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
180.	PM 76-B10.11 CC x I2C0 CC (103/43)-scFc雙特異性 HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYCGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQCPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
181.	PM 76-B10.11 CC x I2C0 CC (103/43)-scFc_delGK雙特異性 HLE分子	人工的	aa	QVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSDYYMYWVRQAPGKCLEWVAIISDGGYYTYYSDIIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAVYYCARGFPLLRHGAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGQAPKSLIYSASYVYWDVPSRFSGSASGTDFTLTISSVQSEDFATYYCQQYDQQLITFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYCGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQCPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
182.	IgG1鉸鏈	人工的	aa	DKTHTCPPCP
183.	IgG2亞型鉸鏈	人工的	aa	ERKCCVECPPCP
184.	IgG3亞型鉸鏈	人工的	aa	ELKTPLDTTHTCPRCP
185.	IgG3亞型鉸鏈	人工的	aa	ELKTPLGDTTHTCPRCP
186.	IgG4亞型鉸鏈	人工的	aa	ESKYGPPCPSCP
187.	G4S連接子	人工的	aa	GGGGS
188.	(G4S)2連接子	人工的	aa	GGGGSGGGGS
189.	(G4S)3連接子	人工的	aa	GGGGSGGGGSGGGGS
190.	(G4S)4連接子	人工的	aa	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
191.	(G4S)5連接子	人工的	aa	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
192.	(G4S)6連接子	人工的	aa	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
193.	(G4S)7連接子	人工的	aa	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
194.	(G4S)8連接子	人工的	aa	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
195.	肽連接子	人工的	aa	PGGGGS
196.	肽連接子	人工的	aa	PGGDGS
197.	肽連接子	人工的	aa	SGGGGS
198.	肽連接子	人工的	aa	GGGG
199.	六組胺酸標籤	人工的	aa	HHHHHH
200.	CD3e結合物VL	人工的	aa	QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
201.	CD3e結合物VH	人工的	aa	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSS
202.	CD3e結合物scFv	人工的	aa	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNSYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
203.	MU 8-B7 CC x I2C0-scFc VH CDR1	人工的	aa	GYYWS
204.	MU 8-B7 CC x I2C0-scFc VH CDR2	人工的	aa	DIDASGSTKYNPSLKS
205.	MU 8-B7 CC x I2C0-scFc VH CDR3	人工的	aa	KKYSTVWSYFDN
206.	MU 8-B7 CC x I2C0-scFc VL CDR1	人工的	aa	SGDKLGDKYAS
207.	MU 8-B7 CC x I2C0-scFc VL CDR2	人工的	aa	QDRKRPS
208.	MU 8-B7 CC x I2C0-scFc VL CDR3	人工的	aa	QAWGSSTAV
209.	MU 8-B7 CC x I2C0-scFc VH	人工的	aa	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKCLEWIGDIDASGSTKYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYFCARKKYSTVWSYFDNWGQGTLVTVSS
210.	MU 8-B7 CC x I2C0-scFc VL	人工的	aa	SYELTQPSSVSVPPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDRKRPSGVPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWGSSTAVFGCGTKLTVL
211.	MU 8-B7 CC x I2C0-scFc scFv	人工的	aa	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKCLEWIGDIDASGSTKYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYFCARKKYSTVWSYFDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPSSVSVPPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDRKRPSGVPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWGSSTAVFGCGTKLTVL
212.	MU 8-B7 CC x I2C0-scFc雙特異性分子	人工的	aa	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKCLEWIGDIDASGSTKYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYFCARKKYSTVWSYFDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPSSVSVPPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDRKRPSGVPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWGSSTAVFGCGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
213.	MU 8-B7 CC x I2C0-scFc雙特異性HLE分子	人工的	aa	QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKCLEWIGDIDASGSTKYNPSLKSRVTISLDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYFCARKKYSTVWSYFDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPSSVSVPPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDRKRPSGVPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWGSSTAVFGCGTKLTVLSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
214.	CL-1 VH CDR1	人工的	aa	GYYMH
215.	CL-1 VH CDR2	人工的	aa	WINPNSGGTKYAQKFQG
216.	CL-1 VH CDR3	人工的	aa	DRITVAGTYYYYGMDV
217.	CL-1 VL CDR1	人工的	aa	RASQGVNNWLA
218.	CL-1 VL CDR2	人工的	aa	TASSLQS
219.	CL-1 VL CDR3	人工的	aa	QQANSFPIT
220.	CL-1 VH	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQCLEWMGWINPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRITVAGTYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
221.	CL-1 VL	人工的	aa	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGVNNWLAWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGCGTRLEIK
222.	CL-1 scFv	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQCLEWMGWINPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRITVAGTYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGVNNWLAWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGCGTRLEIK
223.	CL-1 x I2C雙特異性
224.	分子	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQCLEWMGWINPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRITVAGTYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGVNNWLAWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGCGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
225.	CL-1 x I2C-6His雙特異性分子 -his標籤	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQCLEWMGWINPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRITVAGTYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGVNNWLAWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGCGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLHHHHHH
226.	CL-1 x I2C-scFc雙特異性scFc分子	人工的	aa	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQCLEWMGWINPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRITVAGTYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGVNNWLAWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGCGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
227.	CL-2 VH CDR1	人工的	aa	GYYMH
228.	CL-2 VH CDR2	人工的	aa	WINPNSGGTKYAQKFQG
229.	CL-2 VH CDR3	人工的	aa	DRITVAGTYYYYGMDV
230.	CL-2 VL CDR1	人工的	aa	RASQGVNNWLA
231.	CL-2VL CDR2	人工的	aa	TASSLQS
232.	CL-2 VL CDR3	人工的	aa	QQANSFPIT
233.	CL-2 VH	人工的	aa	QVQMVQSGAEVKKHGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQCLEWMGWINPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRITVAGTYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
234.	CL-2 VL	人工的	aa	DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGVNNWLAWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGCGTRLEIK
235.	CL-2 scFv	人工的	aa	QVQMVQSGAEVKKHGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQCLEWMGWINPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRITVAGTYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGVNNWLAWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGCGTRLEIK
236.	CL-2 x I2C雙特異性分子	人工的	aa	QVQMVQSGAEVKKHGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQCLEWMGWINPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRITVAGTYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGVNNWLAWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGCGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL
237.	CL-2 x I2C-6His雙特異性分子 -his標籤	人工的	aa	QVQMVQSGAEVKKHGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQCLEWMGWINPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRITVAGTYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGVNNWLAWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGCGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLHHHHHH
238.	CL-2 x I2C-scFc雙特異性scFc分子	人工的	aa	QVQMVQSGAEVKKHGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQCLEWMGWINPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDRITVAGTYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGVNNWLAWYQQKPGKAPKLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGCGTRLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
239.	CD70 HCDR1	人工的	aa	TYAMS
240.	CD70 HCDR2	人工的	aa	AISGSGGRTFYAESVEG
241.	CD70 HCDR3	人工的	aa	HDYSNYPYFDY
242.	CD70 LCDR1	人工的	aa	RASQSVRSTYLA
243.	CD70 LCDR2	人工的	aa	GASSRAT
244.	CD70 LCDR3	人工的	aa	QQYGDLPFT
245.	CD70 VH	人工的	aa	EVQLLESGGGMVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGRTFYAESVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHDYSNYPYFDYWGQGTLVTVSS
246.	CD70 VL	人工的	aa	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRSTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYSCQQYGDLPFTFGCGTKLEIK
247.	CD70 VHVL	人工的	aa	EVQLLESGGGMVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGRTFYAESVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHDYSNYPYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRSTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYSCQQYGDLPFTFGCGTKLEI
248.	CD70 x I2C	人工的	aa	EVQLLESGGGMVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGRTFYAESVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHDYSNYPYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRSTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYSCQQYGDLPFTFGCGTKLEIKSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTV

無

[圖1]：圖1顯示了純化根據本發明的雙特異性抗體構建體的下游純化方法步驟的實例設置。所生產材料的名稱對應於相應的下游純化步驟後的加工液體（池），並收集其樣本進行尺寸排阻層析（SEC）分析。除了藉由SEC測定的單體百分比外，材料的其餘百分比為聚集物。低分子量（LMW）物質僅占很小的一部分。將蛋白A過濾的病毒失活池（FVIP）和陽離子交換層析（CEX）HMW池樣本用於氧化還原重折疊。

[圖2]：圖2顯示了在pH 8下在僅鈲（GuHCl）處理後，聚集的示例性CD33xCD3雙特異性抗體構建體CEX HMW（峰後）池的尺寸排阻層析圖。

[圖3]：圖3顯示了用GuHCl和銅(II)或去氫抗壞血酸處理後，聚集的示例性CD33xCD3雙特異性抗體構建體HMW（峰後）池的尺寸排阻層析圖。

[圖4]：圖4顯示了用GuHCl處理後，聚集的示例性CD33xCD3雙特異性抗體構建體蛋白A FVIP池的尺寸排阻層析圖。

[圖5]：圖5顯示了用GuHCl和銅(II)處理後，聚集的示例性CD19xCD3雙特異性抗體構建體CEX HMW（峰後）池的尺寸排阻層析圖。

[圖6]：圖6顯示了用GuHCl和銅(II)處理後，聚集的示例性CLDNxCD3雙特異性抗體構建體CEX HMW（峰後）池的尺寸排阻層析圖。

無

Claims

一種純化雙特異性抗體構建體之方法，該構建體包含至少兩個結構域： • 與靶，較佳的是腫瘤靶結合的pI為5.0至9.5的第一結構域， • 第二結構域，該第二結構域與人和獼猴CD3ε鏈的細胞外表位結合；以及 • 視需要第三結構域，該第三結構域包含兩個多肽單體，每個多肽單體包含鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域，其中所述兩個多肽單體藉由肽連接子彼此融合，其中該構建體包含至少一個開放的二硫鍵，其中一個或多個該結構域包含二硫鍵，該方法包括重折疊該構建體的步驟，其中使該構建體與重折疊緩衝劑接觸以將該構建體重折疊到其天然形式，該緩衝劑包含 (i) 濃度為至少0.1 mM的氧化還原和/或氧化劑，和 (ii) 濃度為至少1 M的離液劑，並且其中所述重折疊緩衝劑的pH對應於該第一結構域的pI值的 +/- 4.5或該整個構建體的pI值的 +/-4.0。
如請求項1之方法，其中該氧化劑選自由以下組成之群組：銅(II)、溶解氧和(L)-去氫抗壞血酸（DHA），較佳的是銅(II)。
如請求項1之方法，其中該氧化劑係硫酸銅(II)。
如請求項1之方法，其中該氧化劑以0.1至10 mM，較佳的是0.1至1 mM的濃度存在。
如請求項1之方法，其中該氧化還原劑選自由以下組成之群組：還原型麩胱甘肽/氧化型麩胱甘肽、半胱胺酸/胱胺酸、半胱胺酸/半胱胺、半胱胺酸/胱胺、二硫蘇糖醇（DTT）、β-巰基乙醇和麩胱甘肽。
如請求項1之方法，其中該氧化還原劑以0.1至10 mM，較佳的是0.1至1 mM的濃度存在。
如請求項1之方法，其中該重折疊緩衝劑包含氧化劑但不包含氧化還原劑。
如請求項1之方法，其中該離液劑選自由以下組成之群組：尿素、二甲基尿素、甲基脲、乙基脲、有機溶劑和鈲，較佳的是鈲。
如請求項1之方法，其中該離液劑以1.2至2 M的濃度存在。
如請求項1之方法，其中該pH值至少係4.9，較佳的是在pH 5.0至9.5的範圍內，更較佳的是5.0至6.0或7.0至9.0，更較佳的是約5.0或7.0至8.0。
如請求項1之方法，其中該第一結構域結合CD33、CDH19、MSLN、FLT3、BCMA、CD19、MUC17、CDH3、CLDN18.2、CD70、EGFRviii、EpCAM、DLL3和/或PSMA。
如請求項1之方法，其中在施加該重折疊緩衝劑後例如藉由尺寸排阻層析法（單體峰百分比）測定的該構建體的該單體含量為至少40%、較佳的是至少60%或至少65%、至少70%或甚至至少85%。
如請求項1之方法，其中該方法在4°C與30°C之間的溫度下進行，較佳的是室溫（25°C）。
如請求項1之方法，其中該方法的孵育時間為1至24 h，較佳的是4 h。
如請求項1之方法，其中使該構建體與該重折疊緩衝劑的接觸 (i) 在下游純化步驟中的加工流體（池）中或 (ii) 在下游純化步驟中的層析柱上進行。
如請求項1之方法，其中該構建體 (i) 在該液體池中的濃度為0.5 mg/ml至15 mg/ml，較佳的是0.7 mg/ml至12 mg/ml或 (ii) 在層析柱上的濃度為5 mg/ml至15 mg/ml，較佳的是10 mg/ml至15 mg/ml。
如請求項15之方法，其中該液體池選自由以下組成之群組：收穫的細胞培養液（HCCF）、層析洗脫液池、蛋白A、蛋白L或蛋白G親和層析洗脫液池、過濾的病毒失活池、陽離子交換層析法（CEX）單體池和CEX高分子量峰後池。
如請求項1之方法，其包括以下步驟 (a) 提供收穫的細胞培養液（HCCF），其包含哺乳動物細胞分泌的該雙特異性抗體構建體； (b) 在適合於該構建體與該分離基質締合的條件下，使該HCCF與第一分離基質接觸以進行層析純化，其中所述分離基質係選自由以下組成之群組的親和樹脂：蛋白A、蛋白G、蛋白L和合成模擬親和樹脂； (c) 洗滌該第一分離基質； (d) 從該第一分離基質洗脫該構建體； (e) 使包含該構建體的洗脫液中的病毒失活； (f) 在適合於該構建體與該分離基質締合的條件下，使包含該構建體的洗脫液與第二分離基質接觸以進行層析精製，其中所述分離基質為陽離子交換層析基質； (g) 洗滌該第二分離基質； (h) 從該第二分離基質洗脫該構建體，其中將該構建體分成兩種級分：(i) 包含構建體單體的單體池和 (ii) 包含構建體聚集物的高分子量池， (i) 藉由過濾從包含級分 (i) 的該洗脫液中分離病毒；以及 (j) 視需要將洗脫液進行進一步的超濾和/或滲濾步驟，其中將 (1) 在收穫前的細胞培養基中或在步驟 (a) 的HCCF中，和/或 (2) 在步驟 (b) 或 (f) 中至少一個的該分離基質上（在柱上），和/或 (3) 在至少一個步驟 (d)、(e) 或 (h) 中的加工流體（池）中，的該構建體與該重折疊緩衝劑接觸以將該構建體重折疊到其天然形式。
如請求項1之方法，其中該構建體的第一結合結構域包含含有選自由以下組成之群組的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH區和含有選自由以下組成之群組的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL區： (a) 如SEQ ID NO: 4中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 5中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 6中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 1中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 2中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 3中所描繪的CDR-L3， (b) 如SEQ ID NO: 29中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 30中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 31中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 34中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 35中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 36中所描繪的CDR-L3， (c) 如SEQ ID NO: 42中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 43中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 44中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 45中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 46中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 47中所描繪的CDR-L3， (d) 如SEQ ID NO: 53中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 54中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 55中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 56中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 57中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 58中所描繪的CDR-L3， (e) 如SEQ ID NO: 65中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 66中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 67中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 68中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 69中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 70中所描繪的CDR-L3； (f) 如SEQ ID NO: 83中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 84中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 85中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 86中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 87中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 88中所描繪的CDR-L3， (g) 如SEQ ID NO: 94中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 95中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 96中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 97中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 98中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 99中所描繪的CDR-L3， (h) 如SEQ ID NO: 105中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 106中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 107中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 109中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 110中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 111中所描繪的CDR-L3， (i) 如SEQ ID NO: 115中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 116中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 117中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 118中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 119中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 120中所描繪的CDR-L3， (j) 如SEQ ID NO: 126中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 127中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 128中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 129中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 130中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 131中所描繪的CDR-L3， (k) 如SEQ ID NO: 137中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 138中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 139中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 140中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 141中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 142中所描繪的CDR-L3， (l) 如SEQ ID NO: 152中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 153中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 154中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 155中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 156中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 157中所描繪的CDR-L3， (m) 如SEQ ID NO: 167中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 168中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 169中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 170中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 171中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 172中所描繪的CDR-L3， (n) 如SEQ ID NO: 203中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 204中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 205中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 206中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 207中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 208中所描繪的CDR-L3； (o) 如SEQ ID NO: 214中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 215中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 216中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 217中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 218中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 219中所描繪的CDR-L3； (p) 如SEQ ID NO: 226中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 227中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 228中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 229中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 230中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 231中所描繪的CDR-L3；以及 (q) 如SEQ ID NO: 238中所描繪的CDR-H1、如SEQ ID NO: 239中所描繪的CDR-H2、如SEQ ID NO: 240中所描繪的CDR-H3、如SEQ ID NO: 241中所描繪的CDR-L1、如SEQ ID NO: 242中所描繪的CDR-L2和如SEQ ID NO: 243中所描繪的CDR-L3。
如請求項1之方法，其中將該方法應用於藉由上游連續製造方法生產的構建體。
一種執行如請求項1之方法之設備。
一種藉由如請求項1之方法純化的雙特異性抗體構建體。