KR102435801B1 - Fc-함유 단백질의 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Fc 영역을 함유하는 단백질, 예컨대 항체 및 Fc 융합 단백질의 정제 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Fc 영역-함유 단백질을 온도-반응성 단백질 A 수지로 흡착시키는 단계 및 35℃ 미만의 온도에서 무질서유발제, 당 알코올, 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 용출 완충액으로 수지로부터 단백질을 용출하는 단계를 포함하는 응집 단백질 수준을 감소시키는 정제 방법에 관한 것이다. 용출 완충액을 사용하여, 완전 조립된 항체를 이의 절반 항체 형태로부터 분리하는 방법이 또한 기재된다.

Description

FC-함유 단백질의 정제 방법
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2016년 7월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 62/365,943의 이익을 청구하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
전자 제출된 텍스트 파일의 설명
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2017년 7월 20일에 생성된 서열 목록의 컴퓨터로 읽을 수 있는 포맷의 사본은 A-2036-WO-PCT_SeqList_ST25로 명명되며 8.81킬로바이트 크기이다.
기술분야
본 발명은 바이오약학 제조 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 정제 공정 동안 Fc 영역-함유 단백질의 응집을 감소시키거나 또는 방지하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 오염물질, 예컨대 절반 항체의 제거 어려움으로부터의 항체 분리 방법에 관한 것이다.
유전 조작된 생물학적 제제, 특히 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 예컨대 다중특이적 항원 결합 단백질의 생산에서 응집은 주요 문제로 남아 있다. 단백질 응집물은 이의 심각한 면역원성으로 인해 치료 약물에서 허용될 수 없다(Maggio, Journal of Excipients and Food Chemicals, Vol. 3(2): 45-53, 2012; Sauerborn et al., Trends Pharmacol. Sci., Vol. 31(2): 53-59, 2010). 단백질 응집은 배지의 충분한 통기를 위해 요구되는 세포 배양물의 격렬한 진탕 결과 단백질의 재조합 발현 동안 일어날 수 있다(Vazquez-Rey and Lang, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 108(7): 1494-1508, 2011). 또한, 여러 단백질은 언폴딩되기 쉽고, 이어서 극한 pH 조건(즉, pH 9.0 초과 또는 pH 4.5 미만)에 노출되었을 때 응집되기 쉽다. 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 단백질의 전형적인 정제 방법에는 단백질 A 친화도 수지를 이용한 단백질의 포획 및 저 pH 산성 완충액(예컨대, pH 2.7 내지 3.7)을 이용한 수지로부터의 후속 용출이 수반된다(Hari et al., Biochemistry, Vol. 49(43): 9328-9338, 2010; Ejima et al., PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics, Vol. 66:954-962, 2007). 저 pH 용출은 단백질의 응집을 유도하여 수율을 감소시킬 뿐만 아니라, 회수된 응집되지 않은 단백질의 장기 안정성을 손상시킬 수 있다.
단백질 A 수지로부터 저 pH 용출의 바람직하지 못한 효과를 배제하기 위한 시도로, 온도-반응성 단백질 A 수지가 통상적인 단백질 A 수지에 대한 대안으로서 개발되었다. 상기 신규 수지는 10℃ 미만의 온도에서 면역글로불린의 Fc 영역에 결합하는 단백질 A의 돌연변이체 버전으로 이루어지지만, 승온(예컨대 40℃)에서 Fc 영역에 대한 친화도를 소실한다(Koguma et al., Journal of Chromatography A, Vol. 1305: 149-153, 2013). 온도-반응성 단백질 A 수지는, 컬럼을 단순히 가열함으로써 중성 pH에서 수지로부터 Fc 영역-함유 단백질의 용출을 허용하므로, 처음에 매우 열정적으로 받아들여졌다(Koguma et al., Journal of Chromatography A, Vol. 1305: 149-153, 2013). 온도-반응성 단백질 A 수지로의 단백질 정제가 안정한 분자를 생성하지만, 이 접근은 컬럼 로딩부터 용출까지 30℃ 이상의 컬럼 온도 변화를 필요로 하여, 로딩 및 용출 단계 간에 상당한 지체 시간을 생성하므로 비실용적이다. 컬럼 온도를 조작하기 위해 요구되는 시간 지연은 정제 공정에 상당량의 사이클 시간을 추가하여, 상기 접근을 대규모 제조 공정 및 탐색기 동안 대규모 단백질 패널의 고처리량 정제 모두에 대해 바람직하지 못하게 만든다. 또한, 온도-반응성 단백질 A 수지로부터 용출되는 단백질의 안정성에 대한 큰 온도 변화의 영향은 알려져 있지 않다.
따라서, 선행기술의 단백질 A 크로마토그래피 방법과 연관된 단백질의 구조적 온전성에 대한 효과를 최소화하거나 감소시키는 Fc 영역-함유 단백질에 대한 효율적인 정제 방법의 필요성이 당분야에 존재한다.
본 발명은 부분적으로, 중성 pH 및 항온에서 온도-반응성 단백질 A 수지로부터 결합된 Fc 영역-함유 단백질의 용출을 허용하는 완충액 조성물의 개발에 기반한다. 본원에서 기재된 용출 완충액과 조합된 온도-반응성 단백질 A 수지를 채택하는 정제 방식은 응집된 단백질의 수준을 감소시키며, 이에 의해 하류 정제 단계 횟수를 감소시킨다. 또한, 본원에서 기재된 용출 완충액으로의 용출은 온도-독립적 방식으로 수행될 수 있으므로, 이러한 정제 방법은 산업적 제조를 위해 쉽게 확장 가능하다.
따라서, 본 발명은 Fc 영역을 포함하는 단백질의 정제 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 방법은 단백질이 온도-반응성 단백질 A 물질에 결합하는 온도에서 단백질 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 용액을 물질과 접촉시키는 단계; 및 약 35℃ 미만의 온도에서 본원에서 기재된 용출 완충액으로 물질로부터 단백질을 용출하는 단계를 포함하며, 여기서 단백질은 용액 중 하나 이상의 불순물로부터 정제된다.
소정 구현예에서, 본 발명은 또한 Fc 영역을 포함하는 단백질의 정제 동안 응집을 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 방법은 단백질이 온도-반응성 단백질 A 물질에 결합하는 온도에서 단백질을 물질로 흡착시키는 단계; 및 약 35℃ 미만의 온도에서 본원에서 기재된 용출 완충액으로 물질로부터 단백질을 용출하는 단계를 포함하며, 여기서 용출액 중 응집된 형태의 Fc 영역-함유 단백질의 양은 통상적인 단백질 A 물질로부터의 용출액 중의 양보다 적다. 일부 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액 중 응집된 형태의 Fc 영역-함유 단백질의 양은 30% 미만이다. 관련 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액 중 Fc 영역-함유 단백질의 적어도 70%는 단량체 형태이다.
본 발명의 방법에서 채택된 용출 완충액은 중성 범위의 pH(예컨대 약 6.5 내지 약 7.5의 pH)를 가지며 무질서유발제 및 당 알코올을 포함한다. 일부 구현예에서, 무질서유발제 및 당 알코올은 약 0.4 내지 약 4.5의 몰 농도 비로 존재한다. 하나의 구현예에서, 무질서유발제 대 당 알코올의 몰 농도 비는 약 1.1 내지 약 1.8이다. 용출 완충액 중 무질서유발제의 농도는 사용되는 특정 무질서유발제에 따라 약 0.4 M 내지 약 5 M일 수 있다. 일부 구현예에서, 무질서유발제는 요소, 구아니디늄 클로라이드, 또는 티오시아네이트 염(예컨대 나트륨 티오시아네이트, 칼륨 티오시아네이트, 또는 암모늄 티오시아네이트)일 수 있다. 소정 구현예에서, 무질서유발제는 요소이다. 다른 구현예에서, 무질서유발제는 구아니디늄 클로라이드이다. 용출 완충액 중 당 알코올의 농도는 약 1 M 내지 약 4.5 M일 수 있다. 소정 구현예에서, 당 알코올은 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 또는 글리세롤이다. 하나의 구현예에서, 당 알코올은 소르비톨이다. 또 다른 구현예에서, 당 알코올은 만니톨이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에서 채택된 용출 완충액은 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함한다. 아미노산은 비극성 아미노산, 예컨대 알라닌, 시스테인, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 또는 발린, 및/또는 염기성 아미노산, 예컨대 히스티딘, 라이신, 오르니틴, 또는 아르기닌일 수 있다. 소정 구현예에서, 용출 완충액은 적어도 하나의 비극성 아미노산 및 적어도 하나의 염기성 아미노산을 포함한다. 예를 들면, 하나의 구현예에서, 용출 완충액은 프롤린 및 아르기닌을 포함한다. 용출 완충액 중 아미노산의 농도는 약 0.25 M 내지 약 1 M일 수 있다.
다양한 구현예에서, 용출 완충액은 염, 예컨대 나트륨 염 또는 클로라이드 염을 추가로 포함할 수 있다. 염은 약 0.1 M 내지 약 1 M의 농도로 용출 완충액에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 용출 완충액에 포함된 염은 나트륨 클로라이드이다.
소정 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용된 용출 완충액은 약 2 M 내지 약 4.5 M의 무질서유발제, 약 1 M 내지 약 4.5 M의 당 알코올, 약 0.25 M 내지 약 1 M의 염기성 아미노산, 약 0.25 M 내지 약 1 M의 비극성 아미노산, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M의 염을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 무질서유발제는 요소이며, 당 알코올은 소르비톨이고, 염기성 아미노산은 아르기닌이고, 비극성 아미노산은 프롤린이고, 염은 나트륨 클로라이드이다.
본 발명의 방법에 따른 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 Fc 영역-함유 단백질의 용출은 약 1℃ 내지 약 25℃의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질의 용출은 단백질이 온도-반응성 단백질 A 물질로 흡착되거나 결합되는 온도와 동일하거나 유사한 온도에서 수행된다. 예를 들면, 하나의 구현예에서, Fc 영역-함유 단백질의 용출은 약 10℃ 미만, 예컨대 약 1℃ 내지 약 6℃의 온도에서 수행된다. 다른 구현예에서, Fc 영역-함유 단백질의 용출은 실온, 예를 들어 약 20℃ 내지 약 25℃에서 수행된다.
본원에서 기재된 방법에 따라 정제될 수 있는 Fc 영역-함유 단백질에는 항체, Fc-융합 단백질, 및 다중-특이적 항원 결합 단백질이 포함된다. 일부 구현예에서, Fc 영역-함유 단백질은 항체이다. 다른 구현예에서, Fc 영역-함유 단백질은 Fc-융합 단백질, 예컨대 적어도 하나의 단일쇄 Fv 단편을 포함하는 Fc-융합 단백질이다. Fc 영역-함유 단백질은, 예를 들어 포유류 세포에서, 재조합적으로 생산될 수 있다. 이러한 구현예에서, Fc 영역-함유 단백질은 세포 배양 상청액 또는 세포 용해액, 예컨대 바이오리액터로부터의 수확 공정의 결과 생산되는 것들으로부터 정제될 수 있다.
본 발명은 또한 부분적으로, 크기 배제 크로마토그래피가 이동상으로서 무질서유발제, 당 알코올, 및 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 완충액과 함께 사용되는 경우, 완전 조립된 항체를 절반 항체 오염물질로부터 효과적으로 분리할 수 있다는 발견에 기반한다. 따라서, 본 발명은 또한 항체를 이의 절반 항체 형태로부터 분리하는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 방법은 항체 및 이의 절반 항체 형태를 포함하는 용액을 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 갖고 무질서유발제, 당 알코올, 비극성 아미노산, 및 염기성 아미노산을 포함하는 이동상을 사용하여 겔 여과 매트릭스와 접촉시키는 단계; 및 겔 여과 매트릭스로부터 용출 분획을 수집하는 단계를 포함하며, 여기서 항체는 한 세트의 용출 분획으로 용출되며 이의 절반 항체 형태는 또 다른 세트의 용출 분획으로 용출되어 항체를 이의 절반 항체 형태로부터 분리한다. 방법의 소정 구현예에서, 항체는 다중특이적(예컨대 이중특이적) 이종이량체 항체이다.
중성 pH 및 항온에서 온도-반응성 단백질 A 수지로부터 Fc 영역-함유 단백질을 용출하기 위해 본원에서 기재된 임의의 용출 완충액이 항체를 이의 절반 항체 형태로부터 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피에서 이동상으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이동상은 약 2 M 내지 약 4.5 M의 무질서유발제, 약 1 M 내지 약 4.5 M의 당 알코올, 약 0.25 M 내지 약 1 M의 염기성 아미노산, 및 약 0.25 M 내지 약 1 M의 비극성 아미노산을 포함한다. 이들 및 다른 구현예에서, 이동상은 요소, 소르비톨, 아르기닌, 및 프롤린을 포함한다. 소정 구현예에서, 이동상은 약 2 M 내지 약 4.5 M 요소, 약 1 M 내지 약 4.5 M 소르비톨, 약 0.25 M 내지 약 1 M 아르기닌, 약 0.25 M 내지 약 1 M 프롤린, 및 0.25 M 내지 약 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 약 4 M 요소, 약 2.2 M 소르비톨, 약 0.5 M 아르기닌, 약 0.5 M 프롤린, 및 약 0.75 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 이동상의 pH는 약 6.5 내지 약 7.5 또는 특정 구현예에서, 약 7.0 내지 약 7.4일 수 있다.
방법의 소정 구현예에서, 이동상은 약 0.01 ㎖/분 내지 약 0.2 ㎖/분의 유속으로 겔 여과 매트릭스를 통과한다. 다른 구현예에서, 이동상은 약 0.02 ㎖/분 내지 약 0.06 ㎖/분의 유속으로 겔 여과 매트릭스를 통과한다. 겔 여과 매트릭스는 가교 아가로스 및 덱스트란으로 이루어질 수 있고, 약 10 kDa 내지 약 600 kDa의 분획화 범위를 가질 수 있다.
도 1. IgG-scFv 결합 단백질의 구조. 도면은 본원에서 기재된 방법에 의해 정제될 수 있는 Fc-함유 단백질의 예인, IgG-scFv 결합 단백질의 모식도를 표시한다. IgG-scFv 결합 단백질은 2개의 단일쇄 가변 단편(scFv)으로 이루어지며, 그 각각은 또 다른 펩타이드 링커를 통해 제2 항체의 중쇄의 카복실-말단으로 융합된, 펩타이드 링커에 의해 함께 연결된 제1 항체로부터의 가변 도메인을 포함한다.
도 2. 통상적인 단백질 A 컬럼으로부터 용출된 IgG-scFv 결합 단백질. 도면은 IgG-scFv 결합 단백질의 단백질 A 용출액 풀의 샘플로부터의 SE-UPLC 크로마토그램을 나타낸다. 결합 단백질을 4℃에서 1% 아세트산 완충액, pH 2.7을 사용하여 통상적인 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하였다. SEC-UPLC 컬럼으로부터 나온 용출액은 응집물 피크(검은색 화살표로 표시됨) 및 단량체 피크(검은색 별로 표시됨)를 둘 다 함유하였다. 4개 패널은 각각 별개의 실험이다.
도 3. 4℃에서 온도-반응성 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출된 IgG-scFv 결합 단백질. 도면은 IgG-scFv 결합 단백질에 대한 단백질 A 용출액 풀의 샘플로부터의 SE-UPLC 크로마토그램을 나타낸다. 결합 단백질을, pH 7.2를 가지며 50 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 용출 완충액을 사용하여 4℃에서 온도-반응성 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하였다. 단량체 피크는 검은색 별로 표시된다. 3개 패널은 각각 별개의 실험이다.
도 4a. 온도-반응성 단백질 A 크로마토그래피 컬럼 상에서 정제 동안 IgG-scFv 결합 단백질의 SDS-PAGE. 겔 상에서 각 레인의 샘플은 다음과 같았다: 표준물질 = 단백질 표준물질; 공급물 = 컬럼 로딩 전 청정화된 세포 배양 상청액의 샘플; FT = 컬럼 플로우 쓰루 분획의 샘플; 및 용출액 = pH 7.2에서 25 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 용출 완충액으로 실온에서 컬럼으로부터 결합 단백질의 용출 후 용출액 풀의 샘플.
도 4b. 실온에서 온도-반응성 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출된 IgG-scFv 결합 단백질. 도면은 IgG-scFv 결합 단백질에 대한 온도-반응성 단백질 A 용출액 풀의 샘플의 SE-HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 결합된 단백질을, pH 7.2를 가지며 25 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 용출 완충액을 사용하여 실온에서 온도-반응성 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하였다. 약 14분의 체류 시간을 갖는 피크는 결합 단백질의 단량체 형태이다. 삽입도는 크로마토그램 상에 나타낸 각각의 피크에 대한 체류 시간 그리고 피크 면적 및 높이를 제공한다. 용출액 풀에 존재하는 IgG-scFv 결합 단백질의 대략 99%는 단량체 형태이다.
도 5. 단일쇄 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 구조. 도면은 본원에서 기재된 방법에 의해 정제될 수 있는 Fc 영역-함유 단백질의 예인, 단일쇄 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 모식도를 표시한다. 단일쇄 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질은 제2 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하는 제2 scFv 단편에 융합된, 제1 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하는 제1 scFv 단편 및 제1 scFv 단편에 펩타이드 링커를 통해 그 N-말단에서 융합된 Fc 영역을 포함한다.
도 6a. 174 mM 아세트산을 사용하여 통상적인 단백질 A 컬럼으로부터 용출된 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 SE-HPLC 크로마토그램. 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질을 실온에서 174 mM(1%) 아세트산, pH 2.7을 사용하여 통상적인 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하였다. 검은색 화살표는 결합 단백질의 응집물에 대응하는 피크를 표시한다. 검은색 별은 결합 단백질의 단량체 형태에 대응하는 피크를 표시한다. 삽입도는 크로마토그램 상에 나타낸 각각의 피크에 대한 체류 시간 그리고 피크 면적 및 높이를 제공한다. 용출액 풀에 존재하는 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 대략 39%는 단량체 형태이다.
도 6b. 33 mM 아세트산을 사용하여 통상적인 단백질 A 컬럼으로부터 용출된 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 SE-HPLC 크로마토그램. 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질을 실온에서 33 mM(0.06%) 아세트산, pH 3.7을 사용하여 통상적인 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하였다. 검은색 화살표는 결합 단백질의 응집물에 대응하는 피크를 표시한다. 검은색 별은 결합 단백질의 단량체 형태에 대응하는 피크를 표시한다. 삽입도는 크로마토그램 상에 나타낸 각각의 피크에 대한 체류 시간 그리고 피크 면적 및 높이를 제공한다. 용출액 풀에 존재하는 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 대략 53%는 단량체 형태이다.
도 7a. 온도-반응성 단백질 A 컬럼으로부터 용출된 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 SE-HPLC 크로마토그램. 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질을, pH 7.2를 가지며 25 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 2.5 M 요소를 포함하는 용출 완충액을 사용하여 실온에서 온도-반응성 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하였다. 삽입도는 크로마토그램 상에 나타낸 피크에 대한 체류 시간 그리고 피크 면적 및 높이를 제공한다. 검은색 화살표는 결합 단백질의 응집물에 대응하는 피크를 표시한다. 약 15.9분의 체류 시간을 갖는 피크는 Fv-Fc 결합 단백질의 단량체 형태에 대응하며 검은색 별로 표시된다. 용출액 풀에 존재하는 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 대략 75%는 단량체 형태이다.
도 7b. 온도-반응성 단백질 A 컬럼으로부터 용출된 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 SE-HPLC 크로마토그램. 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질을, pH 7.2를 가지며 25 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 용출 완충액을 사용하여 실온에서 온도-반응성 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하였다. 삽입도는 크로마토그램 상에 나타낸 각각의 피크에 대한 체류 시간 그리고 피크 면적 및 높이를 제공한다. 검은색 화살표는 결합 단백질의 응집물에 대응하는 피크를 표시한다. 약 15.9분의 체류 시간을 갖는 피크는 Fv-Fc 결합 단백질의 단량체 형태에 대응하며 검은색 별로 표시된다. 용출액 풀에 존재하는 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 대략 88%는 단량체 형태이다.
도 7c. 온도-반응성 단백질 A 컬럼 완충액으로부터 이중특이적 Fv-Fc 용출액의 SDS-PAGE. 온도-반응성 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 정제 동안 상이한 샘플을 취하였다. 겔 상에서 각 레인의 샘플은 다음과 같다: 표준물질 = 단백질 표준물질; 공급물 = 컬럼 로딩 전 청정화된 세포 배양 상청액의 샘플; FT = 컬럼 플로우 쓰루 분획의 샘플; 및 용출액 = pH 7.2에서 25 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 용출 완충액으로 실온에서 컬럼으로부터 결합 단백질의 용출 후 용출액 풀의 샘플.
도 8a. 4℃에서 온도-반응성 단백질 A 컬럼으로부터 용출된 모노클로날 항체의 SE-HPLC 크로마토그램. 항체를, pH 7.2를 가지며 20 mM HEPES, 2 M 구아니디늄 클로라이드, 및 2.2 M 소르비톨을 포함하는 용출 완충액을 사용하여 4℃에서 온도-반응성 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하였다. 항체의 단량체 형태에 대응하는 피크는 검은색 별로 표시된다.
도 8b. 도 8a에서 크로마토그램에 나타낸 피크의 특징을 요약하는 표. 모노클로날 항체의 거의 90%는 용출액 풀에서 단량체 형태로 회수되었다.
도 9a 및 9b. 도면은 통상적인 단백질 A 정제 후 2개의 상이한 로트의 재조합 이중특이적 이종이량체 항체로부터의 LCMS 크로마토그램을 표시한다. 148351달톤의 예측 질량을 갖는 완전 조립된 이종이량체 항체, 및 74355달톤의 예측 질량을 갖는 절반 항체의 1개 종이 2개 로트에서 모두 검출된다. 74004달톤의 예측 질량을 갖는 절반 항체의 다른 종은 검출되지 않는다. 절반 항체의 수준은 로트 별로 다르다.
도 10a. 도면은 이중특이적 이종이량체 항체("이종이량체 항체 A")의 통상적인 단백질 A 용출액 풀의 샘플에 대한 SE-HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 완전 조립된 이종이량체 항체("전체 항체")는 분석용 크기 배제 컬럼 상에서 절반 항체 전에 용출된다. 크로마토그램 아래의 표는 크로마토그램 상에 나타낸 2개 피크에 대한 체류 시간 및 피크 면적, 폭, 및 높이를 제공한다. 절반 항체의 대략 72%는 용출액 풀에 존재한다.
도 10b. 이중특이적 이종이량체 항체("이종이량체 항체 A")의 통상적인 단백질 A 용출액 풀로부터의 샘플의 SDS-PAGE 분석. 환원성(겔의 왼쪽) 또는 비-환원성(겔의 오른쪽) 조건에서 나타낸 샘플 부피를 4~20% 구배 트리스-글리신 SDS 겔 상으로 로딩하였다. 단백질 표준물질을 중간 레인 내로 로딩하였다. 통상적인 단백질 A 크로마토그래피에 의한 정제 후 상당량의 절반 항체가 존재한다.
도 11. 이중특이적 이종이량체 항체("이종이량체 항체 A") 조제물의 분취용 SEC 크로마토그램. 이중특이적 이종이량체 항체 조제물로 PBS, pH 7.0을 포함하는 이동상을 사용하여 분취용 SEC 겔 여과를 거쳤다. 통상적인 조건 하에 수행된 SEC는 완전 조립된 이종이량체 항체로부터의 절반 항체 및 다른 불완전 단편을 분리할 수 없다.
도 12. 이중특이적 이종이량체 항체("이종이량체 항체 A")의 통상적인 단백질 A 용출액 풀의 분취용 SEC 겔 여과 컬럼(2 × 80 ㎖ Superdex 200)으로부터의 용출 프로필. 0.02 ㎖/분의 유속으로 pH 7.2에서 50 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 이동상으로 SEC를 수행하였다. 3개의 일차 단백질 피크가 관찰된다.
도 13a 및 13b. SEC로부터의 용출 분획의 SDS-PAGE 분석으로서, 그 프로필을 도 12에 나타낸다. 각각의 3개 피크를 통해 분획을 수집하였다. "L" = SEC 전의 로딩 물질. 샘플을 비환원성(도 13a) 또는 환원성(도 13b) 조건 중 하나로 4~20% 구배 트리스-글리신 SDS 겔 상으로 로딩하였다. 피크 2는 주로 완전 조립된 항체("F")를 포함하는 반면, 피크 3은 주로 절반 항체("H")를 포함한다. 피크 1은 더 높은 분자량의 응집물에 대응한다. pH 7.2에서 50 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 이동상을 사용하는 SEC는 완전 조립된 이종이량체 항체를 절반 항체로부터 효과적으로 분리하였다.
도 14a. 도면은 SEC 전의 이중특이적 이종이량체 항체를 포함하는 로딩 물질의 샘플 및 도 12에 나타낸 SEC 동안 3개의 일차 단백질 피크 각각으로부터의 용출 분획으로부터 분석용 SE-HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 이중특이적 이종이량체 항체("이종이량체 항체 A")를 포함하는 통상적인 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용출액 풀을 분취용 SEC 겔 여과 컬럼(2 × 80 ㎖ Superdex 200) 상으로 로딩하였다. 0.02 ㎖/분의 유속으로 pH 7.2에서 50 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 이동상으로 SEC를 수행하였다. 완전 조립된 이종이량체 항체는 주로 피크 2에서 용출되는 반면, 절반 항체는 주로 피크 3에서 용출된다. 더 높은 분자량의 응집물은 피크 1에서 용출된다. 상기 이동상으로 수행된 SEC는 완전 조립된 이종이량체 항체를 절반 항체 오염물질로부터 효과적으로 분리할 수 있다.
도 14b. 통상적인 단백질 A 용출액 풀, SEC 전의 로딩 물질, 및 SEC 후의 최종 풀로부터의 재조합 이종이량체 항체의 샘플의 SDS-PAGE 분석. 샘플을 비환원성(겔의 왼쪽) 또는 환원성(겔의 오른쪽) 조건 중 하나로 4~20% 구배 트리스-글리신 SDS 겔 상으로 로딩하였다.
도 14c. pH 7.2에서 50 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 이동상으로 SEC 정제 후 재조합 이중특이적 이종이량체 항체의 LCMS 크로마토그램. 완전 조립된 이종이량체 항체만 검출 가능하다. 2개 종의 절반 항체가 모두 검출 불가능하다. SEC는 절반 항체 오염물질을 효율적으로 제거한다. 도 9a 및 9b를 비교한다.
도 15a 및 15b. 도면은 pH 7.2에서 50 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 이동상을 사용하여 SEC로 정제 전(도 15a) 및 후(도 15b) 재조합 이중특이적 이종이량체 항체 B의 LCMS 크로마토그램을 표시한다. SEC 정제 전에, 조제물은 완전 조립된 항체뿐만 아니라 절반 항체를 모두 함유한다. SEC 정제 후, 절반 항체는 검출할 수 없다.
도 16a 및 16b. 도면은 pH 7.2에서 50 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 이동상을 사용하여 SEC로 정제 전(도 16a) 및 후(도 16b) 재조합 이중특이적 이종이량체 항체 C의 LCMS 크로마토그램을 표시한다. SEC 정제 전에, 조제물은 완전 조립된 항체뿐만 아니라 절반 항체를 모두 함유한다. SEC 정제 후, 절반 항체는 검출할 수 없다.
도 17a~17f. pH 7.2에서 50 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 이동상을 사용하여 분취용 SEC 겔 여과 컬럼으로부터의 용출 분획으로부터 재조합 이중특이적 이종이량체 항체의 SDS-PAGE 분석. SEC은 상이한 유속: 0.02 ㎖/분(도 17a), 0.04 ㎖/분(도 17b), 0.06 ㎖/분(도 17c), 0.08 ㎖/분(도 17d), 0.1 ㎖/분(도 17e), 및 0.2 ㎖/분(도 17f)으로 수행되었다. "F" = 완전 조립된 이종이량체 항체. "H" = 절반 항체. 샘플을 비환원성 조건에서 4~20% 구배 트리스-글리신 SDS 겔 상으로 로딩하였다. 절반 항체 분리 효율은 유속 증가와 함께 감소한다.
본 발명은 부분적으로 응집된 단백질 및 다른 오염물질, 예컨대 절반 항체 수준을 최소화하는 Fc 영역 함유 단백질(예컨대 항체 및 Fc 융합 단백질)에 대한 정제 절차의 개발에 기반한다. Fc 영역-함유 단백질에 대한 통상적인 정제 방법은 전형적으로 단백질 A 친화도 크로마토그래피 컬럼을 채택하며, 이는 컬럼으로부터 결합된 단백질을 용출하기 위해 극히 산성인 용액을 필요로 한다. 이러한 산성 용액은 종종 응집, 불안정성을 유도하며, 종종 단백질의 침전을 유도한다. 온도 변화를 사용하여 중성 pH에서 결합된 단백질의 용출을 허용하는, 변형된 온도-반응성 단백질 A 수지가 개발되었으나, 수지의 온도를 높이기 위해 요구되는 상당한 시간으로 인해 이러한 변형된 수지는 대규모 제조 공정에 적합하지 않다.
본 발명자는 전통적인 단백질 A 크로마토그래피의 저 pH 용출 완충액 및 변형된 온도-반응성 단백질 A 수지에 대해 요구되는 승온의 사용을 배제하는 Fc 영역-함유 단백질에 대한 정제 방법을 고안하였다. 본 발명의 정제 방법은 무질서유발제, 당 알코올, 및 선택적으로 하나 이상의 아미노산을 포함하는 용출 완충액을 채택한다. 용출 완충액의 조성물은 온도-반응성 단백질 A 수지에 결합된 단백질이 수지의 온도를 35℃ 초과로 높이지 않고 중성 pH에서 수지로부터 제거되거나 용출될 수 있도록 허용한다. 또한 놀랍게도, 항체를 이의 절반 항체 형태로부터 효율적으로 분리하기 위해 상기 용출 완충액이 크기 배제 크로마토그래피에서 이동상으로서 사용될 수 있음이 확인되었다.
따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 단백질 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 용액으로부터 Fc 영역을 포함하는 단백질을 정제하는 방법을 제공하며, 이 방법은 단백질이 온도-반응성 단백질 A 물질에 결합하는 온도에서 용액을 물질과 접촉시키는 단계; 및 약 35℃ 미만의 온도에서 본원에서 기재된 용출 완충액으로 물질로부터 단백질을 용출하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에서 기재된 용출 완충액 중 하나를 이동상으로서 사용하여 항체 및 이의 절반 항체 형태를 포함하는 용액을 겔 여과 매트릭스와 접촉시키는 단계, 및 겔 여과 매트릭스로부터 용출 분획을 수집하는 단계를 포함하는 이의 절반 항체 형태로부터 항체의 분리 방법을 제공하며, 여기서 항체는 한 세트의 용출 분획으로 용출되며 이의 절반 항체 형태는 또 다른 세트의 용출 분획으로 용출되어 항체를 이의 절반 항체 형태로부터 분리한다.
본 발명의 방법은 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 단백질의 정제에 특히 적합하다. 본원에서 사용되는 "Fc 영역을 포함하는 단백질" 또는 "Fc 영역-함유 단백질"은 면역글로불린 Fc 영역의 아미노산 서열에 대응하는 연속 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 나타낸다. 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 나타내며, 이는 온전한 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 선택적으로 CH4 도메인을 포함한다. 소정 구현예에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 면역글로불린으로부터의 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG2 면역글로불린으로부터의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 정제될 수 있는 Fc 영역-함유 단백질에는 비제한적으로 항체, Fc-융합 단백질, 및 다중-특이적 항원 결합 단백질이 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 2개의 경쇄 폴리펩타이드(각각 약 25 kDa) 및 2개의 중쇄 폴리펩타이드(각각 약 50~70 kDa)를 포함하는 사량체성 면역글로불린 단백질을 나타낸다. 용어 "경쇄" 또는 "면역글로불린 경쇄"는 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, 단일 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 및 단일 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함하는 폴리펩타이드를 나타낸다. 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(CL)은 카파(κ) 또는 람다(λ)일 수 있다. 용어 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 아미노 말단부터 카복실 말단으로, 단일 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH), 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1(CH1), 면역글로불린 힌지 영역, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 2(CH2), 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 3(CH3), 및 선택적으로 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 4(CH4)를 포함하는 폴리펩타이드를 나타낸다. 중쇄는 뮤(μ), 델타(Δ), 감마(γ), 알파(α), 및 엡실론(ε)으로서 분류되며, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 정의한다. IgG-클래스 및 IgA-클래스 항체는 하위클래스, 즉 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 및 IgA1 및 IgA2로 각각 추가 구분된다. IgG, IgA, 및 IgD 항체에서의 중쇄는 3개 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는 반면, IgM 및 IgE 항체에서의 중쇄는 4개 도메인(CH1, CH2, CH3, 및 CH4)을 갖는다. 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 서브타입을 포함하는 임의의 면역글로불린 이소형에서 유래될 수 있다. 항체쇄는 CL 도메인과 CH1 도메인 사이(즉 경쇄와 중쇄 사이) 및 항체 중쇄의 힌지 영역들 사이의 폴리펩타이드-간 디설파이드 결합을 통해 함께 연결된다.
본 발명의 방법에 따라 정제될 수 있는 항체에는 비제한적으로 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 인간 항체가 포함된다. 일부 구현예에서, 항체는 산-민감성 항체이다. 본원에서 사용되는 "산-민감성 항체"는 산성 조건에서(예컨대 약 6보다 낮은 pH에서) 불안정하거나, 응집하거나 구조적 온전성을 소실하는 항체를 나타낸다. 소정 구현예에서, 항체는 다중-특이적(예컨대 이중특이적) 이종이량체 항체이다. 다중-특이적 이종이량체 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 2개의 상이한 경쇄 및 2개의 상이한 중쇄를 포함하는 항체를 나타낸다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 이중특이적 이종이량체 항체는 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항체로부터의 경쇄 및 중쇄 및 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항체로부터의 경쇄 및 중쇄를 포함한다(도 9a 및 9b의 오른쪽 도식 참고, 여기서 색칠한 기호는 제1 항원에 대해 결합 부위를 형성하는 경쇄 및 중쇄를 나타내며 색칠하지지 않은 기호는 제2 항원에 대해 결합 부위를 형성하는 경쇄 및 중쇄를 나타낸다). 이중특이적 이종이량체 항체는 동일한 세포에서 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 공동-발현함으로써 또는 폴리펩타이드쇄를 개별적으로 발현시킨 후 이들을 조립함으로써 생산될 수 있다. 이종이량체 형성을 촉진하기 위해, 폴리펩타이드쇄는, 예를 들어, "구멍-내로의-매듭" 방법 또는 전하 페어링 방법을 사용하여 조작될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 모두 이의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[WO 96/027011; Ridgway et al., Protein Eng., Vol. 9: 617-621, 1996; Merchant et al., Nat, Biotechnol., Vol. 16: 677-681, 1998; WO 2009/089004; WO 2014/081955; 및 Gunasekaran et al., J. Biol. Chem., Vol. 285: 19637-19646, 2010]에 기재되어 있다.
소정 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 정제될 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"(또는 "mAb")는 실질적으로 동종성 항체 집단으로부터 수득된 항체를 나타낸다(즉, 집단을 이루는 개별 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다). 모노클로날 항체는 매우 특이적으로, 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 유도된 상이한 항체가 포함되는 폴리클로날 항체 조제물과 대조적으로 개별 항원 부위 또는 에피토프에 대해 유도된다. 모노클로날 항체는, 예컨대, 면역화 일정의 완료 후 트랜스제닉 동물로부터 수확된 비장 세포를 불멸화함으로써, 당분야에 공지된 임의의 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 비장 세포는, 예컨대 이들을 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산함으로써, 당분야에 공지된 임의의 기법을 사용하여 불멸화될 수 있다. 하이브리도마-생산 융합 절차에서 사용하기 위한 골수종 세포는 바람직하게는 비-항체-생산성이며, 높은 융합 효율을 가지고, 이들이 요망되는 융합된 세포(하이브리도마)만의 성장을 뒷받침하는 소정의 선택 배지에서 성장할 수 없도록 하는 효소 결핍을 갖는다. 마우스 융합에서 사용하는 데 적합한 세포주의 예에는 Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XXO Bul이 포함되며; 래트 융합에서 사용되는 세포주의 예에는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210이 포함된다. 세포 융합에 유용한 다른 세포주는 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6이다.
일부 구현예에서, 모노클로날 항체는 인간화 항체일 수 있다. "인간화 항체"는 영역(예컨대 프레임워크 영역)이 인간 면역글로불린으로부터의 대응 영역을 포함하도록 변형된 항체를 나타낸다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 동물에서 최초 생성된 모노클로날 항체로부터 생산될 수 있다. 전형적으로 항체의 비-항원 인식 부분으로부터의, 상기 모노클로날 항체에서의 소정 아미노산 잔기는 대응하는 이소형의 인간 항체에서 대응하는 잔기와 상동성으로 변형된다. 인간화는, 예를 들어, 설치류 가변 영역의 적어도 일부를 인간 항체의 대응 영역으로 치환함으로써 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예컨대, 문헌[미국 특허 번호 5,585,089 및 5,693,762; Jones et al., Nature, Vol. 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, Vol. 332:323-27, 1988; Verhoeyen et al., Science, Vol. 239:1534-1536, 1988] 참고). 또 다른 종에서 생성된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR은 공통 인간 프레임워크 영역(FR)으로 그래프팅될 수 있다. 공통 인간 FR을 생성하기 위해, 몇몇 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터의 FR은 공통 아미노산 서열을 확인하기 위해 정렬될 수 있다.
다른 구현예에서, 모노클로날 항체는 완전 인간 항체일 수 있다. "완전 인간 항체"는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열로부터 유도되거나 이를 시사하는 가변 및 불변 영역을 포함하는 항체이다. 완전 인간 항체는 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(보통 마우스)을 면역화함으로써 생산될 수 있다. 상기 목적을 위한 항원은 전형적으로 6개 이상의 인접 아미노산을 가지며, 선택적으로 담체, 예컨대 합텐에 콘주게이션된다. 예컨대, 문헌[Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al.,　1993, Nature 362:255-258; 및 Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33]을 참고한다. 이러한 방법의 한 예에서, 트랜스제닉 동물은 내부에 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 인코딩하는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자위를 불능화하는 단계, 및 마우스 게놈 내로 인간 중쇄 및 경쇄 단백질을 인코딩하는 인간 게놈 DNA 함유 유전자위의 대형 단편을 삽입하는 단계에 의해 생산된다. 이어서 모든 요망되는 면역계 변형을 갖는 동물을 수득하기 위해 인간 면역글로불린 유전자위의 완전 상보체보다 적은 부분을 갖는 부분적으로 변형된 동물이 교배된다. 면역원이 투여되면, 이들 트랜스제닉 동물은 면역원에 대해 면역특이적이지만 가변 영역을 포함하여, 쥐과가 아닌 인간 아미노산 서열을 갖는 항체를 생산한다. 이러한 방법의 추가 상세사항에 대해서는, 예를 들어, WO96/33735 및 WO94/02602를 참고한다. 인간 항체를 제조하기 위한 트랜스제닉 마우스에 관한 추가 방법은 미국 특허 번호 5,545,807; 번호 6,713,610; 번호　6,673,986; 번호　6,162,963; 번호 5,939,598; 번호　5,545,807; 번호　6,300,129; 번호　6,255,458; 번호　5,877,397; 번호　5,874,299 및 번호　5,545,806; PCT 공보 WO91/10741, WO 90/04036, WO 94/02602, WO 96/30498, WO 98/24893 및 EP 546073B1 및　EP　546073A1에 기재되어 있다.
인간-유래 항체는 또한 파지 디스플레이 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이는, 예컨대, 그 각각의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, 및 Caton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990)]에 기재되어 있다. 파지 기술에 의해 생산된 항체는 보통 박테리아에서 항원 결합 단편, 예컨대 Fv 또는 Fab 단편으로서 생산되며, 이에 따라 효과기 기능이 없다. 효과기 기능은 2개 전략 중 하나에 의해 도입될 수 있다: 단편이 포유류 세포 내 발현을 위해 전체 항체 내로, 또는 요망되는 경우, 효과기 기능을 유발할 수 있는 제2 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체 단편 내로 조작될 수 있다. 전형적으로, 항체의 Fd 단편(VH-CH1) 및 경쇄(VL-CL)는 PCR에 의해 개별적으로 클로닝되고 조합 파지 디스플레이 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이어서 특정 항원으로의 결합에 대해 선택될 수 있다. 항체 단편은 파지 표면 상에서 발현되며, 항원 결합에 의한 Fv 또는 Fab(및 이에 따라 항체 단편을 인코딩하는 DNA를 함유하는 파지)의 선택은 패닝으로 명명된 절차인, 수 회의 항원 결합 및 재-증폭을 통해 달성된다. 항원에 대해 특이적인 항체 단편이 농축되고 최종 단리된다. 파지 디스플레이 기법은 또한 "가이드된 선택"으로 불리는, 설치류 모노클로날 항체의 인간화를 위한 접근에서 사용될 수 있다(문헌[Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)] 참고). 이를 위해, 마우스 모노클로날 항체의 Fd 단편은 인간 경쇄 라이브러리와 조합되어 디스플레이될 수 있고, 이어서 생성 하이브리드 Fab 라이브러리가 항원으로 선택될 수 있다. 이에 의해, 마우스 Fd 단편이 주형을 제공하여 선택을 가이드한다. 이후, 선택된 인간 경쇄는 인간 Fd 단편 라이브러리와 조합된다. 생성 라이브러리의 선택은 전적으로 인간 Fab를 산출한다.
소정 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 정제될 Fc 영역을 포함하는 단백질은 Fc 융합 단백질이다. "Fc 융합 단백질"은 이종성 폴리펩타이드에 융합되거나 연결된 Fc 영역을 함유하는 단백질이다. 전형적으로, 융합 단백질은 하나의 단백질(예컨대 Fc 영역)로부터의 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 상이한 단백질로부터의 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 같은 프레임으로 첨부되고, 선택적으로 이로부터 링커에 의해 분리되는 융합 유전자로부터 발현된다. 이어서 융합 유전자는 재조합 숙주 세포에 의해 발현되어 단일 융합 단백질을 생산할 수 있다. Fc 영역에 융합된 이종성 폴리펩타이드는 면역글로불린 단백질 이외의 단백질로부터의 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들면, 이종성 폴리펩타이드는 리간드 폴리펩타이드, 수용체 폴리펩타이드, 호르몬, 사이토카인, 성장 인자, 효소, 또는 면역글로불린의 성분이 아닌 다른 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 Fc 융합 단백질은 비제한적으로 하기 수용체 중 임의의 하나를 포함하는, 수용체 또는 이의 단편 또는 수용체로부터의 리간드에 융합된 Fc 영역을 포함할 수 있다: TNFR의 두 형태(p55 및 p75로 나타냄), 인터류킨-1 수용체 유형 I 및 II(이의 전문이 본원에 참조로 포함되는, EP 특허 번호 0460846, 미국 특허 번호 4,968,607, 및 미국 특허 번호 5,767,064에 기재됨), 인터류킨-2 수용체, 인터류킨-4 수용체(이의 전문이 본원에 참조로 포함되는, EP 특허 번호 0 367 566 및 미국 특허 번호 5,856,296에 기재됨), 인터류킨-15 수용체, 인터류킨-17 수용체, 인터류킨-18 수용체, 과립구-대식구 집락 자극 인자 수용체, 과립구 집락 자극 인자 수용체, 온코스타틴-M 및 백혈병 억제 인자에 대한 수용체, NF-카파 B의 수용체 활성화제(RANK, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 6,271,349에 기재됨), VEGF 수용체, EGF 수용체, FGF 수용체, TRAIL에 대한 수용체(TRAIL 수용체 1, 2, 3, 및 4 포함), 및 사멸 도메인을 포함하는 수용체, 예컨대 Fas 또는 아폽토시스-유도 수용체(AIR). Fc 융합 단백질에는 또한 펩티바디, 예컨대 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 2000/24782에 기재된 것들이 포함된다.
다른 구현예에서, Fc 영역이 융합되거나 연결되는 이종성 폴리펩타이드는 Fc 영역이 유도되는 면역글로불린 이외의 면역글로불린 단백질 또는 이의 단편으로부터의 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 이종성 폴리펩타이드는 Fc 영역이 수득되는 항체 이외의 상이한 항체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역일 수 있다. 소정 구현예에서, Fc 융합 단백질은 적어도 하나의 단일쇄 Fv 단편(scFv 단편)을 포함한다. "단일쇄 가변 항체 단편" 또는 "scFv 단편"은 항체의 VH 및 VL 영역을 포함하며, 여기서 이들 영역은 단일 폴리펩타이드쇄로 존재하며, 선택적으로 Fv가 항원 결합을 위해 요망되는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 및 VL 영역 간 펩타이드 링커를 포함한다(예컨대, 문헌[Bird et al., Science, Vol. 242:423-426, 1988; 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85:5879-5883, 1988] 참고). 일부 구현예에서, Fc 융합 단백질은 2개의 scFv 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, Fc 융합 단백질은 3개의 scFv 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fc 융합 단백질은 4개의 scFv 단편을 포함한다.
하나 이상의 scFv 단편 또는 항체 가변 영역의 다른 단편을 포함하는 Fc 융합 단백질은 하나 이상의 항원에 대해 여러 결합 부위를 가질 수 있다. 따라서, 이러한 Fc 융합 단백질에는 다중특이적, 다가 항원 결합 단백질, 예컨대 미국 공개 번호 20030133939에 기재된 소형 모듈형 면역약제; WO2007/146968에 기재된 단일쇄 다가 결합 단백질, WO2014144722에 기재된 이중특이적, 2가 scFv-Fc 분자, 및 다양한 이중특이적 항체 분자, 예컨대 IgG-scFv, IgG-Fab, 2scFv-IgG, 4scFv-IgG, VH-IgG, IgG-VH, 및 Fab-scFv-Fc, 및 문헌[Spiess et al., Mol Immunol., Vol. 67:95-106, 2015 및 Kontermann, mAbs, Vol. 4:182-197, 2012]에 기재된 다른 것들이 포함될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 정제될 Fc 융합 단백질은 IgG-scFv 결합 단백질이다. 본원에서 사용되는 "IgG-scFv 결합 단백질"은 2개의 단일쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 결합 단백질이며, 그 각각은 또 다른 펩타이드 링커를 통해 제2 항체의 중쇄의 카복실-말단으로 융합된, 펩타이드 링커에 의해 함께 연결된 제1 항체로부터의 가변 도메인을 포함한다. IgG-scFv 결합 단백질의 예가 도 1에 표시된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 정제될 Fc 융합 단백질은 Fv-Fc 결합 단백질이다. "Fv-Fc 결합 단백질"은 선택적으로 링커를 통해 Fc 영역에 융합된 적어도 하나의 scFv 단편을 포함한다. 소정 구현예에서, Fv-Fc 결합 단백질은 선택적으로 링커 펩타이드를 통해 서로 융합된 2개의 scFv 단편을 포함하며, 이는 다시 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단 중 하나로 융합된다. 이러한 2가 Fv-Fc 분자는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO2014144722에 기재되어 있다. 이러한 단일쇄 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 하나의 예를 도 5에 나타낸다.
본원에서 기재된 방법을 사용하여 정제될 수 있는 항체 및 Fc 융합 단백질은 비제한적으로 CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD28, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD147, IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-13, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-13 수용체, IL-I8 수용체 서브유닛, 안지오포이에틴(예컨대 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, 또는 안지오포이에틴-4), PDGF-β, VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-β1, EGF 수용체, VEGF 수용체, FGF 수용체, C5 보체, 베타-클로토(klotho), 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP), CGRP 수용체, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 폴리펩타이드(PACAP), 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 폴리펩타이드 1형 수용체(PAC1 수용체), IgE, 종양 항원, 예컨대, 종양 항원 CA125, 종양 항원 MUC1, PEM 항원, PD-1, LCG(폐암과 연관되어 발현되는 유전자 산물), HER-2, 종양-연관 당단백질 TAG-72, SK-1 항원, 인테그린 알파 4 베타 7, 인테그린 VLA-4, B2 인테그린, TRAIL 수용체 1, 2, 3, 및 4, RANK, RANK 리간드, 스클레로스틴(sclerostin), Dickkopf-1(DKK-1), TLA1, TNF-α, 접착 분자 VAP-l, 상피 세포 접착 분자(EpCAM), 세포내 접착 분자-3(ICAM-3), 류코인테그린 어드헤신(adhesin), 혈소판 당단백질 gp IIb/IIIa, 심장 미오신 중쇄, PCSK9, 부갑상샘 호르몬, rNAPc2, MHC I, 암배아 항원(CEA), 알파-태아단백질(AFP), 종양 괴사 인자(TNF), CTLA-4(세포독성 T 림프구-연관 항원), Fc-γ-1 수용체, HLA-DR 10 베타, HLA-DR 항원, L-셀렉틴, IPN-γ, 호흡기 융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스(HBV), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 포함하는 하나 이상의 단백질에 결합할 수 있다.
본원에서 기재된 방법에 따라 정제될 수 있는 다른 예시적인 Fc 영역-함유 단백질에는 비제한적으로 아플리베르셉트(Eylea®), 알렘투주맙(Campath®), 베바시주맙(Avastin®), 세툭시맙(Erbitux®), 파니투무맙(Vectibix®), 젬투주맙(Mylotarg®), 에볼로쿠맙(Repatha®), 알리로쿠맙(Praluent®), 데노수맙(Prolia®), 리툭시맙(Rituxan®), 토시투모맙(Bexxar®), 이브리투모맙(Zevalin®), 트라스투주맙(Herceptin®), 에쿨리주맙(Soliris®), 아달리무맙(Humira®), 인플릭시맙(Remicade®), 에타네르셉트(Enbrel®), 다클리주맙(Zenapax®), 바실릭시맙(Simulect®), 팔리비주맙(Synagis®), 오말리주맙(Xolair®), 앱식지맙(Reopro®), 에팔리주맙(Raptiva®), 펨브롤리주맙(Keytruda®), 니볼루맙(Opdivo®), 나탈리주맙(Tysabri®), 블리나투모맙(Blincyto®), 및 로미플로스팀(Nplate®)이 포함된다.
정제될 Fc 영역-함유 단백질은 재조합 수단에 의해, 즉 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된 살아 있는 숙주 세포에 의해 생산될 수 있다. 단백질을 생산하기 위한 세포의 유전적 조작 방법은 당분야에 널리 알려져 있다. 예컨대 문헌[Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)]을 참고한다. 이러한 방법에는 살아 있는 숙주 세포 내로 단백질을 인코딩하고 발현을 허용하는 핵산을 도입하는 단계가 포함된다. 이들 숙주 세포는 배양에서 성장시킨 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있다. 원핵생물 숙주 세포에는 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박레시아세애(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스체리키아(Escherichia), 예컨대, 대장균(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 어위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예컨대, 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예컨대, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella)뿐만 아니라 바실러스(Bacillus), 예컨대 B. 서브틸리스(subtilis) 및 B. 리케니포르미스(licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반 제빵 효모가 저등 진핵생물 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 여러 다른 종, 종, 및 균주, 예컨대 피치아(Pichia), 예컨대 P. 파스토리스(pastoris), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia); 칸디다(Candida); 트리코더마 리이시아(Trichoderma reesia); 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa); 슈반니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 필라멘트성 진균, 예컨대, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길러스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 A. 니둘란스(nidulans) 및 A. 나이거(niger)가 일반적으로 이용 가능하며 본원에서 유용하다. 특정 구현예에서, 재조합 단백질은 동물 세포, 특히 포유류 세포에서 생산된다. 발현을 위한 숙주로서 이용 가능한 포유류 세포주는 당분야에 널리 알려져 있고, 비제한적으로 CHOK1 세포(ATCC CCL61), DXB-11, DG-44, 및 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216, 1980)을 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(293 또는 현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, (Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59, 1977); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간암 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68, 1982); MRC 5 세포 또는 FS4 세포; 포유류 골수종 세포, 및 여러 다른 세포주를 포함하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에서 이용 가능한 불멸화된 세포주가 비제한적으로 포함된다. 하나의 특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 정제될 단백질은 포유류 세포주, 특히 CHO 세포주에서, 재조합적으로 생산된다.
본 발명의 방법은 용액 중 표적 단백질(예컨대 Fc 영역-함유 단백질)을 하나 이상의 불순물로부터 정제하거나 분리하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "단백질의 정제"는 표적 단백질과 상이하며 최종 단백질 조성물에서 바람직하게는 제외되는 물질의 양을 감소시키는 공정을 나타낸다. 이러한 불순물 또는 오염물질에는 관심 표적 Fc 영역-함유 단백질과 상이한 단백질(예컨대, 요망되지 않은 관심 단백질의 단편, 예컨대 절반 항체를 포함하는 가용성 또는 불용성 단백질, 또는 단백질의 단편), 지질(예컨대, 세포 벽 물질), 내독소, 바이러스, 핵산(예컨대, 염색체 또는 염색체외 DNA, t-RNA, rRNA, 또는 mRNA), 또는 이의 조합, 또는 임의의 다른 물질이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 불순물 또는 오염물질은 관심 Fc 영역-함유 단백질을 생산한 숙주 세포에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 불순물 또는 오염물질은 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 핵산(DNA 또는 RNA), 또는 관심 Fc 영역-함유 단백질을 발현한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포의 다른 세포 성분이다. 일부 구현예에서, 불순물 또는 오염물질은 숙주 세포에서 유래되지 않으며, 예컨대, 불순물 또는 오염물질은 세포 배양 배지 또는 성장 배지, 완충액, 또는 배지 첨가물로부터의 단백질 또는 다른 물질일 수 있다. 다른 구현예에서, 불순물 또는 오염물질은 요망되지 않는 형태의 Fc 영역-함유 단백질, 예컨대 단백분해 단편 또는 단백질의 조립되지 않은 성분(예컨대 경쇄, 중쇄, 절반 분자 또는 이의 단편)일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "불순물"에는 하나의 요망되지 않는 물질, 또는 몇몇 요망되지 않는 물질의 조합이 포함될 수 있다. 오염 단백질 및 핵산(예컨대 숙주 세포 단백질 및 핵산)의 적합한 검출 방법은 당업자에게 알려져 있다. 이러한 방법에는 비제한적으로 효소-연관 면역흡착 검정(ELISA), 겔 전기영동 방법, 및 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 방법이 포함된다. 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 및 모세관 전기영동 방법이 Fc 영역-함유 단백질의 고분자량 종(예컨대 응집물) 및 저분자량 종(단편, 조립되지 않은 성분)을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
표적 Fc 영역-함유 단백질이 정제될 수 있는 용액은 단백질 및 그 존재가 요망되지 않는, 하나 이상의 불순물 또는 오염물질을 함유하는 임의의 용액일 수 있다. 단백질 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 용액에는 표적 단백질이 생산된 세포 배양으로부터 유도된 임의의 용액이 포함될 수 있다. 예를 들어, 단백질을 생산하기 위한 재조합 수단에 의해 변형된 숙주 세포의 배양 시, Fc 영역-함유 단백질은 세포내로, 원형질막주위 공간에서 생산되거나, 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 단백질이 세포내로 생산되는 경우, 세포는 Fc 영역-함유 단백질을 함유하는 세포 용해액을 생산하기 위해 당업자에게 공지된 방법에 따라 용해될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 정제될 Fc 영역-함유 단백질을 포함하는 용액은 세포 배양 용해액이다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 정제 방법 전에, 숙주 세포, 용해된 단편, 및 다른 대형 입자는, 예를 들어, 원심분리, 마이크로여과, 또는 초여과에 의해, 세포 배양 용해액으로부터 제거될 수 있다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질은 숙주 세포에 의해 배양 배지 내로 분비된다. 이러한 구현예에서, 재조합 숙주 세포 및 다른 입상물은, 예를 들어, 세포 배양 상청액을 생산하기 위해 접선류 여과 또는 원심분리에 의해, Fc 영역-함유 단백질을 함유하는 세포 배양 배지로부터 분리될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 정제될 Fc 영역-함유 단백질을 함유하는 용액은 세포 배양 상청액이다. Fc 영역-함유 단백질을 함유하는 세포 배양 용해액, 세포 배양 상청액, 또는 다른 용액은 본 발명의 정제 방법 전에 미립자 물질 및 가용성 응집물을 제거하기 위해 추가 청정화될 수 있다. 일부 구현예에서, 용액의 청정화는 약 0.1 ㎛ 내지 약 0.5 ㎛의 포어 크기를 갖는 막, 바람직하게는 약 0.22 ㎛의 포어 크기를 갖는 막으로 용액을 여과하여 달성될 수 있다.
소정 구현예에서, Fc 영역-함유 단백질 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 용액은 단백질을 발현하는 숙주 세포가 배양되고 있는 바이오리액터로부터의 수확 스트림 또는 풀이다. "수확 스트림" 또는 "수확 풀"은 Fc 영역-함유 단백질로부터 세포, 세포 파편, 또는 다른 대형 입자를 분리하기 위한 하나 이상의 공정에 의해 가공된 용액을 나타낸다. 이러한 공정에는 숙주 세포 배양으로부터 재조합 단백질을 수확하기 위해 당업자에게 공지된 표준 공정, 예컨대 솜털침전, 원심분리, 및 다양한 형태의 여과(예컨대 심층 여과, 접선류 여과 마이크로여과 및 접선류 초여과)가 포함된다. 일부 구현예에서, 단백질 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 용액은 산업적 규모의 바이오리액터(예컨대 생산 바이오리액터)로부터의 수확 스트림 또는 풀이다. 산업적 규모의 바이오리액터는 전형적으로 500리터 초과, 특히 2,000리터 내지 20,000리터 부피의 재조합 단백질을 생산한다. 하나의 특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 정제될 하나 이상의 불순물 및 단백질을 함유하는 용액은 약 2,000리터 이상의 부피를 갖는 생산 바이오리액터로부터의 수확 스트림 또는 풀이다.
소정 구현예에서, 본 발명의 방법은 정제될 단백질을 함유하는 용액을 온도-반응성 단백질 A 물질과 접촉시키는 단계를 포함한다. "온도-반응성 단백질 A 물질"은 단백질의 Fc 영역에 결합하는 능력이 온도와 함께 변화하도록 변경된, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에서 발견되는 세포벽 단백질인, 단백질 A의 돌연변이체 형태를 나타낸다. 이러한 온도-반응성 단백질 A 돌연변이체는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는, 미국 특허 번호 8,198,409에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질은 고온, 예컨대, 약 35℃ 이상이 아닌 저온, 예컨대 약 0 내지 약 15℃에서 상이한 Fc 영역-결합력을 갖는 돌연변이체 단백질 A를 포함한다. 소정 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질은 아래의 표 1에 기재된 임의의 서열의 아미노 서열을 포함하는 돌연변이체 단백질 A를 포함한다. 하나의 구현예에서, 돌연변이체 단백질 A는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이체 단백질 A는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이체 단백질 A는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이체 단백질 A는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
돌연변이체 단백질 A의 아미노산 서열
SEQ ID NO 아미노산 서열
1 ADNKFNKEQQNAFYEILHGPNGNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKA
2 ADNKFNKEQQNAFYEILHAPNGNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKA
3 ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNGNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKA
4 ADNKFNKEQQNAFYEILHGPNANEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKA
5 ADNKFNKEQQNAFYEILHGPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKA
6 ADNKFNKEQQNAFYEILHAPNANEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKA
7 ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNGNEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKA
8 ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNGNEEQRNAGIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKA
9 ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNGNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKGNDAQAPKA
10 ADNKENKEQQNAFYEILHLPNGNEEGRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKA
11 ADNKFNKEQQNAFYETLHLPNGNEEQGNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKA
12 ADNKFNXEQQNAFYEILHGPNANEEQRNAGIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKA
13 ADNKENKEQQNAFYEILHGPNANEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKGNDAQAPKA
14 ADNKFNKEQQNAFYEILHGPNATEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKA
온도-반응성 단백질 A 물질은 합성적으로, 예를 들어 펩타이드 합성 또는 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 온도-반응성 단백질 A 물질은, 예를 들어 Nomadic Bioscience Co., Ltd.(Byzen Pro® 온도-반응성 단백질 A 수지)로부터 상업적으로 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질은 고상으로 고정된다. 고상에는 비제한적으로 비드, 수지, 겔, 입자, 막, 튜브, 플레이트, 및 필름이 포함될 수 있다. 하나의 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A가 고정되는 고상은 비드, 특히 자성 비드이다. 또 다른 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A가 고정되는 고상은 수지이다. 온도-반응성 단백질 A 물질이 비드, 수지, 입자 또는 용기 내로의 충전에 적합한 다른 고상으로 고정되는 소정 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질을 함유하는 고상은 용기, 예컨대 컬럼 내로 충전되거나 로딩된다.
고상을 제조할 수 있는 적합한 물질에는 유리, 실리카(예컨대 실리카 겔), 다당류(예컨대, 다당류 매트릭스), 예컨대 아가로스, 덱스트란, 및 셀룰로스, 유기 중합체, 예컨대 폴리아크릴아미드, 메틸메타크릴레이트, 및 폴리스티렌-디비닐벤젠 공중합체가 포함된다. 다양한 고상으로 온도-반응성 단백질 A 물질을 고정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 기능적 커플링기(예컨대 카복실 또는 티올기)를 갖는 고상의 활성화 물질 및 미국 특허 공개 번호 2015/0218208 및 2013/0317172에 기재된 다른 방법이 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 Fc 영역-함유 단백질을 포함하는 용액을 온도-반응성 단백질 A 물질과 접촉시키는 단계 또는 Fc 영역-함유 단백질을 온도-반응성 단백질 A 물질로 흡착시키는 단계는 Fc 영역-함유 단백질이 물질에 결합하도록 하는 조건 하에 단백질이 온도-반응성 단백질 A 물질과 조합됨을 의미한다. 특히, Fc 영역-함유 단백질은 단백질이 온도-반응성 단백질 A 물질에 결합하는 온도에서, 예를 들어, 약 0℃ 내지 약 15℃, 약 1℃ 내지 약 12℃, 또는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서, 물질과 조합된다. 일부 구현예에서, Fc 영역-함유 단백질은 약 10℃ 이하의 온도에서 온도-반응성 단백질 A 물질과 접촉되거나 이로 흡착된다. 소정 구현예에서, Fc 영역-함유 단백질은 약 1℃ 내지 약 6℃의 온도에서 온도-반응성 단백질 A 물질과 접촉되거나 이로 흡착된다. 하나의 구현예에서, Fc 영역-함유 단백질은 약 4℃의 온도에서 온도-반응성 단백질 A 물질과 접촉되거나 이로 흡착된다.
소정 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질은 정제될 Fc 영역-함유 단백질을 포함하는 용액과 접촉되기 전에 적합한 완충액으로 평형화될 수 있다. 하나의 이러한 적합한 평형 완충액은 pH 7.2의 포스페이트 완충 식염수이다. 다른 적합한 평형 완충액에는 약 5 내지 약 9의 pH, 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.0의 pH, 보다 바람직하게는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH에서 생리적 염 농도(예컨대 150 mM NaCl)를 포함하는 약 0.5 mM 내지 약 100 mM 농도의 트리스, BIS, 및 HEPES가 포함된다.
Fc 영역-함유 단백질이 온도-반응성 단백질 A 물질에 결합되는 경우, 결합된 물질은 선택적으로 물질로부터의 용출 전 하나 이상의 세척 용액으로 세척될 수 있다. 하나 이상의 세척 용액은 전형적으로 염, 예컨대 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트, 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 중성 pH(예컨대 약 6.5 내지 약 7.5)의 완충액이다. 세척 용액에서 염의 적합한 농도는 약 0.1 M 내지 약 2 M, 약 0.5 M 내지 약 2 M, 약 0.75 M 내지 약 1.5 M, 또는 약 0.2 M 내지 약 0.6 M이다. 소정 구현예에서, 하나 이상의 세척 용액은 약 0.5 M 내지 약 2 M의 농도로 나트륨 클로라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 용액은 약 0.1 M 내지 약 0.8 M의 농도로 나트륨 클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 세척 용액은 약 7 내지 약 7.5의 pH에서 약 10 내지 약 25 mM 포스페이트 완충액 및 약 0.1 M 내지 약 0.8 M NaCl를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 세척 용액은 약 7 내지 약 7.5의 pH에서 약 20 내지 약 50 mM 트리스 완충액 및 약 0.1 M 내지 약 0.8 M NaCl 를 포함한다.
하나 이상의 세척 완충액은 또한 Fc 영역-함유 단백질 및 온도-반응성 단백질 A 물질의 결합 상호작용에 유의미하게 영향을 미치지 않고 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 불순물의 제거를 촉진하는 다른 성분을 포함할 수 있다. 이러한 추가 성분에는 2가 양이온(예컨대, 칼슘, 마그네슘, 및 니켈), 세제(예컨대, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80), 또는 중합체(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜)가 포함될 수 있다. 소정 구현예에서, 하나 이상의 세척 용액의 온도는 Fc 영역-함유 단백질이 온도-반응성 단백질 A 물질로 흡착되는 온도(예컨대 0℃ 내지 15℃)와 동일한 온도이다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 세척 용액의 온도는 약 15℃ 내지 25℃이다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 세척 용액의 온도는 25℃를 초과하지 않으며, 즉, 하나 이상의 세척 용액의 온도는 25℃ 이하, 예를 들어 약 1℃ 내지 약 25℃이다.
Fc 영역-함유 단백질이 온도-반응성 단백질 A 물질에 결합되고 결합된 물질이 상술된 바와 같이 선택적으로 세척되는 경우, Fc 영역-함유 단백질은 본원에서 기재된 바와 같이 용출 완충액을 사용하여 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 제거된다. 전형적으로, 온도-반응성 단백질 A 수지로부터의 Fc 영역-함유 단백질의 용출은 수지의 온도가 35℃ 이상으로 승온되는 것을 필요로 한다. 문헌[미국 특허 번호 8,198,409 및 Koguma et al., Journal of Chromatography A, Vol. 1305: 149-153, 2013]을 참고한다. 그러나, 아래에서 상세히 기재된 용출 완충액 조성물은 온도-반응성 단백질 A 수지에 결합된 단백질이 수지의 온도를 35℃ 초과로 높이지 않고 중성 pH에서 수지로부터 제거될 수 있도록 한다. 따라서, 소정 구현예에서, 본 발명의 방법은 약 35℃ 미만의 온도에서 온도 반응성 단백질 A 물질로부터 결합된 Fc 영역-함유 단백질을 용출하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질은 약 1℃ 내지 약 34℃, 약 4℃ 내지 약 32℃, 약 10℃ 내지 약 30℃, 또는 약 15℃ 내지 약 25℃의 온도에서 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된다. 소정 구현예에서, 단백질은 약 30℃ 미만의 온도, 예를 들어, 약 1℃ 내지 약 25℃의 온도에서 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된다. 일부 구현예에서, 단백질은 약 20℃ 내지 약 25℃의 온도에서 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된다. 다른 구현예에서, 단백질은 약 15℃ 내지 약 22℃의 온도에서 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된다. 소정 구현예에서, 단백질은 약 10℃ 미만, 예를 들어, 약 1℃ 내지 약 8℃의 온도에서 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된다. 일부 구현예에서, 단백질은 약 1℃ 내지 약 6℃의 온도에서 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된다. 다른 구현예에서, 단백질은 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된다. 일부 구현예에서, 단백질은 단백질이 물질에 결합된 온도와 동일한 온도에서 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된다(즉, 흡착 및 용출 단계 간에 물질의 온도가 변경되지 않는다).
일부 구현예에서, Fc 영역-함유 단백질은 아래에서 상세히 기재된 용출 완충액과 동용매로 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출될 수 있다. 대안적인 구현예에서, Fc 영역-함유 단백질은 선형 구배로, 예컨대 본원에서 기재된 세척 용액과 유사한 조성을 갖는 용액 100%로 시작해서 아래에 상세히 기재된 용출 완충액 100%로 끝나며, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출될 수 있다.
온도-반응성 단백질 A 물질로부터 Fc 영역-함유 단백질을 제거하기 위해 채택된 용출 완충액은 전형적으로 약 6.5 내지 약 7.5의 pH의 완충 용액이다. 일부 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 약 6.8 내지 약 7.5이다. 다른 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 약 7.2 내지 약 7.5이다. 하나의 특정 구현예에서, 용출 완충액의 pH는 약 7.0 내지 약 7.4이다. 완충액이 표적 pH 범위에서 용액의 pH를 유지할 수 있는 한(예컨대 6 내지 8의 pKa 값을 갖는 완충액), 임의의 완충액이 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서 용출 완충액의 성분으로서 사용될 수 있는 중성 pH 범위에서 완충작용을 하는 적합한 완충액에는 비제한적으로 HEPES(N-[2-하이드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산]), 트리스, 포스페이트, 시트레이트, MES(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), BES(N,N-비스[2-하이드록시에틸]-2-아미노에탄설폰산), PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), 트리신(N-트리스[하이드록시메틸]메틸글리신), 바이신(N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), TES(N-트리스[하이드록시메틸]메틸-2-아미노에탄설폰산), TAPSO(3-[N-트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-2-하이드록시프로판설폰산), 비스-트리스(비스(2-하이드록시에틸)아미노-트리스(하이드록시메틸)메탄), 및 MOPS(3-[N-모르폴리노]프로판설폰산)가 포함된다. 완충액은 약 5 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 15 mM 내지 약 100 mM, 약 20 mM 내지 약 75 mM, 또는 약 25 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은, 예를 들어 약 15 mM 내지 약 100 mM의 농도로 HEPES 완충액을 포함한다. 다른 구현예에서, 용출 완충액은, 예를 들어 약 15 mM 내지 약 50 mM의 농도로 트리스 완충액을 포함한다.
다양한 구현예에서, 용출 완충액은 무질서유발제를 포함한다. "무질서유발제"는 물 분자 중의 수소 결합 네트워크를 손상시키는 물질이며 비-공유력, 예컨대 수소 결합, 반 데르 발스력, 및 소수성 상호작용에 의해 매개되는 분자내 상호작용에 영향을 미쳐서 거대분자의 구조 내 질서를 감소시킬 수 있다. 이론에 구애받지 않고, 용출 완충액 중 무질서유발제의 존재는 Fc 영역-함유 단백질의 구조를 이완시키는 작용을 하여 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 그 풀림을 촉진하는 것으로 여겨진다. 용출 완충액에 포함될 수 있는 적합한 무질서유발제에는 비제한적으로 부탄올, 에탄올, 프로판올, 구아니디늄 클로라이드, 리튬 아세테이트 또는 리튬 퍼클로레이트, 마그네슘 클로라이드, 페놀, 나트륨 도데실 설페이트, 요소, 티오우레아, 및 티오시아네이트 염(예컨대 나트륨 티오시아네이트, 암모늄 티오시아네이트, 또는 칼륨 티오시아네이트)이 포함된다. 소정 구현예에서, 용출 완충액은 요소, 구아니디늄 클로라이드, 또는 나트륨 도데실 설페이트를 무질서유발제로서 포함한다. 다른 구현예에서, 용출 완충액은 요소, 구아니디늄 클로라이드, 또는 티오시아네이트 염을 무질서유발제로서 포함한다. 또 다른 구현예에서, 용출 완충액은 요소 또는 구아니디늄 클로라이드를 무질서유발제로서 포함한다. 무질서유발제는 사용되는 특정 무질서유발제에 따라 약 0.4 M 내지 약 5.0 M, 약 0.5 M 내지 약 2.5 M, 약 0.8 M 내지 약 1.2 M, 약 2 M 내지 약 4.5 M, 또는 약 3 M 내지 약 4.2 M의 농도로 용출 완충액에 존재할 수 있다. 소정 구현예에서, 용출 완충액은, 예를 들어 약 2 M 내지 약 4.5 M 농도로 요소를 포함한다. 다른 구현예에서, 용출 완충액은 약 3 M 내지 약 4.2 M 농도로 요소를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 용출 완충액은 약 4 M 농도로 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은, 예를 들어 약 0.5 M 내지 약 2.5 M의 농도로 구아니디늄 클로라이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 용출 완충액은 약 0.8 M 내지 약 1.2 M의 농도로 구아니디늄 클로라이드를 포함한다. 소정 구현예에서, 용출 완충액은 약 1 M의 농도로 구아니디늄 클로라이드를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 용출 완충액은 약 2 M의 농도로 구아니디늄 클로라이드를 포함한다.
소정 구현예에서, 용출 완충액은 무질서유발제에 부가하여 당 알코올을 포함한다. "당 알코올"은 당에서 유도된 유기 화합물이며, 일반 화학식 HOCH2(CHOH)nCH2OH에 따른 구조를 갖고, 식 중 n은 전형적으로 1 내지 22 이상으로 변한다. 용출 완충액에 포함될 수 있는 예시적인 당 알코올에는 비제한적으로 글리세롤, 에리트리톨, 트레이톨, 아라비톨, 자일리톨, 리비톨, 만니톨, 소르비톨, 갈락티톨, 푸시톨, 이디톨, 볼레미톨, 이소말트, 말티톨, 락티톨, 말토트리이톨, 및 말토테트라이톨이 포함된다. 소정 구현예에서, 용출 완충액은 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 또는 글리세롤을 당 알코올로서 포함한다. 하나의 구현예에서, 용출 완충액에서의 당 알코올은 소르비톨이다. 또 다른 구현예에서, 용출 완충액에서의 당 알코올은 만니톨이다. 당 알코올은 선택되는 특정 당 알코올에 따라 약 1 M 내지 약 4.5 M, 약 1.5 M 내지 약 4 M, 또는 약 2 M 내지 약 2.5 M의 농도로 용출 완충액에 존재할 수 있다. 소정 구현예에서, 용출 완충액은, 예를 들어 약 1 M 내지 약 4.5 M, 보다 바람직하게는 약 2 M 내지 약 2.5 M의 농도로 소르비톨을 포함한다. 하나의 구현예에서, 용출 완충액은 약 2.2 M의 농도로 소르비톨을 포함한다.
또한, 이론에 구애받지 않고, 당 알코올의 존재는 무질서유발제의 존재 하에 Fc 영역-함유 단백질이 완전히 언폴딩되는 것을 방지하는 것으로 여겨진다. 따라서, 일부 구현예에서, 용출 완충액은 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 풀리도록 Fc 영역-함유 단백질의 구조를 이완시키지만, 단백질이 완전히 언폴딩되고 그 기본 천연 구조를 소실하는 것은 방지하여 그 사이의 균형을 맞추는 특정한 농도 비로 무질서유발제 및 당 알코올을 포함한다. 이러한 구현예에서, 무질서유발제 대 당 알코올의 몰 농도 비는 약 0.4 내지 약 4.5, 약 0.8 내지 약 4, 약 1 내지 약 2, 약 1.5 내지 약 2.5, 또는 약 1.8 내지 약 2.2이다. 소정 구현예에서, 용출 완충액은 요소 및 소르비톨을 포함하며, 여기서 요소 대 소르비톨의 몰 농도 비는 약 1 내지 약 2.5, 또는 보다 바람직하게는 약 1.1 내지 약 1.8이다. 다른 구현예에서, 용출 완충액은 구아니디늄 클로라이드 및 소르비톨을 포함하며, 여기서 구아니디늄 클로라이드 대 소르비톨의 몰 농도 비는 약 0.5 내지 약 1.5, 또는 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 약 0.9이다.
소정 구현예에서, 용출 완충액은 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 용출 완충액은 염기성 아미노산, 비극성 아미노산, 또는 염기성 아미노산과 비극성 아미노산 둘 다를 추가로 포함할 수 있다. 이론에 구애받지 않고, 염기성 아미노산은 단백질과 물질의 전하 상호작용을 조절하여 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 Fc 영역-함유 단백질의 해리를 촉진하는 반면, 비극성 아미노산은 단백질과 물질의 소수성 상호작용을 조절하여 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 Fc 영역-함유 단백질의 풀림을 촉진하는 것으로 여겨진다. 본원에서 사용되는 "염기성 아미노산"은 친수성이고 이의 pKa 미만의 pH값에서 양으로 하전되는 D 또는 L 형태의 극성 아미노산이다. 용출 완충액에서 사용하기 적합한 예시적인 염기성 아미노산에는 비제한적으로 아르기닌, 오르니틴, 라이신, 및 히스티딘이 포함된다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 아르기닌을 포함한다. 다른 구현예에서, 용출 완충액은 라이신을 포함한다. 염기성 아미노산은 약 0.1 M 내지 약 1.5 M, 약 0.25 M 내지 약 1 M, 또는 약 0.3 M 내지 약 0.8 M의 농도로 용출 완충액에 존재할 수 있다. 소정 구현예에서, 용출 완충액은 약 0.5 M의 농도로 염기성 아미노산(예컨대 아르기닌)을 포함한다.
본원에서 "무극성 아미노산"과 상호 교환적으로 사용되는 "비극성 아미노산"은 소수성 작용기를 함유하며 중성 pH에서 전하를 보유하지 않는 D 또는 L 형태의 아미노산을 나타낸다. 용출 완충액에서 사용하기 적합한 예시적인 비극성 아미노산에는 비제한적으로 알라닌, 시스테인, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 및 발린이 포함된다. 소정 구현예에서, 용출 완충액은 프롤린을 포함한다. 비극성 아미노산은 약 0.1 M 내지 약 1.5 M, 약 0.25 M 내지 약 1 M, 또는 약 0.3 M 내지 약 0.8 M의 농도로 용출 완충액에 존재할 수 있다. 소정 구현예에서, 용출 완충액은 약 0.5 M의 농도로 비극성 아미노산(예컨대 프롤린)을 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 적어도 하나의 염기성 아미노산 및 적어도 하나의 비극성 아미노산을 포함한다. 이러한 구현예에서, 염기성 아미노산 및 비극성 아미노산은 동일한 농도로 용출 완충액에 존재할 수 있다. 예를 들어, 염기성 아미노산 및 비극성 아미노산은 각각 약 0.25 M 내지 약 1 M, 보다 바람직하게는 약 0.3 M 내지 약 0.8 M의 농도로 용출 완충액에 존재할 수 있다. 소정 구현예에서, 염기성 아미노산 및 비극성 아미노산은 각각 약 0.5 M의 농도로 용출 완충액에 존재한다. 하나의 구현예에서, 용출 완충액은 아르기닌 및 프롤린을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 용출 완충액은 라이신 및 프롤린을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에서 채택된 용출 완충액은 하나 이상의 염을 추가로 포함할 수 있다. "염"은 산 및 염기의 중화 반응으로 생성되는 이온성 화합물을 나타낸다. 염은 전형적으로 동일한 수의 양이온 및 음이온으로 이루어져서 염의 전체 총 전하는 0이다. 용출 완충액에 포함시키기 적합한 염에는 비제한적으로 나트륨 염, 예컨대 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 클로라이드, 및 나트륨 설페이트; 칼륨 염, 예컨대 칼륨 아세테이트, 칼륨 시트레이트, 칼륨 클로라이드, 및 칼륨 설페이트; 및 클로라이드 염, 예컨대 나트륨 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 니켈 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 및 암모늄 클로라이드가 포함된다. 소정 구현예에서, 용출 완충액은 나트륨 클로라이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 용출 완충액은 칼륨 클로라이드를 포함한다. 염은 약 0.1 M 내지 약 1 M, 약 0.25 M 내지 약 0.8 M, 약 0.5 M 내지 약 1 M, 또는 약 0.5 M 내지 약 0.8 M의 농도로 용출 완충액에 포함될 수 있다. 하나의 구현예에서, 염(예컨대 나트륨 클로라이드)은 약 0.75 M의 농도로 용출 완충액에 존재한다.
소정 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용된 용출 완충액은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 약 5 mM 내지 약 200 mM 완충액, 약 0.4 M 내지 약 5 M 무질서유발제, 약 1 M 내지 약 4.5 M 당 알코올, 약 0.1 M 내지 약 1.5 M 비극성 아미노산, 약 0.1 M 내지 약 1.5 M 염기성 아미노산, 및 약 0.1 M 내지 약 1 M 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 가지며 약 15 mM 내지 약 100 mM 완충액, 약 2 M 내지 약 4.5 M 무질서유발제, 약 1 M 내지 약 4.5 M 당 알코올, 약 0.25 M 내지 약 1 M 비극성 아미노산, 약 0.25 M 내지 약 1 M 염기성 아미노산, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 염을 포함한다. 다른 구현예에서, 용출 완충액은 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 가지며 약 15 mM 내지 약 100 mM 완충액, 약 0.5 M 내지 약 2.5 M 무질서유발제, 약 1 M 내지 약 4.5 M 당 알코올, 약 0.25 M 내지 약 1 M 비극성 아미노산, 약 0.25 M 내지 약 1 M 염기성 아미노산, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 염을 포함한다. 소정 구현예에서, 용출 완충액은 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 가지며 약 15 mM 내지 약 100 mM 완충액, 약 2 M 내지 약 4.5 M 무질서유발제, 약 2 M 내지 약 2.5 M 당 알코올, 약 0.25 M 내지 약 1 M 비극성 아미노산, 약 0.25 M 내지 약 1 M 염기성 아미노산, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 가지며 약 15 mM 내지 약 100 mM 완충액, 약 0.5 M 내지 약 2.5 M 무질서유발제, 약 2 M 내지 약 2.5 M 당 알코올, 약 0.25 M 내지 약 1 M 비극성 아미노산, 약 0.25 M 내지 약 1 M 염기성 아미노산, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 염을 포함한다.
임의의 상기 용출 완충액 조성물에 있어서, 완충액은 HEPES 또는 트리스일 수 있고, 무질서유발제는 요소 또는 구아니디늄 클로라이드일 수 있고, 당 알코올은 소르비톨 또는 만니톨일 수 있고, 비극성 아미노산은 프롤린일 수 있고, 염기성 아미노산은 아르기닌 또는 라이신일 수 있고, 염은 나트륨 염, 예컨대 나트륨 클로라이드일 수 있다. 예를 들면, 소정 구현예에서, 용출 완충액은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 15 mM 내지 약 100 mM HEPES, 약 2 M 내지 약 4.5 M 요소, 약 1 M 내지 약 4.5 M 소르비톨, 약 0.25 M 내지 약 1 M 프롤린, 약 0.25 M 내지 약 1 M 아르기닌, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 가지며 약 20 mM 내지 약 75 mM HEPES, 약 3 M 내지 약 4.2 M 요소, 약 2 M 내지 약 2.5 M 소르비톨, 약 0.3 M 내지 약 0.8 M 프롤린, 약 0.3 M 내지 약 0.8 M 아르기닌, 및 약 0.5 M 내지 약 1 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 용출 완충액은 약 7.2의 pH를 가지며 약 25 mM HEPES, 약 4 M 요소, 약 2.2 M 소르비톨, 약 0.5 M 프롤린, 약 0.5 M 아르기닌, 및 약 0.75 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 용출 완충액은 약 7.2의 pH를 가지며 약 50 mM HEPES, 약 4 M 요소, 약 2.2 M 소르비톨, 약 0.5 M 프롤린, 약 0.5 M 아르기닌, 및 약 0.75 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 15 mM 내지 약 100 mM 트리스, 약 2 M 내지 약 4.5 M 요소, 약 1 M 내지 약 4.5 M 소르비톨, 약 0.25 M 내지 약 1 M 프롤린, 약 0.25 M 내지 약 1 M 아르기닌, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 용출 완충액은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 15 mM 내지 약 100 mM HEPES, 약 2 M 내지 약 4.5 M 요소, 약 1 M 내지 약 4.5 M 만니톨, 약 0.25 M 내지 약 1 M 프롤린, 약 0.25 M 내지 약 1 M 아르기닌, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 용출 완충액은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 15 mM 내지 약 100 mM 트리스, 약 2 M 내지 약 4.5 M 요소, 약 1 M 내지 약 4.5 M 만니톨, 약 0.25 M 내지 약 1 M 프롤린, 약 0.25 M 내지 약 1 M 아르기닌, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함한다.
소정 구현예에서, 용출 완충액은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 15 mM 내지 약 100 mM HEPES, 약 0.5 M 내지 약 2.5 M 구아니디늄 클로라이드, 약 1 M 내지 약 4.5 M 소르비톨, 약 0.25 M 내지 약 1 M 프롤린, 약 0.25 M 내지 약 1 M 아르기닌, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 용출 완충액은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 15 mM 내지 약 100 mM 트리스, 약 0.5 M 내지 약 2.5 M 구아니디늄 클로라이드, 약 1 M 내지 약 4.5 M 소르비톨, 약 0.25 M 내지 약 1 M 프롤린, 약 0.25 M 내지 약 1 M 아르기닌, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 용출 완충액은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 15 mM 내지 약 100 mM HEPES, 약 0.5 M 내지 약 2.5 M 구아니디늄 클로라이드, 약 1 M 내지 약 4.5 M 만니톨, 약 0.25 M 내지 약 1 M 프롤린, 약 0.25 M 내지 약 1 M 아르기닌, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 용출 완충액은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 15 mM 내지 약 100 mM 트리스, 약 0.5 M 내지 약 2.5 M 구아니디늄 클로라이드, 약 1 M 내지 약 4.5 M 만니톨, 약 0.25 M 내지 약 1 M 프롤린, 약 0.25 M 내지 약 1 M 아르기닌, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 정제 절차 동안 일어날 수 있는 Fc 영역-함유 단백질의 응집을 감소시키거나 제거한다. 따라서, 본 발명에는 또한 Fc 영역을 포함하는 단백질의 정제 동안 응집을 감소시키는 방법이 포함된다. 하나의 구현예에서, 방법은 단백질이 온도-반응성 단백질 A 물질에 결합하는 온도에서 Fc 영역-함유 단백질을 물질로 흡착시키는 단계; 및 약 35℃ 미만의 온도에서 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 무질서유발제, 당 알코올, 비극성 아미노산, 및 염기성 아미노산을 포함하는 용출 완충액으로 물질로부터 단백질을 용출하는 단계를 포함하며, 여기서 용출액 중 응집된 형태의 Fc 영역-함유 단백질의 양은 통상적인 단백질 A 물질로부터의 용출액 중의 양보다 적다.
본원에서 사용되는 Fc 영역-함유 단백질의 "응집된 형태"는 비-공유 상호작용에 의해 함께 유지되는 단백질의 여러 분자 또는 단량체로 이루어진 단백질의 다량체 형태를 나타낸다. Fc 영역-함유 단백질의 "단량체 형태"는 모든 성분 및 사슬을 포함하여, 단백질의 하나의 전체 분자를 이루는 단백질 형태를 나타낸다. 예를 들면, 항체 단량체 또는 항체의 단량체 형태는 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된다. 유사하게, IgG-scFv 결합 단백질의 단량체 형태는 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하며, 여기서 각각의 변형된 중쇄는 이의 카복실-말단으로 융합된 단일쇄 가변 단편을 포함한다. IgG-scFv 결합 단백질의 단량체 형태를 도 1에 나타낸다. 단일쇄 Fc 영역-함유 단백질, 예컨대 도 5에 표시된 단일쇄 이중특이적 Fv-Fc 결합에 있어서, 단량체 형태는 단일 폴리펩타이드쇄이다.
본원에서 기재된 정제 방법의 일부 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액 중 Fc 영역-함유 단백질의 상당 비율은 단량체 형태이다. 예를 들어, 본원에서 기재된 용출 완충액으로의 용출로 생성되는 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액 중 Fc 영역-함유 단백질의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 단량체 형태이다. 소정 구현예에서, 물질로부터의 용출액 중 Fc 영역-함유 단백질의 적어도 70%는 단량체 형태이다. 일부 구현예에서, 물질로부터의 용출액 중 Fc 영역-함유 단백질의 적어도 80%는 단량체 형태이다. 다른 구현예에서, 물질로부터의 용출액 중 Fc 영역-함유 단백질의 적어도 90%는 단량체 형태이다.
본원에서 기재된 정제 방법의 소정 구현예에서, 본원에서 기재된 용출 완충액을 사용하는 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액 중 응집된 형태의 Fc 영역-함유 단백질의 양은 통상적인 단백질 A 물질로부터의 용출액 중 응집된 형태의 Fc 영역-함유 단백질의 양보다 적다. 본원에서 사용되는 "통상적인 단백질 A 물질"은 산성 조건 하에(예컨대 약 6 미만의 pH에서) 단백질의 Fc 영역에 대한 친화도를 소실하는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에서 발견된 천연 또는 야생형 형태의 단백질 A를 나타낸다. 통상적인 단백질 A 물질에는 상업적으로 이용 가능한 단백질 A 수지, 예컨대 MabSelect SuRe™ 수지(GE Healthcare), CaptivA® 수지(Repligen), Thermo Fisher, GenScript, 및 Bio-Rad의 단백질 A 수지 등이 포함된다. 통상적인 단백질 A 물질로부터 단백질을 용출하기 위한 전형적인 조건에는 산성 용출 완충액, 예컨대 약 2.5 내지 약 4의 pH에서의 아세트산 완충액의 사용이 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 용출 완충액을 사용하는 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액 중 응집된 형태의 Fc 영역-함유 단백질의 양은 약 2.5 내지 약 4의 pH를 갖는 아세트산 완충액(예컨대, 1% 아세트산)을 사용하는 통상적인 단백질 A 물질로부터의 용출액 중 응집된 형태의 Fc 영역-함유 단백질의 양보다 적다.
본원에서 기재된 용출 완충액을 사용하는 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액 중 응집된 형태의 Fc 영역-함유 단백질의 양은 바람직하게는 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만이다. 소정 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액 중 Fc 영역-함유 단백질의 30% 미만은 응집된 형태이다. 일부 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액 중 Fc 영역-함유 단백질의 20% 미만은 응집된 형태이다. 다른 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액 중 Fc 영역-함유 단백질의 10% 미만은 응집된 형태이다.
응집된 형태 및 단량체 형태의 단백질의 검출 및 정량 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 크기-배제 고성능 액체 크로마토그래피 방법, 예컨대 실시예에 기재된 방법이 포함될 수 있다. 다른 적합한 방법에는 침강 속도 분석 초원심분리, 비대칭 플로우 필드 플로우 분획화, 및 동적 광 산란이 포함된다. 예컨대, 문헌[Gabrielson et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 96: 268-279, 2007]을 참고한다.
본 발명의 방법의 소정 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출 후, Fc 영역-함유 단백질은 추가 정제 단계를 거칠 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된 Fc 영역-함유 단백질은 하나 이상의 추가 크로마토그래피 단계를 거친다. 이러한 추가 크로마토그래피 단계에는 이온 교환 크로마토그래피(예컨대 양이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합식 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피(예컨대 겔 여과 크로마토그래피), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 금속 친화도 크로마토그래피, 또는 이의 조합이 포함될 수 있다. 추가 크로마토그래피 단계는 표적 단백질이 크로마토그래피 물질에 결합하고 불순물이 흘러 나가는(플로우 쓰루) 결합 및 용출 방식, 또는 불순물이 크로마토그래피 물질에 결합하고 표적 단백질이 흘러 나가는 플로우 쓰루 방식으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된 Fc 영역-함유 단백질은 양이온 교환 크로마토그래피를 거친다. 다른 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된 Fc 영역-함유 단백질은 음이온 교환 크로마토그래피를 거친다. 소정 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된 Fc 영역-함유 단백질은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 거친다. 또 다른 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된 Fc 영역-함유 단백질은 혼합식 크로마토그래피를 거친다. 소정의 다른 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된 Fc 영역-함유 단백질은 크기 배제 크로마토그래피(예컨대 겔 여과 크로마토그래피), 예컨대 아래에서 추가로 상세히 기재된 크기 배제 크로마토그래피 방법을 거친다.
본 발명의 방법의 크로마토그래피 단계에는 추가 단계, 예컨대 바이러스 불활성화, 바이러스 여과 및/또는 초여과/정용여과 단계가 뒤따를 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 세제를 사용하는 바이러스 불활성화 단계 또는 UV 불활성화 방법이 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액 풀 또는 유출액으로 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출된 Fc 영역-함유 단백질은 세제 바이러스 불활성화 단계를 거친다. 존재하는 임의의 바이러스를 불활성화하기 위해 세제, 예컨대 Triton X-100(예컨대 1% v/v 농도)이 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액 풀 또는 유출액에 첨가되어 약 30분 내지 약 60분 동안 중성 pH에서 인큐베이션될 수 있다.
본 발명은 또한 항체를 이의 절반 항체 형태로부터 분리하는 방법을 제공한다. 실시예 5에 기재된 바와 같이, 놀랍게도 중성 pH 및 항온에서 온도-반응성 단백질 A 수지로부터 Fc 영역-함유 단백질을 용출하기 위한 본원에서 기재된 용출 완충액은 항체를 이의 절반 항체 형태로부터 효율적으로 분리하기 위해 크기 배제 크로마토그래피에서 이동상으로서 사용될 수 있음이 확인되었다. 따라서, 소정 구현예에서, 본 발명에는 항체를 이의 절반 항체 형태로부터 분리하는 방법이 포함되며, 이 방법은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 갖고 무질서유발제, 당 알코올, 비극성 아미노산, 및 염기성 아미노산을 포함하는 이동상을 사용하여 항체 및 이의 절반 항체 형태를 포함하는 용액을 겔 여과 매트릭스와 접촉시키는 단계; 및 겔 여과 매트릭스로부터의 용출 분획을 수집하는 단계를 포함하고, 여기서 항체는 한 세트의 용출 분획으로 용출되며 이의 절반 항체 형태는 또 다른 세트의 용출 분획으로 용출되어 항체를 이의 절반 항체 형태로부터 분리한다.
"절반 항체"는 전형적으로 단일 경쇄 폴리펩타이드 및 단일 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 관심 항체의 형태를 나타낸다(도 9a 및 9b의 왼쪽 모식도를 참고한다). 절반 항체("절반 분자"와 상호 교환적으로 사용됨)는 일반적으로 조립의 불완전 또는 항체의 2개 중쇄 폴리펩타이드 간 상호작용의 손상(예컨대 2개 중쇄의 힌지 영역들 사이의 폴리펩타이드-간 디설파이드 결합 형성의 손상)으로 야기된다. 소정 구현예에서, 절반 항체 형태로부터 분리될 항체는 다중-특이적(예컨대 이중특이적) 이종이량체 항체이다. 이러한 구현예에서, 2개 종의 절반 항체, 즉 제1 항원에 결합하는 하나의 절반 항체 및 제2 항원에 결합하는 또 다른 절반 항체가 이중특이적 이종이량체 항체의 재조합 생산으로 생성될 수 있다. 본 발명의 방법은 완전 조립된 항체로부터 절반 항체의 1개 또는 2개 종을 모두 분리할 수 있다.
항체를 이의 절반 항체 형태로부터 분리하는 방법의 일부 구현예에서, 이 방법은 정제될 항체 및 이의 절반 항체 형태를 함유하는 용액을 겔 여과 매트릭스와 접촉시키는 단계를 포함한다. 겔 여과 매트릭스는 전형적으로 컬럼 또는 다른 용기에 충전될 수 있는 가교 중합체로 제조된 다공성 비드로 이루어진다. 본 발명의 방법에서 사용하기 적합한 다양한 유형의 겔 여과 매트릭스가 상업적으로 이용 가능하며, 비제한적으로 덱스트란계 겔, 예컨대 SEPHADEX(가교 덱스트란 및 에피클로로하이드린); 폴리아크릴아미드계 겔, 예컨대 SEPHACRYL(알릴 덱스트란 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드의 가교 공중합체); 아가로스계 겔, 예컨대 SUPEROSE(고도 가교 아가로스) 또는 SEPHAROSE(가교 아가로스); 및 2종류의 겔로 제조된 복합 겔, 예컨대 SUPERDEX(가교 덱스트란 및 아가로스)가 포함된다. 소정 구현예에서, 겔 여과 매트릭스는 가교 아가로스 및 덱스트란을 포함한다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 겔 여과 매트릭스는 SUPERDEX 겔 여과 매트릭스(GE Healthcare), 예컨대 SUPERDEX 200 겔 여과 매트릭스이다. 겔 여과 매트릭스의 분획화 범위는 약 5 kDa 내지 약 5000 kDa, 약 10 kDa 내지 약 1500 kDa, 또는 약 10 kDa 내지 약 600 kDa일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에서 채택된 겔 여과 매트릭스의 분획화 범위는 약 10 kDa 내지 약 600 kDa이다.
완전 조립된 항체를 절반 항체로부터 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피에 대한 이동상은 중성 pH 및 항온에서 온도-반응성 단백질 A 수지로부터 Fc 영역-함유 단백질을 용출하기 위한 본원에서 기재된 임의의 용출 완충액일 수 있다. 소정 구현예에서, 이동상은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 무질서유발제, 당 알코올, 비극성 아미노산, 및 염기성 아미노산을 포함한다. 이동상은 일반적으로 약 6.5 내지 약 7.5의 pH의 완충 용액일 것이다. 일부 구현예에서, 이동상의 pH는 약 6.8 내지 약 7.5이다. 다른 구현예에서, 이동상의 pH는 약 7.2 내지 약 7.5이다. 하나의 특정 구현예에서, 이동상의 pH는 약 7.0 내지 약 7.4이다. 상기 pH 범위에서 완충작용을 하는 적합한 완충액 및 농도는 상세히 상술되어 있다. 일부 구현예에서, 이동상은, 예를 들어 약 15 mM 내지 약 100 mM 농도로 HEPES 완충액을 포함한다. 다른 구현예에서, 이동상은, 예를 들어 약 15 mM 내지 약 50 mM의 농도로 트리스 완충액을 포함한다.
이동상에서 사용되는 무질서유발제는 임의의 상술된 농도의 임의의 무질서유발제일 수 있다. 예를 들면, 이동상에서의 무질서유발제는 요소, 구아니디늄 클로라이드, 나트륨 티오시아네이트, 칼륨 티오시아네이트, 또는 암모늄 티오시아네이트일 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 이동상은 무질서유발제로서 요소를 포함한다. 이러한 구현예에서, 요소는 약 2 M 내지 약 4.5 M의 농도로 이동상에 존재한다. 일부 구현예에서, 이동상은 3 M 내지 약 4.2 M의 농도로 요소를 포함한다. 다른 구현예에서, 요소는 약 4 M의 농도로 이동상에 존재한다.
이동상은 또한 바람직하게는 당 알코올을 포함하며, 이는 용출 완충액에 포함될 임의의 상술된 당 알코올일 수 있다. 일부 구현예에서, 이동상은 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 또는 글리세롤을 당 알코올로서 포함한다. 하나의 구현예에서, 이동상에서의 당 알코올은 소르비톨이다. 또 다른 구현예에서, 이동상에서의 당 알코올은 만니톨이다. 당 알코올은 선택된 특정 당 알코올에 따라 약 1 M 내지 약 4.5 M, 약 1.5 M 내지 약 4 M, 또는 약 2 M 내지 약 2.5 M의 농도로 이동상에 존재할 수 있다. 소정 구현예에서, 이동상은, 예를 들어 약 1 M 내지 약 4.5 M, 보다 바람직하게는 약 2 M 내지 약 2.5 M의 농도로 소르비톨을 포함한다. 하나의 구현예에서, 이동상은 약 2.2 M의 농도로 소르비톨을 포함한다.
소정 구현예에서, 이동상은 하나 이상의 아미노산, 예컨대 본 발명의 용출 완충액에 포함될 상술된 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 이동상은 염기성 아미노산, 비극성 아미노산, 또는 염기성 아미노산과 비극성 아미노산 모두를 추가로 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 이동상은 히스티딘, 라이신, 오르니틴, 및 아르기닌으로부터 선택된 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 아르기닌을 포함한다. 다른 구현예에서, 이동상은 라이신을 포함한다. 염기성 아미노산은 약 0.1 M 내지 약 1.5 M, 약 0.25 M 내지 약 1 M, 또는 약 0.3 M 내지 약 0.8 M의 농도로 이동상에 존재할 수 있다. 소정 구현예에서, 이동상은 약 0.5 M의 농도로 염기성 아미노산(예컨대 아르기닌)을 포함한다.
일부 구현예에서, 이동상은 알라닌, 시스테인, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 및 발린으로부터 선택된 비극성 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 이동상은 프롤린을 포함한다. 비극성 아미노산은 약 0.1 M 내지 약 1.5 M, 약 0.25 M 내지 약 1 M, 또는 약 0.3 M 내지 약 0.8 M의 농도로 이동상에 존재할 수 있다. 소정 구현예에서, 이동상은 약 0.5 M의 농도로 비극성 아미노산(예컨대 프롤린)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 적어도 하나의 염기성 아미노산 및 적어도 하나의 비극성 아미노산을 포함한다. 이러한 구현예에서, 염기성 아미노산 및 비극성 아미노산은 동일한 농도로 이동상에 존재할 수 있다. 예를 들어, 염기성 아미노산 및 비극성 아미노산은 각각 약 0.25 M 내지 약 1 M, 보다 바람직하게는 약 0.3 M 내지 약 0.8 M의 농도로 이동상에 존재할 수 있다. 소정 구현예에서, 염기성 아미노산 및 비극성 아미노산은 각각 약 0.5 M의 농도로 이동상에 존재한다. 하나의 구현예에서, 이동상은 아르기닌 및 프롤린을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이동상은 라이신 및 프롤린을 포함한다.
일부 구현예에서, 전체 항체를 절반 항체로부터 분리하기 위해 크기 배제 크로마토그래피-기반 방법에서 채택되는 이동상은 하나 이상의 염, 예컨대 본 발명의 용출 완충액에 포함될 상술된 임의의 염을 추가로 포함할 수 있다. 소정 구현예에서, 이동상은 나트륨 클로라이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 이동상은 칼륨 클로라이드를 포함한다. 염은 약 0.1 M 내지 약 1 M, 약 0.25 M 내지 약 0.8 M, 약 0.5 M 내지 약 1 M, 또는 약 0.5 M 내지 약 0.8 M의 농도로 이동상에 포함될 수 있다. 하나의 구현예에서, 염(예컨대 나트륨 클로라이드)은 약 0.75 M의 농도로 이동상에 존재한다.
소정 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용된 이동상은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 약 5 mM 내지 약 200 mM 완충액, 약 0.4 M 내지 약 5 M 무질서유발제, 약 1 M 내지 약 4.5 M 당 알코올, 약 0.1 M 내지 약 1.5 M 비극성 아미노산, 약 0.1 M 내지 약 1.5 M 염기성 아미노산, 및 약 0.1 M 내지 약 1 M 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 가지며 약 15 mM 내지 약 100 mM 완충액, 약 2 M 내지 약 4.5 M 무질서유발제, 약 1 M 내지 약 4.5 M 당 알코올, 약 0.25 M 내지 약 1 M 비극성 아미노산, 약 0.25 M 내지 약 1 M 염기성 아미노산, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 염을 포함한다. 다른 구현예에서, 이동상은 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 가지며 약 15 mM 내지 약 100 mM 완충액, 약 2 M 내지 약 4.5 M 무질서유발제, 약 2 M 내지 약 2.5 M 당 알코올, 약 0.25 M 내지 약 1 M 비극성 아미노산, 약 0.25 M 내지 약 1 M 염기성 아미노산, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 염을 포함한다. 임의의 상술된 이동상 조성물에 있어서, 완충액은 HEPES 또는 트리스일 수 있고, 무질서유발제는 요소 또는 구아니디늄 클로라이드일 수 있고, 당 알코올은 소르비톨 또는 만니톨일 수 있고, 비극성 아미노산은 프롤린일 수 있고, 염기성 아미노산은 아르기닌 또는 라이신일 수 있고, 염은 나트륨 염, 예컨대 나트륨 클로라이드일 수 있다. 예를 들어, 소정 구현예에서, 이동상은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 15 mM 내지 약 100 mM HEPES, 약 2 M 내지 약 4.5 M 요소, 약 1 M 내지 약 4.5 M 소르비톨, 약 0.25 M 내지 약 1 M 프롤린, 약 0.25 M 내지 약 1 M 아르기닌, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 이동상은 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 가지며 약 20 mM 내지 약 75 mM HEPES, 약 3 M 내지 약 4.2 M 요소, 약 2 M 내지 약 2.5 M 소르비톨, 약 0.3 M 내지 약 0.8 M 프롤린, 약 0.3 M 내지 약 0.8 M 아르기닌, 및 약 0.5 M 내지 약 1 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 하나의 구현예에서, 이동상은 약 7.2의 pH를 가지며 약 25 mM HEPES, 약 4 M 요소, 약 2.2 M 소르비톨, 약 0.5 M 프롤린, 약 0.5 M 아르기닌, 및 약 0.75 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이동상은 약 7.2의 pH를 가지며 약 50 mM HEPES, 약 4 M 요소, 약 2.2 M 소르비톨, 약 0.5 M 프롤린, 약 0.5 M 아르기닌, 및 약 0.75 M 나트륨 클로라이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 이동상은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 15 mM 내지 약 100 mM 트리스, 약 2 M 내지 약 4.5 M 요소, 약 1 M 내지 약 4.5 M 소르비톨, 약 0.25 M 내지 약 1 M 프롤린, 약 0.25 M 내지 약 1 M 아르기닌, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 이동상은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 15 mM 내지 약 100 mM HEPES, 약 2 M 내지 약 4.5 M 요소, 약 1 M 내지 약 4.5 M 만니톨, 약 0.25 M 내지 약 1 M 프롤린, 약 0.25 M 내지 약 1 M 아르기닌, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이동상은 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 15 mM 내지 약 100 mM 트리스, 약 2 M 내지 약 4.5 M 요소, 약 1 M 내지 약 4.5 M 만니톨, 약 0.25 M 내지 약 1 M 프롤린, 약 0.25 M 내지 약 1 M 아르기닌, 및 약 0.25 M 내지 약 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함한다.
겔 여과 매트릭스를 통한 이동상의 유속은 항체 및 이의 절반 항체 형태 간 분리를 추가 증강시키기 위해 조정될 수 있다. 실시예 5에 기재된 바와 같이, 이동상의 유속 증가는 완전 조립된 항체 및 절반 항체 간 분리 효율의 손실을 일으켰다. 따라서, 소정 구현예에서, 더 느린 유속이 바람직하다. 일부 구현예에서, 이동상의 유속은 약 0.01 ㎖/분 내지 약 0.2 ㎖/분의 유속으로 겔 여과 매트릭스에 적용된다. 다른 구현예에서, 이동상의 유속은 약 0.02 ㎖/분 내지 약 0.06 ㎖/분의 유속으로 겔 여과 매트릭스에 적용된다.
항체 및 이의 절반 항체 형태를 포함하는 용액이 본원에서 기재된 이동상으로 겔 여과 매트릭스를 통해 이동되는 경우, 용출 분획이 수집된다. 분획의 단백질 함량은 UV 흡광도를 사용하여, 예컨대 280 nm에서 모니터링될 수 있고, 완전 조립된 항체를 포함하는 용출 분획이 수집될 수 있는 반면, 더 높은 분자량의 응집물 및 절반 항체를 함유하는 분획은 폐기될 수 있다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 크기 배제 크로마토그래피가 본 발명의 방법에 따라 수행되는 경우, 항체 및 다른 더 고분자량의 오염물질의 응집물이 겔 여과 매트릭스로부터 먼저 용출된 후, 완전 조립된 항체, 이어서 절반 항체가 용출된다. 용출 분획으로부터의 샘플은 완전 조립된 항체에 대한 분획의 농축 및 절반 항체의 제거를 확인하기 위해 실시예 5에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE 및/또는 분석용 SE-HPLC에 의해 분석될 수 있다.
항체를 절반 항체로부터 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피-기반 방법(예컨대 겔 여과 크로마토그래피-기반 방법)은 하나 이상의 정제 절차 또는 다른 단위 공정 후 수행될 수 있다. 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피-기반 방법은 항체, 특히 다중-특이적 이종이량체 항체에 대한 정제 공정에서 제2 또는 제3 연마 크로마토그래피일 수 있다. 일부 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피-기반 방법은 단백질 A 친화도 크로마토그래피 정제 단계에 이어 수행된다. 따라서, 항체 및 이의 절반 항체 형태를 함유하는 용액은 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용출액 풀 또는 유출액 스트림이다. 단백질 A 크로마토그래피는 통상적인 단백질 A 크로마토그래피일 수 있다. 대안적으로, 단백질 A 크로마토그래피는 본원에서 기재된 단백질 A 크로마토그래피 방법일 수 있다. Fc 영역-함유 단백질, 예컨대 항체를 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 제거하기 위해 본 발명의 방법에서 채택된 용출 완충액이 겔 여과 크로마토그래피-기반 방법에서 사용된 이동상과 동일한 조성을 가지므로, 이들 두 정제 절차는 순차적으로 사용될 수 있다. 따라서, 소정 구현예에서, 본 발명은 (i) 항체가 온도-반응성 단백질 A 물질에 결합하는 온도에서 항체 및 하나 이상의 불순물(예컨대 이의 절반 항체 형태)을 포함하는 용액을 물질과 접촉시키는 단계; (ii) 약 35℃ 미만의 온도에서 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며 무질서유발제, 당 알코올, 비극성 아미노산, 및 염기성 아미노산을 포함하는 용출 완충액으로 물질로부터 항체를 용출하는 단계; (iii) 이동상으로서 용출 완충액을 사용하여 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액을 겔 여과 매트릭스와 접촉시키는 단계; 및 (iv) 항체를 포함하는 겔 여과 매트릭스로부터 용출 분획을 수집하는 단계를 포함하는 항체의 정제 방법을 제공한다. 소정 구현예에서, 정제될 항체는 다중-특이적 이종이량체 항체이다. 온도-반응성 단백질 A 크로마토그래피 단계 및 겔 여과 크로마토그래피 단계는 온도-반응성 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용출액 스트림이 임의의 개재하는 보유 탱크 없이 겔 여과 매트릭스 상으로 직접 로딩되도록 하는 연속 방식으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 세제 또는 UV 바이러스 불활성화 단계가 선택적으로 온도-반응성 단백질 A 크로마토그래피 단계 및 겔 여과 크로마토그래피 단계 간에 포함될 수 있다.
수행된 실험 및 달성된 결과를 포함하는 하기 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되며 첨부되는 청구범위의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1. IgG-scFv 결합 단백질의 정제
상기 실시예는 통상적인 단백질 A 크로마토그래피 또는 본 발명의 친화도 크로마토그래피 방법을 사용하는, Fc 영역-함유 단백질의 한 유형인 IgG-scFv 결합 단백질의 정제를 기재한다. IgG-scFv 결합 단백질은 2개의 단일쇄 가변 단편(scFv)을 포함하며, 각각 제2 항체의 중쇄의 카복시-말단으로 펩타이드 링커를 통해 융합된, 제1 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유한다. 생성 분자는 면역글로불린 Fc 영역의 아미노 말단 측에 위치하는 제1 표적에 대한 2개의 항원 결합 도메인 및 Fc 영역의 카복실 말단 측에 위치하는 제2 표적에 대한 2개의 항원 결합 도메인을 갖는 4가 결합 단백질이다. IgG-scFv의 단량체 형태를 도 1에 나타낸다.
비교 목적을 위해, IgG-scFv 결합 단백질을 통상적인 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 세포 및 세포 파편을 침강시키기 위해 IgG-scFv 결합 단백질을 발현하는 세포를 함유하는 세포 배양 배지 100~250 ㎖로 15분 동안 4℃에서 저속 원심분리(600 rpm)를 거쳤다. 생성된 청정화 상청액 용액을 0.22마이크론 필터에 통과시켜 미립자 및 가용성 응집물을 제거하였다. 청정화 여과 용액을 4℃ 온도에서 1 ㎖/분의 유속으로 MabSelect SuRe™ 수지(GE Healthcare)를 함유하는 컬럼 상으로 로딩하였다. 컬럼을 pH 7.2에서 0.5 M NaCl 함유 포스페이트 완충 식염수 용액으로 세척한 후, 결합된 IgG-scFv 결합 단백질을 pH 2.7 및 4℃ 온도에서 174 mM(1%) 아세트산 용액을 사용하여 통상적인 단백질 A 수지로부터 용출하였다. 용출액 풀의 샘플을 Superdex 200 분석용 겔 여과 컬럼을 사용하여 크기 배제 - 초고성능 액체 크로마토그래피(SE-UPLC)에 의해 분석하였다. 4개의 독립 실험의 결과를 도 2에 나타낸다. 하나의 실험에서, 단백질을 pH 7.2로의 중화 없이 저 pH 아세트산 완충액으로 용출하였다(도 2에서의 상부 패널). 두 번째 실험에서, 단백질을 저 pH 아세트산 완충액으로 용출하고 pH 7.2로 즉시 중화하였다(도 2에서의 두 번째 패널). 세 번째 실험에서, 단백질을 저 pH 아세트산 완충액으로 용출하고 중화 없이 저 pH 아세트산 완충액 중 8주 동안 보관하였다(도 2에서의 세 번째 패널). 네 번째 실험에서, 단백질을 저 pH 아세트산 완충액으로 용출하고 저 pH 아세트산 완충액 중 8주 동안 보관한 후 pH 7.2로 중화하였다(도 2에서의 하부 패널).
SE-UPLC 프로필로 나타낸 바와 같이, IgG-scFv 결합 단백질은 크로마토그램에서 단량체 피크(검은색 별로 표시됨) 전에 용출되는 여러 피크(검은색 화살표로 표시됨)에 의해 입증된 바와 같이 통상적인 단백질 A 친화도 컬럼으로부터의 저 pH 용출 동안 높은 응집 경향성을 갖는다. 산 노출 및 저 pH에서 중성 pH로의 pH 점프는 둘 다 IgG-scFv 결합 단백질의 응집을 유도하며, 산 노출 단독에 비해 pH 점프가 더 큰 유해 효과를 갖는다. 통상적인 단백질 A 컬럼의 로딩 및 용출을 또한 실온에서 수행하였고, 도 2에 나타낸 것과 유사한 결과를 수득하였다(데이터는 나타내지 않음).
두 번째 시리즈의 실험에서, 컬럼의 온도를 실온보다 높게 상승시키지 않고 온도-반응성 단백질 A 수지로부터 결합 단백질의 용출을 허용한 특정 용출 완충액 및 온도-반응성 단백질 A 수지를 사용하여 IgG-scFv 결합 단백질을 정제하였다. 온도-반응성 단백질 A(TR-ProA) 컬럼을 제조하기 위해, 대략 25 ㎖의 현탁된 TR-ProA 수지(Byzen Pro®, Nomadic Bioscience Co., LTD.)를 15 ㎖ 컬럼에 15 ㎖의 최종 부피까지 충전하였다. 컬럼을 5배 컬럼 부피의 용액 A(포스페이트 완충 식염수(PBS), pH 7.2)로 세척하였다. 이어서 컬럼을 용액 B(0.5 M NaCl 함유 PBS)로 세척한 후 10배 컬럼 부피의 물로 헹구었다. 이어서 헹군 컬럼을 pH 7.2에서 25 또는 50 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 함유하는 15배 컬럼 부피의 용출 완충액으로 세척하였다. 이어서 컬럼을 용액 A로 평형화하였다.
IgG-scFv 결합 단백질을 함유하는 다양한 부피(10 ㎖ ~ 250 ㎖)의 청정화 여과 배양 배지를 4℃에서 1 ㎖/분의 유속으로 TR-ProA 컬럼 상으로 로딩하였다. 10배 컬럼 부피의 용액 B로 세척한 후, 결합된 IgG-scFv 결합 단백질을 4℃ 또는 실온에서 5 내지 10배 컬럼 부피의 용출 완충액으로 용출하였다. 용출 후, 컬럼을 제조업체의 지침에 따라 재생시켰다. 용출액 풀의 샘플을 Superdex 200 분석용 겔 여과 컬럼을 사용하여 SE-UPLC에 의해 분석하였다. 용출을 4℃에서 수행한 3개의 독립 실험 결과를 도 3에 나타낸다. 하나의 실험에서, 단백질을 4℃에서 용출 완충액으로 용출하고 37℃에서 7일 동안 보관 후 SE-UPLC 분석하였다(도 3에서의 상부 패널). 두 번째 실험에서, 단백질을 4℃에서 용출 완충액으로 용출하고 -80℃에서 7일 동안 보관 후 SE-UPLC 분석하였다(도 3에서의 두 번째 패널). 세 번째 실험에서, 단백질을 4℃에서 용출 완충액으로 용출하고 실온에서 7일 동안 보관 후 SE-UPLC 분석하였다(도 3에서의 세 번째 패널). 결과는 IgG-scFv 결합 단백질이 용출 완충액으로 저온에서 TR-ProA 수지로부터 단량체 형태로 용출될 수 있음을 나타낸다. 단량체 피크(검은색 별로 표시됨) 전에 겔 여과 분석용 컬럼으로부터 용출되는 피크의 부재에 의해 입증된 바와 같이 결합 단백질의 응집은 완전히 제거되었다. 또한, 용출 조건은 용출된 IgG-scFv 단백질의 후속 온도 안정성에 영향을 미치지 않았다. 7일 동안 다양한 온도에서 용출된 단백질을 보관한 결과, 용출된 단백질의 응집 또는 분해는 관찰되지 않았다.
용출을 4℃가 아닌 실온에서 수행한 것을 제외하고 상술된 것과 동일한 로딩 및 용출 조건을 이용하여, TR-ProA 컬럼을 사용하는 IgG-scFv 결합 단백질의 정제를 반복하였다. 로딩 전 청정화 배양 배지의 샘플, 로딩 동안 컬럼 플로우-쓰루 용액, 및 용출액 풀을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. SDS-PAGE 분석 결과는 IgG-scFv 결합 단백질이 용출액 풀에서 농축되며, 여러 오염 단백질이 제거되었음을 나타낸다(도 4a). TR-ProA 용출액 풀의 샘플을 또한 크기 배제-고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)에 의해 분석하였다. 도 4b에서 SE-HPLC 크로마토그램에 나타낸 바와 같이, TR-ProA 용출액 풀에 존재하는 IgG-scFv 결합 단백질의 99%는 검출 가능한 응집물이 없는 단량체 형태이다.
종합하면, 상기 실시예의 실험 결과는 Fc 영역-함유 단백질, 예컨대 다중쇄 IgG-scFv 결합 단백질이 전형적으로 통상적인 단백질 A 크로마토그래피로부터의 저 pH 용출로 일어나는 단백질의 응집을 감소시키거나 제거하기 위해 중성 pH에서 온도-반응성 단백질 A 수지로부터 용출될 수 있음을 나타낸다. 또한, 이 결과는 무질서유발제, 당 알코올, 및 아미노산을 포함하는 용출 완충액이, 전형적으로 온도-반응성 단백질 A 수지로부터 단백질을 용출하기 위해 요구되는 35℃ 초과로의 승온 없이, 온도-반응성 단백질 A 수지로부터 Fc 영역-함유 단백질의 용출을 허용함을 나타낸다.
실시예 2. 단일쇄 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 정제
상기 실시예는 통상적인 단백질 A 크로마토그래피 또는 본 발명의 친화도 크로마토그래피 방법을 사용하는 제2 유형의 Fc 영역-함유 단백질, 단일쇄 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질, 예컨대 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO2014144722에 기재된 단백질의 정제를 기재한다. 단일쇄 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질은 제2 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하는 제2 scFv 단편에 융합된, 제1 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하는 제1 scFv 단편, 및 제1 scFv 단편의 C-말단에 펩타이드 링커를 통해 그 N-말단에서 융합된 Fc 영역을 포함한다. 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 단량체 형태를 도 5에 나타낸다.
첫 번째 시리즈의 실험에서, 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질을 통상적인 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질을 발현하는 세포를 함유하는 세포 배양 배지를 15분 동안 4℃에서 600 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 0.22마이크론 필터로 여과하였다. 이어서 청정화 세포 배양 상청액을 MabSelect SuRe™ 단백질 A 수지(GE Healthcare)를 함유하는 컬럼 상으로 로딩하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 세척하였다. 컬럼의 세척 후, 결합된 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질을 pH 2.7에서 174 mM(1%) 아세트산 용액 또는 pH 3.7에서 33 mM(0.06%) 아세트산 용액을 사용하여 통상적인 단백질 A 수지로부터 실온에서 용출하였다. 용출액 풀의 샘플을 SE-HPLC에 의해 분석하였다.
도 6a는 174 mM(1%) 아세트산 용액이 용출 완충액으로서 사용된 경우 용출액 풀의 SE-HPLC 프로필을 나타내는 반면, 도 6b는 더 낮은 농도의 아세트산 용액이 용출 완충액으로서 사용된 경우 용출액 풀의 SE-HPLC 프로필을 나타낸다. 두 용출 조건 모두에서, 결합 단백질 단량체에 대한 피크(검은색 별로 표시됨)보다 짧은 체류 시간을 갖는 여러 피크(검은색 화살표로 표시됨)에 의해 입증된 바와 같이, 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 상당한 응집이 관찰되었다. 174 mM(1%) 아세트산 용액이 용출 완충액으로서 사용된 경우, 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 39%만 단량체 형태로 회수되었다. 용출 완충액 중 아세트산의 농도 감소가 결합 단백질의 단량체 형태의 회수를 개선하였으나, 용출액 풀 중 결합 단백질의 53%만 단량체 형태였고 상당한 응집이 여전히 관찰되었다. 따라서, 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질은 특히 통상적인 단백질 A 크로마토그래피를 위해 요구되는 전형적인 저 pH 용출 조건 하에 응집에 취약하다.
두 번째 시리즈의 실험에서, 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질을 온도-반응성 단백질 A 수지(Byzen Pro®, Nomadic Bioscience Co., LTD.) 및 실시예 1에 기재된 바와 같은 무질서유발제, 당 알코올, 비극성 아미노산, 및 염기성 아미노산을 포함하는 용출 완충액을 사용하여 정제하였다. 상기 용출 완충액은 보통 온도-반응성 단백질 A 수지로부터 단백질의 용출을 위해 요구되는 단계인 컬럼의 승온 없이 온도-반응성 단백질 A(TR-ProA) 수지로부터 결합 단백질의 용출을 허용하였다. 구체적으로, 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질을 함유하는 청정화 세포 배양 상청액을 1㎖/분의 유속 및 4℃ 온도에서 TR-ProA 컬럼 상으로 로딩하였다. 0.5 M NaCl을 함유하는 10배 컬럼 부피의 PBS로 세척한 후, 결합된 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질을 실온에서 5배 내지 10배 컬럼 부피의 용출 완충액 1 또는 용출 완충액 2로 용출하였다. 용출 완충액 1은 pH 7.2에서, 25 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 2.5 M 요소를 함유하였다. 용출 완충액 2는 pH 7.2에서, 25 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 함유하였다. 용출액 풀의 샘플을 SE-HPLC 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
도 7a는 실온에서 용출 완충액 1로 결합 단백질을 용출하여 생성된 용출액 풀의 SE-HPLC 프로필을 나타내는 반면, 도 7b는 실온에서 용출 완충액 2로 결합 단백질을 용출하여 생성된 용출액 풀의 SE-HPLC 프로필을 나타낸다. 두 프로필로부터 알 수 있듯이, 실시예 1에 기재된 IgG-scFv 결합 단백질로 수득된 결과와 유사하게, 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질은 30℃ 미만의 온도에서 두 용출 완충액으로 TR-ProA 수지로부터 실질적으로 단량체 형태로 용출될 수 있다. 두 용출 조건 모두에서, 저 pH 완충액으로 통상적인 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출로 생성되는 응집에 비해 Fv-Fc 결합 단백질의 응집이 유의미하게 감소되었다(도 6a 및 6b에서 검은색 화살표로 표시된 피크를 도 7a 및 7b에서의 피크와 비교한다). 또한, 도 7a에서의 프로필과 도 7b에서의 프로필의 비교는 2.5 M에서 4 M로의 용출 완충액 중 무질서유발제(예컨대 요소)의 농도 증가가 용출액 풀에서 회수된 단량체성 Fv-Fc 결합 단백질의 백분율을 75%에서 88%로 증가시켰고, 용출액 풀에 존재하는 응집된 결합 단백질의 양을 추가로 감소시켰음을 나타낸다. TR-ProA 수지 및 용출 완충액 2로의 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질의 정제 전에, 동안, 및 후에 샘플의 SDS-PAGE 분석 결과를 도 7c에 나타낸다. 이 결과는 Fv-Fc 결합 단백질이 용출액 풀에서 농축됨을 나타낸다.
상기 실시예에 기재된 실험 결과는 단일쇄 Fc 융합 단백질, 예컨대 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질이 통상적인 단백질 A 수지로부터 결합된 단백질을 용출하기 위해 요구되는 저 pH 조건 동안 응집하는 경향이 있음을 나타낸다. 결합 단백질의 이러한 응집은 온도-반응성 단백질 A 수지 및 무질서유발제, 당 알코올, 비극성 아미노산, 및 염기성 아미노산을 포함하는 용출 완충액을 채택하여 실질적으로 감소된다. 중요하게는, 용출 완충액 조성물은 35℃ 초과로의 승온 없이 결합 단백질이 실질적으로 단량체 형태로 온도-반응성 단백질 A 수지에서 제거될 수 있도록 한다.
실시예 3. 온도-반응성 단백질 A 수지로부터의 Fc 영역-함유 단백질의 용출을 위한 완충액
상기 실시예에 기재된 실험은 수지의 온도를 실온보다 높게 상승시키지 않고 상이한 용출 완충액이 온도-반응성 단백질 A(TR-ProA) 수지로부터 결합된 Fc 영역-함유 단백질을 제거하는 능력을 탐색하기 위해 설계되었다. 실시예 1에 기재된 바와 같은 IgG-scFv 결합 단백질 또는 실시예 2에 기재된 바와 같은 단일쇄 이중특이적 Fv-Fc 결합 단백질을 발현하는 세포로부터의 청정화된 세포 배양 상청액을 4℃에서 온도-반응성 단백질 A 수지(Byzen Pro®, Nomadic Bioscience Co., LTD.)의 컬럼 상으로 로딩하고 0.5 M NaCl을 함유하는 PBS 용액으로 세척하였다. 결합된 결합 단백질을 아래의 표 2에 기재된 용출 완충액 중 하나를 사용하여 4℃에서 컬럼으로부터 용출하였다. 용출액 풀에서 단량체로서 회수된 결합 단백질의 백분율을 SE-HPLC를 사용하여 결정하였다. 이 결과를 아래의 표 2에 나타낸다.
상이한 용출 완충액으로 TR-ProA 수지로부터의 용출 후 단량체성 결합 단백질의 회수
용출 완충액 번호 용출 완충액 조성 용출액 풀에서 결합 단백질 단량체%
1 25 mM HEPES, pH 7.2 0%
2 25 mM HEPES, 0.75 M NaCl, pH 7.2 5%
3 25 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.05 M 글루탐산, 2.2 M 소르비톨, pH 7.2 20%
4 25 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, pH 7.2 35%
5 25 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, pH 7.2 40%
6 25 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 4 M 요소, pH 7.2 90% 초과
7 0.1 M Trizma 염기, 0.1 M 아스코르브산, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 0.3 M NaCl, pH 7.2 0%
8 0.1 M Trizma 염기, 0.1 M 아스코르브산, 2.2 M 소르비톨, 0.5 M NaCl, pH 7.2 10%
9 0.1 M Trizma 염기, 0.174 M 아세트산, 2 M 프롤린, 0.6 M NaCl, pH 6.8 2%
10 0.1 M Trizma 염기, 0.174 M 아세트산, 0.5 M 티로신, 0.6 M NaCl, pH 7.0 12%
11 0.1 M 아스코르브산, 2 M 프롤린, 0.7 M NaCl, pH 6.9 20%
12 0.1 M 아세트산, 2 M 프롤린, 0.5 M 아르기닌, 0.6 M NaCl, pH 7.0 14%
13 0.174 M 아세트산, 2 M 프롤린, 0.15 M Trizma 염기, 0.5 M NaCl, pH 6.8 8%
14 0.1 M 아스코르브산, 0.1 M 비스-트리스, 1 M NaCl, pH 7.2 0%
15 0.1 M 아세트산, 0.1 M Trizma 염기, 0.5 M 프롤린, 0.5 M 아르기닌, 0.75 M NaCl, pH 6.8 2%
결과는 무질서유발제(예컨대 요소)의 도입이 단량체 형태의 결합 단백질의 용출 및 회수를 유의미하게 증강시킴을 나타낸다.
실시예 4. 모노클로날 항체의 정제
상기 실시예는 온도 반응성 단백질 A 수지를 사용하는 모노클로날 항체의 정제를 기재한다. 항체를 발현하는 세포로부터의 청정화 세포 배양 상청액을 4℃에서 온도-반응성 단백질 A 수지(Byzen Pro®, Nomadic Bioscience Co., LTD.)의 컬럼 상으로 로딩하고 0.5 M NaCl을 함유하는 PBS 용액으로 세척하였다. 결합된 항체를 20 mM HEPES, 2 M 구아니디늄 클로라이드, 및 2.2 M 소르비톨을 포함하고 7.2의 pH를 갖는 용출 완충액으로 4℃에서 컬럼으로부터 용출하였다. 용출액 풀의 샘플을 SE-HPLC에 의해 분석하였고 이 결과를 도 8a 및 8b에 나타낸다. 모노클로날 항체는 약 0.9의 몰 농도 비로 무질서유발제(예컨대 구아니디늄 클로라이드) 및 당 알코올(소르비톨)만을 포함하는 용출 완충액을 사용하여 저온에서 온도 반응성 단백질 A 수지로부터 용출시킬 수 있었다. 항체의 거의 90%가 용출액 풀에서 단량체 형태로 회수되었다.
실시예 5. 전체 항체로부터 절반 항체의 분리
절반 항체는 조립 불완전 또는 항체의 2개의 중쇄 폴리펩타이드 간 상호작용의 손상(예컨대 2개 중쇄의 힌지 영역들 사이의 폴리펩타이드간 디설파이드 결합 형성의 손상)으로 생성된다. 절반 항체는 일반적으로 단일 경쇄 폴리펩타이드 및 단일 중쇄 폴리펩타이드로 이루어진다. 요망되는 전체 항체를 함유하는 조제물로부터의 절반 항체의 제거는 몇몇 이유로 인해 중요하다. 절반 항체의 존재는 전체 항체 제품 농도를 감소시키고, 용량 재현성을 감소시키고, 제품 균일성을 감소시킨다. 또한, 절반 항체는 표적에 대한 결합에 있어서 전체 항체와 경쟁할 수 있고 전체 항체의 유효성을 감소시킬 수 있다.
절반 항체는 전체 항체와 유사한 특성을 가지므로, 전체 항체로부터 절반 항체를 분리하는 것이 어려울 수 있다. 예를 들면, 절반 항체 및 전체 항체는 모두 유사한 Fc 영역을 함유하며, 이에 따라 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 효과적으로 분리될 수 없다. 절반 항체는 전체 항체와 유사한 등전점, 축 비, 및 수력학적 반지름을 가지며, 이에 따라 이들 특징에 기반하는 분리 방법은 일반적으로 적합하지 않다. 또한, 절반 항체는 자가-연합하고 전체 항체와 연합하는 경향이 있어서 이의 제거를 더 어렵게 만든다.
절반 항체의 존재는 통상적인 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의한 정제 후에도, 항체, 특히 이종이량체 항체의 재조합 조제물에서 종종 관찰된다(도 9a 및 9b). 이종이량체 항체는 제1 표적에 결합하는 제1 항체로부터의 경쇄 및 중쇄 그리고 제2 표적에 결합하는 제2 항체로부터의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체이다. 따라서, 2개 종의 절반 항체, 즉 제1 표적에 결합하는 하나의 절반 항체 및 제2 표적에 결합하는 또 다른 절반 항체가 이러한 이중특이적 이종이량체 항체의 재조합 생산으로 생성될 수 있다. 절반 항체의 존재 및 수준은 이종이량체 항체의 상이한 재조합 생산 로트 별로 변할 수 있고(도 9a 및 9b), 절반 항체의 제거를 위해 요구되는 단계의 수 및 성질로 인해 완전 조립된 이종이량체 항체의 전체 수율은 상당히 낮을 수 있다(데이터는 나타내지 않음).
이중특이적 이종이량체 항체("이종이량체 항체 A")를 발현하는 세포를 함유하는 세포 배양 배지는 세포 및 세포 파편을 침강시키기 위해 15분 동안 4℃에서 저속 원심분리(600 rpm)를 거쳤다. 생성 청정화 상청액 용액을 0.22마이크론 필터에 통과시켜 미립자 및 가용성 응집물을 제거하였다. 청정화 여과 용액을 1 ㎖/분의 유속으로 4℃ 온도에서 MabSelect SuRe™ 수지(GE Healthcare)를 함유하는 컬럼 상으로 로딩하였다. 컬럼을 pH 7.2에서 0.5 M NaCl 함유 포스페이트 완충 식염수 용액으로 세척한 후, 결합된 항체를 pH 2.7 및 4℃ 온도에서 174 mM(1%) 아세트산 용액을 사용하여 통상적인 단백질 A 수지로부터 용출하였다. 용출액 풀 샘플을 SE-HPLC(도 10a) 및 SDS-PAGE(도 10b)에 의해 분석하였다. SE-HPLC 및 SDS-PAGE 분석에 의해 나타낸 바와 같이, 단백질 A 용출액 풀은 상당량(약 72%)의 절반 항체를 함유하였다.
단백질 A 용출액 풀에 잔류하는 절반 항체를 제거하기 위한 시도에서, 통상적인 조건 하에 수행된 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 단계를 평가하였다. 구체적으로, 단백질 A 용출액 풀을 1 ㎖/분의 유속으로 pH 7.0에서 포스페이트 완충 식염수를 포함하는 이동상을 사용하여 Superdex 200 분취용 겔 여과 컬럼 상으로 로딩하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 이들 조건 하에 수행된 SEC는 완전 조립된 이종이량체 항체를 절반 항체로부터 분리할 수 없었다. PBS-함유 이동상의 분취용 SEC 컬럼을 통한 유속의 0.01 ㎖/분만큼 낮은 유속으로의 감소는 분리를 개선하지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
실험을 반복하였으나, PBS를 포함하는 통상적인 이동상을 실시예 1에 기재된 고유한 용출 완충액과 유사한 조성을 갖는 이동상으로 대체하였다. 완전 조립된 이종이량체 항체 및 절반 항체를 포함하는 단백질 A 용출액 풀을 pH 7.2에서 50 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 이동상을 사용하여 Superdex 200 분취용 겔 여과 컬럼(2 × 80 ml) 상으로 로딩하였다. 분취용 겔 여과 컬럼으로부터의 용출 동안 3개의 개별 단백질 피크가 관찰되었다(도 12). 용출 동안 다양한 분획을 수집하고 분석용 SE-HPLC 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. SDS-PAGE 분석은 피크 2가 대부분 완전 조립된 항체를 포함하는 반면, 피크 3이 거의 절반 항체로 이루어짐을 드러내었다(도 13a 및 13b). 피크 1은 더 고분자량의 응집물에 대응하였다. 놀랍게도, SEC에서 상기 고유한 이동상의 사용은 완전 조립된 항체로부터 뿐만 아니라 더 고분자량의 응집물로부터 절반 항체의 분리를 허용하였다(도 14a~14c).
상술된 고유한 이동상을 사용하는 분취용 SEC 공정을 상이한 표적 항원에 대한 특이성을 갖는 2개의 다른 이중특이적 이종이량체 항체로 반복하였다. SEC 정제 전 이종이량체 항체 B 및 이종이량체 항체 C의 조제물은 둘 다 절반 항체 오염물질을 함유하였다(도 15a 및 16a). 그러나, pH 7.2에서 50 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 포함하는 이동상을 사용하는 SEC로의 정제 후, 요망되는 완전 조립된 이종이량체 항체만 잔류하도록 완전 조립된 이종이량체 항체가 절반 항체로부터 분리될 수 있었다(도 15b 및 16b).
또 다른 시리즈의 실험에서, SEC를 사용하는 절반 항체 분리의 효율에 대한 유속의 효과를 평가하였다. 재조합 이중특이적 이종이량체 항체의 조제물을 0.02 ㎖/분 내지 0.2 ㎖/분 범위의 유속으로 Superdex 200 분취용 겔 여과 컬럼(2 × 80 ml) 및 pH 7.2에서 50 mM HEPES, 0.75 M NaCl, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 2.2 M 소르비톨, 및 4 M 요소를 함유하는 이동상을 사용하여 SEC를 거쳤다(도 17a~17f). 결과는 절반 항체가 더 느린 유속에서 완전 조립된 항체로부터 보다 효율적으로 분리됨을 나타내며, 최적 분리는 약 0.02 ㎖/분 내지 약 0.06 ㎖/분의 유속에서 일어난다(도 17a~17f).
종합하면, 상기 실시예에 기재된 실험 데이터는 SEC 겔 여과 컬럼에서 무질서유발제, 당 알코올, 및 아미노산을 포함하는 이동상의 사용이 완전 조립된 항체로부터 절반 항체 오염물질 및 고분자량 응집물을 효율적으로 분리할 수 있음을 나타낸다. 상기 방법은 재조합 항체 조제물, 특히 다중-특이적 이종이량체 항체 조제물로부터 이들 문제 오염물질을 제거하기 위한, 강력한 1-단계 방법을 제공한다.
본원에서 논의되고 인용된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 개시된 발명은 이들이 변할 수 있으므로 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 물질에 제한되지 않음이 이해된다. 또한 본원에서 사용된 용어가 단지 특정 구현예를 설명하는 목적을 위한 것이며 첨부되는 청구범위의 범위를 제한하려는 것이 아님이 이해된다.
당업자는 본원에서 기재된 본 발명의 구체적 구현예에 대한 여러 균등부를 인식할 것이며, 또는 일상적 실험만을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등부는 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것이다.
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Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala 50 55 <210> 9 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 9 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Gly Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Gly Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala 50 55 <210> 10 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 10 Ala Asp Asn Lys Glu Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Gly Asn Glu Glu Gly Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala 50 55 <210> 11 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 11 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Thr 1 5 10 15 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Claims (116)

  1. Fc 영역을 포함하는 단백질의 정제 방법으로서,
    (a) 단백질이 온도-반응성 단백질 A 물질에 결합하는 온도에서 단백질 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 용액을 상기 물질과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 4℃ 내지 25℃의 온도에서 6.5 내지 7.5의 pH를 가지며 무질서유발제(chaotropic agent), 당 알코올, 비극성 아미노산, 및 염기성 아미노산을 포함하는 용출 완충액으로 상기 물질로부터 단백질을 용출하는 단계를 포함하며, 상기 단백질은 용액 중 하나 이상의 불순물로부터 정제되는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 다음 특징 중 하나 이상을 갖는, 방법:
    i) 무질서유발제 대 당 알코올의 몰 농도 비가 1.5 내지 2.5, 1.8 내지 2.2, 또는 0.5 내지 1.5임,
    ii) 용출 완충액은 하나 이상의 아미노산을 더 포함함,
    iii) 용출 완충액은 염기성 아미노산 및/또는 비극성 아미노산을 포함함, 및
    iv) 용출 완충액은 아르기닌 및 프롤린을 포함함.
  4. 제1항에 있어서, 무질서유발제가 요소, 구아니디늄 클로라이드, 나트륨 티오시아네이트, 칼륨 티오시아네이트, 또는 암모늄 티오시아네이트인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 요소가 2 M 내지 4.5 M의 농도, 또는 4 M의 농도로 존재하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 당 알코올이 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 또는 글리세롤인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 염기성 아미노산이 히스티딘, 라이신, 오르니틴, 또는 아르기닌이고/이거나, 비극성 아미노산이 알라닌, 시스테인, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 또는 발린인 방법.
  8. 제3항에 있어서, 염기성 아미노산이 히스티딘, 라이신, 오르니틴, 또는 아르기닌이고/이거나, 비극성 아미노산이 알라닌, 시스테인, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 또는 발린인 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    i) 용출 완충액이 염을 추가로 포함하거나,
    ii) 용출 완충액이 0.25 M 내지 0.8 M의 농도로 염을 추가로 포함하거나,
    iii) 용출 완충액이 나트륨 클로라이드를 추가로 포함하거나, 또는
    iv) 용출 완충액이 0.25 M 내지 0.8 M의 농도로 나트륨 클로라이드를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 용출 완충액이 2 M 내지 4.5 M 요소, 1 M 내지 4.5 M 소르비톨, 0.25 M 내지 1 M 아르기닌, 0.25 M 내지 1 M 프롤린, 및 0.25 M 내지 0.8 M 나트륨 클로라이드를 포함하거나, 또는 용출 완충액이 4 M 요소, 2.2 M 소르비톨, 0.5 M 아르기닌, 0.5 M 프롤린, 및 0.75 M 나트륨 클로라이드를 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 단백질을 용출하는 단계가 4℃ 내지 25℃의 온도, 4℃ 내지 6℃, 또는 20℃ 내지 25℃의 온도에서 수행되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 단백질 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 용액이 생산 바이오리액터로부터의 수확물, 또는 세포 배양 상청액 또는 세포 용해물인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 용출 완충액이 7.0 내지 7.4의 pH를 갖는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 당 알코올이 1 M 내지 4.5 M의 농도, 또는 2 M 내지 2.5 M의 농도로 존재하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, Fc 영역을 포함하는 단백질이 항체, Fc 융합 단백질, 또는 적어도 하나의 단일쇄 Fv 단편을 포함하는 Fc 융합 단백질인 방법.
  16. 제1항에 있어서, Fc 영역을 포함하는 단백질이 포유류 세포 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 재조합적으로 생산되는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 온도-반응성 단백질 A 물질이 고상, 비드, 수지, 겔, 필름, 또는 입자에 고정되는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 염기성 아미노산 및/또는 비극성 아미노산이 0.25 M 내지 1 M의 농도, 또는 0.5 M의 농도로 존재하는 방법.
  19. 제3항에 있어서, 상기 염기성 아미노산 및/또는 비극성 아미노산이 0.25 M 내지 1 M의 농도, 또는 0.5 M의 농도로 존재하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 하나 이상의 불순물이 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 세포 배양 단백질, 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
  21. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 10℃ 이하의 온도, 또는 1℃ 내지 6℃의 온도에서 수행되는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 단백질을 온도-반응성 단백질 A 물질로부터 용출하기 전에 결합된 단백질을 갖는 상기 물질을 하나 이상의 세척 용액 또는 0.5 M 내지 2 M의 농도로 나트륨 클로라이드를 포함하는 세척 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 온도-반응성 단백질 A 물질로부터의 용출액 중 Fc 영역-함유 단백질의 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%가 단량체 형태인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 용출된 Fc 영역-함유 단백질이 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 거치는 단계를 추가로 포함하거나, 또는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합식 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 금속 친화도 크로마토그래피, 및 이의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 거치는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 용출된 Fc 영역-함유 단백질이 6.5 내지 7.5의 pH를 가지며 무질서유발제, 당 알코올, 비극성 아미노산, 및 염기성 아미노산을 포함하는 이동상을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피를 거치는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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