JP2022120138A - Ｆｃ含有タンパク質を精製する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】従来のプロテインＡクロマトグラフィー法に関連するタンパク質の構造的完全性に対する影響を最小限に抑えるか又は低減する、Ｆｃ領域含有タンパク質の効率的な精製方法を提供する。【解決手段】Ｆｃ領域含有タンパク質を温度応答性プロテインＡ樹脂に吸着させる工程と、カオトロピック試薬、糖アルコール、及び少なくとも１つのアミノ酸を含む溶出緩衝液により、３５℃未満の温度で樹脂からタンパク質を溶出する工程とを含む、凝集タンパク質の低下したレベルをもたらす精製方法に関する。溶出緩衝液を使用して、完全に組み立てられた抗体をそのハーフ抗体形態から分離する方法も記載される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１６年７月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／３６５，９４３号明細書の利益を主張するものであり、その出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

電子的に提出されたテキストファイルの説明
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を包含し、その配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１７年７月２０日に作成された、コンピュータが読むことができるフォーマットの配列表のコピーは、名称がＡ－２０３６－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５であり、サイズが８．８１キロバイトである。

本発明は、バイオ医薬品製造の分野に関する。特に、本発明は、精製操作中のＦｃ領域含有タンパク質の凝集を低減又は防止する方法に関する。本発明は又はフ抗体など、除去が困難な混入物から抗体を分離する方法に関する。

凝集は、依然として、遺伝子組換えによって作られた生物製剤、特に多重特異性抗原結合タンパク質などの免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質の製造における主要な問題のままである。タンパク質凝集体は、それらの強い免疫原性のために治療薬において許容することができない（Ｍａｇｇｉｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｖｏｌ．３（２）：４５－５３，２０１２；Ｓａｕｅｒｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３１（２）：５３－５９，２０１０）。タンパク質の凝集は、培地の十分なエアレーションに必要な細胞培養物の激しい振盪の結果として、タンパク質の組換え発現中に生じ得る（Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｒｅｙ ａｎｄ Ｌａｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０８（７）：１４９４－１５０８，２０１１）。さらに、多くのタンパク質は、アンフォールディングしやすく、その後、極端なｐＨ条件（すなわちｐＨ＞９．０又はｐＨ＜４．５）に曝露されると凝集する。免疫グロブリンＦｃ領域を含むタンパク質を精製するための典型的な方法は、プロテインＡアフィニティー樹脂でタンパク質を捕捉し、その後、低ｐＨの酸性緩衝液（例えば、ｐＨ２．７～３．７）で樹脂から溶出することを必要とする（Ｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４９（４３）：９３２８－９３３８，２０１０；Ｅｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．６６：９５４－９６２，２００７）。低ｐＨ溶出は、タンパク質の凝集を誘導し、収率を低下させるだけでなく、回収された非凝集タンパク質の長期安定性を損なうこともある。

プロテインＡ樹脂からの低ｐＨ溶出の望ましくない影響を回避するために、温度応答性プロテインＡ樹脂が従来のプロテインＡ樹脂の代替として開発された。この新しい樹脂は、１０℃未満の温度で免疫グロブリンのＦｃ領域に結合するが、高温（例えば、４０℃）でＦｃ領域に対する親和性を失う、プロテインＡの変異体型から構成される（Ｋｏｇｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，Ｖｏｌ．１３０５：１４９－１５３，２０１３）。温度応答性プロテインＡ樹脂は、中性ｐＨでカラムを単に加熱することによって樹脂からＦｃ領域含有タンパク質を溶出することを可能にするため、初期には非常に熱心に受け入れられた（Ｋｏｇｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，Ｖｏｌ．１３０５：１４９－１５３，２０１３）。温度応答性プロテインＡ樹脂によるタンパク質の精製は、安定な分子を生成するが、このアプローチは、カラムローディングから溶出へ３０°以上のカラム温度のシフトを必要とし、したがってローディング工程と溶出工程との間に有意な遅延時間を生じるため、実用的ではない。カラム温度の操作に必要とされる時間の遅延は、精製操作に膨大な量のサイクル時間を追加し、それによりこのアプローチを大規模製造プロセス及び発見段階中のタンパク質の大きいパネルのハイスループット精製の両方にとって望ましくないものにする。さらに、温度応答性プロテインＡ樹脂から溶出されるタンパク質の安定性に与える大きい温度の振れの影響は、依然として未知のままである。

Ｍａｇｇｉｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｖｏｌ．３（２）：４５－５３，２０１２ Ｓａｕｅｒｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３１（２）：５３－５９，２０１０ Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｒｅｙ ａｎｄ Ｌａｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０８（７）：１４９４－１５０８，２０１１ Ｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４９（４３）：９３２８－９３３８，２０１０ Ｅｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．６６：９５４－９６２，２００７ Ｋｏｇｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，Ｖｏｌ．１３０５：１４９－１５３，２０１３

したがって、従来のプロテインＡクロマトグラフィー法に関連するタンパク質の構造的完全性に対する影響を最小限に抑えるか又は低減する、Ｆｃ領域含有タンパク質の効率的な精製方法が当該技術分野で必要とされている。

本発明は、中性ｐＨ及び一定温度において、温度応答性プロテインＡ樹脂からの、結合されたＦｃ領域含有タンパク質の溶出を可能にする緩衝組成物の開発に部分的に基づいている。温度応答性プロテインＡ樹脂を本明細書に記載の溶出緩衝液と組み合わせて使用する精製スキームは、凝集タンパク質のレベルの低下をもたらし、それによって下流の精製工程の数を減少させる。さらに、そのような精製方法は、本明細書に記載の溶出緩衝液による溶出が温度に依存しない様式で行われ得るため、工業的製造のために容易に拡張可能である。

したがって、本発明は、Ｆｃ領域を含むタンパク質を精製する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、タンパク質及び１又は複数の不純物を含む溶液を、温度応答性プロテインＡ材料と、タンパク質がこの材料に結合する温度で接触させる工程と、本明細書中に記載の溶出緩衝液により、約３５℃未満の温度で材料からタンパク質を溶出する工程とを含み、タンパク質は、溶液中の１又は複数の不純物から精製される。

特定の実施形態において、本発明はまた、Ｆｃ領域を含むタンパク質を精製中の凝集を低減する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、タンパク質を、温度応答性プロテインＡ材料に、タンパク質がこの材料に結合する温度で吸着させる工程と、本明細書中に記載の溶出緩衝液により、約３５℃未満の温度で材料からタンパク質を溶出する工程とを含み、溶出液中の凝集形態のＦｃ領域含有タンパク質の量は、従来のプロテインＡ材料からの溶出液中の量未満である。いくつかの実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料からの溶出液中の凝集形態のＦｃ領域含有タンパク質の量は、３０％未満である。関連するいくつかの実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料からの溶出物中のＦｃ領域含有タンパク質の少なくとも７０％は、単量体型である。

本発明の方法において使用される溶出緩衝液は、中性範囲のｐＨ（例えば、約６．５～約７．５のｐＨ）を有し、かつカオトロピック試薬及び糖アルコールを含む。いくつかの実施形態では、カオトロピック試薬及び糖アルコールは、約０．４～約４．５のモル濃度比で存在する。一実施形態では、糖アルコールに対するカオトロピック試薬のモル濃度比は、約１．１～約１．８である。溶出緩衝液中のカオトロピック試薬の濃度は、使用される特定のカオトロピック試薬に応じて約０．４Ｍ～約５Ｍであり得る。いくつかの実施形態では、カオトロピック試薬は、尿素、塩化グアニジン、又はチオシアン酸塩（例えば、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、又はチオシアン酸アンモニウム）であり得る。特定の実施形態では、カオトロピック試薬は、尿素である。他の実施形態では、カオトロピック試薬は、塩化グアニジンである。溶出緩衝液中の糖アルコールの濃度は、約１Ｍ～約４．５Ｍであり得る。特定の実施形態では、糖アルコールは、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、又はグリセロールである。一実施形態では、糖アルコールは、ソルビトールである。一実施形態では、糖アルコールは、マンニトールである。

いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用される溶出緩衝液は、１又は複数のアミノ酸をさらに含む。アミノ酸は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、もしくはバリンなどの無極性アミノ酸、及び／又はヒスチジン、リシン、オルニチン、もしくはアルギニンなどの塩基性アミノ酸であり得る。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも１つの無極性アミノ酸及び少なくとも１つの塩基性アミノ酸を含む。例えば、一実施形態では、溶出緩衝液は、プロリン及びアルギニンを含む。溶出緩衝液中のアミノ酸の濃度は、約０．２５Ｍ～約１Ｍであり得る。

様々な実施形態において、溶出緩衝液は、ナトリウム塩又は塩化物塩などの塩をさらに含み得る。塩は、溶出緩衝液中に約０．１Ｍ～約１Ｍの濃度で存在し得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液に含まれる塩は、塩化ナトリウムである。

特定の実施形態では、本発明の方法で使用される溶出緩衝液は、約２Ｍ～約４．５Ｍのカオトロピック試薬、約１Ｍ～約４．５Ｍの糖アルコール、約０．２５Ｍ～約１Ｍの塩基性アミノ酸、約０．２５Ｍ～約１Ｍの無極性アミノ酸、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩を含む。いくつかのそのような実施形態では、カオトロピック試薬は、尿素であり、糖アルコールは、ソルビトールであり、塩基性アミノ酸は、アルギニンであり、無極性アミノ酸は、プロリンであり、及び塩は、塩化ナトリウムである。

本発明の方法による温度応答性プロテインＡ材料からのＦｃ領域含有タンパク質の溶出は、約１℃～約２５℃の温度で行われ得る。いくつかの実施形態では、タンパク質の溶出は、タンパク質が温度応答性プロテインＡ材料に吸着又は結合された同じ又は類似の温度で行われる。例えば、一実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質の溶出は、約１０℃未満の温度、例えば約１℃～約６℃の温度で行われる。他の実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質の溶出は、室温、例えば約２０℃～約２５℃で行われる。

本明細書に記載の方法に従って精製することができるＦｃ領域含有タンパク質としては、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、及び多重特異性抗原結合タンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質は、抗体である。他の実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質は、少なくとも１つの一本鎖Ｆｖフラグメントを含むＦｃ融合タンパク質などのＦｃ融合タンパク質である。Ｆｃ領域含有タンパク質は、例えば、哺乳動物細胞において組換え技術によって産生され得る。このような実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質は、細胞培養上清又は細胞溶解物、例えばバイオリアクターからの回収操作の結果として生成されるものから精製され得る。

本発明はまた、サイズ排除クロマトグラフィーが、移動相としてカオトロピック試薬、糖アルコール、及び少なくとも１つのアミノ酸を含む緩衝液と共に使用される場合、完全に組み立てられた抗体をハーフ抗体混入物から効果的に分離することができるという発見に部分的に基づいている。したがって、本発明はまた、抗体をそのハーフ抗体形態から分離する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつカオトロピック試薬、糖アルコール、無極性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸を含む移動相を使用して、抗体及びそのハーフ抗体形態を含む溶液をゲル濾過マトリックスと接触させる工程と、ゲル濾過マトリックスから溶出画分を収集する工程とを含み、抗体は、溶出画分の１セットで溶出され、ハーフ抗体形態は、溶出画分の別のセットで溶出され、それにより抗体をそのハーフ抗体形態から分離する。本方法の特定の実施形態では、抗体は、多重特異性（例えば、二重特異性）ヘテロ二量体抗体である。

中性ｐＨ及び一定温度で温度応答性プロテインＡ樹脂からＦｃ領域含有タンパク質を溶出するための本明細書に記載の溶出緩衝液のいずれかは、抗体をそのハーフ抗体形態から分離するためのサイズ排除クロマトグラフィーにおける移動相として使用され得る。いくつかの実施形態では、移動相は、約２Ｍ～約４．５Ｍのカオトロピック試薬、約１Ｍ～約４．５Ｍの糖アルコール、約０．２５Ｍ～約１Ｍの塩基性アミノ酸、及び約０．２５Ｍ～約１Ｍの無極性アミノ酸を含む。これら及び他の実施形態では、移動相は、尿素、ソルビトール、アルギニン、及びプロリンを含む。特定の実施形態では、移動相は、約２Ｍ～約４．５Ｍの尿素、約１Ｍ～約４．５Ｍのソルビトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、及び０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約４Ｍの尿素、約２．２Ｍのソルビトール、約０．５Ｍのアルギニン、約０．５Ｍのプロリン、及び約０．７５Ｍの塩化ナトリウムを含む。移動相のｐＨは、約６．５～約７．５又は特定の実施形態では約７．０～約７．４であり得る。

本方法の特定の実施形態では、移動相は、約０．０１ｍｌ／分～約０．２ｍｌ／分の流量でゲル濾過マトリックスを通過される。他の実施形態では、移動相は、約０．０２ｍｌ／分～約０．０６ｍｌ／分の流量でゲル濾過マトリックスを通過される。ゲル濾過マトリックスは、架橋アガロース及び架橋デキストランから構成され得、かつ約１０ｋＤａ～約６００ｋＤａの分画範囲を有し得る。

ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質の構造。この図は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質（本明細書中に記載の方法によって精製され得るＦｃ含有タンパク質の例）の概略図を示す。ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質は、２つの一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）から構成され、その各々は、別のペプチドリンカーを介して第２の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合された、ペプチドリンカーによって連結された第１の抗体由来の可変ドメインを含む。 従来のプロテインＡカラムから溶出したＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質。この図は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質のプロテインＡ溶出液プールの試料からのＳＥ－ＵＰＬＣクロマトグラムを示す。結合タンパク質を、１％酢酸緩衝液（ｐＨ２．７）を用いて４℃で従来のプロテインＡクロマトグラフィーカラムから溶出した。ＳＥＣ－ＵＰＬＣカラムからの溶出液は、凝集ピーク（黒い矢印で示す）及び単量体ピーク（黒い星印で示す）の両方を含んでいた。４つのパネルの各々は、別個の実験である。 温度応答性プロテインＡクロマトグラフィーカラムから４℃で溶出したＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質。この図は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質のプロテインＡ溶出液プールの試料からのＳＥ－ＵＰＬＣクロマトグラムを示す。ｐＨ７．２を有し、かつ５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む溶出緩衝液を使用して、温度応答性プロテインＡクロマトグラフィーカラムから結合タンパク質を４℃で溶出した。単量体ピークは、黒い星印で示す。３つのパネルの各々は、別個の実験である。 温度応答性プロテインＡクロマトグラフィーカラムで精製中のＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。ゲル上の各レーン中の試料は、以下の通りである：Ｓｔｄｓ＝タンパク質スタンダード；フィード＝カラムローディング前の清澄化細胞培養上清の試料；ＦＴ＝カラムフロースルー画分の試料；及び溶出液＝ｐＨ７．２の、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む溶出緩衝液により、室温でカラムから結合タンパク質を溶出した後の溶出液プールの試料。 室温で温度応答性プロテインＡクロマトグラフィーカラムから溶出したＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質。この図は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質の温度応答性プロテインＡ溶出液プールの試料のＳＥ－ＵＰＬＣクロマトグラムを示す。ｐＨ７．２を有し、かつ２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む溶出緩衝液を使用して、室温で温度応答性プロテインＡクロマトグラフィーカラムから結合タンパク質を溶出した。約１４分の保持時間を有するピークは、結合タンパク質の単量体型である。挿入図は、クロマトグラムに示された各ピークの保持時間、ピーク面積及び高さを示す。溶出液プール中に存在するＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質の約９９％は、単量体型である。 一本鎖二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の構造。この図は、一本鎖二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質（本明細書中に記載の方法によって精製され得るＦｃ領域含有タンパク質の例）の概略図を示す。一本鎖二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質は、第１の抗体からの重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有し、第２の抗体からの重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有する第２のｓｃＦｖフラグメントに融合した第１のｓｃＦｖフラグメントと、そのＮ末端でペプチドリンカーを介して第１のｓｃＦｖフラグメントに融合したＦｃ領域とを含む。 １７４ｍＭの酢酸を用いて従来のプロテインＡカラムから溶出した二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質のＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラム。二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質を、１７４ｍＭ（１％）の酢酸（ｐＨ２．７）を用いて従来のプロテインＡカラムから室温で溶出した。黒い矢印は、結合タンパク質の凝集体に対応するピークを示す。黒い星印は、結合タンパク質の単量体型に対応するピークを示す。挿入図は、クロマトグラムに示された各ピークの保持時間、ピーク面積及び高さを示す。溶出液プール中に存在する二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の約３９％は、単量体型である。 ３３ｍＭの酢酸を用いて従来のプロテインＡカラムから溶出した二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質のＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラム。二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質を、３３ｍＭ（０．０６％）の酢酸（ｐＨ３．７）を用いて従来のプロテインＡクロマトグラフィーカラムから室温で溶出した。黒い矢印は、結合タンパク質の凝集体に対応するピークを示す。黒い星印は、結合タンパク質の単量体型に対応するピークを示す。挿入図は、クロマトグラムに示された各ピークの保持時間、ピーク面積及び高さを示す。溶出液プール中に存在する二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の約５３％は、単量体型である。 温度応答性プロテインＡカラムから溶出した二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質のＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラム。ｐＨ７．２を有し、かつ２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び２．５Ｍの尿素を含む溶出緩衝液を使用して、室温で温度応答性プロテインＡクロマトグラフィーカラムから二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質を溶出した。挿入図は、クロマトグラムに示されたピークの保持時間、ピーク面積及び高さを示す。黒い矢印は、結合タンパク質の凝集体に対応するピークを示す。約１５．９分の保持時間を有するピークは、Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の単量体型に対応し、黒い星印で注釈されている。溶出液プール中に存在する二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の約７５％は、単量体型である。 温度応答性プロテインＡカラムから溶出した二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質のＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラム。ｐＨ７．２を有し、かつ２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む溶出緩衝液を使用して、室温で温度応答性プロテインＡクロマトグラフィーカラムから二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質を溶出した。挿入図は、クロマトグラムに示された各ピークの保持時間、ピーク面積及び高さを示す。黒い矢印は、結合タンパク質の凝集体に対応するピークを示す。約１５．９分の保持時間を有するピークは、Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の単量体型に対応し、黒い星印で注釈されている。溶出液プール中に存在する二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の約８８％は、単量体型である。 温度応答性プロテインＡカラム緩衝液からの二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ溶出液のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。温度応答性プロテインＡクロマトグラフィーカラムを用いた二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の精製中に異なる試料を採取した。ゲル上の各レーン中の試料は、以下の通りである：Ｓｔｄｓ＝タンパク質スタンダード；フィード＝カラムローディング前の清澄化細胞培養上清の試料；ＦＴ＝カラムフロースルー画分の試料；及び溶出液＝ｐＨ７．２の、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む溶出緩衝液により、室温でカラムから結合タンパク質を溶出した後の溶出液プールの試料。 モノクローナル抗体のＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラムを温度応答性プロテインＡカラムから４℃で溶出した。ｐＨ７．２を有し、かつ２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２Ｍの塩化グアニジン、及び２．２Ｍのソルビトールを含む溶出緩衝液を用いて、４℃で温度応答性プロテインＡクロマトグラフィーカラムから抗体を溶出した。抗体の単量体型に対応するピークは、黒い星印で示す。 図８Ａのクロマトグラムに示されたピークの特徴をまとめた表。モノクローナル抗体のほぼ９０％は、溶出液プールにおいて単量体型で回収された。 従来のプロテインＡ精製後の組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体の２つの異なるロットからのＬＣＭＳクロマトグラムを示す。１４８３５１ダルトンの予測質量を有する完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体、及び７４３５５ダルトンの予測質量を有する一方の種のハーフ抗体が両方のロットで検出される。７４００４ダルトンの予測質量を有する他方の種のハーフ抗体は、検出されない。ハーフ抗体のレベルは、ロット毎に異なる。 従来のプロテインＡ精製後の組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体の２つの異なるロットからのＬＣＭＳクロマトグラムを示す。１４８３５１ダルトンの予測質量を有する完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体、及び７４３５５ダルトンの予測質量を有する一方の種のハーフ抗体が両方のロットで検出される。７４００４ダルトンの予測質量を有する他方の種のハーフ抗体は、検出されない。ハーフ抗体のレベルは、ロット毎に異なる。 二重特異性ヘテロ二量体抗体（「ヘテロ二量体抗体Ａ」）の従来のプロテインＡ溶出液プールの試料についてのＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体（「完全抗体」）は、分析サイズ排除カラムでハーフ抗体の前に溶出する。クロマトグラムの下の表は、クロマトグラムに示された２つのピークの保持時間及びピーク面積、幅ならびに高さを示す。約７２％のハーフ抗体が溶出液プール中に存在する。 二重特異性ヘテロ二量体抗体（「ヘテロ二量体抗体Ａ」）の従来のプロテインＡ溶出液プールからの試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。還元（ゲルの左側）又は非還元（ゲルの右側）条件において示された試料容量を４～２０％勾配トリス－グリシンＳＤＳゲル上にロードした。タンパク質スタンダードを中間レーンにロードした。有意な量のハーフ抗体が従来のプロテインＡクロマトグラフィーによる精製後に存在する。 二重特異性ヘテロ二量体抗体（「ヘテロ二量体抗体Ａ」）調製物の分取ＳＥＣクロマトグラム。二重特異性ヘテロ二量体抗体調製物を、ＰＢＳ、ｐＨ７．０を含む移動相を用いる分取ＳＥＣゲル濾過に供した。従来の条件下で操作されたＳＥＣは、完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体及び他の不完全な断片からハーフ抗体を分離することができない。 二重特異性ヘテロ二量体抗体（「ヘテロ二量体抗体Ａ」）の従来のプロテインＡ溶出液プールの分取ＳＥＣゲル濾過カラム（２×８０ｍｌ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）からの溶出プロファイル。ＳＥＣを、ｐＨ７．２の、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相を用いて０．０２ｍｌ／分の流量で行った。３つの主要なタンパク質ピークが観察される。 そのプロファイルを図１２に示す、ＳＥＣからの溶出画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。３つのピークのそれぞれを通して画分を集めた。「Ｌ」＝ＳＥＣ前のロード材料。試料を非還元（図１３Ａ）又は還元（図１３Ｂ）条件で４～２０％勾配トリス－グリシンＳＤＳゲル上にロードした。ピーク２は、完全に組み立てられた抗体（「Ｆ」）を主に含み、ピーク３は、ハーフ抗体（「Ｈ」）を主に含む。ピーク１は、より高分子量の凝集体に対応する。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相をｐＨ７．２で使用するＳＥＣは、完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体をハーフ抗体から効果的に分離した。 そのプロファイルを図１２に示す、ＳＥＣからの溶出画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。３つのピークのそれぞれを通して画分を集めた。「Ｌ」＝ＳＥＣ前のロード材料。試料を非還元（図１３Ａ）又は還元（図１３Ｂ）条件で４～２０％勾配トリス－グリシンＳＤＳゲル上にロードした。ピーク２は、完全に組み立てられた抗体（「Ｆ」）を主に含み、ピーク３は、ハーフ抗体（「Ｈ」）を主に含む。ピーク１は、より高分子量の凝集体に対応する。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相をｐＨ７．２で使用するＳＥＣは、完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体をハーフ抗体から効果的に分離した。 ＳＥＣ前の二重特異性ヘテロ二量体抗体を含むロード材料、及び図１２に示すＳＥＣ中の３つの主要なタンパク質ピークの各々からの溶出画分の試料からの分析ＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。二重特異性ヘテロ二量体抗体（「ヘテロ二量体抗体Ａ」）を含む従来のプロテインＡクロマトグラフィーからの溶出液プールを分取ＳＥＣゲル濾過カラム（２×８０ｍｌ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）にロードした。ＳＥＣを、ｐＨ７．２の、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相を用いて０．０２ｍｌ／分の流量で行った。完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体は、主にピーク２で溶出し、ハーフ抗体は、主にピーク３で溶出する。より高分子量の凝集体は、ピーク１で溶出する。この移動相で操作されるＳＥＣは、完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体をハーフ抗体混入物から効果的に分離することができる。 従来のプロテインＡ溶出液プール、ＳＥＣ前のロード材料、及びＳＥＣ後の最終プールからの組換えヘテロ二量体抗体の試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。試料を非還元（ゲルの左側）又は還元（ゲルの右側）条件で４～２０％勾配トリス－グリシンＳＤＳゲル上にロードした。 ｐＨ７．２の、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相でのＳＥＣ精製後の組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体のＬＣＭＳクロマトグラム。完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体のみが検出可能である。２種のハーフ抗体のいずれも検出できない。ＳＥＣは、ハーフ抗体混入物を効率よく除去する。図９Ａ及び９Ｂと比較されたい。 ｐＨ７．２の、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相を用いるＳＥＣによる精製前（図１５Ａ）及び精製後（図１５Ｂ）後の組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体ＢのＬＣＭＳクロマトグラムを示す。ＳＥＣ精製前、調製物は、完全に組み立てられた抗体及びハーフ抗体の両方を含む。ＳＥＣ精製後、ハーフ抗体を検出することはできない。 ｐＨ７．２の、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相を用いるＳＥＣによる精製前（図１５Ａ）及び精製後（図１５Ｂ）後の組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体ＢのＬＣＭＳクロマトグラムを示す。ＳＥＣ精製前、調製物は、完全に組み立てられた抗体及びハーフ抗体の両方を含む。ＳＥＣ精製後、ハーフ抗体を検出することはできない。 ｐＨ７．２の、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相を用いるＳＥＣによる精製前（図１６Ａ）及び精製後（図１６Ｂ）後の組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体ＣのＬＣＭＳクロマトグラムを示す。ＳＥＣ精製前、調製物は、完全に組み立てられた抗体及びハーフ抗体の両方を含む。ＳＥＣ精製後、ハーフ抗体を検出することはできない。 ｐＨ７．２の、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相を用いるＳＥＣによる精製前（図１６Ａ）及び精製後（図１６Ｂ）後の組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体ＣのＬＣＭＳクロマトグラムを示す。ＳＥＣ精製前、調製物は、完全に組み立てられた抗体及びハーフ抗体の両方を含む。ＳＥＣ精製後、ハーフ抗体を検出することはできない。 ｐＨ７．２の、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相を用いる分取ＳＥＣゲル濾過カラムの溶出画分からの組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。次の異なる流量でＳＥＣを行った：０．０２ｍｌ／分（図１７Ａ）、０．０４ｍｌ／分（図１７Ｂ）、０．０６ｍｌ／分（図１７Ｃ）、０．０８ｍｌ／分（図１７Ｄ）、０．１ｍｌ／分（図１７Ｅ）、及び０．２ｍｌ／分（図１７Ｆ）。「Ｆ」＝完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体。「Ｈ」＝ハーフ抗体。試料を非還元条件で４～２０％勾配トリス－グリシンＳＤＳゲル上にロードした。ハーフ抗体の分離効率は、流量の増加と共に減少する。 ｐＨ７．２の、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相を用いる分取ＳＥＣゲル濾過カラムの溶出画分からの組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。次の異なる流量でＳＥＣを行った：０．０２ｍｌ／分（図１７Ａ）、０．０４ｍｌ／分（図１７Ｂ）、０．０６ｍｌ／分（図１７Ｃ）、０．０８ｍｌ／分（図１７Ｄ）、０．１ｍｌ／分（図１７Ｅ）、及び０．２ｍｌ／分（図１７Ｆ）。「Ｆ」＝完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体。「Ｈ」＝ハーフ抗体。試料を非還元条件で４～２０％勾配トリス－グリシンＳＤＳゲル上にロードした。ハーフ抗体の分離効率は、流量の増加と共に減少する。 ｐＨ７．２の、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相を用いる分取ＳＥＣゲル濾過カラムの溶出画分からの組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。次の異なる流量でＳＥＣを行った：０．０２ｍｌ／分（図１７Ａ）、０．０４ｍｌ／分（図１７Ｂ）、０．０６ｍｌ／分（図１７Ｃ）、０．０８ｍｌ／分（図１７Ｄ）、０．１ｍｌ／分（図１７Ｅ）、及び０．２ｍｌ／分（図１７Ｆ）。「Ｆ」＝完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体。「Ｈ」＝ハーフ抗体。試料を非還元条件で４～２０％勾配トリス－グリシンＳＤＳゲル上にロードした。ハーフ抗体の分離効率は、流量の増加と共に減少する。 ｐＨ７．２の、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相を用いる分取ＳＥＣゲル濾過カラムの溶出画分からの組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。次の異なる流量でＳＥＣを行った：０．０２ｍｌ／分（図１７Ａ）、０．０４ｍｌ／分（図１７Ｂ）、０．０６ｍｌ／分（図１７Ｃ）、０．０８ｍｌ／分（図１７Ｄ）、０．１ｍｌ／分（図１７Ｅ）、及び０．２ｍｌ／分（図１７Ｆ）。「Ｆ」＝完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体。「Ｈ」＝ハーフ抗体。試料を非還元条件で４～２０％勾配トリス－グリシンＳＤＳゲル上にロードした。ハーフ抗体の分離効率は、流量の増加と共に減少する。 ｐＨ７．２の、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相を用いる分取ＳＥＣゲル濾過カラムの溶出画分からの組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。次の異なる流量でＳＥＣを行った：０．０２ｍｌ／分（図１７Ａ）、０．０４ｍｌ／分（図１７Ｂ）、０．０６ｍｌ／分（図１７Ｃ）、０．０８ｍｌ／分（図１７Ｄ）、０．１ｍｌ／分（図１７Ｅ）、及び０．２ｍｌ／分（図１７Ｆ）。「Ｆ」＝完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体。「Ｈ」＝ハーフ抗体。試料を非還元条件で４～２０％勾配トリス－グリシンＳＤＳゲル上にロードした。ハーフ抗体の分離効率は、流量の増加と共に減少する。 ｐＨ７．２の、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含む移動相を用いる分取ＳＥＣゲル濾過カラムの溶出画分からの組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。次の異なる流量でＳＥＣを行った：０．０２ｍｌ／分（図１７Ａ）、０．０４ｍｌ／分（図１７Ｂ）、０．０６ｍｌ／分（図１７Ｃ）、０．０８ｍｌ／分（図１７Ｄ）、０．１ｍｌ／分（図１７Ｅ）、及び０．２ｍｌ／分（図１７Ｆ）。「Ｆ」＝完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体。「Ｈ」＝ハーフ抗体。試料を非還元条件で４～２０％勾配トリス－グリシンＳＤＳゲル上にロードした。ハーフ抗体の分離効率は、流量の増加と共に減少する。

本発明は、凝集タンパク質及びハーフ抗体などの他の混入物のレベルを最小化する、Ｆｃ領域を含有するタンパク質（例えば、抗体及びＦｃ融合タンパク質）の精製手順の開発に部分的に基づいている。Ｆｃ領域含有タンパク質を精製するための従来の方法は、一般的にプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用し、これは、結合されたタンパク質をカラムから溶出するために酸性の強い溶液を必要とする。このような酸性溶液は、多くの場合、タンパク質の凝集、不安定性、及びしばしば沈殿を誘導する。温度シフトを用いて中性ｐＨで結合されたタンパク質の溶出を可能にする改変された温度応答性プロテインＡ樹脂が開発されたが、そのような改変された樹脂は、樹脂温度を上昇させるのにかなりの時間を必要とするため、大規模な製造操作に適さない。

本発明者は、従来のプロテインＡクロマトグラフィーの低ｐＨ溶出緩衝液の使用及び改変された温度応答性プロテインＡ樹脂に必要とされる高温を回避する、Ｆｃ領域含有タンパク質の精製方法を考案した。本発明の精製方法は、カオトロピック試薬、糖アルコール、及び任意選択により１又は複数のアミノ酸を含む溶出緩衝液を使用する。溶出緩衝液の組成は、温度応答性プロテインＡ樹脂に結合されたタンパク質を、樹脂温度を３５℃より高く上昇させることなく、中性ｐＨで樹脂から除去又は溶出させることを可能にする。また、驚くべきことに、この溶出緩衝液は、抗体をそのハーフ抗体形態から効率よく分離するためにサイズ排除クロマトグラフィーにおいて移動相としても使用され得ることがわかった。

したがって、一実施形態では、本発明は、タンパク質及び１又は複数の不純物を含む溶液から、Ｆｃ領域を含むタンパク質を精製する方法であって、その溶液を、温度応答性プロテインＡ材料と、この材料にタンパク質が結合する温度で接触させる工程と、本明細書中に記載の溶出緩衝液により、約３５℃未満の温度で材料からタンパク質を溶出する工程とを含む方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、抗体をそのハーフ抗体形態から分離する方法であって、本明細書に記載の溶出緩衝液の１つを移動相として用いて、抗体及びそのハーフ抗体形態を含む溶液をゲル濾過マトリックスと接触させる工程と、ゲル濾過マトリックスから溶出画分を収集する工程とを含み、抗体は、溶出画分の１セットで溶出され、ハーフ抗体形態は、溶出画分の別のセットで溶出され、それにより抗体をそのハーフ抗体形態から分離する、方法を提供する。

本発明の方法は、免疫グロブリンＦｃ領域を含むタンパク質を精製するのに特に適している。本明細書中で使用される場合、「Ｆｃ領域を含むタンパク質」又は「Ｆｃ領域含有タンパク質」は、免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列に対応する連続したアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチドを指す。用語「Ｆｃ領域」は、無傷の抗体のパパイン消化によって生成され得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意選択によりＣＨ４ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来のＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。

本発明の方法によって精製され得るＦｃ領域含有タンパク質としては、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、及び多重特異性抗原結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、２つの軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤａ）及び２つの重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０～７０ｋＤａ）を含む四量体免疫グロブリンタンパク質を指す。用語「軽鎖」又は「免疫グロブリン軽鎖」は、アミノ末端からカルボキシル末端へ単一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）及び単一の免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドを指す。免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、カッパ（κ）又はラムダ（λ）であり得る。用語「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」は、アミノ末端からカルボキシル末端へ単一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）、及び任意選択により免疫グロブリン重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含むポリペプチドを指す。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、及びイプシロン（ε）として分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧクラス及びＩｇＡクラス抗体は、サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１及びＩｇＡ２にそれぞれさらに分けられる。ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＤ抗体の重鎖は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有し、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体の重鎖は、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を有する。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、サブタイプを含む任意の免疫グロブリンアイソタイプ由来であり得る。抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間（すなわち軽鎖と重鎖との間）及び抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して連結されている。

本発明の方法によって精製され得る抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体は、酸感受性抗体である。本明細書中で使用される場合、「酸感受性抗体」とは、酸性条件（例えば、約６未満のｐＨ）で不安定であるか、凝集するか、又は構造的完全性を失う抗体を指す。特定の実施形態では、抗体は、多重特異性（例えば、二重特異性）ヘテロ二量体抗体である。多重特異性ヘテロ二量体抗体は、２つ以上の異なる抗原に特異的に結合することができ、２つの異なる軽鎖及び２つの異なる重鎖を含む抗体を指す。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性ヘテロ二量体抗体は、第１の抗原に特異的に結合する第１の抗体由来の軽鎖及び重鎖、ならびに第２の抗原に特異的に結合する第２の抗体由来の軽鎖及び重鎖を含む（図９Ａ及び９Ｂの右側の概略図を参照されたい。ここで、塗りつぶされた記号は、第１の抗原に結合する部位を形成する軽鎖及び重鎖を表し、塗りつぶされていない記号は、第２の抗原に結合する部位を形成する軽鎖及び重鎖を表す）。二重特異性ヘテロ二量体抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を同じ細胞中で共発現させるか、又はポリペプチド鎖を別々に発現させ、続いてそれらを組み立てることによって生成することができる。ヘテロ二量体形成を促進するために、ポリペプチド鎖を、例えば「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）」法又は電荷対形成法を用いて操作することができる。そのような方法は、当該技術分野で知られており、国際公開第９６／０２７０１１号パンフレット、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．９：６１７－６２１，１９９６、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６：６７７－６８１，１９９８、国際公開第２００９／０８９００４号パンフレット、国際公開第２０１４／０８１９５５号パンフレット、及びＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８５：１９６３７－１９６４６，２０１０に記載されており、これらの文献は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、本発明の方法によって精製される抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」（又は「ｍＡｂ」）は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る自然に発生可能な変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、通常、異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、個々の抗原部位又はエピトープに対するものである。モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた任意の手法を用いて、例えば免疫スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって生成され得る。脾臓細胞は、当該技術分野で知られた任意の手法を用いて、例えばそれらを骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成することによって不死化され得る。ハイブリドーマ生成融合手順に使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、かつ所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地においてそれらを増殖不可能にする酵素欠損を有する。マウス融合における使用に好適な細胞株の例としては、Ｓｐ－２０、Ｐ３－Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４ １、Ｓｐ２１０－Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ－１１、ＭＰＣ１１－Ｘ４５－ＧＴＧ１．７及びＳ１９４／５ＸＸＯ Ｂｕｌが挙げられ、ラット融合において使用される細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３－Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ－２６６、ＧＭ１５００－ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ－ＬＯＮ－ＨＭｙ２及びＵＣ７２９－６である。

いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体であり得る。「ヒト化抗体」は、領域（例えば、フレームワーク領域）がヒト免疫グロブリン由来の対応する領域を含むように改変された抗体を指す。一般に、ヒト化抗体は、最初に非ヒト動物で作られたモノクローナル抗体から生成することができる。通常、抗体の非抗原認識部分に由来する、このモノクローナル抗体の特定のアミノ酸残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体における対応する残基に相同であるように改変される。ヒト化は、例えば、齧歯類可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に置換することにより、種々の方法を用いて行うことができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書及び同第５，６９３，７６２号明細書、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２１：５２２－５２５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３２：３２３－２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９：１５３４－１５３６，１９８８を参照されたい）。別の種において生成された抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に結合することができる。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、いくつかのヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲをアラインして、コンセンサスアミノ酸配列を同定し得る。

他の実施形態では、モノクローナル抗体は、完全ヒト抗体であり得る。「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来するか、又はその指標となる可変領域及び定常領域を含む抗体である。完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（通常、マウス）を免疫化することによって生成することができる。この目的のための抗原は、通常、６個以上の連続するアミノ酸を有し、任意選択によりハプテンなどのキャリアに結合される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１－２５５５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－２５８、及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。このような方法の一例では、トランスジェニック動物は、マウスの免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能力化し、マウスのゲノム中に、ヒトの重鎖及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含むヒトゲノムＤＮＡの大きい断片を挿入することによって生産される。次いで、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全相補体より少ない相補体を有する部分的に改変された動物を交雑して、所望の免疫系を全て改変した動物を得る。免疫原を投与すると、これらのトランスジェニック動物は、免疫原に対して免疫特異的であるが、マウスでなくヒトの、可変領域を含むアミノ酸配列を有する抗体を産生する。このような方法のさらなる詳細については、例えば、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット及び国際公開第９４／０２６０２号パンフレットを参照されたい。ヒト抗体を作るためのトランスジェニックマウスに関連するさらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、同第６，７１３，６１０号明細書、同第６，６７３，９８６号明細書、同第６，１６２，９６３号明細書、同第５，９３９，５９８号明細書、同第５，５４５，８０７号明細書、同第６，３００，１２９号明細書、同第６，２５５，４５８号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，８７４，２９９及び同第５，５４５，８０６号明細書、ＰＣＴ公報の国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９０／０４０３６号パンフレット、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３０４９８号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号明細書及び欧州特許出願公開第５４６０７３Ａ１号明細書に記載されている。

ヒト由来抗体は又はジディスプレイ技術を用いて生成することができる。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．による国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，による国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、及びＣａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０－６４５４（１９９０）に記載されており、これらの各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ファージ技術によって生成される抗体は、通常、細菌において、抗原結合フラグメント、例えばＦｖ又はＦａｂフラグメントとして生成され、したがってエフェクタ機能を欠く。エフェクタ機能は、２つの戦略の１つによって導入することができる：フラグメントは、必要に応じて、哺乳動物細胞で発現する完全な抗体へ又はエフェクタ機能を誘発し得る第２の結合部位を有する二重特異性抗体フラグメントへ操作され得る。通常、抗体のＦｄフラグメント（ＶＨ－ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）は、ＰＣＲによって別々にクローン化され、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーでランダムに組み換えられ、これは、その後、特定の抗原に結合するために選択され得る。抗体フラグメントは、ファージ表面で発現し、抗原結合によるＦｖ又はＦａｂ（したがって抗体フラグメントをコードするＤＮＡを含むファージ）の選択は、パンニングと呼ばれる手順である抗原結合及び再増幅を数ラウンド行うことによって達成される。抗原に特異的な抗体フラグメントは、濃縮され、最終的に単離される。ファージディスプレイ技術はまた、「ガイデッドセレクション（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる、齧歯類モノクローナル抗体のヒト化のためのアプローチにおいて使用することができる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，８９９－９０３（１９９４）を参照されたい）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄフラグメントは、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて提示され得、次いで、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーは、抗原を用いて選択され得る。これにより、マウスＦｄフラグメントは、選択を誘導するテンプレートを提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖は、ヒトＦｄフラグメントライブラリーと組み合わされる。得られたライブラリーの選択により、完全にヒトＦａｂが得られる。

特定の実施形態では、本発明の方法によって精製されるＦｃ領域を含むタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質である。「Ｆｃ融合タンパク質」は、異種ポリペプチドに融合又は連結されたＦｃ領域を含有するタンパク質である。一般に、融合タンパク質は、１つのタンパク質（例えば、Ｆｃ領域）由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列とインフレームで付加され、任意選択によりリンカーによって分離される、融合遺伝子から発現する。この融合遺伝子は、その後、組換え宿主細胞によって発現されて、単一の融合タンパク質を産生し得る。Ｆｃ領域に融合した異種ポリペプチドは、免疫グロブリンタンパク質以外のタンパク質由来のポリペプチドであり得る。例えば、異種ポリペプチドは、リガンドポリペプチド、受容体ポリペプチド、ホルモン、サイトカイン、成長因子、酵素、又は免疫グロブリンの成分ではない他のポリペプチドであり得る。このようなＦｃ融合タンパク質は、受容体もしくはその断片、又は受容体由来のリガンド、例えば、限定はされないが、以下の受容体のいずれか１つに融合したＦｃ領域を含み得る：ＴＮＦＲの両形態（ｐ５５及びｐ７５と称される）、インターロイキン－１受容体Ｉ型及びＩＩ型（欧州特許第０４６０８４６号明細書、米国特許第４，９６８，６０７号明細書、及び米国特許第５，７６７，０６４号明細書に記載され、これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、インターロイキン－２受容体、インターロイキン－４受容体（欧州特許第０３６７５６６号明細書、及び米国特許第５，８５６，２９６号明細書に記載され、これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、インターロイキン－１５受容体、インターロイキン－１７受容体、インターロイキン－１８受容体、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン－Ｍ及び白血病阻害因子受容体、ＮＦ－カッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ、米国特許第６，２７１，３４９号明細書に記載され、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＶＥＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４を含む）、及びＦａｓ又はアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などのデスドメインを含む受容体。Ｆｃ融合タンパク質はまた、国際公開第２０００／２４７８２号パンフレット（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどのペプチボディを含む。

他の実施形態では、Ｆｃ領域が融合又は連結される異種ポリペプチドは、Ｆｃ領域が由来する免疫グロブリン以外の免疫グロブリンタンパク質又はその断片由来のポリペプチドであり得る。例えば、異種ポリペプチドは、Ｆｃ領域が得られる抗体と異なる抗体由来の重鎖及び／又は軽鎖可変領域であり得る。特定の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、少なくとも１つの一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖフラグメント）を含む。「一本鎖可変抗体フラグメント」又は「ｓｃＦｖフラグメント」は、抗体のＶＨ及びＶＬ領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在し、任意選択により、ＶＨ及びＶＬ領域間において、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするペプチドリンカーを含む（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４２：４２３－４２６，１９８８、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．。Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５：５８７９－５８８３，１９８８を参照されたい）。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、２つのｓｃＦｖフラグメントを含む。他の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、３つのｓｃＦｖフラグメントを含む。さらに他の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、４つのｓｃＦｖフラグメントを含む。

抗体可変領域の１又は複数のｓｃＦｖフラグメント又は他のフラグメントを含むＦｃ融合タンパク質は、１又は複数の抗原に対する複数の結合部位を有し得る。したがって、このようなＦｃ融合タンパク質としては、米国特許出願公開第２００３０１３３９３９号明細書に記載されている小モジュラー免疫薬剤、国際公開第２００７／１４６９６８号パンフレットに記載されている一本鎖多価結合タンパク質、国際公開第２０１４１４４７２２号パンフレットに記載されている二重特異性二価ｓｃＦｖ－Ｆｃ分子、ならびにＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．６７：９５－１０６，２０１５及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ｍＡｂｓ，Ｖｏｌ．４：１８２－１９７，２０１２に記載されているＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－Ｆａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、４ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＶＨ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－ＶＨ、及びＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃなどの種々の二重特異性抗体分子などの多重特異性多価抗原結合タンパク質を挙げることができる。一実施形態では、本発明の方法によって精製されるＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質である。本明細書中で使用される場合、「ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質」は、２つの一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、その各々は、別のペプチドリンカーを介して第２の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合された、ペプチドリンカーによって連結された第１の抗体由来の可変ドメインを含む結合タンパク質である。ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質の例を図１に示す。別の実施形態では、本発明の方法によって精製されるＦｃ融合タンパク質は、Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質である。「Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質」は、任意選択により、リンカーを介してＦｃ領域に融合した少なくとも１つのｓｃＦｖフラグメントを含む。特定の実施形態では、Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質は、任意選択により、リンカーペプチドを介して互いに融合した２つのｓｃＦｖフラグメントを含み、これは、次にＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端に融合する。このような二価Ｆｖ－Ｆｃ分子は、国際公開第２０１４１４４７２２号パンフレットに記載されており、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このような一本鎖二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の一例を図５に示す。

本明細書に記載の方法を使用して精製され得る抗体及びＦｃ融合タンパク質は、１又は複数のタンパク質、例えば、限定はされないが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－１３受容体、ＩＬ－Ｉ８受容体サブユニット、アンジオポイエチン（例えば、アンジオポイエチン－１、アンジオポイエチン－２、又はアンジオポイエチン－４）、ＰＤＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β１、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、Ｃ５相補体、ベータ－クロトー、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、ＣＧＲＰ受容体、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１型受容体（ＰＡＣ１受容体）、ＩｇＥ、腫瘍抗原、例えば、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＰＤ－１、ＬＣＧ（これは、肺癌に関連して発現する遺伝子産物である）、ＨＥＲ－２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ－７２、ＳＫ－ｌ抗原、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ－４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、スクレロスチン、ディックコプフ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）－１（ＤＫＫ－１）、ＴＬＡ１、ＴＮＦ－α、接着分子ＶＡＰ－ｌ、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子－３（ＩＣＡＭ－３）、ロイコインテグリンアドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、ＰＣＳＫ９、上皮小体ホルモン、ｒＮＡＰｃ２、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ－４（これは、細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原である）、Ｆｃ－γ－ｌ受容体、ＨＬＡ－ＤＲ１０ベータ、ＨＬＡ－ＤＲ抗原、Ｌ－セレクチン、ＩＰＮ－γ、ＲＳウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ならびにストレプトコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に結合し得る。

本明細書に記載の方法によって精製され得るＦｃ領域含有タンパク質の他の例としては、限定はされないが、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、エボロクマブ（Ｒｅｐａｔｈａ（登録商標））、アリロクマブ（Ｐｒａｌｕｅｎｔ（登録商標））、デノスマブ（Ｐｒｏｌｉａ（登録商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））、アブシキシマブ（Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標））、エファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標））、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（登録商標））、及びロミプロスチム（Ｎｐｌａｔｅ（登録商標））が挙げられる。

精製されるＦｃ領域含有タンパク質は、組換え手段により、すなわちタンパク質を産生するように遺伝子操作された生宿主細胞により産生され得る。タンパク質を産生する細胞を遺伝子操作する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ａｕｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。そのような方法は、タンパク質をコードし、それを発現させる核酸を生宿主細胞へ導入することを含む。これらの宿主細胞は、培養で増殖させた原核生物、酵母又は高等真核細胞であり得る。原核生物の宿主細胞としては、グラム陰性又はグラム陽性微生物などの真正細菌、例えば腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えばセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ならびにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えばＢ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．エイケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えばＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、シュヴァンニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュヴァンニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、ならびに糸状菌、例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニドゥランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などの多くの他の属、種及び株が一般に利用可能であり、ここで有用である、特定の実施形態では、組換えタンパク質は、動物細胞、特に哺乳動物細胞において産生される。発現の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野でよく知られており、限定はされないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えば、限定はされないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６，１９８０）；ＳＶ４０（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児性腎臓株（懸濁培養液中の増殖用としてサブクローニングされた２９３又は２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８，１９８２）；ＭＲＣ ５細胞又はＦＳ４細胞；哺乳動物骨髄腫細胞、及び多くの他の細胞株が挙げられる。１つの特定の実施形態では、本発明の方法によって精製されるタンパク質は、哺乳動物細胞株、特にＣＨＯ細胞株において組換え技術によって産生される。

本発明の方法は、溶液中の１又は複数の不純物から標的タンパク質（例えば、Ｆｃ領域含有タンパク質）を精製又は分離するために使用することができる。本明細書中で使用される場合、「タンパク質を精製する」とは、標的タンパク質と異なり、最終タンパク質組成物から排除することが望ましい物質の量を減少させるプロセスを指す。このような不純物又は混入物としては、タンパク質（例えば、可溶性もしくは不溶性タンパク質、又はタンパク質の断片、例えばハーフ抗体などの目的タンパク質の望ましくない断片）、脂質（例えば、細胞壁物質）、エンドトキシン、ウイルス、核酸（例えば、染色体又は染色体外ＤＮＡ、ｔ－ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、もしくはｍＲＮＡ）、又はこれらの組み合わせ、あるいは目的の標的Ｆｃ領域含有タンパク質と異なる任意の他の物質を挙げることができる。いくつかの実施形態では、不純物又は混入物は、目的のＦｃ領域含有タンパク質を産生した宿主細胞に由来し得る。例えば、いくつかの実施形態では、不純物又は混入物は、宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、又は目的のＦｃ領域含有タンパク質を発現する原核もしくは真核宿主細胞の他の細胞成分である。いくつかの実施形態では、不純物又は混入物は、宿主細胞に由来せず、例えば、不純物又は混入物は、細胞培養培地又は増殖培地からのタンパク質もしくは他の物質、緩衝液、又は培地添加物であり得る。他の実施形態では、不純物又は混入物は、タンパク質分解断片又はタンパク質の組み立てられていない成分（例えば、軽鎖、重鎖、半分子又はその断片）などのＦｃ領域含有タンパク質の望ましくない形態であり得る。本明細書で使用される用語「不純物」は、単一の望ましくない物質、又はいくつかの望ましくない物質の組合せを含み得る。混入タンパク質及び核酸（例えば、宿主細胞タンパク質及び核酸）を検出する好適な方法は、当業者に知られている。このような方法としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ゲル電気泳動法、及び定量的ポリメラーゼ連鎖反応法が挙げられるが、これらに限定されない。サイズ排除高速液体クロマトグラフィー及びキャピラリー電気泳動法を使用して、Ｆｃ領域含有タンパク質の高分子量種（例えば、凝集体）及び低分子量種（断片、組み立てられていない成分）を測定することができる。

標的Ｆｃ領域含有タンパク質が精製され得る溶液は、タンパク質と、その存在が望ましくない１又は複数の不純物又は混入物とを含有する任意の溶液であり得る。タンパク質及び１又は複数の不純物を含有する溶液は、標的タンパク質が産生された細胞培養物から生じた任意の溶液を含み得る。例えば、タンパク質を産生するために組換え手段によって改変された宿主細胞を培養すると、Ｆｃ領域含有タンパク質は、細胞内、細胞周辺腔で産生されるか、又は培地中に直接分泌され得る。タンパク質が細胞内で産生される場合、細胞は、当業者に知られた方法により溶解されて、Ｆｃ領域含有タンパク質を含有する細胞溶解物を生成することができる。したがって、一実施形態では、精製されるＦｃ領域含有タンパク質を含む溶液は、細胞培養溶解物である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の精製方法の前に、宿主細胞、溶解断片、及び他の大きい粒子は、例えば、遠心分離、精密濾過、又は限外濾過により、細胞培養溶解物から除去され得る。他の実施形態では、組換えタンパク質は、宿主細胞によって培養培地中に分泌される。このような実施形態では、組換え宿主細胞及び他の粒子状物質を、Ｆｃ領域含有タンパク質を含有する細胞培養培地から、例えばタンデンシャルフロー濾過又は遠心分離によって分離して、細胞培養上清を生成することができる。したがって、いくつかの実施形態では、精製されるＦｃ領域含有タンパク質を含む溶液は、細胞培養上清である。細胞培養溶解物、細胞培養上清、又はＦｃ領域含有タンパク質を含有する他の溶液は、本発明の精製方法に先立って、微細な粒子状物質及び可溶性凝集物を除去するためにさらに清澄化され得る。いくつかの実施形態では、溶液の清澄化は、約０．１μｍ～約０．５μｍの細孔径を有する膜、好ましくは約０．２２μｍの細孔径を有する膜で溶液を濾過することによって達成することができる。

特定の実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質及び１又は複数の不純物を含有する溶液は、タンパク質を発現する宿主細胞が培養されているバイオリアクターからの回収流又はプールである。「回収流」又は「回収プール」は、Ｆｃ領域含有タンパク質から細胞、細胞破片、又は他の大きい粒子を分離する１又は複数の操作が行われた溶液を指す。このような操作としては、凝集、遠心分離、及び種々の形態の濾過（例えば、デプス濾過、タンジェンシャルフロー精密濾過、及びタンジェンシャルフロー限外濾過）など、宿主細胞培養物から組換えタンパク質を回収するための当業者に知られた標準的な操作が挙げられる。いくつかの実施形態では、タンパク質及び１又は複数の不純物を含有する溶液は、工業規模のバイオリアクター（例えば、生産バイオリアクター）からの回収流又は回収プールである。工業規模のバイオリアクターは、通常、５００リットルを超える、特に２，０００リットル～２０，０００リットルの体積の組換えタンパク質を生産する。１つの特定の実施形態では、本発明の方法によって精製される１又は複数の不純物及びタンパク質を含む溶液は、約２，０００リットル以上の容量を有する生産バイオリアクターからの回収流又は回収プールである。

特定の実施形態では、本発明の方法は、精製されるタンパク質を含む溶液を温度応答性プロテインＡ材料と接触させる工程を含む。「温度応答性プロテインＡ材料」は、タンパク質のＦｃ領域に結合する能力が温度と共に変化するように改変された、プロテインＡの変異型、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）株に見出される細胞壁タンパク質を指す。このような温度応答性プロテインＡ変異体は、米国特許第８，１９８，４０９号明細書に記載されており、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料は、低温、例えば約０～約１５℃でのＦｃ領域結合能が、より高い温度、例えば約３５℃以上でのＦｃ領域結合能と異なる変異型プロテインＡを含む。特定の実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料は、下記の表１に列挙する配列のいずれかのアミノ配列を含む変異型プロテインＡを含む。一実施形態では、変異型プロテインＡは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、変異型プロテインＡは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、変異型プロテインＡは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、変異型プロテインＡは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

温度応答性プロテインＡ材料は、例えば、ペプチド合成又は組換え技術によって合成的に作製することができる。あるいは、温度応答性プロテインＡ材料は、例えば、Ｎｏｍａｄｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｂｙｚｅｎ Ｐｒｏ（登録商標）温度応答性プロテインＡ樹脂）から商業的に入手することができる。いくつかの実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料は、固相に固定化される。固相としては、ビーズ、樹脂、ゲル、粒子、膜、チューブ、プレート、及びフィルムを挙げることができるが、これらに限定されない。一実施形態では、温度応答性プロテインＡが固定される固相は、ビーズ、特に磁気ビーズである。別の実施形態では、温度応答性プロテインＡが固定される固相は、樹脂である。温度応答性プロテインＡ材料がビーズ、樹脂、粒子、又は容器に充填しやすい他の固相に固定化される特定の実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料を含む固相は、カラムなどの容器に充填又はロードされる。

固相を製造できる好適な材料としては、ガラス、シリカ（例えば、シリカゲル）、アガロース、デキストラン、及びセルロースなどの多糖類（例えば、多糖マトリックス）、ポリアクリルアミド、メチルメタクリレート及びポリスチレン－ジビニルベンゼンコポリマーなどの有機ポリマーが挙げられる。温度応答性プロテインＡ材料を種々の固相に固定化する方法は、当業者に知られており、官能性カップリング基（例えば、カルボキシル基又はチオール基）で固相の材料を活性化する方法、ならびに米国特許出願公開第２０１５／０２１８２０８号明細書及び同第２０１３／０３１７１７２号明細書に記載される他の方法を挙げることができる。

本明細書中で使用される場合、Ｆｃ領域含有タンパク質を含む溶液を温度応答性プロテインＡ材料と接触させるか、又はＦｃ領域含有タンパク質を温度応答性プロテインＡ材料に吸着させることは、Ｆｃ領域含有タンパク質が材料に結合するような条件下でタンパク質を温度応答性プロテインＡ材料と混合することを意味する。特に、Ｆｃ領域含有タンパク質は、温度応答性プロテインＡ材料と、タンパク質が材料に結合する温度、例えば約０℃～約１５℃、約１℃～約１２℃、又は約２℃～約８℃の温度で混合される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質は、約１０℃以下の温度で温度応答性プロテインＡ材料と接触されるか又はそれに吸着される。特定の実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質は、約１℃～約６℃の温度で温度応答性プロテインＡ材料と接触されるか又はそれに吸着される。一実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質は、約４℃の温度で温度応答性プロテインＡ材料と接触されるか又はそれに吸着される。

特定の実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料は、精製されるＦｃ領域含有タンパク質を含む溶液と接触させる前に好適な緩衝液で平衡化され得る。このような好適な平衡化緩衝液の１つは、ｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水である。他の好適な平衡化緩衝液としては、ｐＨ約５～約９、好ましくはｐＨ約６．０～約８．０、より好ましくはｐＨ約６．５～約７．５で生理食塩濃度（例えば、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を含む約０．５ｍＭ～約１００ｍＭの濃度のトリス、ＢＩＳ、及びＨＥＰＥＳが挙げられる。

Ｆｃ領域含有タンパク質が温度応答性プロテインＡ材料に結合されると、材料から溶出させる前に、任意選択により、結合された材料を１又は複数の洗浄溶液で洗浄することができる。通常、１又は複数の洗浄溶液は、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、又は塩化ナトリウムなどの塩を含む中性ｐＨ（例えば、約６．５～約７．５）の緩衝液である。洗浄溶液中の塩の好適な濃度は、約０．１Ｍ～約２Ｍ、約０．５Ｍ～約２Ｍ、約０．７５Ｍ～約１．５Ｍ、又は約０．２Ｍ～約０．６Ｍである。特定の実施形態では、１又は複数の洗浄溶液は、約０．５Ｍ～約２Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、１又は複数の洗浄溶液は、約０．１Ｍ～約０．８Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む。一実施形態では、１又は複数の洗浄溶液は、ｐＨ約７～約７．５で、約１０～約２５ｍＭのリン酸緩衝液及び約０．１Ｍ～約０．８ＭのＮａＣｌを含む。別の実施形態では、１又は複数の洗浄溶液は、ｐＨ約７～約７．５で約２０～約５０ｍＭのトリス緩衝液及び約０．１Ｍ～約０．８ＭのＮａＣｌを含む。

１又は複数の洗浄緩衝液はまた、Ｆｃ領域含有タンパク質と温度応答性プロテインＡ材料との結合相互作用に大きい影響を及ぼすことなく、温度応答性プロテインＡ材料からの不純物の除去を促進する他の成分を含み得る。このような追加の成分としては、二価カチオン（例えば、カルシウム、マグネシウム、及びニッケル）、洗剤（例えば、ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０）、又はポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）が挙げられ得る。特定の実施形態では、１又は複数の洗浄溶液の温度は、Ｆｃ領域含有タンパク質が温度応答性プロテインＡ材料に吸着される温度と同じ温度（例えば、０℃～１５℃）である。他の実施形態では、１又は複数の洗浄溶液の温度は、約１５℃～２５℃である。さらに他の実施形態では、１又は複数の洗浄溶液の温度は、２５℃を超えず、すなわち、１又は複数の洗浄溶液の温度は、２５℃以下、例えば約１℃～約２５℃である。

Ｆｃ領域含有タンパク質が温度応答性プロテインＡ材料に結合し、結合された材料が任意選択で上記のように洗浄されると、Ｆｃ領域含有タンパク質は、本明細書に記載の溶出緩衝液を使用して温度応答性プロテインＡ材料から除去される。通常、温度応答性プロテインＡ樹脂からＦｃ領域含有タンパク質を溶出させるには、樹脂の温度を３５℃以上に上昇させる必要がある。米国特許第８，１９８，４０９号明細書、及びＫｏｇｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，Ｖｏｌ．１３０５：１４９－１５３，２０１３を参照されたい。しかしながら、以下に詳細に記載する溶出緩衝液の組成は、温度応答性プロテインＡ樹脂に結合されたタンパク質を樹脂から、樹脂の温度を３５℃超に上昇させることなく中性ｐＨで除去させることができる。したがって、特定の実施形態では、本発明の方法は、温度応答性プロテインＡ材料から、結合されたＦｃ領域含有タンパク質を約３５℃未満の温度で溶出する工程を含む。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質は、約１℃～約３４℃、約４℃～約３２℃、約１０℃～約３０℃、又は約１５℃～約２５℃の温度で温度応答性プロテインＡ材料から溶出される。特定の実施形態では、タンパク質は、約３０℃未満の温度、例えば約１℃～約２５℃の温度で温度応答性プロテインＡ材料から溶出される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約２０℃～約２５℃の温度で温度応答性プロテインＡ材料から溶出される。他の実施形態では、タンパク質は、約１５℃～約２２℃の温度で温度応答性プロテインＡ材料から溶出される。特定の実施形態では、タンパク質は、約１０℃未満の温度、例えば約１℃～約８℃の温度で温度応答性プロテインＡ材料から溶出される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、約１℃～約６℃の温度で温度応答性プロテインＡ材料から溶出される。他の実施形態では、タンパク質は、約２℃～約８℃の温度で温度応答性プロテインＡ材料から溶出される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、温度応答性プロテインＡ材料から、タンパク質が材料に結合された温度と同じ温度で溶出される（すなわち、材料の温度は、吸着工程と溶出工程との間で変わらない）。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質は、以下に詳細に記載する溶出緩衝液により、温度応答性プロテインＡ材料から定組成溶出され得る。代替の実施形態では、Ｆｃ領域含有タンパク質は、直線勾配（例えば、本明細書に記載される洗浄溶液に類似した組成を有する溶液の１００％で開始し、以下に詳細に記載する溶出緩衝液の１００％で終わる）を用いて、温度応答性プロテインＡ材料から溶出され得る。

温度応答性プロテインＡ材料からＦｃ領域含有タンパク質を除去するために使用される溶出緩衝液は、通常、約６．５～約７．５のｐＨの緩衝溶液である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約６．８～約７．５である。他の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約７．２～約７．５である。特定の一実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約７．０～約７．４である。緩衝液が、緩衝液のｐＨを目標ｐＨ範囲に維持できることを条件として、いかなる緩衝液も使用することができる（例えば、ｐＫａ値が６～８の緩衝液）。本発明の方法における溶出緩衝液の成分として使用することができる、中性ｐＨ範囲に緩衝する好適な緩衝剤としては、限定はされないが、ＨＥＰＥＳ（Ｎ－［２－ヒドロキシエチル］ピペラジン－Ｎ’－［２－エタンスルホン酸］）、トリス、リン酸塩、クエン酸塩、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＢＥＳ（Ｎ、Ｎ－ビス［２－ヒドロキシエチル］－２－アミノエタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ、Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、トリシン（Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチルグリシン）、ビシン（Ｎ、Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、ＴＥＳ（Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－２－アミノエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ビス－トリス（ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ－トリス（ヒドロキシメチル）メタン）、及びＭＯＰＳ（３－［Ｎ－モルホリノ］プロパンスルホン酸）が挙げられる。緩衝剤は、約５ｍＭ～約２００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１５ｍＭ～約１００ｍＭ、約２０ｍＭ～約７５ｍＭ、又は約２５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で存在し得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、ＨＥＰＥＳ緩衝剤を例えば約１５ｍＭ～約１００ｍＭの濃度で含む。他の実施形態では、溶出緩衝液は、トリス緩衝剤を例えば約１５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で含む。

種々の実施形態では、溶出緩衝液は、カオトロピック試薬を含む。「カオトロピック試薬」は、水分子間の水素結合ネットワークを破壊し、水素結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用などの非共有結合力によって媒介される分子内相互作用に影響を及ぼすことにより、高分子の構造の秩序を低下させることができる物質である。理論に束縛されるものではないが、溶出緩衝液中のカオトロピック試薬の存在は、Ｆｃ領域含有タンパク質の構造を緩和して、温度応答性プロテインＡ材料からの解放を促進するように作用すると考えられる。溶出緩衝液中に含まれ得る好適なカオトロピック試薬としては、限定はされないが、ブタノール、エタノール、プロパノール、塩化グアニジン、酢酸リチウム又は過塩素酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、ドデシル硫酸ナトリウム、尿素、チオ尿素、及びチオシアン酸塩（例えば、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム又はチオシアン酸カリウム）が挙げられる。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、カオトロピック試薬として、尿素、塩化グアニジン、又はドデシル硫酸ナトリウムを含む。他の実施形態では、溶出緩衝液は、カオトロピック試薬として、尿素、塩化グアニジン、又はチオシアン酸塩を含む。さらに他の実施形態では、溶出緩衝液は、カオトロピック試薬として、尿素又は塩化グアニジンを含む。カオトロピック試薬は、使用される具体的なカオトロピック試薬に応じて約０．４Ｍ～約５．０Ｍ、約０．５Ｍ～約２．５Ｍ、約０．８Ｍ～約１．２Ｍ、約２Ｍ～約４．５Ｍ、又は約３Ｍ～約４．２Ｍの濃度で溶出緩衝液中に存在し得る。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、尿素を例えば約２Ｍ～約４．５Ｍの濃度で含む。他の実施形態では、溶出緩衝液は、尿素を約３Ｍ～約４．２Ｍの濃度で含む。特定の一実施形態では、溶出緩衝液は、尿素を約４Ｍの濃度で含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、塩化グアニジンを例えば約０．５Ｍ～約２．５Ｍの濃度で含む。他の実施形態では、溶出緩衝液は、塩化グアニジンを約０．８Ｍ～約１．２Ｍの濃度で含む。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、塩化グアニジンを約１Ｍの濃度で含む。他の特定の実施形態では、溶出緩衝液は、塩化グアニジンを約２Ｍの濃度で含む。

特定の実施形態では、溶出緩衝液は、カオトロピック試薬に加えて糖アルコールを含む。「糖アルコール」は、糖から誘導される有機化合物であり、一般式ＨＯＣＨ_２（ＣＨＯＨ）_ｎＣＨ_２ＯＨ（式中、ｎは、通常、１～２２以上で変化する）による構造を有する。溶出緩衝液に含めることができる糖アルコールの例としては、限定はされないが、グリセロール、エリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、フシトール、イジトール、ボレミトール、イソマルト、マルチトール、ラクチトール、マルトトリイトール、及びマルトテトライトールを挙げることができる。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、糖アルコールとしてソルビトール、マンニトール、キシリトール、又はグリセロールを含む。一実施形態では、溶出緩衝液中の糖アルコールは、ソルビトールである。別の実施形態では、溶出緩衝液中の糖アルコールは、マンニトールである。糖アルコールは、選択される具体的な糖アルコールに応じて約１Ｍ～約４．５Ｍ、約１．５Ｍ～約４Ｍ、又は約２Ｍ～約２．５Ｍの濃度で溶出緩衝液中に存在し得る。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、例えば、約１Ｍ～約４．５Ｍ、より好ましくは約２Ｍ～約２．５Ｍの濃度でソルビトールを含む。一実施形態では、溶出緩衝液は、約２．２Ｍの濃度でソルビトールを含む。

再び、理論に束縛されるものではないが、糖アルコールの存在は、カオトロピック試薬の存在下でＦｃ領域含有タンパク質が完全にアンフォールディングするのを妨げると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、温度応答性プロテインＡ材料から離れるようにＦｃ領域含有タンパク質の構造を緩和するが、完全にアンフォールディングすることを妨げることと、タンパク質の基本的な天然の構造を失うこととの間のバランスをとる特定の濃度比でカオトロピック試薬及び糖アルコールを含む。このような実施形態では、糖アルコールに対するカオトロピック試薬のモル濃度比は、約０．４～約４．５、約０．８～約４、約１～約２、約１．５～約２．５、又は約１．８～約２．２である。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、尿素及びソルビトールを含み、ソルビトールに対する尿素のモル濃度比は、約１～約２．５、又はより好ましくは約１．１～約１．８である。他の実施形態では、溶出緩衝液は、塩化グアニジン及びソルビトールを含み、ソルビトールに対する塩化グアニジンのモル濃度比は、約０．５～約１．５、又はより好ましくは約０．５～約０．９である。

特定の実施形態では、溶出緩衝液は、１又は複数のアミノ酸をさらに含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、塩基性アミノ酸、無極性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸及び無極性アミノ酸の両方をさらに含み得る。理論に束縛されるものではないが、塩基性アミノ酸は、Ｆｃ領域含有タンパク質と温度応答性プロテインＡ材料との電荷相互作用を調節することにより、温度応答性プロテインＡ材料からのＦｃ領域含有タンパク質の解離を促進する一方、無極性アミノ酸は、Ｆｃ領域含有タンパク質と温度応答性プロテインＡ材料との疎水性相互作用を調節することにより、温度応答性プロテインＡ材料からのＦｃ領域含有タンパク質の解離を促進すると考えられる。本明細書中で使用される場合、「塩基性アミノ酸」は、親水性であり、そのｐＫａ未満のｐＨ値で正電荷を有するＤ又はＬ形態の極性アミノ酸である。溶出緩衝液における使用に好適な塩基性アミノ酸の例としては、限定はされないが、アルギニン、オルニチン、リシン、及びヒスチジンが挙げられる。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、アルギニンを含む。他の実施形態では、溶出緩衝液は、リシンを含む。塩基性アミノ酸は、溶出緩衝液中に約０．１Ｍ～約１．５Ｍ、約０．２５Ｍ～約１Ｍ、又は約０．３Ｍ～約０．８Ｍの濃度で存在し得る。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン）を約０．５Ｍの濃度で含む。

本明細書において「非極性アミノ酸」と互換的に使用される「無極性アミノ酸」は、疎水性官能基を含有し、中性ｐＨで電荷を有さないＤ又はＬ形態のアミノ酸を指す。溶出緩衝液における使用に好適な無極性アミノ酸の例としては、限定はされないが、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、及びバリンが挙げられる。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、プロリンを含む。無極性アミノ酸は、溶出緩衝液中に約０．１Ｍ～約１．５Ｍ、約０．２５Ｍ～約１Ｍ、又は約０．３Ｍ～約０．８Ｍの濃度で存在し得る。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、無極性アミノ酸（例えば、プロリン）を約０．５Ｍの濃度で含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも１つの塩基性アミノ酸と少なくとも１つの無極性アミノ酸とを含む。このような実施形態では、塩基性アミノ酸及び無極性アミノ酸は、溶出緩衝液中に同じ濃度で存在し得る。例えば、塩基性アミノ酸及び無極性アミノ酸は、それぞれ溶出緩衝液中に約０．２５Ｍ～約１Ｍ、より好ましくは約０．３Ｍ～約０．８Ｍの濃度で存在し得る。特定の実施形態では、塩基性アミノ酸及び無極性アミノ酸は、それぞれ溶出緩衝液中に約０．５Ｍの濃度で存在する。一実施形態では、溶出緩衝液は、アルギニン及びプロリンを含む。別の実施形態では、溶出緩衝液は、リシン及びプロリンを含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用される溶出緩衝液は、１又は複数の塩をさらに含み得る。「塩」は、酸及び塩基の中和反応から生じるイオン性化合物を指す。塩は、通常、塩の全体的な正味電荷がゼロであるように同数のカチオン及びアニオンからなる。溶出緩衝液中に含めるのに好適な塩としては、限定はされないが、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム及び硫酸ナトリウムなどのナトリウム塩；酢酸カリウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム及び硫酸カリウムなどのカリウム塩；ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化ニッケル、塩化カリウム及び塩化アンモニウムなどの塩化物塩が挙げられる。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、塩化ナトリウムを含む。他の実施形態では、溶出緩衝液は、塩化カリウムを含む。塩は、約０．１Ｍ～約１Ｍ、約０．２５Ｍ～約０．８Ｍ、約０．５Ｍ～約１Ｍ、又は約０．５Ｍ～約０．８Ｍの濃度で溶出緩衝液中に含まれ得る。一実施形態では、塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約０．７５Ｍの濃度で溶出緩衝液中に存在する。

特定の実施形態では、本発明の方法で使用される溶出緩衝液は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約５ｍＭ～約２００ｍＭの緩衝剤、約０．４Ｍ～約５Ｍのカオトロピック試薬、約１Ｍ～約４．５Ｍの糖アルコール、約０．１Ｍ～約１．５Ｍの無極性アミノ酸、約０．１Ｍ～約１．５Ｍの塩基性アミノ酸、及び約０．１Ｍ～約１Ｍの塩を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約７．０～約７．４のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭの緩衝剤、約２Ｍ～約４．５Ｍのカオトロピック試薬、約１Ｍ～約４．５Ｍの糖アルコール、約０．２５Ｍ～約１Ｍの無極性アミノ酸、約０．２５Ｍ～約１Ｍの塩基性アミノ酸、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩を含む。他の実施形態では、溶出緩衝液は、約７．０～約７．４のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭの緩衝剤、約０．５Ｍ～約２．５Ｍのカオトロピック試薬、約１Ｍ～約４．５Ｍの糖アルコール、約０．２５Ｍ～約１Ｍの無極性アミノ酸、約０．２５Ｍ～約１Ｍの塩基性アミノ酸、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩を含む。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約７．０～約７．４のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭの緩衝剤、約２Ｍ～約４．５Ｍのカオトロピック試薬、約２Ｍ～約２．５Ｍの糖アルコール、約０．２５Ｍ～約１Ｍの無極性アミノ酸、約０．２５Ｍ～約１Ｍの塩基性アミノ酸、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約７．０～約７．４のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭの緩衝剤、約０．５Ｍ～約２．５Ｍのカオトロピック試薬、約２Ｍ～約２．５Ｍの糖アルコール、約０．２５Ｍ～約１Ｍの無極性アミノ酸、約０．２５Ｍ～約１Ｍの塩基性アミノ酸、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩を含む。

上記の溶出緩衝組成物のいずれについても、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ又はトリスであり得、カオトロピック試薬は、尿素又は塩化グアニジンであり得、糖アルコールは、ソルビトール又はマンニトールであり得、無極性アミノ酸は、プロリンであり得、塩基性アミノ酸は、アルギニン又はリシンであり得、及び塩は、ナトリウム塩、例えば塩化ナトリウムであり得る。例えば、特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、約２Ｍ～約４．５Ｍの尿素、約１Ｍ～約４．５Ｍのソルビトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約７．０～約７．４のｐＨを有し、かつ約２０ｍＭ～約７５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約３Ｍ～約４．２Ｍの尿素、約２Ｍ～約２．５Ｍのソルビトール、約０．３Ｍ～約０．８Ｍのプロリン、約０．３Ｍ～約０．８Ｍのアルギニン、及び約０．５Ｍ～約１Ｍの塩化ナトリウムを含む。一実施形態では、溶出緩衝液は、約７．２のｐＨを有し、かつ約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約４Ｍの尿素、約２．２Ｍのソルビトール、約０．５Ｍのプロリン、約０．５Ｍのアルギニン、及び約０．７５Ｍの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、溶出緩衝液は、約７．２のｐＨを有し、かつ約５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、約４Ｍの尿素、約２．２Ｍのソルビトール、約０．５Ｍのプロリン、約０．５Ｍのアルギニン、及び約０．７５Ｍの塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭのトリス、約２Ｍ～約４．５Ｍの尿素、約１Ｍ～約４．５Ｍのソルビトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む。他の実施形態では、溶出緩衝液は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、約２Ｍ～約４．５Ｍの尿素、約１Ｍ～約４．５Ｍのマンニトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む。さらに他の実施形態では、溶出緩衝液は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭのトリス、約２Ｍ～約４．５Ｍの尿素、約１Ｍ～約４．５Ｍのマンニトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む。

特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．５Ｍ～約２．５Ｍの塩化グアニジン、約１Ｍ～約４．５Ｍのソルビトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭのトリス、約０．５Ｍ～約２．５Ｍの塩化グアニジン、約１Ｍ～約４．５Ｍのソルビトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む。他の実施形態では、溶出緩衝液は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．５Ｍ～約２．５Ｍの塩化グアニジン、約１Ｍ～約４．５Ｍのマンニトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む。さらに他の実施形態では、溶出緩衝液は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭのトリス、約０．５Ｍ～約２．５Ｍの塩化グアニジン、約１Ｍ～約４．５Ｍのマンニトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、精製手順中に生じ得るＦｃ領域含有タンパク質の凝集を低減又は排除する。したがって、本発明はまた、Ｆｃ領域を含むタンパク質の精製中の凝集を低減する方法を含む。一実施形態では、本方法は、Ｆｃ領域含有タンパク質を、温度応答性プロテインＡ材料に、この材料にタンパク質が結合する温度で吸着させる工程と、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつカオトロピック試薬、糖アルコール、無極性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸を含む溶出緩衝液により、約３５℃未満の温度で材料からタンパク質を溶出する工程とを含み、溶出物中の凝集形態のＦｃ領域含有タンパク質の量は、従来のプロテインＡ材料からの溶出液中の量未満である。

本明細書中で使用される場合、Ｆｃ領域含有タンパク質の「凝集形態」は、非共有結合相互作用によって共に保持されたタンパク質の複数分子又は単量体からなるタンパク質の多量体型を指す。Ｆｃ領域含有タンパク質の「単量体型」は、全ての成分及び鎖を含む、タンパク質の単一の完全分子を含むタンパク質の形態を指す。例えば、抗体単量体又は抗体の単量体型は、ジスルフィド結合によって連結された２本の軽鎖及び２本の重鎖からなる。同様に、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質の単量体型は、ジスルフィド結合によって連結された２本の軽鎖及び２本の改変重鎖を含み、各改変重鎖は、そのカルボキシル末端に融合した一本鎖可変フラグメントを含む。ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質の単量体型を図１に示す。図５に示す一本鎖二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合などの一本鎖Ｆｃ領域含有タンパク質では、単量体型は、一本鎖ポリペプチドである。

本明細書に記載の精製方法のいくつかの実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料からの溶出物中のＦｃ領域含有タンパク質のかなりの割合が単量体型である。例えば、本明細書に記載の溶出緩衝液による溶出から生じる温度応答性プロテインＡ材料からの溶出物中のＦｃ領域含有タンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％は、単量体型である。特定の実施形態では、材料からの溶出物中のＦｃ領域含有タンパク質の少なくとも７０％は、単量体型である。いくつかの実施形態では、材料からの溶出物中のＦｃ領域含有タンパク質の少なくとも８０％は、単量体型である。他の実施形態では、材料からの溶出物中のＦｃ領域含有タンパク質の少なくとも９０％は、単量体型である。

本明細書に記載の精製方法の特定の実施形態では、本明細書に記載の溶出緩衝液を用いた温度応答性プロテインＡ材料からの溶出物中の凝集形態のＦｃ領域含有タンパク質の量は、従来のプロテインＡ材料からの溶出液中の凝集形態のＦｃ領域含有タンパク質の量未満である。本明細書中で使用される場合、「従来のプロテインＡ材料」は、酸性条件下（例えば、約６未満のｐＨ）でタンパク質のＦｃ領域に対する親和性を失う、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）株で見出されたプロテインＡの天然又は野生型の形態を指す。従来のプロテインＡ材料としては、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｉｖ Ａ（登録商標）樹脂（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、及びＢｉｏ－ＲａｄからのプロテインＡ樹脂などの市販のプロテインＡ樹脂が挙げられる。従来のプロテインＡ材料からタンパク質を溶出するための一般的な条件としては、約２．５～約４のｐＨの酢酸緩衝液などの酸性溶出緩衝液の使用が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の溶出緩衝液を用いた温度応答性プロテインＡ材料からの溶出物中の凝集形態のＦｃ領域含有タンパク質の量は、約２．５～約４のｐＨを有する酢酸緩衝液（例えば、１％酢酸）を用いた従来のプロテインＡ材料からの溶出液中の凝集形態のＦｃ領域含有タンパク質の量未満である。

本明細書に記載の溶出緩衝液を用いた温度応答性プロテインＡ材料からの溶出物中の凝集形態のＦｃ領域含有タンパク質の量は、好ましくは、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満である。特定の実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料からの溶出物中のＦｃ領域含有タンパク質の３０％未満が凝集形態である。いくつかの実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料からの溶出物中のＦｃ領域含有タンパク質の２０％未満が凝集形態である。他の実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料からの溶出物中のＦｃ領域含有タンパク質の１０％未満が凝集形態である。

タンパク質の凝集形態及び単量体型を検出及び定量する方法は、当業者に知られており、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー法、例えば実施例に記載されるものを挙げることができる。他の好適な方法としては、沈降速度分析超遠心分離、非対称フロー式フィールドフローフラクショネーション、及び動的光散乱法が挙げられる。例えば、Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．９６：２６８－２７９，２００７を参照されたい。

本発明の方法の特定の実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料からの溶出後、Ｆｃ領域含有タンパク質をさらなる精製工程に供することができる。例えば、いくつかの実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料から溶出したＦｃ領域含有タンパク質は、１又は複数のさらなるクロマトグラフィー工程に供される。そのようなさらなるクロマトグラフィー工程としては、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換クロマトグラフィー又はアニオン交換クロマトグラフィー）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、金属アフィニティークロマトグラフィー、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。さらなるクロマトグラフィー工程は、標的タンパク質がクロマトグラフィー材料に結合し、不純物がフロースルーする結合及び溶出モード、又は不純物がクロマトグラフィー材料に結合し、標的タンパク質がフロースルーするフロースルーモードで行うことができる。いくつかの実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料から溶出したＦｃ領域含有タンパク質は、カチオン交換クロマトグラフィーに供される。他の実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料から溶出したＦｃ領域含有タンパク質は、アニオン交換クロマトグラフィーに供される。特定の実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料から溶出したＦｃ領域含有タンパク質は、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供される。さらに他の実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料から溶出したＦｃ領域含有タンパク質は、ミックスモードクロマトグラフィーに供される。特定の他の実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料から溶出されたＦｃ領域含有タンパク質は、以下にさらに詳細に記載するサイズ排除クロマトグラフィー法などのサイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー）に供される。

本発明の方法のクロマトグラフィー工程に続いて、ウイルス不活化工程、ウイルス濾過工程、及び／又は限外濾過／透析濾過工程などの追加の工程を行うことができる。例えば、いくつかの実施形態では、洗剤又はＵＶ不活化方法を使用するウイルス不活化工程は、温度応答性プロテインＡ材料からの溶出液プール又は溶出液を用いて行われ得る。一実施形態では、温度応答性プロテインＡ材料から溶出したＦｃ領域含有タンパク質は、洗剤ウイルス不活化工程に供される。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（例えば、１％ｖ／ｖの濃度で）などの洗剤を温度応答性プロテインＡ材料からの溶出液プール又は溶出液に添加し、中性ｐＨで約３０分～約６０分間インキュベートして、存在するあらゆるウイルスを不活化することができる。

本発明はまた、抗体をそのハーフ抗体形態から分離する方法を提供する。実施例５に記載するように、驚くべきことに、中性ｐＨ及び一定温度で温度応答性プロテインＡ樹脂からＦｃ領域含有タンパク質を溶出するための本明細書に記載の溶出緩衝液をサイズ排除クロマトグラフィーの移動相として使用して、抗体をそのハーフ抗体形態から効率よく分離できることがわかった。したがって、特定の実施形態では、本発明は、抗体をそのハーフ抗体形態から分離する方法であって、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつカオトロピック試薬、糖アルコール、無極性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸を含む移動相を使用して、抗体及びそのハーフ抗体形態を含む溶液をゲル濾過マトリックスと接触させる工程と、ゲル濾過マトリックスから溶出画分を収集する工程とを含み、抗体は、溶出画分の１で溶出され、ハーフ抗体形態は、溶出画分の別のセットで溶出され、それにより抗体をそのハーフ抗体形態から分離する、方法を含む。

「ハーフ抗体」は、一般に、一本の軽鎖ポリペプチド及び一本の重鎖ポリペプチドを含む目的抗体の形態を指す（図９Ａ及び９Ｂの左側の概略図を参照されたい）。ハーフ抗体（「半分子」と互換的に使用される）は、一般に、抗体の２本の重鎖ポリペプチド間の組み立ての不完全性又は相互作用の崩壊（例えば、２本の重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合形成の崩壊）から生じる。特定の実施形態では、それらのハーフ抗体形態から分離される抗体は、多重特異性（例えば、二重特異性）ヘテロ二量体抗体である。このような実施形態では、２種のハーフ抗体が二重特異性ヘテロ二量体抗体の組換え産生から生じ得、一方のハーフ抗体は、第１の抗原に結合し、もう一方のハーフ抗体は、第２の抗原に結合する。本発明の方法は、ハーフ抗体の一方又は両方の種を、完全に組み立てられた抗体から分離することができる。

抗体をそのハーフ抗体形態から分離する方法のいくつかの実施形態では、方法は、精製される抗体及びそのハーフ抗体形態を含む溶液をゲル濾過マトリックスと接触させる工程を含む。ゲル濾過マトリックスは、一般に、カラム又は他の容器に充填することができる架橋ポリマーで作られた多孔性ビーズから構成される。本発明の方法における使用に好適な様々な種類のゲル濾過マトリックスは、市販されており、限定はされないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（架橋デキストラン及びエピクロルヒドリン）などのデキストランをベースとしたゲル、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（アリルデキシトランとＮ、Ｎ’－メチレンビスアクリルアミドの架橋コポリマー）などのポリアクリルアミドをベースとしたゲル；ＳＵＰＥＲＯＳＥ（高度架橋アガロース）又はＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（架橋アガロース）などのアガロースをベースとしたゲル、及びＳＵＰＥＲＤＥＸ（架橋デキストラン及び架橋アガロース）などの２種のゲルから調製された複合体ゲルが挙げられる。特定の実施形態では、ゲル濾過マトリックスは、架橋アガロース及び架橋デキストランを含む。例えば、一実施形態では、ゲル濾過マトリックスは、ＳＵＰＥＲＤＥＸ ２００ゲル濾過マトリックスなどのＳＵＰＥＲＤＥＸゲル濾過マトリックス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。ゲル濾過マトリックスの分画範囲は、約５ｋＤａ～約５０００ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約１５００ｋＤａ、又は約１０ｋＤａ～約６００ｋＤａであり得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用されるゲル濾過マトリックスの分画範囲は、約１０ｋＤａ～約６００ｋＤａである。

完全に組み立てた抗体をハーフ抗体から分離するサイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、中性ｐＨ及び一定温度で温度応答性プロテインＡ樹脂からＦｃ領域含有タンパク質を溶出するための本明細書に記載の溶出緩衝液のいずれかであり得る。特定の実施形態では、移動相は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつカオトロピック試薬、糖アルコール、無極性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸を含む。移動相は、一般に、約６．５～約７．５のｐＨの緩衝溶液である。いくつかの実施形態では、移動相のｐＨは、約６．８～約７．５である。他の実施形態では、移動相のｐＨは、約７．２～約７．５である。特定の一実施形態では、移動相のｐＨは、約７．０～約７．４である。このｐＨ範囲で緩衝する好適な緩衝剤及び濃度は、上で詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、移動相は、ＨＥＰＥＳ緩衝剤を例えば約１５ｍＭ～約１００ｍＭの濃度で含む。他の実施形態では、移動相は、トリス緩衝剤を例えば約１５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で含む。

移動相において使用されるカオトロピック試薬は、上記の濃度のいずれかのカオトロピック試薬のいずれかであり得る。例えば、移動相におけるカオトロピック試薬は、尿素、塩化グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、又はチオシアン酸アンモニウムであり得る。特定の一実施形態では、移動相は、カオトロピック試薬として尿素を含む。このような実施形態では、尿素は、約２Ｍ～約４．５Ｍの濃度で移動相中に存在する。いくつかの実施形態では、移動相は、約３Ｍ～約４．２Ｍの濃度で尿素を含む。他の実施形態では、尿素は、移動相中に約４Ｍの濃度で存在する。

移動相はまた、糖アルコールを含むことが好ましく、これは、溶出緩衝液中に含めるための上記したもののいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、移動相は、糖アルコールとしてソルビトール、マンニトール、キシリトール、又はグリセロールを含む。一実施形態では、移動相中の糖アルコールは、ソルビトールである。別の実施形態では、移動相中の糖アルコールは、マンニトールである。糖アルコールは、選択される具体的な糖アルコールに応じて約１Ｍ～約４．５Ｍ、約１．５Ｍ～約４Ｍ、又は約２Ｍ～約２．５Ｍの濃度で移動相中に存在し得る。特定の実施形態では、移動相は、例えば、約１Ｍ～約４．５Ｍ、より好ましくは約２Ｍ～約２．５Ｍの濃度でソルビトールを含む。一実施形態では、移動相は、約２．２Ｍの濃度でソルビトールを含む。

特定の実施形態では、移動相は、本発明の溶出緩衝液に含めるための上記したものなどの１又は複数のアミノ酸をさらに含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、移動相は、塩基性アミノ酸、無極性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸及び無極性アミノ酸の両方をさらに含み得る。特定の実施形態では、移動相は、ヒスチジン、リシン、オルニチン、及びアルギニンから選択される塩基性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、アルギニンを含む。他の実施形態では、移動相は、リシンを含む。塩基性アミノ酸は、移動相中に約０．１Ｍ～約１．５Ｍ、約０．２５Ｍ～約１Ｍ、又は約０．３Ｍ～約０．８Ｍの濃度で存在し得る。特定の実施形態では、移動相は、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン）を約０．５Ｍの濃度で含む。

いくつかの実施形態では、移動相は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、及びバリンから選択される無極性アミノ酸を含む。特定の実施形態では、移動相は、プロリンを含む。無極性アミノ酸は、移動相中に約０．１Ｍ～約１．５Ｍ、約０．２５Ｍ～約１Ｍ、又は約０．３Ｍ～約０．８Ｍの濃度で存在し得る。特定の実施形態では、移動相は、無極性アミノ酸（例えば、プロリン）を約０．５Ｍの濃度で含む。いくつかの実施形態では、移動相は、少なくとも１つの塩基性アミノ酸と少なくとも１つの無極性アミノ酸とを含む。このような実施形態では、塩基性アミノ酸及び無極性アミノ酸は、移動相中に同じ濃度で存在し得る。例えば、塩基性アミノ酸及び無極性アミノ酸は、それぞれ移動相中に約０．２５Ｍ～約１Ｍ、より好ましくは約０．３Ｍ～約０．８Ｍの濃度で存在し得る。特定の実施形態では、塩基性アミノ酸及び無極性アミノ酸は、それぞれ移動相中に約０．５Ｍの濃度で存在する。一実施形態では、移動相は、アルギニンとプロリンとを含む。別の実施形態では、移動相は、リシン及びプロリンを含む。

いくつかの実施形態では、ハーフ抗体から完全抗体を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィーに基づく方法において使用される移動相は、本発明の溶出緩衝液に含めるための上記した塩のいずれかなどの１又は複数の塩をさらに含み得る。特定の実施形態では、移動相は、塩化ナトリウムを含む。他の実施形態では、移動相は、塩化カリウムを含む。塩は、約０．１Ｍ～約１Ｍ、約０．２５Ｍ～約０．８Ｍ、約０．５Ｍ～約１Ｍ、又は約０．５Ｍ～約０．８Ｍの濃度で移動相中に含まれ得る。一実施形態では、塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約０．７５Ｍの濃度で移動相中に存在する。

特定の実施形態では、本発明の方法で使用される移動相は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約５ｍＭ～約２００ｍＭの緩衝剤、約０．４Ｍ～約５Ｍのカオトロピック試薬、約１Ｍ～約４．５Ｍの糖アルコール、約０．１Ｍ～約１．５Ｍの無極性アミノ酸、約０．１Ｍ～約１．５Ｍの塩基性アミノ酸、及び約０．１Ｍ～約１Ｍの塩を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約７．０～約７．４のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭの緩衝剤、約２Ｍ～約４．５Ｍのカオトロピック試薬、約１Ｍ～約４．５Ｍの糖アルコール、約０．２５Ｍ～約１Ｍの無極性アミノ酸、約０．２５Ｍ～約１Ｍの塩基性アミノ酸、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩を含む。他の実施形態では、移動相は、約７．０～約７．４のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭの緩衝剤、約２Ｍ～約４．５Ｍのカオトロピック試薬、約２Ｍ～約２．５Ｍの糖アルコール、約０．２５Ｍ～約１Ｍの無極性アミノ酸、約０．２５Ｍ～約１Ｍの塩基性アミノ酸、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩を含む。上記の移動相組成物のいずれについても、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ又はトリスであり得、カオトロピック試薬は、尿素又は塩化グアニジンであり得、糖アルコールは、ソルビトール又はマンニトールであり得、無極性アミノ酸は、プロリンであり得、塩基性アミノ酸は、アルギニン又はリシンであり得、及び塩は、ナトリウム塩、例えば塩化ナトリウムであり得る。例えば、特定の実施形態では、移動相は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、約２Ｍ～約４．５Ｍの尿素、約１Ｍ～約４．５Ｍのソルビトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、移動相は、約７．０～約７．４のｐＨを有し、かつ約２０ｍＭ～約７５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約３Ｍ～約４．２Ｍの尿素、約２Ｍ～約２．５Ｍのソルビトール、約０．３Ｍ～約０．８Ｍのプロリン、約０．３Ｍ～約０．８Ｍのアルギニン、及び約０．５Ｍ～約１Ｍの塩化ナトリウムを含む。一実施形態では、移動相は、約７．２のｐＨを有し、かつ約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約４Ｍの尿素、約２．２Ｍのソルビトール、約０．５Ｍのプロリン、約０．５Ｍのアルギニン、及び約０．７５Ｍの塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、移動相は、約７．２のｐＨを有し、かつ約５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、約４Ｍの尿素、約２．２Ｍのソルビトール、約０．５Ｍのプロリン、約０．５Ｍのアルギニン、及び約０．７５Ｍの塩化ナトリウムを含む。

いくつかの実施形態では、移動相は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭのトリス、約２Ｍ～約４．５Ｍの尿素、約１Ｍ～約４．５Ｍのソルビトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む。他の実施形態では、移動相は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、約２Ｍ～約４．５Ｍの尿素、約１Ｍ～約４．５Ｍのマンニトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む。さらに他の実施形態では、移動相は、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつ約１５ｍＭ～約１００ｍＭのトリス、約２Ｍ～約４．５Ｍの尿素、約１Ｍ～約４．５Ｍのマンニトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む。

ゲル濾過マトリックスを通した移動相の流量は、抗体とそのハーフ抗体形態との間の分離をさらに高めるように調節することができる。実施例５に記載したように、移動相の流量を増加させると、完全に組み立てられた抗体とハーフ抗体との間の分離効率が低下した。したがって、特定の実施形態では、より遅い流量とすることが好ましい。いくつかの実施形態では、移動相の流量は、約０．０１ｍｌ／分～約０．２ｍｌ／分の流量でゲル濾過マトリックスに適用される。他の実施形態では、移動相の流量は、約０．０２ｍｌ／分～約０．０６ｍｌ／分の流量でゲル濾過マトリックスに適用される。

抗体及びそのハーフ抗体形態を含む溶液が、本明細書中に記載される移動相と共にゲル濾過マトリックスを移動するにつれ、溶出画分が収集される。画分のタンパク質含量は、ＵＶ吸収、例えば２８０ｎｍを用いてモニターすることができ、完全に組み立てられた抗体を含む溶出画分を集めることができる一方、より高分子量の凝集体及びハーフ抗体を含む画分を廃棄することができる。図１２に示すように、サイズ排除クロマトグラフィーを本発明の方法により操作すると、抗体の凝集体及び他のより高分子量の混入物の凝集体が最初にゲル濾過マトリックスから溶出し、続いて完全に組み立てられた抗体が溶出し、その後、ハーフ抗体が溶出する。溶出画分からの試料を、実施例５に記載するように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又は分析ＳＥ－ＨＰＬＣによって分析して、完全に組み立てられた抗体に対する画分の濃縮及びハーフ抗体の除去を確認することができる。

ハーフ抗体から抗体を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィーに基づく方法（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーに基づく方法）は、１又は複数の精製手順又は他の単位操作後に行うことができる。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーに基づく方法は、抗体、特に多重特異性ヘテロ二量体抗体の精製プロセスにおける第２又は第３の完成度を高めるクロマトグラフィーであり得る。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーに基づく方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製工程に続いて行われる。したがって、抗体及びそのハーフ抗体形態を含有する溶液は、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出液プール又は流出流である。プロテインＡクロマトグラフィーは、従来のプロテインＡクロマトグラフィーであり得る。あるいは、プロテインＡクロマトグラフィーは、本明細書に記載のプロテインＡクロマトグラフィー法であり得る。温度応答性プロテインＡ材料からＦｃ領域含有タンパク質、例えば抗体を除去するために本発明の方法において使用される溶出緩衝液は、ゲル濾過クロマトグラフィーに基づく方法において使用される移動相と同じ組成を有するため、これらの２つの精製手順は、連続して使用することができる。したがって、特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）抗体及び１又は複数の不純物（例えば、そのハーフ抗体形態）を含む溶液を、温度応答性プロテインＡ材料と、抗体が材料に結合する温度で接触させる工程と、（ｉｉ）約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつカオトロピック試薬、糖アルコール、無極性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸を含む溶出緩衝液により、約３５℃未満の温度で抗体を材料から溶出する工程と、（ｉｉｉ）移動相として溶出緩衝液を使用して、温度応答性プロテインＡ材料からの溶出物をゲル濾過マトリックスと接触させる工程と、（ｉｖ）抗体を含むゲル濾過マトリックスからの溶出画分を収集する工程とを含む、抗体を精製する方法を提供する。特定の実施形態では、精製する抗体は、多重特異性ヘテロ二量体抗体である。温度応答性プロテインＡクロマトグラフィー工程及びゲル濾過クロマトグラフィー工程は、温度応答性プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出物流が、いかなる保持タンクも介在せずにゲル濾過マトリックス上に直接ロードされるように連続的に操作され得る。いくつかの実施形態では、洗剤又はＵＶウイルス不活化工程は、任意選択により、温度応答性プロテインＡクロマトグラフィー工程とゲル濾過クロマトグラフィー工程との間に組み込むことができる。

実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例１．ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質の精製
この実施例は、従来のプロテインＡクロマトグラフィー、又は本発明のアフィニティークロマトグラフィー法を用いる、Ｆｃ領域含有タンパク質の１タイプであるＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質の精製を記載する。ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質は、ペプチドリンカーを介して第２の抗体の重鎖のカルボキシル末端に融合された、第１の抗体由来の重鎖及び軽鎖可変ドメインをそれぞれ含有する２つの一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。得られる分子は、免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端側に位置する第１の標的に対する２つの抗原結合ドメイン、及びＦｃ領域のカルボキシル末端側に位置する第２の標的に対する２つの抗原結合ドメインを有する四価結合タンパク質である。ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質の単量体型を図１に示す。

比較のために、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質を、従来のプロテインＡアフィニティーーを用いて精製した。ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質を発現する細胞を含有する細胞培養培地１００～２５０ｍｌを、細胞及び細胞破片を沈殿させるために、４℃で１５分間、低速遠心分離（６００ｒｐｍ）に供した。得られた清澄化上清溶液を０．２２ミクロンフィルターに通して、微粒子及び可溶性凝集体を除去した。清澄化し、濾過した溶液を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するカラムに１ｍｌ／分の流量及び４℃の温度でロードした。ｐＨ７．２の０．５ＭのＮａＣｌを含有するリン酸緩衝生理食塩水でカラムを洗浄した後、結合されたＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質を、ｐＨ２．７の１７４ｍＭ（１％）酢酸溶液を用いて４℃の温度で従来のプロテインＡ樹脂から溶出した。溶出液プールの試料を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００分析ゲル濾過カラムを使用するサイズ排除－超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）によって分析した。４つの独立した実験の結果を図２に示す。１つの実験では、タンパク質を、ｐＨ７．２に中和することなく、低ｐＨ酢酸緩衝液で溶出した（図２の上部パネル）。第２の実験では、タンパク質を低ｐＨ酢酸緩衝液で溶出し、直ちにｐＨ７．２に中和した（図２の２番目のパネル）。第３の実験では、タンパク質を低ｐＨ酢酸緩衝液で溶出し、中和することなく、低ｐＨ酢酸緩衝液で８週間保存した（図２の３番目のパネル）。第４の実験では、タンパク質を低ｐＨ酢酸緩衝液で溶出し、低ｐＨ酢酸緩衝液で８週間保存した後、ｐＨ７．２に中和した（図２の下部パネル）。

ＳＥ－ＵＰＬＣプロファイルによって示すように、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質は、クロマトグラムにおける単量体ピーク（黒い星印によって示す）の前に溶出する複数のピーク（黒い矢印によって示す）からも明らかなように、従来のプロテインＡアフィニティーカラムからの低ｐＨ溶出の間に凝集する傾向が高い。酸曝露及び低ｐＨから中性ｐＨへのｐＨジャンプは、いずれもＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質の凝集を誘導し、ｐＨジャンプは、酸曝露単独よりも大きい有害作用を有する。従来のプロテインＡカラムのローディング及び溶出も室温で行い、図２に示したものと同様の結果を得た（データは示さず）。

第２の一連の実験において、温度応答性プロテインＡ樹脂、及びカラムの温度を室温より高く上昇させずに温度応答性プロテインＡ樹脂から結合タンパク質を溶出させることができる特定の溶出緩衝液を使用して、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質を精製した。温度応答性プロテインＡ（ＴＲ－ＰｒｏＡ）カラムを調製するために、約２５ｍｌの懸濁ＴＲ－ＰｒｏＡ樹脂（Ｂｙｚｅｎ Ｐｒｏ（登録商標）、Ｎｏｍａｄｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．，ＬＴＤ．）を１５ｍｌカラムに充填し、最終体積を１５ミリリットルにした。カラムを５カラム容量の溶液Ａ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２）で洗浄した。次いで、カラムを溶液Ｂ（０．５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ）で洗浄し、続いて１０カラム容量の水で濯いだ。次いで、濯いだカラムを、ｐＨ７．２の、２５又は５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含有する１５カラム容量の溶出緩衝液で洗浄した。次いで、カラムを溶液Ａで平衡化した。

ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質を含有する種々の容量（１０ｍｌ～２５０ｍｌ）の清澄化及び濾過した培養培地を４℃、１ｍｌ／分の流量でＴＲ－ＰｒｏＡカラムにロードした。１０カラム容量の溶液Ｂで洗浄した後、結合されたＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質を５～１０カラム容量の溶出緩衝液により４℃又は室温で溶出した。溶出後、製造業者の使用説明書に従ってカラムを再生した。溶出液プールの試料を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００分析ゲル濾過カラムを用い、ＳＥ－ＵＰＬＣによって分析した。溶出を４℃で行った３回の独立した実験の結果を図３に示す。１つの実験では、タンパク質を４℃で溶出緩衝液により溶出し、３７℃で７日間保存した後、ＳＥ－ＵＰＬＣ分析を行った（図３の上部パネル）。第２の実験では、タンパク質を４℃で溶出緩衝液により溶出し、－８０℃で７日間保存した後、ＳＥ－ＵＰＬＣ分析を行った（図３の２番目のパネル）。第３の実験では、タンパク質を４℃で溶出緩衝液により溶出し、室温で７日間保存した後、ＳＥ－ＵＰＬＣ分析を行った（図３の３番目のパネル）。結果は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質が、溶出緩衝液を用いて低温でＴＲ－ＰｒｏＡ樹脂から単量体型で溶出され得ることを示す。結合タンパク質の凝集は、単量体ピーク（黒い星印で示す）の前にゲル濾過分析カラムから溶出するピークが存在しないことからも明らかなように、完全に除かれた。さらに、溶出条件は、溶出されたＩｇＧ－ｓｃＦｖタンパク質のその後の温度安定性に影響を与えなかった。溶出したタンパク質を種々の温度で７日間保存した結果、溶出したタンパク質の凝集又は分解は観察されなかった。

ＴＲ－ＰｒｏＡカラムを用いたＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質の精製を、４℃ではなく室温で溶出を行った以外には上記と同じローディング及び溶出条件を用いて繰り返した。ローディング前の清澄化培養培地の試料、ローディング中のカラムフロースルー溶液、及び溶出液プールをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質が溶出液プール中で濃縮され、多くの混入タンパク質が除去されたことを示す（図４Ａ）。ＴＲ－ＰｒｏＡ溶出液プールの試料もサイズ排除－高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によって分析した。図４ＢのＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラムに示すように、ＴＲ－ＰｒｏＡ溶出液プール中に存在するＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質の９９％は、単量体型であり、検出可能な凝集体はなかった。

まとめると、この実施例における実験の結果は、複数鎖ＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質などのＦｃ領域含有タンパク質を中性ｐＨで温度応答性プロテインＡ樹脂から溶出することができ、従来のプロテインＡクロマトグラフィーからの低ｐＨ溶出で通常生じるタンパク質の凝集を低減又は排除し得ることを示す。さらに、結果は、カオトロピック試薬、糖アルコール、及びアミノ酸を含む溶出緩衝液により、温度応答性プロテインＡ樹脂からタンパク質を溶出するのに一般に必要とされる３５℃を超える温度に上昇させることなく、温度応答性プロテインＡ樹脂からのＦｃ領域含有タンパク質の溶出が可能になることを示す。

実施例２．一本鎖二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の精製
この実施例は、従来のプロテインＡクロマトグラフィー又は本発明のアフィニティークロマトグラフィー方法を使用して、Ｆｃ領域含有タンパク質の第２のタイプの、国際公開第２０１４１４４７２２号パンフレット（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような一本鎖二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の精製を記載する。一本鎖二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質は、第１の抗体からの重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有し、第２の抗体からの重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有する第２のｓｃＦｖフラグメントに融合した第１のｓｃＦｖフラグメントと、そのＮ末端でペプチドリンカーを介して第１のｓｃＦｖフラグメントのＣ末端に融合したＦｃ領域とを含む。二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の単量体型を図５に示す。

最初の一連の実験において、二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質を、従来のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質を発現する細胞を含有する細胞培養培地を、６００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を除去し、０．２２ミクロンフィルターで濾過した。次いで、清澄化した細胞培養上清を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するカラムにロードし、実施例１に記載の方法により洗浄した。カラムを洗浄した後、結合された二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質を、ｐＨ２．７の１７４ｍＭ（１％）酢酸溶液又はｐＨ３．７の３３ｍＭ（０．０６％）酢酸溶液を使用して従来のプロテインＡ樹脂から室温で溶出した。溶出液プールの試料をＳＥ－ＨＰＬＣにより分析した。

図６Ａは、１７４ｍＭ（１％）酢酸溶液を溶出緩衝液として用いた場合の溶出液プールのＳＥ－ＨＰＬＣプロファイルを示す一方、図６Ｂは、より低濃度の酢酸溶液を溶出緩衝液として用いた場合の溶出液プールのＳＥ－ＨＰＬＣプロファイルを示す。両方の溶出条件下では、結合タンパク質単量体のピーク（黒い星印で示す）よりも短い保持時間を有する複数のピーク（黒い矢印で示す）からも明らかなように、二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質のかなりの凝集が観察された。１７４ｍＭ（１％）酢酸溶液を溶出緩衝液として使用した場合、二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の単に３９％が単量体型で回収された。溶出緩衝液中の酢酸の濃度を減少させると、結合タンパク質の単量体型の回収が改善されたが、溶出液プール中の結合タンパク質の単に５３％が単量体型であり、相当量の凝集が依然として観察された。したがって、二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質は、従来のプロテインＡクロマトグラフィーに必要とされる典型的な低ｐＨ溶出条件下で特に凝集しやすい。

第２の一連の実験では、温度応答性プロテインＡ樹脂（Ｂｙｚｅｎ Ｐｒｏ（登録商標）、Ｎｏｍａｄｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．，ＬＴＤ．）と、カオトロピック試薬、糖アルコール、無極性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸を含む溶出緩衝液とを用いて、実施例１に記載のようにして二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質を精製した。この溶出緩衝液により、通常、温度応答性プロテインＡ樹脂からタンパク質の溶出するために必要な工程である、カラムの温度を上昇させることなく、温度応答性プロテインＡ（ＴＲ－ＰｒｏＡ）樹脂から結合タンパク質を溶出することが可能になった。具体的には、二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質を含有する清澄化した細胞培養上清を１ｍｌ／分の流量及び４℃の温度でＴＲ－ＰｒｏＡカラムにロードした。１０カラム容量の、０．５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳで洗浄した後、結合された二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質を５～１０カラム容量の溶出緩衝液１又は溶出緩衝液２により室温で溶出した。溶出緩衝液１は、ｐＨ７．２で２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び２．５Ｍの尿素を含有した。溶出緩衝液２は、ｐＨ７．２で２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含有した。溶出液プールの試料をＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。

図７Ａは、室温での溶出緩衝液１による結合タンパク質の溶出から得られた溶出液プールのＳＥ－ＨＰＬＣプロファイルを示す一方、図７Ｂは、室温での溶出緩衝液２による結合タンパク質の溶出から得られた溶出液プールのＳＥ－ＨＰＬＣプロファイルを示す。両方のプロファイルからわかるように、実施例１に記載のＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質で得られた結果と同様に、二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質は、３０℃未満の温度で両方の溶出緩衝液を用いてＴＲ－ＰｒｏＡ樹脂から実質的に単量体型で溶出され得る。両方の溶出条件下において、Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の凝集は、低ｐＨ緩衝液を用いた従来のプロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶出で生じる凝集と比較して大きく減少した（図６Ａ及び６Ｂ中の黒い矢印で示すピークを図７Ａ及び７Ｂ中のピークと比較されたい）。さらに、図７Ａのプロファイルと図７Ｂのプロファイルとの比較は、溶出緩衝液中のカオトロピック試薬（例えば、尿素）の濃度を２．５Ｍから４Ｍに増加させると、溶出液プール中に回収された単量体Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の割合が７５％から８８％に増加し、さらに溶出液プール中に存在する凝集結合タンパク質の量が減少することを示す。ＴＲ－ＰｒｏＡ樹脂及び溶出緩衝液２による二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質の精製前、精製中、及び精製後の試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を図７Ｃに示す。結果は、Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質が溶出液プールにおいて濃縮されていることを示す。

この実施例に記載した実験の結果は、二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質などの一本鎖Ｆｃ融合タンパク質が、結合されたタンパク質を従来のプロテインＡ樹脂から溶出するのに必要とされる低ｐＨ条件中に凝集する傾向があることを示す。このような結合タンパク質の凝集は、温度応答性プロテインＡ樹脂と、カオトロピック試薬、糖アルコール、無極性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸を含む溶出緩衝液とを使用することによって大きく低減される。重要なことに、溶出緩衝液の組成は、温度を３５℃より高く上昇させることなく、結合タンパク質を温度応答性プロテインＡ樹脂から実質的に単量体型で除去することを可能にする。

実施例３．温度応答性プロテインＡ樹脂からのＦｃ領域含有タンパク質の溶出のための緩衝液
この実施例に記載する実験は、異なる溶出緩衝液について、樹脂の温度を室温より高く上昇させることなく、結合されたＦｃ領域含有タンパク質を温度応答性プロテインＡ（ＴＲ－ＰｒｏＡ）樹脂から除去する能力を調べるために設計された。実施例１に記載のＩｇＧ－ｓｃＦｖ結合タンパク質、又は実施例２に記載の一本鎖二重特異性Ｆｖ－Ｆｃ結合タンパク質を発現する細胞からの清澄化細胞培養上清を温度応答性プロテインＡ樹脂（Ｂｙｚｅｎ Ｐｒｏ（登録商標）、Ｎｏｍａｄｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．，ＬＴＤ．）のカラムに４℃でロードし、０．５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ溶液で洗浄した。結合された結合タンパク質を、以下の表２に列挙した溶出緩衝液の１つを使用して４℃でカラムから溶出した。溶出液プール中に単量体として回収された結合タンパク質の割合を、ＳＥ－ＨＰＬＣを用いて測定した。結果を以下の表２に示す。

結果は、カオトロピック試薬（例えば、尿素）の含有により、結合タンパク質の単量体型の溶出及び回収が大きく増強されることを示す。

実施例４．モノクローナル抗体の精製
この実施例は、温度応答性プロテインＡ樹脂を使用するモノクローナル抗体の精製を記載する。抗体を発現する細胞からの清澄化細胞培養上清を温度応答性プロテインＡ樹脂（Ｂｙｚｅｎ Ｐｒｏ（登録商標），Ｎｏｍａｄｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．，ＬＴＤ．）のカラムに４℃でロードし、０．５ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ溶液で洗浄した。結合された抗体を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２Ｍの塩化グアニジン、及び２．２Ｍのソルビトールを含み、かつｐＨ７．２を有する溶出緩衝液により４℃でカラムから溶出した。溶出液プールの試料をＳＥ－ＨＰＬＣによって分析し、その結果を図８Ａ及び８Ｂに示す。モノクローナル抗体は、カオトロピック試薬（例えば、塩化グアニジン）及び糖アルコール（ソルビトール）のみを約０．９のモル濃度比で含む溶出緩衝液を使用して、低温で温度応答性プロテインＡ樹脂から溶出され得る。溶出液プールにおいて、抗体のほぼ９０％が単量体型で回収された。

実施例５．ハーフ抗体の完全抗体からの分離
ハーフ抗体は、抗体の２本の重鎖ポリペプチド間の組み立ての不完全性又は相互作用の崩壊（例えば、２本の重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合形成の崩壊）から生じる。ハーフ抗体は、一般に、一本の軽鎖ポリペプチド及び一本の重鎖ポリペプチドから構成される。所望の完全抗体を含む調製物からハーフ抗体を除去することは、いくつかの理由で重要である。ハーフ抗体の存在は、全抗体生成濃度を減少させ、用量再現性を減少させ、かつ生成物の均質性を低下させる。さらに、ハーフ抗体は、標的への結合に関して完全抗体と競合し得、完全抗体の効力を低下させ得る。

ハーフ抗体は、完全抗体と類似した特性を有するため、ハーフ抗体を完全抗体から分離することは困難であり得る。例えば、ハーフ抗体及び完全抗体の両方は、類似のＦｃ領域を含み、したがってプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して効率的に分離することができない。ハーフ抗体は、完全抗体と類似の等電点、軸比、及び流体力学的半径を有し、したがって、これらの特徴に基づく分離方法は、一般に適切ではない。さらに、ハーフ抗体は、自己会合し、完全抗体と会合する傾向があり、それらの除去をより困難にする。

従来のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製後でも、抗体、特にヘテロ二量体抗体の組換え調製物において、ハーフ抗体の存在が多くの場合に観察される（図９Ａ及び９Ｂ）。ヘテロ二量体抗体は、第１の標的に結合する第１の抗体からの軽鎖及び重鎖、ならびに第２の標的に結合する第２の抗体からの軽鎖及び重鎖を含む抗体である。したがって、これらの二重特異性ヘテロ二量体抗体の組換え産生から２種のハーフ抗体が生じ得、一方のハーフ抗体は、第１の標的に結合し、もう一方のハーフ抗体は、第２の標的に結合する。ハーフ抗体の存在及びレベルは、ヘテロ二量体抗体の組換え産生の異なるロットと異なり得（図９Ａ及び９Ｂ）、完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体の全収率は、ハーフ抗体を除去するために必要とされる工程の数及び性質のために非常に低いことができる（データは示さず）。

二重特異性ヘテロ二量体抗体（ヘテロ二量体抗体Ａ）を発現する細胞を含有する細胞培養培地を、細胞及び細胞破片を沈殿させるために、４℃で１５分間、低速遠心分離（６００ｒｐｍ）に供した。得られた清澄化上清溶液を０．２２ミクロンフィルターに通して、微粒子及び可溶性凝集物を除去した。清澄化し、濾過した溶液を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するカラムに１ｍｌ／分の流量及び４℃の温度でロードした。ｐＨ７．２の０．５ＭのＮａＣｌを含有するリン酸緩衝生理食塩水でカラムを洗浄した後、結合された抗体を、ｐＨ２．７の１７４ｍＭ（１％）酢酸溶液を用いて４℃の温度で従来のプロテインＡ樹脂から溶出した。溶出液プールの試料をＳＥ－ＨＰＬＣ（図１０Ａ）及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１０Ｂ）によって分析した。ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって示されるように、プロテインＡ溶出液プールは、相当量（約７２％）のハーフ抗体を含有していた。

プロテインＡ溶出液プール中に残存するハーフ抗体を除去するために、従来の条件下で操作される分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）工程を評価した。具体的には、プロテインＡ溶出液プールを、ｐＨ７．０のリン酸緩衝化生理食塩水を含む移動相を用いて１ｍｌ／分の流量でＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００分取ゲル濾過カラムにロードした。図１１に示すように、これらの条件下で操作されたＳＥＣは、完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体をハーフ抗体から分離することができなかった。ＰＢＳ含有移動相の分取ＳＥＣカラムに通す流量を０．０１ｍｌ／分まで低下させても、分離は改善されなかった（データは示さず）。

実験を繰り返したが、ＰＢＳを含む従来の移動相を、実施例１に記載の特有の溶出緩衝液と同様の組成を有する移動相で置き換えた。完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体及びハーフ抗体を含むプロテインＡ溶出液プールを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含むｐＨ７．２の移動相を使用して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００分取ゲル濾過カラム（２×８０ｍｌ）にロードした。３つの異なるタンパク質ピークが分取ゲル濾過カラムからの溶出中に観察された（図１２）。様々な画分を溶出中に回収し、分析ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、ピーク２は、完全に組み立てられた抗体を主に含むが、ピーク３は、大部分がハーフ抗体からなることを明らかになった（図１３Ａ及び１３Ｂ）。ピーク１は、より高分子量の凝集体に対応した。驚くべきことに、ＳＥＣにおけるこの特有の移動相の使用により、完全に組み立てられた抗体及びより高い分子量の凝集体からのハーフ抗体の分離が可能になった（図１４Ａ～１４Ｃ）。

異なる標的抗原に対して特異性を有する２つの他の二重特異性ヘテロ二量体抗体を用いて、上記の特有の移動相を用いる分取ＳＥＣプロセスを繰り返した。ＳＥＣ精製前のヘテロ二量体抗体Ｂ及びヘテロ二量体抗体Ｃの両方の調製物は、ハーフ抗体混入物を含有していた（図１５Ａ及び１６Ａ）。しかし、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含むｐＨ７．２の移動相を用いてＳＥＣで精製した後、完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体は、所望の完全に組み立てられたヘテロ二量体抗体のみが残るようにハーフ抗体から分離することができた（図１５Ｂ及び１６Ｂ）。

別の一連の実験において、ＳＥＣを用いたハーフ抗体分離の効率に対する流量の影響を評価した。組換え二重特異性ヘテロ二量体抗体の調製物を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００分取ゲル濾過カラム（２×８０ｍｌ）、及び５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのアルギニン、０．５Ｍのプロリン、２．２Ｍのソルビトール、及び４Ｍの尿素を含むｐＨ７．２の移動相を用いて、０．０２ｍｌ／分～０．２ｍｌ／分の範囲の流量でＳＥＣに供した（図１７Ａ～１７Ｆ）。結果は、ハーフ抗体が、流量がより小さくなると完全に組み立てられた抗体からより効率よく分離され、最適な分離が約０．０２ｍｌ／分～約０．０６ｍｌ／分の流量で起こることを示す（図１７Ａ～１７Ｆ）。

まとめると、この実施例に記載の実験データは、カオトロピック試薬、糖アルコール、及びアミノ酸を含む移動相をＳＥＣゲル濾過カラムで使用することにより、完全に組み立てられた抗体からハーフ抗体混入物及び高分子量凝集体を効率よく分離できることを示している。この方法は、組換え抗体調製物、特に多重特異性ヘテロ二量体抗体調製物からこれらの問題のある混入物を除去するための強力な１段法を提供する。

本明細書において議論され引用された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。開示した本発明は、記載された特定の方法論、プロトコール、及び材料に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語が、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図していないことも理解される。

当業者であれば、単なる日常的な実験により、本明細に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、又は確認することができるであろう。このような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。

Claims (116)

1. Ｆｃ領域を含むタンパク質を精製する方法であって、
   前記タンパク質及び１又は複数の不純物を含む溶液を、温度応答性プロテインＡ材料と、前記タンパク質が前記材料に結合する温度で接触させる工程と、
   約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつカオトロピック試薬、糖アルコール、無極性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸を含む溶出緩衝液により、約３５℃未満の温度で前記材料から前記タンパク質を溶出する工程と
   を含み、前記タンパク質は、前記溶液中の１又は複数の不純物から精製される、方法。
2. 前記カオトロピック試薬は、尿素、塩化グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、又はチオシアン酸アンモニウムである、請求項１に記載の方法。
3. 前記カオトロピック試薬は、尿素である、請求項２に記載の方法。
4. 前記尿素は、約２Ｍ～約４．５Ｍの濃度で存在する、請求項３に記載の方法。
5. 前記尿素は、約４Ｍの濃度で存在する、請求項４に記載の方法。
6. 前記糖アルコールは、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、又はグリセロールである、請求項１に記載の方法。
7. 前記糖アルコールは、ソルビトールである、請求項１に記載の方法。
8. 前記糖アルコールは、約１Ｍ～約４．５Ｍの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
9. 前記糖アルコールは、約２Ｍ～約２．５Ｍの濃度で存在する、請求項８に記載の方法。
10. 前記塩基性アミノ酸は、ヒスチジン、リシン、オルニチン、又はアルギニンである、請求項１に記載の方法。
11. 前記塩基性アミノ酸は、アルギニンである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記無極性アミノ酸は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、又はバリンである、請求項１に記載の方法。
13. 前記無極性アミノ酸は、プロリンである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記塩基性アミノ酸及び／又は前記無極性アミノ酸は、約０．２５Ｍ～約１Ｍの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
15. 前記塩基性アミノ酸及び／又は前記無極性アミノ酸は、約０．５Ｍの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
16. 前記溶出緩衝液は、塩をさらに含む、請求項１に記載の方法。
17. 前記塩は、約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの濃度で存在する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記塩は、塩化ナトリウムである、請求項１６に記載の方法。
19. 前記溶出緩衝液は、約２Ｍ～約４．５Ｍの尿素、約１Ｍ～約４．５Ｍのソルビトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記溶出緩衝液は、約４Ｍの尿素、約２．２Ｍのソルビトール、約０．５Ｍのアルギニン、約０．５Ｍのプロリン、及び約０．７５Ｍの塩化ナトリウムを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記溶出緩衝液は、約７．０～約７．４のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
22. 前記タンパク質を前記材料から溶出する工程は、約１℃～約２５℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
23. 前記タンパク質を前記材料から溶出する工程は、約１℃～約６℃の温度で行われる、請求項２２に記載の方法。
24. 前記タンパク質を前記材料から溶出する工程は、約２０℃～約２５℃の温度で行われる、請求項２２に記載の方法。
25. 前記温度応答性プロテインＡ材料は、固相に固定される、請求項１に記載の方法。
26. 前記固相は、ビーズ、樹脂、ゲル、フィルム、又は粒子である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記溶液を前記材料と接触させる工程は、約１０℃以下の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
28. 前記溶液を前記材料と接触させる工程は、約１℃～約６℃の温度で行われる、請求項２７に記載の方法。
29. 前記タンパク質を前記材料から溶出する前に、前記結合されたタンパク質を有する前記材料を１又は複数の洗浄溶液で洗浄する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
30. 前記１又は複数の洗浄溶液は、塩化ナトリウムを約０．５Ｍ～約２Ｍの濃度で含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記Ｆｃ領域を含むタンパク質は、哺乳動物細胞において組換え技術によって産生される、請求項１に記載の方法。
32. 前記哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記Ｆｃ領域を含むタンパク質は、抗体である、請求項１に記載の方法。
34. 前記Ｆｃ領域を含むタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
35. 前記Ｆｃ融合タンパク質は、少なくとも１つの一本鎖Ｆｖフラグメントを含む、請求項３４に記載の方法。
36. １又は複数の不純物は、宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、細胞培養タンパク質、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
37. 前記タンパク質及び１又は複数の不純物を含む前記溶液は、生産バイオリアクターからの回収物である、請求項１に記載の方法。
38. 前記タンパク質及び１又は複数の不純物を含む前記溶液は、細胞培養上清である、請求項１に記載の方法。
39. 前記タンパク質及び１又は複数の不純物を含む前記溶液は、細胞溶解物である、請求項１に記載の方法。
40. 前記材料からの溶出物中の前記Ｆｃ領域含有タンパク質の少なくとも７０％は、単量体型である、請求項１に記載の方法。
41. 前記材料からの溶出物中の前記Ｆｃ領域含有タンパク質の少なくとも８０％は、単量体型である、請求項１に記載の方法。
42. 前記材料からの溶出物中の前記Ｆｃ領域含有タンパク質の少なくとも９０％は、単量体型である、請求項１に記載の方法。
43. 前記溶出されたＦｃ領域含有タンパク質を１又は複数のクロマトグラフィー工程に供する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
44. 前記１又は複数のクロマトグラフィー工程は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、金属アフィニティークロマトグラフィー、又はこれらの組み合わせである、請求項４３に記載の方法。
45. 前記溶出されたＦｃ領域含有タンパク質を、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつカオトロピック試薬、糖アルコール、無極性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸を含む移動相を用いるサイズ排除クロマトグラフィーに供する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
46. Ｆｃ領域を含むタンパク質及び１又は複数の不純物を含む溶液から前記タンパク質を精製する方法であって、
    前記タンパク質を、温度応答性プロテインＡ材料に、前記タンパク質が前記材料に結合する温度で吸着させる工程と、
    約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつカオトロピック試薬及び糖アルコールを含む溶出緩衝液により、約３５℃未満の温度で前記タンパク質を前記材料から溶出する工程と
    を含み、前記糖アルコールに対する前記カオトロピック試薬のモル濃度比は、約０．４～約４．５である、方法。
47. 前記糖アルコールに対する前記カオトロピック試薬の前記モル濃度比は、約１．５～約２．５である、請求項４６に記載の方法。
48. 前記糖アルコールに対する前記カオトロピック試薬の前記モル濃度比は、約１．８～約２．２である、請求項４６に記載に記載の方法。
49. 前記糖アルコールに対する前記カオトロピック試薬の前記モル濃度比は、約０．５～約１．５である、請求項４６に記載の方法。
50. 前記カオトロピック試薬は、尿素、塩化グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、又はチオシアン酸アンモニウムである、請求項４６に記載の方法。
51. 前記カオトロピック試薬は、尿素である、請求項５０に記載の方法。
52. 前記カオトロピック試薬は、塩化グアニジンである、請求項５０に記載の方法。
53. 前記糖アルコールは、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、又はグリセロールである、請求項４６に記載の方法。
54. 前記糖アルコールは、ソルビトールである、請求項５３に記載の方法。
55. 前記溶出緩衝液は、１又は複数のアミノ酸をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
56. 前記溶出緩衝液は、塩基性アミノ酸及び／又は無極性アミノ酸を含む、請求項５５に記載の方法。
57. 前記塩基性アミノ酸は、ヒスチジン、リシン、オルニチン、又はアルギニンである、請求項５６に記載の方法。
58. 前記塩基性アミノ酸は、アルギニンである、請求項５７に記載の方法。
59. 前記無極性アミノ酸は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、又はバリンである、請求項５６に記載の方法。
60. 前記無極性アミノ酸は、プロリンである、請求項５９に記載の方法。
61. 前記溶出緩衝液は、アルギニン及びプロリンを含む、請求項５５に記載の方法。
62. 前記溶出緩衝液は、塩をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
63. 前記塩は、塩化ナトリウムである、請求項６２に記載の方法。
64. 前記溶出緩衝液は、約７．０～約７．４のｐＨを有する、請求項４６に記載の方法。
65. 前記タンパク質を前記材料から溶出する工程は、約１℃～約２５℃の温度で行われる、請求項４６に記載の方法。
66. 前記タンパク質を前記材料から溶出する工程は、約１℃～約６℃の温度で行われる、請求項６５に記載の方法。
67. 前記タンパク質を前記材料から溶出する工程は、約２０℃～約２５℃の温度で行われる、請求項６５に記載の方法。
68. 前記温度応答性プロテインＡ材料は、固相に固定される、請求項４６に記載の方法。
69. 前記固相は、ビーズ、樹脂、ゲル、フィルム、又は粒子である、請求項６８に記載の方法。
70. 前記タンパク質を前記温度応答性プロテインＡ材料に吸着させる工程は、約１０℃以下の温度で行われる、請求項４６に記載の方法。
71. 前記タンパク質を前記温度応答性プロテインＡ材料に吸着させる工程は、約１℃～約６℃の温度で行われる、請求項７０に記載の方法。
72. 前記タンパク質を前記材料から溶出する前に、前記結合されたタンパク質を有する前記材料を１又は複数の洗浄溶液で洗浄する工程をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
73. 前記Ｆｃ領域を含むタンパク質は、哺乳動物細胞において組換え技術によって産生される、請求項４６に記載の方法。
74. 前記哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項７３に記載の方法。
75. 前記Ｆｃ領域を含むタンパク質は、抗体である、請求項４６に記載の方法。
76. 前記Ｆｃ領域を含むタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質である、請求項４６に記載の方法。
77. 前記Ｆｃ融合タンパク質は、少なくとも１つの一本鎖Ｆｖフラグメントを含む、請求項７６に記載の方法。
78. 前記タンパク質及び１又は複数の不純物を含む前記溶液は、生産バイオリアクターからの回収物である、請求項４６に記載の方法。
79. 前記タンパク質及び１又は複数の不純物を含む前記溶液は、細胞培養上清である、請求項４６に記載の方法。
80. 前記タンパク質及び１又は複数の不純物を含む前記溶液は、細胞溶解物である、請求項４６に記載の方法。
81. 前記材料からの溶出物中の前記Ｆｃ領域含有タンパク質の少なくとも７０％は、単量体型である、請求項４６に記載の方法。
82. 前記材料からの溶出物中の前記Ｆｃ領域含有タンパク質の少なくとも８０％は、単量体型である、請求項４６に記載の方法。
83. 前記材料からの溶出物中の前記Ｆｃ領域含有タンパク質の少なくとも９０％は、単量体型である、請求項４６に記載の方法。
84. 前記溶出されたＦｃ領域含有タンパク質を１又は複数のクロマトグラフィー工程に供する工程をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
85. 前記１又は複数のクロマトグラフィー工程は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、金属アフィニティークロマトグラフィー、又はこれらの組み合わせである、請求項８４に記載の方法。
86. 前記溶出されたＦｃ領域含有タンパク質を、約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつカオトロピック試薬、糖アルコール、無極性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸を含む移動相を用いるサイズ排除クロマトグラフィーに供する工程をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
87. 抗体をそのハーフ抗体形態から分離する方法であって、
    約６．５～約７．５のｐＨを有し、かつカオトロピック試薬、糖アルコール、無極性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸を含む移動相を使用して、抗体及びそのハーフ抗体形態を含む溶液をゲル濾過マトリックスと接触させる工程と、
    前記ゲル濾過マトリックスから溶出画分を収集する工程と
    を含み、前記抗体は、溶出画分の１セットで溶出され、前記そのハーフ抗体形態は、溶出画分の別のセットで溶出され、それにより前記抗体を前記そのハーフ抗体形態から分離する、方法。
88. 前記カオトロピック試薬は、尿素、塩化グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、又はチオシアン酸アンモニウムである、請求項８７に記載の方法。
89. 前記カオトロピック試薬は、尿素である、請求項８８に記載の方法。
90. 前記尿素は、約２Ｍ～約４．５Ｍの濃度で存在する、請求項８９に記載の方法。
91. 前記尿素は、約４Ｍの濃度で存在する、請求項９０に記載の方法。
92. 前記糖アルコールは、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、又はグリセロールである、請求項８７に記載の方法。
93. 前記糖アルコールは、ソルビトールである、請求項８７に記載の方法。
94. 前記糖アルコールは、約１Ｍ～約４．５Ｍの濃度で存在する、請求項８７に記載の方法。
95. 前記糖アルコールは、約２Ｍ～約２．５Ｍの濃度で存在する、請求項９４に記載の方法。
96. 前記塩基性アミノ酸は、ヒスチジン、リシン、オルニチン、又はアルギニンである、請求項８７に記載の方法。
97. 前記塩基性アミノ酸は、アルギニンである、請求項９６に記載の方法。
98. 前記無極性アミノ酸は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、又はバリンである、請求項８７に記載の方法。
99. 前記無極性アミノ酸は、プロリンである、請求項９８に記載の方法。
100. 前記塩基性アミノ酸及び／又は前記無極性アミノ酸は、約０．２５Ｍ～約１Ｍの濃度で存在する、請求項８７に記載の方法。
101. 前記塩基性アミノ酸及び／又は前記無極性アミノ酸は、約０．５Ｍの濃度で存在する、請求項８７に記載の方法。
102. 前記移動相は、塩をさらに含む、請求項８７に記載の方法。
103. 前記塩は、約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの濃度で存在する、請求項１０２に記載の方法。
104. 前記塩は、塩化ナトリウムである、請求項１０２に記載の方法。
105. 前記移動相は、約２Ｍ～約４．５Ｍの尿素、約１Ｍ～約４．５Ｍのソルビトール、約０．２５Ｍ～約１Ｍのアルギニン、約０．２５Ｍ～約１Ｍのプロリン、及び約０．２５Ｍ～約０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む、請求項１０４に記載の方法。
106. 前記移動相は、約４Ｍの尿素、約２．２Ｍのソルビトール、約０．５Ｍのアルギニン、約０．５Ｍのプロリン、及び約０．７５Ｍの塩化ナトリウムを含む、請求項１０５に記載の方法。
107. 前記移動相は、約７．０～約７．４のｐＨを有する、請求項８７に記載の方法。
108. 前記移動相は、約０．０１ｍｌ／分～約０．２ｍｌ／分の流量で前記ゲル濾過マトリックスに適用される、請求項８７に記載の方法。
109. 前記移動相は、約０．０２ｍｌ／分～約０．０６ｍｌ／分の流量で前記ゲル濾過マトリックスに適用される、請求項８７に記載の方法。
110. 前記ゲル濾過マトリックスは、約１０ｋＤａ～約６００ｋＤａの分画範囲を有する、請求項８７に記載の方法。
111. 前記ゲル濾過マトリックスは、架橋アガロース及び架橋デキストランを含む、請求項８７に記載の方法。
112. 前記抗体は、哺乳動物細胞において組換え技術によって産生される、請求項８７に記載の方法。
113. 前記哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１１２に記載の方法。
114. 前記抗体は、多重特異性ヘテロ二量体抗体である、請求項８７に記載の方法。
115. 前記抗体及びそのハーフ抗体形態を含む溶液は、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出液プール又は流出流である、請求項８７に記載の方法。
116. 前記抗体及びそのハーフ抗体形態を含む溶液は、細胞培養上清又は細胞溶解物である、請求項８７に記載の方法。

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