CN115925780A

CN115925780A - 含有Fc的蛋白的纯化方法

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Publication number: CN115925780A
Application number: CN202210979746.6A
Authority: CN
Inventors: J.K.卡乌亚
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2016-07-22
Filing date: 2017-07-21
Publication date: 2023-04-07
Also published as: IL264375A; IL264375B; CN109563125A; JP2019528255A; AU2017298984A1; MA45721A; JP2022120138A; IL285146A; SG11201900573UA; KR102579850B1; MX2019000903A; US20190127418A1; EP3487867A2; CA3031469A1; CA3218290A1; AU2017298984B2; AU2023222915A1; KR102435801B1; WO2018018011A2; KR20190037247A

Abstract

本发明涉及含有Fc的蛋白的纯化方法。本发明涉及纯化含有Fc区的蛋白，例如抗体和Fc融合蛋白的方法。特别地，本发明涉及一种导致聚集体蛋白水平降低的纯化方法，所述方法包括将含有Fc区的蛋白吸附到温度响应性蛋白A树脂上，以及用洗脱缓冲液在低于约35C的温度从所述树脂中洗脱所述蛋白，所述洗脱缓冲液包含离液剂、糖醇、和至少一种氨基酸。还描述了使用洗脱缓冲液将完全组装的抗体与其半抗体形式分离的方法。

Description

含有Fc的蛋白的纯化方法

本申请为分案申请，原申请的申请日为2017年7月21日，申请号为201780045463.1(PCT/US2017/043384)，发明名称为“含有Fc的蛋白的纯化方法”。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年7月22日提交的美国临时申请号62/365,943的权益，将其通过引用以其全部内容并入本文。

电子提交的文本文件的说明

本申请含有一份已经以ASCII格式电子提交的序列表并且将该序列表通过引用以其全部内容并入本文。2017年7月20日创建的序列表的计算机可读格式副本命名为A-2036-WO-PCT_SeqList_ST25，并且大小为8.81千字节。

技术领域

本发明涉及生物药剂制造领域。特别地，本发明涉及在纯化操作过程中减少或防止含有Fc区的蛋白聚集的方法。本发明还涉及从难以去除的污染物(例如半抗体)中分离抗体的方法。

背景技术

聚集体仍然是基因工程化的生物制剂(特别是包含免疫球蛋白Fc区的融合蛋白，例如多特异性抗原结合蛋白)生产中的主要问题。蛋白聚集体由于其强烈的免疫原性而在治疗药物中是不可接受的(Maggio,Journal of Excipients and Food Chemicals[辅料与食品化学杂志],第3卷(2):45-53,2012；Sauerborn等人,Trends Pharmacol.Sci.[药理科学趋势],第31卷(2):53-59,2010)。由于培养基的充分通气需要细胞培养物的剧烈振荡，蛋白聚集体可以在蛋白的重组表达过程中发生(Vazquez-Rey和Lang,Biotechnology andBioengineering[生物技术和生物工程],第108卷(7):1494-1508,2011)。此外，许多蛋白易于解折叠，暴露于极端pH条件下(即pH>9.0或pH<4.5)，随后发生聚集。包含免疫球蛋白Fc区的蛋白的典型纯化方法需要用蛋白A亲和树脂捕获蛋白，并且随后用低pH酸性缓冲液(例如pH 2.7至3.7)从树脂上洗脱(Hari等人,Biochemistry[生物化学],第49卷(43):9328–9338,2010；Ejima等人,PROTEINS:Structure,Function,and Bioinformatics[蛋白：结构、功能、和生物信息学],第66卷:954–962,2007)。低pH洗脱不仅诱导蛋白聚集，从而导致产率降低，而且还可能损害回收的非聚集蛋白的长期稳定性。

为了避免由对蛋白A树脂进行低pH洗脱产生的不良效应，开发了温度响应性蛋白A树脂作为常规蛋白A树脂的替代物。这种新树脂由蛋白A的突变体形式组成，其在低于10℃的温度与免疫球蛋白的Fc区结合，但在升高的温度(例如40℃)对Fc区失去亲和力(Koguma等人,Journal of Chromatography A[色谱学杂志A辑],第1305卷:149-153,2013)。最初，人们怀着极大的热情接受了温度响应性蛋白A树脂，因为它允许通过简单地加热柱在中性pH下从树脂中洗脱含有Fc区的蛋白(Koguma等人,Journal of Chromatography A[色谱学杂志A辑],第1305卷:149-153,2013)。虽然用温度响应性蛋白A树脂纯化蛋白会产生稳定的分子，但这种方法是不切实际的，因为它需要从柱加载到洗脱使柱温改变30℃或更高，因此在加载和洗脱步骤之间产生显著的延迟时间。操纵柱温需要的时间延迟为纯化操作增加了大量的循环时间，从而使得这种方法对于大规模制造过程和在发现阶段期间大组的蛋白的高通量纯化而言都是不可取的。此外，大范围温度波动对从温度响应性蛋白A树脂洗脱的蛋白稳定性的影响仍然未知。

因此，本领域需要针对含有Fc区的蛋白的有效纯化方法，所述方法使得对与先前蛋白A色谱法相关的蛋白的结构完整性的影响最小化或降低。

发明内容

本发明部分基于缓冲液组合物的开发，所述缓冲液组合物允许在中性pH和恒温下从温度响应性蛋白A树脂洗脱结合的含有Fc区的蛋白。采用温度响应性蛋白A树脂与本文描述的洗脱缓冲液组合的纯化方案导致聚集的蛋白水平降低，从而减少下游纯化步骤的数量。另外，这类纯化方法对于工业制造而言是易于扩大规模的，因为使用本文描述的洗脱缓冲液，可以按与温度无关的方式进行洗脱。

因此，本发明提供了纯化包含Fc区的蛋白的方法。在一个实施例中，所述方法包括在蛋白与温度响应性蛋白A材料结合的温度使包含蛋白和一种或多种杂质的溶液与材料接触；以及用本文描述的洗脱缓冲液在低于约35℃的温度从材料中洗脱蛋白，其中所述蛋白从溶液中的一种或多种杂质中纯化。

在某些实施例中，本发明还提供了用于在包含Fc区的蛋白的纯化期间减少聚集的方法。在一个实施例中，所述方法包括在蛋白与温度响应性蛋白A材料结合的温度将蛋白吸附到材料上；以及用本文描述的洗脱缓冲液在低于约35℃的温度从材料中洗脱蛋白，其中洗脱液中聚集形式的含有Fc区的蛋白的量小于来自常规蛋白A材料的洗脱液中的量。在一些实施例中，来自温度响应性蛋白A材料的洗脱液中聚集形式的含有Fc区的蛋白的量小于30％。在相关的实施例中，来自温度响应性蛋白A材料的洗脱液中至少70％的含有Fc区的蛋白呈单体形式。

本发明方法中所使用的洗脱缓冲液具有中性范围的pH(例如约6.5至约7.5的pH)并包含离液剂和糖醇。在一些实施例中，离液剂和糖醇以约0.4至约4.5的摩尔浓度比存在。在一个实施例中，离液剂与糖醇的摩尔浓度比为约1.1至约1.8。取决于所用的特定的离液剂，洗脱缓冲液中离液剂的浓度可以为约0.4M至约5M。在一些实施例中，离液剂可以是尿素、氯化胍或硫氰酸盐(例如硫氰酸钠、硫氰酸钾、或硫氰酸铵)。在某些实施例中，离液剂是尿素。在其他的实施例中，离液剂是氯化胍。洗脱缓冲液中糖醇的浓度可以为从约1M至约4.5M。在某些实施例中，糖醇是山梨糖醇、甘露醇、或甘油。在一个实施例中，糖醇是山梨糖醇。在另一个实施例中，糖醇是甘露醇。

在一些实施例中，本发明方法中采用的洗脱缓冲液进一步包含一种或多种氨基酸。氨基酸可以是非极性氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、或缬氨酸，和/或碱性氨基酸，例如组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含至少一种非极性氨基酸和至少一种碱性氨基酸。例如，在一个实施例中，洗脱缓冲液包含脯氨酸和精氨酸。洗脱缓冲液中氨基酸的浓度可为从约0.25M至约1M。

在各种实施例中，洗脱缓冲液可进一步包含盐，例如钠盐或氯化物盐。盐可以以约0.1M至约1M的浓度存在于洗脱缓冲液中。在一些实施例中，洗脱缓冲液中包括的盐是氯化钠。

在某些实施例中，本发明方法中使用的洗脱缓冲液包含约2M至约4.5M的离液剂、约1M至约4.5M的糖醇、约0.25M至约1M的碱性氨基酸、约0.25M至约1M的非极性氨基酸、和约0.25M至约0.8M的盐。在一些这样的实施例中，离液剂是尿素，糖醇是山梨糖醇，碱性氨基酸是精氨酸，非极性氨基酸是脯氨酸，并且盐是氯化钠。

根据本发明的方法从温度响应性蛋白A材料中洗脱含有Fc区的蛋白可以在从约1℃至约25℃的温度进行。在一些实施例中，蛋白的洗脱在蛋白吸附或结合温度响应性蛋白A材料的相同或相似温度进行。例如，在一个实施例中，含有Fc区的蛋白的洗脱在低于约10℃的温度进行，例如，从约1℃至约6℃。在其他实施例中，含有Fc区的蛋白的洗脱在室温进行，例如在约20℃至约25℃进行。

可根据本文描述的方法纯化的含有Fc区的蛋白包括抗体、Fc-融合蛋白、和多特异性抗原结合蛋白。在一些实施例中，含有Fc区的蛋白是抗体。在其他实施例中，含有Fc区的蛋白是Fc-融合蛋白，例如包含至少一个单链Fv片段的Fc-融合蛋白。含有Fc区的蛋白可以(例如在哺乳动物细胞中)重组地产生。在此类实施例中，可以从细胞培养上清液或细胞裂解液中纯化含有Fc区的蛋白，例如由生物反应器的收获操作产生的那些。

本发明还部分基于以下发现：当与包含离液剂、糖醇、和至少一种氨基酸作为流动相的缓冲液一起使用时，尺寸排阻色谱法可以有效地将完全组装的抗体与半抗体污染物分离。因此，本发明还提供了用于将抗体与其半抗体形式分离的方法。在一个实施例中，所述方法包括使用pH为约6.5至约7.5，并且包含离液剂、糖醇、非极性氨基酸、和碱性氨基酸的流动相，使包含抗体及其半抗体形式的溶液与凝胶过滤基质接触；以及从凝胶过滤基质中收集洗脱级分，其中将抗体在一组洗脱级分中洗脱，并且将其半抗体形式在另一组洗脱级分中洗脱，从而将抗体与其半抗体形式分离。在所述方法的某些实施例中，抗体是多特异性(例如双特异性)异二聚体抗体。

本文描述的用于在中性pH和恒温从温度响应性蛋白A树脂洗脱含有Fc区的蛋白的任何洗脱缓冲液可用作尺寸排阻色谱法中的流动相，用于将抗体与其半抗体形式分离。在一些实施例中，流动相包含约2M至约4.5M的离液剂、约1M至约4.5M的糖醇、约0.25M至约1M的碱性氨基酸、和约0.25M至约1M的非极性氨基酸。在这些和其他的实施例中，流动相包含尿素、山梨糖醇、精氨酸、和脯氨酸。在某些实施例中，流动相包含约2M至约4.5M尿素、约1M至约4.5M山梨糖醇、约0.25M至约1M精氨酸、约0.25M至约1M脯氨酸、和0.25M至约0.8M氯化钠。在一些实施例中，流动相包含约4M尿素、约2.2M山梨糖醇、约0.5M精氨酸、约0.5M脯氨酸、和约0.75M氯化钠。流动相的pH可以为从约6.5至约7.5，或在具体的实施例中，为从约7.0至约7.4。

在所述方法的某些实施例中，流动相以约0.01ml/min至约0.2ml/min的流速通过凝胶过滤基质。在其他的实施例中，流动相以约0.02ml/min至约0.06ml/min的流速通过凝胶过滤基质。凝胶过滤基质可以由交联琼脂糖和葡聚糖组成，并且可以具有约10kDa至约600kDa的分级范围。

附图说明

图1.IgG-scFv结合蛋白的结构。这幅图描绘了IgG-scFv结合蛋白的示意图，所述IgG-scFv结合蛋白是可通过本文描述的方法纯化的含有Fc的蛋白的实例。IgG-scFv结合蛋白由两个单链可变片段(scFv)组成，每个片段包含来自第一抗体的可变结构域，所述第一抗体通过肽接头连接在一起，通过另一种肽接头与第二抗体的重链的羧基末端融合。

图2.从常规蛋白A柱洗脱的IgG-scFv结合蛋白。这幅图示出了来自IgG-scFv结合蛋白的蛋白A洗脱液池的样品的SE-UPLC色谱图。使用1％乙酸缓冲液，pH 2.7，在4℃从常规蛋白A色谱柱洗脱结合蛋白。SEC-UPLC柱外的洗脱液含有聚集峰(用黑色箭头指示)和单体峰(用黑色星指示)。四个图中的每一个都是单独的实验。

图3.IgG-scFv结合蛋白从温度响应性蛋白A色谱柱在4℃洗脱。这幅图示出了来自对IgG-scFv结合蛋白的蛋白A洗脱液池的样品的SE-UPLC色谱图。使用pH为7.2且包含50mMHEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素的洗脱缓冲液，从温度响应性蛋白A色谱柱在4℃洗脱结合蛋白。单体峰由黑色星指示。三个图中的每一个都是单独的实验。

图4A.在温度响应蛋白A色谱柱上纯化期间IgG-scFv结合蛋白的SDS-PAGE。凝胶上每个泳道的样品如下：Stds＝蛋白标准品；进料＝柱加载之前澄清的细胞培养上清液样品；FT＝柱流过级分的样品；以及洗脱液＝在室温用洗脱缓冲液从柱中洗脱结合蛋白后洗脱液池的样品，所述洗脱缓冲液包含pH 7.2的25mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素。

图4B.IgG-scFv结合蛋白从温度响应性蛋白A色谱柱在室温洗脱。这幅图示出了用于IgG-scFv结合蛋白的温度响应性蛋白A洗脱液池的样品的SE-HPLC色谱图。使用pH为7.2且包含25mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素的洗脱缓冲液，从温度响应性蛋白A色谱柱在室温洗脱结合蛋白。保留时间为约14分钟的峰是结合蛋白的单体形式。插图为色谱图上示出的每个峰提供保留时间和峰面积和高度。存在于洗脱液池中的大约99％的IgG-scFv结合蛋白呈单体形式。

图5.单链双特异性Fv-Fc结合蛋白的结构。这幅图描绘了单链双特异性Fv-Fc结合蛋白的示意图，所述Fv-Fc结合蛋白是可通过本文描述的方法纯化的含有Fc的蛋白的实例。单链双特异性Fv-Fc结合蛋白包含第一scFv片段，所述第一scFv片段含有来自第一抗体的重链和轻链可变结构域，与第二scFv片段融合，所述第二scFv片段含有来自第二抗体的重链和轻链可变结构域，和在其N-末端通过肽接头与第一scFv片段融合的Fc区。

图6A.使用174mM乙酸从常规蛋白A柱洗脱的双特异性Fv-Fc结合蛋白的SE-HPLC色谱图。使用174mM(1％)乙酸，pH 2.7在室温从常规蛋白A色谱柱洗脱双特异性Fv-Fc结合蛋白。黑色箭头指示对应于结合蛋白聚集体的峰。黑色星指示对应于结合蛋白的单体形式的峰。插图为色谱图上示出的每个峰提供保留时间和峰面积和高度。存在于洗脱液池中的大约39％的双特异性Fv-Fc结合蛋白呈单体形式。

图6B.使用33mM乙酸从常规蛋白A柱洗脱的双特异性Fv-Fc结合蛋白的SE-HPLC色谱图。使用33mM(0.06％)乙酸，pH 3.7在室温从常规蛋白A色谱柱洗脱双特异性Fv-Fc结合蛋白。黑色箭头指示对应于结合蛋白聚集体的峰。黑色星指示对应于结合蛋白的单体形式的峰。插图为色谱图上示出的每个峰提供保留时间和峰面积和高度。存在于洗脱液池中的大约53％的双特异性Fv-Fc结合蛋白呈单体形式。

图7A.从温度响应性蛋白A柱洗脱的双特异性Fv-Fc结合蛋白的SE-HPLC色谱图。使用pH为7.2且包含25mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和2.5M尿素的洗脱缓冲液，从温度响应性蛋白A色谱柱在室温洗脱双特异性Fv-Fc结合蛋白。插图为色谱图上示出的峰提供保留时间和峰面积和高度。黑色箭头指示对应于结合蛋白聚集体的峰。保留时间为约15.9分钟的峰对应于Fv-Fc结合蛋白的单体形式，并用黑色星注释。存在于洗脱液池中的大约75％的双特异性Fv-Fc结合蛋白呈单体形式。

图7B.从温度响应性蛋白A柱洗脱的双特异性Fv-Fc结合蛋白的SE-HPLC色谱图。使用pH为7.2且包含25mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素的洗脱缓冲液，从温度响应性蛋白A色谱柱在室温洗脱双特异性Fv-Fc结合蛋白。插图为色谱图上示出的每个峰提供保留时间和峰面积和高度。黑色箭头指示对应于结合蛋白聚集体的峰。保留时间为约15.9分钟的峰对应于Fv-Fc结合蛋白的单体形式，并用黑色星注释。存在于洗脱液池中的大约88％的双特异性Fv-Fc结合蛋白呈单体形式。

图7C.来自温度响应性蛋白A柱缓冲液的双特异性Fv-Fc洗脱液的SDS-PAGE。在用温度响应性蛋白A色谱柱纯化双特异性Fv-Fc结合蛋白期间获取不同的样品。凝胶上每个泳道的样品如下：Stds＝蛋白标准品；进料＝柱加载之前澄清的细胞培养上清液样品；FT＝柱流过级分的样品；以及洗脱液＝在室温用洗脱缓冲液从柱中洗脱结合蛋白后洗脱液池的样品，所述洗脱缓冲液包含pH 7.2的25mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素。

图8A.从温度响应性蛋白A柱在4℃洗脱的单克隆抗体的SE-HPLC色谱图。使用pH为7.2且包含20mM HEPES，2M氯化胍和2.2M山梨糖醇的洗脱缓冲液，从温度响应性蛋白A色谱柱在4℃洗脱抗体。对应于抗体单体形式的峰用黑色星指示。

图8B.表总结了图8A中色谱图中示出的峰的特征。在洗脱液池中以单体形式回收了近90％的单克隆抗体。

图9A和9B.图描绘了在常规蛋白A纯化后来自两个不同批次的重组双特异性异源二聚体抗体的LCMS色谱图。在两个批次中检测到完全组装的异源二聚体抗体，所述异源二聚体抗体具有预测的质量为148351道尔顿，和一种半抗体，所述半抗体具有预测的质量为74355道尔顿。未检测到具有预测的质量为74004道尔顿的其他种类的半抗体。半抗体的水平因批次而异。

图10A.图示出了对双特异性异源二聚体抗体(“异源二聚体抗体A”)的常规蛋白A洗脱液池的样品的SE-HPLC色谱图。完全组装的异源二聚体抗体(“全抗体”)在分析尺寸排阻柱上的半抗体之前洗脱。色谱图下方的表为色谱图上示出的两个峰提供保留时间和峰面积、宽度、和高度。大约72％的半抗体存在于洗脱液池中。

图10B.来自双特异性异源二聚体抗体(“异源二聚体抗体A”)的常规蛋白A洗脱液池的样品的SDS-PAGE分析。将还原的(凝胶的左侧)或非还原的(凝胶的右侧)条件下的指示样品体积加载到4％-20％梯度的Tris-甘氨酸SDS凝胶上。将蛋白标准品加载到中间泳道中。通过常规蛋白A色谱法纯化后存在显著量的半抗体。

图11.双特异性异源二聚体抗体(“异源二聚体抗体A”)制剂的制备型SEC色谱图。使用包含PBS，pH 7.0的流动相对双特异性异源二聚体抗体制剂进行制备型SEC凝胶过滤。在常规条件下操作的SEC不能将半抗体从完全组装的异源二聚体抗体和其他不完整的片段分开。

图12.来自制备型SEC凝胶过滤柱(2x80ml Superdex 200)的双特异性异源二聚体抗体(“异源二聚体抗体A”)的常规蛋白A洗脱液池的洗脱曲线。在用pH 7.2的包含50mMHEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素的流动相以0.02ml/min的流速进行SEC。观察到三个主要蛋白峰。

图13A和13B.来自SEC的洗脱级分的SDS-PAGE分析，其曲线示出于图12。通过三个峰中的每一个收集级分。“L”＝在SEC之前加载材料。在非还原(图13A)或还原(图13B)条件下将样品加载到4％-20％梯度Tris-甘氨酸SDS凝胶上。峰2主要包含完全组装的抗体(“F”)，而峰3主要包含半抗体(“H”)。峰1对应于较高分子量聚集体。使用包含50mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素，在pH 7.2下的流动相的SEC有效地将完全组装的异源二聚体抗体从半抗体分离。

图14A.图示出了来自加载材料样品的分析SE-HPLC色谱图，其包含SEC前的双特异性异源二聚体抗体和来自图12中示出的SEC期间的三个主要蛋白峰中的每一个的洗脱级分。将来自包含双特异性异源二聚体抗体(“异源二聚体抗体A”)的常规蛋白A色谱的洗脱液池加载到制备型SEC凝胶过滤柱(2x80ml Superdex 200)上。在用pH 7.2的包含50mMHEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素的流动相以0.02ml/min的流速进行SEC。完全组装的异源二聚体抗体主要在峰2中洗脱，而半抗体主要在峰3中洗脱。较高分子量的聚集体在峰1中洗脱。用该流动相操作的SEC可以有效地将完全组装的异源二聚体抗体从半抗体污染物分离。

图14B.来自常规蛋白A洗脱液池的重组异源二聚体抗体样品、SEC前的加载材料、和SEC之后的最终池的SDS-PAGE分析。在非还原(凝胶的左侧)或还原(凝胶的右侧)条件下将样品加载到4％-20％梯度Tris-甘氨酸SDS凝胶上。

图14C.在用pH 7.2的包含50mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素的流动相进行SEC纯化后，重组双特异性异源二聚体抗体的LCMS色谱图。只有完全组装的异源二聚体抗体是可检测的。两种半抗体都不是可检测的。SEC有效地去除半抗体污染物。与图9A和9B比较。

图15A和15B.图描绘了在用pH 7.2的包含50mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素的流动相进行SEC纯化之前(图15A)和之后(图15B)，重组双特异性异源二聚体抗体B的LCMS色谱图。在SEC纯化之前，制剂含有完全组装的抗体和半抗体。在SEC纯化后，不能检测到半抗体。

图16A和16B.图描绘了在用pH 7.2的包含50mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素的流动相进行SEC纯化之前(图16A)和之后(图16B)，重组双特异性异源二聚体抗体C的LCMS色谱图。在SEC纯化之前，制剂含有完全组装的抗体和半抗体。在SEC纯化后，不能检测到半抗体。

图17A-17F.使用pH 7.2的包含50mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素的流动相，从制备型SEC凝胶过滤柱的洗脱级分中重组双特异性异源二聚体抗体的SDS-PAGE分析。SEC以不同的流速进行：0.02ml/min(图17A)、0.04ml/min(图17B)、0.06ml/min(图17C)、0.08ml/min(图17D)、0.1ml/min(图17E)、和0.2ml/min(图17F)。“F”＝完全组装的异源二聚体抗体。“H”＝半抗体。在非还原条件下将样品加载到4％-20％梯度Tris-甘氨酸SDS凝胶上。半抗体分离效率随着流速的增加而降低。

具体实施方式

本发明部分基于含有Fc区的蛋白(例如抗体和Fc融合蛋白)的纯化方法的开发，所述蛋白使聚集的蛋白和其他污染物(例如半抗体)的水平最小化。用于纯化含有Fc区的蛋白的常规方法典型地采用蛋白A亲和色谱柱，所述色谱柱需要极酸性溶液将结合的蛋白从柱上洗脱。这种酸性溶液通常诱导蛋白的聚集、不稳定、和(经常情况下)沉淀。虽然已经开发了修饰的温度响应性蛋白A树脂，所述树脂允许使用温度转变在中性pH下洗脱结合的蛋白，但是由于树脂温度提高所需的大量时间，这种修饰的树脂不适用于大规模制造操作。

本发明人设计了一种含有Fc区的蛋白的纯化方法，所述方法避免使用传统蛋白A色谱的低pH洗脱缓冲液和修饰的温度响应性蛋白A树脂所需的升高的温度。本发明的纯化方法采洗脱缓冲液，所述缓冲液包含离液剂、糖醇和任选地一种或多种氨基酸。洗脱缓冲液的组成允许与温度响应性蛋白A树脂结合的蛋白在中性pH下从树脂中除去或洗脱，而不会使树脂的温度升高到35℃以上。还令人惊讶地发现，所述洗脱缓冲液也可用作尺寸排阻色谱法中的流动相，以有效地将抗体从其半抗体形式分离。

因此，在一个实施例中，本发明提供了从包含蛋白和一种或多种杂质的溶液中纯化包含Fc区的蛋白的方法，所述方法包括在蛋白与温度响应性蛋白A材料结合的温度下使溶液与材料接触；以及用本文描述的洗脱缓冲液在低于约35℃的温度从材料中洗脱蛋白。

在另一个实施例中，本发明提供了一种从其半抗体形式中分离抗体的方法，所述方法包括使用本文描述的洗脱缓冲液之一作为流动相，使包含抗体和其半抗体形式的溶液与凝胶过滤基质接触，以及从凝胶过滤基质中收集洗脱级分，其中抗体在一组洗脱级分中洗脱，并且其半抗体形式在另一组洗脱级分中洗脱，从而将抗体与其半抗体形式分离。

本发明的方法特别地适用于纯化包含免疫球蛋白Fc区的蛋白。如本文所用，“包含Fc区的蛋白”或“含有Fc区的蛋白”是指包含对应于免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列的连续氨基酸序列的蛋白或多肽。术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C-末端区，所述末端区可以通过木瓜蛋白酶消化完整抗体而产生。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且任选地包含CH4结构域。在某些实施例中，Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4免疫球蛋白的Fc区。在一些实施例中，Fc区包含来自人IgG1或人IgG2免疫球蛋白的CH2和CH3结构域。

可根据本发明的方法纯化的含有Fc区的蛋白包括但不限于抗体、Fc-融合蛋白、和多特异性抗原结合蛋白。如本文所用，术语“抗体”是指包含两个轻链多肽(每个约25kDa)和两个重链多肽(各自约50-70kDa)的四聚体免疫球蛋白。术语“轻链”或“免疫球蛋白轻链”是指从氨基末端至羧基末端包含单个免疫球蛋白轻链可变区(VL)和单个免疫球蛋白轻链恒定区(CL)的多肽。免疫球蛋白轻链恒定结构域(CL)可以是kappa(κ)或lambda(λ)。术语“重链”或“免疫球蛋白重链”是指从氨基末端到羧基末端包含单个免疫球蛋白重链可变区(VH)、免疫球蛋白重链恒定结构域1(CH1)、免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白重链恒定结构域2(CH2)、免疫球蛋白重链恒定结构域3(CH3)、和任选地免疫球蛋白重链恒定结构域4(CH4)的多肽。重链被分类为mu(μ)、delta(δ)、gamma(γ)、alpha(α)、和epsilon(ε)，并将抗体的同种型分别地定义为IgM、IgD、IgG、IgA、和IgE。IgG类和IgA类抗体进一步分别地分为亚类，即IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4、以及IgA1和IgA2。IgG、IgA、和IgD抗体中的重链具有三个结构域(CH1、CH2、和CH3)，而IgM和IgE抗体中的重链具有四个结构域(CH1、CH2、CH3、和CH4)。免疫球蛋白重链恒定结构域可以来自任何免疫球蛋白同种型，包括亚型。抗体链经由CL结构域和CH1结构域之间(即轻链和重链之间)和抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。

可根据本发明的方法纯化的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、和人抗体。在一些实施例中，抗体是酸敏感性抗体。如本文所用，“酸敏感性抗体”是指在酸性条件下(例如在低于约6的pH下)不稳定、聚集、或丧失结构完整性的抗体。在某些实施例中，抗体是多特异性(例如双特异性)异源二聚体抗体。多特异性异源二聚体抗体是指能够特异性地结合两种或更多种不同抗原并包含两种不同轻链和两种不同重链的抗体。例如，在一些实施例中，双特异性异源二聚体抗体包含来自第一抗体的轻链和重链，所述第一抗体特异性结合第一抗原，以及来自第二抗体的轻链和重链，所述第二抗体特异性结合第二抗原(参见图9A和9B右侧的示意图，其中填充的符号表示与第一抗原形成结合位点的轻链和重链，并且未填充的符号表示与第二抗原形成结合位点的轻链和重链)。双特异性异源二聚体抗体可以通过在同一细胞中共表达两条轻链和两条重链或分别地表达多肽链并随后组装它们来产生。为了促进异源二聚体形成，可以使用例如“杵臼结构(knobs-into-holes)”方法或电荷配对方法来工程化多肽链。这些方法是本领域技术人员已知的并且描述于WO 96/027011；Ridgway等人,Protein Eng.[蛋白质工程],第9卷:617-621,1996；Merchant等人,Nat,Biotechnol.[自然生物技术],第16卷:677-681,1998；WO2009/089004；WO 2014/081955；和Gunasekaran等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],第285卷:19637-19646,2010中，将其通过引用以其全部内容并入本文。

在某些实施例中，根据本发明的方法纯化的抗体是单克隆抗体。

如本文所用，术语“单克隆抗体”(或“mAb”)是指从基本上均一的抗体群体中获得的抗体，即包含群体的个体的抗体是同一的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对个体抗原位点或表位，与典型地包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反。单克隆抗体可以使用本领域已知的任何技术产生，例如，通过在完成免疫规划后永生从转基因动物收获的脾细胞。脾细胞可以使用本领域已知的任何技术永生化，例如通过将它们与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。用于产生杂交瘤的融合方法的骨髓瘤细胞优选地是非抗体产生的，具有高融合效率和酶缺陷，并且使得它们不能在某些选择性培养基中生长，所述培养基仅支持所希望的融合细胞(杂交瘤)的生长。用于小鼠融合的合适细胞系的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XXO Bul；用于大鼠融合的细胞系的实例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210。用于细胞融合的其他细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。

在一些实施例中，单克隆抗体可以是人源化抗体。“人源化抗体”是指其中区(例如框架区)已被修饰以包含来自人免疫球蛋白的对应区的抗体。通常，人源化抗体可以从最初在非人动物中产生的单克隆抗体产生。单克隆抗体中的某些氨基酸残基，典型地来自抗体的非抗原识别部分，被修饰为与对应同种型的人抗体中的对应残基同源。例如，通过用啮齿动物可变区的至少一部分取代人抗体的对应区，可以使用各种方法进行人源化(参见，例如美国专利号5,585,089和5,693,762；Jones等人,Nature[自然],第321卷:522-525,1986；Riechmann等人,Nature[自然],第332卷:323-27,1988；Verhoeyen等人,Science[科学],第239卷:1534-1536,1988)。可以将在另一物种中产生的抗体的轻链和重链可变区的CDR移植到共有的人框架区(FR)。为了产生共有人FR，可以将来自若干人重链或轻链氨基酸序列的FR进行比对以鉴定共有氨基酸序列。

在其他实施例中，单克隆抗体可以是完全人抗体。“完全人抗体”是包含衍生自或指示人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。可以通过免疫转基因动物(通常是小鼠)来产生完全人抗体，所述转基因动物能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体库。用于此目的的抗原典型地具有六个或更多个连续氨基酸，并且任选地与载体缀合，例如半抗原。参见，例如Jakobovits等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:2551-2555；Jakobovits等人,1993,Nature[自然],362:255-258；和Bruggermann等人,1993,Year in Immunol.[免疫学之年]7:33。在这种方法的一个实例中，通过使编码其中的小鼠重和轻免疫球蛋白链的内源小鼠免疫球蛋白基因座失能，并将含有编码人重链和轻链蛋白的基因座的人基因组DNA的大片段插入小鼠基因组中来产生转基因动物。然后将具有少于人免疫球蛋白基因座的全补体的部分修饰的动物杂交以获得具有所有希望的免疫系统修饰的动物。当给予免疫原时，这些转基因动物产生对免疫原具有免疫特异性但具有人而不是鼠氨基酸序列的抗体，包括可变区。有关此类方法的进一步详细信息，参见，例如WO 96/33735和WO 94/02602。与用于制备人抗体的转基因小鼠有关的另外的方法描述于美国专利号5,545,807；6,713,610；6,673,986；6,162,963；5,939,598；5,545,807；6,300,129；6,255,458；5,877,397；5,874,299和5,545,806；PCT公开WO 91/10741、WO90/04036、WO 94/02602、WO 96/30498、WO 98/24893中，和EP 546073B1和EP 546073A1中。

还可以使用噬菌体展示技术产生人衍生的抗体。噬菌体展示描述于，例如Dower等人,WO 91/17271，McCafferty等人,WO 92/01047，以及Caton和Koprowski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],87:6450-6454(1990)中，将其每个通过引用以其全部内容并入本文。通过噬菌体技术产生的抗体通常作为抗原结合片段产生，例如，Fv或Fab片段，在细菌中，并因此缺乏效应子功能。效应函数可以通过以下两种策略之一引入：如果希望的，可以将片段工程化成用于在哺乳动物细胞中表达的完整抗体，或工程化成具有能够触发效应子功能的第二结合位点的双特异性抗体片段。典型地，抗体的Fd片段(VH-CH1)和轻链(VL-CL)通过PCR分别地克隆并在组合噬菌体展示文库中随机地重组，然后可以选择其与特定抗原结合。抗体片段在噬菌体表面上表达，并且通过抗原结合选择Fv或Fab(并因此含有编码抗体片段的DNA的噬菌体)通过若干轮抗原结合和再扩增来完成，所述过程称为淘选。对抗原特异的抗体片段富集并最终分离。噬菌体展示技术也可用于啮齿动物单克隆抗体的人源化方法，称为“引导选择”(参见Jespers,L.S.,等人,Bio/Technology[生物技术]12,899-903(1994))。对此，可以将小鼠单克隆抗体的Fd片段与人轻链文库组合展示，并且然后可以用抗原选择得到的杂合Fab文库。因此，小鼠Fd片段提供了引导选择的模板。随后，将选择的人轻链与人Fd片段文库组合。选择得到的文库完全产生人Fab。

在某些实施例中，包含待根据本发明方法纯化的Fc区的蛋白是Fc融合蛋白。“Fc融合蛋白”是含有与异源多肽融合或连接的Fc区的蛋白。典型地，融合蛋白从融合基因表达，其中编码来自一种蛋白(例如Fc区)的多肽序列的核苷酸序列与编码多肽序列的核苷酸序列附在框架内，并且任选地通过接头与编码来自不同蛋白的多肽序列的核苷酸序列分开。然后可以通过重组宿主细胞表达融合基因以产生单融合蛋白。与Fc区融合的异源多肽可以是来自免疫球蛋白以外的蛋白的多肽。例如，异源多肽可以是配体多肽、受体多肽、激素、细胞因子、生长因子、酶、或不是免疫球蛋白成分的其他多肽。此类Fc融合蛋白可包含与受体或其片段融合的Fc区或来自受体的配体，包括但不限于以下任何一种受体：TNFR的两种形式(称为p55和p75)、I型和II型白细胞介素l受体(如欧洲专利号0460846、美国专利号4,968,607、和美国专利号5,767,064中描述的，将其通过引用以其全部内容并入本文)、白细胞介素2受体、白细胞介素4受体(如欧洲专利号0367566、美国专利号5,856,296中描述的，将其通过引用以其全部内容并入本文)、白细胞介素15受体、白细胞介素17受体、白细胞介素18受体、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体、粒细胞集落刺激因子受体、制瘤素-M和白血病抑制因子受体、NF-κB受体激活剂(RANK，如美国专利号6,271,349中描述的，将其通过引用以其全部内容并入本文)、VEGF受体、EGF受体、FGF受体、TRAIL受体(包括TRAIL受体1、2、3、和4)、和包含死亡结构域的受体，例如Fas或凋亡诱导受体(AIR)。Fc融合蛋白还包括肽体，例如WO 2000/24782中描述的那些，将其通过引用以其全部内容并入本文。

在其他实施例中，Fc区融合或连接的异源多肽可以是来自免疫球蛋白或其片段的多肽，而不是衍生自Fc区的免疫球蛋白。例如，异源多肽可以是来自与获得Fc区的抗体不同的抗体的重链和/或轻链可变区。在某些实施例中，Fc融合蛋白包含至少一个单链Fv片段(scFv片段)。“单链可变抗体片段”或“scFv片段”包含抗体的VH和VL区，其中这些区存在于单个多肽链中，并且任选地包含VH和VL区之间的肽接头，使得Fv能够形成抗原结合所希望的结构(参见，例如Bird等人,Science[科学],第242卷:423-426,1988；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],第85卷:5879-5883,1988)。在一些实施例中，Fc融合蛋白包含两个scFv片段。在其他的实施例中，Fc融合蛋白包含三个scFv片段。在仍其他的实施例中，Fc融合蛋白包含四个scFv片段。

包含一个或多个scFv片段或抗体可变区的其他片段的Fc融合蛋白可具有一个或多个抗原的多个结合位点。因此，此类Fc融合蛋白可包括多特异性，多价抗原结合蛋白，例如美国公开号20030133939中描述的小模块化免疫药物；描述于WO 2007/146968中的单链多价结合蛋白，描述于WO 2014144722中的双特异性二价scFv-Fc分子，和各种双特异性抗体分子，例如IgG-scFv、IgG-Fab、2scFv-IgG、4scFv-IgG、VH-IgG、IgG-VH、和Fab-scFv-Fc，和其他的Spiess等人,Mol Immunol.[分子免疫学],第67卷:95-106,2015，和Kontermann,mAbs[单克隆抗体],第4卷:182-197,2012中描述的。在一个实施例中，根据本发明的方法纯化的Fc融合蛋白是IgG-scFv结合蛋白。如本文所用，“IgG-scFv结合蛋白”是包含两个单链可变片段(scFv)的结合蛋白，每个片段包含来自第一抗体的可变结构域，所述第一抗体通过肽接头连接在一起，通过另一种肽接头与第二抗体的重链的羧基末端融合。IgG-scFv结合蛋白的实例描绘于图1中。在另一个实施例中，根据本发明的方法纯化的Fc融合蛋白是Fv-Fc结合蛋白。“Fv-Fc结合蛋白”包含至少一个任选地通过接头与Fc区融合的scFv片段。在某些实施例中，Fv-Fc结合蛋白包含两个彼此融合的scFv片段，任选地通过接头肽依次与Fc区的N-末端或C-末端融合。此类二价Fv-Fc分子描述于WO 2014144722中，将其通过引用以其全部内容并入本文。这种单链双特异性Fv-Fc结合蛋白的一个实例示出于图5中。

可以使用本文描述的方法纯化的抗体和Fc融合蛋白可以结合一种或多种蛋白，包括但不限于CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD28、CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD147、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-13、IL-2受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-13受体、IL-I8受体亚单位、血管生成素(例如血管生成素-1、血管生成素-2、或血管生成素-4)、PDGF-β、VEGF、TGF、TGF-β2、TGF-β1、EGF受体、VEGF受体、FGF受体、C5补体、β-klotho、降钙素基因相关肽(CGRP)、CGRP受体、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽1型受体(PAC1受体)、IgE、肿瘤抗原，例如，肿瘤抗原CA125、肿瘤抗原MUC1、PEM抗原、PD-1、LCG(其是一种与肺癌相关的表达基因产物)、HER-2、肿瘤相关的糖蛋白TAG-72、SK-l抗原、整合素α4β7、整合素VLA-4、B2整合素、TRAIL受体1、2、3和4、RANK、RANK配体、硬化蛋白、Dickkopf-1(DKK-1)、TLA1、TNF-α、粘附分子VAP-l、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、细胞间粘附分子-3(ICAM-3)、白细胞整合素粘附素、血小板糖蛋白gp IIb/IIIa、心肌肌球蛋白重链、PCSK9、甲状旁腺激素、rNAPc2、MHC I、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤坏死因子(TNF)、CTLA-4(其是一种细胞毒性T淋巴细胞相关抗原)、Fc-γ-l受体、HLA-DR 10β、HLA-DR抗原、L-选择素、IPN-γ、呼吸道合胞病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

可根据本文描述的方法纯化的其他示例性含有Fc区的蛋白包括但不限于阿柏西普

阿仑单抗

贝伐单抗

西妥昔单抗

帕尼单抗

吉妥珠单抗

依伏库单抗

阿利库单抗

地诺单抗

利妥昔单抗

托西莫单抗

替伊莫单抗

曲妥单抗

依库丽单抗

阿达木单抗

英利昔单抗

依那西普

达利珠单抗

巴利昔单抗

帕利珠单抗

奥马珠单抗

阿昔单抗

依法利珠单抗

派姆单抗

纳武单抗

那他珠单抗

博纳吐单抗

和罗米司亭

待纯化的含有Fc区的蛋白可以通过重组方法产生，即通过经基因工程化以产生蛋白的活宿主细胞产生。基因工程化细胞以产生蛋白的方法是本领域熟知的。参见,例如Ausabel等人,编辑,(1990),Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法](威利出版社(Wiley)，纽约)。此类方法包括引入编码并允许蛋白表达到活宿主细胞中的核酸。这些宿主细胞可以是在培养基中生长的原核细胞、酵母细胞、或高等真核细胞。原核宿主细胞包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)像埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，例如如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏杆菌(Shigella)、还有芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)、和链霉菌属(Streptomyces)。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种、和菌株通常可用于本文，例如毕赤酵母属(Pichia)，例如毕赤酵母(P.pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、亚罗酵母属(Yarrowia)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichodermareesia)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，例如许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，例如像脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲菌(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。在具体的实施例中，重组蛋白在动物细胞，特别是哺乳动物细胞中产生。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，包括但不限于可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括CHOK1细胞(ATCC CCL61)，DXB-11，DG-44，和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4216,1980)；由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人类胚肾系(293细胞、或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，(Graham等人,J.Gen Virol.[普通病毒学杂志]36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.[生殖生物学]23:243-251，1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；肝实质细胞(buffalo ratliver cells)(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝癌细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.YAcad.Sci.[纽约科学院年报]383:44-68,1982)；MRC 5细胞或FS4细胞；哺乳动物骨髓瘤细胞，和许多其他细胞系。在一个具体的实施例中，根据本发明的方法纯化的蛋白在哺乳动物细胞系，特别是CHO细胞系中重组产生。

本发明的方法可用于从溶液中的一种或多种杂质中纯化或分离靶蛋白(例如含有Fc区的蛋白)。如本文所用，“纯化蛋白”是指减少与靶蛋白不同并且希望地从最终蛋白组合物中排除的物质的量的方法。这些杂质或污染物可包括蛋白(例如，可溶性或不可溶性蛋白，或蛋白片段，包括目的蛋白的不希望的片段，例如半抗体)，脂质(例如，细胞壁材料)，内毒素，病毒，核酸(例如，染色体或染色体外DNA，t-RNA，rRNA或mRNA)，或其组合，或与靶标含有Fc区的目的蛋白不同的任何其他物质。在一些实施例中，杂质或污染物可以来自产生含Fc区的目的蛋白的宿主细胞。例如，在一些实施例中，杂质或污染物是宿主细胞蛋白，宿主细胞核酸(DNA或RNA)，或表达含有Fc区的目的蛋白的原核或真核宿主细胞的其他细胞组分。在一些实施例中，杂质或污染物不是衍生自宿主细胞，例如，杂质或污染物可以是来自细胞培养基或生长培养基的蛋白或其他物质，缓冲液或培养基添加剂。在其他实施例中，杂质或污染物可以是含有Fc区的蛋白的不希望的形式，例如蛋白的蛋白水解片段或未组装的组分(例如轻链，重链，半分子或其片段)。如本文所用的术语“杂质”可包括单个不希望的物质，或若干种不希望的物质的组合。检测污染蛋质和核酸(例如宿主细胞蛋白和核酸)的合适的方法是本领域技术人员已知的。此类方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)，凝胶电泳方法和定量聚合酶链反应方法。尺寸排阻高效液相色谱和毛细管电泳方法可用于测量含有Fc区的蛋白的高分子量种类(例如聚集体)和低分子量种类(片段，未组装的组分)。

可以纯化含有靶Fc区的蛋白的溶液可以是含有蛋白和一种或多种杂质或污染物的任何溶液，所述溶液的存在是不希望的。含有蛋白和一种或多种杂质的溶液可以包括衍生自其中已经产生靶标蛋白的细胞培养物的任何溶液。例如，在培养已经通过重组方法修饰的宿主细胞以产生蛋白时，含有Fc区的蛋白可以在细胞内，周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果蛋白在细胞内产生，可以根据本领域技术人员已知的方法裂解细胞以产生含有含Fc区的蛋白的细胞裂解液。因此，在一个实施例中，包含待纯化的含Fc区的蛋白的溶液是细胞培养裂解物。在一些实施例中，在本文描述的纯化方法之前，可以从细胞培养裂解物中除去宿主细胞、裂解的片段、和其他大颗粒，例如通过离心、微滤、或超滤。在其他实施例中，重组蛋白由宿主细胞分泌到培养基中。在这样的实施方案中，可以从含有含Fc区的蛋白的细胞培养基中分离重组宿主细胞和其他颗粒物质，例如，通过切向流过滤或离心以产生细胞培养上清液。因此，在一些实施例中，含有待纯化的含Fc区的蛋白的溶液是细胞培养上清液。在本发明的纯化方法之前，可以进一步澄清细胞培养裂解物、细胞培养上清液、或含有含Fc区的蛋白的其他溶液以除去细的颗粒物质和可溶性聚集物。在一些实施例中，溶液的澄清可以通过用孔径为约0.1μm至约0.5μm之间的膜过滤溶液来完成，优选地具有孔径为约0.22μm的膜。

在某些实施例中，含有含Fc区的蛋白和一种或多种杂质的溶液是来自生物反应器的收获物流或池，其中正在培养表达蛋白的宿主细胞。“收获流”或“收获池”是指通过一种或多种操作处理以从含有Fc区的蛋白中分离细胞、细胞碎片、或其他大颗粒的溶液。此类操作包括本领域技术人员已知的用于从宿主细胞培养物中收获重组蛋白的标准操作，例如絮凝、离心、和各种形式的过滤(例如深度过滤、切向流微滤和切向流超滤)。在一些实施例中，含有蛋白和一种或多种杂质的溶液是来自工业规模生物反应器(例如生产生物反应器)的收获物流或池。工业规模的生物反应器典型地产生体积超过500升的重组蛋白，特别地是2,000升至20,000升。在一个具体的实施例中，含有一种或多种杂质的溶液和根据本发明方法待纯化的蛋白是来自体积为约2,000升或更高的生产生物反应器的收获物流或池。

在某些实施例中，本发明的方法包括使含有待纯化蛋白的溶液与温度响应性蛋白A材料接触。“温度响应性蛋白A材料”是指蛋白A的突变体形式，即金黄色葡萄球菌菌株中发现的细胞壁蛋白，所述蛋白已经被改变，使得其结合蛋白Fc区的能力随温度而变化。这种温度响应性蛋白A突变体描述于美国专利号8,198,409，将其通过引用以其全部内容并入本文。在一些实施例中，温度响应性蛋白A材料包含在低温，例如约0℃至约15℃，比在较高温度，例如约35℃或更高，具有不同Fc区结合能力的突变体蛋白A。在某些实施例中，温度响应性蛋白A材料包含突变体蛋白A，所述突变体蛋白A包含下表1中列出的任何序列的氨基序列。在一个实施例中，突变体蛋白A包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在另一个实施例中，突变体蛋白A包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个实施例中，突变体蛋白A包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列。在仍另一个实施例中，突变体蛋白A包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

表1.突变体蛋白A蛋白的氨基酸序列

温度响应性蛋白A材料可以合成制备，例如通过肽合成或重组技术。可替代地，温度响应性蛋白A材料可以商购获得，例如，从游牧生物科学有限公司(Nomadic BioscienceCo.,Ltd.)(Byzen

温度响应性蛋白A树脂)获得。在一些实施例中，温度响应性蛋白A材料固定在固相上。固相可包括但不限于珠、树脂、凝胶、颗粒、膜、管、板和薄膜。在一个实施例中，温度响应性蛋白A固定于其上的固相是珠，特别地是磁珠。在另一个实施例中，温度响应性蛋白A固定于其上的固相是树脂。在某些实施例中，温度响应性蛋白A材料被固定到珠、树脂、颗粒、或适于包装到容器中的其他固相，将含有温度响应性蛋白A材料的固相包装或加载入容器例如柱中。

可以制造固相的合适的材料包括玻璃、二氧化硅(例如硅胶)、多糖(例如多糖基质)，例如琼脂糖、葡聚糖、和纤维素，有机聚合物，例如聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、和苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。将温度响应性蛋白A材料固定到各种固相的方法是本领域技术人员已知的，并且可包括用功能性偶联基团(例如羧基或硫醇基团)活化固相材料和描述于美国专利公开号2015/0218208和2013/0317172中的其他方法。

如本文所用，使包含含有Fc区的蛋白的溶液与温度响应性蛋白A材料接触或将含有Fc区的蛋白吸附至温度响应性蛋白A材料意指在使含有Fc区的蛋白与材料结合的条件下，将蛋白与温度响应性蛋白A材料组合。特别地，含有Fc区的蛋白与温度响应性蛋白A材料在蛋白结合材料的温度下结合，例如，在从约0℃至约15℃的温度、从约1℃至约12℃、或从约2℃至约8℃。在一些实施例中，含有Fc区的蛋白在约10℃或更低的温度下与温度响应性蛋白A材料接触或吸附。在某些实施例中，含有Fc区的蛋白在约1℃至约6℃的温度下与温度响应性蛋白A材料接触或吸附。在一个实施例中，含有Fc区的蛋白在约4℃的温度下与温度响应性蛋白A材料接触或吸附。

在某些实施例中，温度响应性蛋白A材料可以在与包含待纯化的含Fc区的蛋白的溶液接触之前用合适的缓冲液平衡。一种这样的合适的平衡缓冲液是pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水。其它合适的平衡缓冲液包括浓度为从约0.5mM至约100mM的Tris、BIS、和HEPES，所述平衡缓冲液包含在约5至约9的pH下，优选地在约6.0至约8.0的pH下、以及更优选地在约6.5至约7.5的pH下的生理盐浓度(例如150mM NaCl)。

一旦含有Fc区的蛋白与温度响应性蛋白A材料结合，在从材料洗脱之前，可任选地用一种或多种洗涤溶液洗涤结合的材料。一种或多种洗涤溶液典型地是中性pH(例如约6.5至约7.5)的缓冲液，所述缓冲液包含盐，例如乙酸钠、柠檬酸钠、或氯化钠。洗涤溶液中合适的盐浓度为从约0.1M至约2M、约0.5M至约2M、约0.75M至约1.5M、或约0.2M至约0.6M。在某些实施例中，一种或多种洗涤溶液包含浓度为约0.5M至约2M的氯化钠。在一些实施例中，一种或多种洗涤溶液包含浓度为约0.1M至约0.8M的氯化钠。在一个实施例中，一种或多种洗涤溶液包含在约7至约7.5的pH下，约10至约25mM磷酸盐缓冲液和约0.1M至约0.8M NaCl。在另一个实施例中，一种或多种洗涤溶液包含在约7至约7.5的pH下，约20至约50mM Tris缓冲液和约0.1M至约0.8M NaCl。

一种或多种洗涤缓冲液还可以包含有助于从温度响应性蛋白A材料中去除杂质而不显著影响含有Fc区的蛋白和温度响应性蛋白A材料的结合相互作用的其他组分。这些另外的组分可包括二价阳离子(例如钙、镁、和镍)、洗涤剂(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)、或聚合物(例如聚乙二醇)。在某些实施例中，一种或多种洗涤溶液的温度与含有Fc区的蛋白吸附至温度响应性蛋白A材料(例如0℃至15℃)的温度相同。在其他的实施例中，一种或多种洗涤溶液的温度为约15℃至25℃。在仍其他的实施例中，一种或多种洗涤溶液的温度不超过25℃，即一种或多种洗涤溶液的温度为25℃或更低，例如约1℃至约25℃之间。

一旦含有Fc区的蛋白与温度响应性蛋白A材料结合并且如上描述任选地洗涤结合的材料，使用如上描述的洗脱缓冲液从温度响应性蛋白A材料中去除含有Fc区的蛋白。典型地，从温度响应性蛋白A树脂中洗脱含有Fc区的蛋白需要将树脂的温度升高至35℃或更高。参见美国专利号8,198,409和Koguma等人,Journal of Chromatography A[色谱学杂志A辑],第1305卷:149-153,2013。但是，以下详细描述的洗脱缓冲液的组成允许与温度响应性蛋白A树脂结合的蛋白在中性pH下从树脂中去除或洗脱，而不会使树脂的温度升高到35℃以上。因此，在某些实施例中，本发明的方法包括在低于约35℃的温度下从温度响应性蛋白A材料中洗脱结合的含有Fc区的蛋白。例如，在一些实施例中，蛋白在温度为从约1℃至约34℃、从约4℃至约32℃、从约10℃至约30℃，或从约15℃至约25℃的温度下从温度响应性蛋白A材料中洗脱。在某些实施例中，蛋白在温度低于约30℃，例如从约1℃至约25℃的温度下从温度响应性蛋白A材料中洗脱。在一些实施例中，蛋白在从约20℃至约25℃的温度下从温度响应性蛋白A材料中洗脱。在其他的实施例中，蛋白在从约15℃至约22℃的温度下从温度响应性蛋白A材料中洗脱。在某些实施例中，蛋白在温度低于约10℃，例如从约1℃至约8℃的温度下从温度响应性蛋白A材料中洗脱。在一些实施例中，蛋白在从约1℃至约6℃的温度下从温度响应性蛋白A材料中洗脱。在其他的实施例中，蛋白在从约2℃至约8℃的温度下从温度响应性蛋白A材料中洗脱。在一些实施例中，蛋白在与蛋白结合到材料的相同温度下从温度响应性蛋白A材料洗脱(即，在吸附和洗脱步骤之间材料的温度没有改变)。

在一些实施例中，含有Fc区的蛋白可以与温度响应性蛋白A材料一起用下文详述的洗脱缓冲液等度洗脱。在可替代的实施例中，含有Fc区的蛋白可以从具有线性梯度的温度响应性蛋白A材料中洗脱，例如，以100％的溶液开始，所述溶液具有与本文描述的洗涤溶液相似的组成，并以100％的以下详细描述的洗脱缓冲液结束。

采用以从温度响应性蛋白A材料中去除含有Fc区的蛋白的洗脱缓冲液典型地是pH为约6.5至约7.5的缓冲溶液。在一些实施例中，洗脱缓冲液的pH是约6.8至约7.5。在其他的实施例中，洗脱缓冲液的pH是约7.2至约7.5。在一个具体的实施例中，洗脱缓冲液的pH是约7.0至约7.4。可以使用任何缓冲液，条件是缓冲液能够将溶液的pH保持在靶标pH范围内(例如，具有pKa值在6和8之间的缓冲液)。在中性pH范围内缓冲的合适的缓冲液可用作本发明方法中洗脱缓冲液的组分，包括但不限于HEPES(N-[2-羟基乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸])、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、BES(N,N-双[2-羟基乙基]-2-氨基乙磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N-双(2-乙磺酸))、曲辛(N-三[羟甲基]甲基甘氨酸)、二甘氨酸(N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸)、TES(N-三[羟甲基]甲基-2-氨基乙磺酸)、TAPSO(3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)、Bis-Tris(双(2-羟基乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷)、和MOPS(3-[N-吗啉代]丙磺酸)。缓冲液可以以从约5mM至约200mM、从约10mM至约150mM、从约15mM至约100mM、从约20mM至约75mM、或从约25mM至约50mM的浓度存在。在一些实施例中，洗脱缓冲液包含HEPES缓冲液，例如浓度为约15mM至约100mM。在其他的实施例中，洗脱缓冲液包含Tris缓冲液，例如浓度为约15mM至约50mM。

在各种实施例中，洗脱缓冲液包含离液剂。“离液剂”是破坏水分子中氢键网络的物质，并且可以通过影响由非共价力例如氢键、范德华力、和疏水相互作用介导的分子内相互作用来降低大分子结构的顺序。不受理论束缚，据信在洗脱缓冲液中存在离液剂用于松弛含Fc区的蛋白的结构，以促进其从温度响应性蛋白A材料的脱离。可包括在洗脱缓冲液中的合适的离液剂包括但不限于丁醇、乙醇、丙醇、氯化胍、乙酸锂或高氯酸锂、氯化镁、苯酚、十二烷基硫酸钠、尿素、硫脲、和硫氰酸盐(例如硫氰酸钠、硫氰酸铵、或硫氰酸钾)。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含尿素、氯化胍、或十二烷基硫酸钠作为离液剂。在其他实施例中，洗脱缓冲液包含尿素、氯化胍、或硫氰酸盐作为离液剂。在仍其他实施例中，洗脱缓冲液包含尿素或氯化胍作为离液剂。离液剂可以取决于所用的特定离液剂，以约从0.4M至约5.0M、从约0.5M至约2.5M、从约0.8M至约1.2M、从约2M至约4.5M、或从约3M至约4.2M的浓度存在于洗脱缓冲液中。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含尿素，例如浓度为约2M至约4.5M。

在其他的实施例中，洗脱缓冲液包含浓度为约3M至约4.2M的尿素。在一个具体的实施例中，洗脱缓冲液包含浓度为约4M的尿素。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含氯化胍，例如浓度为约0.5M至约2.5M。在其他的实施例中，洗脱缓冲液包含浓度为约0.8M至约1.2M的氯化胍。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含浓度为约1M的氯化胍。在其他的具体的实施例中，洗脱缓冲液包含浓度为约2M的氯化胍。

在某些实施例中，洗脱缓冲液除了离液剂外还包含糖醇。“糖醇”是衍生自糖的有机化合物，并且具有根据通式HOCH₂(CHOH)_nCH₂OH的结构，其中n典型地在从1至22或更大的范围内变化。可包括在洗脱缓冲液中的示例性糖醇包括但不限于甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、甘露醇、山梨糖醇、半乳糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇、庚七醇、异麦芽酮糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、麦芽三糖醇、和麦芽四糖醇。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、或甘油作为糖醇。在一个实施例中，洗脱缓冲液中的糖醇是山梨糖醇。在另一个实施例中，洗脱缓冲液中的糖醇是甘露醇。取决于选择的特定糖醇，糖醇可以以从约1M至约4.5M、从约1.5M至约4M、或从约2M至约2.5M的浓度存在于洗脱缓冲液中。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含山梨糖醇，例如浓度为约1M至约4.5M，更优选地约2M至约2.5M。在一个实施例中，洗脱缓冲液包含浓度为约2.2M的山梨糖醇。

同样，不受理论束缚，据信糖醇的存在防止含有Fc区的蛋白在离液剂存在下完全解折叠。因此，在一些实施例中，洗脱缓冲液包含特定浓度比的离液剂和糖醇，其在松弛含有Fc区的蛋白的结构以使其与温度响应性蛋白A材料脱离之间取得平衡，但是要防止蛋白完全解折叠并失去其基本的天然结构。在这样的实施例中，离液剂与糖醇的摩尔浓度比为约0.4至约4.5、约0.8至约4、约1至约2、约1.5至约2.5、或约1.8至约2.2。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含尿素和山梨糖醇，其中尿素与山梨糖醇的摩尔浓度比为约1至约2.5，或更优选地约1.1至约1.8。在其他的实施例中，洗脱缓冲液包含氯化胍和山梨糖醇，其中氯化胍与山梨糖醇的摩尔浓度比为约0.5至约1.5，或更优选地约0.5至约0.9。

在某些实施例中，洗脱缓冲液可进一步包含一种或多种氨基酸。例如，在一些实施例中，洗脱缓冲液可以进一步包含碱性氨基酸、非极性氨基酸、或碱性氨基酸和非极性氨基酸两者。不受理论束缚，据信碱性氨基酸通过调节蛋白与材料的电荷相互作用促进含有Fc区的蛋白与温度响应性蛋白A材料的解离，而非极性氨基酸通过调节蛋白与材料的疏水相互作用促进含有Fc区的蛋白与温度响应性蛋白A材料的脱离。如本文所用，“碱性氨基酸”是D或L形式的极性氨基酸，在低于其pKa的pH值下是亲水性的和带正电荷的。适用于洗脱缓冲液的示例性碱性氨基酸包括但不限于精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、和组氨酸。在一些实施例中，洗脱缓冲液包含精氨酸。在其他的实施例中，洗脱缓冲液包含赖氨酸。碱性氨基酸可以以从约0.1M至约1.5M、从约0.25M至约1M、或从约0.3M至约0.8M的浓度存在于洗脱缓冲液中。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含浓度为约0.5M的碱性氨基酸(例如精氨酸)。

本文与“非极性氨基酸”可互换使用的“非极性氨基酸”是指含有疏水性官能团并且在中性pH下不带电荷的D或L形式的氨基酸。适用于洗脱缓冲液的示例性非极性氨基酸包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含脯氨酸。非极性氨基酸可以以从约0.1M至约1.5M、从约0.25M至约1M、或从约0.3M至约0.8M的浓度存在于洗脱缓冲液中。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含浓度为约0.5M的非极性氨基酸(例如脯氨酸)。在一些实施例中，洗脱缓冲液包含至少一种碱性氨基酸和至少一种非极性氨基酸。在此类实施例中，碱性氨基酸和非极性氨基酸可以相同浓度存在于洗脱缓冲液中。例如，碱性氨基酸和非极性氨基酸可以以从约0.25M至约1M，更优选地从约0.3M至约0.8M的浓度存在于洗脱缓冲液中。在某些实施例中，碱性氨基酸和非极性氨基酸各自以约0.5M的浓度存在于洗脱缓冲液中。在一个实施例中，洗脱缓冲液包含精氨酸和脯氨酸。在另一个实施例中，洗脱缓冲液包含赖氨酸和脯氨酸。

在一些实施例中，本发明方法中采用的洗脱缓冲液可以进一步包含一种或多种盐。“盐”是指由酸和碱的中和反应产生的离子化合物。盐典型地由相同数量的阳离子和阴离子组成，使得盐的总净电荷为零。包含在洗脱缓冲液中的合适的盐包括但不限于钠盐，例如乙酸钠、柠檬酸钠、氯化钠、和硫酸钠；钾盐，例如乙酸钾、柠檬酸钾、氯化钾和硫酸钾；和氯化物盐，例如氯化钠、氯化镁、氯化镍、氯化钾和氯化铵。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含氯化钠。在其他的实施例中，洗脱缓冲液包含氯化钾。盐可以以从约0.1M至约1M、从约0.25M至约0.8M、从约0.5M至约1M、或从约0.5M至约0.8M的浓度包括在洗脱缓冲液中。在一个实施例中，盐(例如氯化钠)以约0.75M的浓度存在于洗脱缓冲液中。

在某些实施例中，本发明方法中使用的洗脱缓冲液具有约6.5至约7.5的pH，并包含约5mM至约200mM缓冲液、约0.4M至约5M离液剂、约1M至约4.5M糖醇、约0.1M至约1.5M非极性氨基酸、约0.1M至约1.5M碱性氨基酸，和约0.1M至约1M盐。在一些实施例中，洗脱缓冲液具有约7.0至约7.4的pH，并包含约15mM至约100mM缓冲液、约2M至约4.5M离液剂、约1M至约4.5M糖醇、约0.25M至约1M非极性氨基酸、约0.25M至约1M碱性氨基酸，和约0.25M至约0.8M盐。在其他的实施例中，洗脱缓冲液具有约7.0至约7.4的pH，并包含约15mM至约100mM缓冲液、约0.5M至约2.5M离液剂、约1M至约4.5M糖醇、约0.25M至约1M非极性氨基酸、约0.25M至约1M碱性氨基酸、和约0.25M至约0.8M盐。在某些实施例中，洗脱缓冲液具有约7.0至约7.4的pH，并包含约15mM至约100mM缓冲液、约2M至约4.5M离液剂、约2M至约2.5M糖醇、约0.25M至约1M非极性氨基酸、约0.25M至约1M碱性氨基酸，和约0.25M至约0.8M盐。在一些实施例中，洗脱缓冲液具有约7.0至约7.4的pH，并包含约15mM至约100mM缓冲液、约0.5M至约2.5M离液剂、约2M至约2.5M糖醇、约0.25M至约1M非极性氨基酸、约0.25M至约1M碱性氨基酸，和约0.25M至约0.8M盐。

对于任何上述洗脱缓冲液组合物，缓冲液可以是HEPES或Tris，离液剂可以是尿素或氯化胍，糖醇可以是山梨糖醇或甘露醇，非极性氨基酸可以是脯氨酸，碱性氨基酸可以是精氨酸或赖氨酸，盐可以是钠盐，例如氯化钠。例如，在某些实施例中，洗脱缓冲液具有约6.5至约7.5的pH，并包含15mM至约100mM HEPES、约2M至约4.5M尿素、约1M至约4.5M山梨糖醇、约0.25M至约1M脯氨酸、约0.25M至约1M精氨酸、和约0.25M至约0.8M氯化钠。在一些实施例中，洗脱缓冲液具有约7.0至约7.4的pH，并包含约20mM至约75mM HEPES、约3M至约4.2M尿素、约2M至约2.5M山梨糖醇、约0.3M至约0.8M脯氨酸、约0.3M至约0.8M精氨酸、和约0.5M至约1M氯化钠。在一个实施例中，洗脱缓冲液具有约7.2的pH，并包含约25mM HEPES、约4M尿素、约2.2M山梨糖醇、约0.5M脯氨酸、约0.5M精氨酸、和约0.75M氯化钠。在另一个实施例中，洗脱缓冲液具有约7.2的pH，并包含约50mM HEPES、约4M尿素、约2.2M山梨糖醇、约0.5M脯氨酸、约0.5M精氨酸、和约0.75M氯化钠。在一些实施例中，洗脱缓冲液具有约6.5至约7.5的pH，并包含15mM至约100mM Tris、约2M至约4.5M尿素、约1M至约4.5M山梨糖醇、约0.25M至约1M脯氨酸、约0.25M至约1M精氨酸、和约0.25M至约0.8M氯化钠。在其他的实施例中，洗脱缓冲液具有约6.5至约7.5的pH，并包含15mM至约100mM HEPES、约2M至约4.5M尿素、约1M至约4.5M甘露醇、约0.25M至约1M脯氨酸、约0.25M至约1M精氨酸、和约0.25M至约0.8M氯化钠。在仍其他的实施例中，洗脱缓冲液具有约6.5至约7.5的pH，并包含15mM至约100mM Tris、约2M至约4.5M尿素、约1M至约4.5M甘露醇、约0.25M至约1M脯氨酸、约0.25M至约1M精氨酸、和约0.25M至约0.8M氯化钠。

在某些实施例中，洗脱缓冲液具有约6.5至约7.5的pH，并包含15mM至约100mMHEPES、约0.5M至约2.5M氯化胍、约1M至约4.5M山梨糖醇、约0.25M至约1M脯氨酸、约0.25M至约1M精氨酸、和约0.25M至约0.8M氯化钠。在一些实施例中，洗脱缓冲液具有约6.5至约7.5的pH，并包含15mM至约100mM Tris、约0.5M至约2.5M氯化胍、约1M至约4.5M山梨糖醇、约0.25M至约1M脯氨酸、约0.25M至约1M精氨酸、和约0.25M至约0.8M氯化钠。在其他的实施例中，洗脱缓冲液具有约6.5至约7.5的pH，并包含15mM至约100mM HEPES、约0.5M至约2.5M氯化胍、约1M至约4.5M甘露醇、约0.25M至约1M脯氨酸、约0.25M至约1M精氨酸、和约0.25M至约0.8M氯化钠。在仍其他的实施例中，洗脱缓冲液具有约6.5至约7.5的pH，并包含15mM至约100mM Tris、约0.5M至约2.5M氯化胍、约1M至约4.5M甘露醇、约0.25M至约1M脯氨酸、约0.25M至约1M精氨酸、和约0.25M至约0.8M氯化钠。

在一些实施例中，本发明的方法减少或消除了含有Fc区的蛋白的聚集，而不是在纯化程序期间可能发生的聚集。因此，本发明还包括用于在包含Fc区的蛋白的纯化期间减少聚集的方法。在一个实施例中，所述方法包括在蛋白与温度响应性蛋白A材料结合的温度将含有Fc区的蛋白吸附到材料上；以及用洗脱缓冲液在低于约35℃的温度从材料中洗脱蛋白，所述洗脱缓冲液具有约6.5至约7.5的pH，并包含离液剂、糖醇、非极性氨基酸、和碱性氨基酸，其中洗脱液中聚集形式的含有Fc区的蛋白的量小于来自常规蛋白A材料的洗脱液中的量。

如本文所用，含有Fc区的蛋白的“聚集形式”是指蛋白的多聚体形式，其由通过非共价相互作用保持在一起的蛋白的多个分子或单体组成。含有Fc区的蛋白的“单体形式”是指包含蛋白的单个完整分子，包括所有组分和链的蛋白的形式。例如，抗体单体或抗体的单体形式由两条轻链和两条通过二硫键连接的重链组成。类似地，IgG-scFv结合蛋白的单体形式包含通过二硫键连接的两条轻链和两条修饰的重链，其中每条修饰的重链包含与其羧基末端融合的单链可变片段。IgG-scFv结合蛋白的单体形式示出于图1中。对于含有单链Fc区的蛋白，例如图5中描绘的单链双特异性Fv-Fc结合，所述单体形式是单一多肽链。

在本文描述的纯化方法的一些实施例中，来自温度响应性蛋白A材料的洗脱液中的大部分含有Fc区的蛋白呈单体形式。例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的来自用本文描述的洗脱缓冲液洗脱得到的温度响应性蛋白A材料的洗脱液中含有Fc区的蛋白是单体形式。在某些实施例中，来自材料的洗脱液中至少70％的含有Fc区的蛋白呈单体形式。在一些实施例中，来自材料的洗脱液中至少80％的含有Fc区的蛋白呈单体形式。在其他的实施例中，来自材料的洗脱液中至少90％的含有Fc区的蛋白呈单体形式。

在本文描述的纯化方法的某些实施例中，使用本文描述的洗脱缓冲液从温度响应性蛋白A材料的洗脱液中聚集形式的含有Fc区的蛋白的量小于从常规蛋白A材料的洗脱液中聚集形式的含有Fc区的蛋白的量。如本文所用，“常规蛋白A材料”是指在金黄色葡萄球菌菌株中发现的天然或野生型蛋白A，其在酸性条件下(例如在低于约6的pH下)失去其对蛋白Fc区的亲和力。常规蛋白A材料包括可商购蛋白A树脂，例如MabSelect SuRe^TM树脂(通用医疗公司(GE Healthcare))、

树脂(瑞普利金公司(Repligen))、来自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher)、金斯瑞公司(GenScript)、和伯乐公司(Bio-Rad)的蛋白A树脂等。从常规蛋白A材料洗脱蛋白的典型的条件包括使用酸性洗脱缓冲液，例如pH约2.5至约4的乙酸缓冲液。在一些实施例中，使用本文描述的洗脱缓冲液从温度响应性蛋白A材料的洗脱液中聚集形式的含有Fc区的蛋白的量小于使用pH为约2.5至约4的乙酸缓冲液(例如1％乙酸)，从常规蛋白A材料的洗脱液中聚集形式的含有Fc区的蛋白的量。

使用本文描述的洗脱缓冲液从温度响应性蛋白A材料的洗脱液中聚集形式的含有Fc区的蛋白的量优选地小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、或小于1％。在某些实施例中，来自温度响应性蛋白A材料的洗脱液中少于30％的含有Fc区的蛋白是聚集形式。在一些实施例中，来自温度响应性蛋白A材料的洗脱液中少于20％的含有Fc区的蛋白是聚集形式。在其他的实施例中，来自温度响应性蛋白A材料的洗脱液中少于10％的含有Fc区的蛋白是聚集形式。

检测和定量蛋白的聚集和单体形式的方法是本领域技术人员已知的，并且可以包括尺寸排阻高效液相色谱方法，例如实例中描述的那些。其他合适的方法包括沉降速度分析超速离心、不对称流场流动分级和动态光散射。参见例如，Gabrielson等人,Journal ofPharmaceutical Sciences[药物科学杂志],第96卷:268-279,2007。

在本发明方法的某些实施例中，在从温度响应性蛋白A材料洗脱后，可以对含有Fc区的蛋白进行进一步的纯化步骤。例如，在一些实施例中，从温度响应性蛋白A材料洗脱的含有Fc区的蛋白进行一个或多个另外的色谱步骤。这些另外的色谱步骤可包括离子交换色谱(例如阳离子交换色谱或阴离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、混合模式色谱、尺寸排阻色谱(例如凝胶过滤色谱)、羟基磷灰石色谱、金属亲和色谱、或其组合。另外的色谱步骤可以以结合和洗脱模式进行，其中靶标蛋白与色谱材料结合以及杂质流过或流过模式，其中杂质与色谱材料结合并且靶标蛋白流过。在一些实施例中，从温度响应性蛋白A材料洗脱的含有Fc区的蛋白进行阳离子交换色谱。在其他的实施例中，从温度响应性蛋白A材料洗脱的含有Fc区的蛋白进行阴离子交换色谱。在某些实施例中，从温度响应性蛋白A材料洗脱的含有Fc区的蛋白进行疏水相互作用色谱。在仍其他的实施例中，从温度响应性蛋白A材料洗脱的含有Fc区的蛋白进行混合模式色谱。在某些实施例中，从温度响应性蛋白A材料洗脱的含有Fc区的蛋白进行尺寸排阻色谱(例如凝胶过滤色谱法)，例如以下进一步详细描述的尺寸排阻色谱法。

本发明方法的色谱步骤随后可以进行另外的步骤，例如病毒失活、病毒过滤和/或超滤/渗滤步骤。例如，在一些实施例中，可以使用洗脱液池或来自温度响应性蛋白A材料的流出物进行使用洗涤剂或UV灭活方法的病毒灭活步骤。在一个实施例中，从温度响应性蛋白A材料洗脱的含有Fc区的蛋白进行洗涤剂病毒灭活步骤。可以将洗涤剂，例如Triton X-100(例如浓度为1％v/v)添加至洗脱液池或来自温度响应性蛋白A材料的流出物中，并在中性pH下孵育约30分钟至约60分钟以灭活任何存在的病毒。

本发明还提供了用于将抗体与其半抗体形式分离的方法。如实例5中描述的，令人惊讶地发现本文描述的用于在中性pH和恒温从温度响应性蛋白A树脂洗脱含有Fc区的蛋白的洗脱缓冲液可用作尺寸排阻色谱法中的流动相，用于将抗体从其半抗体形式有效地分离。因此，在某些实施例中，本发明包括用于从其半抗体形式中分离抗体的方法，所述方法包括使用pH为约6.5至约7.5，并且包含离液剂、糖醇、非极性氨基酸、和碱性氨基酸的流动相使包含抗体及其半抗体形式的溶液与凝胶过滤基质接触；并且从凝胶过滤基质中收集洗脱级分，其中抗体在一组洗脱级分中洗脱，并且其半抗体形式在另一组洗脱级分中洗脱，从而将抗体与其半抗体形式分离。

“半抗体”是指目的抗体的形式，其典型地包含单个轻链多肽和单个重链多肽(参见图9A和9B左侧的示意图)。半抗体(与“半分子”可互换使用)通常是由于装配的不完整或抗体的两个重链多肽之间相互作用的破坏(例如，两个重链的铰链区之间的多肽间二硫键形成的破坏)。在某些实施例中，待从其半抗体形式分离的抗体是多特异性(例如双特异性)异源二聚体抗体。在此类实施例中，两种半抗体可以由双特异性异源二聚体抗体的重组产生而产生：结合第一抗原的一个半抗体和结合第二抗原的另一个半抗体。本发明的方法可以将一种或两种半抗体与完全组装的抗体分开。

在从其半抗体形式分离抗体的方法的一些实施例中，所述方法包括使含有待纯化抗体和其半抗体形式的溶液与凝胶过滤基质接触。凝胶过滤基质通常由交联聚合物制成的多孔珠粒组成，所述聚合物可以包装在柱或其他容器中。适用于本发明方法的各种类型的凝胶过滤基质是可商购的，包括但不限于基于葡聚糖的凝胶，例如SEPHADEX(交联葡聚糖和环氧氯丙烷)；基于聚丙烯酰胺的凝胶，例如SEPHACRYL(烯丙基葡聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物)；基于琼脂糖的凝胶，例如SUPEROSE(高度交联琼脂糖)或SEPHAROSE(交联琼脂糖)；和由两种凝胶制备的复合凝胶，例如SUPERDEX(交联葡聚糖和琼脂糖)。在某些实施例中，凝胶过滤基质包含交联琼脂糖和葡聚糖。例如，在一个实施例中，凝胶过滤基质是SUPERDEX凝胶过滤基质(通用医疗公司(GE Healthcare))，例如SUPERDEX 200凝胶过滤基质。凝胶过滤基质的分级范围可以是从约5kDa至约5000kDa，约10kDa至约1500kDa，或约10kDa至约600kDa。在一些实施例中，本发明方法中采用的凝胶过滤基质的分级范围是从约10kDa至约600kDa。

用于尺寸排阻色谱法以将完全组装的抗体从半抗体分离的流动相可以是本文描述的任何洗脱缓冲液，用于在中性pH和恒定温度下从温度响应性蛋白A树脂洗脱含有Fc区的蛋白。在某些实施例中，流动相具有约6.5至约7.5的pH，并且包含离液剂、糖醇、非极性氨基酸、和碱性氨基酸。流动相通常是pH为约6.5至约7.5的缓冲溶液。在一些实施例中，流动相的pH为约6.8至约7.5。在其他的实施例中，流动相的pH是约7.2至约7.5。在一个具体的实施例中，流动相的pH是约7.0至约7.4。上文详细描述了在这个pH范围内缓冲的合适的缓冲液和浓度。在一些实施例中，流动相包含HEPES缓冲液，例如浓度为约15mM至约100mM。在其他的实施例中，流动相包含Tris缓冲液，例如浓度为约15mM至约50mM。

流动相中使用的离液剂可以是任何上文描述的任何浓度的离液剂。例如，流动相中的离液剂可以是尿素、氯化胍、硫氰酸钠、硫氰酸钾或硫氰酸铵。在一个具体实施例中，流动相包含尿素作为离液剂。在这样的实施例中，尿素以约2M至约4.5M的浓度存在于流动相中。在一些实施例中，流动相包含浓度为约3M至约4.2M的尿素。在其他的实施例中，尿素以约4M的浓度存在于流动相中。

流动相还优选地包含糖醇，其可以是以上描述的那些任何包含在洗脱缓冲液中的糖醇。在一些实施例中，流动相包含山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、或甘油作为糖醇。在一个实施例中，流动相中的糖醇是山梨糖醇。在另一个实施例中，流动相中的糖醇是甘露醇。取决于选择的特定糖醇，糖醇可以以从约1M至约4.5M、从约1.5M至约4M、或从约2M至约2.5M的浓度存在于流动相中。在某些实施例中，流动相包含山梨糖醇，例如浓度为约1M至约4.5M，更优选地约2M至约2.5M。在一个实施例中，流动相包含浓度为约2.2M的山梨糖醇。

在某些实施例中，流动相可以进一步包含一种或多种氨基酸，例如上文描述的包含在本发明的洗脱缓冲液中的那些。例如，在一些实施例中，流动相可以进一步包含碱性氨基酸、非极性氨基酸、或碱性氨基酸和非极性氨基酸两者。在某些实施例中，流动相包含选自组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸的碱性氨基酸。在一些实施例中，流动相包含精氨酸。在其他的实施例中，流动相包含赖氨酸。碱性氨基酸可以以从约0.1M至约1.5M、从约0.25M至约1M、或从约0.3M至约0.8M的浓度存在于流动相中。在某些实施例中，流动相包含浓度为约0.5M的碱性氨基酸(例如精氨酸)。

在一些实施例中，流动相包含选自丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、和缬氨酸的非极性氨基酸。在具体的实施例中，流动相包含脯氨酸。非极性氨基酸可以以从约0.1M至约1.5M、从约0.25M至约1M、或从约0.3M至约0.8M的浓度存在于流动相中。在某些实施例中，流动相包含浓度为约0.5M的非极性氨基酸(例如脯氨酸)。在一些实施例中，流动相包含至少一种碱性氨基酸和至少一种非极性氨基酸。在此类实施例中，碱性氨基酸和非极性氨基酸可以相同浓度存在于流动相中。例如，碱性氨基酸和非极性氨基酸可以以从约0.25M至约1M，更优选地从约0.3M至约0.8M的浓度存在于流动相中。在某些实施例中，碱性氨基酸和非极性氨基酸各自以约0.5M的浓度存在于流动相中。在一个实施例中，流动相包含精氨酸和脯氨酸。在另一个实施例中，流动相包含赖氨酸和脯氨酸。

在一些实施例中，基于尺寸排阻色谱的方法中采用从半抗体中分离全抗体的流动相可以进一步包含一种或多种盐，例如以上描述的任何包含在本发明的洗脱缓冲液中的那些。在某些实施例中，流动相包含氯化钠。在其他的实施例中，流动相包含氯化钾。盐可以以从约0.1M至约1M、从约0.25M至约0.8M、从约0.5M至约1M、或从约0.5M至约0.8M的浓度包括在流动相中。在一个实施例中，盐(例如氯化钠)以约0.75M的浓度存在于流动相中。

在某些实施例中，本发明方法中使用的流动相具有约6.5至约7.5的pH，并包含约5mM至约200mM缓冲液、约0.4M至约5M离液剂、约1M至约4.5M糖醇、约0.1M至约1.5M非极性氨基酸、约0.1M至约1.5M碱性氨基酸，和约0.1M至约1M盐。在一些实施例中，流动相具有约7.0至约7.4的pH，并包含约15mM至约100mM缓冲液、约2M至约4.5M离液剂、约1M至约4.5M糖醇、约0.25M至约1M非极性氨基酸、约0.25M至约1M碱性氨基酸，和约0.25M至约0.8M盐。在其他的实施例中，流动相具有约7.0至约7.4的pH，并包含约15mM至约100mM缓冲液、约2M至约4.5M离液剂、约2M至约2.5M糖醇、约0.25M至约1M非极性氨基酸、约0.25M至约1M碱性氨基酸，和约0.25M至约0.8M盐。对于任何以上描述的流动相组合物，缓冲液可以是HEPES或Tris，离液剂可以是尿素或氯化胍，糖醇可以是山梨糖醇或甘露醇，非极性氨基酸可以是脯氨酸，碱性氨基酸可以是精氨酸或赖氨酸，盐可以是钠盐，例如氯化钠。例如，在某些实施例中，流动相具有约6.5至约7.5的pH，并包含15mM至约100mM HEPES、约2M至约4.5M尿素、约1M至约4.5M山梨糖醇、约0.25M至约1M脯氨酸、约0.25M至约1M精氨酸、和约0.25M至约0.8M氯化钠。在一些实施例中，流动相具有约7.0至约7.4的pH，并包含约20mM至约75mM HEPES、约3M至约4.2M尿素、约2M至约2.5M山梨糖醇、约0.3M至约0.8M脯氨酸、约0.3M至约0.8M精氨酸、和约0.5M至约1M氯化钠。在一个实施例中，流动相具有约7.2的pH，并包含约25mMHEPES、约4M尿素、约2.2M山梨糖醇、约0.5M脯氨酸、约0.5M精氨酸、和约0.75M氯化钠。在另一个实施例中，流动相具有约7.2的pH，并包含约50mM HEPES、约4M尿素、约2.2M山梨糖醇、约0.5M脯氨酸、约0.5M精氨酸、和约0.75M氯化钠。

在一些实施例中，流动相具有约6.5至约7.5的pH，并包含15mM至约100mM Tris、约2M至约4.5M尿素、约1M至约4.5M山梨糖醇、约0.25M至约1M脯氨酸、约0.25M至约1M精氨酸、和约0.25M至约0.8M氯化钠。在其他的实施例中，流动相具有约6.5至约7.5的pH，并包含15mM至约100mM HEPES、约2M至约4.5M尿素、约1M至约4.5M甘露醇、约0.25M至约1M脯氨酸、约0.25M至约1M精氨酸、和约0.25M至约0.8M氯化钠。在仍其他的实施例中，流动相具有约6.5至约7.5的pH，并包含15mM至约100mM Tris、约2M至约4.5M尿素、约1M至约4.5M甘露醇、约0.25M至约1M脯氨酸、约0.25M至约1M精氨酸、和约0.25M至约0.8M氯化钠。

可以调节流动相通过凝胶过滤基质的流速，以进一步增强抗体与其半抗体形式之间的分离。如实例5中描述的，增加流动相的流速导致完全组装的抗体和半抗体之间的分离效率的损失。因此，在某些实施例中，较慢的流速是优选的。在一些实施例中，流动相的流速以约0.01ml/min至约0.2ml/min的流速应用于凝胶过滤基质。在其他的实施例中，流动相的流速以约0.02ml/min至约0.06ml/min的流速应用于凝胶过滤基质。

当包含抗体和其半抗体形式的溶液通过具有本文描述的流动相的凝胶过滤基质移动时，收集洗脱级分。可以使用UV吸收监测级分的蛋白含量，例如，在280nm处，并且可以收集包含完全组装的抗体的洗脱级分，而可以丢弃含有较高分子量聚集体和半抗体的级分。如图12示出的，当根据本发明的方法操作尺寸排阻色谱时，抗体和其他较高分子量污染物的聚集体首先从凝胶过滤基质中洗脱，随后是完全组装的抗体，并且然后是半抗体。如实例5中描述的，可以通过SDS-PAGE和/或分析型SE-HPLC分析来自洗脱级分的样品，以验证级分富集完全组装的抗体和半抗体的去除。

可以在一个或多个纯化程序或其他单元操作之后进行基于尺寸排阻色谱的方法(例如基于凝胶过滤色谱的方法)以从半抗体中分离抗体。例如，基于尺寸排阻色谱的方法可以是抗体纯化过程中的第二或第三次精细色谱，特别地是多特异性异源二聚体抗体。在一些实施例中，基于尺寸排阻色谱的方法在蛋白A亲和色谱纯化步骤之后进行。因此，含有抗体和其半抗体形式的溶液是来自蛋白A色谱的洗脱液池或流出物流。蛋白A层析可以是常规蛋白A层析。可替代地，蛋白A色谱法可以是本文描述的蛋白A色谱法。因为采用于本发明方法的洗脱缓冲液从温度响应性蛋白A材料中除去含有Fc区的蛋白，例如抗体，所以具有与基于凝胶过滤色谱的方法中使用的流动相相同的组成，这些可以顺序地使用两种纯化程序。因此，在某些实施例中，本发明提供了纯化抗体的方法，包括：(i)在抗体与温度响应性蛋白A材料结合的温度使包含抗体和一种或多种杂质(例如其半抗体形式)的溶液与材料接触；(ii)用洗脱缓冲液在低于约35℃的温度从材料中洗脱蛋白，所述洗脱缓冲液具有约6.5至约7.5的pH，并且包含离液剂、糖醇、非极性氨基酸、和碱性氨基酸；(iii)使用洗脱缓冲液作为流动相，将来自温度响应性蛋白A材料的洗脱液与凝胶过滤基质接触；和(iv)从包含抗体的凝胶过滤基质中收集洗脱级分。在某些实施例中，待纯化的抗体是多特异性异源二聚体抗体。温度响应蛋白A色谱步骤和凝胶过滤色谱步骤可以以连续方式操作，使得来自温度响应性蛋白A色谱的洗脱液流直接加载到凝胶过滤基质上，而没有任何介入的保持罐。在一些实施例中，洗涤剂或UV病毒灭活步骤可任选地并入温度响应性蛋白A色谱步骤和凝胶过滤色谱步骤之间。

以下实例，包括进行的实验和实现的结果，仅提供解释说明目的，并且不应被解释为限制所附权利要求的范围。

实例

实例1.IgG-scFv结合蛋白的纯化

这个实例描述了使用常规蛋白A色谱或本发明的亲和色谱方法纯化一种类型的含有Fc区的蛋白，IgG-scFv结合蛋白。IgG-scFv结合蛋白包含两个单链可变片段(scFv)，每个含有来自第一抗体的重链和轻链可变结构域，通过肽接头与第二抗体重链的羧基末端融合。所得分子是四价结合蛋白，其具有针对位于免疫球蛋白Fc区的氨基末端侧的第一靶的两个抗原结合结构域和针对位于Fc区的羧基末端侧的第二靶的两个抗原结合结构域。IgG-scFv的单体形式示出于图1中。

出于比较的目的，使用常规蛋白A亲和色谱纯化IgG-scFv结合蛋白。将含有表达IgG-scFv结合蛋白的细胞的100-250ml之间的细胞培养基在4℃进行低速离心(600rpm)15分钟，以便沉积细胞和细胞碎片。将得到的澄清上清液通过0.22微米过滤器以除去细颗粒和可溶性聚集体。将澄清并过滤的溶液加载到含有MabSelect SuRe^TM树脂(通用医疗公司(GE Healthcare))的柱上，流速为1ml/min，温度为4℃。用含有pH 7.2的0.5M NaCl的磷酸盐缓冲的盐水溶液洗涤柱后，使用pH 2.7，且温度为4℃的174mM(1％)乙酸溶液从常规蛋白A树脂中洗脱结合的IgG-scFv结合蛋白。通过尺寸排阻-使用Superdex 200分析凝胶过滤柱的超高效液相色谱(SE-UPLC)分析洗脱液池的样品。四次独立实验的结果示出于图2。在一个实验中，用低pH乙酸缓冲液洗脱蛋白而不中和至pH 7.2(图2中的上图)。在第二个实验中，用低pH乙酸缓冲液洗脱蛋白并立即中和至pH 7.2(图2中的第二个图)。在第三个实验中，用低pH乙酸缓冲液洗脱蛋白，并在低pH乙酸缓冲液中储存八周而不中和(图2中的第三个图)。在第四个实验中，用低pH乙酸缓冲液洗脱蛋白，并在低pH乙酸缓冲液中储存八周然后中和至pH 7.2(图2中的下图)。

如SE-UPLC图示出的，IgG-scFv结合蛋白在从常规蛋白A亲和柱的低pH洗脱期间具有高聚集趋势，这一点可通过色谱图中在单体峰(用黑星指示)之前洗脱的多个峰(由黑色箭头指示)来证明。酸暴露和pH从低pH跳至中性pH两者均诱导IgG-scFv结合蛋白的聚集，pH跳跃具有比单独的酸暴露更大的副作用。常规蛋白A柱的加载和洗脱也在室温进行，并且获得类似于图2示出的结果(数据未示出)。

在第二系列实验中，使用温度响应性蛋白A树脂和特定的洗脱缓冲液纯化IgG-scFv结合蛋白允许从温度响应性蛋白A树脂中洗脱结合蛋白，而不将柱的温度升高到室温以上。为了制备温度响应蛋白A(TR-ProA)柱，将大约25ml的悬浮的TR-ProA树脂(Byzen

游牧生物科学有限公司(Nomadic Bioscience Co.,LTD.))包装在十五毫升的终体积的15ml柱中。用五个柱体积的溶液A(磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH 7.2)洗涤柱。然后用溶液B(含有0.5M NaCl的PBS)洗涤柱，随后用十个柱体积的水冲洗。然后用十五个柱体积的洗脱缓冲液洗涤冲洗的柱，洗脱缓冲液含有pH 7.2的25或50mM HEPES、0.75MNaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素。然后用溶液A平衡柱。

将含有IgG-scFv结合蛋白的各种体积(10ml-250ml)的澄清和过滤的培养基在4℃以1ml/min的流速加载到TR-ProA柱上。用十个柱体积的溶液B洗涤后，在4℃或室温用五至十个柱体积的洗脱缓冲液洗脱结合的IgG-scFv结合蛋白。洗脱后，根据制造商的说明再生柱。使用Superdex 200分析凝胶过滤柱通过SE-UPLC分析洗脱液池的样品。在4℃进行洗脱的三个独立实验的结果示出于图3中。在一个实验中，蛋白用洗脱缓冲液在4℃洗脱，并在SE-UPLC分析之前在37℃储存7天(图3中的上图)。在第二个实验中，蛋白用洗脱缓冲液在4℃洗脱，并在SE-UPLC分析之前在-80℃储存7天(图3中的第二个图)。在第三个实验中，蛋白用洗脱缓冲液在4℃洗脱，并在SE-UPLC分析之前在室温储存7天(图3中的第三个图)。结果显示IgG-scFv结合蛋白可以用TR-ProA树脂在低温用洗脱缓冲液以单体形式洗脱。结合蛋白的聚集完全消除，这一点可通过在单体峰之前没有从凝胶过滤分析柱洗脱的峰(由黑色星指示)来证明。此外，洗脱条件不影响洗脱的IgG-scFv蛋白的后续温度稳定性。由于将洗脱的蛋白在各种温度储存7天，未观察到洗脱蛋白的聚集或降解。

使用以上描述的相同的加载和洗脱条件重复使用TR-ProA柱纯化IgG-scFv结合蛋白，除了洗脱在室温而不是4℃进行。通过SDS-PAGE分析加载前澄清的培养基样品，加载期间的柱流过溶液和洗脱液池。SDS-PAGE分析的结果显示IgG-scFv结合蛋白富集在洗脱液池中，并且已除去许多污染蛋白(图4A)。还通过尺寸排阻-高效液相色谱(SE-HPLC)分析TR-ProA洗脱液池的样品。如图4B中的SE-HPLC色谱图示出的，TR-ProA洗脱液池中存在的99％的IgG-scFv结合蛋白呈单体形式，没有可检测的聚集体。

总之，本实例中的实验结果显示，含有Fc区的蛋白，例如多链IgG-scFv结合蛋白，可以在中性pH下从温度响应性蛋白A树脂上洗脱，以减少或消除典型地在常规蛋白A色谱的低pH洗脱下发生的蛋白聚集。另外，结果显示，包含离液剂、糖醇、和氨基酸的洗脱缓冲液允许从温度响应性蛋白A树脂中洗脱含Fc区的蛋白，而不会使温度升高到35℃以上，这典型地需要从温度响应蛋白A树脂中洗脱蛋白。

实例2.单链双特异性Fv-Fc结合蛋白的纯化

这个实例描述了第二类型的含有Fc区的蛋白的纯化，单链双特异性Fv-Fc结合蛋白，例如描述于WO 2014144722中的那些，将其通过引用以其全部内容并入本文，使用常规蛋白A色谱法或本发明的亲和色谱方法。单链双特异性Fv-Fc结合蛋白包含第一scFv片段，所述第一scFv片段含有来自第一抗体的重链和轻链可变结构域，与第二scFv片段融合，所述第二scFv片段含有来自第二抗体的重链和轻链可变结构域，和在其N-末端通过肽接头与第一scFv片段的C-末端融合的Fc区。双特异性Fv-Fc结合蛋白的单体形式示出于图5中。

在第一系列实验中，使用常规蛋白A亲和色谱纯化双特异性Fv-Fc结合蛋白。将含有表达双特异性Fv-Fc结合蛋白的细胞的细胞培养基在4℃以600rpm离心15分钟。除去上清液并用0.22微米过滤器过滤。然后将澄清的细胞培养上清液加载到含有MabSelect SuRe^TM蛋白A树脂(通用医疗公司(GE Healthcare))的柱上，并根据实例1中描述的方法洗涤。洗涤柱后，使用pH为2.7的174mM(1％)乙酸溶液或pH为3.7的33mM(0.06％)乙酸溶液在室温从常规蛋白A树脂洗脱结合的双特异性Fv-Fc结合蛋白。通过SE-HPLC分析洗脱液池的样品。

图6A显示当使用174mM(1％)乙酸溶液作为洗脱缓冲液时洗脱液池的SE-HPLC图，而图6B显示当较低浓度乙酸溶液用作洗脱缓冲液时洗脱液池的SE-HPLC图。在两种洗脱条件下，观察到双特异性Fv-Fc结合蛋白的大量聚集，这一点可通过多个峰(由黑色箭头指示)来证明，保留时间短于结合蛋白单体的峰(由黑色星指示)。当使用174mM(1％)乙酸溶液作为洗脱缓冲液时，仅有39％的双特异性Fv-Fc结合蛋白以单体形式回收。尽管降低洗脱缓冲液中乙酸的浓度改善了结合蛋白的单体形式的回收，但洗脱液池中仅有53％的结合蛋白是单体形式，并且仍观察到显著的聚集。因此，双特异性Fv-Fc结合蛋白在常规蛋白A色谱法需要的典型的低pH洗脱条件下特别地易于聚集。

在第二系列实验中，使用温度响应性蛋白A树脂(Byzen

游牧生物科学有限公司(Nomadic Bioscience Co.,LTD.))和包含如实例1中描述的离液剂、糖醇、非极性氨基酸、和碱性氨基酸的洗脱缓冲液纯化双特异性Fv-Fc结合蛋白。这种洗脱缓冲液允许从温度响应性蛋白A(TR-ProA)树脂中洗脱结合蛋白而不升高柱的温度，这是从温度响应性蛋白A树脂洗脱蛋白通常需要的步骤。具体地，将含有双特异性Fv-Fc结合蛋白的澄清的细胞培养上清液以1ml/min的流速和4℃的温度加载到TR-ProA柱上。用十个柱体积的含有0.5M NaCl的PBS洗涤后，在室温用五至十个柱体积的洗脱缓冲液1或洗脱缓冲液2洗脱结合的双特异性Fv-Fc结合蛋白。洗脱缓冲液1含有pH 7.2的25mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和2.5M尿素。洗脱缓冲液2含有pH 7.2的25mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素。通过SE-HPLC和SDS-PAGE分析洗脱液池的样品。

图7A显示了在室温用洗脱缓冲液1洗脱结合蛋白得到的洗脱液池的SE-HPLC图，而图7B显示了在室温用洗脱缓冲液2洗脱结合蛋白得到的洗脱液池的SE-HPLC图。从两个图中可以看出，类似于用实例1中描述的IgG-scFv结合蛋白获得的结果，双特异性Fv-Fc结合蛋白可以从TR-ProA树脂以基本单体形式洗脱，其中洗脱缓冲液为温度均低于30℃。在两种洗脱条件下，与从具有低pH缓冲液的常规蛋白A色谱柱洗脱得到的聚集相比，Fv-Fc结合蛋白的聚集显著降低(比较图6A和6B中黑色箭头与图7A和7B中的那些黑色箭头指示的峰)。此外，比较图7A中的图与图7B中的图，显示将洗脱缓冲液中的离液剂(例如尿素)的浓度从2.5M增加至4M，将洗脱液池中回收的单体Fv-Fc结合蛋白的百分比从75％增加至88％，并进一步降低洗脱液池中存在的聚集的结合蛋白的量。在用TR-ProA树脂和洗脱缓冲液2纯化双特异性Fv-Fc结合蛋白之前、期间、和之后样品的SDS-PAGE分析结果示出于图7C中。结果显示Fv-Fc结合蛋白富集在洗脱液池中。

这个实例中描述的实验结果显示，单链Fc融合蛋白，例如双特异性Fv-Fc结合蛋白，在从常规蛋白A树脂洗脱结合蛋白需要的低pH条件下具有聚集的趋势。通过采用温度响应性蛋白A树脂和包含离液剂、糖醇、非极性氨基酸、和碱性氨基酸的洗脱缓冲液，显著降低了这种结合蛋白的聚集。重要的是，洗脱缓冲液的组成使得结合蛋白能够以基本上单体的形式从温度响应性蛋白A树脂中除去，而不会使温度升高到35℃以上。

实例3.用于从温度响应性蛋白A树脂洗脱含有Fc区的蛋白的缓冲液

设计本实例中描述的实验以探索不同洗脱缓冲液从温度响应性蛋白A(TR-ProA)树脂中除去结合的含有Fc区的蛋白而不会使树脂的温度升高到室温以上的能力。在4℃将表达如实例1中描述的IgG-scFv结合蛋白或如实例2中描述的单链双特异性Fv-Fc结合蛋白的细胞澄清的细胞培养上清液加载到温度响应性蛋白A树脂柱上(Byzen

游牧生物科学有限公司(Nomadic Bioscience Co.,LTD.))并且用含有0.5M NaCl的PBS溶液洗涤。使用下表2中列出的一种洗脱缓冲液，在4℃从柱上洗脱结合的结合蛋白。使用SE-HPLC确定在洗脱液池中作为单体回收的结合蛋白的百分比。结果示出于以下表2中。

表2.用不同洗脱缓冲液从TR-ProA树脂洗脱后单体结合蛋白的回收

结果显示包含离液剂(例如尿素)显著增强了结合蛋白的单体形式的洗脱和回收。

实例4.单克隆抗体的纯化

这个实例描述了使用温度响应性蛋白A树脂纯化单克隆抗体。在4℃将表达抗体的细胞澄清的细胞培养上清液加载到温度响应性蛋白A树脂柱上(Byzen

游牧生物科学有限公司(Nomadic Bioscience Co.,LTD.))并且用含有0.5M NaCl的PBS溶液洗涤。在4℃用包含20mM HEPES、2M氯化胍、和2.2M山梨糖醇并且具有7.2的pH的洗脱缓冲液从柱上洗脱结合的抗体。通过SE-HPLC分析洗脱液池的样品，并且结果示出于图8A和8B中。可以使用洗脱缓冲液在低温从温度响应性蛋白A树脂上洗脱单克隆抗体，所述洗脱缓冲液仅包含摩尔浓度比为约0.9的离液剂(例如氯化胍)和糖醇(山梨糖醇)。在洗脱液池中以单体形式回收了近90％的抗体。

实例5.全抗体与半抗体的分离

半抗体是由于装配的不完整或抗体的两个重链多肽之间相互作用的破坏(例如，两个重链的铰链区之间的多肽间二硫键形成的破坏)而形成的。半抗体通常由单个轻链多肽和单个重链多肽组成。由于若干个原因，从含有希望的全抗体的制剂中除去半抗体是重要的。半抗体的存在降低了全抗体产物浓度，降低了剂量可重复性，并降低了产物的均一性。此外，半抗体可与全抗体竞争结合靶标并可降低全抗体的功效。

从全抗体中分离半抗体可能具有挑战性，因为半抗体具有与全抗体类似的特性。例如，半抗体和全抗体两者都含有类似的Fc区，并且因此不能使用蛋白A亲和色谱有效地分离。半抗体具有与全抗体类似的等电点、轴比率、和流体动力学半径，并且因此基于这些特征的分离方法通常是不合适的。此外，半抗体倾向于自缔合成并与全抗体结合，使得它们的去除更加困难。

即使在通过常规蛋白A亲和色谱法纯化后，在抗体的重组制剂，特别是异源二聚体抗体中经常观察到半抗体的存在(图9A和9B)。异源二聚体抗体是包含来自结合第一靶标的第一抗体的轻链和重链以及来自结合第二靶标的第二抗体的轻链和重链的抗体。因此，两种半抗体可以由这些双特异性异源二聚体抗体的重组产生而产生：结合第一靶标的一个半抗体和结合第二靶标的另一个半抗体。半抗体的存在和水平可以从异源二聚体抗体的不同批次重组产生而变化(图9A和9B)，并且由于去除半抗体需要的步骤的数量和性质，完全组装的异源二聚体抗体的总产率可以非常低(数据未示出)。

将含有表达双特异性异源二聚体抗体的细胞(“异源二聚体抗体A”)的细胞培养基在4℃进行低速离心(600rpm)15分钟以沉积细胞和细胞碎片。将得到的澄清上清液通过0.22微米过滤器以除去细颗粒和可溶性聚集体。将澄清并过滤的溶液加载到含有MabSelect SuRe^TM树脂(通用医疗公司(GE Healthcare))的柱上，流速为1ml/min，温度为4℃。用含有pH 7.2的0.5M NaCl的磷酸盐缓冲的盐水溶液洗涤柱后，使用pH 2.7，且温度为4℃的174mM(1％)乙酸溶液从常规蛋白A树脂中洗脱结合的抗体。通过SE-HPLC(图10A)和SDS-PAGE(图10B)分析洗脱液池的样品。如SE-HPLC和SDS-PAGE分析示出的，蛋白A洗脱液池含有显著量(约72％)的半抗体。

为去除残留在蛋白A洗脱液池中的半抗体，评估了在常规条件下操作的制备型尺寸排阻色谱(SEC)步骤。具体地，使用包含pH 7.0的磷酸盐缓冲盐水的流动相以1ml/min的流速将蛋白A洗脱液池加载到Superdex 200制备型凝胶过滤柱上。如图11中示出的，在这些条件下操作的SEC不能将完全组装的异源二聚体抗体从半抗体分离。降低通过含有PBS流动相的制备型SEC柱的流速至低至0.01ml/min的速率不会改善分离(数据未示出)。

重复所述实验，但用具有与实例1中描述的独特洗脱缓冲液相似组成的流动相替换包含PBS的常规流动相。使用pH 7.2的包含50mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素的流动相，将包含完全组装的异源二聚体抗体和半抗体的蛋白A洗脱液池加载到Superdex 200制备型凝胶过滤柱(2x80ml)上。在从制备型凝胶过滤柱洗脱期间观察到三个不同的蛋白峰(图12)。在洗脱期间收集各种级分，并通过分析型SE-HPLC和SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析显示峰2主要包含完全组装的抗体，而峰3主要包含半抗体(图13A和13B)。峰1对应于较高分子量聚集体。令人惊讶的是，在SEC中使用这种独特的流动相允许从完全组装的抗体以及从更高分子量的聚集体中分离半抗体(图14A-14C)。

使用对不同靶标抗原具有特异性的两种其他的双特异性异源二聚体抗体重复使用以上描述的独特流动相的制备型SEC过程。在SEC纯化之前，异源二聚体抗体B和异源二聚体抗体C两者的制备都含有半抗体污染物(图15A和16A)。然而，在使用pH 7.2的包含50mMHEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素的流动相进行SEC纯化后，可以将完全组装的异源二聚体抗体从半抗体分离，使得仅保留希望的完全组装的异源二聚体抗体(图15B和16B)。

在另一个系列实验中，评估了流速对使用SEC的半抗体分离效率的影响。使用Superdex 200制备型凝胶过滤柱(2x80ml)和包含pH 7.2的包含50mM HEPES、0.75M NaCl、0.5M精氨酸、0.5M脯氨酸、2.2M山梨糖醇、和4M尿素的流动相，以从0.02ml/min至0.2ml/min的流速范围对重组双特异性异源二聚体抗体的制剂进行SEC(图17A-17F)。结果显示半抗体在较慢的流速下更有效地与完全组装的抗体分离，在约0.02ml/min至约0.06ml/min的流速下发生最佳分离(图17A-17F)。

总之，本实例中描述的实验数据显示，在SEC凝胶过滤柱中使用包含离液剂、糖醇、和氨基酸的流动相可以有效地将半抗体污染物和高分子量聚集体从完全组装的抗体分离。这个方法提供了一种稳健的一步法从重组抗体制剂中，特别地是多特异性异源二聚体抗体制剂中除去这些有问题的污染物。

本文讨论和引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其全部内容并入本文。应理解，披露的发明不限于所描述的特定方法、方案和材料，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不意图限制所附权利要求的范围。

本领域的技术人员只使用常规实验就将认识到或能够确定本文描述发明的具体实施例的许多等效形式。此类等效物旨在由以下权利要求所涵盖。

Claims

1. 一种用于将抗体与其半抗体形式分离的方法，所述方法包括：

使用流动相使包含抗体及其半抗体形式的溶液与凝胶过滤基质接触，所述流动相具有约6.5至约7.5的pH，并且包含离液剂、糖醇、非极性氨基酸、和碱性氨基酸；和

从所述凝胶过滤基质中收集洗脱级分，其中所述抗体在一组洗脱级分中洗脱，并且所述其半抗体形式在另一组洗脱级分中洗脱，从而将所述抗体与所述其半抗体形式分离。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述离液剂是尿素、氯化胍、硫氰酸钠、硫氰酸钾或硫氰酸铵。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述离液剂是尿素。

4. 如权利要求3所述的方法，其中所述尿素以约2 M至约4.5 M的浓度存在。

5. 如权利要求4所述的方法，其中所述尿素以约4 M的浓度存在。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述糖醇是山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、或甘油。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述糖醇是山梨糖醇。

8. 如权利要求1所述的方法，其中所述糖醇以约1 M至约4.5 M的浓度存在。

9. 如权利要求8所述的方法，其中所述糖醇以约2 M至约2.5 M的浓度存在。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述碱性氨基酸是组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、或精氨酸。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述碱性氨基酸是精氨酸。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述非极性氨基酸是丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、或缬氨酸。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述非极性氨基酸是脯氨酸。

14. 如权利要求1所述的方法，其中所述碱性氨基酸和/或所述非极性氨基酸以约0.25M至约1 M的浓度存在。

15. 如权利要求1所述的方法，其中所述碱性氨基酸和/或所述非极性氨基酸以约0.5M的浓度存在。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述流动相进一步包含盐。

17. 如权利要求16所述的方法，其中所述盐以约0.25 M至约0.8 M的浓度存在。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述盐是氯化钠。

19. 如权利要求18所述的方法，其中所述流动相包含约2 M至约4.5 M尿素、约1 M至约4.5 M山梨糖醇、约0.25 M至约1 M精氨酸、约0.25 M至约1 M脯氨酸、和0.25 M至约0.8 M氯化钠。

20. 如权利要求19所述的方法，其中所述流动相包含约4 M尿素、约2.2 M山梨糖醇、约0.5 M精氨酸、约0.5 M脯氨酸、和约0.75 M氯化钠。

21.如权利要求1所述的方法，其中所述流动相具有约7.0至约7.4的pH。

22. 如权利要求1所述的方法，其中将所述流动相以约0.01 ml/min至约0.2 ml/min的流速应用于所述凝胶过滤基质。

23. 如权利要求1所述的方法，其中将所述流动相以约0.02 ml/min至约0.06 ml/min的流速应用于所述凝胶过滤基质。

24. 如权利要求1所述的方法，其中所述凝胶过滤基质具有约10 kDa至约600 kDa的分级范围。

25.如权利要求1所述的方法，其中所述凝胶过滤基质包含交联琼脂糖和葡聚糖。

26.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体在哺乳动物细胞中重组产生。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

28.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体是多特异性异源二聚体抗体。

29.如权利要求1所述的方法，其中所述含有抗体和其半抗体形式的溶液是来自蛋白A色谱的洗脱液池或流出物流。

30.如权利要求1所述的方法，其中所述含有抗体和其半抗体形式的溶液是细胞培养上清液或细胞裂解液。