JPWO2012086837A1 - 温度応答性プロテインaの固定化方法 - Google Patents
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Abstract
温度に依存して抗体との結合性が変化するよう変異されたプロテインAである温度応答性プロテインAの固定化担体の製造方法であって、温度応答性プロテインAは、第1の温度領域で抗体との結合性を有し、第2の温度領域で抗体との結合性を有さず、温度応答性プロテインAが抗体との結合性を有する第1の温度領域の温度で、温度応答性プロテインAを担体表面に固定する工程を含む、温度応答性プロテインA固定化担体の製造方法。
Description
本発明は、温度変化に伴って抗体との結合性に変化を示すことを特徴とする温度応答性プロテインAの、担体への固定化方法に関する。
抗体(イムノグロブリン)は、免疫反応を司る生理活性物質である。近年、医薬品、診断薬或いは対応する抗原タンパク質の分離精製材料等の用途において、その利用価値が高まっている。抗体は免疫した動物の血液あるいは抗体産生能を保有する細胞の細胞培養液又は動物の腹水培養液から取得される。但し、それらの抗体を含有する血液や培養液は、抗体以外のタンパク質、又は細胞培養に用いた原料液に由来する複雑な夾雑成分を包含する。そのため、それらの不純物成分から抗体を分離精製するためには、煩雑で長時間を要する操作が通常必要である。
液体クロマトグラフィーは、抗体の分離精製に重要である。抗体を分離するためのクロマトグラフィー手法として、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー等があり、これらの手法を組み合わせることで抗体が分離精製される。
アフィニティークロマトグラフィーでは、目的物質と親和性のある物質(リガンド)を担体に固定しておき、目的物質をこのリガンドに特異的に吸着させることで、目的物質を不純物成分から分離する。また、吸着された目的物は、リガンドとの親和性を下げることにより溶出され、これを回収することで、精製を行うことが可能である。
アフィニティークロマトグラフィーにおいては、下記(A)〜(C)の工程を経て、純度及び濃度の高い抗体が精製される。
(A)不純物の混じった試料をカラムに負荷する工程(負荷工程)
(B)負荷したカラムから精製対象とする抗体以外の不純物を取り除く工程(洗浄工程)
(C)精製対象とする抗体をカラムから回収する工程(溶出工程)
(A)不純物の混じった試料をカラムに負荷する工程(負荷工程)
(B)負荷したカラムから精製対象とする抗体以外の不純物を取り除く工程(洗浄工程)
(C)精製対象とする抗体をカラムから回収する工程(溶出工程)
負荷工程と洗浄工程においては、精製対象とする抗体がアフィニティーリガンドに強く結合するように、カラム内の環境を設定する一方で、溶出工程では両者が分離するようにカラム内の環境を変化させることが必須であり、この環境変化には、通常pHの変化が利用されている。
抗体の精製に用いるアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとしては、抗体の共通領域に極めて高い特異性と親和性を持つ、スタフィロコッカス由来のプロテインA、及びその抗体結合ドメインが知られており、産業規模における抗体製造工程で広く使用されている。
しかしながら、プロテインA又はその一部をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーには、抗体の性質に起因する問題があり、その製造が制約を受けている。
その問題とは、pH変化によってカラムから精製対象とする抗体を溶出させるには、抗体とプロテインAの親和性が高いpH6〜8の中性域(負荷・洗浄工程のpH)から、親和性が極端に低下するpH3〜4の酸性域(溶出工程のpH)に環境を変化させる必要があるが、この酸性域では、抗体に立体構造の変化、及び会合凝集などが起こり、その機能に不具合をきたすため(例えば、特許文献1参照。)、"本来の性質を保持した抗体"の分離・精製の歩留まりが、極端に悪くなるという事である。
特に、モノクローナル抗体医薬品として使用され、産業上最も有用なヒト化又はヒト型IgGは、プロテインAとの親和性が他の抗体より高いため、溶出時に、特に強い酸性度の緩衝液が使用される。そのため、溶出時に、会合・凝集が発生しやすい。よって、それらIgGの失活が、産業上問題となっている。
したがって、高純度の抗体を効率よく製造するためには、溶出工程において酸性域の環境を用いない精製方法を開発することが望まれている。
上記問題を解決するために、温度変化に伴って抗体との結合性が変化する変異プロテインA(温度応答性プロテインA)を用いた精製方法が提案されている(例えば、特許文献2参照。)。提案された方法によれば、精製の対象たる抗体の立体構造の安定性が確保され、かつ損傷、機能の喪失、又は意図しない機能の発生などの不具合が引き起こされないような条件下(pH5〜9、60℃未満)で、それ自身の天然立体構造の喪失と、形成と、の制御が可能な、温度応答性プロテインAをアフィニティークロマトグラフィー用支持体に固定するリガンドとして使用することによって、溶出工程においてpHの変化を必要としない、新たな精製方法が可能となる。
温度応答性プロテインAは、温度変化に伴って抗体との結合性が変化するといった特徴があるが、これまで支持体への最適な固定化方法が検討されたことはなかった。そこで、本発明は、温度変化に伴って抗体との結合性に変化を示すことを特徴とする温度応答性プロテインAを、支持体に固定するための最適な方法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、温度変化に伴って抗体との結合性に変化を示すことを特徴とする温度応答性プロテインAが、抗体に対して吸着性を有する温度で、当該温度応答性プロテインAを担体表面に固定されたカップリング基と接触させ、当該温度応答性プロテインAを共有結合により担体表面に固定化することにより、温度応答性プロテインAの機能を損なわずに固定できることを見出した。本発明で示される技術は、従来技術からは全く予想し得なかったもので、従来技術には全くなかった新規な抗体の分離システムへの発展が期待される。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
本発明に記載される製造方法により、新規なアフィニティークロマト担体が製造可能となる。この担体を利用すれば、免疫グロブリン等のタンパク質等の有用な生理活性物を温度変化によって工業規模で分離精製できるようになる。
以下、本発明の実施形態(以下において、「本実施形態」という。)について詳細に説明する。本実施形態は、温度に依存して抗体との結合性が変化するよう変異されたプロテインAである温度応答性プロテインAに関する。温度応答性プロテインAは、第1の温度領域で抗体との結合性を有し、第2の温度領域で抗体との結合性を有しない。本実施形態に係る温度応答性プロテインAの固定化担体の製造方法は、温度応答性プロテインAが抗体との結合性を有する第1の温度領域の温度で、温度応答性プロテインAを担体表面に固定する工程を含む。
本実施形態で担体として使用する支持体の形状は、特に限定されるものではなく、例えば平膜状、中空糸状等の膜状、又はビーズ状のものがある。中空糸状の支持体は、モジュール成型が容易であり、モジュール容器あたりに充填できる膜面積が大きいため、好適に用いることができる。また、ビーズ状のものは一般的に、体積あたりの表面積が膜状のものと比較して大きく、大量の抗体を吸着できるため、好適に用いることができる。
本実施形態で担体として使用する支持体の材料は、特に限定されるものではない。膜状の担体の材料は、多孔性の膜を形成しうる高分子材料が好適に用いることができる。例えば、ポリエチレンやポリプロピレン等のオレフィン樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンテレナフタレート等のポリエステル樹脂、ナイロン6、ナイロン66等のポリアミド樹脂、ポリフッ化ビニリデン、ポリクロロトリフルオロエチレン等の含フッ素樹脂、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、及びポリカーボネート等の非結晶性樹脂などが使用できる。ビーズ状の担体の材料は、ガラス、シリカ、ポリスチレン樹脂、メタクリル樹脂、架橋アガロース、架橋デキストラン、架橋ポリビニルアルコール、及び架橋セルロースなどが使用できる。架橋ポリビニルアルコール、及び架橋セルロースは親水性が高く、不純物成分の吸着を抑制できるため好適に用いることができる。
本実施形態で使用する支持体は、例えば複数の細孔を有する。細孔径は、特に限定されるものではないが、5〜1000nmがよく、好ましくは10〜700nm、さらに好ましくは20〜500nmである。細孔径が5nm以下であると、分離できる抗体の分子量が低くなる傾向にある。また細孔径が1000nm以上であると基材の表面積が少なくなり、抗体の結合容量が小さくなる傾向にある。
本実施形態では、上記支持体にどのようなカップリング基を導入してもよい。例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化されたカルボキシル基、カルボキシル基、臭化シアン活性化基、水酸基、エポキシ基、アルデヒド基、及びチオール基等が挙げられる。温度応答性プロテインAは一級アミノ基を有しているため、上述したカップリング基のうち、一級アミノ基とカップリングできるNHS活性化されたカルボキシル基、カルボキシル基、臭化シアン活性基、エポキシ基、及びホルミル基等が好ましい。特に、NHSで活性化されたカルボキシル基は、カップリング反応時に他の薬品の使用が不要であり、反応が迅速で強固な結合を形成するため好適に用いられる。
支持体表面に固定されたカップリング基の濃度(密度)は、好ましくは50μmol/mL以上、1000μmol/mL未満である。
カップリング基の濃度が50μmol/mL未満の場合、カップリング基と、温度応答性プロテインAと、のカップリング効率が低下する傾向にある。
カップリング基の濃度を50μmol/mL以上とすることにより、カップリング基と、温度応答性プロテインAと、のカップリング効率を増大させることが可能である。本実施形態では、温度応答性プロテインAが抗体に対して吸着性を有する温度で、温度応答性プロテインAを支持体表面に固定されたカップリング基と接触させ、温度応答性プロテインAを共有結合により支持体表面に固定している。これにより、温度応答性プロテインAの機能を損なうことなく、温度応答性プロテインAを支持体表面に固定することが可能となる。そのため、高い密度でカップリング基を有する支持体を用いることで、高いカップリング効率で、且つ、温度応答性プロテインAの機能を損なうことなく、温度応答性プロテインAを担体表面に固定することが可能となる。ただし、カップリング基の濃度が1000μmol/mL以上となると、支持体と温度応答性プロテインAとの結合数が増大し、温度応答性プロテインAの活性が低下する傾向にある。
カップリング基の密度は、当業者に既知の方法で測定することが可能である。例えば、NHSで活性化されたカルボキシル基の場合、熱やアルカリによってカルボキシル基からNHSを遊離させ、HPLC法で定量する方法(HPLC法)や、NHS活性化反応によって増加した担体の重量(W1)を測定することにより定量する方法(重量法)がある。
支持体表面に固定されたカップリング基の濃度(密度)は、好ましくは50μmol/mL以上、1000μmol/mL未満である。
カップリング基の濃度が50μmol/mL未満の場合、カップリング基と、温度応答性プロテインAと、のカップリング効率が低下する傾向にある。
カップリング基の濃度を50μmol/mL以上とすることにより、カップリング基と、温度応答性プロテインAと、のカップリング効率を増大させることが可能である。本実施形態では、温度応答性プロテインAが抗体に対して吸着性を有する温度で、温度応答性プロテインAを支持体表面に固定されたカップリング基と接触させ、温度応答性プロテインAを共有結合により支持体表面に固定している。これにより、温度応答性プロテインAの機能を損なうことなく、温度応答性プロテインAを支持体表面に固定することが可能となる。そのため、高い密度でカップリング基を有する支持体を用いることで、高いカップリング効率で、且つ、温度応答性プロテインAの機能を損なうことなく、温度応答性プロテインAを担体表面に固定することが可能となる。ただし、カップリング基の濃度が1000μmol/mL以上となると、支持体と温度応答性プロテインAとの結合数が増大し、温度応答性プロテインAの活性が低下する傾向にある。
カップリング基の密度は、当業者に既知の方法で測定することが可能である。例えば、NHSで活性化されたカルボキシル基の場合、熱やアルカリによってカルボキシル基からNHSを遊離させ、HPLC法で定量する方法(HPLC法)や、NHS活性化反応によって増加した担体の重量(W1)を測定することにより定量する方法(重量法)がある。
本実施形態では、支持体へのカップリング基の導入方法はいかなる方法でもよいが、支持体と、カップリング基と、の間にスペーサーを導入するのが一般的である。カップリング基の導入方法は、さまざまな文献によって開示されている。
本実施形態では、カップリング基を末端、及び/又は側鎖に有するグラフト高分子鎖を支持体に導入してもよい。カップリング基を有するグラフト高分子鎖を支持体に導入することで、カップリング基の密度を任意に高める等、制御することが可能となる。カップリング基を有する高分子鎖を支持体にグラフトするか、あるいはカップリング基に変換しうる前駆体官能基を有する高分子鎖を支持体にグラフトし、その後にグラフトした前駆体官能基をカップリング基に変換してもよい。
グラフト高分子鎖の導入方法はいかなる方法でもよい。あらかじめ高分子鎖を調製し、支持体にカップリングしてもよい。また、「リビングラジカル重合法」や「放射線グラフト重合法」の手法により、支持体上で直接グラフト鎖を重合してもよい。「放射線グラフト法」は、支持体にあらかじめ反応開始剤を導入する必要がなく、適応可能な支持体が多種であるため、好適に用いることができる。
「放射線グラフト重合法」でグラフト鎖を導入する場合、支持体にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用し得るが、支持体全体に均一なラジカルを生成させるためには、電離性放射線の照射が好ましい。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、及び中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が好ましい。電離性放射線はコバルト60、ストロンチウム90、及びセシウム137などの放射性同位体から、あるいはX線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等から得られる。
電離性放射線の照射線量は、1kGy以上1000kGy以下が好ましく、より好ましくは2kGy以上500kGy以下、さらに好ましくは5kGy以上200kGy以下である。照射線量が1kGy未満では、ラジカルが均一に生成しにくくなる傾向にある。また、照射線量が1000kGyを超えると、支持体の物理的強度の低下を引き起こす傾向にある。
電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に支持体にラジカルを生成した後、次いでそれを反応性化合物と接触させる前照射法と、支持体を反応性化合物と接触させた状態で支持体にラジカルを生成させる同時照射法と、に大別される。本実施形態においては、いかなる方法も適用し得るが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。
本実施形態においてグラフト重合時に使用する溶媒は、反応性化合物を均一溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、エタノールやイソプロパノール、t−ブチルアルコール等のアルコール類; ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類; アセトンや2−ブタノン等のケトン類; 水、又はそれらの混合物等が挙げられる。
本実施形態において、グラフト重合に使用されるカップリング基を有するモノマーとしては、カルボキシル基をカップリング基とする場合には、アクリル酸、及びメタクリル酸等のモノマーが挙げられる。一級アミノ基をカップリング基とする場合には、アリルアミン等が挙げられる。そして、エポキシ基をカップリング基とする場合には、グリシジルメタクリレート等が挙げられる。
本実施形態において、カップリング基に変換しうる前駆体官能基を有するモノマーを支持体にグラフトし、その後にグラフトした前駆体官能基をカップリング基に変換してもよい。エポキシ基を有するグリシジルメタクリレート(GMA)は、さまざまなエポキシ基の開環反応を利用してさまざまな官能基に変換することが可能であるため、工業的にも好適に用いることが可能である。
カルボキシル基をカップリング基とする場合には、まずGMAをグラフト重合後、GMAのエポキシ基を加水分解してジオールとし、ジオール由来の水酸基に環状酸無水物を開環ハーフエステル化反応させることにより、環状酸無水物に由来するカルボキシル基を形成(開環ハーフエステル化反応)することが可能である。製造コストの点で、環状酸無水物は無水コハク酸又は無水グルタル酸であることが望ましいが、これらに限定されない。
開環ハーフエステル化反応に用いられる触媒としては本反応を促進するものであれば特に限定されないが、具体的にはトリエチルアミン、イソブチルエチルアミン、ピリジン、及び4−ジメチルアミノピリジンなどが挙げられ、トリエチルアミン又は4−ジメチルアミノピリジンが好ましく、反応速度や収率の点で4−ジメチルアミノピリジンが最も好ましい。
開環ハーフエステル化反応は、上記触媒を添加したトルエン等の不活性有機溶媒中で行われることが好ましい。
本実施形態においてNHS活性反応とは、上記開環ハーフエステル化反応により形成されたカルボキシル基を活性エステルに変換する工程である。カルボキシル基と比較して活性エステルは反応性が高いことから、温度応答性プロテインAを担体上に迅速に固定化することが望まれる場合には活性エステル化工程を行うことが好ましい。
活性エステルは、親水性化合物と、固定化対象物質と、を共有結合によって結びつける役目を果たす。ここで、活性エステルとはR−C(=O)−Xという化学構造を意味する。Xには、ハロゲンやN−ヒドロキシスクシンイミド基又はその誘導体、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール基又はその誘導体、ペンタフルオロフェニル基、並びにパラニトロフェニル基などの脱離性基が該当するが、これらに限定されない。活性エステルとしては、反応性、安全性及び製造コストの点で、N−ヒドロキシスクシンイミドエステルが望ましい。カルボキシル基のN−ヒドロキシスクシンイミドエステルへの変換は、カルボキシル基にN−ヒドロキシスクシンイミドと、カルボジイミドと、を同時に反応させることによって達成される。ここで、カルボジイミドとは−N=C=N−の化学構造を有する有機化合物を意味し、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、及び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩等が挙げられるが、これらに限定されない。N−ヒドロキシスクシンイミド及びカルボジイミドの濃度は1〜100mmol/L、反応温度は0〜100℃、反応時間は2分〜16時間の範囲で設定されるのが望ましい。反応溶媒としてはN,N'−ジメチルホルムアミド(DMF)やトルエンなどを使用することができる。
本実施形態において、温度に依存して抗体との結合性が変化するよう変異されたプロテインAである温度応答性プロテインAは、特許文献(WO2008/143199号パンフレット)を参考に調製することができる。
本実施形態において、NHS活性化されたカルボキシル基と、温度応答性プロテインAと、のカップリング反応は、例えば以下のように行われる。まず、クエン酸緩衝液(pH3.0〜6.2)、酢酸緩衝液(pH3.6〜5.6)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH5.8〜8.5)、又は炭酸緩衝液(pH9.2〜10.6)などのアミノ基成分を含まない緩衝液を用いて、0.1〜100mg/mlの温度応答性プロテインA溶液を準備する。この水溶液を活性エステル表面と接触させると、温度応答性プロテインAに含まれるアミノ基等の官能基が活性エステルと反応し、アミド結合が形成される。その結果、温度応答性プロテインAは共有結合によって表面に固定化される。ここで、接触時間は2分〜16時間の範囲で設定するとよい。温度応答性プロテインAを固定化した後は、適当な洗浄液で担体を洗浄することが望ましい。このとき、洗浄液は0.5mol/L程度の塩(NaCl)及び0.1%程度の非イオン性界面活性剤を含む緩衝液であることが望ましい。これによって、共有結合せずに物理吸着しているだけの温度応答性プロテインAを取り除くことができるからである。
本実施形態において、NHS活性化されたカルボキシル基と、温度応答性プロテインAと、のカップリング反応は、温度応答性プロテインAが抗体に対して吸着性を有する温度で達成される。
温度応答性プロテインAの一部は、天然立体構造の喪失と、形成と、が温度変化によって可逆的に生じる。具体的には、温度応答性プロテインAの一部は、低温領域では天然の立体構造が形成されて抗体との結合能を有するが、高温領域では天然の立体構造を喪失して抗体との結合能が著しく低下する。低温領域で天然の立体構造が形成された状態で支持体とカップリングされた場合、温度応答性プロテインAは、抗体との結合性を維持し、かつ、温度変化による天然立体構造の喪失と、形成と、が支持体とのカップリング後も可逆的に生じる。しかしながら、高温領域で天然の立体構造が喪失した状態で支持体とカップリングされた場合、固定された温度応答性プロテインAは、低温に環境温度が変化しても、完全に天然の立体構造に戻ることができないため、充分な抗体結合性を発揮できない。
なお、温度応答性プロテインAの抗体との結合性が温度に依存して変化する機構は、立体構造の変化に限定されない。立体構造の変化を伴わずに、温度に依存して抗体との結合性が変化する温度応答性プロテインAも存在する。立体構造の変化を伴わずに、温度に依存して抗体との結合性が変化する温度応答性プロテインAについても、NHS活性化されたカルボキシル基とのカップリング反応を、温度応答性プロテインAが抗体に対して吸着性を有する温度で行うことにより、カップリング後も、抗体との結合性を維持することが可能となる。
温度応答性プロテインAの一部は、天然立体構造の喪失と、形成と、が温度変化によって可逆的に生じる。具体的には、温度応答性プロテインAの一部は、低温領域では天然の立体構造が形成されて抗体との結合能を有するが、高温領域では天然の立体構造を喪失して抗体との結合能が著しく低下する。低温領域で天然の立体構造が形成された状態で支持体とカップリングされた場合、温度応答性プロテインAは、抗体との結合性を維持し、かつ、温度変化による天然立体構造の喪失と、形成と、が支持体とのカップリング後も可逆的に生じる。しかしながら、高温領域で天然の立体構造が喪失した状態で支持体とカップリングされた場合、固定された温度応答性プロテインAは、低温に環境温度が変化しても、完全に天然の立体構造に戻ることができないため、充分な抗体結合性を発揮できない。
なお、温度応答性プロテインAの抗体との結合性が温度に依存して変化する機構は、立体構造の変化に限定されない。立体構造の変化を伴わずに、温度に依存して抗体との結合性が変化する温度応答性プロテインAも存在する。立体構造の変化を伴わずに、温度に依存して抗体との結合性が変化する温度応答性プロテインAについても、NHS活性化されたカルボキシル基とのカップリング反応を、温度応答性プロテインAが抗体に対して吸着性を有する温度で行うことにより、カップリング後も、抗体との結合性を維持することが可能となる。
本実施形態において「第1の温度領域」あるいは「温度領域A」とは、温度応答性プロテインAが特定のタンパクとの吸着性を有する温度の領域であり、一定量の温度応答性プロテインAに結合可能なタンパクの最大結合量に対して、タンパク結合量が50%以上となる温度の領域である。「第1の温度領域の温度」として、0〜30℃未満が好ましく、0〜20℃がさらに好ましく、0〜10℃が最も好ましい。0℃未満では、カップリング反応時に凍結する可能性があり、30℃以上では十分な抗体の結合性が得難い。また、本実施形態において「第2の温度領域」あるいは「温度領域B」とは、温度応答性プロテインAが特定のタンパクとの吸着性を有効に示さない温度の領域であり、一定量の温度応答性プロテインAに結合可能なタンパクの最大結合量に対して、タンパク結合量が50%未満となる温度の領域である。
温度領域A、及び温度領域Bを特定する具体的な方法は、以下の手順で行う。
1.温度応答性プロテインA固定化担体にそれぞれ5℃未満、10℃、(以後、特定のタンパクが変性する温度の直下まで10℃おきに設定する)の温度において、タンパクを結合させる。
2.特定のタンパクが変性する温度の直下まで昇温して、結合したタンパクを溶出させ、タンパク溶出量を280nmの波長の紫外線(UV)法で測定する。
3.タンパク溶出量を、タンパクを吸着させた温度に対してプロットし、タンパク結合量(溶出量)の最大値の50%とプロット間を結んだ線の交点(以下、「50%結合温度」と呼ぶ。)を境とし、50%以上のタンパク結合量を有する温度領域を温度領域A、50%未満のタンパク結合量を有する温度領域を温度領域Bとする。
1.温度応答性プロテインA固定化担体にそれぞれ5℃未満、10℃、(以後、特定のタンパクが変性する温度の直下まで10℃おきに設定する)の温度において、タンパクを結合させる。
2.特定のタンパクが変性する温度の直下まで昇温して、結合したタンパクを溶出させ、タンパク溶出量を280nmの波長の紫外線(UV)法で測定する。
3.タンパク溶出量を、タンパクを吸着させた温度に対してプロットし、タンパク結合量(溶出量)の最大値の50%とプロット間を結んだ線の交点(以下、「50%結合温度」と呼ぶ。)を境とし、50%以上のタンパク結合量を有する温度領域を温度領域A、50%未満のタンパク結合量を有する温度領域を温度領域Bとする。
特許文献(WO2008/143199号パンフレット)実施例を参考に調製した温度応答性プロテインAを、後述する実施例1記載の方法で固定化し、実施例1記載の条件で抗体の吸着、溶出を行い、上記手順で50%結合温度を算出した。その結果、図1に示すように、ある一定量の温度応答性プロテインAは、環境温度(抗体結合温度)が2℃の場合に、14.5mg/mlの抗体と結合可能であり、当該2℃において、最大結合量を示した。また、プロットより、50%吸着温度は15.0℃であった。この場合、15.0℃以下のカップリング温度が上述した温度領域Aであり、15.0℃より高いカップリング温度が温度領域Bである。
なお、温度応答性プロテインAの温度領域Aと、温度領域Bと、を区分する温度は、温度応答性プロテインAのペプチド鎖の相違により、若干異なる。ただし、同一のペプチド鎖を有する温度応答性プロテインAの温度領域Aと、温度領域Bと、を区分する温度は、変化しない。変わるのは吸脱着可能な抗体結合量の絶対量になる。
温度応答性プロテインAを担体表面に固定化した後(好ましくは更に温度応答性プロテインA固定化担体を洗浄した後)は、未反応のカルボキシル基又は活性エステルを、アミノ基を有する低分子化合物と結合させることにより、当該カルボキシル基又は活性エステルを反応性のより低い官能基に変換させることが好ましい。これによって、不純物等の精製対象外の分子が不本意に担体表面に固定化されるのを防ぐことができる。特に温度応答性プロテインA固定用担体の末端の官能基が活性エステルである場合、この操作がなされることが好ましい。
本明細書では、活性エステル基にアミノ基を有する低分子化合物を反応させる操作を特に「ブロッキング」と記述することがある。ただし、カルボキシル基又は活性エステルを低分子化合物と反応させた後の担体表面は、親水性であることが望ましい。なぜなら、親水性の表面は一般に生体関連物質の非特異的吸着を抑制する効果をもつからである。このためにはアミノ基を含有する低分子化合物として、アミノ基以外に親水性基を更に有する低分子化合物を使用することが好ましい。このような低分子化合物の非限定的な例としては、エタノールアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、及びジグリコールアミン(IUPAC名:2−(2−アミノエトキシ)エタノール)が挙げられる。これらの低分子化合物はPBSなどの緩衝液に10〜1,000mmol/Lとなるように溶解し、溶解液を温度応答性プロテインAを固定化した担体と接触させる。例えば、反応温度は4〜37℃、反応時間は2分〜16時間の範囲で設定するとよい。
温度応答性プロテインA固定化担体は、pH4〜8の範囲の中性溶液を保存液とし、2〜10℃程度の低温で保存する。保存液としては、抗菌性を考慮して、20%エタノールが好ましい。
温度応答性プロテインA固定化担体による抗体の分離方法は特に限定されるものではないが、あらかじめ温度応答性プロテインAの特性が変わる温度を確認しておき、その温度を挟むようにして温度変化させることにより不純物の分離を行う方法が挙げられる。本実施形態の場合、この温度応答性プロテインAの特性が大きく変わる温度を挟むようにして分離することが最も効果的な利用方法である。
以上に示してきた本実施形態における温度応答性プロテインA固定化方法により製造した温度応答性プロテインA固定化担体は、プロテインAがその抗体結合性を固定後も維持する。そのため、工業的に充分な量の抗体を温度変化によって精製することが可能となる。その際には、カラム内の温度を変化させるだけで簡便な操作だけで分離が達成でき、溶出工程において低pHの溶出液を必要としないため、精製された抗体も変性なく得られる。
以下に、本実施形態を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本実施形態を何ら限定するものではない。
放射線グラフト重合法によってカップリング基前駆体モノマーであるグリシジルメタクリレート(GMA)からなるグラフト鎖を中空糸膜に導入した後に、GMAが含有していたエポキシ基をジオール基に変換し、その後カルボキシル基に変換した。次に、側鎖にカルボキシル基を含有したグラフト鎖が導入された中空糸膜をモジュール成型し、その後、カルボキシル基をNHS活性化した。さらに、NHS活性化された中空糸モジュールに、温度応答性プロテインAが抗体に対して吸着性を有する温度で温度応答性プロテインAを透過させることで、温度応答性プロテインAを中空糸に固定化した。詳細は以下のとおりである。
1)表面グラフト重合
GMA20gをメタノール180mLに溶解させ、30分間、窒素バブリングしたものを反応液として用いた。ポリエチレン製中空糸(内径2.0mm、外径3.0mm、平均孔径0.25μm)2gを窒素雰囲気下において、ドライアイスで−60℃に冷却しながら、コバルト(Co)60を線源としてγ線を200kGy照射した。照射後の中空糸は、13.4Pa以下の減圧下に5分間静置した後、20mLの上記反応液と該中空糸を40℃で接触させ、16時間静置した。その後、中空糸をエタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させた。
GMA20gをメタノール180mLに溶解させ、30分間、窒素バブリングしたものを反応液として用いた。ポリエチレン製中空糸(内径2.0mm、外径3.0mm、平均孔径0.25μm)2gを窒素雰囲気下において、ドライアイスで−60℃に冷却しながら、コバルト(Co)60を線源としてγ線を200kGy照射した。照射後の中空糸は、13.4Pa以下の減圧下に5分間静置した後、20mLの上記反応液と該中空糸を40℃で接触させ、16時間静置した。その後、中空糸をエタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させた。
2)エポキシ基のジオール化
表面グラフト重合した中空糸を0.5mol/L硫酸中に投入し、80℃で2時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。反応後、この中空糸を純水で洗浄した後、膜をエタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させた。
表面グラフト重合した中空糸を0.5mol/L硫酸中に投入し、80℃で2時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。反応後、この中空糸を純水で洗浄した後、膜をエタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させた。
3)カルボキシル基の導入
エポキシ基をジオール化した中空糸を、無水コハク酸3.0g及び4−ジメチルアミノピリジン3.6gをトルエン900mLに溶解させた反応液に浸漬し、40℃で60分間反応させることで、グラフト鎖にカルボキシル基を導入した。反応後、この中空糸をエタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させた。
エポキシ基をジオール化した中空糸を、無水コハク酸3.0g及び4−ジメチルアミノピリジン3.6gをトルエン900mLに溶解させた反応液に浸漬し、40℃で60分間反応させることで、グラフト鎖にカルボキシル基を導入した。反応後、この中空糸をエタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させた。
4)NHS活性化
モジュール化した中空糸(中空糸1本モジュール、有効糸長4cm)を40℃に加温しながら、NHS活性化反応液(NHS0.07g、脱水イソプロピルアルコール45mL、ジイソプロピルカルボジイミド0.09mL)を0.4mL/分の流速で60分間透過し、カルボキシル基をNHS活性化した。反応後、中空糸モジュールを氷冷しながら、中空糸モジュールに脱水イソプロピルアルコールを0.4mL/分の流速で60分間透過させることで洗浄した。洗浄後の中空糸モジュールは、脱水イソプロピルアルコールを封入した状態で、4℃で保存した。
モジュール化した中空糸(中空糸1本モジュール、有効糸長4cm)を40℃に加温しながら、NHS活性化反応液(NHS0.07g、脱水イソプロピルアルコール45mL、ジイソプロピルカルボジイミド0.09mL)を0.4mL/分の流速で60分間透過し、カルボキシル基をNHS活性化した。反応後、中空糸モジュールを氷冷しながら、中空糸モジュールに脱水イソプロピルアルコールを0.4mL/分の流速で60分間透過させることで洗浄した。洗浄後の中空糸モジュールは、脱水イソプロピルアルコールを封入した状態で、4℃で保存した。
5)温度応答性プロテインAのカップリング
温度応答性プロテインAは、特許文献(WO2008/143199号パンフレット)実施例を参考に温度応答性プロテインAを調製し用いた。カルボキシル基をNHS活性化した中空糸モジュールに氷冷した1mmol/L塩酸を10mL透過して、保存液である脱水イソプロピルアルコールを置換した。次いで、温度応答性プロテインA20mgを7mLのカップリング緩衝液(0.2mol/L リン酸緩衝液、0.5mol/L NaCl、pH8.3)に溶解後に2℃に冷却し、0.4mL/分の流速で中空糸モジュールを透過させ、透過液を供給液に連続的に加えることで、16時間循環させた。循環中もモジュールを2℃に保つことで、カップリング時の温度を2℃に保った。所定時間経過後、中空糸モジュールにカップリング緩衝液を透過させることで、NHS活性基とカップリング反応しなかった温度応答性プロテインAを洗浄・回収した。
温度応答性プロテインAは、特許文献(WO2008/143199号パンフレット)実施例を参考に温度応答性プロテインAを調製し用いた。カルボキシル基をNHS活性化した中空糸モジュールに氷冷した1mmol/L塩酸を10mL透過して、保存液である脱水イソプロピルアルコールを置換した。次いで、温度応答性プロテインA20mgを7mLのカップリング緩衝液(0.2mol/L リン酸緩衝液、0.5mol/L NaCl、pH8.3)に溶解後に2℃に冷却し、0.4mL/分の流速で中空糸モジュールを透過させ、透過液を供給液に連続的に加えることで、16時間循環させた。循環中もモジュールを2℃に保つことで、カップリング時の温度を2℃に保った。所定時間経過後、中空糸モジュールにカップリング緩衝液を透過させることで、NHS活性基とカップリング反応しなかった温度応答性プロテインAを洗浄・回収した。
6)ブロッキング
温度応答性プロテインAをカップリングした中空糸モジュールにブロッキング反応液(0.5mol/L エタノールアミン、0.5mol/LNaCl、pH8.0)を10mL透過し、室温で30分間放置することで、残留NHSをエタノールアミンでブロッキングした。反応後、この中空糸モジュールを純水で洗浄し、その後20%エタノールでモジュールに封入した状態で、4℃で保存した。
温度応答性プロテインAをカップリングした中空糸モジュールにブロッキング反応液(0.5mol/L エタノールアミン、0.5mol/LNaCl、pH8.0)を10mL透過し、室温で30分間放置することで、残留NHSをエタノールアミンでブロッキングした。反応後、この中空糸モジュールを純水で洗浄し、その後20%エタノールでモジュールに封入した状態で、4℃で保存した。
7)抗体の温度溶出量測定
クロマトグラフィーシステム(AKTA FPLC、GEヘルスケア・ジャパン(株)製)を用いて、温度変化による抗体(献血ヴェノグロブリ−IH、株式会社ベネシス製)の吸着・溶出試験を行った。中空糸モジュールの温度変化操作は、クロマトグラフィーシステムのポンプを一時停止し、中空糸モジュールを所定温度の恒温水槽中に浸漬し、その後10分間以上温置した後にクロマトグラフィーシステムのポンプを再度起動することにより行った。抗体の吸着、及び溶出は、以下の条件で行った。
クロマトグラフィーシステム(AKTA FPLC、GEヘルスケア・ジャパン(株)製)を用いて、温度変化による抗体(献血ヴェノグロブリ−IH、株式会社ベネシス製)の吸着・溶出試験を行った。中空糸モジュールの温度変化操作は、クロマトグラフィーシステムのポンプを一時停止し、中空糸モジュールを所定温度の恒温水槽中に浸漬し、その後10分間以上温置した後にクロマトグラフィーシステムのポンプを再度起動することにより行った。抗体の吸着、及び溶出は、以下の条件で行った。
(吸着ステップ)
・抗体濃度:2.5mg/mL
・吸着緩衝液:20mmol/L リン酸緩衝液、150mmol/L NaCl(pH8.0)
・抗体負荷量:20mL
・流速:0.4mL/min
・中空糸膜体積:0.18mL
・吸着(カップリング)温度:2℃
(洗浄ステップ)
・洗浄緩衝液:吸着緩衝液と同一
・流速:0.4mL/min
・洗浄温度:2℃
(温度溶出ステップ)
・温度溶出緩衝液:吸着緩衝液と同一
・流速:0.4mL/min
・透過液量:20mL
・溶出温度:40℃
(温度溶出ステップ後の低pH溶出ステップ)
・低pH溶出緩衝液:100mmol/L クエン酸バッファー(pH3.0)
・流速:0.4mL/min
・透過液量:20mL
・溶出温度:40℃
・抗体濃度:2.5mg/mL
・吸着緩衝液:20mmol/L リン酸緩衝液、150mmol/L NaCl(pH8.0)
・抗体負荷量:20mL
・流速:0.4mL/min
・中空糸膜体積:0.18mL
・吸着(カップリング)温度:2℃
(洗浄ステップ)
・洗浄緩衝液:吸着緩衝液と同一
・流速:0.4mL/min
・洗浄温度:2℃
(温度溶出ステップ)
・温度溶出緩衝液:吸着緩衝液と同一
・流速:0.4mL/min
・透過液量:20mL
・溶出温度:40℃
(温度溶出ステップ後の低pH溶出ステップ)
・低pH溶出緩衝液:100mmol/L クエン酸バッファー(pH3.0)
・流速:0.4mL/min
・透過液量:20mL
・溶出温度:40℃
温度溶出後、温度で溶出しきれない抗体を、低pHの溶出緩衝液で溶出させた。各ステップの分画のUV吸収(280nm)を測定し、下記式より免疫グロブリン濃度を算出することにより、免疫グロブリンの温度溶出量を算出した。
免疫グロブリン濃度(mg/mL)=280nmでの吸光度/14×10
温度溶出量(mg/mL)=
温度溶出画分の免疫グロブリン濃度×温度溶出画分の液量/膜体積
免疫グロブリン濃度(mg/mL)=280nmでの吸光度/14×10
温度溶出量(mg/mL)=
温度溶出画分の免疫グロブリン濃度×温度溶出画分の液量/膜体積
(結果)
中空糸膜のカップリング基の密度を重量法で測定した結果、160μmol/mLであった。抗体の温度溶出量は14.5mg/mL−膜体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後の中空糸に残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は1.2mg/mL−膜体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインA固定化中空糸が、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
中空糸膜のカップリング基の密度を重量法で測定した結果、160μmol/mLであった。抗体の温度溶出量は14.5mg/mL−膜体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後の中空糸に残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は1.2mg/mL−膜体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインA固定化中空糸が、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
中空糸膜への温度応答性プロテインAのカップリング温度を10℃とすること以外は、実施例1に従って温度応答性プロテインA固定化中空糸を製造した。
(結果)
抗体の温度溶出量は14.1mg/mL−膜体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後の中空糸に残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は1.2mg/mL−膜体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインA固定化中空糸が、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
(結果)
抗体の温度溶出量は14.1mg/mL−膜体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後の中空糸に残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は1.2mg/mL−膜体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインA固定化中空糸が、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
カルボキシル基を架橋ポリビニルアルコールビーズに導入した後に、カルボキシル基をNHS活性化した。さらに、NHS活性化された架橋ポリビニルアルコールビーズと、温度応答性プロテインAが抗体に対して吸着性を有する温度で温度応答性プロテインAを接触させることで、温度応答性プロテインAを架橋ポリビニルアルコールビーズに固定化した。詳細は以下のとおりである。
1)カルボキシル基の導入
無水コハク酸3.0g及び4−ジメチルアミノピリジン3.6gをトルエン450mLに溶解させたものを反応液として用いた。架橋ポリビニルアルコール(平均粒子径100μm)1gを上記反応液と50℃で接触させ、2時間攪拌した。その後、架橋ポリビニルアルコールビーズを脱水イソプロピルアルコールで洗浄した。
無水コハク酸3.0g及び4−ジメチルアミノピリジン3.6gをトルエン450mLに溶解させたものを反応液として用いた。架橋ポリビニルアルコール(平均粒子径100μm)1gを上記反応液と50℃で接触させ、2時間攪拌した。その後、架橋ポリビニルアルコールビーズを脱水イソプロピルアルコールで洗浄した。
2)カラムパッキング
上記架橋ポリビニルアルコールビーズを、空カラム(Tricorn5/20column、GEヘルスケア・ジャパン(株)製)に充填した。
上記架橋ポリビニルアルコールビーズを、空カラム(Tricorn5/20column、GEヘルスケア・ジャパン(株)製)に充填した。
3)NHS活性化
上記カラムを40℃に加温しながら、NHS活性化反応液(NHS0.07g、脱水イソプロピルアルコール45mL、ジイソプロピルカルボジイミド0.09mL)を0.4mL/分の流速で30分間透過し、カルボキシル基をNHS活性化した。反応後、カラムを氷冷しながら、カラムに脱水イソプロピルアルコールを0.4mL/分の流速で30分間透過させることで洗浄した。洗浄後のカラムは、脱水イソプロピルアルコールを封入した状態で、4℃で保存した。
上記カラムを40℃に加温しながら、NHS活性化反応液(NHS0.07g、脱水イソプロピルアルコール45mL、ジイソプロピルカルボジイミド0.09mL)を0.4mL/分の流速で30分間透過し、カルボキシル基をNHS活性化した。反応後、カラムを氷冷しながら、カラムに脱水イソプロピルアルコールを0.4mL/分の流速で30分間透過させることで洗浄した。洗浄後のカラムは、脱水イソプロピルアルコールを封入した状態で、4℃で保存した。
4)温度応答性プロテインAのカップリング
温度応答性プロテインAは、特許文献(WO2008/143199号パンフレット)実施例を参考に温度応答性プロテインAを調製し用いた。カルボキシル基をNHS活性化したカラムに氷冷した1mmol/L塩酸を2mL透過して、保存液である脱水イソプロピルアルコールを置換した。次いで、温度応答性プロテインA30mgを1mLのカップリング緩衝液(0.2mol/L リン酸緩衝液、0.5・BR>高盾戟^L NaCl、pH8.3)に溶解後に2℃に冷却し、0.4mL/分の流速でカラムに供給した後、16時間保持させた。保持中もカラムを2℃に保つことで、カップリング時の温度を2℃に保った。所定時間経過後、カラムにカップリング緩衝液を透過させることで、NHS活性基とカップリング反応しなかった温度応答性プロテインAを洗浄・回収した。
温度応答性プロテインAは、特許文献(WO2008/143199号パンフレット)実施例を参考に温度応答性プロテインAを調製し用いた。カルボキシル基をNHS活性化したカラムに氷冷した1mmol/L塩酸を2mL透過して、保存液である脱水イソプロピルアルコールを置換した。次いで、温度応答性プロテインA30mgを1mLのカップリング緩衝液(0.2mol/L リン酸緩衝液、0.5・BR>高盾戟^L NaCl、pH8.3)に溶解後に2℃に冷却し、0.4mL/分の流速でカラムに供給した後、16時間保持させた。保持中もカラムを2℃に保つことで、カップリング時の温度を2℃に保った。所定時間経過後、カラムにカップリング緩衝液を透過させることで、NHS活性基とカップリング反応しなかった温度応答性プロテインAを洗浄・回収した。
5)ブロッキング
温度応答性プロテインAをカップリングしたカラムにブロッキング反応液(0.5mol/L エタノールアミン、0.5mol/LNaCl、pH8.0)を10mL透過し、室温で30分間放置することで、残留NHSをエタノールアミンでブロッキングした。反応後、このカラムを純水で洗浄し、その後20%エタノールでカラムに封入した状態で、4℃で保存した。
温度応答性プロテインAをカップリングしたカラムにブロッキング反応液(0.5mol/L エタノールアミン、0.5mol/LNaCl、pH8.0)を10mL透過し、室温で30分間放置することで、残留NHSをエタノールアミンでブロッキングした。反応後、このカラムを純水で洗浄し、その後20%エタノールでカラムに封入した状態で、4℃で保存した。
6)抗体の温度溶出量測定
クロマトグラフィーシステム(AKTA FPLC、GEヘルスケア・ジャパン(株)製)を用いて、温度変化による抗体(献血ヴェノグロブリ−IH、株式会社ベネシス製)の吸着・溶出試験を行った。カラムの温度変化操作は、クロマトグラフィーシステムのポンプを一時停止し、カラムを所定温度の恒温水槽中に浸漬し、その後10分間以上温置した後にクロマトグラフィーシステムのポンプを再度起動することにより行った。抗体の吸着、及び溶出は、以下の条件で行った。
クロマトグラフィーシステム(AKTA FPLC、GEヘルスケア・ジャパン(株)製)を用いて、温度変化による抗体(献血ヴェノグロブリ−IH、株式会社ベネシス製)の吸着・溶出試験を行った。カラムの温度変化操作は、クロマトグラフィーシステムのポンプを一時停止し、カラムを所定温度の恒温水槽中に浸漬し、その後10分間以上温置した後にクロマトグラフィーシステムのポンプを再度起動することにより行った。抗体の吸着、及び溶出は、以下の条件で行った。
(吸着ステップ)
・抗体濃度:2.5mg/mL
・吸着緩衝液:20mmol/L リン酸緩衝液、150mmol/L NaCl(pH8.0)
・抗体負荷量:20mL
・流速:0.4mL/min
・ビーズ体積:0.59mL
・吸着(カップリング)温度:2℃
(洗浄ステップ)
・洗浄緩衝液:吸着緩衝液と同一
・流速:0.4mL/min
・洗浄温度:2℃
(温度溶出ステップ)
・温度溶出緩衝液:吸着緩衝液と同一
・流速:0.4mL/min
・透過液量:20mL
・溶出温度:40℃
(温度溶出ステップ後の低pH溶出ステップ)
・低pH溶出緩衝液:100mmol/L クエン酸バッファー(pH3.0)
・流速:0.4mL/min
・透過液量:20mL
・溶出温度:40℃
・抗体濃度:2.5mg/mL
・吸着緩衝液:20mmol/L リン酸緩衝液、150mmol/L NaCl(pH8.0)
・抗体負荷量:20mL
・流速:0.4mL/min
・ビーズ体積:0.59mL
・吸着(カップリング)温度:2℃
(洗浄ステップ)
・洗浄緩衝液:吸着緩衝液と同一
・流速:0.4mL/min
・洗浄温度:2℃
(温度溶出ステップ)
・温度溶出緩衝液:吸着緩衝液と同一
・流速:0.4mL/min
・透過液量:20mL
・溶出温度:40℃
(温度溶出ステップ後の低pH溶出ステップ)
・低pH溶出緩衝液:100mmol/L クエン酸バッファー(pH3.0)
・流速:0.4mL/min
・透過液量:20mL
・溶出温度:40℃
温度溶出後、温度で溶出しきれない抗体を、低pHの溶出緩衝液で溶出させた。各ステップの分画のUV吸収(280nm)を測定し、下記式より免疫グロブリン濃度を算出することにより、免疫グロブリンの温度溶出量を算出した。
免疫グロブリン濃度(mg/mL)=280nmでの吸光度/14×10
温度溶出量(mg/mL)=
温度溶出画分の免疫グロブリン濃度×温度溶出画分の液量/ビーズ体積
免疫グロブリン濃度(mg/mL)=280nmでの吸光度/14×10
温度溶出量(mg/mL)=
温度溶出画分の免疫グロブリン濃度×温度溶出画分の液量/ビーズ体積
(結果)
ビーズのカップリング基の密度をHPLC法で測定した結果、59μmol/mLであった。抗体の温度溶出量は32.1mg/mL−ビーズ体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は0.3mg/mL−ビーズ体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインA固定化ビーズが、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
ビーズのカップリング基の密度をHPLC法で測定した結果、59μmol/mLであった。抗体の温度溶出量は32.1mg/mL−ビーズ体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は0.3mg/mL−ビーズ体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインA固定化ビーズが、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
担体として架橋セルロースビーズ(チッソ(株)製)を用いること以外は、実施例1に従って温度応答性プロテインA固定化ビーズを製造した。
(結果)
ビーズのカップリング基の密度をHPLC法で測定した結果、59μmol/mLであった。抗体の温度溶出量は18.9mg/mL−ビーズ体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は0.4mg/mL−ビーズ体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインA固定化ビーズが、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
(結果)
ビーズのカップリング基の密度をHPLC法で測定した結果、59μmol/mLであった。抗体の温度溶出量は18.9mg/mL−ビーズ体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は0.4mg/mL−ビーズ体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインA固定化ビーズが、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
カップリング基としてホルミル基(アルデヒド基)を10μmol/mL(カタログ値)有する架橋セルロースビーズ(商品名:セルファイン・ホルミル、製品番号676944324、チッソ(株)製)を用いた。
1)温度応答性プロテインAのカップリング
まず、温度応答性プロテインA20mgをカップリング緩衝液(0.2M リン酸緩衝液、pH8.3)2mLに溶解した。セルファイン・ホルミル(50%スラリー)4mLを純水で洗浄後、上記溶解液と混合し、2℃の恒温振とう機中で2時間振とうさせた。その後、還元剤(トリメチルアミンボラン)18mgを加え、2℃の恒温振とう機中で4時間反応させた。所定時間経過後、上記カップリング緩衝液でビーズを洗浄後、ビーズにブロッキング液(0.2M トリス塩酸緩衝液)4mLと還元剤(トリメチルアミンボラン)15mgを加え、2℃の恒温振とう機中で2時間反応した。所定時間経過後、ビーズを純水で洗浄した。
2)抗体の温度溶出量測定
実施例1と同様の方法で、抗体の温度溶出量を測定した。
(結果)
抗体の温度溶出量は21.1mg/mL−ビーズ体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は1.2mg/mL−ビーズ体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインA固定化ビーズが、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
以上示した実施例1乃至5の結果を表1に示す。
1)温度応答性プロテインAのカップリング
まず、温度応答性プロテインA20mgをカップリング緩衝液(0.2M リン酸緩衝液、pH8.3)2mLに溶解した。セルファイン・ホルミル(50%スラリー)4mLを純水で洗浄後、上記溶解液と混合し、2℃の恒温振とう機中で2時間振とうさせた。その後、還元剤(トリメチルアミンボラン)18mgを加え、2℃の恒温振とう機中で4時間反応させた。所定時間経過後、上記カップリング緩衝液でビーズを洗浄後、ビーズにブロッキング液(0.2M トリス塩酸緩衝液)4mLと還元剤(トリメチルアミンボラン)15mgを加え、2℃の恒温振とう機中で2時間反応した。所定時間経過後、ビーズを純水で洗浄した。
2)抗体の温度溶出量測定
実施例1と同様の方法で、抗体の温度溶出量を測定した。
(結果)
抗体の温度溶出量は21.1mg/mL−ビーズ体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は1.2mg/mL−ビーズ体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインA固定化ビーズが、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
以上示した実施例1乃至5の結果を表1に示す。
[比較例1]
中空糸膜への温度応答性プロテインAのカップリング温度を20℃とすること以外は、実施例1に従って温度応答性プロテインA固定化中空糸を製造した。
(結果)
抗体の温度溶出量は6.1mg/mL−膜体積、であった。温度溶出後の中空糸に残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は1.1mg/mL−膜体積、であった。
中空糸膜への温度応答性プロテインAのカップリング温度を20℃とすること以外は、実施例1に従って温度応答性プロテインA固定化中空糸を製造した。
(結果)
抗体の温度溶出量は6.1mg/mL−膜体積、であった。温度溶出後の中空糸に残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は1.1mg/mL−膜体積、であった。
[比較例2]
中空糸膜への温度応答性プロテインAのカップリング温度を30℃とすること以外は、実施例1に従って温度応答性プロテインA固定化中空糸を製造した。
(結果)
抗体の温度溶出量は5.4mg/mL−膜体積、であった。温度溶出後の中空糸に残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は1.1mg/mL−膜体積、であった。
中空糸膜への温度応答性プロテインAのカップリング温度を30℃とすること以外は、実施例1に従って温度応答性プロテインA固定化中空糸を製造した。
(結果)
抗体の温度溶出量は5.4mg/mL−膜体積、であった。温度溶出後の中空糸に残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は1.1mg/mL−膜体積、であった。
[比較例3]
架橋ポリビニルアルコールビーズへの温度応答性プロテインAのカップリング温度を30℃とすること以外は、実施例3に従って温度応答性プロテインA固定化ビーズを製造した。
(結果)
抗体の温度溶出量は26.1mg/mL−ビーズ体積、であった。温度溶出後のビーズに残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は0.3mg/mL−ビーズ体積、であった。
架橋ポリビニルアルコールビーズへの温度応答性プロテインAのカップリング温度を30℃とすること以外は、実施例3に従って温度応答性プロテインA固定化ビーズを製造した。
(結果)
抗体の温度溶出量は26.1mg/mL−ビーズ体積、であった。温度溶出後のビーズに残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は0.3mg/mL−ビーズ体積、であった。
[比較例4]
架橋セルロースビーズへの温度応答性プロテインAのカップリング温度を30℃とすること以外は、実施例4に従って温度応答性プロテインA固定化ビーズを製造した。
(結果)
抗体の温度溶出量は14.2mg/mL−ビーズ体積、であった。温度溶出後のビーズに残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は0.3mg/mL−ビーズ体積、であった。
架橋セルロースビーズへの温度応答性プロテインAのカップリング温度を30℃とすること以外は、実施例4に従って温度応答性プロテインA固定化ビーズを製造した。
(結果)
抗体の温度溶出量は14.2mg/mL−ビーズ体積、であった。温度溶出後のビーズに残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は0.3mg/mL−ビーズ体積、であった。
[比較例5]
セルファイン・ホルミルへの温度応答性プロテインAのカップリング温度を30℃とすること以外は、実施例4に従って温度応答性プロテインA固定化ビーズを製造した。
(結果)
抗体の温度溶出量は17.1mg/mL−ビーズ体積、であった。温度溶出後のビーズに残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は1.0mg/mL−ビーズ体積、であった。
以上示した比較例1乃至5の結果を表2に示す。
セルファイン・ホルミルへの温度応答性プロテインAのカップリング温度を30℃とすること以外は、実施例4に従って温度応答性プロテインA固定化ビーズを製造した。
(結果)
抗体の温度溶出量は17.1mg/mL−ビーズ体積、であった。温度溶出後のビーズに残った抗体を低pH溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は1.0mg/mL−ビーズ体積、であった。
以上示した比較例1乃至5の結果を表2に示す。
本出願は、2010年12月24日に日本国特許庁へ出願された日本特許出願(特願2010−288451号)に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
本実施形態に係る温度応答性プロテインA固定化担体の製造方法、及びそれにより製造された温度応答性プロテインA固定化担体を利用すれば、グロブリン等の有用な生理活性化合物を温度変化によって工業規模で分取できるようになる。
Claims (18)
- 温度に依存して抗体との結合性が変化するよう変異されたプロテインAである温度応答性プロテインAの固定化担体の製造方法であって、
前記温度応答性プロテインAは、第1の温度領域で前記抗体との結合性を有し、第2の温度領域で前記抗体との結合性を有さず、
前記温度応答性プロテインAが前記抗体との結合性を有する前記第1の温度領域の温度で、前記温度応答性プロテインAを担体表面に固定する工程を含む、
温度応答性プロテインA固定化担体の製造方法。 - 共有結合により前記温度応答性プロテインAを前記担体表面に固定する、請求項1に記載の温度応答性プロテインA固定化担体の製造方法。
- 前記温度応答性プロテインAを前記担体表面に固定する工程が、前記温度応答性プロテインAを前記担体表面に固定されたカップリング基と接触させることを含む、請求項1又は2に記載の温度応答性プロテインA固定化担体の製造方法。
- 前記担体表面に固定されたカップリング基の濃度が50μmol/mL以上である、請求項3に記載の温度応答性プロテインA固定化担体の製造方法。
- 前記担体が膜である、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の温度応答性プロテインA固定化担体の製造方法。
- 前記膜が中空糸状であることを特徴とする、請求項5に記載の温度応答性プロテインA固定化担体の製造方法。
- 前記担体がビーズである、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の温度応答性プロテインA固定化担体の製造方法。
- 前記ビーズが、架橋ポリビニルアルコールからなることを特徴とする、請求項7に記載の温度応答性プロテインA固定化担体の製造方法。
- 前記ビーズが、架橋セルロースからなることを特徴とする、請求項7に記載の温度応答性プロテインA固定化担体の製造方法。
- 前記温度応答性プロテインAを含む反応液と、前記担体と、を接触させることにより、前記温度応答性プロテインAを前記担体表面に固定された前記カップリング基と接触させる、請求項3に記載の温度応答性プロテインA固定化担体の製造方法。
- 前記担体が担体表面にグラフト高分子鎖を有し、
前記カップリング基が、前記グラフト高分子鎖の側鎖に存在する、請求項3に記載の温度応答性プロテインA固定化担体の製造方法。 - 前記カップリング基が、N−ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたカルボキシル基である、請求項3に記載の温度応答性プロテインA固定担体の製造方法。
- 請求項1乃至12のいずれか1項に記載の製造方法で製造された温度応答性プロテインA固定担体。
- 温度応答性プロテインAがイムノグロブリンに対して吸着性を有する温度で吸着したイムノグロブリンを、温度変化によって溶出することが可能である、請求項1乃至12のいずれか1項に記載の製造方法で製造された、温度応答性プロテインA固定化担体。
- 前記温度変化によって前記吸着したイムノグロブリンを80%以上溶出することが可能である、請求項14に記載の温度応答性プロテインA固定化担体。
- 膜状である、請求項13乃至15のいずれか1項に記載の温度応答性プロテインA固定化担体。
- 中空糸状である、請求項13乃至16のいずれか1項に記載の温度応答性プロテインA固定化担体。
- ビーズ状である、請求項13乃至15のいずれか1項に記載の温度応答性プロテインA固定化担体。
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OSTROVE S.: "[29] Affinity chromatography: General methods", METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 182, JPN6012012520, 1990, pages 357 - 371, XP008163963, ISSN: 0002918759 * |
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