WO2012086837A1 - 温度応答性プロテインａの固定化方法 - Google Patents

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protein
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一郎 小熊
弘樹 重松
和雄 奥山
佐藤　聡
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旭化成メディカル株式会社
ノマディックバイオサイエンス株式会社
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    • B01J2220/86—Sorbents applied to inner surfaces of columns or capillaries

Definitions

  • the present invention relates to a method for immobilizing a temperature-responsive protein A on a carrier, wherein the binding property to an antibody changes with temperature.
  • Antibody is a physiologically active substance that controls the immune reaction.
  • its utility value has been increasing in applications such as pharmaceuticals, diagnostics, and corresponding antigen protein separation and purification materials.
  • the antibody is obtained from blood of the immunized animal or a cell culture solution of cells possessing antibody-producing ability or an ascites culture solution of the animal.
  • the blood and culture solution containing these antibodies include proteins other than antibodies or complex contaminants derived from the raw material solution used for cell culture. Therefore, in order to separate and purify antibodies from these impurity components, a complicated and time-consuming operation is usually necessary.
  • Liquid chromatography is important for antibody separation and purification.
  • Chromatographic techniques for separating antibodies include gel filtration chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, and the like, and antibodies are separated and purified by combining these techniques.
  • a substance (ligand) having an affinity for a target substance is immobilized on a carrier, and the target substance is specifically adsorbed to the ligand to separate the target substance from the impurity component. Further, the adsorbed target substance is eluted by lowering the affinity with the ligand, and it is possible to purify it by collecting it.
  • the environment in the column is set so that the antibody to be purified binds strongly to the affinity ligand, while in the elution step, the environment in the column is changed so that both are separated. Is essential, and a change in pH is usually used for this environmental change.
  • protein A derived from Staphylococcus which has extremely high specificity and affinity in the common region of antibodies, and its antibody binding domain are known. Widely used in antibody production process.
  • affinity chromatography using protein A or a part thereof as a ligand has a problem due to the nature of the antibody, and its production is restricted.
  • humanized or human IgG which is the most useful in the industry as a monoclonal antibody pharmaceutical, has a higher affinity for protein A than other antibodies, and therefore, a buffer with a particularly strong acidity is used during elution. . Therefore, association / aggregation is likely to occur during elution. Therefore, the deactivation of IgG is an industrial problem.
  • Temperature-responsive protein A has a feature that its binding property to an antibody changes with a change in temperature, but an optimal immobilization method on a support has not been studied so far. Accordingly, an object of the present invention is to provide an optimum method for immobilizing a temperature-responsive protein A, which is characterized in that the binding property with an antibody changes with a temperature change, on a support. .
  • the present inventors have studied and developed from various angles.
  • the temperature-responsive protein A which shows a change in the binding property with the antibody in accordance with the temperature change, is adsorbable to the antibody, and the temperature-responsive protein A is applied to the surface of the carrier. It was found that the temperature-responsive protein A can be immobilized without impairing the function of the temperature-responsive protein A by contacting with the immobilized coupling group and immobilizing the temperature-responsive protein A on the carrier surface by covalent bond.
  • the technology shown in the present invention was completely unpredictable from the prior art, and is expected to develop into a novel antibody separation system that was never found in the prior art. The present invention has been completed based on such findings.
  • a novel affinity chromatographic carrier can be produced by the production method described in the present invention. If this carrier is used, useful physiologically active substances such as proteins such as immunoglobulins can be separated and purified on an industrial scale by temperature change.
  • FIG. 2 is a table and a graph summarizing experimental results of an antibody adsorption / elution test using temperature-responsive protein A immobilized on a carrier by the method shown in Example 1.
  • FIG. 2 is a table and a graph summarizing experimental results of an antibody adsorption / elution test using temperature-responsive protein A immobilized on a carrier by the method shown in Example 1.
  • the present embodiment relates to temperature-responsive protein A, which is protein A that has been mutated so that its binding property to an antibody changes depending on temperature.
  • the temperature-responsive protein A has an antibody binding property in the first temperature region and does not have an antibody binding property in the second temperature region.
  • the temperature-responsive protein A is applied to the surface of the carrier at a temperature in a first temperature region where the temperature-responsive protein A has binding properties with an antibody. A fixing step.
  • the shape of the support used as a carrier in the present embodiment is not particularly limited, and may be, for example, a flat membrane shape, a hollow fiber shape, or a bead shape.
  • a hollow fiber-like support can be suitably used because it can be easily molded into a module and has a large membrane area that can be filled per module container.
  • a bead-shaped material generally has a larger surface area per volume than a film-shaped material and can adsorb a large amount of antibody, so that it can be suitably used.
  • the material of the support used as a carrier in the present embodiment is not particularly limited.
  • a polymer material capable of forming a porous film can be preferably used.
  • olefin resins such as polyethylene and polypropylene
  • polyester resins such as polyethylene terephthalate and polyethylene terephthalate
  • polyamide resins such as nylon 6 and nylon 66
  • fluorine-containing resins such as polyvinylidene fluoride and polychlorotrifluoroethylene
  • polystyrene polysulfone
  • Noncrystalline resins such as polyethersulfone and polycarbonate
  • crosslinked polyvinyl alcohol and crosslinked cellulose are highly hydrophilic and can be suitably used because they can suppress the adsorption of impurity components.
  • the support used in this embodiment has, for example, a plurality of pores.
  • the pore diameter is not particularly limited, but is preferably 5 to 1000 nm, preferably 10 to 700 nm, and more preferably 20 to 500 nm. If the pore diameter is 5 nm or less, the molecular weight of the separable antibody tends to be low. Further, when the pore diameter is 1000 nm or more, the surface area of the substrate is reduced, and the antibody binding capacity tends to be reduced.
  • any coupling group may be introduced into the support.
  • examples thereof include a carboxyl group activated with N-hydroxysuccinimide (NHS), a carboxyl group, a cyanogen bromide activated group, a hydroxyl group, an epoxy group, an aldehyde group, and a thiol group. Since temperature-responsive protein A has a primary amino group, among the above-mentioned coupling groups, NHS-activated carboxyl group, carboxyl group, cyanogen bromide active group, epoxy group that can be coupled with the primary amino group And a formyl group are preferred.
  • a carboxyl group activated with NHS does not require the use of other chemicals during the coupling reaction, and is preferably used because the reaction is quick and forms a strong bond.
  • the concentration (density) of the coupling group immobilized on the surface of the support is preferably 50 ⁇ mol / mL or more and less than 1000 ⁇ mol / mL.
  • concentration of the coupling group is less than 50 ⁇ mol / mL, the coupling efficiency between the coupling group and the temperature-responsive protein A tends to decrease.
  • concentration of the coupling group By setting the concentration of the coupling group to 50 ⁇ mol / mL or more, it is possible to increase the coupling efficiency between the coupling group and the temperature-responsive protein A.
  • the temperature-responsive protein A is brought into contact with a coupling group immobilized on the support surface at a temperature at which the temperature-responsive protein A is adsorbable to the antibody, and the temperature-responsive protein A is covalently bound. Is fixed to the surface of the support. Thereby, it becomes possible to fix the temperature-responsive protein A to the support surface without impairing the function of the temperature-responsive protein A. Therefore, by using a support having a coupling group at a high density, the temperature-responsive protein A can be immobilized on the surface of the carrier with high coupling efficiency and without impairing the function of the temperature-responsive protein A. It becomes possible.
  • the concentration of the coupling group is 1000 ⁇ mol / mL or more, the number of bonds between the support and the temperature-responsive protein A tends to increase, and the activity of the temperature-responsive protein A tends to decrease.
  • the density of the coupling group can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, in the case of a carboxyl group activated with NHS, NHS is liberated from the carboxyl group by heat or alkali and quantified by HPLC method (HPLC method), or the weight of the carrier increased by NHS activation reaction (W1) There is a method (gravimetric method) for quantifying by measuring.
  • any method may be used for introducing the coupling group into the support, but a spacer is generally introduced between the support and the coupling group.
  • Methods for introducing coupling groups are disclosed in various literatures.
  • a graft polymer chain having a coupling group at the terminal and / or side chain may be introduced into the support.
  • a graft polymer chain having a coupling group By introducing a graft polymer chain having a coupling group into the support, it is possible to control the density of the coupling group as desired.
  • a polymer chain having a coupling group is grafted to the support, or a polymer chain having a precursor functional group that can be converted into a coupling group is grafted to the support, and then the grafted precursor functional group is cupped. It may be converted to a ring group.
  • the graft polymer chain can be introduced by any method.
  • a polymer chain may be prepared in advance and coupled to a support. Further, the graft chain may be polymerized directly on the support by the “living radical polymerization method” or the “radiation graft polymerization method”.
  • the “radiation grafting method” can be suitably used because there is no need to introduce a reaction initiator into the support in advance, and there are a variety of applicable supports.
  • any means can be adopted for generating radicals on the support, but in order to generate uniform radicals on the entire support, ionizing radiation can be used. Irradiation is preferred. As types of ionizing radiation, ⁇ rays, electron beams, ⁇ rays, neutron rays and the like can be used. However, electron beams or ⁇ rays are preferable for implementation on an industrial scale.
  • the ionizing radiation is obtained from radioactive isotopes such as cobalt 60, strontium 90, and cesium 137, or from an X-ray imaging apparatus, an electron beam accelerator, an ultraviolet irradiation apparatus, or the like.
  • the irradiation dose of ionizing radiation is preferably 1 kGy or more and 1000 kGy or less, more preferably 2 kGy or more and 500 kGy or less, and further preferably 5 kGy or more and 200 kGy or less. If the irradiation dose is less than 1 kGy, radicals tend not to be generated uniformly. Further, when the irradiation dose exceeds 1000 kGy, the physical strength of the support tends to be lowered.
  • a pre-irradiation method in which the radical is then contacted with a reactive compound, and the support in a state where the support is in contact with the reactive compound.
  • a simultaneous irradiation method for generating radicals in this embodiment, any method can be applied, but a pre-irradiation method with less oligomer formation is preferred.
  • the solvent used in the graft polymerization is not particularly limited as long as the reactive compound can be uniformly dissolved.
  • a solvent include alcohols such as ethanol, isopropanol, and t-butyl alcohol; ethers such as diethyl ether and tetrahydrofuran; ketones such as acetone and 2-butanone; water, or a mixture thereof.
  • examples of the monomer having a coupling group used for graft polymerization include monomers such as acrylic acid and methacrylic acid when a carboxyl group is used as the coupling group.
  • a primary amino group is used as a coupling group, allylamine and the like can be mentioned.
  • an epoxy group is mentioned.
  • a monomer having a precursor functional group that can be converted into a coupling group may be grafted to a support, and then the grafted precursor functional group may be converted into a coupling group.
  • Glycidyl methacrylate (GMA) having an epoxy group can be converted into various functional groups using ring-opening reactions of various epoxy groups, and thus can be suitably used industrially.
  • the epoxy group of GMA is hydrolyzed into a diol, and a cyclic acid anhydride is subjected to a ring-opening half esterification reaction with a hydroxyl group derived from the diol. It is possible to form a carboxyl group derived from a cyclic acid anhydride (ring-opening half esterification reaction).
  • the cyclic acid anhydride is preferably succinic anhydride or glutaric anhydride, but is not limited thereto.
  • the catalyst used in the ring-opening half esterification reaction is not particularly limited as long as it promotes this reaction, and specific examples include triethylamine, isobutylethylamine, pyridine, 4-dimethylaminopyridine, and the like. 4-Dimethylaminopyridine is preferred, and 4-dimethylaminopyridine is most preferred in view of reaction rate and yield.
  • the ring-opening half esterification reaction is preferably performed in an inert organic solvent such as toluene to which the above catalyst is added.
  • the NHS activation reaction is a step of converting a carboxyl group formed by the ring-opening half esterification reaction into an active ester. Since the active ester is more reactive than the carboxyl group, the active esterification step is preferably performed when it is desired to quickly immobilize the temperature-responsive protein A on the carrier.
  • the active ester serves to bind the hydrophilic compound and the substance to be immobilized by a covalent bond.
  • the active ester means a chemical structure of R—C ( ⁇ O) —X.
  • X includes a leaving group such as halogen, N-hydroxysuccinimide group or derivative thereof, 1-hydroxybenzotriazole group or derivative thereof, pentafluorophenyl group, and paranitrophenyl group, but is not limited thereto.
  • N-hydroxysuccinimide ester is desirable in terms of reactivity, safety and production cost.
  • Carbodiimide means an organic compound having a chemical structure of —N ⁇ C ⁇ N—, such as dicyclohexylcarbodiimide, diisopropylcarbodiimide, and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride. However, it is not limited to these.
  • the concentration of N-hydroxysuccinimide and carbodiimide is preferably set in the range of 1 to 100 mmol / L, the reaction temperature is 0 to 100 ° C., and the reaction time is in the range of 2 minutes to 16 hours.
  • the reaction solvent N, N′-dimethylformamide (DMF), toluene or the like can be used.
  • temperature-responsive protein A which is protein A mutated so that the binding property to an antibody changes depending on temperature
  • WO2008 / 143199 pamphlet WO2008 / 143199 pamphlet
  • the coupling reaction between the NHS activated carboxyl group and the temperature-responsive protein A is performed as follows, for example. First, citrate buffer (pH 3.0 to 6.2), acetate buffer (pH 3.6 to 5.6), phosphate buffered saline (PBS, pH 5.8 to 8.5), or carbonate buffer A 0.1-100 mg / ml temperature-responsive protein A solution is prepared using a buffer solution not containing an amino group component such as a solution (pH 9.2 to 10.6). When this aqueous solution is brought into contact with the active ester surface, a functional group such as an amino group contained in the temperature-responsive protein A reacts with the active ester to form an amide bond.
  • citrate buffer pH 3.0 to 6.2
  • acetate buffer pH 3.6 to 5.6
  • phosphate buffered saline PBS, pH 5.8 to 8.5
  • carbonate buffer A 0.1-100 mg / ml temperature-responsive protein A solution is prepared using a buffer solution not containing an amino group component
  • temperature-responsive protein A is immobilized on the surface by covalent bonds.
  • the contact time may be set in the range of 2 minutes to 16 hours.
  • the washing solution is preferably a buffer solution containing about 0.5 mol / L of salt (NaCl) and about 0.1% of nonionic surfactant. This is because the temperature-responsive protein A that is physically adsorbed without being covalently bonded can be removed.
  • the coupling reaction between the NHS-activated carboxyl group and the temperature-responsive protein A is achieved at a temperature at which the temperature-responsive protein A is adsorbable to the antibody.
  • a temperature at which the temperature-responsive protein A is adsorbable to the antibody In part of temperature-responsive protein A, loss of natural conformation and formation occur reversibly due to temperature changes.
  • a part of temperature-responsive protein A has a natural three-dimensional structure formed in the low-temperature region and has an ability to bind to the antibody, but in the high-temperature region, the natural three-dimensional structure is lost and binds to the antibody. The performance is significantly reduced.
  • temperature-responsive protein A When coupled with a support in a state in which a natural conformation is formed in the low temperature region, temperature-responsive protein A maintains binding to an antibody, and the loss of the native conformation due to temperature change, Formation occurs reversibly after coupling with the support.
  • the immobilized temperature-responsive protein A when coupled with the support in a state where the natural conformation has been lost in the high temperature region, the immobilized temperature-responsive protein A is completely converted into the natural conformation even when the environmental temperature is changed to a low temperature. Since it cannot return, it cannot exhibit sufficient antibody binding. Note that the mechanism by which the binding property of the temperature-responsive protein A to the antibody changes depending on the temperature is not limited to the change in the three-dimensional structure.
  • temperature-responsive protein A whose binding property to an antibody changes depending on temperature without changing the conformation.
  • temperature-responsive protein A in which binding to an antibody changes depending on temperature without any change in conformation, temperature-responsive protein A undergoes a coupling reaction with an NHS-activated carboxyl group. By performing the reaction at a temperature having an adsorptivity to the antibody, it is possible to maintain the binding property with the antibody even after the coupling.
  • the “first temperature region” or “temperature region A” is a temperature region where the temperature-responsive protein A has an adsorptivity with a specific protein. This is a temperature region where the protein binding amount is 50% or more with respect to the maximum binding amount of the protein that can be bound.
  • the “temperature in the first temperature range” is preferably 0 to less than 30 ° C., more preferably 0 to 20 ° C., and most preferably 0 to 10 ° C. If it is less than 0 ° C., there is a possibility of freezing during the coupling reaction, and if it is 30 ° C. or more, sufficient antibody binding properties are difficult to obtain.
  • the “second temperature range” or “temperature range B” is a temperature range in which the temperature-responsive protein A does not effectively exhibit the adsorptivity with a specific protein. This is a temperature range where the protein binding amount is less than 50% with respect to the maximum binding amount of the protein capable of binding to responsive protein A.
  • a specific method for specifying the temperature region A and the temperature region B is performed according to the following procedure.
  • the protein is bound to the temperature-responsive protein A-immobilized carrier at a temperature of less than 5 ° C. and 10 ° C. (hereinafter, set every 10 ° C. until just below the temperature at which the specific protein is denatured).
  • the temperature is raised to just below the temperature at which a specific protein is denatured to elute the bound protein, and the amount of protein elution is measured by the ultraviolet (UV) method with a wavelength of 280 nm. 3.
  • UV ultraviolet
  • the protein elution amount is plotted against the temperature at which the protein is adsorbed, and the intersection of 50% of the maximum protein binding amount (elution amount) and the line connecting the plots (hereinafter referred to as “50% binding temperature”). )), A temperature region having a protein binding amount of 50% or more is defined as a temperature region A, and a temperature region having a protein binding amount of less than 50% is defined as a temperature region B.
  • Patent Document (WO2008 / 143199 pamphlet) Temperature-responsive protein A prepared with reference to Examples was immobilized by the method described in Example 1 described below, and the antibody was adsorbed and eluted under the conditions described in Example 1. The 50% binding temperature was calculated according to the above procedure. As a result, as shown in FIG. 1, a certain amount of temperature-responsive protein A can bind to 14.5 mg / ml of antibody when the environmental temperature (antibody binding temperature) is 2 ° C. The maximum amount of binding was shown at ° C. From the plot, the 50% adsorption temperature was 15.0 ° C. In this case, the coupling temperature of 15.0 ° C. or lower is the temperature region A described above, and the coupling temperature higher than 15.0 ° C. is the temperature region B.
  • the temperature at which the temperature region A and the temperature region B of the temperature responsive protein A are separated is slightly different due to the difference in the peptide chain of the temperature responsive protein A.
  • the temperature that separates the temperature region A and the temperature region B of the temperature-responsive protein A having the same peptide chain does not change. What changes is the absolute amount of antibody binding that can be adsorbed and desorbed.
  • the unreacted carboxyl group or active ester is converted into a low molecular compound having an amino group and It is preferable to convert the carboxyl group or the active ester into a functional group having a lower reactivity by bonding. As a result, it is possible to prevent molecules such as impurities that are not subject to purification from being unintentionally immobilized on the surface of the carrier.
  • the functional group at the end of the temperature-responsive protein A immobilizing carrier is an active ester, this operation is preferably performed.
  • the operation of reacting a low molecular weight compound having an amino group with an active ester group may be particularly described as “blocking”.
  • the surface of the carrier after reacting the carboxyl group or the active ester with the low molecular weight compound is hydrophilic. This is because a hydrophilic surface generally has an effect of suppressing nonspecific adsorption of a biological substance.
  • Non-limiting examples of such low molecular weight compounds include ethanolamine, trishydroxymethylaminomethane, and diglycolamine (IUPAC name: 2- (2-aminoethoxy) ethanol).
  • reaction temperature may be set in the range of 4 to 37 ° C. and the reaction time in the range of 2 minutes to 16 hours.
  • the temperature-responsive protein A-immobilized carrier is stored at a low temperature of about 2-10 ° C. with a neutral solution in the pH range of 4-8 as a storage solution.
  • a neutral solution in the pH range of 4-8 as a storage solution.
  • 20% ethanol is preferable in consideration of antibacterial properties.
  • the method of separating the antibody using the temperature-responsive protein A-immobilized carrier is not particularly limited, but the temperature at which the characteristics of the temperature-responsive protein A change is confirmed in advance, and the temperature is changed by sandwiching the temperature.
  • a method for separating impurities can be used. In the case of the present embodiment, it is the most effective utilization method that the separation is performed with a temperature at which the characteristics of the temperature-responsive protein A greatly change.
  • the temperature-responsive protein A immobilization carrier produced by the temperature-responsive protein A immobilization method in the present embodiment described above maintains its antibody binding property after protein A is immobilized. Therefore, an industrially sufficient amount of antibody can be purified by temperature change. In that case, separation can be achieved by simple operation only by changing the temperature in the column, and since a low pH eluate is not required in the elution step, a purified antibody can be obtained without denaturation.
  • a graft chain composed of a coupling group precursor monomer glycidyl methacrylate (GMA) is introduced into the hollow fiber membrane by radiation graft polymerization
  • the epoxy group contained in GMA is converted into a diol group, and then converted into a carboxyl group. Converted.
  • a hollow fiber membrane in which a graft chain containing a carboxyl group in the side chain was introduced was molded into a module, and then the carboxyl group was NHS activated.
  • the temperature-responsive protein A is immobilized on the hollow fiber by allowing the temperature-responsive protein A to pass through the NHS-activated hollow fiber module at a temperature at which the temperature-responsive protein A is adsorbable to the antibody. did. Details are as follows.
  • Temperature-responsive protein A was prepared using temperature-responsive protein A with reference to Examples in the patent document (WO2008 / 143199 pamphlet). 10 mL of ice-cooled 1 mmol / L hydrochloric acid was passed through a hollow fiber module in which the carboxyl group had been NHS activated to replace dehydrated isopropyl alcohol as a stock solution. Next, 20 mg of temperature-responsive protein A was dissolved in 7 mL of coupling buffer (0.2 mol / L phosphate buffer, 0.5 mol / L NaCl, pH 8.3), then cooled to 2 ° C., and 0.4 mL / min.
  • coupling buffer 0.2 mol / L phosphate buffer, 0.5 mol / L NaCl, pH 8.3
  • the permeate was permeated through the hollow fiber module at a flow rate of and the permeate was continuously added to the feed solution to circulate for 16 hours.
  • the temperature during the coupling was kept at 2 ° C. by keeping the module at 2 ° C. during the circulation.
  • the coupling buffer solution was permeated through the hollow fiber module to wash and collect the temperature-responsive protein A that did not undergo a coupling reaction with the NHS active group.
  • Blocking 10 mL of blocking reaction solution (0.5 mol / L ethanolamine, 0.5 mol / L NaCl, pH 8.0) permeates through a hollow fiber module coupled with temperature-responsive protein A and left at room temperature for 30 minutes. The residual NHS was blocked with ethanolamine. After the reaction, the hollow fiber module was washed with pure water, and then stored at 4 ° C. in a state of being sealed in the module with 20% ethanol.
  • Adsorption step Antibody concentration: 2.5 mg / mL Adsorption buffer: 20 mmol / L phosphate buffer, 150 mmol / L NaCl (pH 8.0) ⁇ Antibody load: 20 mL ⁇ Flow rate: 0.4 mL / min ⁇ Hollow fiber membrane volume: 0.18 mL ⁇ Adsorption (coupling) temperature: 2 °C (Washing step) -Washing buffer: Same as adsorption buffer-Flow rate: 0.4 mL / min ⁇ Cleaning temperature: 2 °C (Temperature elution step) -Temperature elution buffer: Same as adsorption buffer-Flow rate: 0.4 mL / min ⁇ Permeate volume: 20mL ⁇ Elution temperature: 40 °C (Low pH elution step after temperature elution step) Low pH elution buffer: 100 mmol / L citrate buffer (pH 3.0) ⁇ Flow rate: 0.4 mL / min
  • a temperature-responsive protein A-immobilized hollow fiber was produced in accordance with Example 1 except that the temperature-responsive protein A coupling temperature to the hollow fiber membrane was 10 ° C. (result)
  • the temperature elution amount of the antibody was 14.1 mg / mL-membrane volume, which showed that the antibody can be eluted by temperature change.
  • the elution amount was as small as 1.2 mg / mL-membrane volume. From the above results, it was shown that this temperature-responsive protein A-immobilized hollow fiber can be used for industrial purification of antibodies.
  • the carboxyl group was NHS activated. Furthermore, the temperature-responsive protein A is brought into contact with the crosslinked polyvinyl alcohol beads by contacting the temperature-responsive protein A at a temperature at which the temperature-responsive protein A is adsorbable to the antibody. Immobilized to. Details are as follows.
  • NHS activation reaction liquid (NHS 0.07 g, dehydrated isopropyl alcohol 45 mL, diisopropylcarbodiimide 0.09 mL) was permeated at a flow rate of 0.4 mL / min for 30 minutes.
  • the carboxyl group was NHS activated.
  • the column was washed by passing dehydrated isopropyl alcohol through the column at a flow rate of 0.4 mL / min for 30 minutes while cooling the column with ice. The washed column was stored at 4 ° C. with dehydrated isopropyl alcohol enclosed.
  • Temperature-responsive protein A was prepared using temperature-responsive protein A with reference to Examples in the patent document (WO2008 / 143199 pamphlet). 2 mL of ice-cooled 1 mmol / L hydrochloric acid was passed through a column in which the carboxyl group had been NHS activated to replace dehydrated isopropyl alcohol as a stock solution. Next, 30 mg of temperature-responsive protein A was dissolved in 1 mL of a coupling buffer (0.2 mol / L phosphate buffer, 0.5 ⁇ BR> Takasumi ⁇ L NaCl, pH 8.3) and then cooled to 2 ° C.
  • a coupling buffer 0.2 mol / L phosphate buffer, 0.5 ⁇ BR> Takasumi ⁇ L NaCl, pH 8.3
  • the density of the coupling group of the beads was measured by the HPLC method and found to be 59 ⁇ mol / mL.
  • the temperature elution amount of the antibody was 32.1 mg / mL-bead volume, indicating that the antibody can be eluted by temperature change.
  • the elution amount was as small as 0.3 mg / mL-bead volume. From the above results, it was shown that the temperature-responsive protein A-immobilized beads can be used for industrial purification of antibodies.
  • Temperature-responsive protein A-immobilized beads were produced according to Example 1 except that crosslinked cellulose beads (manufactured by Chisso Corporation) were used as the carrier. (result) The density of the coupling group of the beads was measured by the HPLC method and found to be 59 ⁇ mol / mL. The temperature elution amount of the antibody was 18.9 mg / mL-bead volume, indicating that the antibody can be eluted by temperature change. When the antibody remaining on the beads after temperature elution was eluted with a low pH elution buffer, the elution amount was as small as 0.4 mg / mL-bead volume. From the above results, it was shown that the temperature-responsive protein A-immobilized beads can be used for industrial purification of antibodies.
  • Cross-linked cellulose beads having a formyl group (aldehyde group) of 10 ⁇ mol / mL (catalog value) as a coupling group (trade name: Cellufine Formyl, product number 676944324, manufactured by Chisso Corporation) were used.
  • 1) Coupling of temperature-responsive protein A First, 20 mg of temperature-responsive protein A was dissolved in 2 mL of a coupling buffer (0.2 M phosphate buffer, pH 8.3). 4 mL of Cellufine Formyl (50% slurry) was washed with pure water, mixed with the above solution, and shaken in a constant temperature shaker at 2 ° C. for 2 hours.
  • the temperature elution amount of the antibody was 21.1 mg / mL-bead volume, which showed that the antibody can be eluted by temperature change.
  • the elution amount was as small as 1.2 mg / mL-bead volume. From the above results, it was shown that the temperature-responsive protein A-immobilized beads can be used for industrial purification of antibodies.
  • the results of Examples 1 to 5 shown above are shown in Table 1.
  • Example 1 A temperature-responsive protein A-immobilized hollow fiber was produced in accordance with Example 1 except that the temperature-responsive protein A coupling temperature to the hollow fiber membrane was 20 ° C. (result) The temperature elution amount of the antibody was 6.1 mg / mL-membrane volume. When the antibody remaining in the hollow fiber after temperature elution was eluted with a low pH elution buffer, the elution amount was 1.1 mg / mL-membrane volume.
  • Example 2 A temperature-responsive protein A-immobilized hollow fiber was produced in accordance with Example 1 except that the temperature-responsive protein A coupling temperature to the hollow fiber membrane was 30 ° C. (result) The temperature elution amount of the antibody was 5.4 mg / mL-membrane volume. When the antibody remaining in the hollow fiber after temperature elution was eluted with a low pH elution buffer, the elution amount was 1.1 mg / mL-membrane volume.
  • Temperature-responsive protein A-immobilized beads were produced according to Example 3 except that the temperature-responsive protein A coupling temperature to the crosslinked polyvinyl alcohol beads was 30 ° C. (result)
  • the temperature elution amount of the antibody was 26.1 mg / mL-bead volume.
  • the elution amount was 0.3 mg / mL-bead volume.
  • Temperature-responsive protein A-immobilized beads were produced according to Example 4 except that the temperature-responsive protein A coupling temperature to the crosslinked cellulose beads was 30 ° C. (result)
  • the temperature elution amount of the antibody was 14.2 mg / mL-bead volume.
  • the elution amount was 0.3 mg / mL-bead volume.
  • Temperature-responsive protein A-immobilized beads were produced according to Example 4 except that the coupling temperature of temperature-responsive protein A to Cellufine Formyl was 30 ° C. (result)
  • the temperature elution amount of the antibody was 17.1 mg / mL-bead volume.
  • the elution amount was 1.0 mg / mL-bead volume.
  • Table 2 shows the results of Comparative Examples 1 to 5 shown above.
  • a useful physiologically active compound such as globulin is converted into an industrial scale by changing the temperature. It becomes possible to sort by.

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Abstract

　温度に依存して抗体との結合性が変化するよう変異されたプロテインＡである温度応答性プロテインＡの固定化担体の製造方法であって、温度応答性プロテインＡは、第１の温度領域で抗体との結合性を有し、第２の温度領域で抗体との結合性を有さず、温度応答性プロテインＡが抗体との結合性を有する第１の温度領域の温度で、温度応答性プロテインＡを担体表面に固定する工程を含む、温度応答性プロテインＡ固定化担体の製造方法。

Description

温度応答性プロテインＡの固定化方法
　本発明は、温度変化に伴って抗体との結合性に変化を示すことを特徴とする温度応答性プロテインＡの、担体への固定化方法に関する。
　抗体（イムノグロブリン）は、免疫反応を司る生理活性物質である。近年、医薬品、診断薬或いは対応する抗原タンパク質の分離精製材料等の用途において、その利用価値が高まっている。抗体は免疫した動物の血液あるいは抗体産生能を保有する細胞の細胞培養液又は動物の腹水培養液から取得される。但し、それらの抗体を含有する血液や培養液は、抗体以外のタンパク質、又は細胞培養に用いた原料液に由来する複雑な夾雑成分を包含する。そのため、それらの不純物成分から抗体を分離精製するためには、煩雑で長時間を要する操作が通常必要である。
　液体クロマトグラフィーは、抗体の分離精製に重要である。抗体を分離するためのクロマトグラフィー手法として、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー等があり、これらの手法を組み合わせることで抗体が分離精製される。
　アフィニティークロマトグラフィーでは、目的物質と親和性のある物質（リガンド）を担体に固定しておき、目的物質をこのリガンドに特異的に吸着させることで、目的物質を不純物成分から分離する。また、吸着された目的物は、リガンドとの親和性を下げることにより溶出され、これを回収することで、精製を行うことが可能である。
　アフィニティークロマトグラフィーにおいては、下記（Ａ）～（Ｃ）の工程を経て、純度及び濃度の高い抗体が精製される。
（Ａ）不純物の混じった試料をカラムに負荷する工程（負荷工程）
（Ｂ）負荷したカラムから精製対象とする抗体以外の不純物を取り除く工程（洗浄工程）
（Ｃ）精製対象とする抗体をカラムから回収する工程（溶出工程）
　負荷工程と洗浄工程においては、精製対象とする抗体がアフィニティーリガンドに強く結合するように、カラム内の環境を設定する一方で、溶出工程では両者が分離するようにカラム内の環境を変化させることが必須であり、この環境変化には、通常ｐＨの変化が利用されている。
　抗体の精製に用いるアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとしては、抗体の共通領域に極めて高い特異性と親和性を持つ、スタフィロコッカス由来のプロテインＡ、及びその抗体結合ドメインが知られており、産業規模における抗体製造工程で広く使用されている。
　しかしながら、プロテインＡ又はその一部をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーには、抗体の性質に起因する問題があり、その製造が制約を受けている。
　その問題とは、ｐＨ変化によってカラムから精製対象とする抗体を溶出させるには、抗体とプロテインＡの親和性が高いｐＨ６～８の中性域（負荷・洗浄工程のｐＨ）から、親和性が極端に低下するｐＨ３～４の酸性域（溶出工程のｐＨ）に環境を変化させる必要があるが、この酸性域では、抗体に立体構造の変化、及び会合凝集などが起こり、その機能に不具合をきたすため（例えば、特許文献１参照。）、"本来の性質を保持した抗体"の分離・精製の歩留まりが、極端に悪くなるという事である。
　特に、モノクローナル抗体医薬品として使用され、産業上最も有用なヒト化又はヒト型ＩｇＧは、プロテインＡとの親和性が他の抗体より高いため、溶出時に、特に強い酸性度の緩衝液が使用される。そのため、溶出時に、会合・凝集が発生しやすい。よって、それらＩｇＧの失活が、産業上問題となっている。
　したがって、高純度の抗体を効率よく製造するためには、溶出工程において酸性域の環境を用いない精製方法を開発することが望まれている。
　上記問題を解決するために、温度変化に伴って抗体との結合性が変化する変異プロテインＡ（温度応答性プロテインＡ）を用いた精製方法が提案されている（例えば、特許文献２参照。）。提案された方法によれば、精製の対象たる抗体の立体構造の安定性が確保され、かつ損傷、機能の喪失、又は意図しない機能の発生などの不具合が引き起こされないような条件下（ｐＨ５～９、６０℃未満）で、それ自身の天然立体構造の喪失と、形成と、の制御が可能な、温度応答性プロテインＡをアフィニティークロマトグラフィー用支持体に固定するリガンドとして使用することによって、溶出工程においてｐＨの変化を必要としない、新たな精製方法が可能となる。
特開２００５―２０６６０２号公報 ＷＯ２００８／１４３１９９号パンフレット
　温度応答性プロテインＡは、温度変化に伴って抗体との結合性が変化するといった特徴があるが、これまで支持体への最適な固定化方法が検討されたことはなかった。そこで、本発明は、温度変化に伴って抗体との結合性に変化を示すことを特徴とする温度応答性プロテインＡを、支持体に固定するための最適な方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、温度変化に伴って抗体との結合性に変化を示すことを特徴とする温度応答性プロテインＡが、抗体に対して吸着性を有する温度で、当該温度応答性プロテインＡを担体表面に固定されたカップリング基と接触させ、当該温度応答性プロテインＡを共有結合により担体表面に固定化することにより、温度応答性プロテインＡの機能を損なわずに固定できることを見出した。本発明で示される技術は、従来技術からは全く予想し得なかったもので、従来技術には全くなかった新規な抗体の分離システムへの発展が期待される。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
　本発明に記載される製造方法により、新規なアフィニティークロマト担体が製造可能となる。この担体を利用すれば、免疫グロブリン等のタンパク質等の有用な生理活性物を温度変化によって工業規模で分離精製できるようになる。
実施例１に示した方法で担体に固定された温度応答性プロテインＡを用いて、抗体の吸着溶出試験を実施した実験結果をまとめた表とグラフである。
　以下、本発明の実施形態（以下において、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。本実施形態は、温度に依存して抗体との結合性が変化するよう変異されたプロテインＡである温度応答性プロテインＡに関する。温度応答性プロテインＡは、第１の温度領域で抗体との結合性を有し、第２の温度領域で抗体との結合性を有しない。本実施形態に係る温度応答性プロテインＡの固定化担体の製造方法は、温度応答性プロテインＡが抗体との結合性を有する第１の温度領域の温度で、温度応答性プロテインＡを担体表面に固定する工程を含む。
　本実施形態で担体として使用する支持体の形状は、特に限定されるものではなく、例えば平膜状、中空糸状等の膜状、又はビーズ状のものがある。中空糸状の支持体は、モジュール成型が容易であり、モジュール容器あたりに充填できる膜面積が大きいため、好適に用いることができる。また、ビーズ状のものは一般的に、体積あたりの表面積が膜状のものと比較して大きく、大量の抗体を吸着できるため、好適に用いることができる。
　本実施形態で担体として使用する支持体の材料は、特に限定されるものではない。膜状の担体の材料は、多孔性の膜を形成しうる高分子材料が好適に用いることができる。例えば、ポリエチレンやポリプロピレン等のオレフィン樹脂、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンテレナフタレート等のポリエステル樹脂、ナイロン６、ナイロン６６等のポリアミド樹脂、ポリフッ化ビニリデン、ポリクロロトリフルオロエチレン等の含フッ素樹脂、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、及びポリカーボネート等の非結晶性樹脂などが使用できる。ビーズ状の担体の材料は、ガラス、シリカ、ポリスチレン樹脂、メタクリル樹脂、架橋アガロース、架橋デキストラン、架橋ポリビニルアルコール、及び架橋セルロースなどが使用できる。架橋ポリビニルアルコール、及び架橋セルロースは親水性が高く、不純物成分の吸着を抑制できるため好適に用いることができる。
　本実施形態で使用する支持体は、例えば複数の細孔を有する。細孔径は、特に限定されるものではないが、５～１０００ｎｍがよく、好ましくは１０～７００ｎｍ、さらに好ましくは２０～５００ｎｍである。細孔径が５ｎｍ以下であると、分離できる抗体の分子量が低くなる傾向にある。また細孔径が１０００ｎｍ以上であると基材の表面積が少なくなり、抗体の結合容量が小さくなる傾向にある。
　本実施形態では、上記支持体にどのようなカップリング基を導入してもよい。例えば、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化されたカルボキシル基、カルボキシル基、臭化シアン活性化基、水酸基、エポキシ基、アルデヒド基、及びチオール基等が挙げられる。温度応答性プロテインＡは一級アミノ基を有しているため、上述したカップリング基のうち、一級アミノ基とカップリングできるＮＨＳ活性化されたカルボキシル基、カルボキシル基、臭化シアン活性基、エポキシ基、及びホルミル基等が好ましい。特に、ＮＨＳで活性化されたカルボキシル基は、カップリング反応時に他の薬品の使用が不要であり、反応が迅速で強固な結合を形成するため好適に用いられる。
　支持体表面に固定されたカップリング基の濃度（密度）は、好ましくは５０μｍｏｌ／ｍＬ以上、１０００μｍｏｌ／ｍＬ未満である。
　カップリング基の濃度が５０μｍｏｌ／ｍＬ未満の場合、カップリング基と、温度応答性プロテインＡと、のカップリング効率が低下する傾向にある。
　カップリング基の濃度を５０μｍｏｌ／ｍＬ以上とすることにより、カップリング基と、温度応答性プロテインＡと、のカップリング効率を増大させることが可能である。本実施形態では、温度応答性プロテインＡが抗体に対して吸着性を有する温度で、温度応答性プロテインＡを支持体表面に固定されたカップリング基と接触させ、温度応答性プロテインＡを共有結合により支持体表面に固定している。これにより、温度応答性プロテインＡの機能を損なうことなく、温度応答性プロテインＡを支持体表面に固定することが可能となる。そのため、高い密度でカップリング基を有する支持体を用いることで、高いカップリング効率で、且つ、温度応答性プロテインＡの機能を損なうことなく、温度応答性プロテインＡを担体表面に固定することが可能となる。ただし、カップリング基の濃度が１０００μｍｏｌ／ｍＬ以上となると、支持体と温度応答性プロテインＡとの結合数が増大し、温度応答性プロテインＡの活性が低下する傾向にある。
　カップリング基の密度は、当業者に既知の方法で測定することが可能である。例えば、ＮＨＳで活性化されたカルボキシル基の場合、熱やアルカリによってカルボキシル基からＮＨＳを遊離させ、ＨＰＬＣ法で定量する方法（ＨＰＬＣ法）や、ＮＨＳ活性化反応によって増加した担体の重量（Ｗ１）を測定することにより定量する方法（重量法）がある。
　本実施形態では、支持体へのカップリング基の導入方法はいかなる方法でもよいが、支持体と、カップリング基と、の間にスペーサーを導入するのが一般的である。カップリング基の導入方法は、さまざまな文献によって開示されている。
　本実施形態では、カップリング基を末端、及び／又は側鎖に有するグラフト高分子鎖を支持体に導入してもよい。カップリング基を有するグラフト高分子鎖を支持体に導入することで、カップリング基の密度を任意に高める等、制御することが可能となる。カップリング基を有する高分子鎖を支持体にグラフトするか、あるいはカップリング基に変換しうる前駆体官能基を有する高分子鎖を支持体にグラフトし、その後にグラフトした前駆体官能基をカップリング基に変換してもよい。
　グラフト高分子鎖の導入方法はいかなる方法でもよい。あらかじめ高分子鎖を調製し、支持体にカップリングしてもよい。また、「リビングラジカル重合法」や「放射線グラフト重合法」の手法により、支持体上で直接グラフト鎖を重合してもよい。「放射線グラフト法」は、支持体にあらかじめ反応開始剤を導入する必要がなく、適応可能な支持体が多種であるため、好適に用いることができる。
　「放射線グラフト重合法」でグラフト鎖を導入する場合、支持体にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用し得るが、支持体全体に均一なラジカルを生成させるためには、電離性放射線の照射が好ましい。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、及び中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が好ましい。電離性放射線はコバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７などの放射性同位体から、あるいはＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等から得られる。
　電離性放射線の照射線量は、１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下が好ましく、より好ましくは２ｋＧｙ以上５００ｋＧｙ以下、さらに好ましくは５ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下である。照射線量が１ｋＧｙ未満では、ラジカルが均一に生成しにくくなる傾向にある。また、照射線量が１０００ｋＧｙを超えると、支持体の物理的強度の低下を引き起こす傾向にある。
　電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に支持体にラジカルを生成した後、次いでそれを反応性化合物と接触させる前照射法と、支持体を反応性化合物と接触させた状態で支持体にラジカルを生成させる同時照射法と、に大別される。本実施形態においては、いかなる方法も適用し得るが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。
　本実施形態においてグラフト重合時に使用する溶媒は、反応性化合物を均一溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、エタノールやイソプロパノール、ｔ－ブチルアルコール等のアルコール類；　ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類；　アセトンや２－ブタノン等のケトン類；　水、又はそれらの混合物等が挙げられる。
　本実施形態において、グラフト重合に使用されるカップリング基を有するモノマーとしては、カルボキシル基をカップリング基とする場合には、アクリル酸、及びメタクリル酸等のモノマーが挙げられる。一級アミノ基をカップリング基とする場合には、アリルアミン等が挙げられる。そして、エポキシ基をカップリング基とする場合には、グリシジルメタクリレート等が挙げられる。
　本実施形態において、カップリング基に変換しうる前駆体官能基を有するモノマーを支持体にグラフトし、その後にグラフトした前駆体官能基をカップリング基に変換してもよい。エポキシ基を有するグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）は、さまざまなエポキシ基の開環反応を利用してさまざまな官能基に変換することが可能であるため、工業的にも好適に用いることが可能である。
　カルボキシル基をカップリング基とする場合には、まずＧＭＡをグラフト重合後、ＧＭＡのエポキシ基を加水分解してジオールとし、ジオール由来の水酸基に環状酸無水物を開環ハーフエステル化反応させることにより、環状酸無水物に由来するカルボキシル基を形成（開環ハーフエステル化反応）することが可能である。製造コストの点で、環状酸無水物は無水コハク酸又は無水グルタル酸であることが望ましいが、これらに限定されない。
　開環ハーフエステル化反応に用いられる触媒としては本反応を促進するものであれば特に限定されないが、具体的にはトリエチルアミン、イソブチルエチルアミン、ピリジン、及び４－ジメチルアミノピリジンなどが挙げられ、トリエチルアミン又は４－ジメチルアミノピリジンが好ましく、反応速度や収率の点で４－ジメチルアミノピリジンが最も好ましい。
　開環ハーフエステル化反応は、上記触媒を添加したトルエン等の不活性有機溶媒中で行われることが好ましい。
　本実施形態においてＮＨＳ活性反応とは、上記開環ハーフエステル化反応により形成されたカルボキシル基を活性エステルに変換する工程である。カルボキシル基と比較して活性エステルは反応性が高いことから、温度応答性プロテインＡを担体上に迅速に固定化することが望まれる場合には活性エステル化工程を行うことが好ましい。
　活性エステルは、親水性化合物と、固定化対象物質と、を共有結合によって結びつける役目を果たす。ここで、活性エステルとはＲ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｘという化学構造を意味する。Ｘには、ハロゲンやＮ－ヒドロキシスクシンイミド基又はその誘導体、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール基又はその誘導体、ペンタフルオロフェニル基、並びにパラニトロフェニル基などの脱離性基が該当するが、これらに限定されない。活性エステルとしては、反応性、安全性及び製造コストの点で、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルが望ましい。カルボキシル基のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルへの変換は、カルボキシル基にＮ－ヒドロキシスクシンイミドと、カルボジイミドと、を同時に反応させることによって達成される。ここで、カルボジイミドとは－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－の化学構造を有する有機化合物を意味し、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられるが、これらに限定されない。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド及びカルボジイミドの濃度は１～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、反応温度は０～１００℃、反応時間は２分～１６時間の範囲で設定されるのが望ましい。反応溶媒としてはＮ，Ｎ'－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）やトルエンなどを使用することができる。
　本実施形態において、温度に依存して抗体との結合性が変化するよう変異されたプロテインＡである温度応答性プロテインＡは、特許文献（ＷＯ２００８／１４３１９９号パンフレット）を参考に調製することができる。
　本実施形態において、ＮＨＳ活性化されたカルボキシル基と、温度応答性プロテインＡと、のカップリング反応は、例えば以下のように行われる。まず、クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０～６．２）、酢酸緩衝液（ｐＨ３．６～５．６）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ５．８～８．５）、又は炭酸緩衝液（ｐＨ９．２～１０．６）などのアミノ基成分を含まない緩衝液を用いて、０．１～１００ｍｇ／ｍｌの温度応答性プロテインＡ溶液を準備する。この水溶液を活性エステル表面と接触させると、温度応答性プロテインＡに含まれるアミノ基等の官能基が活性エステルと反応し、アミド結合が形成される。その結果、温度応答性プロテインＡは共有結合によって表面に固定化される。ここで、接触時間は２分～１６時間の範囲で設定するとよい。温度応答性プロテインＡを固定化した後は、適当な洗浄液で担体を洗浄することが望ましい。このとき、洗浄液は０．５ｍｏｌ／Ｌ程度の塩（ＮａＣｌ）及び０．１％程度の非イオン性界面活性剤を含む緩衝液であることが望ましい。これによって、共有結合せずに物理吸着しているだけの温度応答性プロテインＡを取り除くことができるからである。
　本実施形態において、ＮＨＳ活性化されたカルボキシル基と、温度応答性プロテインＡと、のカップリング反応は、温度応答性プロテインＡが抗体に対して吸着性を有する温度で達成される。
　温度応答性プロテインＡの一部は、天然立体構造の喪失と、形成と、が温度変化によって可逆的に生じる。具体的には、温度応答性プロテインＡの一部は、低温領域では天然の立体構造が形成されて抗体との結合能を有するが、高温領域では天然の立体構造を喪失して抗体との結合能が著しく低下する。低温領域で天然の立体構造が形成された状態で支持体とカップリングされた場合、温度応答性プロテインＡは、抗体との結合性を維持し、かつ、温度変化による天然立体構造の喪失と、形成と、が支持体とのカップリング後も可逆的に生じる。しかしながら、高温領域で天然の立体構造が喪失した状態で支持体とカップリングされた場合、固定された温度応答性プロテインＡは、低温に環境温度が変化しても、完全に天然の立体構造に戻ることができないため、充分な抗体結合性を発揮できない。
　なお、温度応答性プロテインＡの抗体との結合性が温度に依存して変化する機構は、立体構造の変化に限定されない。立体構造の変化を伴わずに、温度に依存して抗体との結合性が変化する温度応答性プロテインＡも存在する。立体構造の変化を伴わずに、温度に依存して抗体との結合性が変化する温度応答性プロテインＡについても、ＮＨＳ活性化されたカルボキシル基とのカップリング反応を、温度応答性プロテインＡが抗体に対して吸着性を有する温度で行うことにより、カップリング後も、抗体との結合性を維持することが可能となる。
　本実施形態において「第１の温度領域」あるいは「温度領域Ａ」とは、温度応答性プロテインＡが特定のタンパクとの吸着性を有する温度の領域であり、一定量の温度応答性プロテインＡに結合可能なタンパクの最大結合量に対して、タンパク結合量が５０％以上となる温度の領域である。「第１の温度領域の温度」として、０～３０℃未満が好ましく、０～２０℃がさらに好ましく、０～１０℃が最も好ましい。０℃未満では、カップリング反応時に凍結する可能性があり、３０℃以上では十分な抗体の結合性が得難い。また、本実施形態において「第２の温度領域」あるいは「温度領域Ｂ」とは、温度応答性プロテインＡが特定のタンパクとの吸着性を有効に示さない温度の領域であり、一定量の温度応答性プロテインＡに結合可能なタンパクの最大結合量に対して、タンパク結合量が５０％未満となる温度の領域である。
　温度領域Ａ、及び温度領域Ｂを特定する具体的な方法は、以下の手順で行う。
　　１．温度応答性プロテインＡ固定化担体にそれぞれ５℃未満、１０℃、（以後、特定のタンパクが変性する温度の直下まで１０℃おきに設定する）の温度において、タンパクを結合させる。
　　２．特定のタンパクが変性する温度の直下まで昇温して、結合したタンパクを溶出させ、タンパク溶出量を２８０ｎｍの波長の紫外線（ＵＶ）法で測定する。
　　３．タンパク溶出量を、タンパクを吸着させた温度に対してプロットし、タンパク結合量（溶出量）の最大値の５０％とプロット間を結んだ線の交点（以下、「５０％結合温度」と呼ぶ。）を境とし、５０％以上のタンパク結合量を有する温度領域を温度領域Ａ、５０％未満のタンパク結合量を有する温度領域を温度領域Ｂとする。
　特許文献（ＷＯ２００８／１４３１９９号パンフレット）実施例を参考に調製した温度応答性プロテインＡを、後述する実施例１記載の方法で固定化し、実施例１記載の条件で抗体の吸着、溶出を行い、上記手順で５０％結合温度を算出した。その結果、図１に示すように、ある一定量の温度応答性プロテインＡは、環境温度（抗体結合温度）が２℃の場合に、１４．５ｍｇ／ｍｌの抗体と結合可能であり、当該２℃において、最大結合量を示した。また、プロットより、５０％吸着温度は１５．０℃であった。この場合、１５．０℃以下のカップリング温度が上述した温度領域Ａであり、１５．０℃より高いカップリング温度が温度領域Ｂである。
　なお、温度応答性プロテインＡの温度領域Ａと、温度領域Ｂと、を区分する温度は、温度応答性プロテインＡのペプチド鎖の相違により、若干異なる。ただし、同一のペプチド鎖を有する温度応答性プロテインＡの温度領域Ａと、温度領域Ｂと、を区分する温度は、変化しない。変わるのは吸脱着可能な抗体結合量の絶対量になる。
　温度応答性プロテインＡを担体表面に固定化した後（好ましくは更に温度応答性プロテインＡ固定化担体を洗浄した後）は、未反応のカルボキシル基又は活性エステルを、アミノ基を有する低分子化合物と結合させることにより、当該カルボキシル基又は活性エステルを反応性のより低い官能基に変換させることが好ましい。これによって、不純物等の精製対象外の分子が不本意に担体表面に固定化されるのを防ぐことができる。特に温度応答性プロテインＡ固定用担体の末端の官能基が活性エステルである場合、この操作がなされることが好ましい。
　本明細書では、活性エステル基にアミノ基を有する低分子化合物を反応させる操作を特に「ブロッキング」と記述することがある。ただし、カルボキシル基又は活性エステルを低分子化合物と反応させた後の担体表面は、親水性であることが望ましい。なぜなら、親水性の表面は一般に生体関連物質の非特異的吸着を抑制する効果をもつからである。このためにはアミノ基を含有する低分子化合物として、アミノ基以外に親水性基を更に有する低分子化合物を使用することが好ましい。このような低分子化合物の非限定的な例としては、エタノールアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、及びジグリコールアミン（ＩＵＰＡＣ名：２－（２－アミノエトキシ）エタノール）が挙げられる。これらの低分子化合物はＰＢＳなどの緩衝液に１０～１，０００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、溶解液を温度応答性プロテインＡを固定化した担体と接触させる。例えば、反応温度は４～３７℃、反応時間は２分～１６時間の範囲で設定するとよい。
　温度応答性プロテインＡ固定化担体は、ｐＨ４～８の範囲の中性溶液を保存液とし、２～１０℃程度の低温で保存する。保存液としては、抗菌性を考慮して、２０％エタノールが好ましい。
　温度応答性プロテインＡ固定化担体による抗体の分離方法は特に限定されるものではないが、あらかじめ温度応答性プロテインＡの特性が変わる温度を確認しておき、その温度を挟むようにして温度変化させることにより不純物の分離を行う方法が挙げられる。本実施形態の場合、この温度応答性プロテインＡの特性が大きく変わる温度を挟むようにして分離することが最も効果的な利用方法である。
　以上に示してきた本実施形態における温度応答性プロテインＡ固定化方法により製造した温度応答性プロテインＡ固定化担体は、プロテインＡがその抗体結合性を固定後も維持する。そのため、工業的に充分な量の抗体を温度変化によって精製することが可能となる。その際には、カラム内の温度を変化させるだけで簡便な操作だけで分離が達成でき、溶出工程において低ｐＨの溶出液を必要としないため、精製された抗体も変性なく得られる。
　以下に、本実施形態を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本実施形態を何ら限定するものではない。
　放射線グラフト重合法によってカップリング基前駆体モノマーであるグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）からなるグラフト鎖を中空糸膜に導入した後に、ＧＭＡが含有していたエポキシ基をジオール基に変換し、その後カルボキシル基に変換した。次に、側鎖にカルボキシル基を含有したグラフト鎖が導入された中空糸膜をモジュール成型し、その後、カルボキシル基をＮＨＳ活性化した。さらに、ＮＨＳ活性化された中空糸モジュールに、温度応答性プロテインＡが抗体に対して吸着性を有する温度で温度応答性プロテインＡを透過させることで、温度応答性プロテインＡを中空糸に固定化した。詳細は以下のとおりである。
　１）表面グラフト重合
　ＧＭＡ２０ｇをメタノール１８０ｍＬに溶解させ、３０分間、窒素バブリングしたものを反応液として用いた。ポリエチレン製中空糸（内径２．０ｍｍ、外径３．０ｍｍ、平均孔径０．２５μｍ）２ｇを窒素雰囲気下において、ドライアイスで－６０℃に冷却しながら、コバルト（Ｃｏ）６０を線源としてγ線を２００ｋＧｙ照射した。照射後の中空糸は、１３．４Ｐａ以下の減圧下に５分間静置した後、２０ｍＬの上記反応液と該中空糸を４０℃で接触させ、１６時間静置した。その後、中空糸をエタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させた。
２）エポキシ基のジオール化
　表面グラフト重合した中空糸を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。反応後、この中空糸を純水で洗浄した後、膜をエタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させた。
３）カルボキシル基の導入
　エポキシ基をジオール化した中空糸を、無水コハク酸３．０ｇ及び４－ジメチルアミノピリジン３．６ｇをトルエン９００ｍＬに溶解させた反応液に浸漬し、４０℃で６０分間反応させることで、グラフト鎖にカルボキシル基を導入した。反応後、この中空糸をエタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させた。
４）ＮＨＳ活性化
　モジュール化した中空糸（中空糸１本モジュール、有効糸長４ｃｍ）を４０℃に加温しながら、ＮＨＳ活性化反応液（ＮＨＳ０．０７ｇ、脱水イソプロピルアルコール４５ｍＬ、ジイソプロピルカルボジイミド０．０９ｍＬ）を０．４ｍＬ／分の流速で６０分間透過し、カルボキシル基をＮＨＳ活性化した。反応後、中空糸モジュールを氷冷しながら、中空糸モジュールに脱水イソプロピルアルコールを０．４ｍＬ／分の流速で６０分間透過させることで洗浄した。洗浄後の中空糸モジュールは、脱水イソプロピルアルコールを封入した状態で、４℃で保存した。
　５）温度応答性プロテインＡのカップリング
　温度応答性プロテインＡは、特許文献（ＷＯ２００８／１４３１９９号パンフレット）実施例を参考に温度応答性プロテインＡを調製し用いた。カルボキシル基をＮＨＳ活性化した中空糸モジュールに氷冷した１ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸を１０ｍＬ透過して、保存液である脱水イソプロピルアルコールを置換した。次いで、温度応答性プロテインＡ２０ｍｇを７ｍＬのカップリング緩衝液（０．２ｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液、０．５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）に溶解後に２℃に冷却し、０．４ｍＬ／分の流速で中空糸モジュールを透過させ、透過液を供給液に連続的に加えることで、１６時間循環させた。循環中もモジュールを２℃に保つことで、カップリング時の温度を２℃に保った。所定時間経過後、中空糸モジュールにカップリング緩衝液を透過させることで、ＮＨＳ活性基とカップリング反応しなかった温度応答性プロテインＡを洗浄・回収した。
　６）ブロッキング
　温度応答性プロテインＡをカップリングした中空糸モジュールにブロッキング反応液（０．５ｍｏｌ／Ｌ　エタノールアミン、０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を１０ｍＬ透過し、室温で３０分間放置することで、残留ＮＨＳをエタノールアミンでブロッキングした。反応後、この中空糸モジュールを純水で洗浄し、その後２０％エタノールでモジュールに封入した状態で、４℃で保存した。
　７）抗体の温度溶出量測定
　クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ　ＦＰＬＣ、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）を用いて、温度変化による抗体（献血ヴェノグロブリ－ＩＨ、株式会社ベネシス製）の吸着・溶出試験を行った。中空糸モジュールの温度変化操作は、クロマトグラフィーシステムのポンプを一時停止し、中空糸モジュールを所定温度の恒温水槽中に浸漬し、その後１０分間以上温置した後にクロマトグラフィーシステムのポンプを再度起動することにより行った。抗体の吸着、及び溶出は、以下の条件で行った。
（吸着ステップ）
・抗体濃度：２．５ｍｇ／ｍＬ
・吸着緩衝液：２０ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）
・抗体負荷量：２０ｍＬ
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・中空糸膜体積：０．１８ｍＬ
・吸着（カップリング）温度：２℃
（洗浄ステップ）
・洗浄緩衝液：吸着緩衝液と同一
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・洗浄温度：２℃
（温度溶出ステップ）
・温度溶出緩衝液：吸着緩衝液と同一
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・透過液量：２０ｍL
・溶出温度：４０℃
（温度溶出ステップ後の低ｐＨ溶出ステップ）
・低ｐＨ溶出緩衝液：１００ｍｍｏｌ／Ｌ　クエン酸バッファー（ｐＨ３．０）
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・透過液量：２０ｍL
・溶出温度：４０℃
　温度溶出後、温度で溶出しきれない抗体を、低ｐＨの溶出緩衝液で溶出させた。各ステップの分画のＵＶ吸収（２８０ｎｍ）を測定し、下記式より免疫グロブリン濃度を算出することにより、免疫グロブリンの温度溶出量を算出した。
　　　免疫グロブリン濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝２８０ｎｍでの吸光度／１４×１０
　　　温度溶出量（ｍｇ／ｍＬ）＝
　　　　　　温度溶出画分の免疫グロブリン濃度×温度溶出画分の液量／膜体積
（結果）
　中空糸膜のカップリング基の密度を重量法で測定した結果、１６０μｍｏｌ／ｍＬであった。抗体の温度溶出量は１４．５ｍｇ／ｍＬ－膜体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後の中空糸に残った抗体を低ｐＨ溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は１．２ｍｇ／ｍＬ－膜体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインＡ固定化中空糸が、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
　中空糸膜への温度応答性プロテインＡのカップリング温度を１０℃とすること以外は、実施例１に従って温度応答性プロテインＡ固定化中空糸を製造した。
（結果）
　抗体の温度溶出量は１４．１ｍｇ／ｍＬ－膜体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後の中空糸に残った抗体を低ｐＨ溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は１．２ｍｇ／ｍＬ－膜体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインＡ固定化中空糸が、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
　カルボキシル基を架橋ポリビニルアルコールビーズに導入した後に、カルボキシル基をＮＨＳ活性化した。さらに、ＮＨＳ活性化された架橋ポリビニルアルコールビーズと、温度応答性プロテインＡが抗体に対して吸着性を有する温度で温度応答性プロテインＡを接触させることで、温度応答性プロテインＡを架橋ポリビニルアルコールビーズに固定化した。詳細は以下のとおりである。
　１）カルボキシル基の導入
　無水コハク酸３．０ｇ及び４－ジメチルアミノピリジン３．６ｇをトルエン４５０ｍＬに溶解させたものを反応液として用いた。架橋ポリビニルアルコール（平均粒子径１００μｍ）１ｇを上記反応液と５０℃で接触させ、２時間攪拌した。その後、架橋ポリビニルアルコールビーズを脱水イソプロピルアルコールで洗浄した。
２）カラムパッキング
　上記架橋ポリビニルアルコールビーズを、空カラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ５／２０ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）に充填した。
３）ＮＨＳ活性化
　上記カラムを４０℃に加温しながら、ＮＨＳ活性化反応液（ＮＨＳ０．０７ｇ、脱水イソプロピルアルコール４５ｍＬ、ジイソプロピルカルボジイミド０．０９ｍＬ）を０．４ｍＬ／分の流速で３０分間透過し、カルボキシル基をＮＨＳ活性化した。反応後、カラムを氷冷しながら、カラムに脱水イソプロピルアルコールを０．４ｍＬ／分の流速で３０分間透過させることで洗浄した。洗浄後のカラムは、脱水イソプロピルアルコールを封入した状態で、４℃で保存した。
　４）温度応答性プロテインＡのカップリング
　温度応答性プロテインＡは、特許文献（ＷＯ２００８／１４３１９９号パンフレット）実施例を参考に温度応答性プロテインＡを調製し用いた。カルボキシル基をＮＨＳ活性化したカラムに氷冷した１ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸を２ｍＬ透過して、保存液である脱水イソプロピルアルコールを置換した。次いで、温度応答性プロテインＡ３０ｍｇを１ｍＬのカップリング緩衝液（０．２ｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液、０．５・BR>高盾戟^Ｌ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）に溶解後に２℃に冷却し、０．４ｍＬ／分の流速でカラムに供給した後、１６時間保持させた。保持中もカラムを２℃に保つことで、カップリング時の温度を２℃に保った。所定時間経過後、カラムにカップリング緩衝液を透過させることで、ＮＨＳ活性基とカップリング反応しなかった温度応答性プロテインＡを洗浄・回収した。
　５）ブロッキング
温度応答性プロテインＡをカップリングしたカラムにブロッキング反応液（０．５ｍｏｌ／Ｌ　エタノールアミン、０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を１０ｍＬ透過し、室温で３０分間放置することで、残留ＮＨＳをエタノールアミンでブロッキングした。反応後、このカラムを純水で洗浄し、その後２０％エタノールでカラムに封入した状態で、４℃で保存した。
　６）抗体の温度溶出量測定
クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ　ＦＰＬＣ、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）を用いて、温度変化による抗体（献血ヴェノグロブリ－ＩＨ、株式会社ベネシス製）の吸着・溶出試験を行った。カラムの温度変化操作は、クロマトグラフィーシステムのポンプを一時停止し、カラムを所定温度の恒温水槽中に浸漬し、その後１０分間以上温置した後にクロマトグラフィーシステムのポンプを再度起動することにより行った。抗体の吸着、及び溶出は、以下の条件で行った。
（吸着ステップ）
・抗体濃度：２．５ｍｇ／ｍＬ
・吸着緩衝液：２０ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）
・抗体負荷量：２０ｍＬ
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・ビーズ体積：０．５９ｍＬ
・吸着（カップリング）温度：２℃
（洗浄ステップ）
・洗浄緩衝液：吸着緩衝液と同一
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・洗浄温度：２℃
（温度溶出ステップ）
・温度溶出緩衝液：吸着緩衝液と同一
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・透過液量：２０ｍL
・溶出温度：４０℃
（温度溶出ステップ後の低ｐＨ溶出ステップ）
・低ｐＨ溶出緩衝液：１００ｍｍｏｌ／Ｌ　クエン酸バッファー（ｐＨ３．０）
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・透過液量：２０ｍL
・溶出温度：４０℃
　温度溶出後、温度で溶出しきれない抗体を、低ｐＨの溶出緩衝液で溶出させた。各ステップの分画のＵＶ吸収（２８０ｎｍ）を測定し、下記式より免疫グロブリン濃度を算出することにより、免疫グロブリンの温度溶出量を算出した。
　　　免疫グロブリン濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝２８０ｎｍでの吸光度／１４×１０
　　　温度溶出量（ｍｇ／ｍＬ）＝
　　　　　　温度溶出画分の免疫グロブリン濃度×温度溶出画分の液量／ビーズ体積
（結果）
　ビーズのカップリング基の密度をＨＰＬＣ法で測定した結果、５９μｍｏｌ／ｍＬであった。抗体の温度溶出量は３２．１ｍｇ／ｍＬ－ビーズ体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った抗体を低ｐＨ溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は０．３ｍｇ／ｍＬ－ビーズ体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインＡ固定化ビーズが、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
　担体として架橋セルロースビーズ（チッソ（株）製）を用いること以外は、実施例１に従って温度応答性プロテインＡ固定化ビーズを製造した。
（結果）
　ビーズのカップリング基の密度をＨＰＬＣ法で測定した結果、５９μｍｏｌ／ｍＬであった。抗体の温度溶出量は１８．９ｍｇ／ｍＬ－ビーズ体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った抗体を低ｐＨ溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は０．４ｍｇ／ｍＬ－ビーズ体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインＡ固定化ビーズが、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
　カップリング基としてホルミル基（アルデヒド基）を１０μｍｏｌ／ｍＬ（カタログ値）有する架橋セルロースビーズ（商品名：セルファイン・ホルミル、製品番号６７６９４４３２４、チッソ（株）製）を用いた。
１）温度応答性プロテインＡのカップリング
　まず、温度応答性プロテインＡ２０ｍｇをカップリング緩衝液（０．２Ｍ　リン酸緩衝液、ｐＨ８．３）２ｍＬに溶解した。セルファイン・ホルミル（５０％スラリー）４ｍＬを純水で洗浄後、上記溶解液と混合し、２℃の恒温振とう機中で２時間振とうさせた。その後、還元剤（トリメチルアミンボラン）１８ｍｇを加え、２℃の恒温振とう機中で４時間反応させた。所定時間経過後、上記カップリング緩衝液でビーズを洗浄後、ビーズにブロッキング液（０．２Ｍ　トリス塩酸緩衝液）４ｍＬと還元剤（トリメチルアミンボラン）１５ｍｇを加え、２℃の恒温振とう機中で２時間反応した。所定時間経過後、ビーズを純水で洗浄した。
２）抗体の温度溶出量測定
　実施例１と同様の方法で、抗体の温度溶出量を測定した。
（結果）
　抗体の温度溶出量は２１．１ｍｇ／ｍＬ－ビーズ体積、であり、抗体を温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った抗体を低ｐＨ溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は１．２ｍｇ／ｍＬ－ビーズ体積、と少なかった。以上の結果から、この温度応答性プロテインＡ固定化ビーズが、抗体の工業的な精製に使用できることが示された。
　以上示した実施例１乃至５の結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［比較例１］
　中空糸膜への温度応答性プロテインＡのカップリング温度を２０℃とすること以外は、実施例１に従って温度応答性プロテインＡ固定化中空糸を製造した。
（結果）
　抗体の温度溶出量は６．１ｍｇ／ｍＬ－膜体積、であった。温度溶出後の中空糸に残った抗体を低ｐＨ溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は１．１ｍｇ／ｍＬ－膜体積、であった。
［比較例２］
　中空糸膜への温度応答性プロテインＡのカップリング温度を３０℃とすること以外は、実施例１に従って温度応答性プロテインＡ固定化中空糸を製造した。
（結果）
　抗体の温度溶出量は５．４ｍｇ／ｍＬ－膜体積、であった。温度溶出後の中空糸に残った抗体を低ｐＨ溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は１．１ｍｇ／ｍＬ－膜体積、であった。
［比較例３］
　架橋ポリビニルアルコールビーズへの温度応答性プロテインＡのカップリング温度を３０℃とすること以外は、実施例３に従って温度応答性プロテインＡ固定化ビーズを製造した。
（結果）
　抗体の温度溶出量は２６．１ｍｇ／ｍＬ－ビーズ体積、であった。温度溶出後のビーズに残った抗体を低ｐＨ溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は０．３ｍｇ／ｍＬ－ビーズ体積、であった。
［比較例４］
　架橋セルロースビーズへの温度応答性プロテインＡのカップリング温度を３０℃とすること以外は、実施例４に従って温度応答性プロテインＡ固定化ビーズを製造した。
（結果）
　抗体の温度溶出量は１４．２ｍｇ／ｍＬ－ビーズ体積、であった。温度溶出後のビーズに残った抗体を低ｐＨ溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は０．３ｍｇ／ｍＬ－ビーズ体積、であった。
［比較例５］
　セルファイン・ホルミルへの温度応答性プロテインＡのカップリング温度を３０℃とすること以外は、実施例４に従って温度応答性プロテインＡ固定化ビーズを製造した。
（結果）
　抗体の温度溶出量は１７．１ｍｇ／ｍＬ－ビーズ体積、であった。温度溶出後のビーズに残った抗体を低ｐＨ溶出緩衝液で溶出したところ、溶出量は１．０ｍｇ／ｍＬ－ビーズ体積、であった。
　以上示した比較例１乃至５の結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
本出願は、２０１０年１２月２４日に日本国特許庁へ出願された日本特許出願（特願２０１０－２８８４５１号）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
  本実施形態に係る温度応答性プロテインＡ固定化担体の製造方法、及びそれにより製造された温度応答性プロテインＡ固定化担体を利用すれば、グロブリン等の有用な生理活性化合物を温度変化によって工業規模で分取できるようになる。

Claims (18)

  1. 　温度に依存して抗体との結合性が変化するよう変異されたプロテインＡである温度応答性プロテインＡの固定化担体の製造方法であって、
    　前記温度応答性プロテインＡは、第１の温度領域で前記抗体との結合性を有し、第２の温度領域で前記抗体との結合性を有さず、
    　前記温度応答性プロテインＡが前記抗体との結合性を有する前記第１の温度領域の温度で、前記温度応答性プロテインＡを担体表面に固定する工程を含む、
    　温度応答性プロテインＡ固定化担体の製造方法。
  2. 　共有結合により前記温度応答性プロテインＡを前記担体表面に固定する、請求項１に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体の製造方法。
  3. 　前記温度応答性プロテインＡを前記担体表面に固定する工程が、前記温度応答性プロテインＡを前記担体表面に固定されたカップリング基と接触させることを含む、請求項１又は２に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体の製造方法。
  4. 　前記担体表面に固定されたカップリング基の濃度が５０μｍｏｌ／ｍＬ以上である、請求項３に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体の製造方法。
  5. 　前記担体が膜である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体の製造方法。
  6. 　前記膜が中空糸状であることを特徴とする、請求項５に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体の製造方法。
  7. 　前記担体がビーズである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体の製造方法。
  8. 　前記ビーズが、架橋ポリビニルアルコールからなることを特徴とする、請求項７に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体の製造方法。
  9. 　前記ビーズが、架橋セルロースからなることを特徴とする、請求項７に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体の製造方法。
  10. 　前記温度応答性プロテインＡを含む反応液と、前記担体と、を接触させることにより、前記温度応答性プロテインＡを前記担体表面に固定された前記カップリング基と接触させる、請求項３に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体の製造方法。
  11. 　前記担体が担体表面にグラフト高分子鎖を有し、
    　前記カップリング基が、前記グラフト高分子鎖の側鎖に存在する、請求項３に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体の製造方法。
  12. 　前記カップリング基が、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたカルボキシル基である、請求項３に記載の温度応答性プロテインＡ固定担体の製造方法。
  13. 　請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の製造方法で製造された温度応答性プロテインＡ固定担体。
  14. 　温度応答性プロテインＡがイムノグロブリンに対して吸着性を有する温度で吸着したイムノグロブリンを、温度変化によって溶出することが可能である、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の製造方法で製造された、温度応答性プロテインＡ固定化担体。
  15. 　前記温度変化によって前記吸着したイムノグロブリンを８０％以上溶出することが可能である、請求項１４に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体。
  16. 　膜状である、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体。
  17. 　中空糸状である、請求項１３乃至１６のいずれか１項に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体。
  18. 　ビーズ状である、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載の温度応答性プロテインＡ固定化担体。
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