JP3890625B2 - スーパー抗原吸着材料 - Google Patents
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Description
【発明が属する技術分野】
本発明は、黄色ブドウ球菌毒素や連鎖球菌毒素等のスーパー抗原を、選択的に吸着するスーパー抗原吸着材料、およびその材料を用いた体液浄化や感染症の治療に用いるカラムあるいは創傷被覆材料に関する。特にヒト血液中等の高蛋白濃度溶液から選択的にスーパー抗原を吸着除去するのに好適に用いられる。
【0002】
【従来の技術】
スーパー抗原とは、従来の抗原と異なり、抗原提示細胞内におけるプロセッシング過程を経ることなく、抗原提示細胞上の主要組織適合性抗原クラスII蛋白(以下、「MHCクラスII」と言うことがある)に結合し、さらにはこのMHCクラスIIとの複合体を形成することにより特定のV領域を有するT細胞を刺激し、免疫系を異常に活性化させる化合物であり、敗血症時の発熱、発疹、血圧低下や食中毒時の嘔吐あるいは自己免疫疾患の誘発等を引き起こすとされている。スーパー抗原としては、黄色ブドウ球菌外毒素や連鎖球菌外毒素、あるいはある種のウイルス蛋白やヒートショック蛋白が確認されているが、今後も特定化されていく可能性がある。
【0003】
もし、スーパー抗原を選択的に吸着することができる材料が存在すれば、これを用いて血液、尿等の体液や食料品、飲料物中からスーパー抗原を除去することが可能となり、食中毒、敗血症や自己免疫疾患の治療や発症を予防することが可能になる。
【0004】
これまで、これら毒素を選択的に血液中や培養液上清から吸着するための結合物質には、毒素に対する抗体や、黄色ブドウ球菌外毒素に対する主要組織適合性抗原クラスII蛋白質等の高親和性ポリペプチドが固定されたカラム材料が用いられてきた。
【0005】
しかし、これらの結合物質はペプチドあるいは蛋白質であることが多く、その結果、高価である,滅菌により失活しやすい等の欠点を有していた。
【0006】
また、毒素蛋白質を精製するために培養上清よりイオン交換樹脂を用いて毒素を吸着してくる方法も知られているが、この方法では、溶液のpHの影響を受けやすく、血液や食料品等でpHを中性に保つ必要性のある場合には特異性が低く、血液中等の高蛋白質溶液から微量の毒素を溶液組成を変化することなく吸着するには不適当である。
【0007】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明はこれら従来技術の欠点を解消しようとするものであり、選択性に優れ、滅菌による失活がなく、かつ安価であるスーパー抗原の吸着材料を提供することを目的とする。さらに、本発明の目的は、該材料を用いたスーパー抗原除去用の体液浄化モジュールおよびスーパー抗原吸着性の創傷被覆材料を提供することにある。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、黄色ブドウ球菌外毒素等のスーパー抗原が疎水性相互作用を強く有する官能基に対して選択的に吸着する性質を見出し、種々の官能基を検討した。その結果、上記目的を達成するために、本発明は下記の構成を有する。
【0009】
「(1) 下記構造を側鎖に有するポリマからなるスーパー抗原吸着材料。
【0010】
−(CH2 )n−Y [I]
(nは、1以上、20以下の整数、Yは、1級、2級、3級あるいは4級のアミノ基を示す。)
(2) 下記構造を側鎖に有するポリマからなるスーパー抗原吸着材料。
【0011】
−R−(CH2 ) n−R’−Y [II]
(nは0または1、R,R’は、ベンゼン環、シクロヘキサン環及びその誘導体から選ばれる1種,Yは1級、2級あるいは3級のアミノ基を示す。)」
本発明においてポリマ成分としては特に限定なく、ナイロン、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリテトラフルオロエチレンなどの合成高分子材料や、セルロース、コラーゲン、キトサン及びその誘導体を含む天然高分子材料等が好ましく用いられ、これらポリマは、単独重合あるいは共重合、また、ブレンドしても用いることができる。さらに、本発明の材料においては、後述の式[I]あるいは[II] で示される側鎖を有するが、かかる側鎖の導入のし易さを考慮すると、前記ポリマとして、アミノ基やカルボキシル基を有する高分子材料が特に好ましい。また、本発明においては、これらアミノ基やカルボキシル基を有しない材料の表面を、アミノ基やカルボキシル基を有する材料で被覆して用いることも好ましい。
【0012】
また、本発明の材料は、体液浄化カラム、創傷被覆材、免疫学的な測定材料などとして好ましく用いられる。その形状としては特に限定はないが、カラムとして用いる場合にはビーズ、繊維、中空繊維、織物等が好ましく、また、免疫学的な測定に用いる場合には、ビーズ、プレート、チューブ等の形状が好ましく、創傷被覆材料の場合は、織物あるいはフィルム等の形状が好ましい。さらに、本発明の材料には、例えば、金属、セラミックス、ガラスなどの無機材料などに、前記ポリマを被覆した材料も含まれる。
【0013】
本発明においては、スーパー抗原を吸着するために、上記ポリマの側鎖に、
−(CH2 ) n−Y [I]
(nは、1以上、20以下の整数、Yは、1級、2級、3級あるいは4級のアミノ基を示す。)、
あるいは
−R−(CH2 ) n−R’−Y [II]
(nは0または1、R,R’は、ベンゼン環、シクロヘキサン環及びその誘導体から選ばれる1種,Yは1級、2級あるいは3級のアミノ基を示す。)
を有する。
【0014】
これら[I]あるいは[II]で示される官能基として、[I]としては、アミノヘキシル基、モノメチルアミノヘキシル基、ジメチルアミノヘキシル基、アミノオクチル基、アミノドデシル基などが挙げられる。また、[II]としては、p−(β−p−アミノフェニルエチル)フェニル基、p−(p−アミノフェニルメチル)フェニル基、4−(4アミノシクロヘキシルメチル)シクロヘキシル基、p−(β−p−モノメチルアミノフェニルエチル)フェニル基等が挙げられる。
リガンドの結合法としては、一般に公知の方法が用いられる。例えば、1級アミノ基を有する材料に、1級アミノ基に対して過剰量、つまりはアミノ基1モルに対して2モル以上、好ましくは5モル以上のヘキサメチレンジイソシアネートや4,4’−ジフェニルメタンジイソシアネート,ナフタレンジイソシアネート、1,4ジシクロヘキシルジイソシアネート等の有機ジイソシアネートを反応させた後、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基性水溶液あるいは熱水で処理し末端の未反応イソシアネート基を加水分解し1級アミノ基を得る方法が挙げられる。
【0015】
あるいは、イソシアネート基あるいはカルボキシル基あるいはスクシンイミド等のカルボン酸の活性エステル基を有する材料にヘキサメチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン、4,4’ジフェニルメタンジアミン等のジアミン類をイソシアネート基あるいはカルボキシル基あるいはスクシンイミド等のカルボン酸の活性エステル基に対して過剰量、つまりはアミノ基1モルに対して2モル以上好ましくは5モル以上反応させることも挙げられる。
【0016】
溶媒としては、上記の有機ジイソシアネートや有機ジアミン類が溶解する極性溶媒、例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、nブタノール等のアルコール類やアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類が使用できる。
【0017】
有機ジイソシアネートおよび有機ジアミンの反応時間及び温度に関しては限定はないが、用いた極性溶媒の沸点以下の温度において30分から24時間の温度が好ましい。また、アミノ基の2級、3級および4級化としては、ヨウ化メチルなどのハロゲン化アルキルやジメチル硫酸を反応させることにより容易に行える。
【0018】
以下に実施例を用いて詳細に説明を加えるが発明の内容が実施例に限定されるものではない。
【0019】
【実施例】
実施例1
疎水性基を付加したキトサンビーズによるスーパー抗原のバッチ法のよる吸着試験を以下の通り行った。
【0020】
粒径0.1mmのキトサンビーズ(富士紡(株)製、“キトパール”AL−01)12ml(沈降時体積、乾燥時重量は1.0g)をジメチルホルムアミド中で撹拌する。この操作を1回20分間、4回繰り返し、含水水分をジメチルホルムアミドと完全に置換させた。
【0021】
このビーズを10gのヘキサメチレンジイソシアネートを溶解させた1リットルのジメチルホルムアミドに徐々に添加し、撹拌しながら室温で1時間反応させた後、これらを取り出し、別々に準備しておいた1リットルのジメチルホルムアミド中に入れて20分間洗浄操作を行い、この洗浄操作を3回繰り返し未反応ヘキサメチレンジイソシアネートを完全に除去した。次いで、水洗を4回行い、ジメチルホルムアミドを水と置換し、さらに0.1Mの水酸化ナトリウム溶液と撹拌しながら室温で20分間反応させイソシアネート基を1級アミノ基に加水分解し、さらに水洗を4回行い、最後に80℃の水中で20分間浸漬し、次の構造式を有するキトサンビーズを得た。
【0022】
【化3】
この修飾キトサンビーズおよびコントロールとしての未修飾キトサンビーズを用いて、ウサギ血漿中の3種のスーパー抗原、黄色ブドウ球菌外毒素B(SEB)及び外毒素C(SEC)及びトキシックショックシンドロームトキシン1(TSST1)の吸着除去を行った。スーパー抗原の初期濃度は1ng/mlとし、血漿量10mlに対して上記のキトサンビーズ1mlを添加し、37℃において60分間振盪し、反応前後のウサギ血漿中の3種のスーパー抗原濃度を酵素免疫学的に測定した。60分後のウサギ血漿中のスーパー抗原濃度を表1に示す。この結果が示すように、化学修飾によりキトサンビーズにスーパー抗原吸着能が付加されることが示された。
【0023】
【表1】
実施例2
疎水性基を付加したキトサンビーズによるスーパー抗原の循環法による吸着試験について以下のとおり行なった。
【0024】
粒径0.1mmの実施例1と同様のキトサンビーズ12ml(沈降時体積、乾燥時重量は1.0g)をジメチルホルムアミド中で撹拌する。この操作を1回20分間、4回繰り返し、含水水分をジメチルホルムアミドと完全に置換させた。
【0025】
このビーズを15gの4,4’−ジフェニルメタンジイソシアネートを溶解させた1リットルのジメチルホルムアミドに徐々に添加し、撹拌しながら室温で1時間反応させた後、これらを取り出し、別々に準備しておいた1リットルのジメチルホルムアミド中に入れて20分間洗浄操作を行い、この洗浄操作を3回繰り返し未反応4,4’−ジフェニルメタンジイソシアネートを完全に除去した。次いで、水洗を4回行い、ジメチルホルムアミドを水と置換し、さらに0.1Mの水酸化ナトリウム溶液と撹拌しながら室温で20分間反応させイソシアネート基を1級アミノ基に加水分解し、さらに水洗を4回行い、最後に80℃の水中で20分間浸漬し、次の構造式を有するキトサンビーズを得た。
【0026】
【化4】
この修飾キトサンビーズおよびコントロールとしての未修飾キトサンビーズを用いて、実施例1同様にウサギ血漿中のスーパー抗原(TSST1)の循環方法による吸着除去を行った。スーパー抗原の初期濃度は1ng/mlとし、血漿量10mlに対して上記のキトサンビーズ1mlを添加し、37℃において60分間反応させ、5分,15分,30分,45分,60分後のウサギ血漿中の3種のスーパー抗原濃度を酵素免疫学的に測定した(図1)。このように、化学修飾によりキトサンビーズに体外循環のような流動条件下におけるスーパー抗原吸着能が示された。
【0027】
比較例1
3種の疎水性ビーズによるスーパー抗原吸着試験につき、以下の通り行った。
実施例1で作製した疎水性キトサンビーズ及び市販の疎水クロマトグラフィー用ビーズであるブチルトヨパール(東ソー(株))及びフェニルセファロース(ファルマシア バイオテク(株))を用いて3種のスーパー抗原、SEB、SEC、TSST−1の吸着試験を行った。スーパー抗原の初期濃度は1ng/mlとし、血漿量10mlに対して上記のビーズ1mlを添加し、37℃において60分間振盪し、反応前後のウサギ血漿中の3種のスーパー抗原濃度を酵素免疫学的に測定した。その結果を表2に示す。
【0028】
【表2】
このように、他の疎水性のビーズに比較しても本発明のリガンドを有するビーズはスーパー抗原に対して高い結合活性があることが示された。
【0029】
【発明の効果】
本発明により、選択性に優れ、滅菌による失活がなく、かつ安価であるスーパー抗原の吸着材料が提供された。本発明の吸着材料を用いて、各種スーパー抗原を選択的に効率よく除去できるので、血液、尿等の体液や食料品、飲料物中よりスーパー抗原を除去するために用いることができ、これにより、除去カラムや創傷被覆材料を構成することで食中毒、敗血症や自己免疫疾患の治療や発症を予防することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】循環法によるスーパー抗原吸着試験の結果を示す。
Claims (8)
- 下記構造[I]を側鎖に有するポリマからなるスーパー抗原吸着材料。
−(CH2 )n−Y [I]
(nは、1以上、20以下の整数、Yは、1級、2級、3級あるいは4級のアミノ基を示す。) - 請求項1または2記載のスーパー抗原吸着材料を用いた体液浄化カラム。
- 請求項1または2記載のスーパー抗原吸着材料を用いた創傷被覆材。
- 下記構造[II]を側鎖に有するポリマからなるスーパー抗原吸着材料。
−R−(CH2 ) n−R’−Y [ II ]
(nは0または1、R,R’は、ベンゼン環、シクロヘキサン環及びその誘導体から選ばれる1種,Yは1級、2級あるいは3級のアミノ基を示す。) - 請求項5または6記載のスーパー抗原吸着材料を用いた体液浄化カラム。
- 請求項5または6記載のスーパー抗原吸着材料を用いた創傷被覆材。
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