JPH01157000A - 凝固因子の単離方法およびそれに適した吸着剤 - Google Patents

凝固因子の単離方法およびそれに適した吸着剤

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JPH01157000A
JPH01157000A JP63202624A JP20262488A JPH01157000A JP H01157000 A JPH01157000 A JP H01157000A JP 63202624 A JP63202624 A JP 63202624A JP 20262488 A JP20262488 A JP 20262488A JP H01157000 A JPH01157000 A JP H01157000A
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Bondewyn W Koenig
ボウデイウイン　ウイナンド　ケーニツグ
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ウイルレム　ゲラード　ヴアンエイケン
Adriaan Bantjes
アドリアン　バンツジエス
Tom Beugeling
トム　ベウゲリング
Booy Marcelinus P W M Te
マルセリナス　ペトラス　ウイルヘルマス　マリア　テボーイ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、凝固因子の単離方法に関し、さらに詳しくは
、液体クロマトグラフィを用いて血漿、血漿製剤、細胞
溶解液（ｃｅｌｌ　Ｉｙｓａｔｅｓ）　、およ゛び発酵
または培養の培地などの開始物質から、血液凝固因子Ｆ
Ｉ［、Ｆ■、Ｆ■、Ｆ’ｓ、ＦＸおよびフォノ・ビルプ
ラント因子（以下、ｖ　Ｗ　Ｆと略記する、文献ではＦ
ｖｌＲで示されることもある）などの凝固因子を単離す
る方法に関する。
また本発明は、前記単離方法に使用される吸着７ＦＩＪ
に関し、該吸着剤は時にアフイニテイマトリックス、ヒ
ドロゲル、またはゲルなどの術語で呼ばれ、さらに吸着
剤は高分子支持体を合み、その高分子支持体にはスペー
サを介して第１、第２、第３、または第４末端アミノ基
から成るリガンドが連結される。
従来の技術 ヒトおよび動物の血液は、血液の凝固または血液が凝固
する過程に関連する少量のさまざまな物質を含む。様々
な理由からこれらの物質が、できるだけ高い収率および
できるだけ高い純度で血液（または他の適当な開始物質
）から単離される方法に対する要求がある。たとえば血
漿中に存在する蛋白質性の因子■（文献ではＦ■と呼ば
れることもある）は、有効な血液凝固過程に必要な１３
種の凝固因子のうちの１つである。オランダにおける約
１０００人（血友病Ａ患者）においては、この凝固因子
が完全にまたは部分的に欠如または効力がなく、それに
よって彼らの血液は正常に凝固することができない。血
友病はヒトの供与血液から精製される因子■の製剤で治
療される。現在の精製方法の収率は大変低く（＜４０％
）かつ製剤に対する要求が増大しているので、世界中を
通じて因子■が不足している。
血液を基とした開始物質から液体クロマトグラフィを用
いてＦ■および／または他の凝固因子および蛋白質を単
離する様々な方法が知られている。
これらの既知の方法の中には、単離のためにＤＥＡＥセ
ルロースおよびＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　５ｅｐｂａｄｅｘなど
の在来の陰イオン交換剤を用いたものがあり；特定の高
分子電解質を利用したちの；および変性Ｓ　ｅ　ｐ　ｌ
＋　ａ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅを用いたものがある。これらの
様々な既知の方法が以下により詳しく考察されるであろ
う。
在来の陰イオン交換剤 ＤＥＡＥセルロースおよびＤ　Ｅ　Ａ　ＥＳｅｐｈａｄ
ｅｘなど在来の陰イオン交換剤は、１９６０年代に因子
■の濃縮物の精製においてよく用いられていた。
それらは（幾分、今日では用いられないが）、よく知れ
たしばしば用いられる結合方法によって置換ジアミン（
ジエチル−アミノ−エチルアミン）が結合されたマトリ
ックスである。しかし、因子■の精製および単離のため
にこれらのマトリックスを使用することは、これらのゲ
ルの多くの不都合から廃止されて、ここ数年はほとんど
使用されていない。
文献：　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｄｉａｔｈ、Ｈａｅｎｏｒｒｌ
＋、　３　（１９５９）　５７２　；　４（１９６０）
　２１１；　６（１９６１）　２８２；　１６（１９６
６）　７３８−７５１゜高分子電解＠　　ＥＭＡ　　Ｐ
Ｅ−５およびＰＥ−１９７０年代にＪｏｈｎｓｏｎによ
って導入されたＥＭＡ　　高分子電解質は、またジアミ
ン（ジメチル−アミノ−プロピルアミン）が結きされた
高分子物質から成り、したがってまた陰イオン交換剤に
属する。そのリガンド密度は高く、そして高分子電解質
によって異なる。！！択されるマトリックス（エチレン
と無水マレイン酸の共重合体）はあまり一般的ではない
、化学構造における本質的な特徴は、Ｎ、Ｎ−ジメチル
アミノプロピルアミド基であり、その弱塩基性（ｐＫａ
＝５．４）によりｐＨ６〜７において部分的に正に帯電
している。
２つの異なる高分子電解質が用いられる＝　１）ＰＥ−
１００は、無水マレイン酸を単位として実質的に１００
％がアミンと置換されている。ｐＨ８，０で凝固因子■
、■、■およびＸは血漿からＰＥ−１００に吸着され、
そして、高分子電解質の洗浄後、ｐＨ６で１．５Ｍの塩
化ナトリウムで溶出される。
２）ＰＥ−５は、無水マレイン酸の５％がアミンと置換
されている。ｐＨ６でＦ■：Ｃは吸着され、溶液中には
ｖ　Ｗ　Ｆが残る。ＰＲ−５の洗浄後、Ｆ■：ＣはｐＨ
７，４で１．５Ｍ塩化ナトリウム中に１．０Ｍリジンで
収率４３％および５２回の精製で溶出される。その上澄
み液は再び（他の条件で）ＰＥ−１ｏｏ　（ＰＨ６，０
）と接触されることによって、ｖ　Ｗ　Ｆもまた７１回
の精製において４３％の収率で単離される。
実験から、最初Ｆ■は静電気的相互作用によってＥＭＡ
ＰＥに結合していたが、疎水性相互作用の後、その結合
は強化されることが結論された。
これは溶出を困難とし、それによって収率は相対的に低
下する。さらに、リジンは安定化の効果を有し、ヘパリ
ンを加えることによって収率が増加され、その間は肝炎
Ｂ型ウィルスの力価が減少する。
血液の触媒接触特性およびこれらのＥＭＡ高分子電解質
の機械的特性はどちらも良好でなく（凝固活性化、低い
特異的吸着性、低通過性および低懸濁性）、それらは主
にポルシンの血漿からのＦ■の単離あるいは低温法ｒｉ
物の精製に用いられている。
文献：　Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｈｅｄ、９２　（１９
７８）　１９４−２１０　；　ＵＳ−＾−４，３９７，
８４１　；　ＵＳ−＾−４，４７１．１１２゜変性５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅｓ 一般式（５ｅｐｈａｒｏｓｅ−０−Ｃ（二ＮＨ）−ＮＨ
−（ＣＩ＋２）ｓ−ＮＨ２）を有するＡ　Ｈ−５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　（アミノヘキシル−５ｅ　ｐ　ｂ　ａ　ｒ
　ｏ　ｓ　ｅ　）は最初、アミンと蛋白質のカルボキシ
ル基との共有結合によって蛋白質を固定化するためにＰ
ｂａｒｍａｃｉａによって導入された。しかし、この第
１アミンの強塩基性（ｐＫａ＝９．９）によって、その
ゲルはまた陰イオン交換剤に分類され、またそのように
作用する。
因子■の分離のために、この後者は＾ｕｓｔｅｎによっ
て発表された研究から明らかにされている。８゜６ｍｌ
のＡ　Ｈ−５ｅｐｂａｒｏｓｅ　４　Ｂで、Ｆ■は約３
５％の収率でＦ■の濃縮物（６００ＩＵ）から７０倍（
１，８ＩＵ／ｒｎｇ）に精製される。吸着はｐＨ５，５
の０．１Ｍ酢酸塩／リジン中において行われ；溶出はこ
の緩衝液中で０〜ＩＭ塩化ナトリウムで行われ；Ｆ■：
Ｃとｖ　Ｗ　Ｆとの分離が行われる。Ａ　Ｈ−５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅは、＾ｘｅｎ法によって１゜６−ヘキサンジ
アミンをＣＮＢｒ−活性５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂに
結合させることによって調製され、リガンド密度は約７
μｍｏｌｅｓ／ｍＮとされる。ｆ１加的な疎水性相互作
用は除外できないけれども、Ｆ■のゲルへの結合は静電
気的である。
精製後の肝炎ウィルスＢ型の力価は初期値の１／６０で
あることがまた明らかにされた。
同じ時期に、一般式 ％式％ Ｓ　ｅ　ｐ　Ｉ＋　ａ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅがＶｕｋｏｖｉ
ｃｌ＋らによって研究された。このブチル−５ｅｐｌ＋
ａｒｏｓｅは１−ブタンアミンの活性化ＣＮ　Ｂ　ｒ　
−５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅ　４　Ｂへの結合によって調製
された。血Ｍ＜１０ｍ１＞は、ｐｉ（７，４の１ｒｎ　
Ｍクエン酸緩＠液中に２０ｍＭ）リスで５倍に希釈され
、ブチル−Ｓ　ｅ　ｐ　Ｉ＋　ａ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅカラ
ム（２０ｍｌ）へ性態された。これによって凝固因子ｎ
、ｖ、■。
■、　ＩＫおよびＸが定量的に結合される。溶出は緩衝
液中においてＯ〜２Ｍ塩ｆヒナトリウムで効果的である
。Ｆ■は０．３〜０．６Ｍ塩化ナトリウムで２３回の精
製で約６０％の収率で溶出され、他の凝固因子から分離
された。その結果をもとにして、Ｆ■のブチル−５ｅｐ
ｌ＋ａｒｏｓｅとの疎水性相互ｆヤ用が結論され、静電
気的反応は充分に除外された。
その後、Ｍｏｒｇｅｎ　ｔｈａ　ｌｅｒはＦ■のさまざ
まな置換Ｓ　ｅ　ｐ　ｌ＋　ａ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅとの結
合特性を明らかにするために系統的な研究を行った。ア
ミノアルキル−Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅの
同族列が調製され、＾ｕｓｔｅｎの研究と同じ条件（ｐ
Ｈ５，５）の下で試験が行われた。
同時に、アルキル−Ｓ　ｅ　ｐ　Ｉ＋　ｉ　ｒ　ｏ　ｓ
　ｅの同族列が調製され、同様な条件の下、かつまた、
疎水性相互作用に好適な条件の下で研究が行われた。こ
れら両方の同族列は、問題のアミンを活性化ＣＮＢｒ−
５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅ　４　Ｂに結合されることによっ
て調製された。
鎖長が増加すると、より多くのＦ■：Ｃと蛋白質とがア
ミノアルキル−Ｓ　ｅ　ｐ　ｌ＋　ａ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅ
に結合され、これらは高い塩化ナトリウム濃度で溶出さ
れた。
Ｆ■：Ｃは、アミノヘプタンおよびアミノ−ノナン−５
ｅｐｈａｒｏｓｅからは溶出されなかった。アルキル−
５ｅｐｈａｒｏｓｅへの吸着は、アミノアルキル−５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅへの吸着と特に異なることはなかった。
蛋白質をあまり含まないエチレングリコールグラジェン
ト（０〜５０％）では、Ｆ■；Ｃは溶出されなかった。
塩の濃度を増大させることによって、Ｆ■：Ｃが結合し
た蛋白質は比較的短い鎖から溶出されたが、比教的長い
鎖では溶出されなかった。
疎水性相互作用は、吸着に対して応答するものと考えら
れ、一方アルキルーＳ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｒ　ｏ　ｓ　
ｅの同族列においては静電気的な相互作用は充分に排除
された。
Ｖｕｋｏｖｉｅｌ＋とＭｏｒｇｅｎｔｌ＋ａｌｅｒは、
Ｆ■と使用されたアルキル−５ｅｐｈａｒｏｓｅとの相
互作用は疎水性相互作用に基づいていると仮定した。こ
のことは、彼らが溶出を高い塩化ナトリウム濃度で達成
できたという事実と矛盾する。
同じ時期に文献および我々の研究から、アミンの活性化
ＣＮ　Ｂ　ｒ　　５ｅｐｈａｒｏｓｅへの結きはイソ尿
素結きで行われ、それは弱アルカリ性（ｐＫａ＝８）で
あるから、ＣＮＢｒ活性化をとおして、ＪＱ　？Ｊされ
たアルカリ−５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅとの静電気的な相互
作用が排除されることはないことがわかった。
要約すれば、Ｆ■：Ｃは（アミノ）アルキルリガンドと
の相互作用を示すが、しかし、この相互作用の特性はあ
まり明らかではないということが結論される。さらに、
長鎖に対する強結合は、鎖が長いことに加えて、これら
の鎖がまた疎水性であるためなのか、それとも立体障害
が少ないために大きなＦ■：Ｃの分子に対してより近付
きやすいためであるかどうかは明らかでない。また、Ｆ
■：Ｃと他の血漿蛋白質との結合において、「リガンド
密度」がどのような効果を有するかはこれまでに研究さ
れてきていない。
結合の働きについての知識、それは「より良い」結合剤
の開発をもたらし重要であることに加えて実用的な有用
性がある。一方、このことについて主にＡ　Ｈ−５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅに対して注意を向けた文献もある。
一般的にいえば、使用される緩衝液のＰＨが収率と純度
の両方に効果を有するということがいわれている。最も
よく用いられるｐＨは５．５である。これは低ｐＨでは
蛋白質は一般的にあまり負には帯電せず、他方ゲルに帯
電した正の電荷は変化せず、より高ＰＨでは蛋白質はあ
まり吸着されないからである。このことはＦ■（低いｐ
Ｉ）に対して低い程度で適用されることがわかっている
ので、このことはゲルの特異性を増長（より高い精製）
させ得る。しかし、低Ｐ）（ではＦＩ［ｌ、Ｃはあまり
安定でないので収率が低下する。
Ｆａｕｒｅらは、安定剤のけ加によってこの問題を解決
しようとした。サッカロースは、Ｆ■がＦＩＸａおよび
ＦＸと複合すること、およびそれゆえの蛋白質の加水分
解を避けるために加えられた。しかし、血漿ではこれは
あまり効果を示さない、、３０　ｍ　Ｉ　Ａ　Ｈ−５ｅ
ｐｂａｒｏｓｅでの２２４ｍ１血漿から、９回の精製で
収率は約４０％であった。
＾ｎｐｈｌｅＬｔは、ＰＨ６，８で血漿からの単離につ
いて記述している。安定剤を付加することなく、３２回
の精製で収率は３９％であった。吸着はｐＨ６，８の０
．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリジンに対して２
０ｍＭ）リス中で効果的であり、溶出は０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含むこの緩衝液中で溶出が行われた。０．１
％トラシロールに対して０．５Ｍベンズアミジンが付加
されると、蛋白質の加水分解は抑えられ、４８回の精製
で収率は９０％である。
文献：　Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｈａｅｍａｔｏｌ、４３　（１
９７９）６６９−６７４　；　Ｔｈｒｏ＋ａｂ、１ｌａ
ｅｎｏｓｔ、　４８　（１９８２）　４６−４８　；　
Ｆｏｌｉａ　ＨａｅｍａＬｏｌ、、Ｌｅｉｐｚｉｇｌ　
Ｏ７（１９７９）１４８　１５１　；　Ｔｈｒｏｓｂ、
Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、４７　（１９８２）　１２４−１
２７　；Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔ、２５７　（ｌ　９８３）
３８７−３９１　：　ＵＳ−Ａ−４，５０８゜７０９゜ 発明が解決しようとする課題 上述の先行技術の議論から明らかになったように、既知
の方法は全て低収率、低純度および／または単離精製物
の低安定性などのような１つまたは多くの不都合さを有
する。
本発明の目的は、特に収率、純度、および／または安定
性を格段に向上した、凝固因子の単離方法およびそれに
用いられる吸着剤を提供することであり、またこの目的
に対して好適な新しい吸着剤を提供することである。
本発明は、さらに特に１Ｌ血漿製剤、細胞溶解液（ｃｅ
ｌｌ　Ｉｙｓａｔｅｓ）および発酵または培養の培地な
どのような開始物質から液体クロマトグラフィを用いて
凝固因子を単離する方法において、特に高分子支持体を
含む吸着剤を使用し、その高分子支持体にはスペーサを
介して第１、第２、第３、または第４アミノ基から成る
リガンドが連結されており、該スペーサは少なくとも原
子６個分の鎖長を有し、該鎖中には親水性を有する少な
くとも１つのリンクが含まれていることを特徴とする凝
固因子の単離方法を提供することである。
ここで用いられる、親水性を有するリンクまたは親水性
リンクという術語は、鎖内の１つの基または元素を意味
する。
さらに本発明は、凝固因子の単離方法において使用され
る高分子支持体を含む吸着剤を提供するものであり、該
高分子支持体にはスペーサを介して第１、第２、第３、
または第４末端アミン基から成るリガンドが連結されて
おり、該吸着剤はそのスペーサが少なくとも原子６個分
の鎖長を有し、該鎖中には親水性を有する少なくとも１
つのリンりが含まれていることを特徴とする吸着剤であ
る。
前記吸着剤について、高分子支持体を合み、その高分子
支持体には少なくとも原子６個分の鎖長を有し、その鎖
中には少なくとも１つの親水性を有するリンクが含まれ
たスペーサを介してアミン基が連結された吸着剤もいく
つか知られている。
米国特許４，０９０，９１９にはアルキレン、ジアミン
をカルボキシメチル多糖と反応させて得られるアミノア
ルキル多糖が公表されており、酸素原子を介して高分子
支持体へ結合された側鎖は一般式 ％式％ る。しかしこの米国特許では、このような物質を凝固因
子の単離方法において使用することには言及されておら
ず、タンニンに対する水不溶性の支持体として提案され
ている。その明細書に従えば、この支持体へタンニンを
結合または吸着することによって水不溶性のタンニン化
合物が得られ、蛋白質の全種類に対して吸着剤として使
用できる。
さらに、ＬｏｓｅとＤｅａｎによるｒアフイニテイクロ
マトグラフイＪ（１９７４＞のｐｐ、２１８−２２０に
おいては、さまざまなタイプのスペーサが記載されてい
る。しかし、この著書もまた、ここでいう凝固因子の単
離方法における吸着剤の応用には言及していない。
したがってまた本発明の目的は、上述された凝固因子の
単離方法において好適に使用される吸着剤を提供するこ
とであり、その高分子支持体にはスペーサを介して第１
、第２、第３、および第４アミン基から成るリガンドが
連結され、該スペーサは少なくとも原子６個分の鎖長を
有し、該鎖中には親水性を有する少なくとも１つのリン
クが含まれており、リガンド密度は膨潤マトリックス１
ｍｌあたり３０μｒ口ｏｌｅｓより高く、好ましくは膨
潤マトリックス１ｍｌあたり５０μｍ　ｏ　ｌ　ｅＳよ
り高いことを特徴とする吸着剤である。
課題を解決するための手段 本発明は、液体クロマトグラフィを用いて血漿、血漿製
剤、細胞溶解液（ｃｅｌｌ　１ｙｓａＬｅｓ）および発
酵または培養の培地などのような開始物質から凝固因子
を単離する方法であって、高分子支持体を含む吸着剤を
使用し、その高分子支持体にはスペーサを介して第１、
第２、第３、または第４アミノ基から成るリガンドが連
結されており、該スペーサは少なくとも原子６個分の鎖
長を有し、該鎖中には親水性を有する少なくとも１つの
リンクが含まれていることを特徴とする凝固因子の単離
方法である。
本発明は、前記スペーサが、−ｍには第１式：％式％（
１） ここでｍとｎは１〜６の値を有する整数を表しくｍ＋ｎ
）は少なくとも４である を満足することを特徴とする凝固因子の単離方法である
。
本発明は前記支持体が、ヒドロキシル基を含む高分子物
質であり、該ヒドロキシル基にはスペーサが第２式： ％式％（２） を有する結合基を介して連結されていることを特徴とす
る凝固因子の単離方法である。
本発明は前記支持体が、アガロースであることを特徴と
する凝固因子の単離方法である。
本発明は、前記リガンドが、第１アミノ基であることを
特徴とする凝固因子の単離方法である。
本発明はリガンド密度が、膨潤マトリックス１ｒｎ　１
当り３０　）ｔ　ｍ　ｏ　ｌ　ｅ　ｓよりも高く、好ま
しくは膨潤マトリックス１ｍｌ’当たり少なくとも５０
μｍ　ｏ　ｌ　ｅ　ｓであることを特徴とする凝固因子
の単離方法である。
本発明は吸着段階で、比導電率が２０　ｒｎ　Ｓ　／　
ｃｍ以下、好ましくは１３〜１６　ｒｎ　Ｓ　／　ｃ　
ｒｎであるＫｍ液および液体状の開始物質を使用するこ
とを特徴とする凝固因子の単離方法である。
本発明は、マトリックスと開始物質との体積比が１＝８
よりも小さく、好ましくは１：１２から１：２０である
マトリックスおよび開始物質を使用することを特徴とす
る凝固因子の単離方法である。
本発明は、緩衝液の導電率を、好ましくは塩化ナトリウ
ムを用いて、増大させることによって溶出が実現される
ことを特徴とする凝固因子の単離方法である。
本発明は、ｐＨを６〜８の範囲に、好ましくは約７に保
持することを特徴とする凝固因子の単離方法である。
本発明は、高分子支持体を合み、その高分子支持体には
スペーサを介して第１、第２、第３、または第４末端ア
ミン基から成るリガンドが連結された凝固因子の単離方
法に用いられる吸着剤であって、該スペーサは少なくと
も原子６個分の鎖長を有し、該鎖中には親水性を有する
少なくとも１つのリンクが含まれていることを特徴とす
る吸着剤である。
本発明は、凝固因子の単離方法において好適に用いられ
る吸着剤であって、高分子支持体を合み、その高分子支
持体にはスペーサを介して第１、第２、第３、または第
４アミノ基から成るリガンドが連結されており、該スペ
ーサは少なくとも原子６個分の鎖長を有し、該鎖中には
親水性を有する少なくとも１つのリンクが含まれており
、リガンド密度は膨潤マトリックス１ｒｎｌ当たり３０
μｍｏ１ｅｓより過剰であることを特徴とする吸着剤で
ある。
本発明は、リガンド密度が膨潤マトリックス１ｍ！当た
り５０μｍθｌｅｓよりも高いことを特徴とする吸着剤
である。
本発明は、前記スペーサが一般には第１式。
−（ＣＩ！２）輸−Ｃｏ　　Ｎｉｌ　　　（Ｃ１ｈ）ｎ
−・・・　（１）ここでｍとｎは１〜６の値を有する整
数を表しく　ｍ　＋　ｎ　）は少なくとも４であるを満
足することを特徴とする吸着剤である。
本発明は、前記支持体がヒドロキシル基を含む高分子物
質であり、その高分子物質には第２式：％式％（２） の結合基を介してスペーサが結きされていることを特徴
とする吸着剤である。
本発明は、前記支持体がアガロースであることを特徴と
する吸着剤である。
本発明は、前記リガンドが第１アミノ基であることを特
徴とする吸着剤である。
１Ｙ用 本発明に従う吸着剤の好ましい実施態様では、スペーサ
は一般には第１式： ％式％（１） ここでｍとｎは１〜６の値を有する整数を表しくｒｎ　
＋　ｎ　）は少なくとも４である。
を満足する。
さらに本発明に従えば、高分子物質はヒドロキシル基を
含む高分子物質であって、そのヒドロキシル基は第２式
： ％式％（２） を有する結き基を介してスペーサに連結される。
本発明に従う最も好適な吸着剤は一般には第３式： ％式％ ｍとｎは前記と同様な意味であり、Ｒ’とＲ２とはお互
いに独立にそれぞれ水素原子あるいは置換または置換さ
れていないアルキル、シクロアルキル、アリール、アラ
ルキルなどの炭化水素基を表す。
好ましくは、支持体は５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　　４
　Ｂ　（商品名）などのアガロースである。
好ましくは、リガンドは第１アミノ基から成る、すなわ
ち上述の第３式においてＲ１とＲ２が水素原子を表す。
本発明に従う好ましい実施態様では、吸着剤中のリガン
ド密度は膨潤マトリックス１ｍｌあたり３０μｒｎｏｌ
ｅｓより高く、好ましくは５０１１　ｍｏ１ｅｓ／ｍｆ
ｆ１より高く、最も好ましくは膨潤マトリックス１ｒｎ
ｌあたり６０〜１００μｒｎＯ１ｅＳである。
本発明に従う凝固因子の単離方法において、好ましくは
、吸着段階において２０　ｍ　ｍ　Ｓ　／　ｃ　ｍ以下
の比導電率、好ましくは１３〜ｌ　６　ｍ　ｒｎ　Ｓ　
／　ｃｍの緩衝液および液状水の開始物質が用いられる
。
さらに好ましい特徴は、に８より小さく、最も好適には
１：１２から１；２０のマトリックスと開始物質との体
積比が用いられることである。
また、緩衝液の導電率を、好ましくは塩ｆヒナトリウム
を用いて、増加することによって溶出が行われることが
好ましい。
ｐＨについては、好ましくは６〜８の値、最も好ましく
は約７の範囲にｐＨが保持されていることが望ましい。
凝固因子の単離における本発明による利点はリガンドと
して働くアミン基と支持体との間にスペーサを用いたこ
とが不所望な事態を招かないことであり、前記スペーサ
はよく知られたアミノヘキシル−５ｅｐｈａｒｏｓｅと
等しいか、またはそれよりも長＜、−Ｃｏ−ＮＨ−のリ
ンクのような親水性を有するリンクがスペーサ中に存在
することによって、より親水性とはなっても疎水性とは
ならないことである。
比較的長いスペーサを使うことによってＤＥＡＥ　−５
ｅｐｈａｄｅｘ、　Ｄ　Ｍ　Ａ　Ｐ　−Ｅ　Ｍ　Ａ　（
Ｊｏｌ＋ｎ５ｏｎ）　、ＡＨ−５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅ、
およびアミノブチル−５ｅｐｈａｒｏｓｅなどのような
凝固因子の精製に関する既知の物質と比較して同じリガ
ンド密度でＦ■−ｖ　Ｗ　Ｆ複合体に対する高い吸着容
量が得られる。その結果として所望の蛋白質の吸着はよ
り特異的となり、より純粋な精製物が得られる。
比較的親水性のスペーサ（メチレン基が６個リンクされ
たち・のよりも弱い）を使うことによって、たとえば同
じ吸着容Ｉｔ（すなわち、おそらくより低いリガンド密
度を有する）　Ａ　Ｈ−５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅと比較し
て吸着はより特異的であり、一方で、Ｆ■−ｖ　Ｗ　Ｆ
の溶出は同じ時間で比較してより良好である（すなわち
より高い収率、良再現性）。したがって、より純粋な精
製物をより高い収率で得ることができる。
本発明に従う吸着剤中の支持体は好ましくは、５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅＣＬ　　４　Ｂなどのアガロースであるが、
このような高分子物質には限定されない。好ましくは支
持体は次の要件を満たす。； （１）一般に支持体は血漿蛋白質と最低限の反応しか起
こさないこと。このことは吸着期間中にアフイニテイマ
トリックスの特異性を促進し、さらに溶出期間中に収率
を増大させる。；（２）支持体は広い内部表面積を有し
た大変広いメツシュの細孔構造を有していること。この
ことは高い吸着容量をもたらす。
〈３）支持体は化学的および物理的に高い安定性を有す
ること、このことはリガンドの結合、再使用に対する再
生の可能性、滅菌、カラム溶出、貯蔵などに関係して必
要とされる。
（４）支持体は高価ではなく、経済的に満足できるもの
であること。
現在、これらの要件を全て最適に満たす支持体は知られ
ておらず、数多くの非理想的な物質から還択が行われな
ければならない。基本的にはすべての水不溶性支持体が
多少Ｆ■の単離過程に適している。そのいくつかの例を
以下に示す。これらはすべてを尽くしているわけではな
い。
（１）架橋アガロース； （２）架橋エチレン／無水マレイン酸（ＨＭＡ）共重合
体； （３）セルロース； 〈４）トリサクリル； （５）フラクトゲル　ＴＳＫ　。
（６）ポリスチレン： （７）架橋ポリビニルアルコール； （８〉ポリアクリルアミド； くっ）シリカゲル； （１０）モノマーとしてアクリル酸を基とした架橋ポリ
マー（ＰＭＭＡ、ポリ−ＨＥ　Ｍ　Ａなど）（１１）架
橋デキストラン（５ｅｐｈａｄｅｘ　）実施例で示され
るＦ■の単離に対しては５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　　
４Ｂ＋５ｅｐｈａｒｏｓｅ　　ＣＬ　　２Ｂ。
５ｅｐｂａｃｒｙｌ　Ｓ　−４００、Ｓ−５００，Ｓ−
１０００およびＦｒａｅｔｏｇｅｌ　Ｔ　Ｓ　Ｋ　−Ｈ
Ｗ　５５が支持体として用いられた。
本発明に従えば、吸着剤中のリガンドは好ましくは、第
１アミノ基ＮＨ，であり、比較的高いｐＫ値を有し、そ
のために比較的高い６〜８のｐＨでリガンドの大部分は
たとえばＤＥＡＥ−Ｓｅｐｂａｄｅｘ　、Ｄ　Ｅ　Ａ　
Ｅ−セルロースおよびＤＭＡＰ−Ｅ　Ｍ　Ａ　（Ｊｏｈ
ｎｓｏｎ　）の場合よりも正に帯電している。したがっ
て同じ帯電密度（吸着容量）を実現するために、より低
いリガンド密度が要求される。
結果として、所望の蛋白質の吸着がより特異的になり、
より純粋な精製物が得られる。しがしリガンドは第１ア
ミン基に限られるものではない。−船釣にいえば、全て
のアミンが所望の目的に対して大なり小なり好適であり
、そのためにリガンドは実施例によって示されるように
選択的に第２、第３、あるいは第４アミノ基から構成さ
れる。
リガンドがスペーサを介して支持体に結合される仕方は
１つの特定の結合基および方法に限られたものではない
。原理的にはアミノ基がスペーサを介して支持体に固定
化される全ての方法が適している。しかし、好ましくは
、結合方法は次の要件を満足するものである； （１）結合は簡単に、迅速に、なおかつ再現性のある方
法によって行われること； （２）高い置換度（リガンド密度）が架橋を生じること
なく得られること； （３）反応条件は当然のことながらマトリックスに対し
て有害であってはならない； （４）得られる結合は非常に安定であり、リガンドが漏
出することがないこと。
たとえばアガロースについてそうであるように支持体が
遊離ヒロドキシル基を含む高分子物質であるとき、結合
はたとえば次の結合剤によって行われる。
（Ａ＞ハロゲン化シアン； （Ｂ）トリアジン： （Ｃ）過沃素酸塩； （Ｄ）（ビス−）エポキシド； （Ｅ）カルボキシアルキルハロゲンゴヒ物；（Ｆ）ジビ
ニルスルホン； （Ｅ）トレシルおよびトシル塩化物： （Ｈ）カルボニルジイミダゾール 最もよく用いられる結合方法の１つは、臭化シアンを適
用したものである。それはまた上記したアルキルおよび
アミノアルキル−５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅを調製するため
に用いられる。しかしこの方法は置換度に関する要件お
よび余分な電荷を持たないという要件を満たさない、し
がってあまり適したちのではない。安定性もまた良好で
はない、近年、Ｂｅｔｂｅｌｌら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｎ、２５４　（８）　（１９７９）２５７２−２５
７４；Ｊ、　Ｃｈｒｏｍ、１８５（１９７９）４６３−
４７０；Ｊ、　Ｃ１＋ｒｏ＋＊、２１８（１９８１）　
５０９−５１８）は前記要件を満足すると思われる方法
を開発した。１．１′−カルボニル−ジイミダゾール（
以下、ＣＤＩと略記する）が結合剤として用いられる。
最初の反応段階においては、マトリックスが活性化され
、第２段階においてはたとえばアミンが結合される。
活性化はアセトン、ジオキサンまたはジメチルホルムア
ミド（以下、ＤＭＦと略記する）などのような無水有機
溶媒中において行われる。ヒドロゲルは溶媒の交換によ
って活性化状態に移る。水酸化ナトリウムによって活性
化されたゲルの加水分解を通して、イミダシルおよび二
酸化炭素が形成され、それによって活性度が簡単な方法
によって決定される。活性化ゲルは有機溶媒中でも水溶
媒中でも他の化合物よりも高い収率でアミンと反応する
、したがってアミンを含む全ての種類のリガンドは簡単
な方法で結合され得る。結合は充分に再現性があり、高
いリガンド密度を形成することができる。形成されたカ
ルバミン酸エステル（ウレタン）結合は加水分解に対し
て非常に安定であり、４よりも高いｐＨで非帯電である
。
このＣＤＩを結合剤として用いた結合方法および得られ
る結合基−Ｃｏ−ＮＨ−は、したがって本発明に好適で
ある。
本発明に従う第３式分有するアフイニテイマトリックス
は、最初に直鎖アミノカルボキシル酸エステルのＣＤＩ
の活性化によって支持体に結きされ、次にエステルをジ
アミンで再エステル化して所望のゲルを生成することに
よって調製される。
ジアミンを遊離カルボキシル酸基に周知のカルボジイミ
ド結合によって結合させることもまた可能である。
本発明に従うアフイニテイマトリックスのリガンド密度
は好ましくは３０μｍｏｌｅｓ／ｍｅより高く、より好
ましくは５０　ｔｔ　ｍ　ｏ　Ｉ　ｅ　ｓ　／　ｒｎ　
１より高く、最も好ましくは膨潤ゲル１ｍｌあたり６０
〜１００μｍｏｌｅｓである。ＣＤＩ活性化方法によれ
ば、約２００μｍｏ　１　ｅ　ｓ／ｍ１と同様の高いリ
ガンド音度が容易に再現可能な方法で実現され得る。高
リガンド密度は、高吸着容量をもたらす。結果としてよ
り低いゲル／血漿比が可能となり、このことはより低コ
スト化をもたらす。
単離される凝固因子を含み本発明に従う方法において用
いられる液体状の開始物質は、好ましくは血漿であり、
さらに好ましくは新鮮なヒトの血漿または新鮮に冷凍さ
れたヒトの血漿である。単離方法に対しての前精製およ
び適応化（ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）は必ずしも必要では
ない０本発明は血漿を用いたものに限られるわけではな
いが、特にＦＶＫ濃縮物、低温沈澱物および特許ＤＥ−
Ａ−２，７１５，８３２に記述されているＤＥＡＥ−３
ｅｐｂａｄｅｘ　−Ａ　５０などのような陰イオン交換
剤で最初の前処理が行われた血漿などの（前精製された
）血漿製剤から、あるいは細胞溶解液（ｃｅｌｌＩｙｓ
ａｔｅｓ）およびＦ■または他の凝固因子の生物工学的
生産において得られる発酵または培養の培地などから所
望の物質を単離するために適用される。
本発明に従う単離方法は吸着段階および溶出段階を合み
、様々な条件は可能であるけれども、好ましくは常温、
常圧において実行される。したがって、重大な欠点がな
ければ、温度は０〜６０℃の範囲内に選択される、しか
し実用的な理由がら室温が好ましい。吸着段階および溶
出段階はともに回分式またはカラム式において実行され
る。しかじカラム方式における処理は溶出段階に関して
特に好ましい。吸着段階に関しては、四分式の処理が好
ましい。
時間に関してもまた特に制限はない。しかし吸着段階は
実際には少なくとも１０分で行われる。
アフイニテイマトリックスは使用される前に桜ｆｆ液に
よって平衡状態とされる。この＃ｙＵＥＩ液は好ましく
は単離されるべき凝固因子を含む液体状の開始物質が有
すると同じｐ　Ｉ−１および導電率を有する１本発明に
従う凝固因子の単離方法においては、ｐＨは単離過程の
間６〜８の値、々Ｔましくは約７の値に保たれることが
好ましく、緩＠液および液体状の開始物質の比導電率は
ともに２０　ｍ　Ｓ　／　ｃｍより小さく、好ましくは
１３〜１６　ｍ　Ｓ　／　ｃ　ｍであることが好都合で
あることが明らかとなった。
これらの精製条件は血漿などのような開始物質を用いる
ことによって可能となり、比較的高い収率をもたらすこ
とになる。このような精製条件、および特に生理学上の
ＰＨに近いｐＨを用いた精製条件はまた大規模な応用（
人足の血漿のｐＨを５゜５の値に調節するのは難しい）
に対しては好適であり、Ｆ■：Ｃなどのような単離され
るべき凝固因子の安定性に対しても好ましい。
ゲル／血漿比に関しては、その値が低いほど低コストお
よび高い特異的吸着に関連して好都合である。実際に、
本発明に従う精製において用いられる好ましいゲル／血
漿比Ｇ／Ｐは１／１２から１／３０などのように１／８
より小さい、好ましくは約１／２０である。約１単位／
　ｍ　１を含む血漿から始めた場合、１／２０のＧ／Ｐ
比とは、凝固因子の約２０単位がゲル１ｍｌ当たりに得
られるということを意味する。
吸着された凝固因子の溶出は、ＭｆＭ液の導電率の増加
によって有効にされる。これは好ましくは１ｆｌｌ液に
塩化ナトリウム（たとえば０．５または１．０Ｍになる
まで）を加えることによって実現される。しかし実施例
から明らかになるように、この目的のためには当然のこ
とながら他の方法も用いることができる。
ｉａの精製条件と開始媒質として用いられる血漿を組み
合わせることによって、Ｆ■−ｖ　Ｗ　Ｆと同様に凝固
因子Ｆ■、Ｆ■、ＦＸ、およびＦＸの複合体が比較的高
収率および高純度で単離される。
Ｆ■／　ｖ　Ｗ　Ｆの精製に加えてＦ■／　Ｆ　ＩＸ：
のｖＪ製を行わなければならない場合には、Ｆ■／　ｖ
　Ｗ　Ｆに付随するＦＩＩ、Ｆ■、Ｆ［、およびＦＸの
脱離は好ましくない。さらに特に脱離留分中のＦｉｌの
存在は、重量基準で無視できない不純物を構成してしま
う、したがってＦｎ、Ｆ■、Ｆ　ＩＸ、およびＦＸとＦ
■／　ｖ　Ｗ　Ｆとの分離がいずれにしても必要となる
。この分離は、必要ならば、同じ工程段階または引き続
く工程ｆ２階において実現される。ここで記述された物
質のＦ〜１／ｖＷＦの単離の前に分難を行うこともまた
可能である。血漿に対しては、この目的のためにＤ　Ｅ
　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｂａｄｅｘ　−Ａ　５０などの陰イ
オン交換剤が用いられる。この前処理の一実施例を示す
。
実施例 次の実施例中においておよび実施例によって本発明を説
明する。
吸着剤の調製に関する実施例 合成方法 以下記述される実験に従って、異なるアミンを用いて５
ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　　４　Ｂ　の誘導体が調製さ
れ、それらは特にクエン酸塩を添加したヒトの血漿（ｃ
ｉｔｒａｔｅｄ　ｌ＋ｕｍａｎ　ｂｌｏｏｄ　ｐｌａｓ
ｍａ　）から得られる凝固因子の単離に対して吸着剤（
アフイニテイ　マトリックス〉として用いられる。
５ｅｐｂａｒｏｓｅ　ＣＬ　　４　Ｂは、水中で懸濁の
状態で用いられる。合成に対して水は充分にＮ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと略記する）などの
ような有機溶媒によって置換されなければならない、こ
れは比較的少ない量ではグラスフィルタで回分式で、大
量の場合はカラム中で実現される。溶媒交換の後、Ｓ　
ｅ　ｐ　ｌ＋　ａ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅマトリックスは１．
１′−カルボニル−ジイミダゾール（以下、ＣＤＩと略
記する）でＢｅｔｌ＋ｅｌｌ　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、　２５４（１９７９）、　２５７２−２５７４＞に
よって記述された手順で活性化される。
その後、アミノ−アルカン酸は活性化ゲルと結合されて
、中間体としてのカルボキシアルキル−Ｓ　ｅ　＋３１
１　ａ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅが生成される。活性Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド（以下、ＮＨ８と略記する）エステ
ルがたとえば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミドを用いたカルボジイミド結きに
よって得られる。この活性エステルは容易にアルカンジ
アミンと反応し、これによって所望のアミノアルキル−
カルバミルアルキル−Ｓｅρｈａｒｏｓｅが分ｐ段君ま
たは同じ反応段暗において定量的な収率で得られる。
５ｅｐｂａｒｏｓｅの誘導体は全てリガンドとして塩基
性のアミノ基を含むので、リガンド密度は簡単に酸塩基
滴定または窒素元素分析によって決定される。
溶媒交換、これによって水はジメチルホルムアミドまた
は他の有機溶媒によって置き換えられる、は使用される
しドロゲルの量に応じて２つの異なる方法によって行わ
れた： １）−数的に言えば、ゲル懸濁液１２ｍ１　（１０ｍｌ
湿潤ケーク）はグラスフィルタ（Ｇ３）で蒸留水によっ
て３回洗浄され、充分に乾燥され引き続いて蒸留水／Ｄ
ＭＦ　７０　：　３０　（ｖ／ｖ　）で１度洗浄され、
３０ニア０で再び洗浄され、ＤＭＦで３度洗浄された。
この手順によって少量のヒドロゲルで効果的に水が置換
された。他の場合には、４００ｍ１までのゲル（懸濁液
４８０ｍ１）がガラスカラム（２６Ｘ７５０ｍｍ）に注
入され、カラムはカラム２本分の容積の蒸留水で洗浄さ
れる。この後、０〜１００％ＤＭｒ７の直線水／ＤＭＦ
グラジェント（４００ｍｌ）が性態されて水が置き換え
られ、最後にゲルはＤＭＦ約１約１マ積出液から完全に
水が無くなるまで（これは溶出液の水分析によってチエ
ツクされる）洗浄された。
ＣＤＩの活性ｆヒはＤＭＦと同量のゲル（ｖ／ｖ　）を
懸濁し、最初の水中のゲルの体積（たとえばゲル１ｍｌ
当たり０．１ｍｍｏｌｅｓ）に基づいて予め定められる
旦のＣＤＩを加えることによって行われた。懸濁は室温
において少なくとも２０分間注注意深撹拌または１辰と
うされて、活性化ゲルはグラスフィルタで同量のＤＭＦ
で３回洗浄された。
アミン結合は有機溶媒（ＤＭＦ、ジオキサン、アセトン
）中または水：容液中で行われ、それはアミンの溶解度
および得られるゲルの特性に依存する。この目的のため
に予め定められた量のアミン（−数的には必要とする全
リガンド密度ＴＬＤの少なくとも５倍）が溶媒の１容積
中に溶かされ、同じ容積の活性化ゲルに加えられ、引続
き必要な時間だけ室温で注意深く撹拌または振どうが行
われた。
カルボキシル基を含むアミンは蒸留水中に溶かされ、Ｐ
　Ｈが約１２．６になるまで溶液に水酸化ナトリウムの
粒剤が加えられた。カルボキシル基がエステル化される
と、そのエステルはＤＭＦ　（５ｍｌ／ｇ）中で溶解さ
れ、トリエチルアミン（以下、ＴＥＡと略記する）の等
モル量が撹拌された溶液中に滴加され、塩化水素は中和
された。トリエチルアミン・ＨＣｌは沈澱し沢過によっ
て除去された。
水溶液中でアミンのＮ　Ｉ−Ｉ　Ｓ−ゲルへの結合のた
めに（後述されるカルボジイミド結合を参照）、０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ８，４の０゜１Ｍ炭酸水素
ナトリウム緩衝液が溶媒として用いられた。結合期間は
１５０分であった。
結合後の過剰のアミンを取り除くために、ゲルは結合し
たアミン（すなわちカルボキシル基を有するかまたは有
しないか）および特定の応用（すなわち、引続く活性化
、滴定、試験）に依存して、０、ＩＮ塩酸、０．ＩＮ水
酸化ナトリウム、および蒸留水の溶媒で洗浄された。
ｎ−アミノ−アルカンカルボキシル酸−エチルエステル
のＣＤｌ−活性化ゲルへの結合の後、遊離酸はエチルエ
ステルの加水分解によって得られた。この目的のために
ゲルは乾燥され、当初のゲル体積の２イΔの体積の０．
５Ｎ水酸化ナトリウム中で懸濁された。懸濁液は室温で
６時間装置され、その後ゲルはグラスフィルタでＩＮ水
酸化ナトリウムで洗浄され、蒸留水で２度洗浄された。
引き続きカルボキシゲルはリガンド密度（以下、ＬＤと
略記する）を決定するために滴定が行われた。
カルボジイミド結合は、等容量の溶媒、この溶媒は蒸留
水、８０　：　２０　（ｖ／ｖ）ＤＭＦ／ジオキサン、
またはＤＭＦ、中にカルボキシル基が含まれるゲルを懸
濁させることによって行われた。
溶媒の交換が必要な場合もある。Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミド（以下、ＮＨ３と略記する）および１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミ
ド（以下、ＥＤＡＣと略記する）が加えられ、懸濁液は
室温で１８〜２０時間振とうされた。−数的に言えば、
カルボキシゲルの全リガンド密度に対してＮＨ３の量は
６〜１０倍およびＥＤＡＣの量は４〜８倍である。
ここで水は溶媒として用いられ、０．ＩＮ塩酸はｐＨが
４．１になるまで加えられ、このｐＨは３０分間一定に
保たれた。
反応の後、ゲルはグラスフィルタ（Ｇ３）において溶媒
＜１ｍＭ　　ＨＣｌを含む水またはＤＭＦ）で３度洗浄
され、過剰のＮＨ３およびＥＤＡＣが取り除かれ、その
後Ｎ　ＨＳゲルはアミンの結合のために使われた。
ヒドロゲルは０．０１％のｔｈｉ請ｅｒｏｓａｌを含む
リン酸エステル緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆ
ｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ以下、ＰＢＳと略記する）中で
、また時にはＰＢＳの代わりに吸着緩衝液中で４℃に保
たれた。
滴定は通常４〜８ｍｌヒドロゲルで行われた。
ゲルの体積は１５００Ｘｇおよび３０分の待ち時間で１
０分間遠心分離された後決定された。ゲルは０．０５Ｎ
水酸化ナトリウムで３度洗浄することによって平衡状態
とされ、グラスフィルタで乾燥させられて蒸留水５０ｍ
中で懸濁させられ撹拌された。その後、Ｏ，１００Ｎ塩
酸が流量０，１２５ｍ１７ｍ１ｎ、で加えられ、ｐＨお
よび導電率が測定され記録された。イオン交換容量（帯
電したリガンドに対してはこれは全リガンド密度（ＴＬ
Ｄ）に等しい）は導電率の曲線（これは明らかに開始地
点と滴定の終端を示す）およびゲル体積から計算され、
見かけ（ａｐｐａｒｅｎ　ｔ　）のｐ　Ｋ値は導電率５
　ｍ　Ｓ　／　ｃ　ｍでの滴定のｐＨ曲線の中途から得
られた。既知のゲル体績に対してリガンド密度（ＬＤ）
が計算された。
ゲル誘導体のゲル体積（以下、ＧＶと略記する）は他の
方法で示されない限りＰＢＳ中で決定された。ｒｎ　１
目盛の１５ｍ１ポリスチレン管中で約７ｍｌのゲル懸濁
液が２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。その後
沈澱したゲルは室温で少なくとも１５分間静置され、体
積が（±０．２ｍ１単位で）読み収られた。ゲルが有機
溶媒中（ＤＭＦのような）に存在する場合は、通常水溶
液中での当初の体積が読取られる。
異なる鎖長を有するアミノアルキル−カルバミルアルキ
ル−５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅ 第１実施例 溶媒が水で交換された後アミノアルカン酸が活性化ＣＤ
　Ｉ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（以下、ＣＤｌ−３ＥＰ
Ｈと略記する）と結合された場合には、おそらく活性化
された基の加水分解の結果として結合効果が相対的に低
下（１０〜２０％）した。この理由から、アミノアルカ
ン′ｆＩｉ（Ｃ１〜３）のエチルエステルはＤＭＦ　（
結合反応時間ＣＲＴ＝２０時間、ＣＤ　Ｉ／アミン＝１
／７）中の活性化ＣＤｌ−５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅ　１０
０ｍｊ！　（１０ｒｎｍｏ　Ｉ　ｅ　ｓ　　ＣＤ　１；
活性ｒヒ反応時間ＡＲＴ＝９０分）の１／３で結きされ
加水分解してカルボキシゲルを精製する。
この結果が次の第１表に示されている。
（以下余白） 第１表 Ｃｌ−５ＥＰ１１．２２．０５．８６１．５１　−４６
　３５　　４３．　５．０Ｃ２−５ＥＰＨ，２２，０５
，８６１，９１５８３３５８５，４３つのカルボキシゲ
ル（Ｃｒｎ　−ＣＤ　Ｉ　−Ｓ　Ｅ　ＰＨ２２，０５，
８６）から、９つのアミノアルキル−カルバミルアルキ
ル−５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅ（Ａ　ｎ　−Ｃｒｎ　−ＣＤ
　Ｉ　−Ｓ　Ｅ　Ｐ　Ｈ）がＮ）（ＳとＥＤＡＣとの活
性化によって調製され、ＤＭＦ　（ＣＲＴ＝　１６時間
）において各カルボキシゲルの１／９でｎ−アルカン　
ジアミン（ｎ＝２．３．４）が結合される。このゲルは
カラム方式の吸着試験に使用された。この合成について
のデータは次の第２表に明らかにされている。
（以下余白） 第２表 八３−Ｃ１，２９，０５，８６２６０５２１０，０２６
９，１＾４−Ｃ１，２９，０５，８６２２３４５９，３
２４９，３＾２−Ｃ２，２８，０５，８６３３６５３７
，３４６８，７＾３−Ｃ２，２８，０５，８６３６７５
８７，８４７８，９八４−Ｃ２，２８，０５，８６３０
８４８７，５４１８，７＾２−Ｃ３，２８，０５，８６
２９２５５７，３４０８，５＾３−Ｃ３，２８，０５，
８６’３１０　５８　７．２　４３　８．９第２実施例 鎖長および組成の効果を研究するために、回分式吸着お
よびカラム式溶出において、アミノアルキル−カルバミ
ルアルキル−５ｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａ　ｎ　−Ｃｍ−Ｃ
Ｄ　ｌ−３ＥＰＨ）の５つの同族列が調製された。ＤＭ
Ｆ　（Ｃｌ〜３に対する）におけるエステル化されたア
ミノアルカン酸または夕景の水中の遊離アミノアルカン
ａ（Ｃ４〜５に対する）はＣＤｌ−３ＥＰＩ−１に吸着
され、両方の場合においてＤＭＦ　（ＡＲＴ＝９０分、
ＣＲＴ＝１６時間）で想濁さｉｔな、この合成のデータ
は次の第３表に明らかにされている。
第３表 Ｃ１−５Ｅｒ’Ｈ，２２，０８，８６１００１０９０３
，１３１７２４３Ｃ２−ＳＥＩ’ｌ（，０５，（１８，
８６１００１０６０４，２４２７０６０Ｃ３−５ＥＰＩ
１．２２．０８．８６１００　１０　６０　３．９　３
９　７０　５５Ｃ４−ＳＥＰＨ，２２，０８，８６１０
０２Ｇ　　４０　５．０　２５　７０　７２■−５ＥＩ
’１１．２９．０１．８７７４０　９６　６４０　６２
．０　６５６６７　９３Ｃ４−３ＥＰＨ，２８，０１，
８７２００２６１７０１３，７５３１８０７６■ＭＦ中
のカルボキシゲル（Ｃｍ−ＣＤＩ−３ＥＰＨ）の懸濁液
はＮＨ３およびＥＤＡＣで活性化され、過剰のｎ−アル
カンジアミン（ＣＲＴ＝１６時間；ＬＤ／アミン−１／
１００）と結合させるために１０等分（ＧＶ−７，０ｍ
ｌ、ただしＣ５−３ＥＰｔｌ　　２９．０１．８７は除
く）された、この結果は第４表〜第８表に明らかにされ
ている。
第４表 異なる鎖長を有するアミノアルキル−カルバミルメチル
−５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅの合成＾２−ＣＩ−ＩＱ、０９
．８６　　　１８６　　　６０　　　４．７　　　　４
０＾３−ＣＩ−１０，０９，８６１９９６４４，９４１
ＤＩ４八３−ＣＩ−１０，０９，８６１９８６４５，２
３９＾４−ＣＩ−１０，０９，８６１４９４８４，２３
６＾５−ＣＩ−１０，０９，８６１８０５８４，７３８
ΔＢ−ＣＩ−１０，０９，８８１８８６１６，０３１＾
７〜Ｃｌ−１０，０９，８６２０４６６６，１３４八８
−Ｃ１−１０，０９，８６１９１６２’６．６　　　　
　　　　２９八９−ＣＩ−１０，０９，８６２０６６６
７，３２８第５表 ＾２−Ｃ２−１１．０８．８６　　３７１　　８８　　
６．５　　５７＾３−Ｃ２−１１，０８，８６３５９８
５６，３５７ＤＭ＾３−Ｃ２−１１，０８，８６４７２
１００７，５６３＾４−Ｃ２−１１，０８，８６３２３
７６６，３５１＾５−Ｃ２−１１，０８，８６２８２６
７６，０４７八６−Ｃ２−１１，０８，８６２６０６２
５，３４９Δ７−Ｃ２−１１，０８，８６２３７５６５
，５４３＾８−Ｃ２−１１，０８，８６２５６６１８，
４４０ゲルはＣ２−ＣＤＩ−ＳＥＰｔｌ、０５．０８．
８６　（ＴＬＤ＝４．２ｍｍｏｌｅｓ）から調製された
（以下余白） 第６表 異なる鑓長を有するアミノアルキル−カルバミルプロピ
ル−５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅの自戒＾２−Ｃ３，１０，０
９，８６３１４８１６，５４８＾３−Ｃ３，１０，０９
，８６２５６６６５，４４８ＤＭ＾３−Ｃ３，１０，０
９，８６３３４８６６，２５４＾４−Ｃ３，１０，０９
，８６２０２６７５，５４８＾５−Ｃ３，１０，０９，
８６２５１６４５，８４３Ａ６−Ｃ３，１Ｇ、０９．８
６　　　２５０　　　６４　　　５．５　　　　４６＾
７−Ｃ３，１０，０９，８６３０６７８５，２６０八８
−Ｃ３，１０，０９，８６１８７４８５，３３６＾９−
Ｃ３，１０，０９，８６２１９５６６，３３５ゲルはＣ
３−ＣＤＩ−ＳＥＰＩｌ、２２．０８．８Ｂ　（ＴＬＤ
＝３．９繭ｏｌｅｓ）から調製された（以下余白） 第７表 ＾２−Ｃ４，１０，０９，８６３０２６０４，９６２＾
３−Ｃ４，１０，０９，８６２７７５５４，６６０ＤＨ
＾３−Ｃ４，１０，０９，８６３７２７４５，２７２＾
４−Ｃ４，１０，０９，８６３８２７６５，７６７＾５
−Ｃ４，１０，０９，８６２６９５４４，３６３＾６−
Ｃ４，１０，０９，８６３０２６０５，４５６＾７−Ｃ
４，１０，０９，８６４５０９０６，８６６八８−Ｃ４
，１０，０９゜８６　　　　　　　２５７　　　　　　
　５１　　　　　　５．７　　　　　　　　４５＾９−
Ｃ４，１０，０９，８６２４２４８３，８６５＾４−Ｃ
４−０３，０２，８７７１６８５９１２８５６ゲルはＣ
４−ＣＤＩ−ＳＥＰＩｌ、２２．０８．８６から調製さ
れた（以下余白） 第８表 ＾３−Ｃ５，０３，０２，８７＋０．９　０．７５　７
４　１０．４　　７２Ｉｌ１Ｍ＾３−Ｃ５，０３，０２
，８７Ｇｏ　　６．８６　１００　７５．４　　９１＾
４−Ｃ５，０３，０２，８７４００１７，０５４６３４
１５０＾５−Ｃ５，０３，０２，８７１０，３０，５９
６２９，０６６ΔＢ−Ｃ５，０３，０２，８７６０４，
３１７７６８，４’６３ゲルはＣ３−ＣＤＩ−ＳＥＰｌ
（，２９，０１，８７から調製された（以下余白） 第９表 ９回の実験から合成されたアミノアルキル−カルバミル
アルキル−５ｅｐｈａｒｏｓｅ＾１ドＣ２，１１，０８
，８６３０６１８０７１±１６　　６．２ｔｈ０．６　
　　　４９±８＾ｎ−Ｃ５，１０，０９，８６２６４ｉ
４４　　　　６Ｂ±１１　５．７ｔｈ０．５　　　　　
４６±７Ｓｅｐｂａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ以外の支持
体は、アミノアルキル−カルバミルアルキルの＠鎖とし
て供給され、同様な方法（第６実施例参照）で試験され
た。
ゲルコートはゲルの性質およびその調製データを示して
いる０合成され試験されたゲルは全て一般的な第３式を
満たす、： ５ｅｐｈａｒｏｓｅ　−０−ＣＯ−Ｎ）Ｉ　−（ＣＩり
　、−ＣＯ−８１１−（Ｃ１１２）　ｏ−ＮＲ’１１２
ゲルコートの文字Ａに続く数字はｎの値を示し、文字Ｃ
に続く数字はｍの値を示す、たとえば、ゲルＡ２−Ｃ３
−２８，０５，８５は次式％式％ を満たし、１９８６年５月２８日に調製された。
略語ＤＭＡ３は、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピル基を
意味する。
因子■の単離に関する実施例 凝固因子の精製 以下に記述する実験においては、吸着剤（これはまたア
フイニテイマトリツクスまたはゲルとも言われる）が使
用され、それは吸着Ｅ１　衝？ｌ中で平衡ｆヒされ懸濁
された。その後１つの吸着実験において、ゲルおよび標
準血漿プール（以下、ＮＰＰと略記する）は、特定の条
件の下で異なるゲル／血漿比でカラム式または回分式で
放置された。
高い因子■吸着を示すゲル（Ｇ／Ｐ比が１：８で７５％
を超える）は再装置され、緩衝液中で１Ｍ塩化ナトリウ
ムでカラム式の溶出が行われた。
溶出液中の因子■および全蛋白質濃度が標準血漿プール
を参照として決定された。これらのデータから因子■の
回収率および精製因子（以下、ＰＵＲと略記する）が容
易に得られた。リファレンス（Ｆ■：Ｃに対してＣＬＢ
−ＰＳ４１および蛋白質に対してヒト血清アルブミン）
が標準液として用いられた場合、比活性が決定された（
第１２表参照）。
凝固因子はまたゲルに吸着されて溶出されるから、有望
なゲルに対して凝固因子■、■、■、およびＸの溶出に
おける回収率および比活性がまた決定された。
少なくとも１５人の供与体（ヒト血清アルブミン　　　
Ｈ３Ａ＝３９．　６　　±　１．　０ｍｇ／ｍ　１　　
；　　Ｉ　　ｇＧ＝１１．８±０．４ｍｇ／ｍＺ）から
新鮮にクエン酸塩を添加した血漿（ｆｒｅｓｌｌｌｙ　
ｃｉｔｒａｔｅｄｐｌａｓ＋＊ａ）（ＣＰＤＡ　　１　
　血漿）を結合することによって標準血漿プール（ＮＰ
Ｐ）が得られた。
必要な場合には、冷凍の前にＩＮ酢酸でｐＨ７゜４に調
節された。ＰＨ５，５の場合には、所望のｐ　Ｈを得る
ために使用のすぐ前に酢酸が血漿に加えられた。
回分式吸着 試験されるヒドロゲルは、所望のｐＨで０．１Ｍ酢酸エ
ステル／リジン緩衝液でグラスフィルタにおいて平衡化
されて、１．２１９のゲル容積で懸濁された。この懸濁
液の予め定められた量は、プラスチック製管中において
同じｐＨおよび室温でヒト血漿（ＮＰＰ）で５〜１２０
分間温置され装。
使用された０、１Ｍ酢酸エステル／リジン緩衝液１１中
には、ｐＨを調節するために８．２０ｇ酢酸ナトリウム
、１８．２７ｇＬ−一塩酸塩、２゜９４ｇクエン酸三ナ
トリウム、１．０Ｍ塩化カルシウム１．０ｍＮ　、およ
びＩＮ水酸化ナトリウムまたはＩＮ塩酸が含まれる。
Ｆ■：Ｃ吸着でのρ■］の効果を強めるために、放置は
ｐ）１７．４〜７．５の間で行われた。血漿および！Ｊ
Ｅ　Ｌｉ液のｐＨを調節するために、１．０Ｍ酢酸がゆ
っくりと加えられた。
放置の後、混合物はフルスピードで２分間遠心分離され
、上澄み血漿（ｓｕｐ＞は通常因子■決定のために凍結
状悪で貯蔵された。
溶出が必要な場合には、ヒドロゲルがカラム（Ｐｈａｒ
＋＊ａｃｉａ　Ｃ１０／　１０　）へ注入され、後述さ
れる方法で溶出された。洗浄の間、緩衝液は上澄み血漿
として集められる。この分別物には結合されない蛋白質
（非吸着蛋白質部分　ＮＡＤ　Ｓ　）を含むと仮定され
た。
カラム式吸着 カラム方式の吸着に対しては、約５１ｍｌのヒドロゲル
が使用された。ゲルはカラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　
　・ＣＩＯ／１０）へ性態され、ｐｉ−Ｉ７．Ｏまたは
５゜５でＯ，１Ｍ酢酸エステル／リジン緩衝液で平衡化
された。緩衝液と同じｐＨおよび同じ導電率のヒト血Ｍ
（ＮＰＰ）の予め定められた量（１〜３０ｍ１）が室温
でカラムへ加えられ、一方１〜５ｍｌのＮＰＰは実験中
に冷凍され貯蔵された（ＲＥＦ）、流量は０．３〜１．
０ｍｌ／ｍ　ｉ　ｎ、にペリスタルチックポンプ（Ｐｈ
ａｒＴａａｃｉａ　　Ｐ　−１）を用いて一定に保たれ
た。２８０ｎｍでの紫外吸収がＰｈａｒｓａｃｉａ　　
Ｓｉｎｇｌｅ　ＰＡＴＨＭＯＮ　Ｉ　Ｔ。
ＲＩＶ−１を用いてカラム溶出液中において監視された
。蛋白質がカラムから溶出（ヒドロゲルに応じて２〜３
ｍｌの後）されるとすぐ、溶出液は一定容量（血漿＋洗
浄緩衝液）まで集められ（ＮＡＤＳ）冷凍されて貯蔵さ
れた。
カラム式溶出 カラム式溶出は、蛋白質が検出されなくなってからｆｉ
Ｗｒ液（通常１０〜２０ｒｎｆ）で洗浄された後開始さ
れた。結合した蛋白質の溶出は１，０Ｍ塩化ナトリウム
を含む同じ緩衝液で効果的であった。蛋白質が検出され
た溶出液（約１０ｒｎ１）は、収集され冷凍されて貯蔵
された（溶出蛋白質部分ＥＬＵ）。
Ｆ■：ＣのＡＰＴＴ定ｊｔ　（ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐ
ａｒｔｉａｌｔｂｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ　Ｌｉｍｅ
）に対して高い塩化ナトリウム濃度を調整するためにＥ
ＬＵは適当に塩化ナトリウムをあまり含まないＡ　Ｐ　
Ｔ　Ｔ　ｋｌ、　ｖＲ液で希釈された。
蛋白質濃度はクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０
が蛋白質に結きするときに生ずる吸収極大のシフトに基
づいたＢｒａｔｆｏｒｄ蛋白質検定、ＢｉｏＲａｄ　（
Ｉ３　Ｐ　Ａ　）またはビユレット反応に基づくＢＳＡ
蛋白質検定、６０℃でのＰｉｅｒｃｅ　（Ｂ　ＣＡ　）
によって決定され、この両方の検定については製作者が
記した条件が使用された。複製（Ｄｕｐｌ　ｉｃａｔｅ
ｇＢｍｐｌｅｓ）試料は標準血漿（ＢＣＡ試験はこの実
施例に対してやや高い値を与える）またはヒト血清アル
ブミン（５４，１ｍｌ／ｍｌ　）に対して製作者の指示
に従った適当な希釈および分析が行われた。
抗原濃度（Ｆ■：ＡｇおよびｖＷＦ：Ａｇ＞は、Ｆ■：
Ａｇに対しては単クローン性抗体ＣＬＢ−ＣＡ４　　Ａ
とＣＬＢ−ＣＡｇ　１１７およびｖ　Ｗ　Ｆ：Ａｇに対
してはＣＬＢ−ＲＡｇ２０とＣＬＢ−ＲＡｇ３５に基づ
いてＥｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎ。
５ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　（Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　
）によって決定された。
Ｆ■＝血液凝固因子■： ｖ　Ｗ　Ｆ　＝フォノ・ビルプラント因子、文献ではＦ
〜’ＩＲと示キれることもある： Ｆ■：Ｃ＝因子■の凝固活性； Ｆ■：Ａｇ＝囚子■抗原；および ｖＷＦ：Ａｇ＝フオン・ビルプラント因子抗原、文献で
はＦ■ＲＡｇと示されることもある。
凝固因子活性は１ｌａｒｄｉｓｔｙとＨｃＰｈｅｒｓｏ
ｎによってＴＩ＋ｒｏｎｂ、　Ｄｉａｔｂ、　Ｉｌａｅ
ｍｏｒｒ、　７　（１９６２）　、　２１５−２２９に
記述された１段階ＡＰＴＴ試験で決定された。
検定はＬ　ＯＤ　Ｅ　　Ｌ　Ｃ６Ｃｏａｇｕｌａｔｏｍ
ｅｔｅｒでＦｎとＦＸに対しては合成基質、Ｆ■とＦ■
に対しては先天性異常基質、およびＦＩＸに対しては免
疫除去基質で行われた。リファレンスは標準血漿溶液の
連続希釈＜１／１０から１／３２０）によって′Ａ製さ
れた。
染色体基質状のＦ■：Ｃ活性の測定に対するＦ■　Ｃｏ
ａｔｃｓｔは製作者の指示（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｎ）
に従って行われた６レフアレンスとしては標準血漿（Ｃ
ＬＢ−ＰＳ４１、Ｆ■：　Ｃ＝０．７８Ｕ／ｍｌ）を連
続希釈（１／１６０から１／８００）したものがとられ
た。
アルブミンおよび免疫グロブリンＧは比濁法で測定され
た。ヒブリノーゲン（Ｆｂ）およびフィブロネクチン（
Ｆｎ）はＮａｎｃｉｎｉによる放射免疫拡散法によって
決定された。
第３実施例 回分式吸着実験 異なった条件下でのＦ■：Ｃの吸着についての情報を得
るために、小規模の回分式吸着実験が実質的に合成され
た全てのゲルで行われた。約１ｍｌの血漿が予め定めら
れるゲル／血漿比（ｐＨ＝７．４；ＡＴ＝３０分間）で
装置され、血漿の上澄液（以下、ＳＵＰと略記する）は
１：１０の比で希釈され、ＡＰＴＴでＦ■：Ｃについて
重複して（ｉｎ　ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）分析された；こ
れは開始物質であるマトリックス（５ｅｐｂａｒｏｓｅ
　ＣＬ　　４　Ｂ　＞で実行された同じ試験で比較され
た。この結果は示されていない。
第４実施例 カラム式吸着実験 吸着および溶出におけるアルキルの鎖長の効果カラム式
吸着中のＦ■吸着に及ぼす全鎖長の効果を研究するため
に、アミノアルキルーカルノくミルアルキル−５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅの３種の同族列（ＬＤ＝２５±１，４５±３
．４２±２　、Ｌ！　ｍｏｌｅｓ／　ｍ　１　）が試験
された。血漿＜４ｍｌ　　ＮＰＰ）がカラム（５ｒｎｌ
　；　Ｇ／Ｐ＝１．２５　；流ｊｔ　ＦＲ＝０．３ｍｌ
　／ｒａｉｎ、　；ｐ　Ｈ７、４）へ江別され、カラム
はＭ　＠　ｉ’＆　（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｓ　＝　２０　ｒｎ
　１　）で洗浄され、１゜０Ｍ塩化ナトリウムで溶出（
ＥＬＵ−８ｍＮ　＞が行われた。Ｆ■：Ｃ，Ｆ■：Ａｇ
およびｖＷＦ：Ａｇの分析結果は次の第１０表に示され
ている。
蛋白質の吸着に関するデータは、それらがあまりに低い
ために決定することができないために与えられていない
。同時に、カラム式溶出が行われた。
Ｆ■、ｖＷＦ、および蛋白質に関する結果はまた第１０
表に与えられている。
（以下余白） 第１０表 異なる鎖長を有するアミノアルキルーカルノ〈ミルアル
キル−３ｅｐｈａｒｏｓｅでの＾３−Ｃ１−２９．０５
．８６　　４　　６　　７　　ｔｏ　　　５　　３　　
０．３３　　　　１８＾４−Ｃ１−２９，０５，８８１
９９−４１１４０，５０１８＾２−Ｃ２−２８，０５，
８Ｂ　　１９　１９　１７　１３　　９　　５　　０．
７６　　　　２５＾３−Ｃ２−２８，０５，８６６３３
９６５−５４２００，７５５２Ａ４−Ｃ２−２８，０５
，８６５７５２６０−４１２２０，５８、９０＾２−Ｃ
３−２８，０５，８Ｇ　　３０　１６　３６　８Ｑ　　
　３２　１０　　０．８０　　　　２０＾３−Ｃ３−２
８，０５，８６９５５５９５−９３２６０，９３５９先
行するアミノアルキル−カルバミルアルキル−５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅの３種の同族列でのカラム式吸着および溶出
におけるＦ■の相互作用の研究の陵、異なる鎖長を有す
る５種の同族列が調製された。試験は回分式吸着および
カラム式溶出によってｐ　Ｈ７．４でＦ■に対する比較
的高い吸着容量を示したゲルについてのみ行われた。ゲ
ルは血漿（１２ｍｌ　　ＮＰＰ；ｐＨ７，４；Ｇ／Ｐ＝
０．１０；吸着時間ＡＴ＝３０分間）とともに温置され
、緩衝液（Ｐ　Ｒ＝　１　、０　ｍ　ｌ　／　ｍ　ｉ　
ｎ　；　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｓ　＝　５０ｒｎｌ）で洗浄され
、１．０Ｍ塩化ナトリウム（ＦＲ’＝０．５ｍ１／ｍｉ
＋＋、；ＥＬＵ＝２０ｍｌ）で溶出された。溶出された
Ｆ■（ＡＰＴＴ）およびｖ　Ｗ　Ｆは３ｆΔ希釈で重複
して（ｉｎ　ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）分析された。このデ
ータは次の第１１表に明らかにされている。
（以下余白） 第　　１１　　表 アミノアルキル−カルバミルアルキル−５ｅｐｌ＋ａｒ
ｏＳｅでの回分式吸着Ｆ■二Ｃ［＄］　　　　　　　蛋
白１丁ｍ２１京）八４−Ｃ２−１１，０８，８６−８５
６４５４０，２７２００＾５−Ｃ２−１１，０８，８６
７５７５３７２８０，１４２００＾６−Ｃ２−１１，０
８，８Ｂ　　　　９６　　　９８　　４５　　　４４　
　０．２１　　　２１０＾７−Ｃ２−１１，０８，８６
９７９８２１２１０，２９７２＾５−Ｃ：３−１０．０
９．８Ｇ　　　　５３　　　７０　　３７　　　２６　
　０．１１　　　２３（ｉ＾６−Ｃ３−１０，０９，８
６８０９２２８２６０，１５１７３＾フーＣ３−１０，
０９，８６９８９９１４１４０，２３６１＾３−Ｃ４−
１０，０９，８６９５９８５７５Ｇ　　　０．３８　　
　１４７＾４−Ｃ４−１０，０９，８６９５９８６０（
１００，３５１７１＾４−Ｃ４−１０，０９８６＊本”
）　　　　７８−　　　　９０　　　　　６７　　　　
　　６４　　　　　０．３３　　　　　　　１９４＾５
−Ｃ４−１０，０９，８６９８９９４４４４０，３３１
３３＾６−Ｃ４−１０，０９，８６９８１００４０４０
０，５４７４ＤＡＭ３−Ｃ５，０３，０２，８７−９５
６５６２０，５０１２４＾４−Ｃ５−０３，０２，８７
−９６５７５５０，５６９８＾６−Ｃ５−０３，０２，
８フ　　　　　　　　−９６４３４１１，０８：１８本
）ＢＰＡで決定 傘車）本実験はＧ／Ｐ＝０．０５で行われた。
第１１表から計算され得るように、相対溶出（ＥＬＵ／
ＡＤＳ）はアミノアルキル基（ｎ＝４゜５．６．７それ
ぞれに対してＥＬＵ／ＡＤＳ＝６２±４．３９±３．３
９±９．１８±４）のアルキル鎖長に関係している。こ
のような直接的な関係はアルキルの鎖長ｍ　（ｍ＝２．
３，４．５それぞれに対してＥＬＵ／ＡＤＳ＝４２±１
５．２６±９，５４±１０．５５±９）に対しては結論
されなかった。
第５実施例 有望なマトリックスの再現性 アフイニテイクロマトグラフイ法の再現性を試験するた
めに、４種の有望なヒロドゲルの同族列が回分式吸着お
よびカラム式溶出実験に用いられた。血漿（２０ｍｌ　
ＮＰＰ）はゲル（Ｇ／Ｐ＝０．１　；ＡＴ＝４５ｍｉｎ
、；　ｐＨ７，４＞で温置され、緩衝液（ＦＲ＝１．０
ｍｌ／ｍｉｎ、；　ＮＡＤＳ＝３２ｍｌ　）で洗浄され
、１，０Ｍ塩化ナトリウム（ＦＲ，＝０．５ｍｌ　／ｍ
ｉｎ、；　ＥＬＵ＝２０ｍｌ）で溶出された。ＮＰＰ、
ＮＡＤＳ、およびＥＬＵ中におけるＦ■：Ｃは、標準血
漿に対するＦ　ＶＩＣｏａｔｅｓｔを用いて決定された
。この実験は各ゲルに対してＮ回１２　ｍされた。Ｆ■
および全蛋白質に対する平均値および標準偏差は次の第
１２表に示されている。
第　　１２　　表 ２ｍｌアフイニテイゲルでの２０ｍ１ＮＰＰの回分式吸
着およびカラム式溶出：Ｆ■および全蛋白質；口＃（実
験番号）ＬＤ　　　　ＮＰＰ　　　Ｆ■：　Ｃ［＄コ　
　収率　　蛋白質［＄］本）Ｆ■：Ｃゲルコート　　［
ｕ＋ｏｏｌｅｓ／ｍ／］　［０，Ｗｌ　　八〇Ｓ　　Ｅ
ＬＵ　［Ｕ／ｋｇ　ＮＰ＋’］ＥＬＵ　　　　［Ｅ／＋
ｇコＡ４−Ｃ４−０３，０２，８７５４０，９７９３ｉ
２５５ｔ９　５３０ｔ１８　　０．２８　　　１．９７
ｔ、１４ＤＭ八３−Ｃ５−０３．０２．８７９１０．９
９９５±２６２ｔ１６６２０上２５０．５０１．２１ｔ
、１７Ａ４−Ｃ５−０３，０２，８７５４０，９４９６
ｔｌ　　５５ｔ５　５００ｔ１６　　０．５６　　　０
．９８ｔ、１２＾６−Ｃ５−０３，０２，８７６３０，
９０９６土１４１±１５　３６０ｉ６　　　１．銘　　
　０．四−０１３次の第１３表および第１４表は、同実
験に対する凝固因子およびその他の蛋白質の分析結果を
示している。溶出液中のアルブミンおよび免疫グロブリ
ンＧに対する値は、検出閾値以下であった（＜０．０３
％）。
第　　１３　　表 ２ｍｌアフィニティゲルでの２０ｍ１　ＮＰＰの回分式
吸着およびカラム式溶出：凝固因子ＦＩ１．Ｆ■、Ｆ［
、およびＦＸＦＩＩ：Ｃ［＄１　　ＦＷ：Ｃ［＄］　　
ＦＩＸ：ＣＩＪ］　　ＦＸ：Ｃ［＄］　　　Ｆｌ’！’
ｙ’ルコ−トＡＤＳ　　ＥＬＩＪ　　ＡＤＳ　　ＥＬＬ
Ｉ　　ＡＤＳ　　ＥＬ（Ｉ　　ＡＤＳ　　ＥＬ［Ｉ　　
［Ｅ／ｍｇｌ＾４−Ｃ４−０３，０２，８７９１５６３
９７９７５１９１５８１，６４ＣＭＡ３−Ｃ５−０３，
０２，８７９８５６６０４０１００６７９Ｂ　　６７　
　１．１３八４−Ｃ５−０３，０２，８７９７６７６６
８０９９６７９７８９１，１１Ａ６−Ｃ５−０３，０２
，８７９９６７９１１００１００６７９９７８０，４９
第　　１４　　表 ２ｒｎｌア２イニテイゲルでの２０ｍ１’ＮＰＰの回分
式吸着およびカラム式溶出：ｖＷＦ、ＦＷ：Ａｇ、フィ
プリーゲンおよびフィブロネクチンＪＦ：Ａｇ［＄］　
　　脱離分率　Ｆｂ：八ｇ［＄］　Ｆｎ：＾ｇｒＺ］ゲ
ルコートＡＤＳ　　ＥＬＵ　　ＦＶＩ：Ｃ／Ａｇ　　Ｆ
Ｗ：Ｃ／ｖＷＦ：Ａｌｌ　　ＡＤＳ　　ＥＬＵ　　ＡＤ
Ｓ　　ＥＬＵＡ４−Ｃ４−０３，０２，８７９４４６１
，０２１，１４５０１１＜４ＣＭＡ３−Ｃ５−０３，０
２，８７９７５６０，６１、１，３８１１１６＜４Ａ４
−Ｃ５−０３，０２，８７９９４６０，９２１，１７１
２４０３１第６実施例 ５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ以外の支持体におけ
るＦ■／　ｖ　Ｗ　Ｆの単離 上述したような手順を用いて、５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃ
Ｌ−４Ｂ以外の支持体はアミノアルキル−カルバミルア
ルキルのりガンドースペーサの結合として与えられる。
これらの物質は、第５実施例中に記述された手順で血漿
と接触させられる。さまざまな支持体が結合されたアミ
ノブチル−カルバミルブチルでのＦ■／　ｖ　Ｗ　Ｆの
単離結果は次の第１５表に明らかにされている。
（以下余白） 第　　１５　　表 異なる支持体を有する２ｍｌＡ４−Ｃ４アフイニテイマ
トリツクスでの２０ｍ１標準血漿の回分式吸着およびカ
ラム式脱離：ＦＷ：Ｃ，ｖＷＦＬＤ　　　　　ＦＷ：Ｃ
［＄コ　ｖＷＦ：Ａｇ［＄］　　蛋白質［π］支持体　
　　　［ｐｍｏｌｅｓ／ｍ１］　ＡＤＳ　ＤＥＳ　　Ａ
ＤＳ　ＤＥＳ　　　ＤＥＳＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂ
　　　　　　　５４　　　９３　５５　　９４　４６　
　　０．４４ＳｅｐｂａｒｏｓｅＣＬ２１１　　　　　
　５０　　　７０　７０　　　ｎｄ＊）ｎｄ　　　　Ｏ
，４２ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ４００　　　　　　６０　
　　９７　５３　　９２　５３　　　０．５３Ｓｅｐｌ
＋ａｃｒｙｌＳ５００　　　　　　６８　　　８４　６
５　　４９　３３　　　０．４９ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ
１０００　　　　　　４４　　　９６　８５　　　ｎｄ
　　ｎｄ　　　　Ｏ，５６ＦｒａｃｔｏｇｅｌＴＳＫＩ
ｌｌ’１５５　　　　１５０　　　９２　９０　　５３
　３０　　　０．４６第７実施例 他の原料からのＦ■／　ｖ　Ｗ　Ｆの単１ｌＩｉ：低温
沈澱１勿 １０ｍ１の大プールの低温沈澱物（アムステルダムにお
いてＣＬＢがら得られた１ｍｌ当たり２２０Ｆ■：Ｃお
よび蛋白質４９ｍｇ）がＤＭＡ３Ｃ５５ｅｐｂａｒｏｓ
ｅ　　　ＣＬ　−４Ｂ　　、　　０　３　　、　０　２
　　。
８７タイプのアフイニテイマトリックス８ｍｌで４５分
間混きされた。ＦＷ、ｖ　Ｗ　Ｆおよび全蛋白質に関す
る吸着および脱離の結果は次の第１６表に示されている
。
第８実施例 他の原料からのＦ■／　ｖ　Ｗ　Ｆの単ｔａ：ＤＥＡＥ
−５ｅｐｌ＋ａｄｅｘ　Ａ　５０で前処理された血漿陰
イオン交換剤Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｂａｄｅｘ　Ａ
５０　（ｒ’ｈａｒ＋５ａｃｉａ社製、Ｕｐｐｓａｌａ
、スウェーデン）を用いることによって、選択的に血漿
から凝固因子■、■、■、およびＸをＦ■／　ｖ　Ｗ　
Ｆの認め得る残存なく単離することが可能である。ＦＩ
Ｉ、ＦＷ、ＦＷ、およびＰＸとＦ■／　ｖ　Ｗ　Ｆとの
分離に加えて、前処理は前記アフイニテイマトリックス
によるＦ■／　ｖ　Ｗ　Ｆの単離に対して付加的な２つ
の利点：高専４１（Ｆ■／　ｖ　Ｗ　Ｆ吸着に対してよ
り広い結合場所が利用できるため）および高純度（特に
単離されたＦ■／ｖＷＦ中には汚染物としてＦｉｌが存
在しないため）を有する。
アフイニテイマトリックスにおけるＦ■／ｖ’ＷＦの単
離が引続いて行われる、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ａ　　５０を用いた血漿の前処理新鮮に充分冷凍
された血Ｍ（アムステルダムにおいてＣＬＢから得られ
た１０〜２０容の供与体）は迅速に解凍された。血漿の
温度が１５℃に上昇した後、１５０ｒｎＭ　　ＮａＣ１
の膨潤ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｌ＋ａｄｅｘ　Ａ　　５０　（
Ｐｌ＋ａｒｍａｃｉａ社製、スウェーデン）が血漿１に
対して乾燥５ｅｐｈａｄｅｘ　０　、５　ｇの比率で加
えられた。４５〜６０分間の撹拌で懸濁が行われ、その
後血漿は２０μｍナイロンガーゼを用いてＤ　Ｅ　Ａ　
Ｅ−５ｅｐｌ＋ａｄｅｘから分離された。ＤＥ　ＡＩｇ
ｉ、　−５ｅｐｈａｄｅｘはカラムへ移されｐＨ７の１
０ｍＭトリソジウムクエン酸中で１８０　ｒｎ　Ｍ　　
Ｎ　ａＣｌで洗浄されｐＨ７の１０ｍＭクエン酸三ナト
リウム中において２０００ｍＭＮａＣ１で溶出された。
Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−Ｓｅｐｌ＋ａｄｅｘ　　Ａ　　５０処
理の後得られたＰ液は、様々な比率の様々なアフイニテ
イマトリックスで接触された。第１７表は血漿のＤＥ　
Ａ　Ｅ　−５ｅｐｌ＋ａｄｅｘでの幾つかの前処理の結
果を示している。Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｌ＋ａｄｃ
ｘの脱離の結果もまた示されている。第１８表は前処理
された血漿が様々なアフイニテイマトリックスと接触さ
れた幾つかの実験の結果を示している。
第　　１７　　表 Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｌ＋ａｄｅｘ　Ａ　５０での
４５〜６０分間（１５℃）の回分式培養による血漿（３
〜８１）の前処理、カラム式脱離（２Ｍ　　ＮａＣ１）
、ＦＩＩ。
Ｆ■、Ｆ■：Ｃ，ＦＩＸ、ＦＸ、および全蛋白質（６回
の実験の平均値）［Ｕ／積Ｉコ　　　　　　　　　　　
吸着［％コ　　　　　　　　　　　脱離［％］ＦＩＩ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，９０９０５５
Ｆ■　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０１　　
　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　　　
　　　　　８Ｆ■　　　　　　　　　　　　　　　　０
．８５　　　　　　　　　　　　　　１２　　　　　　
　　　　　　　　　ｎｄＦＩＸ　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．９５　　　　　　　　　　　　　　９
１　　　　　　　　　　　　　　６０ＦＸ　　　　　　
　　　　　　　　　　　Ｏ，９２９２６１全蛋白質　　
　　　７２ｔｓｇ／ｍｌ　　　　　　　　　ｎｄ　　　
　　　　０．４比活性Ｓ、Ａ、　［ＯＦｆｆ／＋ａｇ蛋
白質］１，９（以下余白） 第　　１８　　表 ２ｒｎｌアフイニテイマトリツクスでのＤＥＡＥ　　５
ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ５０で前処理した血漿２０〜６０ｍ
／の回分式吸着：Ｆ■：Ｃおよび全蛋白質（３回の実験
の平均値） Ｓｅｐｂａｒｏｓｅ　　Ｃｌ３［Ｉ　　　　　ＬＤ　　
　　血５ＡＦ■、Ｃ［＄］　　　収率　　　　Ｆ■：Ｃ
Ａ４−Ｃ４−０３，０２，８７５４２０９８６７４５０
４，７４０８２５３４４０４，９ ５０８６４２３４０４，３ ＤＭＡ３−Ｃ５−０３，０２，８７９１２０９８７１４
８０２，２４０９６６５５３０３，３ ５０９１５５４５０２，９ Ａ４Ｃ−Ｃ５−０３，０２，８７５４４０９５４９４０
０２，４５０９４５３３７０２，２ 第９実施例 アフイニティマトリックス　ＤＭＡ３−Ｃ５−５ｅｐｂ
ａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ　、　０４　、０３　、８８
におけるＦ■／　ｖ　Ｗ　Ｆの単離が引き続＜ＤＥＡＥ
−汽鴇 ５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ａ　　５０におけるＦ■、ＦＩＸ
、およびＦＸの単離：大規模実験 １００ｋｇの新鮮に充分冷凍された血漿（アムステルダ
ムでＣＬＢから得られた血漿１ｋｇ当たり７３０Ｕ　　
Ｆ■：Ｃおよび９００Ｕ　　Ｆ■）は、二重壁の撹拌ｐ
ａ（壁温４０℃）中で素早く解凍された。血漿が解凍さ
れ形成されていた低温沈澱物は完全に溶解されて、撹拌
槽は血漿の温度が１５℃となるまで冷却（壁温Ｏ℃）さ
れた。このとき撹拌槽の温度が一定（Ｕ温１５℃）に保
たれた。
１５０ｍＭ　　ＮａＣ１中で膨潤したＤＥＡＥ＝Ｓｅｐ
ｌ＋ａｄｅｘ　Ａ　　５０　（Ｐｌｔａｒｍａｃｉａ社
製、スウェーデン）が撹拌されながら血漿に加えられた
（血漿１容当たり０．５ｇ乾燥Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅ
ｐｈａｄｅｘ）　、全体は６０分間撹拌された。Ｄ　Ｅ
　Ａ　Ｅ　−Ｓ　ｅｐｂａｄｅｘＡ　　５０が沈降した
ｆ＆　（静置期間１０分間）血漿はタンクの上部からポ
ンプで吸出され、涙過され（２０μｍおよび０．５μｍ
フィルタ）緩衝容器に集められた。容器の底からＤ　Ｅ
ＡＥ　−５ｅｐｈａｄｅｘが回収され、カラム（Ｂｉｏ
　−Ｐｒｏｃｅｓｓ　１１３、ＰＩ＋ａｒｎａｃｉａ社
製、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）中に集められ、洗
浄され第８実施例で記述された次の手順で脱離された。
Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｌ＋ａｄｅｘ　　Ａ　　５０
を用いた処理の後得られるＦ■を含むＰ液は、ＤＭＡ３
−Ｃ５５ｅｐｌ＋ａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂ、　０３．０
４．８８の種類のアフイニテイマトリックス（リガンド
密度９２μｍｏ　ｌ　ｅ　ｓ／ｍｊ’　、カラムＢＰ２
５２　、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）の５２と接触され、
ｐ）４７．０で１７０ｍＭ　　ＮａＣｊ！、１０ｍＭク
エン酸塩、１ｒｎＭ　　ＣａＣｌ２を用いて平衡化が行
われた。試料の注入の後、アフイニテイマトリックスは
ＰＨ７，４の１００　ｒｎ　Ｍ酢酸塩、１００ｍＭリジ
ン、１０ｍＭクエン酸塩、および１ｍＭ　　Ｃａｃｌ　
ｚの３カラム容積で洗浄された。Ｆ■の脱離はｐＨ７，
４の１００ｍＭ酢酸塩、１００ｍＭリジン、１０００ｍ
Ｍ　　ＮａＣＺ、１０ｍＭクエン酸塩、および１ｍＭ　
　ＣａＣｌ２の６力ラム分の容積で行われた。カラム中
の流速は、３０ｃｍ／１１であった。結果が次の第１９
表に示されている。
第　　１９　　表 アフイニテイマトリックスＤＭＡ３　　Ｃ５−３ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂ、０３０４゜８８　（ＬＤ９２ｐ
ｍｏｌｅｓ／ｍ／、５１）でのＦ■／ＦｖＷＦの単離の
後のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｂａｄｅｘ　Ａ　５０　（０、５
ｇ／ｆｆｉ　ｌｌ１ｗりでのＦＩ［、Ｆ■、Ｆ■、およ
びＦＸの単離ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｌ＋ａｄｅｘ−へ５０吸
着［％］＊）　　　　　　　　８７　　　９　　　８８
　　８９　　　１１　　　３脱離［％］零）　　　　　
　　　６２　　　６　　６９　　６７Ｓ、＾、（比活性
） ［ＯＦＩＫ／＋１１１１蛋白１７１　　　　　　　　　
１．８ＤＮ＾３−Ｃ５−０３，０４，８８ 吸着　［％］本本）　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　９８　　　　　　９５１脱ｊ区　［％］本本本　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　
　４５Ｓ、＾、（比活性） ［ＵＦ■：Ｃ／ｌａｇ蛋白質］１．９ 本）新鮮な血漿中の量に対する 木本）Ｑ、５μｍν５液中の呈に対する発明の効果 本発明の凝固因子の単離方法およびそれに適した吸着剤
によれば、液体クロマトグラフィを用いて血漿、血漿製
剤、細胞溶解液などの開始物質がら、血液凝固因子ＦＩ
Ｉ、Ｆ■、Ｆ■、ＦＩＸ、ＦＸおよびフォノ・ビルプラ
ント因子ｖ　Ｗ　Ｆなとの凝固因子が高純度、高収率、
および／または高い安定性をもって単離される。

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）液体クロマトグラフィを用いて血漿、血漿製剤、
    細胞溶解液（ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｓ）および発酵また
    は培養の培地などのような開始物質から凝固因子を単離
    する方法であつて、高分子支持体を含む吸着剤を使用し
    、その高分子支持体にはスペーサを介して第１、第２、
    第３、または第４アミノ基から成るリガンドが連結され
    ており、該スペーサは少なくとも原子６個分の鎖長を有
    し、該鎖中には親水性を有する少なくとも１つのリンク
    が含まれていることを特徴とする凝固因子の単離方法。
  2. （２）前記スペーサは、一般には第１式： −（ＣＨ＿２）ｍ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ＿２）ｎ−・・
    ・（１）ここでｍとｎは１〜６の値を有する整数を表し
    （ｍ＋ｎ）は少なくとも４である を満足することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
    の凝固因子の単離方法。
  3. （３）前記支持体は、ヒドロキシル基を含む高分子物質
    であり、該ヒドロキシル基にはスペーサが第２式： −ＣＯ−ＮＨ−・・・（２） を有する結合基を介して連結されていることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項または第２項記載の凝固因子の
    単離方法。
  4. （４）前記支持体は、アガロースであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項〜第３項記載のいずれかの凝固
    因子の単離方法。
  5. （５）前記リガンドは、第１アミノ基であることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項〜第４項記載のいずれかの
    凝固因子の単離方法。
  6. （６）リガンド密度は、膨潤マトリックス１ｍｌ当り３
    ０μｍｏｌｅｓよりも高く、好ましくは膨潤マトリック
    ス１ｍｌ当たり少なくとも５０μｍｏｌｅｓであること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項〜第５項記載のいず
    れかの凝固因子の単離方法。
  7. （７）吸着段階では、比導電率が２０ｍＳ／ｃｍ以下、
    好ましくは１３〜１６ｍＳ／ｃｍである緩衝液および液
    体状の開始物質を使用することを特徴とする特許請求の
    範囲第１項〜第６項記載のいずれかの凝固因子の単離方
    法。
  8. （８）マトリックスと開始物質との体積比が１：８より
    も小さく、好ましくは１：１２から１：２０であるマト
    リックスおよび開始物質を使用することを特徴とする特
    許請求の範囲第１項〜第７項記載のいずれかの凝固因子
    の単離方法。
  9. （９）緩衝液の導電率を、好ましくは塩化ナトリウムを
    用いて、増大させることによつて溶出が実現されること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項〜第８項記載のいず
    れかの凝固因子の単離方法。
  10. （１０）ｐＨを６〜８の範囲に、好ましくは約７に保持
    することを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第９項記
    載のいずれかの凝固因子の単離方法。
  11. （１１）高分子支持体を含み、その高分子支持体にはス
    ペーサを介して第１、第２、第３、または第４末端アミ
    ノ基から成るリガンドが連結された特許請求の範囲第１
    項記載の凝固因子の単離方法に用いられる吸着剤であつ
    て、該スペーサは少なくとも原子６個分の鎖長を有し、
    該鎖中には親水性を有する少なくとも１つのリンクが含
    まれていることを特徴とする吸着剤。
  12. （１２）特許請求の範囲第１項記載の凝固因子の単離方
    法において好適に用いられる吸着剤であつて、高分子支
    持体を合み、その高分子支持体にはスペーサを介して第
    １、第２、第３、または第４アミノ基から成るリガンド
    が連結されており、該スペーサは少なくとも原子６個分
    の鎖長を有し、該鎖中には親水性を有する少なくとも１
    つのリンクが含まれており、リガンド密度は膨潤マトリ
    ックス１ｍｌ当たり３０μｍｏｌｅｓより過剰であるこ
    とを特徴とする吸着剤。
  13. （１３）リガンド密度が膨潤マトリックス１ｍｌ当たり
    ５０μｍｏｌｅｓよりも高いことを特徴とする特許請求
    の範囲第１２項記載の吸着剤。
  14. （１４）前記スペーサは一般には第１式： −（ＣＨ＿２）ｍ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ＿２）ｎ−・・
    ・（１）ここでｍとｎは１〜６の値を有する整数を表し
    （ｍ＋ｎ）は少なくとも４である を満足することを特徴とする特許請求の範囲第１２項ま
    たは第１３項記載の吸着剤。
  15. （１５）前記支持体はヒドロキシル基を含む高分子物質
    であり、その高分子物質には第２式： −ＣＯ−ＮＨ−・・・（２） の結合基を介してスペーサが結合されていることを特徴
    とする特許請求の範囲第１２項〜第１４項記載のいずれ
    かの吸着剤。
  16. （１６）前記支持体はアガロースであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１２項〜第１５項記載のいずれかの
    吸着剤。
  17. （１７）前記リガンドは第１アミノ基であることを特徴
    とする特許請求の範囲第１２項〜第１６項記載のいずれ
    かの吸着剤。
JP63202624A 1987-08-14 1988-08-12 凝固因子の単離方法およびそれに適した吸着剤 Pending JPH01157000A (ja)

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