CN104603144A - 混合模式抗体亲和分离基质和使用其的纯化方法及靶分子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种混合模式抗体亲和分离基质，其在同一分离基质中具有抗体亲和配体和阳离子交换基。在抗体或含Fc靶分子纯化工序的第一层析工序中，这样的基质可提高作为亲和纯化的主要目的的抗体自身的纯度，同时可提高单体的选择分离特性，并且在凝聚体除去方面，可降低对后段的杂质除去工序的负荷。

Description

混合模式抗体亲和分离基质和使用其的纯化方法及靶分子
技术领域
本发明涉及一种用于将靶分子特异性地纯化的亲和分离基质、特别是亲和配体和其它配体可同时或连续地在单一基质上发挥作用的新型混合模式抗体亲和分离基质、使用有该分离基质的纯化方法及靶分子。
背景技术
亲和配体具有与特定的分子特异性结合的功能，将该配体在水不溶性载体上固定化而成的亲和分离基质可以用于从含有生物体成分或重组体的微生物及哺乳类培养细胞中有效地分离纯化有用物质。作为实际工业上利用的抗体亲和配体，例如可以举出：由蛋白A或蛋白G、蛋白L等源自微生物或使它们重组表达而得到的功能性修饰体(类似物)构成的肽性或蛋白质性配体、骆驼单链抗体(ラクダー一本鎖)或抗体的Fc受体等重组蛋白质性配体、及噻唑衍生物等化学合成性配体，用于抗体医药品等的纯化。抗体医药品相对于化学药品显示更低的毒性且显示更高的特异性，因此，作为理想的医药品，其需求不断增高。
作为抗体医药品的主要成分的单克隆抗体主要使用哺乳类培养细胞等以重组蛋白质的形式在培养液中表达，通过多级层析或膜工序高纯度纯化后进行制剂化。抗体医药品为免疫球蛋白G及其类似物，一般而言除称为抗体的分子以外，还包含将免疫球蛋白分子的恒定区域即Fc区域和其它的功能性蛋白质或肽融合而成的Fc融合蛋白质(含Fc分子)。另外，这些抗体医药品还包含以微生物为宿主，在其培养上清液中分泌表达的医药品、在菌体内或菌体外壁和菌体细胞膜之间蓄积表达、纯化、制剂化的医药品。
该培养、纯化、制剂化的工序中所形成或残留的凝聚体(二聚体以上的多聚体)成为副作用的主要原因，因此，降低其含量成为抗体医药品生产的重要课题。在此，所谓单体，例如在抗体的情况下，将四聚体结构的抗体定义为1个分子单位，所述四聚体结构的抗体具有下述构成：由作为恒定区域的Fc区域和可变区域构成的重链(H链)2分子以及由可变区域构成的氢链(L链)2分子构成。该单位分子的多聚体形成凝聚体，成为抗体医药品的副作用的主要原因。
在培养、纯化、制剂化的工序中通过使用复杂的管理方法及添加剂来尝试对抑制凝聚体的生成及其除去进行控制。特别是在纯化工序中，除抑制凝聚体的生成以外将其除去也很重要。因此，在纯化工序中，要求开发一种简便且有效的凝聚体除去技术。
抗体医药品的纯化工序中，利用特定单元操作的组合进行的纯化方法的模板化(平台化)不断发展，在其初期纯化工序(回收工序)中，广泛利用将作为配体的蛋白A固定化于水不溶性载体而成的抗体亲和分离基质(蛋白A载体)。一般而言使用在中性条件下使抗体吸附于蛋白A载体，在酸性条件下使抗体溶出的方法，但在该溶出过程中暴露于酸性条件下的抗体容易变性而形成凝聚体。一般而言，在蛋白A层析工序的后段，可通过离子交换层析或疏水性相互作用层析等的组合除去凝聚体等杂质(非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3、专利文献5)。
然而，在蛋白A层析工序后凝聚体含量较多时，在后段的杂质除去工序中导致目标单体(monomer)的收率降低，因此，除尝试抑制蛋白A层析工序中的凝聚体形成以外，还进一步尝试了除去该层析工序中的凝聚体。
蛋白A层析工序通常进行酸性溶出，但溶出pH越低，形成凝聚体的风险越高，因此，对蛋白A配体进行了施加蛋白质工程学修饰的尝试，使得需要pH3左右的较低pH溶出的抗体也能够在pH3.5～4左右溶出(专利文献1)。
另外，在蛋白A层析工序的使用工序中，研究了提高凝聚体的分离性的方法。即，提出了一种溶出时的pH或离子强度的优化、以及划分溶出峰的前半部分和后半部分等的方法。具体而言，是利用由于作为蛋白A载体的特性多聚体化而成的抗体分子以比未多聚体化的抗体分子有更高的概率与蛋白A配体接触，因此，解离常数稍微变低，且基于微调疏水性的分离机制的方法(专利文献2、专利文献3、专利文献4)。但是，这些方法难以进行严密的控制，此外，分离性能低，无法用作一般的分离方法。
如上所述，抗体亲和分离基质虽然对抗体显示较高的特异性且可达到高纯度化，但即使严密地设置使用方法，单体和凝聚体的分离性能也较低，因此，作为凝聚体的除去工序存在限制。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4391830号
专利文献2：WO2008/085988
专利文献3：日本特表2010-507583
专利文献4：WO2010/019493
专利文献5：WO2010/141039
非专利文献
非专利文献1：Hober S.等著，“J.Chromatogr.B”，2007年，848卷，40-47页
非专利文献2：HLow D.等著，“J.Chromatogr.B”，2007年，848卷，48-63页
非专利文献3：Roque A.C.A.等著，“J.Chromatogr.A”，2007年，1160卷，44-55页
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于，提供一种新型分离材料和其分离方法，其中，在抗体或含Fc靶分子纯化工序的第一层析工序中，可提高作为亲和纯化的主要目的的抗体自身的纯度，同时可提高单体的选择分离特性，并且关于凝聚体除去，可降低对后段的杂质除去工序的负荷。
用于解决课题的技术方案
本发明人鉴于上述课题进行了潜心研究，结果发现，通过在非水溶载体上将抗体亲和配体和阳离子交换基(阳离子交换配体)两者固定化，各自的配体协同地作用，可得到兼具对抗体等含Fc靶分子的特异性吸附性能和优异的凝聚体除去性能的分离基质，完成了本发明。
即，本发明的混合模式抗体亲和分离基质为在同一分离基质中具有抗体亲和配体和阳离子交换基的混合模式抗体亲和分离基质。
另外，基于在靶分子的溶出pH条件下的阳离子交换基的动态结合容量优选为基于在中性条件下的抗体亲和配体的动态结合容量的2倍以下。
进而，优选对具有抗体亲和配体的分离基质附加阳离子交换基而成。
另外，优选对具有阳离子交换基的分离基质附加抗体亲和配体而成。
抗体亲和配体优选为选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白H、蛋白D、蛋白Arp、蛋白FcγR、抗体结合性合成配体及它们的类似物中的至少1种，抗体亲和配体优选为选自蛋白A、蛋白G、蛋白L及它们的类似物中的至少1种。
另外，抗体亲和配体优选为选自蛋白A及它们的类似物中的至少1种。
另外，阳离子交换基优选为含有选自羧基及硫酸基中的至少1种的配体。
分离基质的水不溶性载体基材优选为选自碳水化合物及其衍生物、合成聚合物以及玻璃中的至少1种，分离基质的基材的结构优选为多孔性珠、整体柱或膜。
进而，本发明为一种靶分子的纯化方法，其使用有所述混合模式抗体亲和分离基质。
靶分子的溶出pH优选为6以下，靶分子的溶出pH进一步优选为2以上。
靶分子优选为免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、或含Fc分子。
另外，本发明为通过本发明的纯化方法纯化的靶分子。
发明的效果
根据本发明，在抗体等含Fc靶分子纯化工序的第一工序即亲和层析工序中，可提高作为亲和纯化的主要目标的抗体自身的纯度，同时可提高单体的选择分离特性，并且可降低对于后段的杂质除去工序的负荷。
具体实施方式
本发明的混合模式抗体亲和分离基质的特征在于，抗体亲和配体和阳离子交换基一起通过共价键固定化于分离基质(本说明书中，也称为水不溶性载体、载体)。
本发明为在水不溶性载体中具有抗体亲和配体和阳离子交换基的混合模式抗体亲和分离基质，因此，可使用预先将一方固定化的分离基质来制备。即，可以在具有抗体亲和配体的分离基质中导入阳离子交换基，或在具有阳离子交换基的分离基质中将抗体亲和配体固定化。或者，也可以在水不溶性载体中同时将两配体固定化。
以下，对本发明中的抗体亲和配体、阳离子交换基、水不溶性载体、抗体亲和配体及阳离子交换基向载体上的结合(固定化)等详细地进行说明。
本发明中的所谓“抗体亲和配体”是指，抗原和抗体的结合所代表的基于特异性的分子间亲和力从某种分子的集合中选择性地收集(结合)靶(目标)分子的物质。
可用于本发明的抗体亲和配体只要具有可与作为靶分子的抗体或抗体的恒定区域即含Fc分子特异性结合的特征，就没有特别限定，优选为肽性配体、蛋白质性配体或化学合成性配体(合成化合物)。从相对于靶分子的特异性的观点考虑，进一步优选为肽性或蛋白质性配体，其中，抗体亲和配体特别优选为选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白H、蛋白D、蛋白Arp、蛋白FcγR、抗体结合性合成肽配体及它们的类似物。作为抗体亲和配体，更优选为蛋白A、蛋白G、蛋白L及它们的类似物，最优选为蛋白A及其类似物。抗体亲和配体只要具有靶分子结合结构域(单体肽或蛋白质、单结构域)就没有特别限制，优选2个以上的结构域连结而成的多聚体肽或蛋白质(多结构域)，更优选2～10个，更优选2～8个，进一步优选2～6个，特别优选为3～6个结构域连结而成的多聚体蛋白质。这些多聚体蛋白质也可以是作为单一靶分子结合结构域的连结体的同源二聚体、同源三聚体等均聚物，若靶分子相同，则也可以是作为多种靶分子结合结构域的连结体的异源二聚体、异源三聚体等杂聚物。
作为连结本发明的抗体亲和配体的靶分子结合结构域的方法，优选使多聚体蛋白质的三维立体结构稳定的方法，例如可以举出：经由结构域序列的末端氨基酸的连结方法、不经由结构域序列的氨基酸残基而进行连结的方法、或用1或多个结构域序列以外的氨基酸残基进行连结的方法，并不限定于这些方法。
作为本发明的抗体亲和配体，可优选使用将多聚体蛋白质作为1个构成成分且与功能不同的其它蛋白质融合而成的融合蛋白质。作为融合蛋白质，可以举出：融合了白蛋白或GST(谷胱甘肽S-转移酶)的蛋白质，或融合了DNA适体等核酸、抗生素等药物、PEG(聚乙二醇)等高分子的蛋白质等，但并不限定于这些蛋白质。
本发明中的“阳离子交换基”，只要满足下述条件即可：可在作为靶分子的抗体或含Fc分子从抗体亲和配体中溶出(洗脱)的条件下作为阳离子交换基发挥作用而捕捉靶分子，同时通过钠离子、钾离子等抗衡离子按照该靶分子的单体(monomer)、凝聚体的顺序离子强度依赖性地溶出(洗脱)。例如，作为阳离子交换基，可以举出羧基或硫酸基。在靶分子从抗体亲和配体溶出的pH范围内，优选避免形成局部的酸性环境，优选为弱酸性基团。例如，在将蛋白A作为抗体亲和配体的情况下，优选利用羧基作为阳离子交换基。
可用于本发明的“水不溶性载体”为不溶于水的基材，只要能够将抗体亲和配体和阳离子交换基固定化，就没有特别限制，例如可以举出：玻璃珠、硅胶等无机载体，由交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子、结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类构成的有机载体，以及由它们的组合得到的有机-有机、有机-无机等复合载体等。作为市售品，可例示作为多孔质纤维素凝胶的GCL2000、将烯丙基葡聚糖和亚甲基双丙烯酰胺以共价键交联而成的Sephacryl S-1000、作为丙烯酸酯类载体的Toyopearl、作为琼脂糖类交联载体的Sepharose CL4B、Rapid Run Agarose Beads、及作为纤维素类交联载体的Cellufine等。上述水不溶性载体也可以分类为碳水化合物及其衍生物、合成聚合物、玻璃等，这些可适宜组合。
另外，用于本发明的水不溶性载体从每单位时间的处理容量的观点考虑，希望其表面积较大，优选为具有多个适当大小的细孔的多孔质。作为载体的形态，可以为珠状、整体柱状、纤维状、膜状(包含中空纤维)等的任一种，可选择任意的形态。作为水不溶性载体，优选多孔性珠、整体柱、或膜，特别是为了让配置在水不溶性载体上的抗体亲和配体和阳离子交换基发挥协同作用，其物理距离接近，可得到一定的滞留时间，这样可有效地发挥该分离基质的功能，从该方面考虑，优选多孔性珠(多孔质珠)。在将阳离子交换基在固定化有抗体亲和配体的载体上进行固定化的情况下，从抗体亲和配体导入的难易度的方面考虑，优选由多糖类构成的、或者用单糖或多糖类进行了修饰的载体。具体而言，优选琼脂糖或纤维素载体，但并不特别限定于此。
作为将抗体亲和配体固定化于分离基质的方法，可使用一般的方法。例如抗体亲和配体的氨基可以经由导入在载体上的甲酰基与载体结合，抗体亲和配体的氨基也可以经由载体上的被活化的羧基与载体结合。另外，这些水不溶性载体可以在抗体亲和配体导入之前进行活化以使配体可与载体共价键合，也可以使用市售的活化载体，也可以自行进行活化。
作为通过活化导入水不溶性载体的官能团，只要是能与抗体亲和配体形成共价键的官能团就没有特别限定，例如可以举出用环氧基(环氧氯丙烷)、溴化氰、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸盐(DSC)等活化的羟基、醛基或活化羧基(例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、羰基二咪唑(CDI)活化酯)等反应性官能团(“活化基团”)等(Hermanson G.T.等著、“Immobilized Affinity Ligand Techniques，Academic Press”、1992年、美国专利第5,874,165号、美国专利第3,932,557号、美国专利第4,772,653号、美国专利第4,210,723号、美国专利第5,250,6123号、欧州专利公开第1352957号、WO2004/074471)。其中包含将抗体亲和配体直接共价键合于载体的官能团和使用直链、支链、或环状连接基团(linker)或间隔基团(spacer)的官能团。另外，在将导入了抗体亲和配体的载体活化时，优选不与抗体亲和配体直接发生反应的活化方法。
在抗体亲和配体内，将蛋白质性配体固定化于载体的方法可使用使蛋白质的官能团的一部分和载体的官能团的一部分发生反应的方法，可利用于该反应的蛋白质侧的主要官能团(活性基团)可以举出N末端氨基酸及赖氨酸
(Lys)侧链的氨基、或者半胱氨酸(Cys)侧链的硫醇基、或者C末端氨基酸及谷氨酸(Glu)侧链及天冬氨酸(Asp)侧链的羧基等，但并不限定于这些官能团。
另外，作为控制配体的取向性并将蛋白质性抗体亲和配体固定化于水不溶性载体的方法，提出了一种利用在C末端具有半胱氨酸的蛋白A的方法(美国专利第6,399,750号、Ljungquist C.等著，“Eur.J.Biochem.”，1989年，186卷，557-561页)。
作为利用连接基团的固定化技术，除确保载体和配体的距离、排除立体位阻而谋求高性能化的方法以外，还可以举出：在连接基团或间隔基团中赋予、形成官能团(例如带电胺)的方法等。一直在对通过在抗体亲和配体固定化时配体有效地聚集于连接基团或间隔基团部分，提高固定化收率来提高分离性能进行研究。例如可以举出：向利用作为连接臂的一部分的经NHS活化的羧酸衍生物化而成的琼脂糖载体上固定化蛋白质配体的固定化技术(美国专利第5,260,373号、日本特开2010-133733、日本特开2010-133734)。
另外，也提出了一种除连接基团或间隔基团以外，在载体上利用缔合性基团，在使抗体亲和配体聚集于载体之后，缔合性基团和抗体亲和配体之间不形成共价键而在水不溶性载体上将抗体亲和配体分别固定化的方法(日本特开2011-256176)。
作为将阳离子交换基固定化或导入水不溶性载体的方法，在抗体亲和配体固定化之前导入阳离子交换基的情况下，通常可利用阳离子交换体的制作中所使用的方法。例如：作为向糖骨架导入羧甲基的方法，有在碱性条件下使一氯乙酸进行反应的方法；作为导入硫酸基的方法，有在碱条件下使硫酸进行反应的方法；但并不限定于这些方法。也可以通过向水不溶性载体导入与氨基反应的活性基团后，经由氨基酸的氨基将氨基酸固定化来导入羧基。
在导入抗体亲和配体后导入阳离子交换基的情况下，优选将抗体亲和配体的活性降低抑制在最小限度的方法。例如可以使高碘酸钠与水不溶性载体上存在或导入的二醇基反应而使载体活化来导入醛基，添加在同一分子内具有氨基和阳离子交换基的分子，在亚胺形成后进行还原处理，由此通过还原氨基化法使载体上的醛基和氨基共价键合而导入阳离子交换基。从配体洗脱时的毒性的观点考虑，氨基酸的羧基导入方法也优选以抗体纯化用分离基质的材料的方式进行。
也可以将抗体亲和配体和阳离子交换基连续地或同时地导入水不溶性载体。例如使高碘酸钠与水不溶性载体上存在或导入的二醇基反应使载体活化而导入醛基。在其中添加抗体亲和配体进行固定化时，可与其连续地或同时地添加在同一分子中具有氨基和阳离子交换基的氨基酸等分子，通过还原氨基化法对水不溶性载体上的各个醛基分别导入抗体亲和配体和阳离子交换基。
阳离子交换基可以直接固定化于水不溶性载体，也可以经由间隔基团、连接基团等进行固定化。另外，只要能在靶分子从抗体亲和配体上溶出(洗脱)的酸性pH条件下作为阳离子交换体发挥作用，则阳离子交换基、间隔基团或连接基团也可以包含具有其它功能的官能团，它们的分子形状也没有特别限制。
本发明为将抗体亲和配体和阳离子交换基一起经由共价键固定化在由水不溶性基材构成的载体上而形成的混合模式抗体亲和分离基质，其特征在于，具有将不同的分离功能复合，且由各分离机能的协同作用而带来的优异的分离性(例如单体的选择性、凝聚体的除去性)。
作为抗体医药品的纯化平台工艺中所利用的第一层析和第二层析的代表例，可使用例如蛋白A层析和阳离子层析的组合。
在第一层析中，所使用的蛋白A层析的单体与凝聚体的分离性能低，分离的稳定性也不足，因此，通常选择将作为靶分子的抗体或含Fc分子的变性或凝聚抑制在最小限度的同时可得到高回收率的溶出条件，而凝聚体等的除去由后段工艺来担负。
在选择阳离子交换层析作为第二层析的情况下，一般而言以吸附洗脱模式进行凝聚体或其它杂质的除去，但需要将来自蛋白A载体的溶出液调整为适于阳离子交换层析吸附的pH及离子强度，此外，凝聚体等的分离性能依赖于载样量，在优先分离的情况下，可以对载样量设置限制。因此，存在多种限制因素，而不能说可进行有效地进行凝聚体分离。
另一方面，在使用本发明的混合模式抗体亲和分离基质的情况下，通过具有两种配体的单体(monomer)与凝聚体的分离功能的协同作用，显示出优异的分离特性，此外，能够将2个工序的层析操作缩短为1个工序，可以期待使用的缓冲液的种类及使用量、以及工作时间的缩短。
另外，本发明的混合模式抗体亲和分离基质可通过在靶分子从抗体亲和配体溶出的狭窄的pH范围(优选为pH3～4，更优选为pH3.1～3.9，进一步优选为pH3.2～3.8)内，对离子强度(优选为10～500mM，更优选为15～400mM，进一步与优选为20～350mM，使用2种以上在上述范围内阶段性增高盐浓度的“逐步溶出”，或者使用在上述范围内梯度性增高盐浓度的“梯度溶出”)进行设定来得到单体含量高的溶出级分。特别是在单克隆抗体的纯化中，由于该溶出pH大幅偏离靶分子的等电点，因此，每个抗体的溶出离子强度的幅度没有较大的差异，可期待能够在狭窄的范围内设定各种靶分子的使用条件。进而，在使用修饰蛋白A配体作为抗体亲和配体的情况下，除了可进一步狭窄地设定溶出pH范围以外，还可以通过使用碱CIP(cleaning in place；原位清洗)进行有效的清洗，因此，从构建稳定的工艺的观点考虑，优选利用修饰蛋白A。
通常用作混合模式分离基质的、以由离子交换基和疏水基团构成的合成化合物作为配体的分离基质，即使靶分子为单克隆抗体，由于疏水性及等电点的不同等，各靶分子的使用条件的设定也不同，此外，特异性也较低，作为回收工序难以平台化。
另一方面，本发明的混合模式抗体亲和分离基质在吸附时通过抗体亲和配体可发挥较高的特异性，此外，通过在抗体亲和配体的溶出条件范围内设定离子强度，可容易地设定其使用条件，从该方面考虑，比现有的混合模式分离基质更优异。
更具体而言，关于本发明的混合模式抗体亲和分离基质的使用方法，在中性附近下吸附抗体等靶分子时，优选添加一定浓度以上的阳离子交换基的抗衡离子来使用，在该条件下，阳离子交换体的功能不发生作用，另外，即使发生作用，也可以通过更高离子强度的清洗，来清洗除去源自其阳离子交换基的非特异性吸附物。另一方面，离子强度不阻碍抗体亲和配体的吸附，能够以高特异性吸附目标物质，此外，通过使用高离子强度的清洗液，可有效地清洗除去非特异性地吸附于基材、连接基团、间隔基团、配体及靶分子的分子。
通常，使重组单克隆抗体表达的培养上清液由于具有接近于人等的体液的离子强度，因此，即使直接供于本发明的分离基质也可维持较高的特异性，此外，还可通过更高离子强度的清洗液进一步减少杂质。
另外，已知如下方法：在将抗体亲和配体在分离基质上固定化时，使用离子交换基或疏水性官能团将该配体非共价键合于基材载体上且有效地聚集于基材载体上，以提高固定化率(日本特开2011-256176)。对该方法而言，(1)从未伴有对凝聚体等的分离性能的改善的方面考虑，本质上与本发明不同，(2)从抗体亲和配体聚集在基材载体上，未利用作为本发明的另一配体的阳离子交换基的方面考虑，在制备原理上与本发明有明显区别，(3)从本发明的分离基质具有对凝聚体的优异的分离特性的方面考虑，在功能上也有明显区别。
本发明的分离基质的特征在于，也可通过在固定化了抗体亲和配体的抗体亲和载体上追加导入阳离子交换基来制备，且可与抗体亲和配体的固定化相独立地导入期望的离子交换基。
另外，一般已知在NHS活性化载体中导入抗体亲和配体的方法，但通常在向经NHS活化的羧基导入蛋白质性配体后，使羧基与胺等反应而失活，因此，没有有意地利用羧基的功能的例子。因此，该一般方法与有意地导入阳离子交换基的本发明有明显区别。在本发明中，阳离子交换基的导入可以为抗体亲和配体的导入的前后的任一种，关于配体的导入方法，也并不限定于使用通过NHS等活化了的羧基。
公开了一种将羧基有效地导入不溶性载体的方法及使用将导入的羧基活化了的载体制备抗体亲和分离基质的方法(日本特开2010-133733、日本特开2010-133734)，但NHS活化以后的方法与公知的使用NHS活化载体的亲和配体固化方法没有任何改变。本发明为同时利用抗体亲和配体和阳离子交换基来减少凝聚体等杂质的新型的混合模式抗体亲和分离基质及其使用方法，与以往使用NHS活化载体制备的抗体亲和分离基质有明显区别。
根据本发明制备的混合模式抗体亲和分离基质可通过抗体亲和配体和阳离子交换基的比率调节其功能。在抗体亲和配体的结合容量比阳离子交换基的结合容量大的情况下，存在酸性溶出时即使在低离子强度下抗体也可以从载体溶出的倾向，在抗体亲和配体的结合容量与阳离子交换基的结合容量为相同程度或较低的情况下，存在低离子强度时从抗体亲和配体溶出的抗体被较牢地保持在阳离子交换基上而抗体不易溶出的倾向，为了得到更高的回收率，需要较高地设定溶出离子强度。在任一情况下均可通过调节离子强度来控制回收率及其单体比率。
基于抗体亲和配体的抗体结合容量和基于阳离子交换基的抗体结合容量的比率没有特别限制，但在本发明的混合模式抗体亲和分离基质中的靶分子(特别是抗体、更优选为人IgG或人源化单克隆抗体等IgG。)的溶出pH条件下，基于阳离子交换基的靶分子(特别是抗体，更优选为人IgG或人源化单克隆抗体等IgG)的动态结合容量优选相对于抗体吸附条件下(中性条件下)的基于抗体亲和配体的靶分子(特别是抗体，更优选为人IgG或人源化单克隆抗体等IgG)的动态结合容量为2倍以下，更优选为等量以下，特别优选为1/5以下。下限值例如可以为1/100以上，也可以为1/50以上。在基于阳离子交换基的抗体结合量小的情况下，可较低地设定溶出离子强度，存在不需要利用后段的抗体纯化工艺进行脱盐等处理的倾向，此外，溶出离子强度的设定幅度窄，工艺开发容易。
利用本发明的混合模式亲和分离基质纯化的靶分子为免疫球蛋白G及其类似物(包含衍生物)，一般而言除称为抗体的分子以外，还包含将免疫球蛋白分子的恒定区域即Fc区域与其它的功能性蛋白质或肽融合而成的Fc融合蛋白质(含Fc分子)。这些可用作抗体医药品的原料。
以下，针对靶分子为免疫球蛋白G的情况对使用了本发明的混合模式抗体亲和分离基质的纯化方法的详细说明进行例示，但本发明并不限定于此。
使用有混合模式抗体亲和分离基质的靶分子(抗体)的纯化大致由吸附工序、清洗工序、离子强度调节工序、溶出工序这4个工序构成，此外，还可以含有之后的再生工序及/或CIP工序、再平衡化工序等用于再利用的工序。
在吸附工序中，可使用一般的亲和柱层析纯化方法。即，在其一个例子中，将含有免疫球蛋白G的蛋白质溶液的pH调整为中性附近后，使该溶液通过填充有本发明的混合模式抗体亲和分离基质的柱，经由抗体亲和配体将蛋白G特异性地吸附于分离基质。例如在将蛋白A作为抗体亲和配体的情况下，其载样pH优选为6以上，更优选为6.3以上且9以下，进一步优选为6.5以上且8.5以下。在由哺乳类培养细胞生产的免疫球蛋白G的纯化中，不需要特别调整离子强度，此外，也可预先提高离子强度而进一步抑制非特异吸附。
在清洗工序中，使在抗体亲和配体发挥作用的条件范围内的缓冲液适量通过来清洗柱内部。即，pH的优选范围也可以为与上述载样时相同的范围(中性附近的pH)，例如优选为6以上。此时，作为靶分子的免疫球蛋白G吸附于本发明的混合模式抗体亲和分离基质。此时，通过在中性附近的pH下将离子强度及组合物优化，有时可有效地除去杂质。在载样、清洗时，优选阳离子交换基不发挥作用的条件，即，优选利用中性附近的pH且具有一定以上离子强度的清洗液，在该过程中，可清洗经由该分离基质及/或免疫球蛋白G而非特异性地残留于柱的杂质。离子强度例如优选为0.2M以上，更优选为0.5M以上。
在离子强度调节工序中，用中性附近且离子强度低的缓冲液置换柱，为在溶出时基于阳离子交换基的离子强度依赖性溶出功能的发挥而准备。
在溶出工序中，通过酸性pH、离子强度的组合，在从抗体亲和配体溶出时，阳离子交换分离模式发挥作用，在两种配体的协同作用下，可将单体含量高的级分回收于低离子强度溶出级分中。溶出液的pH可应用免疫球蛋白G从抗体亲和配体溶出的pH。该pH由于以抗体亲和分离基质和免疫球蛋白G的种类而确定的分离条件为中心来确定，因此，不需要特别的条件设定，所述抗体亲和分离基质由用于混合模式抗体亲和分离基质的制作的抗体亲和配体所构成。
在抗体亲和配体中使用蛋白A的情况下，pH优选设定在6～2之间。但是，为了避免靶分子的酸变性，更优选为pH3.0以上，更优选为pH3.3以上，特别优选为pH3.5以上。pH优选为5.5以下，更优选为5.0以下。
在使用耐碱性型的蛋白A配体的情况下，一般而言其溶出pH以3.5～4.0之间为中心进行设定，但并不限定于此。另外，溶出离子强度依赖于抗体亲和配体与阳离子交换基的导入比率，此外，也依赖于每单位体积的免疫球蛋白G的载样量，可通过梯度实验或逐步溶出实验容易地设定优化点。
从根据本发明制备的混合模式亲和分离基质的抗体溶出，无论是盐浓度梯度溶出还是逐步溶出均可应用，但在以降低溶出液量为目的的情况下，优选基于离子强度的逐步溶出。进而，为了简化操作，优选设定为能实现通过一步溶出进行抗体的回收并实现高单体含量的条件。
另外，在即使进行清洗工序的离子强度和酸性pH的组合，凝聚体也残留于柱而不会混入溶出级分的情况下，可省略离子强度调节工序。
使用根据本发明制备的混合模式抗体亲和分离基质纯化的免疫球蛋白G显示出比基于单一分离模式的抗体亲和分离基质更高的单体选择性，其溶出液中的单体含量较高。
在使用基于单一分离模式的抗体亲和分离基质的情况下，也可通过溶出pH及离子强度等的优化来稍微提高单体含量，但其效果低，其效果的显现伴有更大的回收率的降低。通过使用本发明的混合模式抗体亲和分离基质，能够在保持高回收率的状态下通过单一层析操作有效地实现单体含量的提高，所述单体含量的提高可以通过特异性高的亲和纯化和主要通过阳离子交换层析来实现，因此，可降低对后段工艺的负荷，可有助于工艺整体的收率提高和单体含量的提高。即，通过使用本发明的新型混合模式抗体亲和分离基质，可有助于抗体医药品的制造工艺的生产率提高和高纯度化。
本申请要求基于在2012年9月3日申请的日本专利申请第2012-193069号的优先权。以参考的方式将在2012年9月3日申请的日本专利申请第2012-193069号的说明书的全部内容引用到本申请中。
实施例
以下，基于实施例对本发明更详细地进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
(载体的制备例1)
蛋白A固定化载体的制备
在反应容器中取以湿润体积计为4mL量的用水置换的Low densityGlyoxal 4Rapid Run(ABT公司)作为4％琼脂糖珠，用水使浆料体积达到5mL后，加入0.25M柠檬酸钠(pH3.5)溶液1mL。再加入0.8M高碘酸钠2mL，在室温下翻转搅拌0.5小时，得到导入了醛基的载体。用水及作为磷酸缓冲液的达尔伯克PBS(-)(日水)(以下称为PBS)将该载体的浆料充分清洗，在回收后使浆料的量为5mL。然后，加入0.1M磷酸钠、1M柠檬酸钠、0.3M氯化钠的混合溶液(pH6.8)5mL，在混合后将液量调整为5.5mL。在其中加入5N氢氧化钠水溶液，将载体浆料的pH调节为11.5～12之后，立即加入100mg的蛋白A并在2～8℃的条件下搅拌2.5小时。使用1M柠檬酸溶液将载体浆料的pH调节为7～5之后，加入1M的二甲胺硼烷0.5mL，在室温下翻转搅拌过夜。用水、0.1M柠檬酸、0.1M氢氧化钠、及PBS充分清洗，得到以共价键将蛋白A固定化(键合)于琼脂糖的蛋白A载体(载体1)。需要说明的是，在此使用的蛋白A基于国际公开公报WO2011/118699的实施例而制备。
对载体1而言，测定了其作为抗体亲和分离基质的抗体结合容量，特别是动态结合容量。具体而言，直至未与蛋白A载体结合的IgG3等级分以外的载样IgG的10％漏出为止，根据此时结合于柱的抗体量除以柱中的载体体积而得到的值，将每1mL载体的IgG吸附量作为10％动态结合容量(Dynamicbinding capacity；DBC)算出。层析条件示于以下，载样时的流速设为0.4mL/min，求出接触时间为6分钟的动态结合容量。另外，载样以外的流速设定设为0.6mL/分钟(接触时间：4分钟)。
关于载体1，作为接触时间为6分钟的抗体亲和分离基质的10％DBC为56.0mg。
基于抗体亲和配体的10％DBC测定中使用的层析条件
柱：ID 0.66cm×柱长(Height)7cm(Omnifit公司制)
流速：0.4mL/分钟(接触时间：6分钟)或0.6mL/分钟(接触时间：4分钟)
多克隆抗体(IgG)：GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(人免疫球蛋白G)(日本制药)
载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS：达尔伯克·日水)
平衡液：PBS(pH7.4)
溶出液：50mM乙酸、0.1M氯化钠(pH3.75)
再生液：0.1M乙酸、1M氯化钠
CIP液：0.1M氢氧化钠、1M氯化钠
中和·再平衡液：PBS(pH7.4)
(载体的制备例2)
通过将蛋白A固定化于导入了羧基的载体而进行的混合模式抗体亲和分离基质的制备
在反应容器中取以湿润体积计为4mL的用水置换的Low density Glyoxal4Rapid Run(ABT公司)作为4％琼脂糖珠，用水使浆料体积达到5mL后，加入0.25M柠檬酸钠(pH3.5)溶液1mL。然后，加入0.1M柠檬酸和0.1M谷氨酸的混合溶液(pH3.5)1mL并搅拌。再加入0.8M高碘酸钠0.5mL，在室温下翻转搅拌1小时而导入醛基。用以冷水稀释为100倍的1M谷氨酸/PBS(pH7)将该载体浆料清洗5次，在回收后使浆料的液量为5mL。在其中添加1M谷氨酸/PBS(pH7)5mL，在室温下翻转搅拌2小时之后，追加投入1M的二甲胺硼烷水溶液0.5mL并在室温下翻转搅拌过夜。进行离心使载体沉降后，除去上清液使液面为6mL，并在其中直接加入20mg的硼氢化钠，在室温下进一步翻转搅拌2小时。用添加了水、0.1M柠檬酸、0.1M氢氧化钠、及0.5M的NaCl的PBS充分清洗，得到了用还原氨基化法经由谷氨酸的氨基向醛基导入了羧基的琼脂糖载体。
然后，将导入了羧基的琼脂糖载体用0.1M MES、0.5M NaCl(pH6)(MES缓冲液)清洗并进行液体置换后，在反应容器中取以湿润体积计为4mL的相同载体，使浆料体积为5mL。在其中溶解NHS使每20mLMES缓冲液中NHS量为0.25g，接下来加入溶解了1.5g的EDC而制备成的NHS/EDC溶液5mL，在室温下翻转搅拌15分钟之后，用冷却后的PBS充分地清洗，得到了将羧基的一部份EDC/NHS化而成的琼脂糖载体。将液量调整为7mL，加入80mg的蛋白A并翻转搅拌2小时。将其置换为0.1N的氢氧化钠溶液并清洗，将未与蛋白A反应的EDC/NHS化的羧基再生，作为导入了羧基的蛋白A载体，得到本发明的混合模式抗体亲和分离基质(载体2)。需要说明的是，在此使用的蛋白A基于国际公开公报WO2011/118699的实施例而制备。
对载体2测定了基于抗体亲和配体的抗体结合容量。测定方法与载体的制备例1相同，求出接触时间为6分钟的10％DBC的结果为10.2mg。
然后，对载体2测定了基于阳离子交换基的抗体结合容量。作为抗体的载样条件，几乎没有作为抗体亲和配体的蛋白A的抗体捕捉能力，使用了能使作为阳离子交换基导入的羧基发挥作用的条件的pH3.5的10mM乙酸缓冲液。阳离子交换基与蛋白A配体不同，对IgG3等不显示选择性，因此，载样开始至总载样IgG的10％漏出为止，根据结合于柱的抗体量除以柱中的载体体积而得到的值，将每1mL载体的IgG吸附量作为10％DBC算出。层析条件示于以下，载样时的流速设为0.4mL/分钟，求出接触时间为6分钟的动态结合容量。另外，载样以外的流速设定为0.6mL/分钟(接触时间：4分钟)。关于载体2，基于阳离子交换基的导入的抗体溶出条件下的接触时间6分钟的10％DBC为10.6mg。
如上所述，可得到作为本发明的混合模式抗体亲和分离基质的载体2，其中，基于阳离子交换基的导入的抗体结合容量比基于抗体亲和配体的抗体结合容量稍高。
基于阳离子交换基的10％DBC测定中使用的层析条件
柱：ID 0.66cm×柱长(Height)7cm(Omnifit公司制)
流速：0.4mL/分钟(接触时间：6分钟)或0.6mL/分钟(接触时间：4分钟)
多克隆抗体(IgG)：GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(日本制药)
载样液：2.5mg-IgG/mL(10mM乙酸：pH3.5)
平衡液：10mM乙酸(pH3.5)
溶出液：10mM乙酸、0.5M氯化钠(pH3.5)
CIP液：0.1M氢氧化钠、1M氯化钠
中和·再平衡液：10mM乙酸(pH3.5)
(载体的制备例3)
通过将羧基固定化于导入了蛋白A的载体而进行的混合模式抗体亲和分离基质的制备
作为蛋白A固定化载体，向置换为0.5M食盐水的MabSelect SuRe(GEHealthcare Bio-Sciences公司、载体3)导入羧基。将MabSelect SuRe作为载体3并在反应容器中取以湿润体积计为4mL的载体3，使浆料体积达到5mL后，加入0.25M柠檬酸钠(pH3.5)溶液1mL。然后，加入0.1M柠檬酸、0.1M谷氨酸(pH3.5)1mL并搅拌。在其中加入0.8M高碘酸钠0.5mL，在室温下翻转搅拌1小时而导入醛基。用以冷水稀释为100倍的1M谷氨酸/PBS(pH7)将该载体浆料清洗5次，在回收后使浆料的液量为5mL。在其中添加1M谷氨酸/PBS(pH7)5mL，在室温下翻转搅拌2小时之后，追加投入1M的二甲胺硼烷水溶液0.5mL并在室温下翻转搅拌过夜。进行离心使载体沉降后，除去上清液使液面为6mL并在其中直接加入20mg的硼氢化钠，在室温下进一步翻转搅拌2小时。用添加了水、0.1M柠檬酸、0.1M氢氧化钠、及0.5M NaCl的PBS充分清洗，作为用还原氨基化法经由谷氨酸的氨基向醛基导入了羧基的蛋白A载体，得到了本发明的混合模式抗体亲和分离基质(载体4)。
对载体4测定了基于抗体亲和配体的抗体结合容量。测定方法与载体的制备例1相同，求出接触时间为6分钟的10％DBC的结果为42.4mg。
然后，对载体4测定了基于阳离子交换基的抗体结合容量。测定方法与实施例1相同，求出接触时间6分钟的10％DBC的结果为4.2mg。
如上所述，可得到作为本发明的混合模式抗体亲和分离基质的载体4，其中，基于阳离子交换基的导入的抗体结合容量是基于抗体亲和配体的抗体结合容量的约1/10。
另外，同样地对用于上述载体4的材料的蛋白A固定化载体即载体3测定了作为抗体亲和分离基质的抗体结合容量，结果是接触时间为6分钟的10％DBC为50.3mg。
(比较例1)
蛋白A固定化载体(载体1)在酸性条件下的逐步盐溶出和凝聚体的分离
使用在载体的制备例1中制备且用于评价的Omnifit公司制的柱(ID0.66cm×柱长(Height)7cm)中所填充的载体1，在中性条件下将每1mL载体7mg的人多克隆抗体载样于载体1，在酸性条件下以各种离子强度的溶出缓冲液使抗体溶出(凝聚体分离用层析条件1)。
通过凝胶过滤层析对各溶出液进行分析，由各溶出级分(级分)的蛋白质峰面积值算出蛋白质含量和收率(Yield)，进而，由蛋白质峰分析求出单体和凝聚体(多聚体)等的比率而算出单体含量(Monomer content)及单体收率(Monomer Yield)。此时，将来自载体1的溶出级分的面积值的总和设为100％，对各溶出级分进行评价。另外，为了阻止在来自亲和分离基质的溶出级分中形成凝聚体，在各溶出液中添加精氨酸使得最终浓度为0.05M以上，另外，使用pH5的磷酸钠溶液使各溶出液的pH为5～6，供于凝胶过滤层析。另外，各层析条件示于以下。
凝聚体分离用层析条件1(酸性pH、逐步盐溶出)
柱：ID 0.66cm×柱长(Height)7cm(Omnifit公司制)
流速：0.6mL/分钟(接触时间：4分钟)
多克隆抗体(IgG)：GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(日本制药)
载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS：达尔伯克·日水)
平衡液：PBS(pH7.4)(3CV、CV：柱体积)
载样：6.8mL
载样后清洗：PBS(pH7.4)(5CV)
溶出前清洗液：10mM Tris/HCl(pH7)(5CV)
溶出液1：10mM乙酸(pH3.5)(8CV)
溶出液2：含有150mM氯化钠、10mM乙酸(pH3.5)(8CV)
溶出液3：含有300mM氯化钠、10mM乙酸(pH3.5)(4CV)
CIP液：0.1M氢氧化钠、1M氯化钠(4CV)
中和·再平衡液：PBS(pH7.4)
凝胶过滤层析条件
柱：Superdex 20010/300GL(ID 1cm×柱长(Height)30cm)(GE HealthcareBio-Sciences公司制)
流速：0.5mL/分钟
检测波长：214nm
载样液：100μL/注射(稀释为吸光度值不超过1的范围)
洗脱液：PBS(pH7.4)
将载体1在酸性条件下的逐步盐溶出和凝聚体的分离特性的评价结果示于表1。
[表1]
(实施例1)
混合模式抗体亲和分离基质(载体2)在酸性条件下的逐步盐溶出和凝聚体的分离
使用在载体的制备例2中制备且用于评价的Omnifit公司制的柱(ID0.66cm×柱长(Height)7cm)所填充的载体2，与比较例同样地在中性条件下将每1mL载体7mg的人多克隆抗体载样于载体2，在酸性条件下以各种离子强度的溶出缓冲液使抗体溶出。其中，对溶出液2的离子强度以3个级别进行评价(凝聚体分离用层析条件2)。
通过凝胶过滤层析对各溶出液进行分析，由各溶出级分(级分)的蛋白质峰面积值算出蛋白质含量和收率(Yield)，进而，由蛋白质峰分析求出单体和凝聚体(多聚体)等的比率而算出单体含量(Monomer content)及单体收率(Monomer Yield)。此时，将来自比较例1中评价的载体1的溶出级分的面积值的总和设为100％，评价各溶出级分。另外，为了阻止在来自亲和分离基质的溶出级分中形成凝聚体，在各溶出液中添加精氨酸使得最终浓度为0.05M以上，另外，使用pH5的磷酸钠溶液使各溶出液的pH为5～6，供于凝胶过滤层析。另外，除将凝聚体分离用层析条件示于以下以外，凝胶过滤层析与比较例1同样地进行评价。凝聚体分离用层析条件2(酸性pH、逐步盐溶出)
柱：ID 0.66cm×柱长(Height)7cm(Omnifit公司制)
流速：0.6mL/分钟(接触时间：4分钟)
多克隆抗体(IgG)：GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(日本制药)
载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS：达尔伯克·日水)
平衡液：PBS(pH7.4)(3CV)
载样：6.8mL
载样后清洗：PBS(pH7.4)(5CV)
溶出前清洗液：10mM Tris/HCl(pH7)(5CV)
溶出液1：10mM乙酸(pH3.5)(8CV)
溶出液2：含有150mM、175mM或200mM氯化钠、10mM乙酸(pH3.5)(8CV)
溶出液3：含有300mM氯化钠、10mM乙酸(pH3.5)(4CV)
CIP液：0.1M氢氧化钠、1M氯化钠(4CV)
中和·再平衡液：PBS(pH7.4)
将载体2在酸性条件下的逐步盐溶出和凝聚体的分离特性的评价结果示于表2。
[表2]
以上，根据表1及表2的结果可以确认，载体1即使在酸性溶出时NaCl的离子强度为零的情况下[表1中的溶出级分：溶出液1(0mM NaCl)]也会有99％以上的抗体溶出，相比之下，作为本发明的混合模式抗体亲和分离基质的载体2在酸性溶出条件[表2中的溶出级分：溶出液2(150mM、175mM、200mM NaCl)]下，通过阳离子交换基的功能而显示出离子强度依赖性溶出行为，作为蛋白A配体和阳离子交换基的协同效果，单体选择性显著提高。因此，可以确认本发明的载体2协同地表现出蛋白A配体和阳离子交换基的各自的特性，可在1个层析工序中发挥较高的特异性和较高的单体选择性。
另外，在来自蛋白A的抗体溶出pH条件下，载体2的基于阳离子交换基的抗体结合容量比蛋白A亲和配体稍高，抗体的溶出需要一定浓度以上的较高的离子强度。
(比较例2)
蛋白A固定化载体(载体3)在酸性条件下的逐步盐溶出和凝聚体的分离
使用在载体的制备例3中用于评价的Omnifit公司制的柱(ID 0.66cm×柱长(Height)7cm)中所填充的载体3，在中性条件下将每1mL载体7mg的人多克隆抗体载样于载体3，在酸性条件下以各种离子强度的溶出缓冲液使抗体溶出(凝聚体分离用层析条件3)。
通过凝胶过滤层析对各溶出液进行分析，由各溶出级分的蛋白质峰面积值算出蛋白质含量和收率(Yield)，进而，由蛋白质峰分析求出单体和凝聚体(多聚体)等的比率而算出单体含量(Monomer content)及单体收率(MonomerYield)。此时，将来自载体3的溶出级分的面积值的总和设为100％，评价各溶出级分。另外，为了阻止在来自亲和分离基质的溶出级分中形成凝聚体，在各溶出液中添加精氨酸使得最终浓度为0.05M以上，另外，使用pH5的磷酸钠溶液使各溶出液的pH为5～6，供于凝胶过滤层析。另外，除将凝聚体分离用层析条件示于以下以外，凝胶过滤层析与比较例1同样地进行评价。
凝聚体分离用层析条件3(酸性pH、逐步盐溶出)
柱：ID 0.66cm×柱长(Height)7cm(Omnifit公司制)
流速：0.6mL/分钟(接触时间：4分钟)
多克隆抗体(IgG)：GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(日本制药)
载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS：达尔伯克·日水)
平衡液：PBS(pH7.4)(3CV)
载样：6.8mL
载样后清洗：PBS(pH7.4)(5CV)
溶出前清洗液：10mM Tris/HCl(pH7)(5CV)
溶出液1：10mM乙酸(pH3.5)(8CV)
溶出液2：含有50mM氯化钠、10mM乙酸(pH3.5)(8CV)
溶出液3：含有300mM氯化钠、10mM乙酸(pH3.5)(4CV)
CIP液：0.1M氢氧化钠、1M氯化钠(4CV)
中和·再平衡液：PBS(pH7.4)
将载体3在酸性条件下的逐步盐溶出和凝聚体的分离特性的评价结果示于表3。另外，由于至溶出液2为止，全部的抗体已经溶出，因此，将至溶出液2为止的数据示于表3。
[表3]
(实施例2)
混合模式抗体亲和分离基质(载体4)在酸性条件下的逐步盐溶出和凝聚体的分离
使用在载体的制备例3中用于评价的Omnifit公司制的柱(ID 0.66cm×柱长(Height)7cm)中所填充的载体4，与比较例2同样地在中性条件下将每1mL载体7mg的人多克隆抗体载样于载体4，在酸性条件下以各种离子强度的溶出缓冲液使抗体溶出。其中，将溶出液2的离子强度以3个级别进行评价(凝聚体分离用层析条件4)。
通过凝胶过滤层析对各溶出液进行分析，由各溶出级分的蛋白质峰面积值算出蛋白质含量和收率(Yield)，进而，由蛋白质峰分析求出单体和凝聚体(多聚体)等的比率而算出单体含量(Monomer content)及单体收率(MonomerYield)。此时，将来自比较例2中评价的载体3的溶出级分的面积值的总和设为100％，评价各溶出级分。另外，为了阻止在来自亲和分离基质的溶出级分中形成凝聚体，在各溶出液中添加精氨酸使得最终浓度为0.05M以上，另外，使用pH5的磷酸钠溶液使各溶出液的pH为5～6，供于凝胶过滤层析。另外，除将凝聚体分离用层析条件示于以下以外，凝胶过滤层析与比较例1同样地进行评价。凝聚体分离用层析条件4(酸性pH、逐步盐溶出)
柱：ID 0.66cm×柱长(Height)7cm(Omnifit公司制)
流速：0.6mL/分钟(接触时间：4分钟)
多克隆抗体(IgG)：GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(日本制药)
载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS：达尔伯克·日水)
平衡液：PBS(pH7.4)(3CV)
载样：6.8mL
载样后清洗：PBS(pH7.4)(5CV)
溶出前清洗液：10mM Tris/HCl(pH7)(5CV)
溶出液1：10mM乙酸(pH3.5)(8CV)
溶出液2：含有25mM、50mM或75mM氯化钠、10mM乙酸(pH3.5)(8CV)
溶出液3：含有300mM氯化钠、10mM乙酸(pH3.5)(4CV)
CIP液：0.1M氢氧化钠、1M氯化钠(4CV)
中和·再平衡液：PBS(pH7.4)
将载体4在酸性条件下的逐步盐溶出和凝聚体的分离特性的评价结果示于表4。另外，为了与比较例2的表3进行比较，也将本实施例中至溶出液2为止的结果示于表4。
[表4]
以上，根据表3及表4的结果可以确认，载体3即使在酸性溶出时NaCl的离子强度为零的情况下[表3中的溶出级分：溶出液1(0mM NaCl)]也会有99％以上的抗体溶出，相比之下，作为本发明的混合模式抗体亲和分离基质的载体4在酸性溶出条件[表4中的溶出级分：溶出液1(0mM NaCl)及溶出液2(25mM、50mM、75mM NaCl)]下，通过阳离子交换基的功能而显示出离子强度依赖性溶出行为，作为蛋白A配体和阳离子交换基的协同效果，单体选择性显著提高。因此，可以确认本发明的载体4协同地表现出蛋白A配体和阳离子交换基的各自的特性，可在1个层析工序中发挥较高的特异性和较高的单体选择性。
另外，在来自蛋白A的抗体溶出pH条件下，载体4的基于阳离子交换基的抗体结合容量为基于蛋白A亲和配体的抗体结合容量的约1/10，在溶出pH为3.5的情况下，即使NaCl的离子强度为零的情况下，也有80％以上的抗体溶出，与实施例1相比，使几乎全部的抗体溶出的离子强度较低。
(比较例3)
蛋白A固定化载体(载体3)的酸性pH依赖性溶出和凝聚体的分离
使用在载体的制备例3中用于评价的Omnifit公司制的柱(ID 0.66cm×柱长(Height)7cm)中所填充的载体3，在中性条件下将每1mL载体7mg的人多克隆抗体载样于载体3，在酸性条件下且在低离子强度的条件下以各种酸性溶出pH使抗体溶出(凝聚体分离用层析条件5)。
通过凝胶过滤层析对各溶出液进行分析，由各溶出级分的蛋白质峰面积值算出蛋白质含量和收率(Yield)，进而，由蛋白质峰分析求出单体和凝聚体(多聚体)等的比率而算出单体含量(Monomer content)及单体收率(MonomerYield)。此时，将各色谱的各个溶出级分的面积值的总和设为100％，评价各溶出pH条件的差异。另外，为了阻止在来自亲和分离基质的溶出级分中形成凝聚体，在各溶出液中添加精氨酸使得最终浓度为0.05M以上，另外，使用pH5的磷酸钠溶液使各溶出液的pH为5～6，供于凝胶过滤层析。另外，除将凝聚体分离用层析条件示于以下以外，凝胶过滤层析与比较例1同样地进行评价。
凝聚体分离用层析条件5(酸性pH溶出)
柱：ID 0.66cm×柱长(Height)7cm(Omnifit公司制)
流速：0.6mL/分钟(接触时间：4分钟)
多克隆抗体(IgG)：GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(日本制药)
载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS：达尔伯克·日水)
平衡液：PBS(pH7.4)(3CV)
载样：6.8mL
载样后清洗：PBS(pH7.4)(5CV)
溶出液：10mM乙酸(pH3.25，pH3.5，或pH3.75)(8CV)
再生液：0.1M乙酸(4CV)
CIP液：0.1M氢氧化钠、1M氯化钠(4CV)
中和·再平衡液：PBS(pH7.4)
将载体3的酸性pH依赖性溶出和凝聚体的分离特性的评价结果示于表5。
[表5]
根据表5的结果可以确认，通过蛋白A固定化载体原本具有的平缓的单体选择性的表现，以吸附IgG的一部分残留于载体的方式选择溶出pH[表5中的溶出级分：溶出液(pH3.75)]，由此，可增加溶出液中的单体含量。然而，与作为表4的结果示出的本发明的载体4[表4中的溶出级分：溶出液1(0mMNaCl)+溶出液2(25mM NaCl)]相比，单体收率的降低比例较大，单体含量的增加比例也较低。因此，可以确认本发明的混合模式抗体亲和分离基质与抗体亲和分离基质相比，具有能够以较高的单体收率得到较高的单体(单体含量)的优异的特性。
(比较例4)
蛋白A固定化载体和阳离子交换层析载体连结体在酸性条件下的逐步盐溶出和凝聚体的分离
将在配体上具有羧基的阳离子交换层析载体即CM Sepharose FastFlow(GE Healthcare Bio-Sciences公司)作为载体5，填充于同公司的柱(ID0.5cm×柱长(Height)2.5cm)中，制备成0.5mL容量的微型柱。将其与在载体的制备例3中用于评价的Omnifit公司制的柱(ID 0.66cm×柱长(Height)7cm)中所填充的载体3的正下方连接而作为连结柱(载体6)。在中性条件下将每1mL载体3为10mg的人多克隆抗体载样于其中，在酸性条件下以各种离子强度的溶出缓冲液使抗体溶出(凝聚体分离用层析条件6)。
通过凝胶过滤层析对各溶出液进行分析，由各溶出级分的蛋白质峰面积值算出蛋白质含量和收率(Yield)，进而，由蛋白质峰分析求出单体和凝聚体(多聚体)等的比率而算出单体含量(Monomer content)及单体收率(MonomerYield)。此时，将来自比较例3的载体3的溶出级分的面积值的总和设为100％，评价各溶出级分。另外，为了阻止在来自亲和分离基质的溶出级分中形成凝聚体，在各溶出液中添加精氨酸使得最终浓度为0.05M以上，另外，使用pH5的磷酸钠溶液使溶出液的pH为5～6，供于凝胶过滤层析。另外，除将凝聚体分离用层析条件示于以下以外，凝胶过滤层析与比较例1同样地进行评价。凝聚体分离用层析条件6(酸性pH、逐步盐溶出)
柱：ID 0.66cm×柱长(Height)7cm(Omnifit公司制)，及
ID 0.5cm×柱长(Height)2.5cm(GE Healthcare Bio-Sciences公司制)
流速：0.4mL/分钟(接触时间：6分钟)
多克隆抗体(IgG)：GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(日本制药)
载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS：达尔伯克·日水)
平衡液：PBS(pH7.4)(3CV)
载样：9.6mL
载样后清洗：PBS(pH7.4)(5CV)
溶出前清洗液：10mM Tris/HCl(pH7)(5CV)
溶出液1：10mM乙酸(pH3.5)(8CV)
溶出液2：含有25mM氯化钠、10mM乙酸(pH3.5)(8CV)
溶出液3：含有250mM氯化钠、10mM乙酸(pH3.5)(8CV)
再生液：0.1M乙酸(4CV)
CIP液：0.1M氢氧化钠、1M氯化钠(4CV)
中和·再平衡液：PBS(pH7.4)
将作为载体6的载体3与载体5的连结柱在酸性条件下的逐步盐溶出和凝聚体的分离特性的评价结果示于表6。
[表6]
根据表6的结果，将蛋白A固定化载体(载体3)和阳离子交换层析载体(载体5)串联连结的柱的单体选择性较低，此外，即使在pH3.5下提高离子强度至250mM[表6中的溶出级分：溶出液1+2+3]，总抗体回收率也未达到50％。相比之下，如表4所示，可以确认，实施例2中示出的本发明的混合模式抗体亲和分离基质即载体4[表4中的溶出成分：溶出液1(0mM NaCl)+溶出液2(25mM NaCl)]可实现优异的单体选择性和较高的回收率。根据这些结果可以确认，蛋白A配体和阳离子交换基在同一载体上邻接地存在，对于混合模式抗体亲和分离基质较为重要，通过2种配体在附近协同地发挥作用，能够以较高的回收率发挥较高的单体选择性。
如上所述，根据本发明，可提供一种新型分离模式的载体及使用方法，其中，作为混合模式抗体亲和分离基质，通过在1个层析工序中蛋白A配体和阳离子交换体的协同作用，能够以较高的回收率提高单体含量，可期待有助于抗体的纯化的高效化。
工业上的可利用性
本发明的混合模式抗体亲和分离基质在抗体或含Fc靶分子纯化工序的第一层析工序中用于高纯度化抗体，可用于抗体医药品的研究开发及制造。

Claims (15)

1.一种混合模式抗体亲和分离基质，其在同一分离基质中具有抗体亲和配体和阳离子交换基。
2.根据权利要求1所述的混合模式抗体亲和分离基质，其中，靶分子在溶出pH条件下的基于阳离子交换基的动态结合容量为中性条件下基于抗体亲和配体的动态结合容量的2倍以下。
3.根据权利要求1或2所述的混合模式抗体亲和分离基质，其是对具有抗体亲和配体的分离基质附加阳离子交换基而成的。
4.根据权利要求1或2所述的混合模式抗体亲和分离基质，其是对具有阳离子交换基的分离基质附加抗体亲和配体而成的。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的混合模式抗体亲和分离基质，其中，抗体亲和配体为选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白H、蛋白D、蛋白Arp、蛋白FcγR、抗体结合性合成配体及它们的类似物中的至少1种。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的混合模式抗体亲和分离基质，其中，抗体亲和配体为选自蛋白A、蛋白G、蛋白L及它们的类似物中的至少1种。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的混合模式抗体亲和分离基质，其中，抗体亲和配体为选自蛋白A及它们的类似物中的至少1种。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的混合模式抗体亲和分离基质，其中，阳离子交换基为含有选自羧基及硫酸基中的至少1种的配体。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的混合模式抗体亲和分离基质，其中，分离基质的水不溶性载体基材为选自碳水化合物及其衍生物、合成聚合物以及玻璃中的至少1种。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的混合模式抗体亲和分离基质，其中，分离基质的基材结构为多孔性珠、整体柱或膜。
11.一种靶分子的纯化方法，其使用了权利要求1～10中任一项所述的混合模式抗体亲和分离基质。
12.一种靶分子的纯化方法，其使用了靶分子的溶出pH为6以下的权利要求11所述的混合模式抗体亲和分离基质。
13.一种靶分子的纯化方法，其使用了靶分子的溶出pH为2以上的权利要求11或12所述的混合模式抗体亲和分离基质。
14.一种靶分子的纯化方法，其使用了靶分子为免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、或含Fc分子的权利要求11～13中任一项所述的混合模式抗体亲和分离基质。
15.一种靶分子，其通过权利要求11～14中任一项所述的纯化方法进行纯化。
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