CN113248606B

CN113248606B - 两步抗体纯化方法

Info

Publication number: CN113248606B
Application number: CN202110268521.5A
Authority: CN
Inventors: 耿明涛; 耿明辉; 耿信笃
Original assignee: Suzhou Puruimasi Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Puruimasi Technology Co ltd
Priority date: 2021-03-12
Filing date: 2021-03-12
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2041-03-12
Also published as: CN113248606A

Abstract

本发明涉及一种两步抗体纯化方法，包括：a.提供包含抗体的样品；b.经至少一次抗体捕集装置处理；所述抗体捕集装置含有以捕集目标抗体成分为主，并辅以分离其他杂蛋白双功能效果的非蛋白A；任选的含有用于捕集目标抗体成分的蛋白A；c.经至少一次精纯化装置处理，所述精纯化装置用于对从所述捕集装置流出的含有抗体的馏出液进行再纯化；其中，所述抗体捕集装置和所述精纯化装置以全自动、半自动、或手动方式配合使用并组成抗体两步纯化系统。现在所有需要进行7～10天的超滤、灭菌、再浓缩、缓冲交换等的离线操作，都可以由本发明操作代替，只需1～3小时。该技术具有速度快、产量高、有害物质少、能耗低、生产成本低等优点。

Description

两步抗体纯化方法

技术领域

本发明涉及抗体分离纯化领域，具体而言，涉及一种两步抗体纯化方法。

背景技术

在癌症、炎症以及自身免疫性病症等疾病的治疗过程中，蛋白类生物药品是重要的一类药物。蛋白药物有很多不同形式，目前应用最多的是单克隆抗体(monoclonalantibodies,mAbs)和抗体偶联药物(antibody-drugconjugates,ADC)。这些蛋白质分子的明显优势在于他们的安全性和有效性，到现在临床研究中已经超过了2000种，其中250种已经获准用于人类疾病治疗。可以毫无疑问地说，生物制药的前景非常广阔。蛋白质、单抗和抗体药物结合物是由生物体产生的。复杂性远远超过化学合成所产生的小分子和肽。液相色谱(LC)是解决分析、分离和纯化蛋白最有效的方法。

最常用的LC为离子交换色谱法(IEX)，凝胶排阻色谱(SEC)，疏水色谱法(HIC)和亲水色谱法(HILIC)。在所有色谱法中，色谱柱是色谱分离和分析的核心。科学家一直在尽力提高色谱柱效以用一根色谱柱就能解决一般较复杂的物质分离和分析问题，发展了混合机理的色谱(mixed-modechromatography，MMC)和单柱二维色谱法(2D-LC-1C)和多种亲合色谱法(AFC)，即在液相色谱中同时应用两种或两种以上的作用力使溶质进行保留和分离的色谱方法。该方法具有更高的选择性和高色谱柱负载量，这为半制备和制备型色谱的发展提供了新的选择和思路。然而，对于更复杂混合物的分析，目前商品色谱柱的分离度远远达不到要求，因此必须要用二维液相色谱法(2D-LC)或多维液相色谱法(mD-LC)才能部分地解决这些问题。

色谱饼(chromatographic cake)是一种特殊规格的直径大于厚度的短柱，因为分离柱床类似饼状，故称其为色谱饼。色谱饼的外壳为不锈钢外，或耐压的工程塑料，内装填有不同功能的或可适用于多肽、抗体、蛋白质以及各种生物大分子的分离纯化，或对蛋白具有复性并同时分离纯化的介质，能使处于变性状态的蛋白复性并同时纯化。可以做成不同的规格，从实验室到制备，再到生产规模。因在高压条件下(一般的装填压力为4，000psi)装填的刚性、极小颗粒(0.1～5μm)分离介质。可在高流速(1～1000mL/min)条件下进行“高速”、“高分离度”和“高重现性”的“三高”分离。

色谱饼的出现，从理论上解决了“色谱柱愈长，分离效果愈好；但是对于由此色谱柱愈长所产生的柱压愈高，从而影响了快速分离的”问题，而且在一维色谱分离中取得了“高速”、“高分离度”，“高柱负荷”和“高重现性”的“四高”，并同时具有“低能耗”，“低排放”和“低消耗”的“三低”效果。在mD-LC法中，在色谱饼上还能起到在线缓冲溶液交换，目标产品的再浓集等作用，大大缩短了分离速度。

mAbs的分子量约有150kDa，1300个左右氨基酸和一些糖基化基团。从理论上讲，mAbs由单一的蛋白产生，但在mAB和ADC的制药过程中，这种复杂性表现为微观上的不均一性(micro heterogeneity)，在蛋白表达、纯化和长期储存(即糖基化、脱酰胺、氧化、硫化，聚集，等等)过程都会发生等电异质性，即分子的电荷相同而质量不同，从而影响了该类药物的活性。因此，如何得到纯度高且微观均一性(micro homorogeneity)就成为一个既艰巨而又热点的技术瓶颈。

从单元色谱分离mAB来考察，因单元纯化多用聚合物分离介质，因不能耐高压，流动相的流速必须放慢；第一步所用的亲合色谱柱的配体为蛋白A的作用仅仅是为了抓捕mAB，而不能分离其他的性质类似的杂蛋白。其存在的缺点是“用蛋白纯化蛋白”，不仅其成本太高，而且蛋白A配体容易脱落，进入了分离体系。国际上呼吁了几十年，迄今未能得到解决[J.Chromatogr A,2012,1221:57]。

再从用多维液相色谱(mD-LC)纯化mAB来看，中间产品从上一维到下一维的转移还必须要用离线地，非密闭系统的手工操作、质量损失较大、重现性差、耗时费事、系统还容易被污染等。此外，在此期间，还要周而复始地灭菌、离心和过滤。包括蛋白A在内，一般需要3-4步(3D-LC到4D-LC)不同的色谱纯化单元才能达到要求，如此一个纯化周期约需7-10天。

文献报道，如此以液相色谱法为主体的复杂和长周期纯化工艺的成本要占到纯化总成本的50-80％[Roque ACA,Lowe CR,Taipa MA.2004.Biotechnol Progress 3:639–654]。

根据2006年的研究报道，与相关成分比较，以单分子(单组分)存在的单克隆抗体糖蛋白的生物活性，可增加约100倍[2006.Curr.Opin Biotechnol 17:341–346.]。然而，因为分离纯化的难度，到目前为止的mAB药，如利妥昔单抗(Rituximab)只能以三组分，且达到一定比例要求的混合物[酸组≤25％,天然≥65％,碱组(100-前二者之和)％]为一个整体才行。虽然这是因为研发该药的当初，因为纯化技术落后的不得已所做的如此选择，但现在仍然作为仿制药质量的出度标准。

为改善纯化工艺并降低成本，新近推出了“连续流色谱纯化法”。该法是由几个色谱柱串联在一起所组成的一个不可分的“分离单元”。在该同一分离单元内实施多次逆流循环的纯化法(Biotechnology&Bioengineering 2008,100:1166～1177)和多柱连续流置换色谱法[Journal of Chromatography A,1586(2019)40–51)]。这里所用色谱柱虽多，但几根色谱柱加在一起也才能完成一步，如离子交换的纯化功能。该法的优势是连续地工作，缩短了整体工艺的周期，成本也大大减低(Journal of Biotechnology,2017，242：11)，但每一步需要一组色谱柱，在同一分离单元的色谱柱之间，和多种不同连续流分离单元之间，都必须解决缓冲溶液交换问题。目前在大多数情况下所采用的分离介质依然是非刚性的基质，故承受柱压低，流动相的流速低，难以满足快速分离的需要。广大的癌症患者对如此高疗效，但在经济上又难以承受如此高价的治疗癌症药物，只能是可望而不可及的事。本申请的专利的每一分离单元只需要一根色谱柱，各分离单元之间，可实施自动控制的在线，或离线，或半自动控制的三种纯化工艺，均能在不同程度上大大地降低单抗的纯化成本。

发明内容

本发明涉及一种两步抗体纯化方法，包括：

a.提供包含抗体的样品；

b.经至少一次抗体捕集装置处理；

所述抗体捕集装置含有以捕集目标抗体成分为主，并辅以分离其他杂蛋白双功能效果的非蛋白A；任选的含有用于捕集目标抗体成分的蛋白A；

c.经至少一次精纯化装置处理，所述精纯化装置用于对从所述捕集装置流出的含有抗体的馏出液进行再纯化；

其中，所述抗体捕集装置和所述精纯化装置以全自动、半自动、或手动方式配合使用并组成抗体两步纯化系统。

两步纯化系统总共用两根色谱柱实现两个分离单元；对仿制药而言，得到15毫克/毫升/小时的合格产品，其中天然成分的含量＞35％；全自动在线二维色谱纯化时间＜3小时。

本发明首次发现非蛋白A亲合色谱分离装置也可以用于抗体的分离纯化，解决了国际上一直渴望能够解决的“用蛋白纯化蛋白”成本高、周期长、重现性差、操作效率低等问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A为本发明一个实施例中等电异质单克隆抗体亲合色谱饼上呈现出了阳离子色谱(CAX)保留模式；

图1B为本发明一个实施例中等电异质单克隆抗体亲合色谱饼上呈现出了阴离子色谱(AEX)保留模式；

图1C为本发明一个实施例中等电异质单克隆抗体亲合色谱饼上呈现出了疏水相互作用色谱(HIC)的三种保留模式；

图2A为本发明一个实施例中蛋白A色谱柱对mAB捕集结果；

图2B为本发明一个实施例中非蛋白A亲合色谱柱对mAB捕集结果；

图3为本发明一个实施例中单抗在SPM-SPM-WCX-1色谱饼上的分离色谱图；

图4为本发明一个实施例中单抗在SPM-WCX-1色谱饼上的分离的三种等电同质单抗在SPM-WCX-1色谱饼上各自的浓度分布图；

图5为本发明一个实施例中经SPM-WCX-1色谱饼纯化后产品中聚合物含量的质检图；

图6为本发明一个实施例中为本发明一个实施例中mAB的在线2D-LC色谱分离图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

所用概念和术语的说明：“色谱”与“色谱”为相同含义；

“色谱饼”是一种直径大于长度的饼形“色谱柱”，“色谱装置”是“色谱柱”和“色谱饼”的总称；

“分离”和“纯化”绝同等的含义

“色谱单元”指能完成一种色谱分离机理的装置，可以是传统的一根色谱柱完成的一步分离；也可以是连续流色谱中必须要用的“多根色谱柱”的“多次循环”的“多步分离”。

“一步抗体纯化”分系指仅在“一根色谱柱”上进行的“一次进样”的纯化。

“多维色谱分离”系指包括用两种，或两种以上的“色谱单元的”分离。

“混合机理柱”系指用一个色谱装置但有两种，或两种以上分离机理实施组分的分离。

“单色谱装置的二维色谱”系指用一个色谱装置能分别实施两个色谱单元的分离，其分离效果等于，或由于两个商品装置。

“在线分离”是指在多维色谱分离中，从进样到或得合格纯度产品的全过程中的所有操作均为自动化的，目标产品不离开具正压的密闭的色谱系统。

“离线分离”系指目标产品可以离开分离系统以便在系统外实行手工操作。

“等电异质单抗”系指氨基酸序列完全相同，但质量不同的一组单抗的总称。

在仿制单抗药中的“天然成分(N)”表示一种单一成分；“主成分”可以是一种单一成分，也可以是单一组成分；“中性成分”系指在色谱分离中位于“酸性组”和“碱性组”之间的一种单一成分，或一组成分。

“亲合捕集流出液”与“低pH灭活收集液””为同等含义，均指经亲合捕集和洗脱后，又经过“低pH灭活”的目标单抗溶液；

“深层过滤液收集液”系指经生物反应器生产的，经过过滤后的含有目标单抗的清液。

在仿制药中质量检测指标中的“单一成分”表示系指“天然成分N”的纯度，或质量回收率；

在仿制药中质量检测指标中的“组成分”表示系指(1)“酸性成分A”，“天然成分N”，“碱性成分B”三种成分；(2)按一定比例混合在一起的混和成分，简称“组成分”。如利妥昔单抗(Rituximab)的比例为：酸性组分<25％：中性组分>65％：碱性组分<或>10％。

本发明涉及一种两步抗体纯化方法，包括：

a.提供包含抗体的样品；

b.经至少一次抗体捕集装置处理；

术语“处理”可以描述样品流过或通过色谱柱、树脂、膜、过滤器，或其它机构的过程，并且应包括经每一机构的连续流动以及在每一机构间暂停或停止的流动。在一些实施方式中，本发明包含一步或多步澄清(或称收集沉淀/上清)步骤，澄清的方法可以通过一步或多步离心、微滤、超滤或深层过滤等方法进行；澄清可以在例如上述任一步操作结束后进行，例如在收集穿透物和洗脱物之前和之后进行。在一些实施方式中，离心的条件可以如本领域公知的参数来进行。例如，可以使用约1×10^-8m/s的标准化装载和约1,000×g至约20,000×g的重力进行样品的离心。

在另一实施方式中，样品可以通过一步或多步深层过滤步骤进行澄清。深层过滤指使用一系列按顺序排列的具有逐渐减小孔径的滤器从溶液中去除颗粒的方法。深层过滤器三维基质产生了样品流经的迷宫样的路径。深层过滤器的保留机制原理依靠通过基质深层时的随机吸附和机械俘获。在多种实施方式中，过滤器膜或片可以是创伤棉、聚丙烯、人造丝纤维素、玻璃纤维、烧结金属、瓷、硅藻土或其它公知的成份。在某些实施方式中，可以对包含深层过滤器膜的组分进行化学处理来带有正电电荷，即阳离子电荷，以使过滤器能够俘获负电荷粒子，如DNA、宿主细胞蛋白或聚集体。

在一些实施方式中，所述色谱分离装置选自：SPE固相萃取柱、带分离膜的离心管、磁珠、分离膜、快速检测生物芯片、纤维束柱、整体柱及常规分析级或制备级色谱色谱柱和色谱饼。在一些实施方式中，所述色谱分离装置所采用的基体支持物包括硼硅酸盐玻璃、琼脂、琼脂糖、琼脂糖衍生物、磁珠、二氧化硅、二氧化钛、藻酸盐、纤维素、纤维素衍生物、葡聚糖、淀粉、环糊精、壳聚糖、角叉菜胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、印度胶、黄蓍胶、刺梧桐树胶、槐豆胶、黄原胶、果胶、粘蛋白、肝硫酯和明胶、硅、陶瓷、玻璃、聚氨酯、聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇对苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮中的任一种，或任意几种形成的共聚物。所述非蛋白A亲合色谱和所述第二非蛋白A亲合色谱的配基连接于所述基体支持物上以形成所述色谱分离装置。

进一步的，所述基体支持物可为无孔的，或包括一个或多个孔隙。特别可以为多孔树脂，多孔树脂的例子可以包括：其他基于琼脂糖的树脂，聚甲基丙烯酸酯，聚苯乙烯二乙烯基苯，二氧化硅，可控孔度玻璃，葡聚糖衍生物，聚丙烯酰胺衍生物，和/或其他聚合物；或它们的任意组合。无孔树脂可以为以上多孔树脂相同的基质材料制备。

在一些实施方式中，孔径为在本发明中，“无孔”是指基体支持物没有明显可以测量到的孔，例如孔径/>在一些实施方式中，所述抗体捕集装置还具有在洗脱所述抗体的过程中除去杂蛋白的功能；

在一些实施方式中，所述抗体捕集装置具有亲合色谱功能；

和/或，所述抗体捕集装置具有阳离子交换性能；

和/或，所述抗体捕集装置具有阴离子交换性能；

和/或，所述抗体捕集装置具有疏水色谱性能；

和/或，所述抗体捕集装置具有疏水色谱性能。

在一些实施方式中，所述抗体捕集装置和所述精纯化装置独立的选自刚性的硅胶基质、非刚性的聚合物基质上键合的各种配基，例如除蛋白A以外的其他蛋白，多肽，寡肽，氨基酸和其他的含非氨基酸残基的配基；

在一些实施方式中，所述精纯化装置选自离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、混合机理色柱，以及单柱二维色谱柱；其中所述离子交换色谱进一步选自弱阳离子交换色谱、强阳离子交换色谱、弱阴离子交换色谱和强阴离子交换色谱。

在一些实施方式中，步骤b和c中，依据色谱双变量理论中各种蛋白在“停滞”和“迁移”之间的“临界置换剂浓度”不同，实施全自动快速分离；

在一些实施方式中，所述全自动快速分离为在线实施；

在一些实施方式中，收集的馏分在线保存在与主流路并联的馏分寄存器中；在一些实施方式中，所述分寄存器流回主线路的馏分与从另一流入主流路的流动相在线混合后，其置换剂浓度低于该单抗的临界迁移浓度；在一些实施方式中，所述置换剂浓度低于该单抗的临界迁移浓度，在线进入非亲合色谱组中以进行该单抗的第二维分离；

在一些实施方式中，收集的馏分以反方向流动的方式流回主线路。

在一些实施方式中，依据色谱双变量理论中各种蛋白在“停滞”和“迁移”之间的各组分的“临界置换剂浓度”不同，实施手工操作，在第一维和第二维进样时，始终保持置换剂浓度低于目标产品的“临界置换剂浓度”，以非连续速地、多次进样方式完成第一，或第二维进样。

在一些实施方式中，依据色谱双变量理论中各种蛋白在“停滞”和“迁移”之间的各组分的“临界置换剂浓度”不同，实施半自动操作，在第一维和第二维进样操作中一种为自动法，另一种为手动法；

在一些实施方式中，当第一维中的原样自动进样时，原样作为一种“准流动相”与另一溶液或第一维流动相在线混合后，其置换剂浓度低于该单抗的“临界置换剂迁移浓度”；在高流速条件下连续进样；任选的在进样过程中除去部分杂蛋白，提高第一维色谱分离的进样量；且第二维进样前必须实施离线所需的各种人工操作；

在一些实施方式中，当第一维为手工操作，除通常的一次小体积的色谱进样方法外，在置换剂浓度低于该单抗的“临界迁移浓度”的前提下，采用多次的、大体积的进样法，以得到在制备色谱要求的色谱柱高负荷的效果；第二维的单抗分离为在线的密闭系统中的全自动操作。

在一些实施方式中，在步骤b和c中色谱的流动相组成中主要阳离子种类为H⁺,K⁺,Na⁺或NH₄ ⁺中的至少一种，其范围为log[H⁺](pH)从2～12，阳离子浓度可选为1×10^-3～5×10¹；

在一些实施方式中，在步骤b和c中色谱的流动相组成中主要阴离子种类为Cl^-,NO₃ ^-,SO₄ ^2-,PO₄ ^3-,HPO₄ ^2-,H₂PO₄ ^-中的至少一种；阳离子浓度范围为为可选为1×10^-3～5×10¹；

在一些实施方式中，在步骤b和c中色谱的流动相组成中主要中性物质为尿素、饱和烃基或不饱和烃基或其烷基醇以及环链骨架结构中的至少一种；中性物质浓度范围选为1×10^-3～5×10¹。

饱和烃基或不饱和烃基可以为C_x-C_y烷基。术语“C_x-C_y烷基”是指在支链或非支链的烃基中具有x到y(包括x和y在内的)的碳原子的烷基。作为说明，但不限制，术语“C₁-C₄烷基”是指具有从1到4的碳原子的直链或支链烃部分，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基以及叔丁基。术语“C₁-C₄正烷基”是指具有从1至4碳原子的直链烃部分，包括甲基、乙基、正丙基以及正丁基。C_x-C_y中x可以从1至10而y是从2至20。每个烷基、环烷基可以为诸如但不限于本文中说指明那样的可选取代的。在一些实施方式中，基团为单或二基取代的。在一些实施方式中，烷基为C₁-C₃、C₁-C₄、C₁-C₆、C₄-C₆或C₁-C₁₀烷基。优选C₁-C₃。饱和烃基或不饱和烃基的烷基醇为将烃基中的一个或多个替换为OH得到，优选为乙二醇，丙三醇，聚乙二醇等。

在一些实施方式中，所述环链骨架结构还可以为环烷基。例如但不限于环丙基甲基、二甲基环丙基、环丙基乙基、环丙基丙基、环丙基丁基、环丁基甲基、环丁基乙基、环丁基丙基、环戊基甲基、环戊基乙基、环戊基丙基、环己基甲基、环己基乙基以及环己基丙基。

在一些实施方式中，所述环链骨架结构为单糖，二糖或多糖；

在一些实施方式中，所述环链骨架结构优选为甘露糖、果糖、半乳糖、含甘露糖的二糖以及含甘露糖的寡聚糖。

在一些实施方式中，在步骤b和c中，经处理后洗脱的条件为调整盐浓度、pH值、流速这三种变量中的至少一种；

在一些实施方式中，洗脱模式为线性或非线性的梯度洗脱。

所指的梯度洗脱脱条件也可以是双变量，二者可以是同方向变化，即：双变量中的两个均能使抗体保留增加，或均是抗体保留减小；

所指的梯度洗脱脱条件可以是也可以是双变量，可以是反方向变化，即：一个变量可使抗体保留增加，而另一个变量可使抗体保留减小；二者的作用对抗体的贡献，可以相等，也可以不相等。

在本发明中，非蛋白A是指AolanChrom(OPs)-S-5-300的活性基团，其来自西安奥岚科技开发有限公司，Aulanst.com,西安。

所指的梯度洗脱脱条件可以是三变量中之一的的流速变化，在进样和在线溶液交换时，流动相流速为高流速，分离时用相对低的流动相流速。

“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。

在一些实施方式中，所述抗体或抗体片段可通过以SEQ ID NO：1或其部分(例如SEQ ID NO：2)作为抗原免疫得到，免疫对象可以选择包括人类及所有畜养(如家畜和宠物)和野生的动物及禽鸟，其非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡等。

在一些实施方式中，所述抗体或抗体片段标记有显示信号强度的指示剂。

在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。在一些优选的实施方式中，所述抗体为单克隆抗体；

在本发明的一个实施方式中，提供包含抗体的样品。任何包含抗体的样品均可以用在本发明中。包含抗体的样品可以包含例如细胞培养物(特别是细胞培养物上清)、血液提取物(特别是血清提取物)以及腹水(例如鼠、兔、羊、马、牛、骆驼等动物的腹水)。作为实例，可以在搅动罐生物反应器中在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达抗体。抗体可以是本领域公知的任何抗体或其片段。在一些实施方式中，也可以是抗体的融合蛋白。

可选的，所述抗体为天然人IgG，重组人单抗或等电异质单抗体；

更近一步优选的，所述抗体为抗体药物，或其原料药；优选自下列抗体所组成的组：

抗GD2抗体3F8、阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、ACZ885(卡那单抗(canakinumab))、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatumumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、阿托珠单抗(Afutuzumab)、培化阿珠单抗(Alacizumab pegol)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomab pentetate)、麻安莫单抗(Anatumomabmafenatox)、安芦珠单抗(Anrukinzumab)(IMA-638)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿替珠单抗(Atezolizumab)、阿托木单抗(Atorolimumab)、阿维单抗(Avelumab)、巴匹珠单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴土昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝利木单抗(Belimumab)、桕替莫单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、比西单抗(Biciromab)、比伐单抗-DMl(Bivatuzumab mertansine)、兰妥莫单抗(Blinatumomab)、Brentuximab vedotin、Briakinumab、卡那单抗(Canakinumab)、美坎珠单抗(Cantuzumab mertansine)、卡罗单抗喷地妝(Capromab pendetide)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、西利珠单抗(Cedelizumab)、培舍珠单抗(Certolizumabpegol)、西妥昔单抗(Cetuximab)、泊西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)、西妥木单抗(Cixutumumab)、克立昔单抗(Clenoliximab)、Clivatuzumab tetraxetan、CNTO148(戈利木单抗(golimumab))、CNTO 1275(优特克单抗(ustekinumab))、可那木单抗(Conatumumab)、达西珠单抗(Dacetuzumab)、达克珠单抗(Daclizumab)、地诺单抗(Denosumab)、地莫单抗(Detumomab)、阿托度单抗(Dorlimomab aritox)、Dorlixizumab、度伐单抗(durvalumab)、依美昔单抗(Ecromeximab)、依库珠单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依决洛单抗(Edrecolomab)、依法珠单抗(Efalizumab)、依夫单抗(Efungumab)、艾西莫单抗(Elsilimomab)、培戈赖莫单抗(Enlimomab pegol)、西依匹莫单抗(Epitumomabcituxetan)、依帕珠单抗(Epratuzumab)、厄利珠单抗(Erlizumab)、厄马索单抗(Ertumaxomab)、埃达珠单抗(Etaracizumab)、艾韦单抗(Exbivirumab)、法索单抗(Fanolesomab)、法拉莫单抗(Faralimomab)、非维珠单抗(Felvizumab)、非扎奴单抗(Fezakinumab)、芬妥木单抗(Figitumumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、福拉韦单抗(Foravirumab)、夫苏木单抗(Fresolimumab)、力口利昔单抗(Galiximab)、GantenerumabΛ加维莫单抗(Gavilimomab)、吉妥珠单抗奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)、戈利木单抗(Golimumab)、戈利昔单抗(Gomiliximab)、Ibalizumab、替伊莫单抗(Ibritumomabtiuxetan)、伊戈伏单抗(Igovomab)、英西单抗(Imciromab)、英利昔单抗(Infliximab)、英妥木单抗(Intetumumab)、伊诺莫单抗(Inolimomab)、伊珠单抗奥佐米星(Inotuzumabozogamicin)、伊匹木单抗(Ipilimumab)、伊妥木单抗(Iratumumab)、凯利昔单抗(Keliximab)、拉贝珠单抗(Labetuzumab)、来金珠单抗(Lebrikizumab)、来马索单抗(Lemalesomab)、乐地单抗(Lerdelimumab)、来沙木单抗(Lexatumumab)、利韦单抗(Libivirumab)、林妥珠单抗(Lintuzumab)、鲁卡木单抗(Lucatumumab)、鲁昔单抗(Lumiliximab)、马帕木单抗(Mapatumumab)、马司莫单抗(Maslimomab)、马妥珠单抗(Matuzumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、美替木单抗(Metelimumab)、米拉珠单抗(Milatuzumab)、明瑞莫单抗(Minretumomab)、米妥莫单抗(Mitumomab)、莫罗木单抗(Morolimumab)、莫他珠单抗(Motavizumab)、莫罗单抗-CD3(Muromonab_CD3)、MY0-029(司他莫单抗(stamulumab))、他那可单抗(Nacolomab tafenatox)、他那莫单抗(Naptumomabestafenatox)、那他珠单抗(Natalizumab)、奈巴库单抗(Nebacumab)、奈昔木单抗(Necitumumab)、奈瑞莫单抗(Nerelimomab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、纳武单抗(Nivolumab)、巯诺莫单抗(Nofetumomab merpentan)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、奥度莫单抗(Odulimomab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、莫奥珠单抗(Oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、奥昔珠单抗(Otelixizumab)、帕昔单抗(Pagibaximab)JQ利珠单抗(Palivizumab)、帕木单抗(Panitumumab)、帕诺库单抗(Panobacumab)、帕考珠单抗(Pascolizumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、帕尼单抗(Pemtumomab)、培妥珠单抗(Pertuzumab)、培克珠单抗(Pexelizumab)、平妥莫单抗(Pintumomab)、普立昔单抗(Priliximab)、普立木单抗(Pritumumab)、PRO 140、雷韦单抗(Rafivirumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、雷昔库单抗(Raxibacumab)、瑞加韦单抗(Regavirumab)、瑞利珠单抗(Reslizumab)、利妥木单抗(Rilotumumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、罗妥木单抗(Robatumumab)、罗利珠单抗(Rontalizumab)、罗维珠单抗(Rovelizumab)、鲁利珠单抗(Ruplizumab)、沙妥莫单抗(Satumomab)、司韦单抗(Sevirumab)、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)、西法木单抗(Sifalimumab)、司妥昔单抗(Siltuximab)、西利珠单抗(Siplizumab)、苏兰珠单抗(Solanezumab)、索耐珠单抗(Sonepcizumab)、松妥珠单抗(Sontuzumab)、司他芦单抗(Stamulumab)、硫索单抗(Sulesomab)、他珠单抗(Tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(Tadocizumab)、他利珠单抗(Talizumab)、他尼珠单抗(Tanezumab)、帕他莫单抗(Taplitumomab paptox)、替非珠单抗(Tefibazumab)、阿替莫单抗(Telimomab aritox)、替妥莫单抗(Tenatumomab)、替奈昔单抗(Teneliximab)、替利珠单抗(Teplizumab)、TGN1412、替西木单抗(Ticilimumab)、曲美木单抗(tremeIimumab)、替加珠单抗(Tigatuzumab)、TNX-355(伊巴珠单抗(ibalizumab))、TNX-650、TNX-901(他利珠单抗(talizumab))、托珠单抗(Tocilizumab)、托利珠单抗(Toralizumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、曲美木单抗(Tremelimumab)、西莫白介素单抗(Tucotuzumabcelmoleukin)、妥韦单抗(Tuvirumab)、乌珠单抗(Urtoxazumab)、优特克单抗(Ustekinumab)、伐利昔单抗(Vapaliximab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、维帕莫单抗(Vepalimomab)、维西珠单抗(Visilizumab)、伏洛昔单抗(Volociximab)、伏妥昔单抗(Votumumab)、扎芦木单抗(Zalutumumab)、扎木单抗(Zanolimumab)、齐拉木单抗(Ziralimumab)以及阿佐莫单抗(Zolimomab aritox)；

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1

等电异质单克隆抗体(以下简称单抗，mAB)在非蛋白A亲合色谱饼(AolanChrom(OPs)-S-5-300，西安奥岚科技开发有限公司，Aulanst.com,西安)上吸附及洗脱特征。

等电异质单克隆抗体(以下简称为“单抗”)亲合色谱饼呈现出了阳离子色谱(CAX)，阴离子色谱(AEX)和疏水相互作用色谱(HIC)的三种保留模式,表明了该亲合色谱介质与蛋白分子以多种分子相互作用力，具备了混合机理的特征。

图1A～图1C展示了该mAB被非蛋白A亲合色谱饼(AolanChrom(OPs)-S-5-300)捕集和洗脱的色谱流出曲线。进含有50μg的该mAB的“低pH灭活收集液”到已经用阳离子色谱(CAX)流动相溶液平衡后的亲合色谱饼上，再以梯度的方式洗脱，得到如图1A所示的色谱图；再以相同的方式测试该mAB在阴离子色谱(AEX)和疏水相互作用色谱(HIC)的，如图1B或1C的，与图1A相对应的色谱特征。

图1A和图1B的色谱流出曲线呈现出了接近“对称”形状，表明同一色谱固定相可对同一mAB实施或CAX机理，或阴离子交换色谱(AEX机理)分离，再加上图1C所示的HIC机理的分离。表明了本发明选用的虽为亲合色谱柱的高选择性，但又有广谱性，即在一个极宽的pH范围内捕集和分离其他类型的mAB。

该同一亲合色谱饼上，分别用阳离子色谱(CAX)，阴离子色谱(AEX)和疏水相互作用色谱(HIC)的用前沿色谱分析法吸附该mAB直至达到饱合吸附后，全程记录在被该非蛋白A了阳离子色谱(CAX)，阴离子色谱(AEX)和疏水相互作用色谱(HIC)的三种保留模式，表明了该亲合色谱介质与蛋白分子以多种分子相互作用力，具备了MMC机理的特征。

实施例2

非蛋白A亲合色谱柱对免疫球蛋白(IgG)的捕集并同时分离

蛋白A亲合色谱柱捕mAB是生命科学研究和生物制药沿用了半个世纪的方法，虽然价格非常高，且柱上的配体易于脱落，在20年前就提出用非蛋白A亲合介质从溶液中选择性的捕集mAB,但一直未能成功。我们申请的该替代蛋白A亲合介质的方法必学要用标准的检测方法与原用的蛋白A法进行比较。

不同pH值的条件下，用前沿分析法，用免疫球蛋白(IgG)为模型蛋白，测定了该非蛋白A的亲合吸附介质的在色谱饼中的突破量和动态饱和吸附量，在不同pH值的条件下，用前沿分析法，用免疫球蛋白(IgG)为模型蛋白，测定了该AFC吸附介质的在色谱饼中的动态饱和吸附量，且随pH值的升高而增大，当分别为4.0和7.4时，其柱负荷分别为20和35(mg/mL填充柱体积)。吸附量可以满足要求。

检测方法：色谱柱、流动相及所有的操作均为行业规定的标准如下：MAbPacSCX-104×250mm柱；流动相：A，20mM MES[中文名：2-(N-吗啉)乙磺酸]pH＝6.5；20mM MES+0.15MNaCl pH＝6.5；波长：280nm，流速：1.0mL/min，梯度35％B～80％B 20分钟。相同的原液，在经蛋白A亲合柱(A)、非蛋白A亲合柱捕集和洗脱后的色谱图分别列入到了图2A和图2B。其中蛋白A捕集进样量130μg，非蛋白A捕集，进样量16μg。

图2A和图2B分别为用蛋白A亲合柱(图2A)、非蛋白A亲合柱(图2B)的分离色谱图。二者的流出曲线样式相同。表明用非蛋白A色谱饼代替昂贵的蛋白A亲合柱是可行的。但是，其中的(A)和(B)色谱图是用的同一个色谱饼，但色谱分离条件不同，结果显示了可以在抓捕mAB的同时，还可以改变色谱条件以达到对分离度部分杂质的目的。

实施例3

蛋白A-弱阳离子交换色谱对mAB的半自动纯化法：

实施例3-1：Protein A亲合色谱捕集mAB的捕集法

将装填好的柱高20cm,柱直径1.6cm GE Protein A亲合色谱柱安装在GE AKTAprocess上。用溶液1(0.20mol/L氢氧化钠冲洗5CV，填料与氢氧化钠接触30min。流速1mL/min，)在流速1mL/min条件下平衡至紫外、电导率曲线平稳，约需30分钟，之后进合适体积的“低pH灭活收集液”。用缓冲液1(配成25mM Tris,200mM KCl,pH 7.2.1L)冲洗至紫外、电导率曲线平稳之后，再用亲合缓冲液2(2.5M柠檬酸配成pH6.0的25mM柠檬酸—柠檬酸钾缓冲液)冲洗至紫外、电导率曲线平衡之后，最后用缓冲溶液3(21.01g柠檬酸,2M柠檬酸钾配成pH 3.20的100mM柠檬酸—柠檬酸钾缓冲液)洗脱。收集紫外280nm处主峰(吸收值大于或等于合适的mAU时开始手工收集，峰下降时，吸收值大于或等于合适的AU时停止收集)。完成后，立即用2.5mol/L Tris调节收集液pH6.0.用0.45μm滤器过滤后置于4℃冰箱存放，命名亲合收集液。之后用纯水和20％乙醇冲洗系统，填料保存于20％乙醇中。收集液溶液的组成：A 23％，N38％,B39％。

实施例3-2：弱阳离子交换色谱对mAB的纯化方法

以上述的亲合收集液为样品，分别测定了该样品在TSKgel CM-5PW。Shim-packWCX-1；E,F,Column，Shim-pack WCX PA-CM；PolyCAT ATM及AolanChrom-WCX-CM-5-1500，50mm x,4.6mm I.D，西安奥岚科技开发公司的这5种种商品柱上的保留行为，均能程度不等的对经亲合色谱柱纯化后的分离和纯化该单抗。

当将色谱饼改为色谱，AolanChrom-WCX-CM-5-1500，50mm x 4.6mm I.D(10mmx20mm ID)，在进样的抗体浓度接近10mg/mL的条件下进样，其进样的柱负荷为41.3mg/mL柱床体积时，采用以下表1所示的梯度洗脱条件实施分离。

表1 在梯度洗脱条件下的离子交换色谱纯化实验条件：

图3为用西安奥岚科技开发公司生产的AolanChrom-WCX-CM-5-1500，50mm x4.6mm I.D(10mmx 20mm ID)。图中的Y轴为吸光值(A)，X轴为时间“t_min”.色谱饼上的纯化分离后的色谱图。从馏出液出现开始，每隔30秒收集一次，合计接收48份流出液，对该酸性成分(A)，天然成分(N)和碱性成分(B)三种成分的含量进行了检测，三者的浓度分布图如图4所示。图4的X-轴表示收集的馏分号；左Y-轴的高度(红色)为与质量成正比的色谱峰面积；从左至右的折线(橙色)是以右-Y轴表示的该三种成分各自在不同馏分中的含量(％)。

质量回收率R％的计算

1计算公式：

R％＝M_后(纯化后质量(mg)/M_前(纯化前质量)x100％(1)

M_前和M_后可以是色谱单元纯化，即色谱进样前和色谱纯化后的单一组分；也可以是合格的一组组分；M_前和M_后还可以是一个纯化工艺，或有多步单元组成的一条生产线的质量回收率。这时的M_前表示原料液中的某组分，M_后为最终合格产品的质量回收率。

依据式(1)的计算，该合格产品的质量回收率为：85.7％

2.质量回收率的种类

1)“单一成分”表示法：即以该目标产品中的主成分，在本发明中称其为中性成分，也就是比活性(IU/mg)最高的成分，如上述的参考标准要求中比例成分最高的中性组分>65％。其单个(single)组分的质量回收率以其质量回收率以R_S表示。单个的酸性成分(acid)，中性成分(neutrol)，和碱性成分(basic)分别表示为R_S,A,R_S,N,和R_S,B。

2)“组成分表示”法：即以该目标产品中的酸性成分、中性成分和碱性成分按一定比例(如仿制药)，本发明称其为产考标准样品：如上述的参考标准要求：酸性组分<25％：中性组分>65％：碱性组分<或>10％，其质量回收率以R_G表示。

在通常情况下，样品中的中性成分比例远小于参考样品的要求的比例，换句话讲，非中性成分比例远大于参考样品要求的比例。故提高中性成分的质量回收率就成为提高该合格样品回收率质量回收率R_G的基础。

在本实施例中，如图4所示，收集不同馏分范围可得到不同的“天然成分N”和“组成分”的纯度和质量回收率：图中Y轴左表示光吸收值(A)；Y轴右侧表示天然成分(N)在个收集液中的含量(质量％)，A表示酸性成分，B表示碱性成分；例如：

当收集馏分的第13～25馏分时，即图中标明的”BSD”(biosimilar dru)收集馏分为符合生物仿制药的成分要求，即：A:14.51％,N:65.84％,B:19.63％，完全满足该仿制药的质量要求；R_g％:＝79.48％；

如按“天然成分N”在“亲合流出液”中N的质量为准计算，R_g％:＝129.1％(关于质量回收率超过100％的问题不在此进一步讨论)。

当收集馏分的第18和19馏分时，在第18和19馏分中的天然成分分别为99.97％和99.99％，占天然成分总质量的35％，占总合格产品的23％。从图4还能看出，该一个色谱饼，经一步CAX纯化，只需80分钟就能完成。但是，国际上最高只能达到93％，但所用的是6色谱柱组成的连续逆流色谱技术，经52次循环，共计7020分钟才完成[Biotechnology&Bioengineering 2008,100:1166～1177；Journal of Chromatography A]。文献报道，单一组分的单抗的生物活性约为相关生物活性的100倍[2006.Curr.Opin Biotechnol 17:341–346.]。国际上迄今未能实现的事，在本申请中依据该该精纯化的生产能力计算，接得到15毫克/毫升填充床体积/小时。可将色谱饼的直径的算术放大，以使填充床体积按平方增加方式扩大到工业化生产，在高流速条件下分离而不会导致色谱分离装置的压力以超压。

产品中聚合物的含量测定方法

色谱柱：TSKgel G3000SWxl 7.8×300mm，5μm；保护柱：TSKgel SWxl 6.0×40mm；流动相：20mmol/L磷酸盐(PB)+200mmol/L NaCl，pH6.8.

色谱条件：流速，0.5mL/min；进样体积：50uL；等度洗脱，30min.图5为用排阻色谱柱对最终产品中聚合物的含量测定的色谱图。聚合物含量：＜0.70％。完全符合仿制药要求。

如果还要再提高“组成分”的质量回收率。可按废液利用处理。即将第13～25流出液以外的向相关流出液中的天然成分收集，将该多次收集的废液合并在一起，还用蛋白多维液相色谱分离系统，再进次样和纯化，只需要一小时就能就能可实现的最终质量回收率为98％。

实施例4

用色谱装置对该单抗的在线二维液相色谱(2D-LC)分离法

用传统的2D-LC法，在分别获得了捕集和精纯化单元操作的最优化条件后，因为、涉及到离线的各种操作难度，并不能毫无改变的将二者串联在一起就成为2D-LC的最佳工艺。然而，对于使用蛋白多维色谱分离系统和基于使用“临界迁移浓度”的在线缓冲溶液交换而言，因为从第一维接收的馏分中的缓冲溶液，在第二维进样的同时被全部洗出柱外。对于本发明所讲的mAB的在线2D-LC纯化而言其实施的办法和结果如图6所示。从图中看出，仅用了75分钟，经精纯化的中间天然(主峰)蛋白峰与左(酸)、右(碱)成分分离的很开。

1.所用设备：

(1)，全自动蛋白多维液相色谱系统(苏州普瑞马斯可公司，苏州)；

(2)，单抗捕集装置为非蛋白A色谱饼(AolanChrom(OPs)-S-5-300，10*5mm，西安奥岚科技开发有限公司，西安)；

(3)，精纯化弱阳色谱柱(AolanChrom-WCX-CM-5-300，50mm x 4.6mm I.D4.6*50mm，精纯化单元)的在线实施必需要用蛋白多维色谱分离系统(苏州普瑞马斯可公司，苏州)

2.流动相：

单抗捕集色谱流动相A:KH₂PO₄ 20mM+尿素1M pH6.5

单抗捕集色谱流动相B：KH₂PO₄ 20mM+NaCl 0.1M+尿素1.0M pH5.6

精纯化色谱流动相C:KH₂PO₄ 20mM+NaCl 0.04M pH5.6

精纯化色谱流动相D:KH₂PO₄ 20mM+NaCl 0.06M pH5.6

3.梯度洗脱程序

样品：含100μg的“深层过滤收集液”，收样时间为66-69min的时间范围。

在将精纯化的色谱装置柱床体积放大到10升时，每日按8小时计算，其合格范制药的产出量可达1.2kg/日。在用全自动在线两步进行工业规模纯化是，“低pH灭菌可与“深层过滤”同步进行以便节约时间。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种两步抗体纯化方法，其特征在于，包括：

a. 提供包含抗体的样品；

b. 经一次抗体捕集装置处理；

所述抗体捕集装置含有非蛋白A和蛋白A，所述非蛋白A具有以捕集目标抗体成分为主、并辅以分离其他杂蛋白的双功能效果；所述蛋白A用于捕集目标抗体成分；

c. 经一次精纯化装置处理，所述精纯化装置用于对从所述抗体捕集装置流出的含有抗体的馏分进行再纯化；

其中，所述抗体捕集装置和所述精纯化装置以全自动、半自动、或手动方式配合使用并组成抗体两步纯化系统；所述两步纯化系统总共用两根色谱柱实现两个分离单元；依据色谱双变量理论中各种蛋白在“停滞”和“迁移”之间的各组分的“临界置换剂浓度”不同，实施手工操作，在第一维和第二维进样时，始终保持置换剂浓度低于目标产品的“临界置换剂浓度”，以非连续地、多次进样方式完成第一，或第二维进样；

步骤b和c中，依据色谱双变量理论中各种蛋白在“停滞”和“迁移”之间的“临界置换剂浓度”不同，实施全自动多维色谱快速分离，或半自动的多维色谱的快速分离；在步骤b和c中，经处理后洗脱的条件为调整盐浓度、pH值、流速这三种变量中的至少一种；

所述色谱柱选自：整体柱及常规分析级或制备级色谱柱和色谱饼；所述抗体捕集装置具有在洗脱所述抗体的过程中除去杂蛋白的功能；所述抗体捕集装置和所述精纯化装置独立的选自刚性的硅胶基质、非刚性的聚合物基质上键合的各种配基；

对仿制药而言，该方法能够得到15毫克/毫升/小时的合格产品，其中天然成分的含量＞65%。

2.根据权利要求1所述的抗体纯化方法，其特征在于，所述抗体纯化方法满足如下条件（1）~（5）中的一个或多个：

（1）所述抗体捕集装置具有亲合色谱功能；

（2）所述抗体捕集装置具有阳离子交换性能；

（3）所述抗体捕集装置具有阴离子交换性能；

（4）所述抗体捕集装置具有疏水色谱性能；

（5）所述抗体捕集装置具有混合机理色谱性能。

3.根据权利要求1所述的两步抗体纯化方法，其特征在于，所述精纯化装置选自离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、混合机理色谱柱，以及单柱二维色谱柱；其中所述离子交换色谱选自弱阳离子交换色谱、强阳离子交换色谱、弱阴离子交换色谱和强阴离子交换色谱。

4.根据权利要求1所述的两步抗体纯化方法，其特征在于，依据色谱双变量理论中各种蛋白在“停滞”和“迁移”之间的各组分的“临界置换剂浓度”不同，实施半自动操作，在第一维和第二维进样操作中一种为自动法，另一种为手动法。

5. 根据权利要求1所述的两步抗体纯化方法，其特征在于，在步骤b和c中色谱的流动相组成中阳离子种类为H⁺, K⁺, Na⁺或NH₄ ⁺中的至少一种，其范围为log[H⁺](pH) 从2~12，阳离子浓度可选为1 × 10^-3~5 × 10¹；在步骤b和c中色谱的流动相组成中阴离子种类为Cl^-, NO₃ ^-, SO₄ ^2-, PO₄ ^3-, HPO₄ ^2-, H₂PO₄ ^-中的至少一种；阴离子浓度范围可选为1 × 10^-3~5× 10¹；在步骤b和c中色谱的流动相组成中主要中性物质为尿素、饱和烃基或不饱和烃基或其烷基醇以及环链骨架结构中的至少一种；中性物质浓度范围选为1 × 10^-3~5 × 10¹。

6.根据权利要求1所述的两步抗体纯化方法，其特征在于，洗脱模式为所指的梯度洗脱条件是双变量。

7.根据权利要求1所述的两步抗体纯化方法，其特征在于，洗脱模式为所指的梯度洗脱条件二者是同方向变化，即：双变量中的两个均能使抗体保留增加，或均是抗体保留减小。

8.根据权利要求1所述的两步抗体纯化方法，其特征在于，洗脱模式为所指的梯度洗脱条件是双变量，呈现反方向变化，即：一个变量可使抗体保留增加，而另一个变量可使抗体保留减小。