KR101753569B1

KR101753569B1 - Ｆｃ―함유 단백질을 정제하는 크로마토그래피 방법

Info

Publication number: KR101753569B1
Application number: KR1020127019071A
Authority: KR
Inventors: 크리스티안 에커만; 도로테 암브로지우스; 프란츠 노텔퍼; 토마스 라첸
Original assignee: 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
Priority date: 2010-01-22
Filing date: 2011-01-21
Publication date: 2017-07-04
Also published as: JP5567691B2; KR20120118013A; DK2526114T3; EP2526114A1; ES2492681T3; CN102712673B; CA2784959C; JP2013517318A; US20130197197A1; AU2011208659B2; WO2011089212A1; SG182553A1; CA2784959A1; HK1174044A1; AU2011208659A1; CN102712673A; US9284347B2; EP2526114B1

Abstract

본 발명은 신규한 세척 완충액을 사용하는 단백질 A 크로마토그래피의 수단에 의해 세포 배양 상청액으로부터 불순물, 특히 숙수 세포 단백질(HCP) 및 DNA를 제거하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＦＣ―함유 단백질을 정제하는 크로마토그래피 방법{CHROMATOGRAPHIC METHOD FOR PURIFYING FC-CONTAINING PROTEINS}

본 발명은 단백질을 정제하는 크로마토그래피 방법 및 이와 같은 방법을 위한 제제에 관한 것이다.

단백질, 폴리뉴클레오타이드, 폴리사카라이드 등과 같은 바이오분자는 의약으로서, 진단제로서, 사료, 세정제 등으로의 첨가제로서, 연구용 시약으로서 및 기타 많은 용도에서 상업적 중요성을 점점 높여가고 있다. 예를 들어 단백질의 경우와 같은 바이오분자에 대한 필요량은 천연원으로부터 그 바이오분자를 분리함으로써 더 이상 충족될 수 없다는 것이 일반적이나, 바이오기술적 생산 방법의 사용은 여전히 요구되고 있다.

전형적으로 단백질의 바이오기술적 제조는 목적하는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리하고 이 DNA를 적합한 발현 벡터내로 클로닝하는 것으로부터 출발한다. 발현 벡터는 적합한 원핵 또는 진핵 발현 세포내로 형질감염되고 이어서 형질감염 세포가 선별된 후 이 형질감염 세포를 발효기에서 배양하여 목적하는 단백질이 발현되도록 한다. 그런 다음, 세포 또는 배양 상청액을 수확하고 이에 함유된 단백질을 후처리 및 정제한다.

진핵세포 발현 시스템의 경우, 즉 CHO 또는 NS0 세포와 같은 포유동물 세포 배양을 사용하는 경우에 있어서, 예를 들어, 과거 15년 동안에 발현 단계에서 도달될 수 있는 세포 배양물 또는 세포 배양 상청액중의 목적 단백질 농도는 100배 정도 증가되어 왔다. 같은 기간에 걸쳐 단백질의 후속 정제 단계에서 사용되는 크로마토그래피 물질의 결합능은 3배 정도 증가되었다. 이와 같은 이유때문에 대량의 산업적 규모에서 실행될 수 있는 바이오분자, 특히 단백질의 정제 방법을 개량하고 최적화하는 것이 시급히 요구되고 있다.

바이오의약의 경우, 예를 들어 의약으로 사용되는 단백질(예를 들어, 치료용 항생제)의 경우에 있어서, 생성물의 수율이외에 불순물의 분리 또한 상당히 중요한 문제이다. 공정-의존성 불순물과 생성물-의존성 불순물은 서로 구분될 필요가 있다. 공정-의존성 불순물은 단백질(숙주 세포 단백질, HCP) 및 핵산과 같은 숙주 세포의 성분을 함유하며 세포 배양물(예를 들어, 배지 구성 성분)로부터 유래된 것이거나 후처리 과정(예를 들어, 염 또는 용해된 크로마토그래피 리간드)으로부터 유래된 것이다. 생성물-의존성 불순물은 상이한 특성을 가진 생성물의 분자 변이체이다. 이들은 전구체 및 가수분해 산물과 같은 축소된 형태를 포함할뿐만 아니라 예를 들어 탈아민화, 비정상 당화 또는 비정상적으로 결합된 디설파이드 브리지(bridge)에 의해 생성된 변형 형태를 포함한다. 생성물-의존성 변이체는 또한 중합체 및 응집체를 포함한다. 기타 불순물은 오염물이다. 이와 같은 것은 제조 공정과 직접적인 연관성이 없는 화학적, 생화학적 또는 미생물학적 성질을 갖는 모든 기타 물질을 의미한다. 예를 들어, 오염물은 세포 배양물에 원치않게 발생할 수 있는 바이러스이다.

불순물은 바이오의약에 안전성 문제를 초래한다. 이러한 문제는 바이오의약의 경우에서 아주 흔하게 투여되는 것처럼 치료용 단백질이 혈액내로 직접 주사 또는 주입될때 더욱 심각해 진다. 따라서, 숙주 세포 성분들은 알러지 반응 또는 면역병리학적 부작용을 유발할 수 있다. 게다가, 불순물은 또한 투여된 단백질의 원치않는 면역원성을 초래할 수 있다. 즉, 이들은 환자에게 치료제에 대해 바람직하지 못한 면역 반응을 일으키고, 유사시 과민성쇼크로 생명을 위협할 수도 있다. 따라서, 바람직하지 못한 모든 물질을 비유의적 수준으로 제거할 수 있는 적합한 정제 방법이 필요하다.

한편, 바이오의약의 경우에 경제적 측면을 고려하지 않을 수 없다. 따라서, 사용된 제조 및 정제 방법은 이에 따라 생성된 바이오의약 생성물의 경제적 생존성을 저해해서는 안된다. 또한, 새로운 정제 공정을 설정할 수 있는 기간이 중요하다. 공정 개발은 이들이 영향을 미치는 비용뿐만 아니라 약물의 전임상 및 임상 시험 단계에 맞춰야 한다. 따라서, 예를 들면 전임상 시험의 일부 및 임상 시험의 전부는 충분한 순도를 갖는 바이오의약이 충분한 양으로 확보되었을때만이 개시될 수 있다.

네 가지 기본 단계로 구성되는 하기 표준 방법은 대규모로 실시될 수 있는 항체의 정제 방법을 개발하기 위한 출발점으로 역할을 할 수 있다: 제1 단계는 표적 단백질을 분리, 농축 및 안정화("포획")하는 것이다. 제2 단계는 바이러스를 제거하는 것이고, 제3 단계는 핵산, 기타 단백질 및 내독소와 같은 불순물의 대부분을 제거하는 정제를 실시하는 것이다. 마지막으로 제4 단계는 잔류하는 미량의 오염물을 제거("폴리싱(polishing)")하는 것이다.

여과 및 침전 단계이외에, (컬럼)크로마토그래피 방법은 상당히 중요하다. 따라서, 포획은 흔히 친화성 크로마토그래피에 의한 정제 단계를 포함한다. 이와 관련하여, 알려진 많은 컬럼 크로마토그래피 방법 및 이들 방법에 함께 사용될 수 있는 크로마토그래피 물질들이 있다.

친화성 크로마토그래피 매트릭스(이하, 친화성 매트릭스라고도 한다)는 여러 물질의 산업적 정제에서 고정상으로서 사용된다. 고정된 리간드의 수단에 의해 사용된 특수 리간드에 대해 특정 친화성을 갖는 물질을 특이적으로 농축 및 정제할 수 있다. 항체(면역글로불린)의 산업적 정제시, 특히 단클론 항체의 정제시, 초기 정제 단계로서 고정된 단백질 A의 사용이 효과적인 것으로 입증되어 왔다. 단백질 A는 약 41 kDa의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질로서 면역글로불린의 Fc 영역의 CH₂/CH₃ 도메인과 고도의 친화성(사람 IgG의 10^-8 M 내지 10^-12 M)으로 결합한다. 단백질 A 크로마토그래피에서 이동상의 단백질-A-결합 Fc 영역을 갖는 면역글로불린 또는 융합 단백질은 담체(예를 들어, 세파로즈)에 공유결합된 단백질 A 리간드와 특이적으로 결합한다. 스타필로코커스 아우레우스의 단백질 A(야생형 단백질 A) 및 유전자 변형된 재조합 단백질 A(재조합 단백질 A)는 항체의 불변영역(Fc 단편)과 비공유 상호작용을 통해 상호작용한다. 이러한 특이적 상호작용을 사용하여 항체로부터 불순물을 효율적으로 분리할 수 있다. pH를 조정함으로써 항체와 단백질 A 리간드사이의 상호작용을 정밀하게 정지시킬 수 있고 항체를 고정상으로부터 방출 또는 용출시킬 수 있다.

친화성 크로마토그래피의 효율성은 고정상을 충전 후 세척하면 증가시킬 수 있다. 이 경우에서 세척은 고정상으로부터 불순물을 용출시키지만 표적 생성물을 용출시키지 않는 이동상의 적용을 의미한다. 단백질 A 매트릭스의 수단에 의한 항체의 친화성 크로마토그래피의 경우 아르기닌, 이소프로판올, NaCl 또는 세정제를 함유하는 세척 완충액이 사용되어 왔다(국제 특허 출원 공보 제WO2008031020호, 제WO2007109163호, 제WO2007081906호, 제WO2003066662호, Millipore Tech Brief TB1026EN00). 그러나 위 언급된 성분들이 배합되어 단일 세척 완충액으로 사용된 바는 없다. 이들 성분중 두 가지, 염 및 세정제, 즉 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 이들로 이루어진 공중합체와 같은 중합체의 배합물이 미국특허 제6,870,034 B2호에 기술되었다.

놀랍게도 단백질 A 크로마토그래피에서 단일 세척 완충액으로서 이의 성분들을 특정 배합하여 사용한 경우가 동일한 성분을 순차적으로 별도로 사용한 경우보다 정제하고자 하는 표적 단백질을 보다 고도한 정도의 순도로 제공한다는 사실이 발견되었다. 또한, 본 발명에 따른 세척 완충액은 표준방법을 기준으로 항체 정제의 사용에 적합하며 최적화 단계의 배제로 공정 개발의 단축이 가능하다.

본 발명은 (a) 면역글로불린의 Fc 도메인을 포함하는 단백질(표적 단백질)을 함유하는 이동상을, 상기 표적 단백질이 고정상과 결합하는 조건하에서, 단백질 A를 함유하는 고정상에 대해 적용하고;

(b) 첨가제로서 (i) 0.1 내지 1 mol/l의 농도로 아르기닌, (ii) 0.2 내지 2 mol/l의 농도로 염화나트륨, (iii) 5% 내지 30%(w/v)의 농도로 이소프로판올, n-프로판올 및 에탄올중에서 선택된 알코올 및 (iv) 0.05% 내지 2%(w/v)의 농도로 폴리비닐피롤리돈 및/또는 세정제를 함유하는, 4 내지 8의 pH를 갖는 세척 완충액을 이동상으로서 적용하며;

(c) 표적 단백질이 고정상으로부터 용출되는 조건하에서 용출 완충액을 이동상으로서 사용하는 단계를 포함하여, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 상기 표적 단백질을 함유하는 조성물로부터 불순물을 제거하는 방법에 관한 것이다.

다른 관점으로서, 세척 완충액은 4.5 내지 8의 pH를 갖는다. 또 다른 관점으로서, 세척 완충액은 5 내지 8의 pH를 갖는다. 또 다른 관점으로서, 세척 완충액은 6 내지 8의 완충액을 갖는다.

세척 완충액 중의 아르기닌 농도는 바람직하게는 0.4 내지 0.6 mol/l, 특히 바람직하게는 0.5 mol/l이다. 세척 완충액 중의 염화나트륨 농도는 바람직하게는 0.9 내지 1.1 mol/l, 특히 바람직하게는 1 mol/l이다. 세척 완충액에 사용된 알코올은 바람직하게는 10 내지 20%(v/v) 농도, 특히 바람직하게는 15%(v/v) 농도의 이소프로판올이다.

폴리비닐피롤리돈(PVP)은 바람직하게는 0.1 내지 2%(w/v), 특히 바람직하게는 0.25%(w/v)의 농도로 사용된다. 추가로 또는 대안으로서, 폴리옥시에틸렌-소르비탄-모노라우레이트(폴리소르바트 20, 폴리소르바트 80)이 0.05 내지 2%(w/v)의 농도로 사용될 수 있다.

다른 관점으로서, 본 발명은 (i) 0.1 내지 1 mol/l 농도의 아르기닌, (ii) 0.2 내지 2 mol/l 농도의 염화나트륨, (iii) 5 내지 30%(v/v) 농도의 이소프로판올, n-프로판올 및 에탄올중에서 선택된 알코올 및 (iv) 0.05 내지 2%(w/v) 농도의 폴리비닐피롤리돈 또는 세정제를 함유하는 pH 4 내지 8의 친화성 크로마토그래피용 세척 완충액에 관한 것이다.

도 1은 항체 BI-MAb 06a를 표본으로 하여, 상이한 조합 및 상이한 조성의 세척 완충액들로 세척한 후 친화성 크로마토그래피로부터의 용출액 중의 수율(1a), 탁도(1b), 단량체 함량(1c) 및 HCP 양(1d)을 도시한다. X축의 숫자는 실시예에 명시된 세척 완충액의 첨가제를 가리킨다.
도 2는 항체 BI-MAb 1003a를 표본으로 하여, 상이한 조합 및 상이한 조성의 세척 완충액들로 세척한 후 친화성 크로마토그래피로부터의 용출액 중의 수율(2a), 탁도(2b), 단량체 함량(2c) 및 HCP 양(2d)을 도시한다. X축의 숫자는 실시예에 명시된 세척 완충액의 첨가제를 가리킨다.
도 3은 항체 BI-Mab 07c를 표본으로 하여, 상이한 조합 및 상이한 조성의 세척 완충액들로 세척한 후 친화성 크로마토그래피로부터의 용출액 중의 HCP의 양을 비교한 것이다. X축의 숫자는 실시예에 명시된 세척 완충액의 첨가제를 가리킨다.
도 4는 항체 BI-Mab 1001b를 표본으로 하여, 상이한 조합 및 상이한 조성의 세척 완충액들로 세척한 후 친화성 크로마토그래피로부터의 용출액 중의 HCP의 양을 비교한 것이다. X축의 숫자는 실시예에 명시된 세척 완충액의 첨가제를 가리킨다.

본 발명은 단백질이 재조합적으로 또는 내생적으로 발현되는 세포 배양물로부터 수득된 단백질 조성물로부터 불순물, 특히 숙주 세포 단백질(HCP) 및 DNA를 제거하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 리간드의 수단에 의해 고정상에 가역적으로 고정될 수 있고 이에 따라 친화성 크로마토그래피에 적용되는 단백질(표적 단백질)을 정제 또는 농축하는 방법에 관한 것이다.

표적 단백질은 특히 면역글로불린 또는 이의 Fc 도메인을 함유하는 단백질일 수 있고 단백질 A와 결합할 수 있다. 바람직한 양태로서, 이들은 2개의 면역글로불린 중쇄와 2개의 면역글로불린 경쇄로 이루어진 면역글로불린이다. 항체는 공유 디설파이드 브리지에 의해 함께 결합되어 Y-모양 구조를 형성하는 2개의 동일한 중쇄(H)와 2개의 동일한 경쇄(L)로 구성된다. 경쇄 각각은 1개의 가변 도메인과 1개의 불변 도메인으로 구성되며 이들은 각각 VL 및 CL로 표기한다. 한편, 중쇄 각각은 면역글로불린에 따라 1개의 가변 도메인과 3개 내지 4개의 불변 도메인을 갖는다. 이들은 마찬가지로 VH 및 CH1, CH2, CH3로 표기한다. 경쇄와 중쇄의 가변 도메인은 항원 결합 부위를 형성한다. 도메인 CH2는 탄수화물 쇄를 함유하며 이것은 보체계를 위한 결합 부위를 형성한다. CH3 도메인은 Fc 수용체 결합 부위를 함유한다.

단백질 A는 면역글로불린의 Fc 도메인과 중쇄와의 상호작용에 의해 결합한다. 결합 친화성은 사람 IgG1, IgG2 및 IgG2a 및 뮤린(murine) IgG2b에서 가장 크다. 단백질 A는 사람 IgM, IgA, IgE 및 뮤린 IgG3 및 IgG1과 중간 친화성으로 결합한다. 그러나, 단백질 A는 사람 IgG3 및 IgD 또는 다음의 뮤린 면역글로불린들: IgM, IgA 및 IgE와 반응하지 않는다.

본 발명의 방법이 적용될 수 있는 표적 단백질은 면역글로불린과 같이 Fc 도메인을 갖는 모든 단백질이다. 면역글로불린은 하이브리도마 세포 또는 재조합 숙주 세포에서 발현되는 다클론 또는 단클론 항체일 수 있다. 이와 같은 항체는 처음에 동물, 특히 포유동물(예를 들어, 사람 면역글로불린을 발현하는 마우스와 같은 형질전환 동물을 포함)을 면역화함으로써 생성할 수 있었다. 그러나, 적합한 표적 단백질은 또한 임의의 목적하는 단백질과 면역글로불린의 Fc 도메인이 융합된 융합 단백질을 포함한다.

본 발명의 목적을 위한 단백질 A 매트릭스는 리간드로서 고정된 단백질을 함유하는 친화성 크로마토그래피 매트릭스이다. 이들은 리간드로서 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스의 야생형 단백질 A를 함유하는 친화성 매트릭스를 포함한다. 단백질 A에 대한 설명은 특히 문헌[Lofdahl, S. et al., 1983(Lindmark, R., Thoren-Tolling, K., Sjoquist J(1983); Binding of immunoglobulins to protein A and immunoglobulin levels in mammalian sera: J Immunol Methods 1983 Aug 12;62(1):1-13.) 및 Lindmark et al., 1983(Lindmark, R., Thoren-Tolling, K., Sjoquist J(1983); Binding of immunoglobulins to protein A and immunoglobulin levels in mammalian sera: J Immunol Methods 1983 Aug 12;62(1):1-13.)]에서 찾아볼 수 있다. 추가로, 본 발명은 또한 리간드로서 재조합으로 생성된 단백질 A를 갖는 매트릭스에 관한 것이다. 재조합 단백질 A는 예를 들어 문헌[Duggleby C.J. and Jones, S.A., 1983(Duggleby, C.J. and Jones, S.A.(1983), Cloning and expression of Staphylococcus aureus protein A gene in Escherichia coli. Nucl.Acid.Res. 1983 May 25; 11(10):3065-76) 또는 Li, R. et al., 1998(Li, R. Dowd, V., Stewart, D.J., Burton, S.J. Lowe, C.R., Design, Synthesis and application of a protein A mimetic. Nat.Biotechnol. 1998 Feb; 16(2):190-5)]에 기술되어 있고 본 분야에 잘 알려져 있다.

단백질 A는 예를 들어, 아가로즈, 다당류, 덱스트란, 실리카겔 및 유리비드와 같은 여러 가지 담체 물질에 결합될 수 있다. 적합 담체 물질의 비제한적인 예는 문헌[Harlow, E. and Lane, D. 1999]에서 찾아볼 수 있다. 흔히 사용된 한 가지 담체 물질은 아가로즈-기본 물질, 예를 들어 본 분야의 전문가에게 잘 알려져 있는 Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala, Sweden) 제품 "세파로즈"에 의해 형성된다. 단백질 A 세파로즈의 특수한 예는 위 회사에서 2001년 출판한 "친화성 크로마토그래피"에 관한 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다. 또한, 다른 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스가 본 분야의 전문가에게 알려져 있으며, 예를 들면 MabSelect(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), STREAMLINE^TM rProtein A(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 및 Poros A(Millipore, Durham, England)이다. 본 발명의 방법은 모든 것을 망라한 것은 아니고 단지 예시적으로 수록된 상응하는 매트릭스의 처리를 포함한다.

리간드의 결합은 일반적으로 담체 매트릭스의 시아노겐 브로마이드 활성화, NHS 활성화 또는 티올 결합을 통한 유리 아미노, 카르복실 또는 황 그룹의 수단에 의해 수행된다. 이에 관한 내용은 예를 들어 Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala, Sweden)의 2001년 매뉴얼 "친화성 크로마토그래피"를 참조할 수 있다.

특히 바람직한 양태로서 폴리비닐피롤리돈(PVP, 또는 폴리비돈 또는 포비돈(CAS: 9003-39-8)으로도 알려져 있다)이 본 발명에 따른 세척 완충액에 사용된다. 폴리비닐피롤리돈은 N-비닐피롤리돈 단량체 단위로 이루어진 수용성 중합체이다. 그러나, 이것은 또한 다른 극성 용매에서도 용해될 수 있다. PVP는 백색 내지 담황색의 흡습성 무정형 분말이다. 표준 시판 중합체는 약 2,500 내지 2,500,000 달톤의 범위의 몰질량을 갖는다.

본 발명의 세척 완충액에서 세정제는 PVP에 추가하여 사용하거나 이를 대체해서 사용할 수 있다. 세정제는 미셀(micelle), 즉 친수성 헤드가 수성 용매쪽으로 밖으로 향해있는 세정제 분자의 응집체를 형성할 수 있는 계면활성 및 친양쪽성 분자이다.

본 발명의 목적을 위한 세정제는 비온성 및 이온성 물질 둘 다이다. 그러나, 비이온성 세정제가 바람직하며, 예로는 폴리글리콜에테르(NP-40, Tergitol NP40, CAS: 127087-87-0), PEG-알킬에테르 폴리옥시에틸렌(23)라우릴에테르(CAS: 9002-92-0), PEG-소르비탄 지방산 에스테르[예를 들어, 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄-모노라우레이트(폴리소르바트 20, CAS: 9005-64-5) 또는 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄-모노올레이트(폴리소르바트 80, CAS: 9005-65-6)], 알킬페닐-PEG-에테르[예를 들어, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(트리톤-X-100, CAS: 9002-93-1)], 또는 PEO-PPO 블록 공중합체(폴록사머 유도체)[예를 들어, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체(플루로닉 F 68, 루트롤 F 68, 폴록사머 188, CAS: 9003-11-6 또는 폴록사머 407, 플루로닉 F 127, 루트롤 F 127, CAS: 9003-11-6)]를 들 수 있다.

세척 및 용출 완충액의 pH 값은 대체로 시스템에 의해 좌우되며, 이에 따라 일반적으로 각 시스템에 따라 개별적으로 결정되고 최적화된다.

한 가지 관점에서 세척 완충액은 4 내지 8의 pH를 갖는다. 전문가는 컬럼으로부터 단백질이 용출되는 pH가 많은 요인에 의해 좌우된다는 사실을 잘 알고 있다. 그러한 요인들로는 특히 결합, 세척 및 용출동안에 사용되는 완충시스템, 불순물의 존재, 매트릭스 입자의 기하학적 구조, 크로마토그래피 매트릭스에 친화성 리간드의 결합 성질이 포함될 수 있다. 특히 단백질의 특이적 특성이 결정적인 영향을 미친다.

일부 경우에서 친화성 리간드로부터 단백질의 부분 또는 전부 용출이 pH 4 이상에서 조차 발생할 수 있는 조합이 있을 수 있다. 이러한 경우 단백질의 손실을 방지하기 위해 세척 완충액의 pH는 더욱 더 높아야 한다. 전문가는 이와 같은 경우에 세척 완충액의 pH를 적절히 조절해야 한다는 것을 잘 알고 있다. 그러나, 대부분의 경우 단백질과 단백질 A 친화성 리간드사이의 결합은 pH 4이하에서만 진행되지 않을 것이다.

다른 관점에서 세척 완충액은 4.5 내지 8의 pH를 갖는다. 또 다른 관점에서, 세척 완충액은 5 내지 8의 pH를 갖는다. 또 다른 관점에서 세척 완충액은 6 내지 8의 pH를 갖는다.

전형적인 양태로서 본 발명은 예를 들어 다음과 같이 실시할 수 있다:

단백질 A 크로마토그래피는 일반적으로 제1 정제단계이다. 무세포 세포배양 상청액은 컬럼에 직접 첨가될 수 있거나 우선적으로 소위 UF/DF 시스템이라고 하는 한외여과막을 통해 농축될 수 있다.

단백질 A 컬럼은 우선 생리화학적 특성상 충전 풀(charging pool)에 대략적으로 상응하는 인산염 완충액(PBS)로 평형시킨다. 충전 풀은 정제 대상 생성물 및 또한 CHO 또는 NS0 세포와 같은 논의되는 포유동물 세포를 성장시키는데 필요한 추가적 배지 구성 성분을 함유하는 세포 배양물의 상청액으로 구성된다. 이와 같은 세포 배양물의 무세포 상청액 또는 이의 농축물은 단백질 A 컬럼에 충전한다. 이후에 표적 단백질은 컬럼상의 단백질 A 결합 부위와 결합한다. 그럼 다음 비결합 배지 구성 성분 및 세포 생성물이 용출될때 까지 컬럼을 평형 완충액으로 플러시한다. 상기 세척 완충액은 평형 완충액 후 또는 충전 후 직접 첨가할 수 있다. 세척 완충액의 양은 규모에 따라 좌우되며 이에 따라 크로마토그래피 컬럼의 크기에 비례한다.

보통 세척 완충액의 용량은 크로마토그래피 컬럼의 용량에 대략 2 내지 5배이다(2 내지 5회 층용량, BV). 세척 완충액의 첨가 후 세척 완충액의 구성 성분이 생성물과 함께 전혀 용출되지 않도록 컬럼은 재차 평형 완충액 또는 다른 완충액으로 처리할 수 있다. 본 발명에서 사용된 완충액은 세척 완충액의 pH보다는 낮지만 용출 완충액의 pH보다는 높은 pH를 가져야하고 완충액 염 및 조성에서 용출 완충액과 비슷하다. 예를 들어, pH가 4 미만인 완충액을 용출에 사용하고, 이의 주요 구성 요소로서 아세테이트 또는 시트레이트 염을 함유할 수 있다. 용출 완충액은 아세테이트를 10 mM 내지 200 mL의 농도로, 바람직하게는 20 mM 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 50 mM 내지 100 mM의 농도로 함유할 수 있거나, 시트레이트를 10 내지 200 mM의 농도, 바람직하게는 20 내지 100 mM의 농도로 함유할 수 있다. 두 완충액 모두는 pH 범위가 상기된 4 미만이어야 하고, 바람직하게는 3 내지 4, 특히 바람직하게는 3.4 내지 3.6이어야 한다. 또한, 아르기닌 또는 PVP와 같은 첨가제가 존재할 수 있다. 게다가, 글리신 완충액이 pH 2 내지 3.5에서 10 내지 200 mM의 농도로, 바람직하게는 25 내지 100 mM의 농도로 사용되거나 항체의 Fc 도메인과 단백질 A사이의 결합을 감소시키는데 적합한 다른 완충액이 사용될 수 있다. 그런 다음, 용출물은 이후 공정에서, 예를 들어 보다 낮은 pH에서의 항온처리 또는 중화 공정에서 후처리될 수 있다.

실시예

상이한 배지에서 발현된 상이한 세포주(CHO 및 NS0)로부터 수득한 여러 가지 단백질 및 상이한 IgG 아형(IgG1, IgG2, IgG4)의 Fc 부분으로 실험을 실시하였다.

표준 방법으로 개시하고 단지 세척 완충액 또는 완충액을 바꾸면서 일련의 시험을 수행하였다. 평형 완충액은 첨가제가 전혀 없이 도입되었고 세척 완충액은 단지 한 가지 첨가제와 함께 사용되었으며, 많은 다른 완충액들은 각각 한 가지 첨가제와 함께 순차적으로 첨가되거나, 세척 완충액은 많은 첨가제들과 조합되어 함께 사용되었다.

적용된 단백질 용액은 항상 각 단백질에 대해 동일하였다.

각 시험은 용출물중의 불순물의 양을 측정하였다. 실험간의 비교에 의해 세척 완충액은 이후 용출물이 가능한 가장 적은 양의 개개 불순물이 동정되었다. 일부 실험에서 수율, 탁도 및 단량체 함량이 또한 측정되었다.

크로마토그래피

크로마토그래피 실험은 자동화 AKTA-FPLC 모델 900 시스템(GE Healthcare)으로 실시하였다. 이들 실험에서 4 가지 상이한 생성물이 사용되었다. 생성물 가운데, 무세포 배양 상청액 또는 농축된 배양 상청액이 출발 물질로 사용되었고, 이 제제는 50 kD 오메가 막(Pall)으로 10배 농축된 다음 PBS로 3회 정용여과된다.

사용된 컬럼은 용량이 1 ml 내지 8 ml이고 크로마토그래피 겔 MabSelect 또는 MabSelect Xtra(GE Healthcare)중 하나를 함유하였다.

완충액

모든 실험에서 10 mM 포스페이트, 5 mM 염화칼륨 및 140 mM 염화나트륨을 함유한 인산염 완충액(PBS)(pH 7.4)을 평형 완충액으로 사용하였다.

모든 세척 완충액은 8 mmol/L 인산일수소나트륨, 1.5 mmol/L 인산수소칼륨, 2.7 mM 염화칼륨 및 140 mM 염화나트륨을 함유한 PBS 완충액(pH 7.4)을 기본으로 하였다.

첨가제는 다음의 것들이 개별적으로 또는 여러가지 조합적으로(도면에서 특정된 바와 같이) 사용되었다:

(1) 860 mmol/L 염화나트륨(총함량 1 mol/L 염화나트륨)

(2) 0.25%(w/V) 폴리비닐피롤리돈(PVP)

(3) 15%(V/V) 이소프로판올

(4) 0.5 mol/L L-아르기닌

용출시 생성물에 따라 상이한 완충액이 아세테이트 농도 및 pH를 상이하게 하여 사용되었다. 농도는 다음과 같이 사용되었다:

BI-Mab 06a: 100 mM 아세테이트 pH 3.4

BI-Mab 1003a: 50 mM 아세테이트 pH 3.4

BI-Mab 1001b: 50 mM 아세테이트 pH 3.4

BI-Mab 07c: 50 mM 아세테이트 pH 3.6

분석

실험 용출물은 이들의 불순물 함량에 대해 비교되었고 수율이 결정되었다.

세포 구성 성분의 양을 측정하기 위해 일반적 샌드위치 ELISA가 사용되었고 숙주 세포 단백질은 실험적 변수로서 결정되었다. 검사시 다클론 검출 항체가 사용되었다.

단량체 함량은 Agilent Series HPLC 1200(Waters) 시스템을 사용하여 측정하였고 단백질에 따라 TSK 3000SW 또는 TSK 3000SWXL 컬럼(TosoH)을 사용하였다. 등용매방법은 pH 7.0의 트리스 완충액으로 1 ml/분의 유속으로 실시하였다.

DNA는 역치측정법으로 측정하였다[참조: Kung, V.T. et al., Picogram Quantitation of Total DNA Using DNA-Binding Proteins in a Silicon Sensor-Based System, Anal. Biochem. 1990, 187, 220-227].

Phast 시스템(GE Healthcare)을 사용하여 SDS-PAGE를 실시하였다. 시료는 Phast SDS 겔(4%-15%, GE)을 사용하여 분리하였다. 염색은 Heukeshoven 은 염색법으로 수행하였다[참고: Heukeshoven, Dernick 1988, Electrophoresis 9(1), pages 28-32].

충전액 및 용출액 중의 항체의 양을 측정하기 위해, PA 2-1001-00 단백질 A 컬럼(Applied Biosystems) 및 Agilent Series 1200 HPLC 시스템(Waters)을 사용하였다. 결합 및 용출은 PBS 완충시스템중의 pH 7.4 내지 pH 2.8의 구배에 걸쳐 실시하였고 평가는 논의되고 있는 항체의 외부 검정 라인을 사용하여 수행하였다.

탁도 측정은 2100AN 탁도계(Hach)로 제조사의 탁도 표준으로 검정 후 수행하였다.

결과

BI - Mab 06a(아류 IgG1 항체)로의 실험

결과는 수율, 단량체, 탁도 및 숙주 세포 단백질(HCP)에 미치는 세척의 유의적인 영향을 보여준다.

수율, 단량체 함량 및 HCP 제거의 정석 기준에서, 용출액은 4 가지 모든 첨가제를 함유한 완충액으로 세척 후 최상치를 보여준다. 또한, 이들 첨가제의 조합, 즉 세 가지 성분 0.86 mol/L 염화나트륨, 0.25%(w/V) PVP와 15%(V/V) 이소프로판올의 배합 및 네 가지 모든 첨가제 0.86 mol/L 염화나트륨, 0.25%(w/V) PVP, 15%(V/V) 이소프로판올과 0.5 mol/L 아르기닌의 배합 둘다는 탁도의 실질적인 감소를 유도하였다.

BI-Mab 1003a(아류 IgG1 항체)로의 실험

네가지 모든 추가 성분을 함유한 세척 완충액으로 최상의 HCP 제거가 달성되었다. 염화나트륨, PVP와 이소프로판올이 배합된 세척 완충액으로 유사하게 양호한 값을 수득하였다. 네 가지 성분을 개별적으로 함유한 완충액으로 세척한 경우 용출물에서 더 많은 HCP가 검출되었다.

탁도도 마찬가지로 완충액 중의 세척 물질의 조합은 보다 양호한 결과를 제공하였다.

BI-Mab 07c(아류 IgG4 항체)로의 실험

개별적인 세척 완충액으로 실시한 시험에서 용출액은 조합된 세척 완충액으로 실시한 시험에서의 용출액보다 HCP 수준이 더 높은 것으로 나타났다.

BI - Mab 1001b(아류 IgG2 항체)로의 실험

4 가지 실험은 네 가지 첨가제 염화나트륨, PVP, 이소프로판올과 아르기닌을 단일 세척 완충액에 조합한 것이 위 첨가제를 개별적으로 함유한 세척 완충액을 사용한 것에 비해 용출액 중의 숙주 세포 단백질(HCP)의 함량에 있어서 유리하다는 것을 보여준다.

또한, 기술된 세척 완충액의 사용은 용출액 중의 탁도가 상당히 감소한다는 것을 보여준다. 또한, 단량체의 양 및 수율이 개선되거나(BI-Mab 06a) 적어도 동일한 것으로 나타난다(BI-Mab 1003a).

따라서, 기술된 세척 완충액은 단백질의 제조 공정을 상당히 개선시키는데 적합하다. 세척 완충액의 조합을 도입하는 것은 추가적인 정제 단계에 의해 제거되어야 했던 불순물을 제거해 준다.

Claims

단백질 A 크로마토그래피에 의해, 면역글로불린의 Fc 도메인을 포함하는 단백질(표적 단백질)을 함유하는 조성물로부터 불순물을 제거하는 방법으로서,
a. 상기 표적 단백질이 고정상과 결합하는 조건하에서, 상기 표적 단백질을 함유하는 이동상을 단백질 A를 함유하는 고정상에 대해 적용하는 단계;
b.
i. 0.1 내지 1 mol/l 농도의 아르기닌,
ii. 0.2 내지 2 mol/l 농도의 염화나트륨,
iii. 5 내지 30%(w/v) 농도의, 이소프로판올, n-프로판올 및 에탄올 중에서 선택된 알코올 및
iv. 0.05 내지 2%(w/v) 농도의 폴리비닐피롤리돈 또는 세정제를 함유하는, 5 내지 8의 pH를 갖는 세척 완충액을 이동상으로서 적용하는 단계;
c. 상기 표적 단백질이 상기 고정상으로부터 용출되는 조건하에서 용출 완충액을 이동상으로서 사용하는 단계를 포함하는,
단백질 A 크로마토그래피에 의해, 상기 표적 단백질을 함유하는 조성물로부터 불순물을 제거하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 세척 완충액 중의 아르기닌 농도가 0.4 내지 0.6 mol/l임을 특징으로 하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세척 완충액 중의 염화나트륨 농도가 0.9 내지 1.1 mol/l임을 특징으로 하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세척 완충액 중의 알코올이 10 내지 20%(w/v) 농도의 이소프로판올임을 특징으로 하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리비닐피롤리돈(PVP)이 0.1 내지 2%(w/v)의 농도임을 특징으로 하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세정제가 0.05 내지 2%(w/v) 농도의 폴리옥시에틸렌-소르비탄-모노라우레이트임을 특징으로 하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 불순물이 숙주 세포 단백질(HCP)임을 특징으로 하는, 방법.
i. 0.1 내지 1 mol/l 농도의 아르기닌,
ii. 0.2 내지 2 mol/l 농도의 염화나트륨,
iii. 5 내지 30%(w/v) 농도의, 이소프로판올, n-프로판올 및 에탄올 중에서 선택된 알코올, 및
iv. 0.05 내지 2%(w/v) 농도의 폴리비닐피롤리돈 또는 세정제를 함유하는,
pH 5 내지 8인 친화성 크로마토그래피용 세척 완충액.
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