CN107446044A - 一种纯化抗体的方法及所用缓冲液 - Google Patents

Abstract

一种纯化抗体的方法及所用缓冲液，属于生物医药领域，用于降低抗体分子在低pH处理过程中形成聚集物，技术方案包括在低pH缓冲液中添加一定浓度的甘露醇，该方法能够将IgG4亚型抗体（包括含有IgG4亚型Fc段的融合蛋白）在低pH下形成的聚集物的比例从30%降低到2%，从而提高抗体的纯化得率以及抗体药的活性和安全性。

Description

一种纯化抗体的方法及所用缓冲液

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种纯化抗体的方法及所用缓冲液。

背景技术

抗体药是近年来增长迅速的药物种类，新药品种和市场份额不断增加，在恶性肿瘤和自身免疫疾病等疾病的治疗上发挥着越来越大的作用。抗体药出现早期IgG1亚型的抗体占据主导地位，几乎所有的早期抗体药都是IgG1亚型。近几年IgG4亚型的抗体药开始走向市场。IgG4亚型抗体有较弱的ADCC（抗体依赖的细胞介导的细胞毒性）和CDC（补体依赖的细胞毒性）效应，是开发以信号阻断、调控或中和作用为主要机制的抗体药物的理想选择，可比IgG1产生更小的副反应。目前已有Pembrolizumab（曾用名Lambrolizumab）、Nivolumab两个抗PD-1的IgG4亚型抗体药先后于2014、2015年被美国FDA批准上市，还有Reslizumab（抗IL-5）、Lebrikizumab（抗IL-13）、Ixekizumab（抗IL-17a）等IgG4亚型抗体药已经提交新药上市申请或正在进行II、III期临床研究。IgG4亚型抗体药种类不断增多，正在医药领域发挥着越来越大的作用。

然而IgG4亚型的抗体药在纯化工艺上产生了新的问题。低pH病毒灭活是抗体药生产过程中的一个常规步骤，这一步骤一般是在ProteinA亲和层析之后，通过用pH3.3-3.8的低pH缓冲液将抗体从层析介质上洗脱来完成病毒灭活。与IgG1相比，IgG4亚型抗体在低pH条件下更容易发生聚集（aggregation），IgG4聚集物的比例可达纯化总产物的30%，并且这种聚集倾向主要由Fc段在低pH下的不稳定（熔解温度Tm值和熔融热ΔH降低）和解折叠（unfolding）构象变化引起，尤其是Fc段上的CH2区（Pharmaceutical Research 2016, Vol33, Issue 3: 716-728；J Pharm Sci 2014，103:1701-1710、115-127；J Mol Biol 2014，426:630-44；Journal of Chromatography A 2015，1415:83-90）。低pH下的聚集倾向是IgG4亚型抗体的共性。

抗体形成聚集物不仅将降低抗体的活性，还可能形成免疫原性并导致药物副反应，对抗体聚集物的控制和检测是药品相关法规的要求。聚集物的出现会大幅降低抗体的纯化得率，因此解决抗体聚集的问题十分必要。

精氨酸、组氨酸等碱性氨基酸和蔗糖被报道能够预防抗体在纯化过程中的聚集，然而本单位研究发现碱性氨基酸和蔗糖等对预防IgG4亚型抗体聚集的效果并不理想，甚至还有反作用。因此需要开发一种新的防止IgG4抗体在低pH下聚集的方法。

发明内容

本发明解决的问题是IgG4亚型抗体在低pH条件下发生聚集的问题。本发明提供了一种纯化抗体的方法及所用缓冲液，能够将IgG4亚型抗体（包括含有IgG4亚型Fc段的融合蛋白）在低pH下的聚集大幅降低，从而提高IgG4亚型抗体的纯化得率以及抗体药的活性和安全性。

本发明的技术方案如下：

一种纯化抗体的方法，所述的抗体是IgG4亚型，或是含有IgG4亚型Fc段的融合蛋白，包含在低pH处理的过程中使用甘露醇的步骤。

在一些实施例中，所述的甘露醇的工作浓度为5-15%（w/v）。优选的，所述的甘露醇的工作浓度为10%（w/v）。

一种纯化抗体的方法，包含如下步骤：先采用纯化介质捕获IgG4亚型的抗体或含有IgG4亚型Fc段的融合蛋白，再采用含有5-15%（w/v）甘露醇的低pH缓冲液将抗体从纯化介质上洗脱，然后进入后续的纯化或制剂步骤。

优选的，采用含有10%（w/v）甘露醇的低pH缓冲液。

在一些实施例中，所述的低pH的范围为pH3.3~4.0。优选的，所述的低pH的值为pH3.5。

在一些实施例中，所述的低pH缓冲液中含有20-30mM柠檬酸盐，优选的，25mM。

一种用于IgG4亚型抗体或含有IgG4亚型Fc段的融合蛋白纯化过程的低pH缓冲液，pH值为3.3-4.0，含有5-15%（w/v）的甘露醇。

在一些实施例中，所述的低pH缓冲液，pH值为3.5，含有10%（w/v）的甘露醇。

在一些实施例中，所述的低pH缓冲液还含有柠檬酸和柠檬酸钠，其中柠檬酸和柠檬酸钠的合计浓度为20-30mM，优选的，25mM。

在一些实施例中，所述的IgG4亚型的抗体是Nivolumab（一种抗程序性死亡受体1抗体，即抗PD-1抗体，商品名Opdivo，于2015年3月被美国食品药品管理局即FDA首次批准新药上市，申请号BLA 125527、BLA125554，已被批准的适应症有不可切除或转移性黑色素瘤、转移性非小细胞肺癌）。

Nivolumab是一种全人源IgG4亚型单克隆抗体，具有典型的IgG4亚型框架区结构，在铰链区带有S228P突变，该突变可以防止IgG4常见的Fab臂交换，在其他IgG4亚型抗体药，如Pembrolizumab（Lambrolizumab）中也带有S228P突变。因此Nivolumab可以作为代表性药物来研究带有共性的IgG4亚型抗体纯化工艺。

IgG（免疫球蛋白G，Immunoglobulin G）是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%，也是国内外现有抗体药的主要类型。人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG4与抗体药常用的IgG1相比，具有相近的分子量、血浆半衰期、ProteinA结合能力，但是结合免疫效应细胞上的FcR的能力和固定补体的能力很弱或没有，因此IgG4诱导ADCC或CDC等细胞裂解效应的能力很弱或缺乏。所有的IgG4亚型抗体拥有非常相似的Fc段序列和结构。

为了提高一些蛋白或多肽药物在体内的稳定性、延长半衰期，常常通过基因工程技术将这些蛋白或多肽与抗体的Fc段构建成融合蛋白，目前已经成功的例子有FDA批准上市的药物Etanercept（依那西普，TNF受体与Fc段融合蛋白）、Aflibercept（阿柏西普，VEGF受体与Fc段融合蛋白）等。虽然这些药物是含有IgG1的Fc段的融合蛋白，但是不排除IgG4的Fc段也被用于构建融合蛋白的可能。

甘露醇英文的名称是mannitol，也叫mannite或manna sugar。甘露醇是一种多醇糖，分子式C6H14O6，分子量182.17，易溶于水。甘露醇的已知医药用途是良好的利尿剂，可用于降低颅内压、眼内压及作为治疗肾药、脱水药、食糖代用品；甘露醇也常用作药片的赋形剂、注射液的渗透压调节剂。

柠檬酸盐缓冲液是一种常用于亲和层析和免疫分析的缓冲液，缓冲范围pH3.0-6.6，由柠檬酸（Citric Acid）和柠檬酸钠（Trisodium Citrate）按照一定比例配制而成。

本发明的有益效果在于：将IgG4亚型抗体在低pH处理过程中形成的聚集物比例从30%左右降低到2%，极大的提高了IgG4亚型抗体的纯化得率，以及IgG4亚型抗体药的活性和安全性。

附图说明

图1 ：超高效液相色谱（UPLC）结合分子排阻层析（SEC）对Nivolumab经常规亲和层析后的低pH洗脱物的纯度分析

图2：超高效液相色谱（UPLC）结合分子排阻层析（SEC）对强离子交换层析分离获得的Nivolumab聚集物的纯度分析

图3：超高效液相色谱（UPLC）结合分子排阻层析（SEC）对强离子交换层析分离获得的Nivolumab单体的纯度分析

图4：液相色谱串联质谱（LC-MS）对Nivolumab聚集物的分子量测定结果

图5：液相色谱串联质谱（LC-MS）对Nivolumab单体的分子量测定结果

图6：液相色谱串联质谱（LC-MS）对Nivolumab聚集物和单体的糖形等翻译后修饰的测定结果对比

图7：超高效液相色谱（UPLC）结合分子排阻层析（SEC）对pH4.0、pH3.5条件下Nivolumab聚集情况的分析

图8：超高效液相色谱（UPLC）结合分子排阻层析（SEC）对pH4.0、pH3.5条件下Nivolumab的Fab段和Fc段聚集情况的分析

图9：在不同pH下Nivolumab抗体及其Fab段、Fc段聚集情况的分析

图10：pH3.5时在不同添加剂下Nivolumab抗体聚集情况的分析

图11：甘露醇对Nivolumab抗体稳定性影响的热力学分析

图12：添加不同浓度甘露醇时Nivolumab抗体聚集情况的分析

图13：在不同pH下添加甘露醇时Nivolumab抗体聚集情况的分析。

具体实施方式

实施例 1 、 Nivolumab （ IgG4 亚型抗体的代表）抗体原液的制备

克隆Nivolumab的轻链、重链基因，分别插入pcDNA3.1表达载体，转染CHO-K1表达宿主细胞，筛选高表达克隆，在DMEM/F-12K培养基（Thermofisher公司）中37℃、8%CO2条件下进行大量培养、诱导表达，培养2周后收集细胞培养液，采用深层过滤系统（Pall公司）进行澄清过滤，先用孔径0.6-9μm的深层过滤器过滤去除细胞、细胞碎片及不溶性物质，然后用孔径0.1μm以下的深层过滤器去除微细颗粒，收集滤液作为研究Nivolumab纯化工艺的抗体原液。采用OD280紫外吸收法测定抗体原液中的蛋白含量为1.6mg/ml，pH值经测定为7.0。

实施例 2 、采用常规工艺对 Nivolumab 抗体原液进行 Protein A 亲和层析和低 pH 洗脱

① ProteinA 亲和层析和低 pH 洗脱

采用GE公司的rProteinA Sepharose 4 Fast Flow纯化介质和Avant 150蛋白纯化系统，将Nivolumab抗体原液按30mg蛋白/ml介质的剂量上样，结合缓冲液（Binding Buffer）为pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液（Elution Buffer）为pH3.5的25mM柠檬酸盐缓冲液，流速5ml/min，收集含有蛋白的洗脱液。

②超高效液相色谱仪（ UPLC ）结合分子排阻层析（ SEC ）分析洗脱物

经测定洗脱物的pH值为3.9，对含有目标蛋白（即Nivolumab抗体）的洗脱物进行取样，采用Waters公司的UPLC H-Class Bio超高效液相色谱仪和ACQUITY UPLC Protein BEH分子排阻凝胶柱（200Å，1.7 µm，分离分子量10-450kD）分析，结果发现洗脱物中有含量约为30%的聚集物（Aggregation）（图1）。

实施例 3 、采用离子交换层析对亲和层析洗脱物中的目标蛋白和聚集物分离、鉴定

采用Fractogel® EMD SO3 (S) 强离子交换层析 (Merck KGaA公司)对实施例2亲和层析洗脱物中的聚集物和目标蛋白进行分离，平衡缓冲液为pH5.0的20 mM醋酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为含有1M氯化钠的pH5.0的20 mM醋酸盐缓冲液，蛋白纯化仪的紫外监测显示有2个蛋白洗脱峰，对2个洗脱峰收集液采用实施例2中的超高效液相色谱仪结合分子排阻层析方法分析显示，首个洗脱峰为Nivolumab单体（Monomer）的洗脱峰，仅含有1%的聚集物，次个洗脱峰为聚集物的洗脱峰，含有70%的聚集物和30%的Nivolumab单体（图2、图3）。

采用液相色谱串联质谱（LC-MS）对洗脱物中的Nivolumab单体和聚集物进行鉴定，聚集物的分子量分布(146058, 146223, 146381, 146539, 146702 Da)与Nivolumab单体的分子量分布(146054, 146223, 146383, 146540, 146697 Da)高度相似（<5Da的分子量差异可视为设备的系统误差）（图4、图5），并且糖形、焦谷氨酸等翻译后修饰非常接近（图6）。

鉴定结果说明聚集物是Nivolumab的单体聚集而成。

实施例 4 、比较 Nivolumab 抗体及其 Fab 段、 Fc 段在不同 pH 下形成聚集物的倾向

①测定 Nivolumab 抗体在 pH4.0 和 pH3.5 时的聚集情况

为了分析引起Nivolumab抗体聚集的原因，取Nivolumab抗体以1 mg/mL 的浓度分别溶解于pH4.0、pH3.5的25mM柠檬酸钠缓冲液，孵育1小时；采用实施例2中的超高效液相色谱仪结合分子排阻层析方法对Nivolumab在pH4.0和pH3.5时形成聚集物的情况进行分析；结果表明，Nivolumab在pH4.0时聚集物的比例小于2%，而在pH3.5时聚集物比例约为30%（图7）。这说明低pH的酸性环境是引起Nivolumab聚集的原因。

②测定抗体的 Fab 段、 Fc 段在 pH4.0 和 pH3.5 时的聚集情况

为了分析Nivolumab抗体上与形成聚集物相关的酸性敏感区域，将Nivolumab样品采用IdeS（Immunoglubulin G-Degrading Enzyme of Streptococcus pyogenes，酿脓链球菌来源的免疫球蛋白G降解酶，购自Sigma-Adrich公司）在37℃处理2小时，IdeS是一种能将IgG抗体酶切为(Fab)2、Fc两个片段的蛋白酶，酶切完成后将产物分为2份，分别采用盐酸将pH值调至pH4.0、pH3.5并孵育1小时；采用实施例2中的超高效液相色谱仪结合分子排阻层析方法对IdeS酶切产物在pH4.0和pH3.5时的聚集情况进行分析；结果表明，与pH4.0时的色谱峰形对比，在pH3.5时(Fab)2所对应的峰形未变，而Fc段所对应的峰形明显变化（图8）。这说明低pH下Nivolumab抗体的聚集可能是由于Fc段而非(Fab)2段引起。

③测定 Nivolumab 抗体及其 Fab 段、 Fc 段酸性条件下发生聚集的 pH 阈值

采用IdeS将含有Nivolumab全长抗体的原液在37℃处理2小时，采用ProteinA亲和层析在pH6.0条件下分离酶解产物(Fab)2和Fc段，用超高效液相色谱仪结合分子排阻层析方法和SDS-PAGE方法鉴定(Fab)2和Fc的纯度均在95%以上。采用10K MWCO（截留分子量）的滤膜（Millipore公司）对分离的(Fab)2和Fc段进行超滤浓缩，用25 mM柠檬酸盐缓冲液将蛋白浓度调至1mg/ml。

将含有1mg/ml Nivolumab全长抗体或其酶解后的(Fab)2段、Fc段的25 mM柠檬酸盐缓冲液用盐酸调节pH至4.00、3.75、3.50、3.25、2.75、2.5，孵育1小时，然后用实施例2中的超高效液相色谱仪结合分子排阻层析方法测定反应产物中单体和聚集物的含量百分比，以单体百分比下降15%以上时的pH值做为发生聚集的pH阈值。

试验结果表明，Nivolumab全长抗体及其酶解后的(Fab)2段、Fc段在不同pH下的单体百分比见图9，三者发生聚集的pH阈值分别为pH3.5、pH3.25、pH3.75。这说明IgG4抗体的Fc段对酸性条件更加敏感，具有很强的酸不稳定性，IgG4亚型抗体Nivolumab在pH3.5酸性条件下的聚集主要由Fc段引起。

实施例 5 、比较精氨酸、组氨酸、蔗糖、甘露醇、海藻糖对 Nivolumab 抗体聚集物的影响

在实施例2的ProteinA亲和层析洗脱缓冲液（即pH3.5的25mM柠檬酸盐缓冲液）中分别添加10%（w/v）海藻糖（购自日本株式会社林原公司）、甘露醇（购自山东天力药业有限公司）、蔗糖（购自国药集团化学试剂有限公司），或50 mM精氨酸（购自上海协和氨基酸公司）、组氨酸（购自上海协和氨基酸公司），其他层析条件不变，上样样品仍为实施例1制备的Nivolumab抗体原液，重复实施例2的“① ProteinA亲和层析和低pH洗脱”和“② 超高效液相色谱仪结合分子排阻层析分析洗脱物”步骤。

试验结果表明，在添加海藻糖、甘露醇、蔗糖、精氨酸、组氨酸的情况下，含有目标蛋白的洗脱物中抗体聚集物的比例分别11%、6%、12%、27%、24%，空白对照中抗体聚集物比例为23%（图10）；说明甘露醇对降低抗体聚集物的效果最好。

实施例 6 、测定甘露醇对 Nivolumab 的热稳定性的影响

采用差示扫描热量法（DSC，Differential Scanning Calorimetry）在VP-DSC设备（购自Microcal公司）上测定甘露醇对Nivolumab的热稳定性Tm（熔点温度）和ΔH（熔融热）的影响。将Nivolumab抗体以0.5mg/ml的浓度分别稀释于：①pH6.0的25mM柠檬酸盐缓冲液、②pH3.5的25mM柠檬酸盐缓冲液、③pH3.5、添加10%（w/v）甘露醇的25mM柠檬酸盐缓冲液中，分别以不含有蛋白的相应空白缓冲液作为参考品，上样测试，扫描范围为10-120℃，速率100℃/小时，起始阶段在10℃平衡10分钟。以16秒作为过滤周期（Filtering Period），采用统计分析软件对测得的曲线进行分析获得Tm值和ΔH值。

试验结果表明：①在pH6.0的25mM柠檬酸盐缓冲液中，Nivolumab的Tm值为69.92℃，ΔH值为859KJ/mol；②在pH3.5的25mM柠檬酸盐缓冲液中，Nivolumab的Tm值为40.75、54.58℃，ΔH值为452KJ/mol；③在pH3.5、添加10%（w/v）甘露醇的25mM柠檬酸盐缓冲液中，Tm值升至43.91、56.25℃，ΔH值升至599KJ/mol（图11）。

这说明Nivolumab在pH3.5的酸性条件下的热稳定性比pH6.0时大幅降低，而添加甘露醇有提高Nivolumab的热稳定性的作用。

实施例 7 、测定不同浓度甘露醇对 Nivolumab 抗体聚集的影响

在实施例2的ProteinA亲和层析洗脱缓冲液（即pH3.5的25mM柠檬酸盐缓冲液）中分别添加5%、10%、15%、20%（w/v）的甘露醇，上样样品和其他层析条件不变，重复实施例2的“① ProteinA亲和层析和低pH洗脱”和“② 超高效液相色谱仪结合分子排阻层析分析洗脱物”步骤。

试验结果表明，在添加5%、10%、15%、20%（w/v）的甘露醇情况下，含有目标蛋白的洗脱物中抗体聚集物的比例分别10%、5%、8%、12%，空白对照中抗体聚集物比例为25%（图12）；说明浓度为10%（w/v）的甘露醇对降低抗体聚集物的效果最好。

实施例 8 、测定不同 pH 下添加甘露醇对 Nivolumab 抗体聚集物的影响

ProteinA亲和层析洗脱缓冲液分别使用pH3.0、pH3.3、pH3.5、pH3.8、pH4.0并添加10%（w/v）甘露醇的25mM柠檬酸盐缓冲液，上样样品和其他层析条件不变，重复实施例2的“① ProteinA亲和层析和低pH洗脱”和“② 超高效液相色谱仪结合分子排阻层析分析洗脱物”步骤。

试验结果表明，在洗脱液pH3.0、pH3.3、pH3.5、pH3.8、pH4.0的情况下，含有目标蛋白的洗脱物pH值分别为pH3.5、pH3.7、pH3.9、pH4.1、pH4.3，纯化产物中抗体聚集物的比例分别为14%、8%、4%、2%、0%（图13）。

为了在控制抗体聚集物比例的同时达到病毒灭活的最佳效果，pH3.5、10%甘露醇（w/v）的25mM柠檬酸盐洗脱液为Nivolumab抗体在ProteinA亲和层析纯化中的最优洗脱液配方。

Claims (10)

1.一种纯化抗体的方法，所述的抗体是IgG4亚型，或是含有IgG4亚型Fc段的融合蛋白，包含在低pH处理的过程中使用甘露醇的步骤。

2.权利要求1的纯化抗体的方法，所述的甘露醇在纯化过程中的工作浓度为5-15%（w/v）。

3.权利要求2的纯化抗体的方法，所述的甘露醇在纯化过程中的工作浓度为10%（w/v）。

4.一种纯化抗体的方法，包含如下步骤：先采用纯化介质捕获IgG4亚型的抗体或含有IgG4亚型Fc段的融合蛋白，再采用含有10%（w/v）甘露醇的低pH缓冲液将抗体从纯化介质上洗脱，然后进入后续的纯化或制剂步骤。

5.权利要求1-4的纯化抗体的方法，所述的低pH的范围为pH3.3~4.0。

6.权利要求1-4的纯化抗体的方法，所述的低pH的值为pH3.5。

7.权利要求1-4的纯化抗体的方法，所述的低pH缓冲液中含有25mM柠檬酸盐。

8.权利要求1-4的纯化抗体的方法，所述的IgG4亚型的抗体是Nivolumab。

9.一种用于IgG4亚型抗体或含有IgG4亚型Fc段的融合蛋白纯化过程的低pH缓冲液，pH值为3.3~4.0，含有5-15%（w/v）甘露醇。

10.权利要求9的低pH缓冲液，pH值为3.5，含有以下成分：

柠檬酸和柠檬酸钠合计：25mM；

甘露醇：10%（w/v）。