EA031324B1

EA031324B1 - Правильно свернутый этанерцепт с высокой чистотой и высоким уровнем выхода

Info

Publication number: EA031324B1
Application number: EA201590542A
Authority: EA
Inventors: Цутому Аракава; Дуглас Фаррар
Original assignee: Кохерус Байосайенсис, Инк.
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2018-12-28
Also published as: IL267452B; IL237311A0; JP6913066B2; TWI609877B; CO7400876A2; TW201425331A; CA2882551A1; KR102133699B1; AU2013315750B2; AU2018247244B2; ES2657377T3; WO2014043103A1; HRP20180182T1; EP2895188B1; KR20200085937A; US20190300601A1; TW201803593A; PE20150996A1; US20140072560A1; US10954293B2

Abstract

Представлен способ хроматографии смешанного типа для разделения правильно свернутых и неправильно свернутых конформаций данного белка. Способ является высокоэффективным для разделения правильно свернутого этанерцепта и неправильно свернутого этанерцепта и агрегатов с привлекательными с коммерческой точки зрения выходами продукта, способными обеспечивать препараты этанерцепта очень высокой чистоты в отношении правильно свернутого этанерцепта по сравнению с неправильно свернутым этанерцептом. Изобретение дополнительно относится к препаратам белка и составам, содержащим правильно свернутые белки, получаемые настоящими способами, и к способам лечения с использованием препаратов высокой степени чистоты, получаемых способом смешанного типа.

Description

Настоящее изобретение в основном относится к способам хроматографического разделения для очистки рекомбинантно экспрессируемых белков и к продуктам, полученным такими способами. Более конкретно, оно относится к применению хроматографии смешанного типа для очистки продукта экспрессии рекомбинантного белка, включая, например, слитые белки, которые могут содержать нежелательные количества неправильно свернутого и/или агрегированного белка наряду с правильно свернутым белком. Способ хроматографии смешанного типа по изобретению является особенно пригодным для отделения правильно свернутого этанерцепта от неправильно свернутого этанерцепта (как определено в настоящем описании). Изобретение также относится к препаратам этанерцепта и фармацевтическим составам, где содержащийся в них этанерцепт получали с высоким уровнем выхода и высокой чистотой описываемым способом. Изобретение дополнительно относится к способам лечения связанных с TNF состояний с применением высокоочищенного этанерцепта, характеризующегося существенно низкими уровнями неправильно свернутого/агрегированного белка.

Уровень техники, предшествующий изобретению

Этанерцепт (Enbrel®, производимый Immunex Corporation) представляет собой димерный слитый полипептид, состоящий из внеклеточного связывающегося с лигандом участка рецептора фактора некроза опухоли человека (TNFR) 75 килодальтон (р75), связанного с Fc-областью [фрагмент, кристаллизующийся] рецептора иммуноглобулина человека G (IgG1). Этанерцепт состоит из 934 аминокислот и имеет кажущуюся молекулярную массу приблизительно 150 килодальтон (Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company, Inc.). Fc-компонент этанерцепта содержит константный тяжелый домен 2 (СН2), константный тяжелый домен 3 (CH3) и шарнирную область, но не константный тяжелый домен 1 (CH1) IgG1 человека. Домен Fc может содержать один или все описанные выше домены.

Люди, страдающие от некоторых типов воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, бляшковидный псориаз, псориатический артрит, ювенильный идиопатический артрит и анкилозирующий спондилит, обладают иммунной системой, которая сверхпродуцирует фактор некроза опухоли (TNF). Было выявлено, что введение этанерцепта является эффективным для лечения некоторых воспалительных заболеваний, т.к. он может снижать уровни активной формы TNF у индивидуума посредством связывания с TNF как рецептор-ловушка.

Этанерцепт можно получать известным способом посредством технологии рекомбинантных ДНК в экспрессирующей системе млекопитающего на основе клеток яичника китайского хомяка (СНО). К сожалению, продукт, который продуцируют клетки СНО, содержит большое количество некорректно или неправильно свернутого и/или агрегированного этанерцепта. Для фармацевтического применения желательно предоставлять этанерцепт, который относительно не содержит неправильно свернутый и агрегированный белок, вследствие того, что неправильно свернутый/агрегированный белок не обладает таким же терапевтическим эффектом как правильно свернутый белок и может фактически являться вредным для пациента.

Неправильное сворачивание и агрегация часто возникают при получении рекомбинантных белков и, таким образом, эту проблему необходимо решать способами последующей обработки, способными разделять правильно свернутый белок от белка, который является неправильно свернутым или агрегированным. Неправильное сворачивание снижает или устраняет терапевтический эффект белка. Как правило, полагают, что агрегация включает нековалентную ассоциацию двух или более гомодимеров этанерцепта с образованием высокомолекулярных соединений, приводит к аналогичной потере терапевтического эффекта и возникает, когда белки, включая неправильно свернутые белки, накапливаются и слипаются друг с другом. Как указано выше, такие неправильно свернутые белки и белковые агрегаты являются не только терапевтически неэффективными, но также могут являться вредными для пациента. Таким образом, возможность очищать белковый продукт экспрессии, содержащий этанерцепт, таким образом, чтобы правильно свернутый этанерцепт отделять от неправильно свернутого и/или агрегированного этанерцепта, является важной для получения этанерцепта, который обеспечивает максимальную степень фармацевтической приемлемости.

Продукция неправильно свернутых и агрегированных белков не является конкретной проблемой этанерцепта. Существует много терапевтических белков, для которых неправильное сворачивание может являться проблемой. Например, трудно избежать неправильного сворачивания содержащих дисульфид белков во время рефолдинга рекомбинантных белков из телец включения Escherichia coli, но их можно эффективно разделять обращенно-фазовой хроматографией высокого разрешения. Однако использование низкого рН и органического растворителя в обращенно-фазовой хроматографии может вызывать денатурацию белков и может вызывать агрегацию очищенного белок во время хроматографии.

Даже в том случае, когда полагают, что неправильное сворачивание является незначительным при продукции фармацевтических белков, например, в случае секреторной экспрессии млекопитающего, все еще могут происходить агрегация и некоторое неправильное сворачивание (см., например, Chi E.Y., Krishnan S., Randolph T.W. and Carpenter J.F., Physical Stability of Proteins in Aqueous Solution: Mechanism and Driving Forces in Nonnative Protein Aggregation, Pharm. Res., 20, 1325-1336 (2003); Kiese S., Pappenberger A., Friess W. and Mahler H.C., Shaken, Not Stirred: Mechanical Stress Testing of an IgG1 Antibody, J.

- 1 031324

Pharm. Sci., 97, 4347-4366 (2008)). Исследователи успешно разделяли ненативные, неправильно свернутые белки в невосстановительных условиях с использованием водной хроматографии с применением ионного обмена (IEC) (см., например, Gagnon P.J., Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography in the Presence of Polyethylene Glycol, Immunol. Methods, 336, 222-228 (2008); Gagnon P., Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Validated Biosystems, Tucson, AZ, 57-87 (1996); Shukla A.A. and Yigzaw Y., Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry, Shukla A., Etzel M. and Gadam S., eds., 179-227, CRC Press, Boca Raton (2007); Staby A., Jacobsen J.H., Hansen R.G., Bruus U.K., Jensen

I. H., Comparison of Chromatographic Ion-exchange Resins. V. Strong and Weak Cation-Exchange Resins,

J. Chromatogr. A, 1118, 168-179 (2006); Shukla A.A., Hubbard В., Tressel Т., Guhan S., Low D.J., Downstream Processing of Monoclonal Antibodies-Application of Platform Approaches, Chromatogr. B, 848, 28-39 (2007); Shihara Т., Kadoya T.J., Accelerated Purification Process Development of Monoclonal Antibodies for Shortening Time to Clinic: Design and Case Study of Chromatography Processes, Chromatogr. A, 1176, 149-156 (2007); Fahrner R.L., Knudsen H.L., Basey CD., Galan W., Feuerhelm D., Vanderlaan M., Blank G.S., Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies: Development, Operation, and Validation of Chromatography Processes, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 18, 301-27 (2001) и Yigzaw Y., Hinckley P., Hewig A. and Vedantham G., Ion Exchange Chromatography of Proteins and Clearance of Aggregates, Curr. Pharm. Biotech., 10, 421-426 (2009)), гидрофобного взаимодействия (HIC) (см., например, Chen J., Tetrault J., Ley A., Comparison of Standard and New Generation Hydrophobic Interaction Chromatography Resins in the Monoclonal Antibody Purification Process, J. Chromatogr. A., 1177, 272-81 (2008); Gagnon P. and Grund E., Large Scale Process Development for Hydrophobic Interaction Chromatography, Part 4: Controlling Selectivity, BioPharm,

9, 54-64 (1996) и Lu Y., Williamson B. and Gillespie R., Recent Advancement in Application of Hydrophobic Interaction Chromatography for Aggregate Removal in Industrial Purification Process, Curr. Pharm. Biotech.,

10, 427-33 (2009)) и хроматографии на гидроксиапатите (НА) (см., например, Aoyama K., Chiba J., Separation of Molecular Forms of Mouse IgG and IgM Monoclonal Antibodies in High Performance Liquid Chromatography on Spherical Hydroxyapatite Beads, J. Immunol. Methods, 162, 201-210 (1993); Luellau E., Marison W., von Stockar U., Ceramic Hydroxapatite: A New Tool for Separation and Analysis of IgA Monocolonal Antibodies, in Animal Cell Technology, Carondo M., ed., Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 265-269 (1997); Luellau E., von Stockar U., Vogt S., Freitag R., Development of a Downstream Process for the Isolation and Separation of Monoclonal Immunoglobulin A Monomer, Dimers, and Polymers from Cell Culture Supernatant, J. Chomatogr. A., 796, 165-175 (1998); Yamakawa Y., Chiba J., High Performance Liquid Chromatography of Mouse Monoclonal Antibodies on Spherical Hydroxyapatite Beads, J. Liquid. Chromatogr., 11, 665681 (1998); Coppola G., Underwood J., Cartwright G., Hearn M.T., High-performance Liquid Chromatography of Amino Acids, Peptides and Proteins: XCIII. Comparison of Methods for the Purification of Mouse Monoclonal Immunoglobulin M Autoantibodies, J. Chromatogr. A., 476, 269-290 (1989); Josics D., Loster K., Kuhl R., Noll F., Reusch J., Purification of Monoclonal Antibodies by Hydroxylapatite HPLC and Size Exclusion HPLC, Biol. Chem. Hoppe-Seylars, 372, 149-156 (1991); Gagnon P. and Beam K., Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography, Curr. Pharm. Biotech. (2008)).

Предшествующие уровни, такие как указанные выше, не оказались пригодными для применения для разделения правильно свернутого этанерцепта и неправильно свернутого этанерцепта, что заключается в том, что они не обеспечивают качественно и/или количественно соответствующие образцы. Таким образом, в данной области существует необходимость в эффективном и действенном способе разделения для использования для продуцируемого клетками СНО этанерцепта, способного обеспечивать препараты этанерцепта очень высокой чистоты (т.е. в которых неправильно свернутый этанерцепт отсутствует или содержится на очень низких уровнях) и с привлекательными с коммерческой точки зрения выходами продукции.

В настоящем изобретении применяют так называемую хроматографию смешанного типа. Хроматографический способ очистки рекомбинантно экспрессируемых белков, как правило, может называться смешанного типа, когда в нем используют по меньшей мере две различные силы для связывания белков и разделения желаемого белкового продукта от нежелательных веществ, которые могут содержаться в относительно содержащем примеси продукте экспрессии, содержащем желаемый белок наряду с нежелательными примесями. Такие силы могут включать, например, электростатические силы и гидрофобные силы.

Хроматография смешанного типа функционирует образом, аналогичным более традиционным техникам хроматографии, что заключается в том, что присутствует неподвижная фаза и подвижная фаза. Неподвижная фаза обычно представляет собой нерастворимую смолу или гель, как правило, обозначаемый как хроматографическая смола, которая обеспечивает основу для разделения. Смола содержится в колонке, обеспечивающей прохождение и контактирование со смолой жидкостей. Способность хроматографической смолы разделять желаемое вещество от нежелаемого вещества становится возможной в результате наличия отобранных химических групп или молекул, которые конъюгированы со смолой. Эти конъюгированные группы, как правило, называемые лигандами, придают смоле необходимые аффинные свойства (т.е. свойства электростатического притяжения, обусловленные ионообменными группами, содержащимися в лигандах, и свойства гидрофобного притяжения, обусловленные гидрофобными группа

- 2 031324 ми, содержащимися в лигандах), таким образом, обеспечивая возможность связывания смолы с некоторыми белковыми веществами в содержащем примеси образце, но не с другими, когда обеспечивают протекание раствора, содержащего образец, содержащий примесь, через хроматографическую колонку при контактировании со смолой.

Неподвижную фазу хроматографической колонки, содержащей смолу с такими аффинными группами, помещают внутри хроматографической колонки, которая, как правило, представляет собой прочный цилиндрический сосуд, в котором жидкость можно вводить с одного конца, она может контактировать со смолой, а затем выходить из колонки с противоположной стороны. Раствор, содержащий белок, который необходимо очищать, можно вводить (и, таким образом, обеспечивать его протекание) в колонку путем помещения белкового продукта в подходящий раствор, и обеспечивая перемещение раствора, называемого подвижной фазой, через колонку. Когда белковый продукт, который необходимо очищать (называемый аналитом), содержится в колонке в подвижной фазе, он достигает состояние равновесия между колонкой и подвижной фазой, что означает, что некоторое вещество в растворе белка прикрепляется, связывается или становится присоединенным к аффинным группам или захваченным ими на смоле в колонке, при этом оставшаяся часть вещества в продукте не прикрепляется к колонке, а наоборот, протекает и вытекает из колонки, где ее можно собирать для анализа, дополнительно обрабатывать или его можно выкидывать.

После того как белковый аналит становится связанным с колонкой описанным выше образом, затем используют этап промывания, как правило, называемый этапом элюирования, для элюирования или выделения связанного аналита из колонки. В зависимости от типа аффинных лигандов (например, группы на основе заряда или гидрофобные группы, или их сочетание и т.д.,), которые содержатся на смоле, для связывания аналита с колонкой, раствор, используемый для элюирования или выделения аналита из колонки, должен обладать аффинностью или притяжением к аналиту и/или лиганду (например, свойствами заряда, гидрофобными свойствами, свойствами рН, концентрацией солей и т.д.), которое может преодолевать аффинность или притяжение аналита к смоле, таким образом, приводя к выделению аналита из смолы (указанной выше неподвижной фазы) и в элюирующую среду (подвижную фазу). Затем, после выделения или элюирования в подвижную фазу аналит может протекать через хроматографическую колонку и вытекать из нее для последующего сбора, анализа и т.д. или его можно переносить в дальнейшие способы очистки или этапы фильтрования. Следует понимать, что независимо от свойств притяжения или аффинности, обуславливающих связывание аналита с хроматографической смолой (например, свойств заряда или гидрофобных свойств), раствор подвижной фазы, который затем используют для элюирования или выделения аналита, должен обладать конкурирующим набором свойств, таким образом, что аналит в этом случае предпочитает находиться в элюирующей среде, а не оставаться захваченным на смоле колонки.

По сравнению с другими способами хроматографии одного типа, так называемая хроматография смешанного типа является уникальной, что заключается в том, что различные факторы связывания и элюирования могут являться взаимозаменяемыми и противодействовать друг другу. Например, увеличение ионной силы подвижной фазы в традиционной ионообменной хроматографии одного типа может регулировать элюирование или выделение связанного со смолой аналита, когда характеристики заряда аналита обладают большим притяжением (предпочтением) к элюирующей среде по сравнению с силами притяжения смолы колонки. Однако в способе хроматографии смешанного типа, где в хроматографической смоле используется электростатическое притяжение, а также гидрофобное притяжение для связывания аналита, увеличение ионной силы подвижной (элюирующей) фазы может регулировать выделение вещества образца из колонки, в зависимости от свойств заряда этого вещества, при этом в то же время направляя или усиливая связывание гидрофобных веществ в аналите, т.к. затем такие гидрофобные белковые вещества в присутствии заряженной основной элюирующей среды, как правило, обладают более сильным притяжением или предпочтением, чтобы связываться с гидрофобными лигандами колонки по сравнению с заряженной средой элюирующей среды. Таким образом, несмотря на то, что увеличение концентрации солей может фактически управлять тенденцией перемещения заряженных белковых веществ из неподвижной фазы, когда заряженные ионы в подвижной фазе конкурируют с белком за участки связывания на этих участках неподвижной фазы смеси продуктов аналитов, которые могут обладать более высокой степенью гидрофобного характера, то они могут обладать повышенной тенденцией оставаться связанными с гидрофобными группами колонки хроматографии смешанного типа. Способность использовать эти явления в любом данном контексте разделения белка едва ли можно считать предсказуемой.

Два примера смол смешанного типа представляют собой Capto™ ММС и Capto™ Adhere (доступные от GE Healthcare). В Capto™ MMC используют лиганд, прикрепленный к твердой матрицеподложке, которая может взаимодействовать с аналитом посредством катионного обмена (с его карбоксильной группой), образования водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Лиганд Capto™ ММС проиллюстрирован ниже:

- 3 031324

Capto™ Adhere является аналогичным Capto™ ММС в том, что в нем также применяют лиганд, который прикреплен к твердой подложке-матрице. Лиганд ^-бензил-^-метилэтаноламин также взаимодействует с аналитом посредством анионного обмена, образования водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Лиганд Capto™ Adhere проиллюстрирован ниже:

Ожидают, что в обоих лигандах гидрофобное взаимодействие является слабым. Таким образом, если эти лиганды содержат только гидрофобные группы (не заряды), для связывания белка с большой вероятностью для них требуются условия высаливания (осаждения белка). Однако наличие электростатического взаимодействия может делать такое слабое гидрофобное взаимодействие достаточным для обеспечения дополнительной силы связывания.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано на открытие того, что хроматографию смешанного типа, например, с использованием Capto™ MMC и Capto™ Adhere в качестве смолы для хроматографии смешанного типа, можно применять для очистки аналита, содержащего смесь правильно свернутого и неправильно свернутого белка, включая, например, смесь белков, содержащую правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт, таким образом, правильно свернутый белок можно эффективно отделять от некорректно свернутого или неправильно свернутого белка очень эффективным образом и с высокими уровнями выхода продукта с получением препарата белка, который содержит большие количества желаемого правильно свернутого белка. Кроме того, настоящее изобретение относится к возможности практически осуществлять хроматографическое разделение смешанного типа, описываемое в настоящем описании, таким образом, чтобы получать продукт элюирования в результате хроматографического разделения, который может при желании не содержать или по существу не содержать неправильно свернутый продукт, хотя следует понимать, что с целью уравновешивания выхода и чистоты можно находить приемлемым включение очень низких уровней неправильно свернутого продукта (например, менее 5 мас.% и предпочтительно менее 3 мас.%) для максимального увеличения выходов до желаемой величины.

Таким образом, в первом варианте осуществления настоящее изобретение представляет собой способ разделения правильно свернутого белка и неправильно свернутого белка на основе хроматографии смешанного типа, включающий этапы: (а) связывания первой смеси белков, содержащей правильно свернутые и неправильно свернутые конформации данного белка со смолой для хроматографии смешанного типа, имеющей ионообменные группы и гидрофобные группы; (b) элюирование правильно свернутого белка из смолы смешанного типа с получением второй смеси белков с более высокой долей правильно свернутого белка по сравнению с первой смесью белков. Термин более высокая доля означает, что отношение правильно свернутого к неправильно свернутому белку в элюате после этапа (b) является по меньшей мере больше 1:1, но наиболее предпочтительно больше приблизительно 8:2 и предпочтительно больше приблизительно 9:1. Вторая смесь белков наиболее предпочтительно содержит правильно свернутый белок в количестве, составляющем по меньшей мере приблизительно 95 мас.% второй смеси белков.

Во втором варианте осуществления способ относится к способу очистки смеси белков на основе хроматографии смешанного типа для разделения правильно свернутого этанерцепта и неправильно свернутого этанерцепта, содержащегося в указанной смеси, где способ включает этапы: (а) приведение смолы для хроматографии смешанного типа, содержащей гидрофобные группы и ионообменные группы в контакт с раствором, содержащим смесь белков, содержащую правильно свернутый этанерцепт и неправильно свернутый этанерцепт, таким образом, что правильно и неправильно свернутый этанерцепт становятся присоединенными, связанными или захваченными на смоле для хроматографии смешанного типа, и (b) приведение смолы смешанного типа в контакт с раствором, способным элюировать белки этанерцепта из смолы для хроматографии смешанного типа, с получением элюата, в котором отношение количества правильно свернутого этанерцепта к неправильно свернутому этанерцепту является выше, и предпочтительно гораздо выше по сравнению со смесью белков, вводимой в смолу на этапе (а).

Третий вариант осуществления настоящего изобретения относится к содержащей этанерцепт смеси белков или фармацевтически приемлемому составу, содержащему указанную смесь, полученному в со

- 4 031324 ответствии с описанными выше вариантами осуществления способа, и где указанная смесь белков содержит правильно свернутый этанерцепт в количестве, составляющем более приблизительно 90 мас.% смеси белков, и содержащую неправильно свернутый этанерцепт в количестве, составляющем менее приблизительно 5 мас.% смеси белков, и где смесь белков содержит общее количество правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта, составляющее по меньшей мере приблизительно 95 и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98 мас.% содержащей этанерцепт смеси белков. Количества правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта можно определять с использованием хроматографии гидрофобного взаимодействия (один тип). Общие количества правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта можно определять с использованием эксклюзионной хроматографии (SEK). Как используют в настоящем описании, термины смесь белков на основе этанерцепта или содержащая этанерцепт смесь белков или препарат этанерцепта или вещество на основе этанерцепта и т.п. следует понимать как синонимы и предназначены обозначать смесь белков, в которой основной компонент содержит правильно свернутый этанерцепт, и второстепенные компоненты могут содержать усеченный этанерцепт, неправильно свернутый этанерцепт, агрегированный этанерцепт (где такие агрегаты состоят из правильно и/или неправильно свернутого этанерцепта) или фрагменты этанерцепта. Настоящее изобретение обеспечивает возможность получения смеси белков на основе этанерцепта (или препарата этанерцепт) для применения в качестве активного ингредиента в фармацевтических составах, в которых желательно максимально увеличивать количество правильно свернутого этанерцепта, при этом сводить к минимуму количество неправильно свернутого (включая агрегированное) этанерцепта в большей степени по сравнению с тем, что было достигнуто до настоящего времени.

В четвертом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтически приемлемому составу, содержащему этанерцепт высокой степени чистоты, подходящий для введения индивидууму, нуждающемуся в лечении опосредованного TNF состояния, где указанный состав содержит смесь белков, содержащую основное количество правильно свернутого этанерцепта и незначительное количество неправильно свернутого этанерцепта, где: (i) неправильно свернутый этанерцепт составляет менее приблизительно 10 мас.%, предпочтительно менее приблизительно 8 мас.% и наиболее предпочтительно менее приблизительно 5 мас.% смеси белков; (ii) правильно свернутый этанерцепт составляет более 90 мас.% и предпочтительно более приблизительно 92 мас.% и наиболее предпочтительно более приблизительно 95 мас.% смеси белков, и (iii) общее количество правильно свернутого этанерцепта и неправильно свернутого этанерцепта (но не включая его агрегаты) составляет по меньшей мере 95 мас.% и предпочтительно по меньшей мере 98 мас.% смеси белков; где состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемые неактивные ингредиенты, эксципиенты или носители, делающие состав подходящим для введения индивидууму.

В пятом варианте осуществления изобретение представляет собой способ получения содержащей этанерцепт смеси белков с высокой степенью чистоты в отношении количества правильно свернутого этанерцепта по сравнению с неправильно свернутым этанерцептом, содержащегося в ней, где указанный способ включает этапы: (1) экспрессии этанерцепта в экспрессирующей система млекопитающего с получением собираемой жидкости от культуры клеток, содержащей смесь белков, содержащую этанерцепт, содержащую правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт; (2) подвергание собираемой культуральной жидкости, полученной на этапе 1, способу очистки, в результате чего получают содержащую этанерцепт смесь белков со сниженным количеством, или по существу не содержащую нежелательных примесей (т.е. белков не на основе этанерцепта), содержащихся в собираемой культуральной жидкости, полученной на этапе (1); (3) приведение содержащей этанерцепт смеси белков, полученной на этапе (2), в контакт один или несколько раз со смолой для хроматографии смешанного типа, имеющей ионообменные группы и группы гидрофобного взаимодействия, для прикрепления белков, содержащихся в смеси, к смоле, и (4) приведение смолы смешанного типа, содержащей связанный с ней белок, после этапа 3 в контакт с раствором, способным элюировать правильно свернутый этанерцепт из смолы смешанного типа с получением элюата, содержащего смесь белков, содержащую этанерцепт, с более высокой долей правильно свернутого этанерцепта по сравнению с неправильно свернутым этанерцептом, чем содержащая этанерцепт смесь, вводимая в смолу на этапе 3, и где (i) количество белка, содержащегося в содержащей этанерцепт смеси белков, полученной после очистки этапа 2, составляет по меньшей мере приблизительно 80 мас.% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 85 мас.% количества смеси белков на основе этанерцепта, содержащейся в собираемой культуральной жидкости, полученной на этапе 1; (ii) общее количество правильно и неправильно свернутого белка этанерцепта, содержащегося в смеси белков, элюируемых на этапе 4, составляет по меньшей мере приблизительно 60 мас.% их количества, содержащегося в смеси белков, полученной на этапе 2; (iii) количество правильно свернутого этанерцепта, содержащегося в элюате этапа 4, составляет по меньшей мере приблизительно 30 мас.% и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 34 мас.% количества содержащей этанерцепт смеси белков, содержащейся в собираемой культуральной жидкости, полученной на этапе 1, и (iv) указанный правильно свернутый этанерцепт составляет по меньшей мере приблизительно 90 мас.% и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95 мас.% элюата, полученного на этапе 4.

В шестом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения индивидуума, стра

- 5 031324 дающего опосредованным TNF заболеванием, включающему этапы введения такому индивидууму фармацевтического состава, содержащего смесь белков, содержащую правильно свернутый этанерцепт и неправильно свернутый этанерцепт, где указанную смесь получают любым из способов, описанных выше, и где количество неправильно свернутого этанерцепта в смеси белков составляет менее приблизительно 10 мас.% и предпочтительно менее приблизительно 5 мас.% указанной смеси.

В седьмом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения индивидуума, страдающего опосредованным TNF заболеванием, включающему этапы введения такому индивидууму фармацевтического состава, содержащего смесь белков, содержащую правильно свернутый этанерцепт и неправильно свернутый этанерцепт, где количество неправильно свернутого этанерцепта в смеси белков составляет менее приблизительно 10 мас.% и предпочтительно менее приблизительно 5 мас.% указанной смеси.

В восьмом варианте осуществления изобретение относится к способу разделения правильно свернутого этанерцепта и неправильно свернутого этанерцепта, где используют средства хроматографии для получения указанного разделения и где средства хроматографии состоят только из хроматографии смешанного типа, в которой смесь, содержащую правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт, приводят в контакт со смолой для хроматографии смешанного типа, содержащей ионообменные и гидрофобные группы, а затем элюируют из нее с получением элюата, содержащего по меньшей мере приблизительно 85 и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95 мас.% правильно свернутого этанерцепта. Касательно этого варианта осуществления, при указании в настоящем описании, что средства хроматографии состоят только из хроматографии смешанного типа, следует понимать, что такая формулировка не исключает необязательное использование различных средств хроматографии (например, HIC, SEK и т.д.) при использовании только для аналитических целей. Этот вариант осуществления является предпочтительным, потому что для него не требуется использование способов разделения для отделения правильно свернутого белка от неправильно свернутого белка, отличного от способа смешанного типа, описываемого в настоящем описании.

В дополнительном аспекте описанные выше способы, как применяют по отношению к этанерцепту, можно осуществлять два или более раз для получения препарата этанерцепта высокой степени чистоты следующим образом: путем проведения первого разделения смешанного типа (разделение № 1) посредством проведения этапов (а) и (b), как описано, например, в вариантах осуществления 1 и 2 выше, с последующим проведением второго разделения смешанного типа (разделение № 2) посредством повторного проведения этапов (а) и (b); где элюат, полученный на этапе (b) разделения № 1, затем используют в качестве аналита (т.е. раствора, содержащего смесь белков) для этапа (а) разделения № 2. Смолы смешанного типа, используемые в разделении № 1 и разделении № 2, могут являться одинаковыми или различными. В особенно предпочтительном осуществлении этого аспекта разделение № 1 проводят с использованием смолы смешанного типа САРТО ММС и разделение № 2 проводят с использованием смолы смешанного типа САРТО ADHERE.

Необязательно препараты этанерцепта, полученные способом по изобретению или предоставленные в описанных выше вариантах осуществления препарата, состава или лечения, по желанию могут не содержать или по существу не содержать неправильно свернутый этанерцепт, хотя следует понимать, что возможность в настоящем описании предоставлять препараты этанерцепта, содержащие заметно низкие уровни неправильно свернутого этанерцепта предпочтительно менее приблизительно 10 мас.% и наиболее предпочтительно менее приблизительно 5 мас.% общего количества смеси белков на основе этанерцепта, содержащейся в составе лекарственного средства, является значительным преимуществом по сравнению с доступными в настоящее время для коммерческого сбыта фармацевтическими составами, содержащими смеси на основе этанерцепта, в которых количество неправильно свернутого этанерцепта в таких смесях, определяемое на основании анализа HIC, может быть больше приблизительно 10% белков на основе этанерцепта, встречающихся в таких составах.

Предпочтительные смолы смешанного типа для применения в изобретеним представляют собой САРТО ММС и САРТО ADHERE; однако следует понимать, что в настоящем изобретении предусматривают использование любой смолы смешанного типа, функционализированной ионообменными группами и гидрофобными группами.

Без связи с какой-либо конкретной теорией, считалось возможным или даже полностью прогнозировали, что можно использовать взаимосвязанность и противоположное действие между характеристиками заряда и гидрофобными характеристиками в хроматографии смешанного типа с использованием этих двух типов аффинности для развития высокоэффективного разделения правильно молекул свернутого белка и молекул, которые являются неправильно свернутыми и/или агрегированными. Неожиданно, способ смешанного типа по изобретению не нужно комбинировать с какими-либо другими стратегиями разделения или дополнять ими для отделения правильно свернутого белка от неправильно свернутого белка с высоким уровнем выхода и высокой степенью чистоты. Например, не является обязательным применение дополнительного этапа HIC для последующего получения такого разделения правильно свернутого белка и неправильно свернутого белка.

- 6 031324

Как применяют по отношению к этанерцепту, способ хроматографии смешанного типа по настоящему изобретению включает осуществление следующей ниже общей последовательности процесса: вопервых после введения в смолу смешанного типа образца, содержащего этанерцепт, содержащий примеси (т.е. образца, содержащего правильно свернутый, неправильно свернутый и другие примеси), такого как полученный, например, в результате экспресии СНО этанерцепта, способ по изобретению позволяет этанерцепту (правильно и неправильно свернутому) связываться со смолой смешанного типа. Во-вторых, во время последующего этапа элюирования или промывания (например, с использованием солевого градиента, применяемого предпочтительно в градиенте увеличивающейся концентрации), настоящее изобретение обеспечивает выделение (т.е. элюирование) из смолы смеси на основе этанерцепта, где содержащийся в ней этанерцепт является преимущественно правильно свернутым, при этом по существу обеспечивая возможность того, что этанерцепт, который является неправильно свернутым, остается связанным или захваченным на смоле смешанного типа; таким образом, в веществе, элюируемом из смолы, можно получать очень высокое соотношение правильно свернутого этанерцепта (по сравнению с более низким его соотношением, содержащимся в образце белка, содержащего этанерцепт, исходно вводимого в смолу и связывающегося с ней). Касательно физического функционирования хроматографии смешанного типа по настоящему изобретению, смола смешанного типа может содержаться (т.е. являться упакованной) в прочных колончатых средствах удерживания или сосуде, который может содержать смолу и который оборудован средствами ввода и вывода, чтобы обеспечивать возможность вхождения жидких растворов с одного конца колонки, протекание в контакте со смолой, а затем выход на противоположном конце сосуда, чтобы его можно было собрать для последующего анализа или обработки, или чтобы выкинуть.

Раствор, содержащий смесь белков правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта, используемый на этапе (а) описанных выше способов, можно получать известным образом в результате экспрессии белка этанерцепта в культуре клеток млекопитающих, например, клетках СНО. Перед проведением очистки хроматографией смешанного типа в настоящем изобретении собираемый белок в результате экспрессии в системе млекопитающих (собираемая культуральная жидкость) можно подвергать начальному этапу очистки, такому как аффинная очистка с использованием белка А, для удаления примесей. Несмотря на то, что такой этап может являться желательным для удаления примесей, не относящихся к этанерцепту, такая очистка, как правило, не приводит к значительному разделению (т.е. разрешению) правильно свернутого этанерцепта от неправильно свернутого этанерцепта. Таким образом, совокупность белка А затем подвергают способу смешанного типа по настоящему изобретению для проведения такого разделения.

Способ по настоящему изобретению обеспечивает коммерчески пригодные выделения (выходы) правильно свернутого этанерцепта.

Например, в случаях, когда раствор белка на основе этанерцепта правильно и неправильно свернутого этанерцепта, используемый на этапе (а) настоящего способа, предпочтительно предоставлен в форме продукта хроматографии с белком А, полученного очисткой продукта экспрессии млекопитающего этанерцепта в колонке с белком А, количество вещества, выделяемого на этапе очистки белка А, предпочтительно составляет по меньшей мере приблизительно 80 мас.% и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 85 мас.% продуктов экспрессии на основе этанерцепта, содержащихся в собираемой культуре клеток, вводимой в колонку с белком А (где количество белков на основе этанерцепта, содержащегося в собираемой культуре клеток, можно определять Fc Elisa, и количество белков на основе этанерцепта, полученных в объединенных элюатах белка А, можно определять по оптической плотности в УФ-области при А280 нм). Затем, когда проводят хроматографию смешанного типа по настоящему изобретению с использованием указанного выше очищенного с использованием белка А вещества, количество белкового вещества на основе этанерцепта, полученного при элюировании после этапа (b) по настоящему изобретению, предпочтительно составляет по меньшей мере приблизительно 60 мас.% и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70 мас.% количества вещества на основе этанерцепта, вводимого в смолу смешанного типа на этапе (а) по изобретению.

Таким образом, общий выход смеси этанерцепта высокой чистоты в элюате смешанного типа после этапа (b) по настоящему описанию, который содержит в большом количестве правильно свернутый этанерцепт (т.е. содержащий не более 10% масс. и предпочтительно не более приблизительно 5 мас.% неправильно свернутого вещества в пересчете на массу элюата) может составлять приблизительно от 30 приблизительно до 50 мас.% смеси на основе этанерцепта, исходно содержащейся в собираемой культуральной жидкости до ее очистки (например, очистки с использованием белка А).

Очистку собираемой культуральной жидкости также можно получать посредством других хроматографических средств, таких как хроматография смешанного типа, с использованием хроматографических смол, содержащих ионообменные частицы и частицы, обеспечивающие гидрофобные взаимодействия.

При осуществлении способа по настоящему изобретению можно проводить дополнительные этапы фильтрования (например, фильтрования вирусов и фильтрования тангенциальным потоком) известным способом для дополнительной обработки элюатов, полученных на этапе (b) описанного выше способа хроматографии смешанного типа.

- 7 031324

Настоящее изобретение обеспечивает значительно улучшенный способ разделения для разделения правильно свернутых и неправильно свернутых конформаций (включая агрегаты) данного белка, и, в частности, разделение правильно свернутого этанерцепта от неправильно свернутого (и агрегированного) этанерцепта, полученного из сбора культуры клеток млекопитающих, содержащего в значительной степени неоднородную смесь молекул на основе этанерцепта.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена химическая структура смолы смешанного типа Capto-MMC и Capto-Adhere.

На фиг. 2А (профиль элюирования из белка А) представлен профиль элюирования из белка А собираемой культуры СНО, содержащей правильно свернутый и неправильно свернутый белок этанерцепта с использованием элюирования 0,1 М цитратом при указанном рН, содержащем 1 М аргинина. Сплошная кривая представляет собой оптическую плотность в УФ-области; пунктирная кривая представляет собой электропроводность (аналогично на следующих ниже фигурах).

На фиг. 2В (профиль элюирования из белка А) представлены результаты нативного-PAGE образцов, элюируемых из белка А, где дорожка 1 представляет собой стандарт (коммерческий энбрел); дорожка 2 представляет собой нагрузку; дорожка 3 представляет собой FT (фильтрат); дорожка 4 - рН 6,0; дорожка 5 - рН 4,2; дорожка 6 - рН 3,7; дорожка 7 - рН 3,0.

На фиг. 3A (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto ММС) представлена хроматограмма САРТО ММС элюирования NaCl или аргинином в 10 мМ фосфате, рН 7,5.

На фиг. 3B (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto ММС) SDS-PAGE и нативный PAGE элюируемых образцов), где дорожка 0 - стандарт; дорожка 1 - нагрузка; дорожка 2 - FT; дорожка 3 - 0,15 М NaCl; дорожка 4 - 0,3 М NaCl; дорожка 5-1 М аргинин.

На фиг. 4А (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto ММС) представлена хроматограмма элюирования градиентом 0-0,5 М NaCl при рН 7,5. Колонку уравновешивали 10 мМ фосфатом, рН 7,5 перед элюированием в градиенте.

На фиг. 4В (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto ММС) представлен нативный PAGE элюируемых образцов, где: дорожка 0 стандарт; дорожка 1 - нагрузка; дорожка 2 дорожка 8 - элюируемые фракции; дорожка 9 - 1 М аргинин.

На фиг. 4С (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto ММС) представлен SDS-PATE и нативный PAGE элюируемого образца для различных объединенной фракции белка А, где: дорожка 0 - стандарт; дорожка 1 - нагрузка, дорожка 2 -FT; дорожка 3 - дорожка 8 - элюируемые фракции; дорожка 9 - 1 М аргинин.

Фиг. 5А (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto-MMC) хроматограмма элюирования градиентом 0-0,4 М Na₂SO₄ при рН 7,5. Колонку уравновешивали 10 мМ фосфатом, рН 7,5 перед элюированием в градиенте.

На фиг. 5В. (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto-MMC) SDS-PAGE и нативный PAGE элюируемых образцов, где дорожка 1 - нагрузка; дорожка 2 - FT; дорожка 3 -промывной буфер; дорожка 4 - дорожка 9 - элюируемые фракции; дорожка 10 - 1 М аргинин.

На фиг. 6 представлен анализ HIC элюируемых фракций Capto-MMC.

На фиг. 7А (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto-MMC) представлена хроматограмма элюирования рН и солевым градиентом.

На фиг. 7В (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto-MMC) представлен SDS-PAGE и нативный PAGE элюируемых образцов, где дорожка 0 - стандарт; дорожка 1 - нагрузка; дорожка 2 и 3 - FT; дорожка 4 - дорожка 8 - элюируемые фракции; дорожка 9 - 1 М аргинин.

На фиг. 8А (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto-MMC) представлена хроматограмма элюирования рН и градиентом Na2SO4.

На фиг. 8В (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto-MMC) представлен SDS-PAGE и нативный PAGE элюируемых образцов, где дорожка 0 - стандарт; дорожка 1 - нагрузка; дорожка 2 - FT; дорожка 3 - дорожка 5 - элюируемые фракции; дорожка 6 - 1 М аргинин.

На фиг. 9 представлен нативный PAGE объединенной фракции белка А из Capto-Adhere, где дорожка 0 - стандарт; дорожка 1 -нагрузка; дорожка 2-5 мМ цитрат (рН 4,5); дорожка 3 и 4 - 0,1 М аргинин (рН 4,5); дорожка 5 - 0,5 М аргинин. Наблюдаемые низкомолекулярные молекулы заключены в рамки.

На фиг. 10А (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto-Adhere) представлена хроматограмма элюирования рН и градиентом аргинина.

На фиг. 10В (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto-Adhere) представлен SDS-PAGE и нативный PAGE элюируемых образцов, где дорожка 0 - стандарт; дорожка 1 нагрузка; дорожка 2 - дорожка 4 - FT; дорожка 5 - дорожка 7 -элюируемые фракции; дорожка 8 - 0,5 М аргинин.

На фиг. 11A (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto-Adhere) представлена хроматограмма элюирования рН и градиентом аргинина.

На фиг. 11В (профиль элюирования объединенной фракции белка А из Capto-Adhere) представлен нативный PAGE элюируемых образцов, где дорожка 0 - стандарт; дорожка 1 - нагрузка; дорожка 2 - FT; дорожка 3 - дорожка 5 - элюируемые фракции; дорожка 6 - 1 М аргинин.

Фиг. 12 представляет собой схематическое представление анализа HIC (хроматография гидрофоб

- 8 031324 ного взаимодействия) элюируемых фракций смолы Capto-Adhere смешанного типа, полученных на этапе 3B примера 12, где нагружаемый образец представляет собой вещество, полученное на этапе 3A примера 12. Процентное содержание правильно свернутого этанерцепта обозначено на вертикальной оси, и применение солевого градиента в течение времени представлено на горизонтальной оси. Элюируемая фракция, полученная на начальной стадии в градиенте, содержит 100% правильно свернутого этанерцепта.

На фиг. 13 (профиль элюирования объединенной фракции Capto-MMC из Capto-Adhere) представлен SDS и нативный PAGE элюируемых образцов. Элюирование проводили в градиенте аргинина при рН 7,5, где: дорожка 0 - стандарт; дорожка 1 - нагрузка; дорожка 2 и 3 - FT; дорожка 4 - дорожка 7 - элюируемые фракции; дорожка 8 - 1 М аргинин.

Фиг. 14 представляет собой хроматограмму элюирования объединенной фракции Capto-MMC из Capto-Adhere. Элюирование проводили градиентом NaCl при рН 7,5.

На фиг. 15А (профиль элюирования объединенной фракции Capto-MMC из Capto-Adhere) представлена хроматограмма элюирования градиентом соли/аргинина при рН 7,5.

Фиг. 15В (профиль элюирования объединенной фракции Capto-MMC из Capto-Adhere) SDS-PAGE и нативный PAGE элюируемых образцов, где дорожка 0 - стандарт; дорожка 1 - нагрузка; дорожка 2 - FT; дорожка 3 - дорожка 6 - элюируемые фракции; дорожка 7 - 1 М аргинин.

Фиг. 16 представляет собой хроматограмму HIC, соответствующую веществу этанерцепта, полученного в примере 12, на которой график, на котором по существу отсутствует второй меньший пик (неправильно свернутое вещество), соответствует веществу, полученному по настоящему изобретению (пример 12), и где видно, что на дополнительной кривой на фигуре, соответствующей коммерчески доступному этанерцепту, приведенной для сравнения, присутствует второй минорный пик, соответствующий неправильно свернутому и/или агрегированному веществу.

Подробное описание изобретения

Изобретение основано на открытии в настоящем описании, что смолы смешанного типа, в которых используются принципы ионного обмена и гидрофобного взаимодействия, например, Capto™ MMC и Capto™ Adhere, можно использовать для связывания, а затем для предпочтительного (т.е. избирательного) элюирования правильно свернутых против неправильно свернутых конформаций данного белкового аналита. Обе из указанных выше смол смешанного типа содержат лиганды с группами (т.е. химическими группами), которые обеспечивают два различных типа притяжения и связывания белкового аналита, а именно притяжение в результате ионного обмена и гидрофобное взаимодействие.

Определения

Используемые в этом описании термины, как правило, имеют свое общепринятое значение в данной области в контексте изобретения, и в конкретном контексте, в котором используют каждый термин. Определенные термины, которые используют для описания изобретения, описаны ниже или где-либо еще в описании для обеспечения дополнительного руководства для специалиста в отношении описания изобретения. Приведены синонимы для определенных терминов. Перечисление одного или более синонимов не исключает использование других синонимов. Использование примеров где-либо еще в этом описании, включая примеры любого из терминов, описываемых в настоящем описании, является только иллюстративным и не ограничивает каким-либо образом объем и значение изобретения или любого иллюстративного термина. Изобретение не ограничено различными вариантами осуществления, приведенными в этом описании.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, как общепринято понимает специалист в данной области, к которой принадлежит настоящее изобретение. В случае противоречия настоящий документ, включая определения, является контрольным.

Около, приблизительно или примерно, как правило, означают в пределах 20%, в пределах 10%, в пределах 5, 4, 3, 2 или 1% от данного значения или диапазона. Приведенные численные значения являются приблизительными, что означает, что термин около, приблизительно или примерно может подразумеваться, если прямо не указано.

Как используют в настоящем описании, термин этанерцепт означает активный ингредиент, содержащийся в коммерческом составе Enbrel®, а именно, гомодимера слитого полипептида, состоящего из внеклеточного связывающегося с лигандом участка рецептора фактора некроза опухоли человека (TNFR) 75 килодальтон (р75), связанного с Fc-участком [фрагментом, кристаллизуемым] иммуноглобулина G человека (IgG1).

Этанерцепт представляет собой гомодимер, в котором две цепи TNFR 75 килодальтон : молекула Fc, как описано выше, соединены дисульфидной связью в шарнирной области Fc-участка. Этанерцепт состоит из 934 аминокислот и имеет кажущуюся молекулярную массу приблизительно 150 килодальтон, и его Fc-компонент содержит константный тяжелый домен 2 (СН2), константный тяжелый домен 3 (CH3) и шарнирную область, но не константный тяжелый домен 1 (CH1) IgG1 человека. Для целей настоящей заявки термин этанерцепт также может включать этанерцепт с незначительными модификациями в аминокислотной структуре (включая делеции, добавления и/или замены аминокислот), которые не ока

- 9 031324 зывают существенного влияния на функцию полипептида, как описано выше. Также следует понимать, что термин этанерцепт включает белки, для которых предполагают или считают, что они являются так называемыми биоэквивалентными или улучшенными с биологической точки зрения вариантами этанерцепта.

Как используют в настоящем описании, термин правильно свернутый этанерцепт предназначен означать свернутую конформацию гомодимера этанерцепта (как определено выше) с биологической активностью для ингибирования TNF и конформацией, которые являются аналогичными или, по существу, аналогичными конформации и биологической активности активного ингредиента в Enbrel®.

Как используют в настоящем описании, термин неправильно свернутый этанерцепт предназначен включать: (i) гомодимерный белок, содержащий такую же или по существу такую же аминокислотную последовательность как этанерцепт (как определено выше), но обладающий конформацией, отличающейся от конформации правильно свернутого этанерцепта, где указанная отличная конформация способствует тому, что у белка отсутствует или по существу отсутствует биологическая активность как ингибитора TNF, и/или (ii) агрегат, в котором два или более гомодимера правильно и/или неправильно свернутого этанерцепта образовали ассоциацию (т.е. агрегировали или образовали кластеры) таким образом, что образуют молекулы с большей молекулярной массой, чем правильно свернутый этанерцепт, и/или (iii) смесь (i) и (ii); и/или (iv) композиции агрегированного, т.е. образовавшего кластеры белка, содержащие такую же или по существу такую же последовательность или ее участки, как правильно свернутый этанерцепт, но для которых демонстрируют уменьшенное положение элюирования (вследствие более высокой гидрофобности) на колонке HIC по сравнению с правильно свернутым этанерцептом.

Термин лечение относится к любому введению или применению лекарственных средств для заболевания у млекопитающего и включает ингибирование заболевания, купирование его развития, ослабление заболевания (например, путем вызывания регрессии или восстановления или репарации потери, отсутствия или дефектной функции) или стимуляцию неэффективного процесса. Термин включает получение желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта и включает любое лечение патологического состояния или нарушения у млекопитающего. Эффект может являться профилактическим в отношении полного или частичного предотвращения нарушения или его симптома и/или может являться терапевтическим в отношении частичного или полного излечения от нарушения и/или побочного действия, вызываемого нарушением. Он включает (1) предотвращение возникновения или рецидива нарушения у индивидуума, который может являться предрасположенным к нарушению, но еще не проявляет симптомов, (2) ингибирование нарушения, такое как купирование его развития, (3) блокирование или прекращение нарушения или по меньшей мере связанных с ним симптомов, таким образом, что хозяин больше не страдает нарушением или его симптомами, такое как вызывание регрессии нарушения или его симптомов, например, путем восстановления или репарации потери, отсутствия или дефектной функции, или стимуляции неэффективного процесса, или (4) ослабление, облегчение или улучшение состояния нарушения или связанных с ним симптомов, где улучшение состояния используют в широком смысле для обозначения по меньшей мере уменьшения величины параметра, такого как воспаление, боль и/или размер опухоли.

Термин фармацевтически приемлемый носитель относится к нетоксическому твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему веществу, составу вспомогательного средства или эксципиенту любого общепринятого типа. Фармацевтически приемлемый носитель является нетоксичным для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и является совместимым с другими ингредиентами состава.

Термин композиция или состав относится к смеси, которая, как правило, содержит носитель, такой как фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, который является общепринятым в данной области и который является подходящим для введения индивидууму для терапевтических, диагностических или профилактических целей. Она может содержать культуру клеток, в которой полипептид или полинуклеотид содержится в клетках или в среде для культивирования. Например, композиции для перорального введения могут образовывать растворы, суспензии, таблетки, пилюли, капсулы, составы с длительным высвобождением, ополаскиватели для полости рта или порошки.

Настоящее изобретение является подходящим для разделения правильно свернутых и неправильно свернутых конформаций данного белка. Примеры белков, которые можно подвергать обработке в соответствии со способами по изобретению, включают любые содержащие дисульфид белки, для которых необходим рефолдинг, такие как G-CSF, IGF, инсулин, гормон роста и т.д., а также конструируемые антитела, например одноцепочечные фрагменты вариабельного домена антитела.

Этанерцепт, подходящий для очистки способом хроматографии смешанного типа по настоящему изобретению, можно получать посредством живых клеток-хозяев, которые экспрессирует этанерцепт, таких как гибридомы в случае антител, или клеток-хозяев, которых генетически конструировали для продукции полипептида, в случае слитых полипептидов или антител. Способы генетического конструирования клеток для продукции полипептидов хорошо известны в данной области. См., например, Ausubel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York). Такие способы включают введение нуклеиновых кислот, которые кодируют и обеспечивают экспрессию полипептида в живых клет

- 10 031324 ках-хозяевах. Эти клетки-хозяева могут представлять собой бактериальные клетки, грибковые клетки или предпочтительно клетки животных, растущие в культуре. Бактериальные клетки-хозяева включают, но не ограничиваются ими, клетки Escherichia coli. Примеры подходящих штаммов Е. coli включают НВ101, DH5.alpha, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539 и любой штамм Е. coli, который не может расщеплять чужеродную ДНК. Грибковые клетки-хозяева, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, клетки Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris и Aspergillus. Некоторые примеры линий клеток животных, которые можно использовать, представляют собой СНО, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3 и W138. Новые линии клеток животных можно устанавливать способами, хорошо известными специалистам в данной области (например, трансформацией, вирусной инфекцией и/или отбором). Необязательно клетки-хозяева могут секретировать этанерцепт в среду.

Перед хроматографическим разделением смешанного типа правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта можно проводить очистку экспрессируемого этанерцепта любым стандартным способом. В случае, когда этанерцепт продуцируется внутриклеточно, удаляют дебрис из макрочастиц, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. В случае, когда этанерцепт секретируется в среду, супернатанты из таких экспрессирующих систем можно сначала концентрировать с использованием стандартных фильтров для концентрирования полипептидов. Также можно добавлять ингибиторы протеаз для ингибирования протеолиза и можно вводить антибиотики для предотвращения роста микроорганизмов.

Этанерцепт можно очищать с использованием, например, хроматографии на гидроксиапатите, электрофореза в геле, диализа и аффинной хроматографии, и любой комбинации известных или тех, которые будут открыты, способов очистки, включая, но не ограничиваясь ими, хроматографию с белком А, фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовую ВЭЖХ, хроматографию на диоксиде кремния, хроматографию на гепарине SEPHAROSET®, хроматографию с анионообменной или катионообменной смолой (такой как колонка с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE и осаждение сульфатом аммония.

В очень общих терминах, как применяют к этанерцепту (но не ограничиваются им), изобретение относится к способу разделения белка, включающему этапы: (а) введения раствора, содержащего смесь белков на основе этанерцепта, содержащую правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт, в смолу для хроматографии смешанного типа, функционализированную ионообменными группами, а также группами гидрофобного взаимодействия в условиях, способных обеспечивать связывание правильно и неправильно свернутого этанерцепта со смолой, а затем (b) промывание смолы элюирующей средой, способной элюировать правильно свернутый этанерцепт из смолы, таким образом, что полученный элюат имеет более высокое соотношение правильно свернутого этанерцепта по сравнению с раствором белка, вводимым на этапе (а).

Необязательно, способ может дополнительно включать предварительные этапы экспрессии этанерцепта в культуре клеток млекопитающего, такой как культура клеток СНО, а затем очистку продукта экспрессии с использованием, например, хроматографии с белком А, после чего полученный продукт белка А становится раствором белка, используемым на этапе (а) по настоящему изобретению. Следует понимать, что способ по изобретению можно практически осуществлять таким образом, что этапы экспрессии у млекопитающего и белка А, в результате которых получают исходный раствор для применения на этапе (а) по настоящему изобретению, может проводить первый субъект на данном месте производства, тогда как способ разделения смешанного типа по настоящему изобретению может проводить тот же самый или другой субъект на том же самом или другом месте производства.

Условия для этапа (а) - связывание со смолой смешанного типа САРТО ММС.

На этапе (а) по изобретению раствор белка, содержащий правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт, следует вводить в смолу смешанного типа САРТО ММС для связывания с ней при рН приблизительно от 4 приблизительно до 8 и предпочтительно при рН приблизительно от 4 приблизительно до 6. Альтернативно, в случае, когда используют смолу смешанного типа САРТО ADHERE раствор белка, содержащий правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт, на этапе (а) следует вводить в смолу смешанного типа САРТО ADHERE для связывания с ней при рН приблизительно от 6 приблизительно до 8,5 и предпочтительно при рН приблизительно от 7 приблизительно до 8.

Условия для этапа (b) - элюирование из смолы смешанного типа.

На этапе (b) элюирующая среда содержит соль в определенной концентрации, и ее вносят в колонку определенным способом, эффективным для предпочтительного элюирования правильно свернутого белка этанерцепта против неправильно свернутого этанерцепта. При этом в общем случае элюат должен содержать более высокое отношение правильно свернутого к неправильно свернутому этанерцепту, раствор соли и способ внесения его в смолу предпочтительно выбирают таким образом, чтобы количество правильно свернутого этанерцепта значительно превышало количество неправильно свернутого этанерцепта в элюате после этапа (b). Первые элюируемые фракции могут содержать по существу 100% правильно свернутого белка. Этап элюирования раствором соли можно проводить посредством изменения (повышения) молярной концентрации раствора соли, такого как посредством градиента. Градиент можно применять постепенно, но предпочтительно, чтобы он являлся непрерывным и линейным. В предпочти

- 11 031324 тельном варианте осуществления раствор соли содержит хлорид натрия (NaCl). Линейный градиент NaCl может составлять приблизительно от 0 приблизительно до 1 М.

В альтернативном варианте осуществления раствор соли может содержать сульфат натрия (Na₂SO4). Раствор Na₂SO₄ также можно применять на этапе ступенчатого или линейного градиента, предпочтительно линейного и наиболее предпочтительно от градиента концентрации приблизительно от 0 приблизительно до 1 моль.

Этанерцепт можно получать культивированием в клетках СНО.

В предпочтительном варианте осуществления раствор соли содержит NaCl.

Следующие ниже способы проводили для экспрессии, очистки продуктов экспрессии и анализа содержащих этанерцепт элюатов, полученных способом хроматографии смешанного типа по настоящему изобретению.

Экспрессия этанерцепта

Этанерцепт экспрессируют в кондиционированных средах (СМ) рекомбинантных клеток СНО, трансфицированных геном, кодирующим внеклеточный домен TNFR человека, слитый с Fc человека на С-конце. Примеры в данной области экспрессии этанерцепта в системах млекопитающих можно найти в следующих ниже патентах США, включенных в настоящее описание посредством ссылки: RE 36755, патент США № 5605690, ЕР 464533, ЕР 417563, патент США № 8063182 и патент США № 7294481. Хроматография с белком А. Полученную выше СМ подвергают обработке с использованием колонки с белком А с использованием колонки 1 мл HiTrap rProtein А (доступной от GE Healthcare) и уравновешенной раствором 10 мМ фосфата, 0,1 М NaCl, pH 7,0. После промывания колонки раствором 1 М аргинин-гидрохлорида (аргинин), 0,1 М цитрата, рН 6,0, связанные белки поэтапно элюируют раствором с рН 4,2, 3,7 и 3,0, содержащим 1 М аргинина и 0,1 М цитрата. Альтернативно, колонку можно обрабатывать без аргинина при понижающемся рН 0,1 М цитратом. В отсутствие аргинина большую часть этанерцепта элюировали при рН 3,85 с получением элюата, который содержит загрязнения, а также неправильно свернутый этанерцепт, фрагменты этанерцепта, агрегаты этанерцепта и т.д., которые элюируются ниже этого рН. Затем элюаты белка А подвергали действию Capto™ MMC или Capto™ Adhere в колонке HiTrap (доступной от GE Healthcare), как описано ниже в примерах.

Анализ элюата белка А

Анализ полученного выше элюата белка А указан на фиг. 2А и 2В. На фиг. 2А представлен профиль элюирования из белка А буферами с низким рН, содержащими 1 М аргинина. Большой пик оптической плотности в УФ-области наблюдали при рН 6,0 (пик, обозначаемый как 6,0), и он не содержал полосы (фиг. 2В, дорожка 4), соответствующей коммерческому этанерцепту, как анализировали нативным PAGE (дорожка 1): следует отметить, что этанерцепт не проходил через колонку с белком А (дорожки сравнения 2 и 3). Несмотря на то, что полосы белка не наблюдали при рН 6,0 (дорожка 4), наблюдаемая значительная оптическая плотность в УФ-области свидетельствует об элюировании пигментов. После достижения фоновой оптической плотности (фиг. 2А) колонку затем элюировали 0,1 М аргинином, 0,1 М цитратом, рН 4,2, что приводило к четкому пику элюирования (фиг. 2А, обозначаемому 4,2). Анализ нативного PAGE этого пика демонстрировал яркую полосу этанерцепта наряду со смазанными полосами низкой подвижности (дорожка 5). Анализ HIC элюируемого белка демонстрировал 2 пика, первый пик, соответствующий основному пику коммерческого этанерцепта, и второй пик, соответствующий минорным соединениям, также присутствующим в коммерческом этанерцепте. Хотя природа второго пика остается неясной, по-видимому, он относится к неправильно свернутым молекулам этанерцепта, т.к. он связывался с белком А и, таким образом, должен содержать домен Fc. Оставшиеся связанные белки элюировали при рН 3,7, а затем 3,0, в обоих случаях в присутствии 1 М аргинина. Эти растворители с низким рН приводили к элюированию малых пиков, как представлено на фиг. 2А (3,7 и 3,0). Пик рН 3,7 содержал небольшое количество этанерцепта (дорожка 6), тогда как пик рН 3,0 содержал в основном молекулы с низкой подвижностью, соответствующие неправильно упакованным молекулам, а также молекулам, которые также могут находиться в агрегированном состоянии (дорожка 7). Аналогичный профиль элюирования наблюдали в отсутствие аргинина. Более низкий рН, например, рН 3,85, являлся необходимым для элюирования этанерцепта, и дальнейшее снижение рН приводило к элюированию молекул с низкой подвижностью. Тот факт, что эти молекулы с низкой подвижностью связывались с белком А, означает, что они также являлись Fc-слитыми белками. Вследствие того, что эти соединения элюировались при более низком рН по сравнению с этанерцептом, они связывались с белком А прочнее. Эти анализы подтверждают, что экспрессия этанерцепта в рекомбинантных клетках СНО приводит к продукции нативного (правильно свернутого) этанерцепта, соответствующего правильно свернутым молекулам, и молекулам с низкой подвижностью, соответствующих неправильно свернутым молекулам, как анализировали аналитической HIC. Вследствие того, что неправильно свернутая молекула элюировались позже в HIC, она должна являться более гидрофобной, чем нативный этанерцепт. В зависимости от клонов СНО и условий ферментирования, количество правильно свернутых молекул варьировало от 40 до 60 мас.% элюата белка А. В примерах ниже оценивают производительность хроматографии смешанного типа для разделения свернутых молекул от неправильно свернутых молекул.

- 12 031324

Аналитические способы

Элюируемые фракции из белка А, композиций Capto™ MMC и Capto™ Adhere можно анализировать с использованием ряда техник, хорошо известных в данной области, таких как эксклюзионная хроматография (SEC), SEC в денатурирующих условиях (dSEC), хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC), электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и нативный PAGE. Например, техники эксклюзионной хроматографии описаны у Hawe et al., Pharm. Res., 2011, 28: 2302 и/или van Marrschalkerweerd et al., Eur. J. Pharm. Biopharm., 2011, 78: 213.

SDS-PAGE

Например, элюируемые фракции из белка A, Capto™ MMC и Capto™ Adhere можно анализировать электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия или нативным электрофорезом в полиакриламидном геле (SDS-PAGE или нативный PAGE, соответственно). SDS-PAGE и нативный PAGE проводили с использованием 6% Tris-глицин геля (доступный от Life Technology). SDSPAGE можно проводить не в восстановительных условиях, таким образом, чтобы можно было наблюдать связанные дисульфидными связями агрегаты.

Эксклюзионная хроматография

Фракции элюатов, полученные способами хроматографии смешанного типа по настоящему изобретению, можно анализировать хорошо известным способом эксклюзионной хроматографии (SEC), способом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), в которых аналиты разделяют по размеру (см. Rogner, M. (2000). Size Exclusion Chromatography. Protein Liquid Chromatography. M. Kastner. Amsterdam, Elsevier. 61: 89-145). Только в качестве примера, а не ограничения каким-либо образом, можно получать буфер подвижной фазы, содержащий 50 мМ моногидрата одноосновного фосфата натрия и 150 мМ аргинина. рН доводят до 6,5 с использованием 1 М HCl. Разделения можно проводить с использованием предколонки Tosoh TSK-Gel SWx1 6 мм х 4 см (каталожный номер 8543), последовательно присоединенной к Tosoh TSK-Gel G4000 SWx 1 7,8 мм х 30 см (каталожный номер 8542). Для проведения разделения колонки доводят до комнатной температуры (23°С) и уравновешивают подвижной фазой при скорости потока 0,5 мл/мин. 5 мкл 50 мг/мл раствора, содержащего этанерцепт, впрыскивают в колонку с использованием автоматического дозатора. Разделение можно проводить в течение приблизительно 30 мин при скорости потока приблизительно 0,5 мл/мин. За элюентом колонки наблюдали при длине волны 280 нм в течение этого периода времени. Интегрирование можно проводить с использованием программного обеспечения Chromeleon (Dionex). Перед интегрированием хроматограмму SEC для буфера, не содержащего этанерцепт, вычитают из всех хроматограмм. Все интегрирование можно проводить для времени удерживания в диапазоне от 12 до 26 мин. Для определения пика используют несколько параметров. Минимальная площадь для детектируемого пика указана для 0,05 милли-единиц оптической плотности * мин. Двумерный анализ чувствительности для детекции пика указан для 0,01 милли-единиц оптической плотности и 75 с. Плечи пика добавляют в ручном режиме с использованием средства ручного интегрирования. Все детектируемые пики корректировали вручную в два этапа. Во-первых, фоновые уровни пика (нижнюю границу пика) доводили до горизонтального состояния. Во-вторых, вертикальные положения фоновых уровней пика приводили к вертикальным положениям фоновой хроматограммы. Фоновое значение хроматограммы определяют как сигнал в отсутствие аналита. Сигнал в отсутствие аналита определяют как оптическую плотность в милли-единицах оптической плотности при времени удерживания 12 мин.

Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC). Анализ на основе хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) можно проводить с бутил-Sepharose® с использованием градиента сульфата аммония от 1,8 до 0 М. Хроматографию HIC также можно проводить способом, описанным в патенте США 7294481 (см. колонку 19, строки 49-55). Также можно привести ссылку на патент США № 7157557; Chen J., Tetrault J., Ley A., (2008) J. Chromatogr A., 1177, 272-81; Gagnon P. and Grund E., (1996) BioPharm., 9, 54-64 и Lu Y., Williamson В., and Gillespie R., Recent advancement in application of hydrophobic interaction chromatography for aggregate removal in industrial purification process. Curr. Pharm. Biotech.

Касательно анализа HIC препаратов этанерцепта, полученных в соответствии со способом хроматографии смешанного типа по настоящему изобретению, следует отметить, что фигура 4 в патенте США 7294481, включенная в настоящее описание посредством ссылки, содержит хроматограмму HIC препарата этанерцепта, на которой представлены три пика, самый большой из которых (определяемый как пик 2 в патенте '481) описан как соответствующий слитому белку правильно свернутого этанерцепта; тогда как патентообладатель постулирует, что меньший пик (определяемый как пик 3 в патенте '481) содержит рандомизированный (т.е. в настоящем обсуждении полагают, что это является синонимом неправильно свернутого) этанерцепт, а также агрегированный этанерцепт (см. патент США 7294481 колонку 22, строки 13-66 и фиг. 5 в нем). Значительное преимущество настоящего изобретения заключается в возможности предоставлять содержащий этанерцепт неожиданно высокой степени чистоты препарат с привлекательными с коммерческой точки зрения выходами продукта, в которых пик 3 хроматограммы HIC, как обозначено на фигуре 4 и фигуре 5 патента '481, и как полагают в настоящем описании, содержит неправильно свернутый этанерцепт, можно значительно уменьшать или по существу устранять.

- 13 031324

Изобретение дополнительно относится к фармацевтическим составам этанерцепта, где этанерцепт высокой степени чистоты для применения в таких составах получают способами по настоящему изобретению. Составы по изобретению также могут содержать буферы, модификаторы тоничности, эксципиенты, фармацевтически приемлемые носители и другие общепринятые неактивные ингредиенты фармацевтических композиций. Для простоты они более полно описаны ниже в заявке.

Буферы поддерживают рН а желаемом диапазоне. Подходящие буферы включают гистидин, фосфат калия, цитрат натрия или калия, малеиновую кислоту, ацетат аммония, трис(гидроксиметил)аминометан (трис), различные формы ацетата и диэтаноламина. Концентрация буфера в составе предпочтительно составляет приблизительно от 1 приблизительно до 1 М и более предпочтительно приблизительно от 10 приблизительно до 200 мМ. Буферы хорошо известны в данной области, и их получают известными способами, и они являются доступными от коммерческих поставщиков.

Примеры подходящих буферов представляют собой фосфат, гистидин, цитрат, малеат, тартрат, сукцинат, ацетат, трис(гидроксиметил)аминометан (трис), бикарбонат.

В предпочтительном варианте осуществления буфер представляет собой фосфат натрия.

В предпочтительном варианте осуществления рН фармацевтической композиции находится на физиологических уровнях или близко к ним. Таким образом, предпочтительно рН предоставляемых композиций составляет приблизительно от 5,8 приблизительно до 8,4 и даже более предпочтительно приблизительно от 6,2 приблизительно до 7,4. Специалисту в данной области будет понятно, что рН можно регулировать по мере необходимости для максимального увеличения стабильности и растворимости этанерцепта в конкретном составе. Таким образом, составы этанерцепта при рН вне физиологических диапазонов, еще переносимые пациентом, также входят в объем изобретения.

Модификатор тоничности представляет собой молекулу, которая вносит вклад в осмоляльность раствора. Осмоляльность фармацевтической композиции предпочтительно регулируют для максимального увеличения стабильности активного ингредиента и/или сведения к минимуму дискомфорта у пациента при введении. Как правильно, предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция являлась изотонической с сывороткой, т.е. обладала такой же или аналогичной осмоляльностью, которую получают добавлением модификатора тоничности.

В предпочтительном варианте осуществления осмоляльность предоставляемых составов составляет приблизительно от 180 приблизительно до 420 мОсм. Однако следует понимать, что осмоляльность может быть выше или ниже, как требуется при конкретных условиях.

Примеры модификаторов тоничности, подходящих для модификации осмоляльности, включают, но не ограничиваются ими, аминокислоты (не включая аргинин) (например, цистеин, гистидин и глицин), соли (например, хлорид натрия, хлорид калия и цитрат натрия) и/или сахариды/полиолы (например, сахарозу, глюкозу и маннит).

Предпочтительные модификаторы тоничности представляют собой глицин, аланин, хлорид натрия, хлорид калия и сульфат натрия.

В предпочтительном варианте осуществления концентрация модификатора тоничности в составе составляет предпочтительно приблизительно от 1 приблизительно до 1 М, более предпочтительно приблизительно от 10 приблизительно до 200 мМ. Модификаторы тоничности хорошо известны в данной области, и их получают известными способами, и они являются доступными от коммерческих поставщиков.

К фармацевтической композиции также можно добавлять эксципиенты, также обозначаемые как химические добавки, вспомогательные растворенные вещества или вспомогательные растворители, которые стабилизируют полипептид в растворе (также в сухих или замороженных формах). Эксципиенты хорошо известны в данной области, и их получают известными способами, и они являются доступными от коммерческих поставщиков.

Примеры подходящих эксципиентов включают, но не ограничиваются ими, сахара/полиолы, такие как сахароза, лактоза, глицерин, ксилит, сорбит, маннит, мальтоза, инозитол, трегалоза, глюкоза; полимеры, такие как сывороточный альбумин (бычий сывороточный альбумин (BSA), SA человека или рекомбинантный НА), декстран, поли(виниловый спирт) PVA, гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), полиэтиленимин, желатин, поливинилпирролидон (PVP), гидроксиэтилцеллюлоза (НЕС); неводные растворители, такие как PEG, и глицерин и диметилформамид (DMF); аминокислоты, такие как пролин, Lсерин, натрий глутаминовая кислота, аланин, глицин, гидрохлорид лизина, саркозин и гаммааминомасляная кислота; поверхностно-активные вещества, такие как Tween®-80 (полисорбат 80), Tween®-20 (полисорбат 20), SDS, полисорбат, полоксамеры, и различные эксципиенты, такие как фосфат калия, ацетат натрия, сульфат аммония, сульфат магния, сульфат натрия, триметиламин-Ы-оксид, бетаин, ионы металлов (например, цинк, кальций и магний), CHAPS, монолаурат, 2-О-бета-манноглицерат или любое сочетание указанных выше соединений.

Предпочтительные эксципиенты представляют собой сахарозу, лактозу, глицерин, ксилит, сорбит, маннит, мальтозу, инозитол, трегалозу, глюкозу, бычий сывороточный альбумин (BSA), сывороточный альбумин человека (HSA), рекомбинантный альбумин, декстран, PVA, гидроксипропилметилцеллюлозу

- 14 031324 (НРМС), полиэтиленимин, желатин, поливинилпирролидон (PVP), гидроксиэтилцеллюлозу (НЕС), PEG, этиленгликоль, глицерин, аланин, глицин, лизин гидрохлорид, саркозин, SDS, полисорбат 20, полисорбат 80, полоксамер 188, триметиламин-Ы-оксид, бетаин, ионы цинка, ионы кальция, ионы магния, CHAPS, монолаурат сахарозы и 2-О-бета-манноглицерат.

Концентрация одного или более эксципиентов в составе по изобретению предпочтительно составляет приблизительно от 0,001 до 5 мас.%, более предпочтительно приблизительно от 0,1 до 2 мас.%.

При желании, препарат этанерцепта, полученный по настоящему изобретению, можно использовать в том же составе, в котором в настоящее время поставляют коммерческий энбрел, где такой состав содержит приблизительно от 25 приблизительно до 75 мг/мл состава и дополнительно содержит сахарозу, хлорид натрия, гидрохлорид L-аргинина и фосфат натрия.

Альтернативно, препараты этанерцепта, полученные в соответствии с настоящим изобретением, можно поставлять в фармацевтическом составе, который не содержит аргинин; например в любом из составов не на основе аргинина, как описано у Manning et al. предварительные заявки USSN 61/548518 и 61/669480, зарегистрированные 18 октября 2011 г. и 9 июля 2012 г., соответственно, которые, таким образом, включены посредством ссылки полностью.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения млекопитающего, включающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтических композиций по изобретению млекопитающему, где млекопитающее страдает заболеванием или нарушением, которое можно эффективно лечить этанерцептом.

В предпочтительном варианте осуществления этанерцепт получают от того же вида млекопитающего, как вид, который подлежит лечению композицией.

В предпочтительном варианте осуществления млекопитающее представляет собой человека.

Заболевания или нарушения, которые можно лечить предоставленными композициями, включают, но не ограничиваются ими, ревматоидный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, болезнь Вегенера (гранулематоз), болезнь Крона (или воспалительное заболевание кишечника), хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), гепатит С, эндометриоз, астму, кахексию, псориаз и атопический дерматит. Дополнительные заболевания или нарушения, которые можно лечить композициями по настоящему изобретению, включают заболевания и нарушения, описанные в WO 00/62790, WO 01/62272, патентной заявке США № 2001/0021380 и патенте США 7648702 В2, соответствующие отрывки которых включены в настоящее описание посредством ссылки.

Предоставляемые фармацевтические композиции можно вводить нуждающемуся в лечении индивидууму посредством системной инъекции, такой как внутривенная инъекция, или посредством инъекции или нанесения на соответствующий участок, таким образом, как посредством прямой инъекции или прямого нанесения на участок, в тех случаях, когда участок обнажают при хирургической операции, или посредством местного применения.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу лечения и/или профилактики ревматоидного артрита, который включает введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества одной из предоставляемых композиций этанерцепта.

Терапевтически эффективное количество этанерцепта в предоставляемых композициях зависит от подлежащего лечению состояния, тяжести состояния, предшествующей терапии и истории болезни и реакции пациента на терапевтическое средство. Подходящую дозу можно регулировать в соответствии с решением лечащего врача, таким образом, что ее можно вводить пациенту один раз или в ходе серии введений.

В одном из вариантов осуществления эффективное количество этанерцепта в дозе для взрослых составляет приблизительно 1-500 мг/м² или приблизительно 1-200 мг/м², или приблизительно 1-40 мг/м²или приблизительно 5-25 мг/м².

Альтернативно, можно вводить базовую дозу, количество которой может находиться в диапазоне 2500 мг/доза, 2-100 мг/доза или приблизительно 10-80 мг/доза.

Если дозу необходимо вводить более одного раза в неделю, иллюстративный диапазон доз является таким же, как указанные выше описываемые диапазоны доз или ниже и предпочтительно вводимые два или более раз в неделю в диапазоне доз 25-100 мг/доза.

В другом варианте осуществления приемлемая доза для введения посредством инъекции содержит 80-100 мг/доза или, альтернативно, содержит 80 мг в дозе.

Дозу можно вводить еженедельно, раз в две недели или с интервалом в несколько недель (например, от 2 до 8).

В одном из вариантов осуществления этанерцепт вводят от 25 до 75 мг/мл посредством однократной подкожной (п/к) инъекции.

В некоторых случаях улучшение состояния пациента получают посредством введения дозы приблизительно до 100 мг фармацевтической композиции от одного до трех раз в неделю в течение периода по меньшей мере трех недель. Для индукции желаемой степени улучшения необходимым может являться лечение в течение более длительных периодов времени. Для инкурабельных хронических состояний схему лечения можно проводить в течение неопределенного периода времени. Для пациентов детского

- 15 031324 возраста (в возрасте 4-17 лет) подходящая схема лечения может включать введение дозы от 0,4 до 5 мг/кг этанерцепта один или более раз в неделю.

В другом варианте осуществления фармацевтические составы по изобретению можно получать в нефасованном составе и сами по себе, компоненты фармацевтической композиции регулируют так, чтобы они составляли большее количество, чем необходимо для введения, и разбавляют соответствующим образом перед введением.

Фармацевтические композиции можно вводить в качестве единственного терапевтического средства или в комбинации с дополнительными видами терапии по мере необходимости. Таким образом, в одном из вариантов осуществления предоставляемые способы лечения и/или профилактики используют в сочетании с введением терапевтически эффективного количества другого активного средства. Другое активное средство можно вводить перед, во время или после введения фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Другое активное средство можно вводить в виде части предоставляемых композиций или, альтернативно, в виде отдельного состава.

Введение предоставляемых фармацевтических композиций можно проводить различными способами, включая парентеральное, пероральное, буккальное, назальное, ректальное, интраперитонеальное, внутрикожное, чрескожное, подкожное, внутривенное, внутриартериальное, внутрисердечное, внутрижелудочковое, внутричерепное, внутритрахеальное, интратекальное введение, внутримышечную инъекцию, инъекцию в стекловидное тело и местное применение.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению являются особенно пригодными для парентерального введения, т.е. подкожно, внутримышечно, внутривенно, интраперитонеально, интрацероброспинально, внутрисуставно, интрасиновиально и/или интратекально. Парентеральное введение можно проводить посредством болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Фармацевтические композиции для инъекции могут находиться в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с добавленным консервантом. Кроме того, были разработаны различные современные подходы доставки лекарственного средства, и фармацевтические композиции по настоящему изобретению являются подходящими для введения этими новыми способами, например, Inject-ease®, Genject®, ручки-шприцы, такие как GenPen®, и безыгольные средства, такие как MediJector® и BioJector®. Настоящую фармацевтическую композицию также можно адаптировать для способов введения, которые еще будут открыты. Также см. Langer, 1990, Science, 249:1527-1533.

Предоставляемые фармацевтические композиции также можно формулировать в виде депопрепаратов. Такие составы длительного действия можно вводить путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или посредством внутримышечной инъекции. Таким образом, например, составы можно модифицировать подходящими полимерными или гидрофобными веществами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или в виде умеренно растворимых производных, например, в виде умеренно растворимой соли.

При желании фармацевтические композиции можно предоставлять во флаконах, упаковке или дозирующем устройстве, которое может содержать одну или более стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. В одном из вариантов осуществления дозирующее устройство может содержать шприц, содержащий однократную дозу жидкого состава, готового для инъекции. К шприцу могут прилагаться инструкции по введению.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору или контейнеру, который содержит водную фармацевтическую композицию по изобретению. Концентрация полипептида в водной фармацевтической композиции может изменяться в очень широком диапазоне, но, как правило, в диапазоне приблизительно от 0,05 приблизительно до 20000 мкг на миллилитр (мкг/мл) водного состава. К набору также могут прилагаться инструкции по использованию.

Настоящее изобретение более конкретно описано в следующих ниже примерах, которые предназначены только как иллюстративные, т.к. многие их модификации и варианты будут понятны специалистам в данной области. В приложении А предоставлены дополнительные репрезентативные варианты осуществления настоящего изобретения.

Пример 1. Очистка смешанного типа Capto™ ММС с использованием элюирования NaCl

В этом примере элюат белка А, полученный как описано выше, подвергают хроматографии на Capto™ ММС. Колонку Capto™ ММС уравновешивали раствором 5 мМ цитрата, рН 4,5. Соответствующее разведение элюата белка А (например, разведение от 3 до 6 раз в зависимости от элюирующего буфера на этапе белка А) 5 мМ цитрата приводит к полному связыванию на колонке. Как было показано в анализе SDS-PAGE нагружаемый образец (рН 4,2, элюат белка А) является очень гетерогенным, и не наблюдают протекание белка через колонку Capto™ ММС. Затем связанные белки элюируют раствором 0,15 М NaCl в 10 мМ фосфата, рН 7,5, что приводит к одновременному изменению рН (от 4,5 до 7,5) и концентрации NaCl (от 0 до 0,15 М). В анализе элюата наблюдают четкий пик элюирования, содержащий правильно свернутый этанерцепт. Однако выход составлял приблизительно 40-50%. После этапа элюирования, как только что описано, смолу, содержащую оставшееся связанное белковое вещество, приводят в контакт с растворами 0,3 М NaCl и 1 М аргинина в 10 мМ фосфате, рН 7,5, что приводит к элюировани

- 16 031324 ям, содержащим в основном неправильно свернутые молекулы, а также связанные дисульфидными связами агрегаты. Этот пример демонстрирует, что Capto™ ММС является эффективной для разделения неправильно свернутых молекул от правильно свернутых молекул. Тот факт, что неправильно свернутые молекулы элюируются при более высокой концентрации солей (0,3 М в сравнении с 0,1 М) означает, что они обладают более сильным электростатическим взаимодействием с колонкой. Кроме того, 1 М аргинин дополнительно увеличивает элюирование неправильно свернутых, а также агрегированных белков, свидетельствуя о том, что эти белки являются связанными с Capto™ MMC не только посредством электростатического взаимодействия, но также гидрофобного взаимодействия, и что аргинин усиливает распад электростатических и гидрофобных взаимодействий. Анализ фракций элюата, полученных в этом примере, представлен на фигурах 3A и 3B.

Пример 2. Очистка смешанного типа Capto™ MMC с использованием NaCl

Смола, уравновешенная до рН 7,5

В указанном выше примере раствор белка, содержащий правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт, сначала приводили в контакт со смолой CAPTO MMC при рН 4,5. В этом примере наблюдают аналогичное элюирование, как элюирование, наблюдаемое в примере 1, когда колонку Capto™ MMC сначала уравновешивают раствором 10 мМ фосфата, рН 7,5, а затем элюируют NaCl с последующим элюированием аргинина. В частности, этанерцепт не элюируется при уравновешивании при таком рН. Этот результат является неожиданным, т.к. этанерцепт является отрицательно заряженным при рН 7,5; pI этанерцепта находится в диапазоне от 4,9 до 5,4 вследствие сильного гликозилирования. Таким образом, при рН 4,5 или ниже этанерцепт является положительно заряженным и, таким образом, должен связываться с отрицательно заряженными лигандами Capto™ MMC, при этом гидрофобное взаимодействие может способствовать связыванию. При рН 7,5 отрицательно заряженный этанерцепт должен диссоциировать с отрицательно заряженной Capto™ MMC, но обнаружено, что этого не происходит. Это можно объяснить гидрофобным взаимодействием между этанерцептом и Capto™ MMC, подавляющим электростатическое отталкивание между отрицательно заряженными колонкой и этанерцептом. Альтернативно, Capto™ MMC может удерживать связанный белок посредством связывания с локальными положительными зарядами на молекуле белка (pI молекулы белка составляет ~8,1).

Пример 3. Очистка смешанного типа Capto™ MMC с использованием градиента NaCl для элюирования

В этом примере эффективное элюирование проводят с использованием градиента концентрации NaCl. В частности, после промывания колонки раствором 10 мМ фосфата, рН 7,5, связанные белки элюировали с использованием линейного градиента соли от 0 до 0,5 М. Нагружаемый образец (рН 4,2 элюат белка А) является в значительной степени гетерогенным (содержащим правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт), как и в предшествующем случае, и связанные белки элюируют при увеличивающейся ионной силе градиента NaCl. Через 180 мин градиент останавливали, а затем приводили концентрацию солей к 0,5 М, что вызывало незначительное увеличение элюирования белка. Как определяли последующими анализами, фракции с низким содержанием солей содержат больше правильно свернутого этанерцепта, а фракции с более высоким содержанием солей были обогащены молекулами с низкой подвижностью (неправильно свернутыми и агрегированными). Наконец, оставшиеся белки элюируют раствором 1 М аргинина, 10 мМ фосфата, рН 7,5. Эта фракция не содержит этанерцепта, а только молекулы с низкой подвижностью (неправильно свернутые/агрегированные).

Использование элюирования градиентом NaCl Capto™ MMC на различных элюатах белка А в сочетании с предварительным уравновешиванием смолы приводит к более чистому элюату по отношению к правильно свернутому этанерцепту. При низких концентрациях NaCl в элюирующей среде элюируемые образцы обогащены свернутым этанерцептом. Неправильно свернутые молекулы постепенно увеличиваются в элюате по мере применения описанного выше градиента соли к смоле. После проведения солевого градиента смолу приводят в контакт с 1 М раствора аргинина и обнаружено, что полученная из нее фракция элюата содержит неправильно свернутые молекулы (которые включают не только неправильно свернутые, а также агрегированные молекулы), как видно в последующем анализе SDS-PAGE. Предполагают, что некоторые из молекул с низкой подвижностью представляют собой неправильно свернутый (но не агрегированный) этанерцепт на SDS-PAGE, свидетельствуя о том, что часть неправильно свернутых молекул мигрирует как неправильно свернутый гомодимер этанерцепта с более низкой подвижностью на нативном PAGE по сравнению с правильно свернутым гомодимером этанерцепта. Анализ фракций элюатов, полученных в этом примере, предоставлен на фигурах 4А, 4В и 4С.

Пример 4. Очистка смешанного типа Capto™ MMC с использованием градиента Na₂SO₄ для элюирования

В этом примере используют градиент Na₂SO₄ вместо NaCl в качестве градиента соли для элюирования правильно свернутого этанерцепта из смолы смешанного типа. Несмотря на то, что NaCl в основном используют исключительно для элюирования белков в IEC, общеизвестно, что различные соли обладают различными степенями действия высаливания (осаждения белка). NaCl представляет собой промежуточное соединение между всаливающими солями, такими как MgCl₂, и высаливающими солями, такими как

- 17 031324

Na₂SO₄. NaCl может являться эффективным для ослабления электростатического взаимодействия между этанерцептом и Capto™ MMC, но может являться нейтральным для ослабления гидрофобного взаимодействия. В настоящем описании полагают, что Na₂SO₄ также должен являться эффективным для ослабления электростатического взаимодействия, но должен усиливать гидрофобное взаимодействие, поскольку известно, что он является сильной высаливающей солью. Таким образом, если молекулы с низкой подвижностью связаны с колонкой посредством гидрофобного взаимодействия, как указано выше, Na₂SO₄ может подавлять их элюирование. Это тестируют посредством элюирования раствора белка, содержащего правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт, в градиенте Na₂SO₄ от 0 до 0,4 М после уравновешивания рН колонки со смолой САРТО ММС раствором 10 мМ фосфата, рН 7,5. После проведения элюирования белков в градиенте Na₂SO₄ колонку промывают раствором 1 М аргинина, рН 7,5. На фиг. 5А представлена хроматограмма элюирования, тогда как на фиг. 5В представлены SDSPAGE и нативный PAGE элюируемых фракций. Относительно яркую полосу правильно свернутого этанерцепта наблюдают во фракции с низким содержанием Na₂SO₄ (дорожки 6 и 7 фиг. 5В), и чистота этих фракций является больше, чем при внесении (дорожка 1). Более высокие концентрации Na₂SO₄ приводят к элюированию молекул с низкой подвижностью на нативном PAGE (дорожки 8 и 9 фиг. 5В). Конечное элюирование 1 М аргинином при рН 7,5 приводит к элюированию молекул с низкой подвижностью (неправильно свернутых/агрегированных). По-видимому, в этой фракции присутствует некоторое количество этанерцепта (дорожка 10 фиг. 5В), свидетельствуя о том, что Na₂SO₄ может также подавлять элюирование нативного этанерцепта. Можно сделать вывод, что Na₂SO₄ является в равной степени, если не более эффективным при разделении свернутых молекул от неправильно свернутых молекул, несмотря на то, что он может вызывать удерживание нативного этанерцепта (дорожка 10).

Пример 5. Очистка смешанного типа Capto™ ММС с использованием элюирования градиентом NaCl и рН

В предшествующих примерах не наблюдают элюирование белков во время этапа уравновешивания рН, т.е. изменения рН от 4,5 (5 мМ цитрата) до 7,5 (10 мМ фосфата). Однако в случае, когда количество нагружаемого белка увеличивают до более 10 мг на 1 мл колонки, ситуация изменяется. Во время изменения рН происходит повышенное элюирование белков при высокой нагрузке, хотя причина этого наблюдения не ясна. Чистота такого элюируемого образца больше, чем в нагружаемых образцах, но значительно меньше, чем во фракциях с низким содержанием соли. Например, когда нагружаемый образец (элюат белка А) содержит только 51% правильно свернутых молекул этанерцепта, элюирование, которое происходит во время уравновешивания рН, является только на 65% чистым, больше чем в нагрузке, но значительно меньше, чем во фракциях с низким содержанием соли, при этом элюирования солью в указанных выше примерах могут обеспечивать 96% чистоту в начале градиента соли, как определяют аналитической HIC (фиг. 6). Как отражено на фиг. 6, чистота элюируемых фракций постепенно уменьшается от 96 до 20% при увеличении концентрации соли, что соответствует результату нативного PAGE для Capto™ ММС (фиг. 3B, 4В, 5В). Чистота фракции 1 М аргинина (относительно правильно свернутого этанерцепта) являлась низкой (только 11%), что также соответствует анализу нативного PAGE (см. фиг. 4В, дорожка 9 и фиг. 5В, дорожка 10). Принимая во внимание указанные выше наблюдения, в связи с выполненными открытиями в настоящем описании, постулируют, что эффективным может являться сочетание градиента рН с градиентом соли для устранения потенциальной потери любых правильно свернутых молекул во время уравновешивания рН колонки для большей нагрузки белка. Таким образом, в этом примере 5 ниже градиент рН комбинируют с градиентом соли при проведении определяемого выше этапа (b) настоящего способа. В этом примере возможность того, что небольшие количества правильно свернутого этанерцепта можно нежелательным образом элюировать во время начального уравновешивания рН колонки со смолой смешанного типа, устраняют комбинацией изменения рН с градиентом соли. В частности, связанный белок элюируют одновременно градиентом рН и концентрации NaCl, т.е. колонку проявляют раствором от 5 мМ цитрата, рН 4,5, до раствора 10 мМ фосфата, рН 7,5, содержащий NaCl. Это приводит к одновременному изменению рН и концентрации солей, что обуславливает элюирование связанных белков. Это аналогично профилю элюирования солью, который наблюдают после уравновешивания рН, что заключается в том, что молекулы с низкой подвижностью элюируются в последних фракциях (т.е. при более высоком рН и концентрации солей) и при конечном промывании 1 М аргинина, рН 7,5. Например, элюат белка А (24 мг) является связанным с колонкой при рН 4,5 и элюируется градиентом от 5 мМ цитрата рН 4,5 до 10 мМ фосфата рН 7,5, содержащим 0,5 М NaCl. Постулируют, что такая большая нагрузка при уравновешивании рН может приводить к элюированию связанных белков во время сдвига рН. Для профиля элюирования во время градиента рН и соли фактически демонстрируют небольшой пик в начале градиента и основной пик (желаемый правильно свернутый этанерцепт) при промежуточном градиенте. Наблюдаемый небольшой пик может соответствовать элюированию того, что наблюдали в случае, когда уравновешивание рН проводили первоначально без градиента рН/соли. Затем, после завершения элюирования градиентом NaCl/pH колонку подвергают дополнительному элюированию раствором 1 М аргинина, которое приводит к конечному четкому пику, соответствующему молекулам с низкой подвижностью. Первые фракции элюирования при низкой концентрации соли и низком рН

- 18 031324 обогащены этанерцептом, тогда как для фракций с высокой концентрацией соли и высоким рН демонстрировали элюирование молекул с низкой подвижностью; рН постепенно увеличивали от 4,5 до 7,5, например рН 4,1-5,1 при промежуточных концентрациях соли и рН 6,6 в конце градиента. При конечном промывании 1 М аргинином, раствором с рН 7,5 демонстрируют смазанную полосу на нативном PAGE и много полос на SDS-PAGE, по существу, идентичных элюированию, которое после начального уравновешивания колонки вызывает сдвиг рН при промывании 10 мМ фосфата, рН 7,5. Выделение правильно свернутого этанерцепта в объединенных фракциях составляло ~70%. Аналогичный результат получают, когда проводят элюирование таким же градиентом рН/соли до 10 мМ фосфата, раствор с рН 7,5, но завершая при более низкой концентрации соли, содержащей 0,25 М NaCl. Такой градиент с использованием более низкой концентрации солей приводит к неполному элюированию этанерцепта с выходом ~50%. Как и в предшествующих примерах наблюдали большой пик при промывании 1 М аргинина, соответствующий молекулам (неправильно свернутым/агрегированным) этанерцепта с низкой подвижностью. Анализ элюатов, полученных в этом примере, представлен на фиг. 7А и 7В.

Пример 6. Очистка смешанного типа Capto™ MMC с использованием градиента Na₂SO₄/pH для элюирования

Аналогично способам, используемым в указанном выше примере 5, также проводили элюирование градиентом рН/соли с использованием раствора 0,5 М Na2SO4 в качестве конечного растворителя, который, как полагают, улучшает разделение свернутых молекул от неправильно свернутых молекул. Выделение этанерцепта в объединенных фракциях составляет ~50%, и полагают, что низкий выход обусловлен усиленным гидрофобным взаимодействием в результате 0,5 М Na2SO4, приводящим к удерживанию не только неправильно свернутых молекул, главным образом, элюирующих при промывании 1 М аргинина, а также этанерцепта, который также появляется при промывании 1 М аргинином. Таким образом, использование Na₂SO₄ может повышать разделение (т.е. разрешение) неправильно свернутых от правильно свернутых молекул, а также снижать выделение этанерцепта. Для анализа элюатов в этом примере можно привести ссылки на фиг. 8 А и 8В.

Пример 7. Capto™ Adhere, элюирование NaCl при рН 7,5 и рН 4,5

В этом примере элюат белка А, содержащий правильно и неправильно свернутые молекулы этанерцепта, подвергают хроматографии смешанного типа с использованием Capto™ Adhere в качестве смолы смешанного типа. Связывание раствора белка, содержащего правильно свернутые и неправильно свернутые молекулы этанерцепта, проводили при рН 7,5, при котором этанерцепт является отрицательно заряженным и, таким образом, должен связываться с положительно заряженными лигандами Capto™ Adhere. При рН 4,2 элюат белка А подвергают диализу против 10 мМ фосфата, раствор с рН 7,5, связывание белка заканчивается, но выявлено, что элюирование одной солью (при рН 7,5) является эффективным, что подтверждает, что Capto™ Adhere является в значительной степени гидрофобной. Таким образом, считают, что вследствие того, что pI этанерцепта составляет 4,9-5,4, что при более низком рН элюировании, возможно рН 4,5, молекулы этанерцепт будут являться положительно заряженными и, таким образом, отталкиваться от положительно заряженной смолы при рН 4,5 Capto™ Adhere. Эту вероятность исследуют посредством проведения элюирования молекул этанерцепта из Capto™ Adhere при рН 4,5. Элюат белка А с рН 4,2 (который подвергали диализу до рН 7,5) связывается с Capto™ Adhere, уравновешенной 10 мМ фосфата, раствор с рН 7,5. После нагрузки белка колонку промывают 0 и 0,2 М NaCl в том же буфере, без элюирования белка в этих промываниях.

Пример 8. Capto™ Adhere, элюирование с/без аргинина при рН 4,5

В соответствии с результатами примера 7, затем связанный белок элюируют 5 мМ цитратом, раствор с рН 4,5 с аргинином и без него. В этом примере используют аргинин вместо NaCl для исследования способа, в котором более гидрофобные молекулы (аргинин) могут влиять на элюирование с учетом гидрофобной природы лигандов Capto™ Adhere. Выявлено, что молекулы с низкой подвижностью (неправильно свернутые/агрегированные) наряду с правильно свернутым этанерцептом элюируют 5 мМ цитратом, промывной раствор с рН 4,5 (не содержащий аргинин). Элюирование молекул с низкой подвижностью в этой фракции может быть обусловлено резким изменением рН, т.к. измеряемый рН этой фракции составлял 3,0. Когда этот этап повторяют с 0,1 и 0,2 М аргинина в 5 мМ цитрате, раствор с рН 4,5, наблюдают только незначительные количества правильно свернутого этанерцепта. Для полного элюирования правильно свернутого этанерцепта необходимым являлся 0,5 М аргинин, однако элюат содержит нежелательное количество молекул с низкой подвижностью. Таким образом, выявлено, что даже при рН

4,5 аргинин является неэффективным в низких концентрациях, и более высокие концентрации аргинина приводили к слабому разрешению между свернутыми и неправильно свернутыми молекулами. Для анализа элюатов, полученных в этом примере, см. фиг. 9.

Пример 9. Capto™ Adhere, элюирование с использованием двух градиентов аргинина и градиента рН от 7,5 до 4,5

Затем постулируют, что объединенный градиент рН/аргинина может приводить к лучшему разрешению между правильно свернутыми и неправильно свернутыми молекулами. Как и в предшествующих примерах для САРТО ММС, снижение рН во время уравновешивания рН от 7,5 до 4,5 с использованием

- 19 031324 мМ цитрата можно предотвращать применением одновременно градиента рН, который затем можно сочетать с градиентом концентрации аргинина (например, градиентом от 10 мМ фосфата рН 7,5 до 5 мМ цитрата рН 4,5, содержащего аргинин). С этим градиентом рН исследовали два градиента аргинина. В случае градиента аргинина до 0,25 М аргинина (фиг. 10А и 10В) выявлено, что конечное промывание 0,5 М аргинина приводило к элюированию молекул с низкой подвижностью и этанерцепта, что свидетельствует о том, что использование градиента до концентрации аргинина только 0,25 М аргинина является недостаточным для полного элюирования правильно свернутого этанерцепта. Таким образом, исследовали градиент аргинина 0-0,5 М (в сочетании с указанным выше градиентом рН от 7,5 до 4,5) (фиг. 11A и 11В). Из последующего анализа нативного PAGE очевидно, что относительная высота пика являлась меньше для конечного промывания 1 М аргинина с более высоким градиентом аргинина по сравнению с предшествующим градиентом 0,25 М аргинина. Не наблюдают второго пика, что означает, что разрешение могло быть нарушено. Градиент рН является таким, что рН элюируемых фракций постепенно понижается от 7,5 до 6,0, 5,7, 5,2 и в конечном итоге до 4,5. Касательно 0,5 М аргинина и градиента рН две фракции в основном пике элюирования обогащены правильно свернутым этанерцептом с выходом белка ~65%. Для более поздней части градиента демонстрировали смазанную полосу, содержащую этанерцепт. Таким образом, несмотря на то, что градиент 0,5 М аргинина совместно с градиентом рН увеличивал элюирование связанного этанерцепта, правильно свернутый этанерцепт элюировался совместно с неправильно свернутыми молекулами в более поздней части градиента аргинина/рН. Для конечного промывания 1 М аргинина демонстрировали только смазанную полосу.

Пример 10. Capto™ Adhere, элюирование градиентом аргинина и градиентом рН от 7,5 до 4,5

Элюирования градиентом аргинина также проводили при рН 7,5 с использованием объединенных фракций Capto™ MMC. Связанные белки элюировали градиентом от 10 мМ фосфата рН 7,5 до 0,6 М аргинина, 10 мМ фосфата, рН 7,5. Профили SDS-PAGE и нативного PAGE демонстрируют элюирование правильно свернутого этанерцепта в средних фракциях (0,2-0,4 М аргинина) (фиг. 13). Как видно из обоих гелей, молекулы с низкой подвижностью наблюдают в последней фракции и конечном промывании 1 М аргинина рН 7,0. Для сравнения: когда 0,6 М аргинина заменяют 0,5 М NaCl в градиентном элюировании при рН 7,5, элюирование этанерцепта значительно снижалось. На фиг. 14 представлен профиль элюирования при рН 7,5 при градиенте соли до 0,5 М NaCl. При градиенте наблюдали два пика, содержащие в основном этанерцепт, но с низким выходом. Большое количество этанерцепта элюировали в конечном промывании 1 М аргинина, что свидетельствует о том, что концентрация соли 0,5 М NaCl в сочетании с рН 7,5 являлась не оптимальной для разделения правильно свернутого этанерцепта и неправильно свернутого/агрегированного вещества. Как указано выше, 1 М аргинин являлся высокоэффективным для элюирования правильно свернутого этанерцепта, несмотря на присутствие молекул с низкой подвижностью. Следует отметить, что изменение градиента соли для элюирования с применением градиента приблизительно от 0 приблизительно до 1М NaCal и проведение элюирования при рН 8 приводит к превосходному разрешению правильно свернутого этанерцепта в сравнении с молекулами с высокой/низкой подвижностью (неправильно свернутыми/агрегированными) в первых продуктах элюирования такого градиента, как продемонстрировано в примере 12. По-видимому, вклад гидрофобного взаимодействия в связывание этанерцепта с Capto Adhere снижается при рН 8,0, что приводит к эффективному элюированию правильно свернутого этанерцепта с использованием одного NaCl.

Пример 11. Capto™ Adhere, элюирование с градиентами аргинина/NaCl при рН 7,5

В этом примере исследуют объединенный градиент NaCl/аргинина при рН 7,5. Исследовали два таких градиента: первый градиент, который исследуют для элюирующей среды, представляет собой градиент, при котором конечные концентрации NaCl и аргинина составляют 0,4 и 0,2 соответственно. Затем исследуют второй градиент, в котором конечные концентрации NaCl и аргинин составляют 0,25 М NaCl и 0,5 М аргинина соответственно. В обоих случаях градиенты примеряют в 10 мМ фосфате, раствор с рН 7,5. Первый градиент все еще являлся слишком слабым для уменьшения гидрофобных взаимодействий и, таким образом, элюирования этанерцепта. Второй градиент являлся более эффективным, на что указывает меньший пик в конечном промывании 1 М аргинина. В частности, как подтверждают SDS-PAGE, элюирование этанерцепта происходит на всем протяжении второго тестируемого градиента до 0,25 М NaCl, 0,5 М аргинина без высокомолекулярных молекул (с низкой подвижностью/неправильно свернутых/агрегированных). Такую высокомолекулярную молекулу затем элюируют конечным промыванием 1 М аргинина. На нативном PAGE показано, что большая часть нативного правильно свернутого этанерцепта элюируется в средней фракции. Смазанную полосу наблюдали при промывании 1 М аргинина. Таким образом, очевидно, что сочетание аргинина и NaCl может приводить к элюированию этанерцепта и разделению молекул с низкой подвижностью и большой молекулярной массой, соответствующих неправильно свернутым молекулам. Анализ HIC фракции Capto™ Adhere для объединенных фракций Capto™ MMC (60-80% чистоты) демонстрирует, что элюируемые фракции при градиенте (за исключением хвостовых фракций), как правило, давали чистоту более 95%. Анализы элюатов, полученных в этом примере, приведены на фиг. 15А и 15В.

- 20 031324

Пример 12. Capto™ Adhere и Capto™ MMC

В этом примере элюат белка А, содержащий правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт, получали способом, аналогичным описанному выше способу с белком А. Затем элюаты вносили в колонку с Capto™ MMCe, а затем объединенные продукты вносили в колонку с Capto™ ADHERE с получением превосходного как с точки зрения количества, так и качества продукта этанерцепта.

Этап 1. Размножение клеток.

Известным в данной области способом проводят размножение клетки, необходимое для получения достаточного количества клеток для инокуляции производственного биореактора с использованием клона клеток СНО, экспрессирующих слитый белок этанерцепта. Продукт такого способа экспрессии (собираемая культуральная жидкость) приводит к получению смеси правильно свернутого этанерцепта, а также неправильно свернутого и/или агрегированного этанерцепта наряду с дополнительными примесями. Собираемую культуральную жидкость, содержащую такую смесь белков, подвергают инактивации вирусов детергентом.

Этап 2. Аффинная хроматография.

Аффинную хроматографию проводят на собираемой культуральной жидкости, полученной на указанном выше этапе 1 с использованием общепринятой аффинной колонки с белком А хорошо известным способом. Выделение продукта составляет приблизительно 85%. Полученный продукт представляет собой сложную смесь белков, содержащую правильно свернутый этанерцепт, неправильно свернутый этанерцепт и/или агрегаты правильно и/или неправильно свернутого этанерцепта, или фрагменты белков. Продукт, полученный после этого этапа очистки на аффинной колонке с белком А, доводят до рН 3,5, а затем подвергают этапу инактивации вирусов. После инактивации вирусов продукт доводят до рН 5,5, а затем дополнительно осветляют известным способом с использованием полученного коммерческим путем капсульного фильтра.

Этап 3A. Катионообменная хроматография смешанного типа.

Для очистки продукта, полученного на указанном выше этапе 2, используют 31,8 л (диаметр 45 см х 20 см высота слоя) хроматографическую колонку Capto MMC с фильтрующим слоем от GE Healthcare. Перед использованием колонку уравновешивали 2 CV 25 мМ ацетата рН 5,5 и подвергали санитарной обработке 2 CV 0,1н NaOH, 1 M NaCl и нейтрализовали 2 CV 25 мМ ацетата, 0,7 М NaCl, рН 5,5. Затем колонку уравновешивают 8-10 CV 25 мМ ацетата рН 5,5 до тех пор, пока не получали элюат с рН 5,5 и

3,5 мС/см. Объединенные фракции белка А после указанного выше этапа 2 разбавляют до <6 мС/см WFI и вносят в колонку, нагружая до 15 г/л среды для каждого цикла. Колонку эксплуатируют при линейной скорости 200 см/ч с получением продолжительности обработки 6 мин. После нагрузки колонку промывают 2 CV 25 мМ ацетата рН 5,5. Затем продукт элюируют 8,5 CV, от 15 до 85% градиента от 25 мМ ацетата рН 5,5 до 25 мМ ацетата, 0,7 М NaCl, рН 5,5. Сбор продукта начинают при OD 0,15 (А280, длина пути 1,0 см) и заканчивают сбор при 50% максимума пика. Объем элюата составляет приблизительно 5 CV. Остаточный продукт и загрязнители снимают с колонки 2 CV 10 мМ Tris, 1 M NaCl, рН 8,0 и выбрасывают. Продукт, полученный из колонки смешанного типа, фильтруют с использованием Millipore Opticap XL10, 0,22 мкм капсульного фильтра Durapore (0,69 м²). Полученный после этого этапа продукт представляет выход приблизительно 70% вещества белка А, полученного на этапе 2.

Этап 3B. Анионообменная хроматография смешанного типа.

Для дополнительной очистки продукта, полученного на указанном выше этапе 3A, используют 27,0 л (диаметр 45 см х 17 см высота слоя) хроматографическую колонку Capto Adhere с фильтрующим слоем от GE Healthcare. Перед использованием колонку уравновешивали 2 CV 25 мМ Tris, рН 8,0 и подвергали санитарной обработке 2 CV 0,1н NaOH, 1M NaCl и нейтрализовали и уравновешивали 2 CV 25 мМ Tris, рН 8,0. Перед нагрузкой продукта колонку уравновешивали 3 CV 10 мМ Tris, рН 8,0. Объединенную фракцию Capto MMC после указанного выше этапа 3A доводят до рН 8,1 с использованием ~0,045 кг 1 М Tris, рН 8,3 на кг объединенной фракции. Продукт после указанного выше этапа 3A последовательно разбавляли 1:3,8 WFI для доведения электропроводности до 12,0 мС/см и рН 8,0. Затем полученное вещество нагружали в колонку до 15 г/л среды. Колонку эксплуатируют при линейной скорости 170 см/ч с получением продолжительности обработки 6 мин. После нагрузки колонку промывают 2 CV 25 мМ Tris, рН 8,0. Затем элюируют продукт 10 CV градиента (от 20 до 90%) от 25 мМ Tris, рН 8,0 до 10 мМ Tris, 1 M NaCl, рН 8,0. Сбор продукта начинают при OD 0,15 (А280, длина пути 1,0 см) и заканчивают сбор при 25% максимума пика. Объем элюата составляет 4-6 CV. Элюируемый продукт фильтруют с использованием коммерчески доступного капсульного фильтра, а затем подвергают известным способом этапам фильтрования вирусов и фильтрования тангенциальным потоком. Общий выход продукта после этапа 3B (включая этапы конечного фильтрования вирусом и тангенциальным потоком) составлял приблизительно 68%. Выход продукта, измеряемый до этапов фильтрования, составлял приблизительно 75%.

Схематическое представление данных HIC, полученных на фракциях элюирования после этого этапа, представлено на фиг. 12.

Анализ: Выявлено, что конечный отфильтрованный продукт, полученный в этом примере, содержит более приблизительно 90 мас.% правильно свернутого этанерцепта, как определяют HIC; менее 5

- 21 031324 мас.% неправильно свернутых молекул этанерцепта, как определяют HIC; менее приблизительно 3 мас.% усеченного вещества, как определяют анализом HIC (полагают, что оно представляет собой фрагменты этанерцепта, в которых его участок TNFR был усечен) и общее количество правильно и неправильно свернутого этанерцепта более 95 мас.% как определяют эксклюзионной хроматографией.

Факт того, что связывание белка, происходящее в высаливающих условиях, подтверждает возможность того, что гидрофобное взаимодействие не участвует в связывании этанерцепта Capto™ MMC и Capto™ Adhere, учитывая, что для гидрофобного связывания белка с HIC, как правило, требуется сильное высаливание. Однако наличие электростатического взаимодействия между белком и такими смолами смешанного типа может облегчать гидрофобное взаимодействие. Таким образом, без желания быть связанными какой-либо конкретной теорией, связывание этанерцепта со смолой смешанного типа может быть опосредовано режимами электростатического и гидрофобного взаимодействия даже в условиях высаливания. Аналитическая HIC ясно указывает на то, что неправильно свернутая молекула, которая элюируется при более низкой концентрации сульфата аммония, является более гидрофобной, чем свернутая молекула. При условии, что свернутая и неправильно свернутая молекулы обладают идентичными электростатическими свойствами и связываются в равной степени хорошо с заряженной группой Capto™ ММС или лигандами Capto™ Adhere, возможно, что более существенный вклад гидрофобного взаимодействия неправильно свернутых молекул приводит к тому, что они прочнее связываются со смолами смешанного типа, таким образом, вызывая необходимость более сильных условий элюирования для неправильно свернутых молекул, как наблюдают в предшествующих примерах. Для Capto™ ММС это можно получать при более высокой концентрации солей, которая не может являться достаточной для значительного усиления гидрофобного взаимодействия, но может быть достаточной для нарушения дополнительного электростатического взаимодействие между Capto™ ММС и правильно и неправильно свернутыми молекулами. С другой стороны, по-видимому, Capto™ Adhere является более гидрофобной, чем Capto™ ММС, что вызывает необходимость применения аргинина или, альтернативно, более высокой концентрации солей при более высоком рН для элюирования правильно свернутых молекул. Для элюирования неправильно свернутых молекул требуется более высокая концентрация аргинина или более жесткие условия.

Несмотря на то, что в настоящем изобретении термины неправильно свернутый или некорректно свернутый, или неправильным образом свернутый используют взаимозаменяемо, также следует понимать, что эти термины также предназначены включать агрегированные молекулы, т.к. также выявлено, что смолы смешанного типа являются эффективными для удаления агрегированных молекул в тех же фракциях элюирования, для которых выявлено, что они содержат неправильно свернутые молекулы. Фактически, этанерцепт образует связанные дисульфидной связью олигомеры, как видно на SDS-PAGE. Такие олигомеры элюируют главным образом в промывании 1 М аргинина, что свидетельствует об их более сильном гидрофобном взаимодействии со смолами. Таким образом, для этанерцепта, по-видимому, Capto™ MMC и Capto™ Adhere могут приводить к одновременному удалению неправильно свернутых и агрегированных молекул. Удаление неправильно свернутого вещества и агрегатов, ковалентно или нековалентно, является очень желательным для обеспечения более безопасных биофармацевтических средств вследствие потенциальной иммуногенности агрегированного вещества (правильно или неправильно свернутого).

Касательно эффектов аргинина в предшествующих примерах, очевидно, что аргинин (гидрохлорид аргинина) служит не только в качестве соли, а также ослабляет гидрофобное взаимодействие. В данной области известно, что аргинин подавляет агрегацию и адсорбцию на поверхности белка. Кроме того, аргинин взаимодействует с ароматическими группами и, таким образом, препятствует ароматическомуароматическому или ароматическому-катионному взаимодействию между белками или между белками и поверхностью. Capto™ MMC и Capto™ Adhere содержат ароматическую группу, которая может способствовать связыванию белка. Теоретически не было рассчитано, что аргинин, но не NaCl, может нарушать такой тип связывания. Аргинин также ослабляет взаимодействие между жирными кислотами, что подтверждает, что он может нарушать гидрофобное взаимодействие, не опосредованное ароматическими группами. Гидрофобная природа аргинина, хотя недостаточно исследована с механической точки зрения, таким образом, может играть важную роль в модуляции взаимодействия белок-белок и поверхностной адсорбции и, таким образом, элюировании белка из смолы смешанного типа. Однако, как показано в примере 12 выше, использование аргинина не является обязательным для практического осуществления настоящего изобретения для обеспечения препарата этанерцепта очень высокой степени чистоты. Вероятно, это обусловлено слабым гидрофобным вкладом смол Capto MMC и Capto Adhere в связывание белка. Однако использование аргинина в сочетании с NaCl может улучшать выход и разрешение хроматографии смешанного типа для белков.

- 22 031324

Приложение А.

Дополнительные репрезентативные варианты осуществления (Раскрытые в приоритетной заявке USSN 61/699552)

A. Способ хроматографии смешанного типа для разделения правильно свернутого белка и неправильно свернутого белка, включающий этапы:

(a) связывание первой смеси белков, содержащей правильно свернутые и неправильно свернутые конформации данного белка, со смолой для хроматографии смешанного типа, имеющей ионообменные группы и гидрофобные группы;

(b) элюирование правильно свернутого белка из смолы смешанного типа с получением второй смеси белков с более высокой долей правильно свернутого белка по сравнению с первой смесью белков.

B. Способ варианта осуществления А, где смола для хроматографии смешанного типа представляет собой смолу Capto™ MMC для хроматографии смешанного типа.

C. Способ варианта осуществления А, где смола для хроматографии смешанного типа представляет собой смолу Capto™ Adhere для хроматографии смешанного типа.

D. Способ по любому из вариантов осуществления А-С, где правильно и неправильно свернутые конформации белка содержат правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт.

E. Способ варианта осуществления D, где неправильно свернутый этанерцепт составляет менее приблизительно 10 мас.% и предпочтительно менее приблизительно 5 мас.% элюата, полученного на этапе (b); правильно свернутый этанерцепт составляет более приблизительно 90 мас.% и предпочтительно более приблизительно 95 мас.% элюата, полученного на этапе (b), и общее количество правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта составляет по меньшей мере приблизительно 95 мас.% и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98 мас.% элюата, полученного на этапе (b).

F. Способ по любому из вариантов осуществления А-Е, где смола смешанного типа представляет собой Capto™ MMC, и этапы (а) и (b) способа проводят при рН приблизительно от 4,5 приблизительно до 7,5, и этап элюирования (b) проводят путем приведения смолы смешанного типа в контакт с раствором соли.

G. Способ по любому из вариантов осуществления А-Е, где смола смешанного типа представляет собой Capto™ Adhere и этапы (а) и (b) проводят при рН приблизительно от 4,5 приблизительно до 8,5, и этап элюирования (b) проводят путем приведения смолы смешанного типа в контакт с раствор соли, где указанный раствор необязательно дополнительно содержит аргинин.

H. Способ из вариантов осуществления F или G, где раствор соли применяют на этапе (b) посредством градиента, таким образом, постепенно увеличивают концентрация соли.

I. Способ варианта осуществления Н, где градиент концентрации соли этапа (b) вызывает увеличение концентрации соли приблизительно от 0 приблизительно до 1 М.

J. Способ по любому из вариантов осуществления F-I, где соль выбрана из хлорида натрия и сульфата натрия.

K. Способ по любому из вариантов осуществления A-J, где во время этапа (b) рН раствора, контактирующего со смолой на этапе (b), постепенно изменяют.

L. Способ варианта осуществления K, где рН постепенно повышают.

M. Способ варианта осуществления K, где рН постепенно понижают.

N. Способ по любому из вариантов осуществления А-М, где количество правильно свернутого белка, полученного в элюате этапа (b), составляет по меньшей мере приблизительно 60 мас.% количества белка, присутствующего в смеси белков, вводимой в смолу на этапе (а).

O. Способ варианта осуществления N, где количество правильно свернутого белка составляет по меньшей мере приблизительно 70 мас.% количества белка, присутствующего в смеси белков, вводимой в смолу на этапе (а).

P. Способ по любому из вариантов осуществления А-О, в котором смесь белков, содержащих по меньшей мере 90 мас.% правильно свернутого этанерцепта и предпочтительно менее приблизительно 5 мас.% неправильно свернутого этанерцепта, получают без проведения или без необходимости проведения какого-либо хроматографического разделения или этапов очистки для разделения правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта, отличных от следующих:

(1) одного или более этапов очистки, предпочтительно включающих хроматографический этап очистки с использованием белка А, где такой этап(ы) применяют для очистки собираемой культуральной жидкости, содержащей белки на основе этанерцепта, и где такой этап очистки не приводит к какомулибо существенному разделению правильно от неправильно свернутого этанерцепта.

(2) этапов (а) и (b) хроматографии смешанного типа, указанных в варианте осуществления 1, и (3) SEC, HIC или другие аналитические хроматографические этапы, проводимые только с целью анализа.

Q. Способ по любому из вариантов осуществления А-Р, где количество белка, содержащегося в элюате после этапа (b) определяют по оптической плотности в УФ-области при А280; количество правильно свернутого этанерцепта в элюате после этапа В, определяют хроматографией гидрофобного вза

- 23 031324 имодействия и общее количество правильно и неправильно свернутого этанерцепта, содержащегося в элюате после этапа (b), определяют эксклюзионной хроматографией.

R. Способ хроматографии смешанного типа для очистки смеси белков с целью разделения правильно свернутого этанерцепта и неправильно свернутого этанерцепта, содержащегося в указанной смеси, где способ включает этапы:

(a) приведение смолы для хроматографии смешанного типа, содержащей гидрофобные группы и ионообменные группы, в контакт с раствором, содержащим смесь белков, содержащую правильно свернутый этанерцепт и неправильно свернутый этанерцепт, таким образом, что правильно свернутый этанерцепт и неправильно свернутый этанерцепт становятся присоединенными, связанными или захваченными на смоле для хроматографии смешанного типа, и (b) приведение смолы смешанного типа в контакт с раствором, способным элюировать белки этанерцепта из смолы для хроматографии смешанного типа с получением элюата, в котором отношение количества правильно свернутого этанерцепта к неправильно свернутому этанерцепту больше, чем в смеси белков, вводимой в смолу на этапе (а).

S. Способ варианта осуществления R, где смола для хроматографии смешанного типа представляет собой смолу Capto™ ММС для хроматографии смешанного типа.

T. Способ варианта осуществления R, где смола для хроматографии смешанного типа представляет собой смолу Capto™ Adhere для хроматографии смешанного типа.

U. Способ вариантов осуществления А-Т, где:

(A) неправильно свернутый этанерцепт составляет менее приблизительно 5 мас.% элюата, полученного на этапе (b); правильно свернутый этанерцепт составляет более приблизительно 90 мас.% элюата, полученного на этапе (b), и общее количество правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта составляет по меньшей мере приблизительно 95 мас.% элюата, полученного на этапе (b), или (B) элюат или его часть, полученная на этапе (b), содержит правильно свернутый этанерцепт и не содержит или по существу не содержит неправильно свернутый этанерцепт.

V. Способ по любому из вариантов осуществления A-U, где смола смешанного типа представляет собой Capto™ ММС, этапы (а) и (b) способа проводят при рН приблизительно от 4,5 приблизительно до

7,5 и этап элюирования (b) проводят путем приведения смолы смешанного типа в контакт с раствором соли.

W. Способ по любому из вариантов осуществления R-V, где смола смешанного типа представляет собой Capto™ Adhere, этапы (а) и (b) проводят при рН приблизительно от 4,5 приблизительно до 8,5 и этап элюирования (b) проводят путем приведения смолы смешанного типа в контакт с раствором соли, где указанный раствор необязательно дополнительно содержит аргинин.

X. Способ вариантов осуществления V или W, где раствор соли применяют на этапе (b) посредством градиента, таким образом постепенно увеличивая концентрацию соли.

Y. Способ варианта осуществления X, где градиент концентрации соли после этапа (b) вызывает увеличение концентрации соли приблизительно от 0 приблизительно до 1 М.

Z. Способ по любому из вариантов осуществления V-Y, где соль выбрана из хлорида натрия и сульфата натрия.

АА. Способ по любому из вариантов осуществления R-Z, где во время этапа (b) рН раствора, содержащего смолу на этапе (b), постепенно повышают или постепенно понижают.

ВВ. Способ по любому из вариантов осуществления R-AA, где количество правильно свернутого белка, полученного в элюате после этапа (b), составляет по меньшей мере приблизительно 60 мас.% и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70 мас.% количества белка, присутствующего в смеси белков, вводимой в смолу на этапе (а).

СС. Способ по любому из вариантов осуществления А-ВВ, где способ проводят два или более раз следующим образом:

выполнение первого разделения смешанного типа (разделение № 1) путем проведения этапов (а) и (b), с последующим выполнением второго разделения смешанного типа (разделение № 2) путем повторного проведения этапов (а) и (b);

где элюат, полученный на этапе (b) разделения № 1, используют в качестве раствора, содержащего смесь белков на этапе (а) разделения № 2.

DD. Способ варианта осуществления СС, где смола смешанного типа, используемая в разделении № 1, является такой же или отличной от смолы смешанного типа, используемой в разделении № 2.

ЕЕ. Способ варианта осуществления DD, где разделение № 1 и разделение № 2 проводят способом, выбранным из следующих ниже комбинаций:

в разделении № 1 используют САРТО ММС в качестве смолы для хроматографии смешанного типа и в разделении № 2 используют САРТО ADHERE в качестве смолы для хроматографии смешанного типа;

в разделении № 1 используют САРТО ADHERE в качестве смолы для хроматографии смешанного

- 24 031324 типа и в разделение № 2 используют САРТО ММС в качестве смолы для хроматографии смешанного типа;

в разделении № 1 используют САРТО ММС в качестве смолы для хроматографии смешанного типа и в разделение № 2 используют САРТО ММС в качестве смолы для хроматографии смешанного типа, или в разделении № 1 используют САРТО ADHERE в качестве смолы для хроматографии смешанного типа и в разделение № 2 используют САРТО ADHERE в качестве смолы для хроматографии смешанного типа.

FF. Способ варианта осуществления ЕЕ, где разделение № 1 и разделение № 2 проводят следующим образом: в разделении № 1 используют САРТО ММС в качестве смолы для хроматографии смешанного типа и в разделении № 2 используют САРТО ADHERE в качестве смолы для хроматографии смешанного типа.

GG. Содержащая этанерцепт смесь белков или фармацевтически приемлемый состав, содержащий указанную смесь, полученную способом по любому из вариантов осуществления A-FF, и где указанная смесь белков содержит правильно свернутый этанерцепт в количестве, составляющем более приблизительно 90 мас.% смеси белков, и содержит неправильно свернутый этанерцепт в количестве, составляющем менее приблизительно 5 мас.% смеси белков; и где общее количество правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта в смеси белков составляет по меньшей мере приблизительно 95 и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98 мас.% содержащей этанерцепт смеси белков.

НН. Фармацевтически приемлемый состав, содержащий этанерцепт высокой чистоты, подходящий для введения индивидууму, нуждающемуся в лечении состояния, опосредованного TNF-альфа, где указанный состав содержит смесь белков, содержащую основное количество правильно свернутого этанерцепта и незначительное количество неправильно свернутого этанерцепта, где:

(i) неправильно свернутый этанерцепт составляет менее приблизительно 10 мас.%, предпочтительно менее приблизительно 8 мас.% и наиболее предпочтительно менее приблизительно 5 мас.% смеси белков;

(ii) правильно свернутый этанерцепт составляет более 90 мас.% и предпочтительно более приблизительно 92 мас.% и предпочтительно более приблизительно 95 мас. % смеси белков, и (iii) общее количество правильно свернутого этанерцепта и неправильно свернутого этанерцепта (но не включая его агрегаты) составляет по меньшей мере 95 и предпочтительно по меньшей мере 98 мас.% смеси белков;

где состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемые неактивные ингредиенты, эксципиенты или носители, делающие состав подходящим для введения индивидууму.

II. Состав варианта осуществления НН, где препарат этанерцепта составляет приблизительно от 25 приблизительно до 75 мг/мл состава и состав дополнительно содержит сахарозу, хлорид натрия, гидрохлорид L-аргинина и фосфат натрия.

JJ. Способ получения содержащей этанерцепт смеси белков с высокой чистотой в отношении количества правильно свернутого по сравнению с неправильно свернутым этанерцептом, содержащимся в ней, где указанный способ включающий этапы:

(1) экспрессия этанерцепта в экспрессирующей системе млекопитающего с получением собираемой культуральной жидкости, содержащей смесь белков этанерцепта, содержащую правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт;

(2) подвергание собираемой культуральной жидкости, полученной на этапе 1, способу очистки таким образом, что содержащую этанерцепт смесь белков получают со сниженным количеством или по существу не содержащую нежелательные примеси, содержащиеся в собираемой культуральной жидкости, полученной на этапе (1);

(3) приведение содержащей этанерцепт смеси белков, полученной на этапе (2), один или более раз в контакт с хроматографической смолой смешанного типа, содержащей ионообменные группы и группы гидрофобного взаимодействия для присоединения белков, содержащихся в смеси, к смоле, и (4) приведение смолы, содержащей связанный с ней белок, после этапа 3 в контакт с раствором для элюирования правильно свернутого этанерцепта из смолы смешанного типа с получением элюата, содержащего смесь белков, содержащую этанерцепт, с высоким соотношением правильно свернутого этанерцепта относительно неправильно свернутого этанерцепта, по сравнению с содержащей этанерцепт смесью, вводимой в смолу на этапе 3;

где:

(i) количество белка, присутствующего в смеси белков, содержащей этанерцепт, полученной после очистки этапа 2, составляет по меньшей мере приблизительно 80 мас.% количества смесь белков на основе этанерцепта, содержащейся в собираемой культуральной жидкости, полученного на этапе 1.

(ii) общее количество правильно и неправильно свернутого белка этанерцепта, содержащегося в

- 25 031324 смеси белков, элюируемой на этапе 4, составляет по меньшей мере приблизительно 60 мас.% их количества, содержащегося в смеси белков, полученной после этапа 2;

(iii) количество правильно свернутого этанерцепта, содержащегося в элюате после этапа 4, составляет по меньшей мере приблизительно 30 мас.% и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 35 мас.% количества содержащей этанерцепт смеси белков, содержащейся в собираемой культуральной жидкости, полученной на этапе 1, и (iv) указанный правильно свернутый этанерцепт составляет по меньшей мере приблизительно 90 мас.% и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95 мас. % элюата, полученного на этапе 4.

KK. Способ варианта осуществления JJ, где смола смешанного типа выбрана из группы, состоящей из САРТО ММС и САРТО ADHERE.

LL. Способ из вариантов осуществления JJ или KK, включающий следующие дополнительные этапы:

этап (5): приведение смеси белков, полученной в элюате после этапа 4, в контакт со смолой для хроматографии смешанного типа, имеющей ионообменные группы и группы гидрофобного взаимодействия, с целью присоединения белков, содержащихся в смеси, к смоле, а затем этап (6): приведение смолы в контакт с раствором для элюирования правильно свернутого этанерцепта из нее с получением элюата, содержащего смесь белков с более высокой долей правильно свернутого относительно неправильно свернутого этанерцепта;

где смола смешанного типа, используемая в указанных дополнительных этапах 5 и 6, является такой же или отличной от смолы смешанного типа, используемой на этапах 3 и 4.

ММ. Способ варианта осуществления LL, где смола смешанного типа, используемая на этапе (3) и (4), представляет собой САРТО ММС, и смола, используемая на этапах (5) и (6), представляет собой САРТО ADHERE.

NN. Способ по любому из вариантов осуществления JJ-MM, где этап 4 (и/или этап 6 в случае варианта осуществления LL) проводят путем приведения смолы смешанного типа в контакт с раствором соли для элюирования правильно свернутого этанерцепта из смолы смешанного типа, и необязательно (i) где концентрацию раствора соли постепенно повышают на этапах (4) или (6) во время указанного приведения раствора в контакт со смолой, и необязательно (ii) pH элюирующего раствора постепенно повышают или понижают на этапах (4) и/или (6) во время указанного приведения раствора в контакт со смолой.

OO. Способ по любому из вариантов осуществления JJ-NN, где продукт, полученный на одном или более этапов способа, подвергают фильтрованию, такой как фильтрование вирусов и/или фильтрование тангенциальным потоком.

PP. Способ по любому из вариантов осуществления JJ-OO, где этап 2 проводят с использованием хроматографической колонки с белком А.

QQ. Способ по любому из вариантов осуществления JJ-OO, где этап 2 проводят с использованием смолы смешанного типа, содержащей гидрофобные и ионообменные группы.

RR. Способ по любому из вариантов осуществления А-РР, в котором смесь белков, содержащую по меньшей мере 90 мас.% правильно свернутого этанерцепта и предпочтительно менее приблизительно 5 мас.% неправильно свернутого этанерцепта, получают без проведения какого-либо хроматографического разделения или этапов очистки для разделения правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта, отличных от одного или более из следующих ниже этапов:

(1) необязательно одного или более этапов очистки, предпочтительно включающих этап хроматографической очистки с белком А, такой как этап(ы), применяемый для очистки собираемой культуральной жидкости, содержащей белки на основе этанерцепта, где этап очистки не разделяет правильно свернутый от неправильно свернутого этанерцепта;

(2) указанного одного или более случаев этапов хроматографии смешанного типа (3) и (4), указанных в одном из вариантов осуществления А (или этапов 3, 4, 5 и 6 в соответствии с вариантом осуществления LL), и (3) необязательно одного или более этапов SEC, HIC или другого типа хроматографии, проводимых только с целью анализа.

SS. Способ по любому из вариантов осуществления A-RR, который исключает использование хроматографии гидрофобного взаимодействия одного типа в качестве средства разделения правильно свернутого этанерцепта и неправильно свернутого этанерцепта, за исключением случая проведения только с целью анализа.

ТТ. Способ лечения индивидуума, страдающего опосредованным TNF заболеванием, включающий этапы введения такому индивидууму фармацевтического состава, содержащего смесь белков, содержащую правильно свернутый этанерцепт и неправильно свернутый этанерцепт, где указанную смесь получают способом по любому из вариантов осуществления A-SS, где количество неправильно свернутого этанерцепта в смеси белков составляет менее приблизительно 5 мас. % указанной смеси.

UU. Способ варианта осуществления ТТ, где количество неправильно свернутого этанерцепта в смеси белков составляет менее приблизительно 3 мас.% указанной смеси, и количество правильно свернутого этанерцепта в смеси составляет более приблизительно 95 мас.% указанной смеси.

- 26 031324

W. Способ лечения индивидуума, страдающего опосредованным TNF заболеванием, включающий этапы введения такому индивидууму фармацевтического состава, содержащего смесь белков, содержащую правильно свернутый этанерцепт и неправильно свернутый этанерцепт, где количество неправильно свернутого этанерцепта в смеси белков составляет менее приблизительно 5 мас.% указанной смеси.

WW. Способ по вариантам осуществления TT-W, где количество неправильно свернутого этанерцепта в смеси белков составляет менее приблизительно 3 мас.% указанной смеси, и количество правильно свернутого этанерцепта в смеси составляет более приблизительно 95 мас.% смеси.

XX. Способ по любому из вариантов осуществления TT-W, где общее количество правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта (за исключением его агрегатов) составляет по меньшей мере приблизительно 95 мас.% указанной смеси.

YY. Способ варианта осуществления XX, где общее количество правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта (за исключением его агрегатов) составляет по меньшей мере приблизительно 98 мас.% указанной смеси.

ZZ. Способы или композиции по любому из вариантов осуществления A-YY, где, если не указано иначе, предполагают, что термин неправильно свернутый этанерцепт включает агрегаты, содержащие правильно свернутый и/или неправильно свернутый этанерцепт.

ААА. Способ по вариантам осуществления JJ-QQ, где количество белка на основе этанерцепта, содержащегося в собираемой культуре клеток после этапа 1 определяют посредством Fc ELISA.

ВВВ. Способ по любому из вариантов осуществления JJ-QQ, где количество белков на основе этанерцепта, содержащихся в элюатах, полученных из смолы смешанного типа на этапе 4 (или как в случае варианта осуществления LL, этапы 4 и 6), определяют по оптической плотности в УФ-области при А280.

ССС. Способ варианта осуществления ВВВ, где количество белка на основе этанерцепта, содержащегося в продукте, полученном после процесса очистки этапа 2, определяют по оптической плотности в УФ-области при А280 или посредством Fc ELISA.

DDD. Способ разделения правильно свернутого этанерцепта и неправильно свернутого этанерцепта, где для получения такого разделения используют хроматографические средства, и где хроматографические средства состоят только или по существу из хроматографии смешанного типа, в которой смесь, содержащую правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт, приводят в контакт со смолой для хроматографии смешанного типа, содержащей ионообменные и гидрофобные группы, а затем элюируют из нее с получением элюата, содержащего по меньшей мере приблизительно 85 и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% масс. правильно свернутого этанерцепта.

ЕЕЕ. Способ варианта осуществления DDD, где смола смешанного типа выбрана из САРТО ММС и САРТО ADHERE; элюирование проводят раствором соли, необязательно применяемым с использованием градиента увеличивающейся концентрации солей;

рН раствора соли находится в диапазоне приблизительно от 4 приблизительно до 8,5, применяемого необязательно в градиенте, в котором рН постепенно повышают или понижают; и где элюат получают из смолы в течение определенного периода времени, и элюат, собираемый в начале указанного периода, не содержит или по существу не содержит неправильно свернутый этанерцепт.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ хроматографии смешанного типа для разделения правильно свернутого этанерцепта и неправильно свернутого этанерцепта, включающий этапы:

(a) связывание первой содержащей этанерцепт смеси белков, содержащей правильно свернутые и неправильно свернутые конформации этанерцепта, со смолой для хроматографии смешанного типа, имеющей ионообменные группы и гидрофобные группы;

(b) элюирование правильно свернутого этанерцепта из смолы смешанного типа путем приведения в контакт смолы смешанного типа с раствором соли с получением второй содержащей этанерцепт смеси белков с более высокой долей правильно свернутого этанерцепта, чем в первой смеси этанерцепта.
2. Способ по п.1, где смола для хроматографии смешанного типа представляет собой смолу Capto™ MMC для хроматографии смешанного типа или смолу Capto™ Adhere для хроматографии смешанного типа.
3. Способ по п.1, где неправильно свернутый этанерцепт составляет менее 10 мас.% элюата, полученного на этапе (b); правильно свернутый этанерцепт составляет более 90 мас.% элюата, полученного на этапе (b), и общее количество правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта составляет по меньшей мере 95 мас.% элюата, полученного на этапе (b).
4. Способ по п.3, где смола смешанного типа представляет собой Capto™ Adhere и этапы (а) и (b) проводят при рН от 4,5 до 8,5 и где указанный раствор соли необязательно дополнительно содержит аргинин.
5. Способ по п.3, где раствор соли применяют на этапе (b) посредством градиента, таким образом постепенно увеличивая концентрацию соли.

- 27 031324
6. Способ по п.1, где во время этапа (b) рН раствора соли, контактирующего со смолой на этапе (b), постепенно изменяют.
7. Способ по п.1, где количество правильно свернутого белка составляет по меньшей мере 70 мас.% количества белка, присутствующего в смеси белков, вводимой в смолу на этапе (а).
8. Способ по п.1, где смесь белков, содержащую по меньшей мере 90 мас.% правильно свернутого этанерцепта, получают без проведения или без необходимости проведения какого-либо хроматографического разделения или этапов очистки для отделения правильно свернутого от неправильно свернутого этанерцепта, отличных от указанных:

(1) одного или более этапов очистки, где такой этап(ы) применяют только для удаления примесей, не относящихся к этанерцепту;

(2) этапов хроматографии смешанного типа (а) и (b), указанных в п.1; и (3) SEC, HIC или других аналитических этапов хроматографии, проводимых только с целью анализа.
9. Способ по п.1, где способ проводят два или более раз следующим образом:

выполнение первого разделения смешанного типа (разделение № 1) путем проведения этапов (а) и (b) с последующим выполнением второго разделения смешанного типа (разделение № 2) путем повторного проведения этапов (а) и (b);

где элюат, полученный на этапе (b) разделения № 1, используют в качестве раствора, содержащего смесь белков, на этапе (а) разделения № 2.
10. Способ по п.9, где разделение № 1 и разделение № 2 выполняют способом, выбранным из следующих комбинаций:

в разделении № 1 используют САРТО ММС в качестве смолы для хроматографии смешанного типа и в разделении № 2 используют САРТО ADHERE в качестве смолы для хроматографии смешанного типа;

в разделении № 1 используют САРТО ADHERE в качестве смолы для хроматографии смешанного типа и в разделении № 2 используют САРТО ММС в качестве смолы для хроматографии смешанного типа;

в разделении № 1 используют САРТО ММС в качестве смолы для хроматографии смешанного типа и в разделении № 2 используют САРТО ММС в качестве смолы для хроматографии смешанного типа или в разделении № 1 используют САРТО ADHERE в качестве смолы для хроматографии смешанного типа и в разделении № 2 используют САРТО ADHERE в качестве смолы для хроматографии смешанного типа.
11. Способ получения содержащей этанерцепт смеси белков с высокой степенью чистоты в отношении количества правильно свернутого относительно неправильно свернутого этанерцепта, содержащегося в ней, где указанный способ включает этапы:

(1) экспрессия этанерцепта в экспрессирующей системе млекопитающего с получением собираемой культуральной жидкости, содержащей смесь белков, содержащую этанерцепт, содержащую правильно свернутый и неправильно свернутый этанерцепт;

(2) подвергание собираемой культуральной жидкости, полученной на этапе (1), способу очистки таким образом, что содержащую этанерцепт смесь белков получают со сниженным количеством или по существу не содержащую нежелательных примесей, содержащихся в собираемой культуральной жидкости, полученной на этапе (1);

(3) приведение содержащей этанерцепт смеси белков, полученной на этапе (2), один или более раз в контакт со смолой для хроматографии смешанного типа, имеющей ионообменные группы и группы гидрофобного взаимодействия, для присоединения белков, содержащихся в смеси, к смоле; и (4) приведение смолы, содержащей связанный на ней белок, после этапа (3) в контакт с раствором для элюирования правильно свернутого этанерцепта из смолы смешанного типа с получением элюата, содержащего смесь белков, содержащую этанерцепт, с более высокой долей правильно свернутого этанерцепта по отношению к неправильно свернутому этанерцепту, чем содержащая этанерцепт смесь, вводимая в смолу на этапе (3);

где (i) количество белка, присутствующего в смеси белков, содержащей этанерцепт, полученной после очистки после этапа (2), составляет по меньшей мере 80 мас.% количества смеси белков на основе этанерцепта, содержащейся в собираемой культуральной жидкости, полученной на этапе (1);

(ii) общее количество правильно и неправильно свернутого белка этанерцепта, содержащегося в смеси белков, элюируемой на этапе (4), составляет по меньшей мере 60 мас.% от его количества, содержащегося в смеси белков, полученной после этапа (2);

(iii) количество правильно свернутого этанерцепта, содержащегося в элюате после этапа 4, состав

- 28 031324 ляет по меньшей мере 30 мас.% количества содержащей этанерцепт смеси белков, содержащейся в собираемой культуральной жидкости, полученной на этапе (1); и (iv) указанный правильно свернутый этанерцепт составляет по меньшей мере 90 мас.% элюата, полученного на этапе (4).
12. Способ по п.11, где смола смешанного типа выбрана из группы, состоящей из САРТО ММС и САРТО ADHERE.
13. Способ по п.12, включающий следующие дополнительные этапы:

(5) приведение смеси белков, полученной в элюате после этапа (4), в контакт со смолой для хроматографии смешанного типа, имеющей ионообменные группы и группы гидрофобного взаимодействия, для присоединения белков, содержащихся в смеси, к смоле, а затем (6) приведение смолы в контакт с раствором для элюирования из нее правильно свернутого этанерцепта с получением элюата, содержащего смесь белков с более высокой долей правильно свернутого этанерцепта по отношению к неправильно свернутому этанерцепту;

где смола смешанного типа, используемая в указанных дополнительных этапах (5) и (6), является такой же или отличной от смолы смешанного типа, используемой на этапах (3) и (4).
14. Способ по п.1, в котором исключают использование хроматографии гидрофобного взаимодействия одного типа в качестве средства разделения правильно свернутого этанерцепта и неправильно свернутого этанерцепта, за исключением ее проведения только с целью анализа.
15. Содержащая этанерцепт смесь белков, полученная способом по п.1, где указанная смесь белков содержит правильно свернутый этанерцепт в количестве, составляющем более приблизительно 90 мас.% смеси белков, и содержит неправильно свернутый этанерцепт в количестве, составляющем менее приблизительно 5 мас.% смеси белков, и где смесь белков содержит общее количество правильно свернутого и неправильно свернутого этанерцепта, составляющего по меньшей мере приблизительно 95 мас.% содержащей этанерцепт смеси белков.
16. Фармацевтически приемлемый состав, включающий содержащую этанерцепт смесь белков по

п.15.
17. Фармацевтически приемлемый состав по п.16, включающий от приблизительно 25 до приблизительно 75 мг/мл указанной смеси.
18. Фармацевтический приемлемый состав по п.17, дополнительно включающий сахарозу, хлорид натрия, гидрохлорид L-аргинина и фосфат натрия.

Capto ММС он он 'ОН

Capto Adhere

Фиг. 1

- 29 031324 ¹ ’ л2-в--з ⁴ .· ⁶ - - --⁷

Фиг. 2В

SDS-PAGE Нативный . ..1 . .2 . 3 4 5, . . .0, _; 1 2 3 4 5.

бМИМИ^^^И^^||[Д|^^И

Фиг. 3B

- 30 031324

Нативный о

8 . 9 .

Фиг. 4В

Фиг. 4С

- 31 031324

Фиг. 7В

Фиг. 5В

- 32 031324

SDS

Нативный i

θ

Фиг. 8В

Фиг. 9

- 33 031324

Фиг. 10В

- 34 031324

Фиг. 13

Фиг. 14

Фиг. 15В

- 35 031324

О