MXPA02007683A - Metodo para tratar o inhibir la lesion celular o muerte celular. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo de tratamiento o inhibicion de la lesion celular o muerte celular despues de un evento isquemico, tratamiento o inhibicion de la lesion por reperfusion, y reduccion de mortalidad despues de un infarto miocardial proporcionando terapia con un antagonista del TNFalfa.

Description

fODO PARA TRATAR O INHIBIR LA LESIÓN CELULAR O MUERTE CELULAR DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al tratamiento o inhibición de la lesión celular o muerte celular después de un evento isquémico, tratamiento o inhibición de la lesión por reperfusión, y reducción de la mortalidad después de un infarto miocardial, proporcionando terapia con un antagonista del TNFa. La reducción o cesación del flujo sanguíneo a un lecho vascular cuenta por una variedad de eventos clínicos que requieren intervención y restitución inmediata de la perfusión adecuada al órgano o tejido arriesgado. Diferentes tejidos pueden resistir diferentes grados de lesión isquémica. Sin embargo, todos los tejidos progresarán a lesión irreversible y necrosis celular si no son sometidos a reperfusión. La reperfusión dañada del tejido cardiaco (isquemia) , resulta en una perdida de la habilidad del corazón para funcionar apropiadamente cuando el tejido llega a ser privado de oxigeno y energia. La lesión permanente está directamente relacionada con la duración del déficit de oxigeno de las experiencias del miocardio. La reperfusión del REF 140733 isquémico simplemente se refiere a la restauración del a tal sistema de órgano o tejido. La necesidad de reperfusión, lograda por medios mecánicos o farmacológicos se ha aceptado por la comunidad médica, especialmente en el medio clínico de un infarto miocardial. Los datos sugieren que la "lesión por reperfusión" compromete el grado de tejido salvado cuando el flujo sanguíneo regresa al tejido. Las intervenciones terapéuticas tales como la angioplastia coronaria y la terapia trombolitica son dirigidas hacia el tratamiento de la isquemia miocardial aguda. Es bien reconocido que la mortalidad entre pacientes quienes experimentaron un infarto miocardial es dependiente de la extensión de la disfunción ventricular izquierda, la cual en cambio, está directamente relacionada con la cantidad de miocardio que llega a infartarse y de este modo no es funcional. Hay un acuerdo general de que el tejido miocardial sometido a una intervención isquémica es dependiente de la restauración del flujo sanguíneo dentro de un periodo definido para viabilidad y función celular a ser restaurada. El tejido comprometido después de la isquemia, puede solamente ser recuperado sometiéndolo a reperfusión. Aunque el acto por reperfusión puede extenderse más allá de la lesión. Como los investigadores comienzan a reconocer ^¡ ?vL??^m . — ^ — ^É lll I llillllJIIII los estudios se dirigen a explorar los mecanismos responsables, asi como también a desarrollar terapias potenciales para suprimir el daño celular asociado con la lesión por reperfusión. Un número de mecanismos celulares se cree son responsables por la lesión por reperfusión inducida por isquemia. El TNFa es una citocina secretada por macrófagos y monocitos, los cuales causan una amplia variedad de efectos en un número de tipos celulares. Las proteínas del TNF inician su efecto biológico en las células enlazándolas a proteínas receptoras del TNF especificas (TNFR) expresado en la membrana plasmática de una célula responsiva del TNF. Los efectos causados por el TNFa incluyen efectos inhibitorios o citotóxicos en las lineas celulares tumorales, estimulación de la proliferación de fibroblastos y la actividad fagocitica/citotóxica de células mieloides, inducción de las moléculas de adhesión en las células endotel ales, inhibición de la sintesis de las enzimas especificas en adipocitos, e inducción de la expresión de antigenos de histocompatibilidad. [véase, Patente Estadounidense No. 5,610,279]. El TNFa también causa acciones pro-mflamatorias las cuales resultan en la lesión del tejido, tal como degradación del cartílago y hueso [Saklatvala. Nature 322:547 ; Bertolini, Nature 319:516 (1986)]. El TNFa está también asociado con infecciones, alteraciones inmunes, patologías neoplásticas, patologías autoinmunes y padecimiento injerto contra hospedante. El TNFa está también implicado en la causa de un síndrome de desgaste conocido como caquexia, asociada con el cáncer, la cual incluye pérdida progresiva de peso, anorexia, y erosión persistente de la masa corporal delgada en respuesta al crecimiento maligno [véase WO 98/51344] . El TNFa se cree también contribuye a la inducción de la disfunción ventricular, edema pulmonar y cardiomiopatia. [Torre-Amione G, J Am Coil Cardiol 27:1201- 1206 (1996) ] . Existe un crecimiento del cuerpo de evidencia que sugiere que los componentes de la cascada inflamatoria disparados por el enlace del TNF al receptor I y II del TNF (TNFR, p55, p75) , son directamente responsables por los efectos perjudiciales agudos observados en el miocardio [Oral, H., J Biol Chem. 272 (8) : 4836-4842 (1997); Kapadia, S., Am J. Physiol. 268 :H517-H525 (1995)]. Las citocinas inflamatorias, que incluyen el TNF han mostrado ser liberadas por los miocitos inmediatamente después del comienzo de la isquemia [Meldrum, D.R., J Mol Cell Cardiol. 30:1683-1689 (1998)] y se cree están expresión de las moléculas de adhesión que Son instrumenta es en la extravasación del neutrófilo. La trayectoria de la esfingomielinasa puede ser iniciada por la liberación del TNF, y es considerara la trayectoria de señalización predominante de la citocina [Kim et al., J Biol Chem 266:484-489 (1991); Dressler et al., Science 255:1715- 1718 (1992); Yang et al, J Biol Chem 268:20520-20523 (1993)]. Esta trayectoria se ha demostrado en miocitos cardiacos. [Oral et al., J Biol Chem 272:4836-4842 (1997)]. Las esfingomielinasas pueden ser activadas por el TNF para el rompimiento del enlace de membrana de esfingomielina a ceramida. En cambio, las ceramidasas endógenas catabolizan la ceramida a esfingosina. Tanto la ceramida como la esfingosina han mostrado poseer propiedades mensajeras secundarias. La esfingosina ha mostrado reducir la función cardiaca disminuyendo el calcio inducido por la liberación de calcio a partir del retículo sarcoplásmico, asi como también la habilidad para suprimir directamente la corriente de calcio de tipo L. Cain et al. [Crit Care Med. 27 (7) : 1309-1318 (1999) ] utiliza trabéculo atrial humano estimulado suspendido en las soluciones de órgano, y registra la fuerza desarrollada en el tejido generado. Las concentraciones graduadas del TNF-a, IL-lß o TNF-a + IL-lß se agregaron y funcionaron como se valoraron. Además, los tejidos se expusieron a N-oleoil etanolamina (NOE) antes del TNF-a o IL- lß. El TNF-a y IL-lß cada uno reduce una función miocardial humana en una forma dependiente de la concentración. La inhibición de la esfingosma miocardial por NOE abóle los efectos depresivos iocardiales de ya sea TNF-a o IL-lß. Los investigadores concluyen que el TNF-a y IL-lß de manera separada y sinergisticamente, reducen la función miocardial humana. La esfingosina probablemente participa en la señal TNF-alfa y IL-lbeta que conduce a la depresión funcional miocardial humana. La lesión celular también se ha demostrado en otros tejidos. Las células tubulares próximas del riñon humano adulto (HK-2), se cultivaron por 0-20 horas en la presencia o ausencia de esfingosina y metabolitos, asi como también ceramidas C2, C8 ó C16. La esfingosina (> ó =10 microM) , y ceramidas seleccionadas (C2 y C8), cada una inducen citotoxicidad dependiente de la concentración, rápida, en la ausencia de cambios morfológicos o escalerado de ADN de apoptosis, sugiriendo una forma necrótica de muerte celular. Los investigadores podrían reproducir los resultados en los fibroblastos del prepucio humano, sugiriendo relevancia de [Iwata et al., PNAS 92 (19) : 8970-8974 (1995)]. La ENBREL (etanercept; p75TNFR:Fc) es una proteina de fusión dimérica que consiste de la proteina de enlace al ligando extracelular del receptor del factor de necrosis del tumor (TNFR) humano de 75 kilodalton (p75) , ligada a la porción Fc del IgGl humano. La etanercept es una antagonista del TNFa actualmente comercializada para el tratamiento de artritis reumatoide, y está sometida a ensayos clínicos para el tratamiento de deficiencia cardiaca crónica [Bozkurt B, JACC (Suppl.) 184-185A (1999); Deswal A. Circulation (suppl) 96(8) : 1-323 (1997) ] . El documento WO 98/51344 describe el uso de un antagonista del TNFa en combinación con un antagonista VEGF para el tratamiento o prevención de padecimientos mediados por el TNF que incluyen artritis reumatoide, padecimiento de Crohn, y padecimientos inmunes crónicos y agudos asociados con el transplante.

Esta invención proporciona un método de tratamiento o inhibición de la lesión celular o muerte celular después de un evento isquémico el cual comprende proporcionar una cantidad efectiva de un antagonista del TNFa. Más particularmente, esta invención proporciona un método de tratamiento o inhibición de la lesión celular o muerte celular que resulta del infarto miocardial, isquemia miocardial, isquemia retinal, oclusión retinal central, oclusión arterial periférica (es decir, un embolismo) , ataques isquémicos temporales (es decir, ataques isquémicos ceberales) , choque isquémico, obstrucción arterial isquémica, lesión por reperfusión que resulta de congelamiento, trombosis arterial y oclusión, y traumatismo por aplastamiento proporcionando una cantidad efectiva de un antagonista del TNFa. Esta invención también proporciona un método para reducir la mortalidad después del infarto miocardial proporcionando una cantidad efectiva de un antagonista del TNFa. Esta invención adicionalmente proporciona un método para inhibir el daño cardiaco después de un evento isquémico cardiaco, proporcionando una cantidad efectiva de un antagonista del TNFa. Esta invención además proporciona un método de tratamiento o inhibición de la lesión por reperfusión proporcionando una cantidad efectiva de un antagonista del TNFa. Como se usa de conformidad con esta invención, el ¿áá iÁiliM proporcionar una cantidad efectiva de un antagonista del TNFa sugiere ya sea directamente administrar tal antagonista, o administrar un profármaco, derivado o análogo, el cual formará una cantidad efectiva del antagonista dentro del cuerpo . El término antagonista del TNFa se ha definido bien en el documento WO 98/51344, y es definido igual que disminuye, bloquea, inhibe, abroga, o interfiere con la actividad del TNFa in vivo. Por ejemplo, un antagonista del TNFa adecuado, puede enlazarse al TNFa e incluye anticuerpos anti-TNFa, fragmentos del mismo que se enlazan al antígeno, y moléculas receptoras y derivados los cuales se enlazan específicamente al TNFa. Un antagonista del TNFa adecuado puede también prevenir o inhibir la síntesis del TNFa y/o liberar TNFa e incluye compuestos tales como talidomida, tenidap e inhibidores de la fosfodiesterasa, tal como pero no limitado a pentoxifilina y rolipram. Un antagonista del TNFa adecuado puede prevenir o inhibir la síntesis del TNFa y/o la liberación del TNFa, también incluye mejoradores del receptor de adenosina A2b y agonistas del receptor de adenosina A2b (por ejemplo, 51- (N-ciclopropil) -carboxamidoadenosina, 51-N- etilcarboxamidoadenosina, ciclohexiladenosina y R-N6-fenil-2- . Véase por ejemplo, Jacobson, GB 2 289 218A.

Un a Antagonista del TNFa adecuado puede también prevenir o inhibir la señalización del receptor del TNFa e incluye inhibidores de la proteina cinasa activada por mitógeno (MAP) . Otros antagonistas del TNFa adecuados incluyen agentes los cuales disminuyen, bloquean, inhiben, abrogan o interfieren con el desdoblamiento del TNFa de la membrana tal como, pero no limitado a, inhibidores de la metaloproteinasa; agentes los cuales disminuyen, bloquean, inhiben, abrogan o interfieren con la actividad del TNFa, tal como, pero no limitado a, inhibidores de la enzima que convierte la angiotensina (ACE) , tal como captoprilo, enalaprilo y lisinoprilo; y agentes los cuales disminuyen, bloquean, inhiben, abrogan o interfieren con la producción y/o la síntesis del TNFa, tal como pero no limitado a, inhibidores de la cinasa MAP. Se prefiere que el antagonista del TNFa sea una molécula receptora del TNF que se enlaza al TNFa. Es más preferido que la molécula del receptor del TNF sea una proteina de fusión al fragmento/inmunoglobulina del receptor del TNF. Es todavia más preferido que la proteína de fusión comprenda un fragmento de TNFR y una porción de la región constante completa de una cadena pesada de inmunoglobulina humana . Un antagonista del TNFa particularmente preferido es la etanercept (p75TNFR: Fc) , la cual es una proteína de fusión dimérica que consiste de la proteína que se enlaza al ligando extracelular del receptor del factor necrosis del tumor (TNFR) humano de 75 kilodalton (p75) ligado a la porción Fc del IgGl humano. La etanercept es comercialmente disponible como ENBREL, y está actualmente aprobada para usarse en el tratamiento de artritis reumatoide. La etanercept puede ser preparada de conformidad con los procedimientos descritos en las Patentes Estadounidenses 5,605,690, 5,478,925, EP 464533, y EP670730, las cuales están con ello, incorporadas aquí por referencia. Otro antagonista del TNFa preferido es designado como p55TNFR:Fc, el cual es una proteína de fusión dimérica que consiste de la proteína que se enlaza al ligando extracelular del receptor del factor necrosis del tumor (TNFR) humano de 55 kilodalton (p55) , ligado a la porción Fc del IgGl humano. La producción de p55TNFR:Fc se describe en la Patente Estadounidense 5,610,279, la cual se incorpora por referencia. La habilidad de los antagonistas del TNFa para m tratar o inhibir la lesión celular o muerte celular después de un evento isquémico y para tratar o inhibir la lesión por reperfusión, se evaluó en dos procedimientos de prueba farmacológica estándar in vivo. El primer procedimiento evaluó los efectos del TNF y esfingosina en la función cardiaca, y el segundo procedimiento de prueba evaluó la supervivencia después de una oclusión de 30 minutos de la arteria coronaria principal seguida por reperfusión. El etanercept se evaluó como un antagonista del TNFa representativo en el segundo procedimiento de prueba el cual emula un infarto agudo miocardial. Un procedimiento de prueba farmacológica estándar in vivo también se realizó para evaluar el efecto cardiodepresivo de la esfingosina en miocitos. Los procedimientos usados y resultados obtenidos son descritos abajo.

Procedimientos Preparación quirúrgica. Ratas macho Sprague-Dawley que pesan 505+5 g, se anestesiaron con pentobarbital de sodio (50 mg/kg I.P). Un tubo endotraqueal se aseguró en su lugar y conectó a un respirador para animales pequeños (Aparato Harvard, Modelo 683, South Natick, MA) , fijo en 100 respiraciones/minuto, con un volumen de marea de 2-3 ' iifei*?í mL/respiración. La temperatura corporal se mantuvo usando un parche de calentamiento con agua caliente circulante (modelo K 100, Baxter Laboratories) . Se realizó una toracoto ía izquierda, el corazón se expuso y se removió el pericardio. La presión ventricular izquierda se midió usando un catéter de polietileno lleno con salina, unido a un angiocatéter (Medida 20) , insertado a través del ápex del corazón y conectado a un transductor de presión Statham/Gould P23 ID. La presión arterial se monitoreó vía un catéter de polietileno lleno con salina (PE 50) , introducido en la arteria carótida izquierda. La vena yugular derecha también se canuló con un catéter de polietileno (PE 50) para las infusiones del fármaco IV y repleción de volumen (NaCl al 0.9%). Las agujas subcutáneas se colocaron en los limbos para los registros ECG. Todas las salidas de datos se registraron en un registradora de serie Gould Modelo 6600 (Valley View, OH) , con un sistema de adquisición de datos Po-Ne-Mah (Valley, View, OH) , y se presentaron en una registradora de plataforma fisiológica CRS800W/CRS400W (General Scanning Inc., Bedford MA) . En el primer procedimiento de prueba, las ratas fueron preparadas quirúrgicamente (abiertas del tórax, pero sin oclusión) y se administró TNF, esfingomielina o por infusión i.v. lenta (0.1 mg/kg durante 5 minutos) . Cada animal se observó continuamente por 15 minutos, después de lo cual se administró una segunda dosis por infusión i.v. lenta (0.3 mg/kg durante 5 minutos) y cada animal fue nuevamente observado por 15 minutos. En el segundo procedimiento de prueba, la arteria coronaria principal de ratas sometida a oclusión coronaria se localizó y ocluyó cerca de su origen usando una sutura 0-5 pasada por debajo del recipiente que podrá ser apretado sobre una sección corta del entubado PE (PE 20) para iniciar la isquemia regional. La reperfusión se reinstaló removiendo el segmento corto del entubado PE. Determinación del tamaño de infarto. El corazón se removió y dividió en cinco a seis secciones coronarias, las cuales se sumergieron en cloruro de trifeniltetrazonio al 1% (TTC) por 10-15 minutos. Las secciones del corazón se removieron, mancharon en seco y trazaron en hojas de acetato.

Las áreas de infarto fueron claramente demarcadas por una apariencia pálida en la zona isquémica, y un ladrillo de color rojo de miocardio no infartado. Las áreas de todas las secciones se determinaron por métodos planimétricos y el área de infarto se expresó como porcentaje del ventrículo izquierdo.

Determinación del TNF en Suero de Rata. Las muestras de sangre se colectaron en jeringas en la ausencia de cualquier anticoagulante e inmediatamente se colocaron en tubos separadores de suero Microtainer® (Becton Dickinson) y centrifugaron a 2000 g por 6 minutos. El suero se removió, congeló inmediatamente y se almacenó a -20°C hasta que el análisis pudiera realizarse. La concentración del TNF del suero colectado a puntos de tiempo preseleccionados, se determinó para ratas individuales por ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA) ; utilizando el Factor de Prueba X (Genzyme Inc., Cambridge, M.A., Cat #80-3905-01) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 100 µL de suero se diluyó 1:2 en 0.1% de salina amortiguada con albúmina/fosfato de suero bovino y se agregó por duplicado en una placa microtituladora de 96 pocilios. Una curva estándar se generó trazando las concentraciones de los estándares del TNF de rata contra sus absorbencias. El fabricante del ensayo y la validación en laboratorio, han indicado que este ensayo es capaz de detectar tanto el TNF libre como TNF ligado al etanercept (datos no mostrados) . El límite de detección de este ensayo fue de 10 pg/ L. Adicionalmente, el fabricante ha determinado que este ensayo ELISA es altamente específico al TNF de rata. Las que alcanzaron 10d pg/ L de IFN-?, GRO-ß/MIP- 2, GRO/KC de rata, e interleucinas IL-lß, IL-2, y IL4, así como también LIF, SCF, GM-CSF de ratón, e interleucmas IL- la, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7 e IL-10, no proporcionaron reactividad cruzada detectable. Aislamiento del Miocito Ventricular. Los miocitos ventriculares se aislaron usando un procedimiento de perfusión Langendorff modificado resumido por Silver, et al., (13) . Brevemente, gatos de cualquier sexo, que pesan 2-4 kg se anestesiaron con pentobarbital sódico (40 mg/kg I.P.). Bajo anestesia, se realizó una esternotomía, el corazón rápidamente se escindió y después se sumergió en solución amortiguadora Krebs-Henseleit libre de Ca++ (KHB) a 4°C por canulación aórtica. El KHB tiene la siguiente composición (en mM) : 130 NaCl, 4.8 KCl, 1.2 MgS0, 1.2 NaH2P04, 25 NaHC03, 12.5 dextrosa. El pH de la solución fue de 7.35-7.40 cuando se equilibró con mezcla de gas al 95% de 02/5% de C02. La solución fue activamente aireada a través del procedimiento. E corazón canulado se enjuagó con KHB a 37°C por 2-4 minutos, seguido por perfusión por 12-15 minutos con KHB que contiene 0.7 mg/mL de colagenasa Tipo II (197 U/mg; Worthington; Freehold, NJ USA) . El tejido ventricular digerido fue entonces disectado del atrio, desmenuzado y filtrado a través de una malla de nailon de poro de 200 µm. Lo filtrado se centrifugó a 50 x por 1-2 minutos y la pelotilla celular separada se resuspendió en KHB fresco. El último proceso se realizó tres veces. En la tercera repetición, la pelotilla se resuspendió con KHB que contiene albúmina de suero bovino al 2% y 100 µM de Ca+A Las suspensión celular resultante se dividió en dos alícuotas. Una se diluyó 1:1 con solución de Tyrode (composición abajo) , mantenida a temperatura ambiente (19-25°C), y se usó para registros celulares dentro de 12 horas de aislamiento. La segunda alícuota se utilizó para las células de placa usadas para registros subsecuentes y se dispensó en una mezcla 1:1 de medio de cultivo DMEM/F-12 (Bio Whittaker, Walkersville, MD, USA) , suplementado con sulfato de estreptomicina (200 µg/mL) y sal sódica de penicilina G (200 unidades/mL) . Las células sometidas a placa se mantuvieron a temperatura ambiente en un incubador (pH = 7.2). El medio de suspensión se cambió cada dos días. Registro Electrofisiológico del Miocito. Se hicieron registros de corriente y voltaje Patch-clamp con la centrifugación celular completa de parche roto a 36-37 °C (14) . Para estudios en corrientes de Ca++ tipo L, las células se bañaron con Tyrode modificado que contiene (en mM) : 157 TEA-C1, 5 CaCl2/ 0.5 MgCl2, y HEPES 10. La solución interna electrodo contiene (en mM) : 10 de Acido Glutámico-L, 20 CsCl, 10 EGTA, 1 MgCl2, 1 CaCl2, HEPES 20, y 5 ATP-Mg2; el pH se ajustó con CsOH. En todos los estudios, la resistencia del electrodo se midió por ser 2-3.5 MO. El potencial de referencia cero se ajustó en el baño antes de formar sellos. Los registros se realizaron con un amplificador de Axon Instruments 2OOB (Axon Instruments, Culver City, CA USA) que intercara un sistema de adquisición de DigiData 1200 DA/DA. Las corrientes iónicas se evocaron despolarizando el paso de voltaje (2 seg de long) a partir de -30 hasta +60 mV, en incrementos de 10-m V, a partir de un potencial de mantenimiento de -40 V suministrado a una frecuencia de 1 Hz. Los potenciales de acción se estimularon a una frecuencia de 1 Hz por inyección de los pulsos breves de corriente despolarizada. El software usado en la adquisición de datos y análisis fue pClamp v6.04 y Origin v 5.0 (Microcal Software, Northampton, M.A) .

Resultados Parámetros Hemodinámicos en Ratas No Ocluidas. La siguiente tabla muestra los efectos de esfingosina, esfingomielina y TNF en los siguientes parámetros hemodinámicos en tórax abiertos de ratas en la ausencia de isquemia miocardial: frecuencia cardiaca, presión sanguínea media, presión sanguínea ventricular izquierda (LVL) y su primer derivado (+dP/dt) .

Parámetros cardiovasculares medidos en tórax abiertos de ratas en la ausencia de isquemia miocardial GRUPOS Frecuencia Media LVPdev +dP/dt cardiaca BP TNFa de rata 0.1 mg/kg iv -3+1 4+7 1+ 4 10+5 (n=5) + 0.3 mg/kg iv -3+2 4+6 -1+3 9+8 Esfingomielina 0.1 mg/kg iv 7+9 -3+17 3+11 1+13 (n=4) + 0.3 mg/kg iv 8+ 10 2+2 4+12 6+15 Esfingosina 0.3 mg/kg ív -4+4 -24+12 24+ 8* -33+12* (n=4) + 1.0 mg/kg ív -18+1* -17+19 24+14 -32+18* Los datos son expresados como media + sem. Los datos son porcentajes de cambios a partir de la línea base del pre-fármaco 15 minutos después de la administración del fármaco. * indica p<0.05 contra otros grupos de pretratamiento sobre el periodo de observación completo.

Los resultados de este procedimiento de prueba que después de la infusión de la esfingosina (0.1 + 0.3 mg/kg), la función miocardial completa fue significantemente reducida: LVP fue reducido por 24 + 8% y +dP/dt se redujo 33+12% a partir de la línea base. La dosis del TNF que se administró exanguineamente a las ratas en éste procedimiento de prueba resultó en concentraciones de suero dos veces superior que el Cmax del TNF generado endógenamente después de la isquemia miocardial. Sin embargo, aún cada una de las concentraciones de suero muy altas de TNF caen para producir cardiodepresión aguda en la ausencia de una respuesta inflamatoria, la cual es necesaria para la iniciación de la cascada esgfingolípida. En la ausencia de la lesión del miocito, uno no podrá esperar la administración de esfingomielina para reducir la función puesto que las esfingomielinasas de la membrana no podrían haber sido estimuladas por concentraciones incrementadas de TNF para degradar la esfingomielina a ceramida, el metabolito previamente mostrado para disminuir la contractilidad en iocitos aislados. Efectos de Esfingosina en Miocitos Aislados: Para evaluar además los efectos de la esfingosina en la función cardiaca y la lesión celular, se aislaron miocitos aislados y los efectos de esfingosina en corrientes de calcio se midieron como se describe anteriormente. Estudios previos han demostrado que la esfingosina puede efectuar la electrogénesis de la acción potencial disminuyendo la liberación de Ca+2 a partir del retículo sarcoplásmico [Yasui, et al. Am J. Physi ol . 270:C645-C649 (1996); MacDonell, et al. Am J Physiol . 275: H2291-H2299 (1998)]. Los resultados obtenidos en el procedimiento de prueba farmacológico estándar descrito anteriormente, muestran que la esfingosina acorta la duración del potencial de acción (APD) de los miocitos ventriculares de felino aislados de una manera dependiente de la concentración, con 0.25, 2.5 y 25 µM de esfingosina que reduce la duración al 95% de la repolarización completa (APD95) por 16+2%, 28+2% y 39+2% (n=4), respectivamente. El acortamiento del APD fue mayormente el resultado de una disminución de la fase estabilizada. La corriente Ca+2 (Ica-L) fue aislada suprimiendo otras corrientes K+ usando CsA un bloqueador de corrientes KA en tanto la solución externa como en la pipeta. La corriente Na+ rápida (INa) se eliminó manteniendo los miocítos a -40 V, un potencial donde (INa) es ampliamente inactivado, y substituyendo NaCl con TEA-C1 en la solución externa. La exposición de esfingosina (2.5 y 2.5 µM) causa un bloque significante de Ica-L (17+7 y 75+4% de bloque a 25 µM) . El acortamiento del potencial de acción cardiaca y reducción en la corriente Ca+2 hacia el centro, podrá esperarse se correlacione con los cambios inotrópicos negativos vistos directamente después de la administración sistémica o, indirectamente, después de la activación de TNFR1.

Finalmente, la esfingosina (25 µM) conduce a la muerte celular miocardial valorada por su morfología resultante y carente de viabilidad poco después de la exposición de la esfingosina a la concentración más alta. El tratamiento de miocitos con TNF (200-20,000 U/ml) no altera el potencial de acción o ICa+2-L. Niveles de TNF en Ratas Ocluidas. Como se describe anteriormente, las ratas fueron quirúrgicamente preparadas y la arteria coronaria se ocluyó. La siguiente tabla muestra la concentración de suero de TNF en tórax abiertos de ratas que se someten a isquemia miocardial.

GRUPOS Vehículos Etanercept -30 min 0+0 0+0 0 min 6056+925 2299+357* 30 min 2122+371 2057+349 60 min 740+153 1592+258* 90 min 585+112 1108+279* 120 min 338+44 721+209 150 min 204+7 580+193* Los datos son expresados como media + sem en unidades de pg/ml . * indica p<0.05 contra el grupo de tratamiento de vehículo en el punto de tiempo indicado. Línea Base = -30 min, Final de la Isquemia = 0 min, y Reperfusión = 30, 60, 90 ... min.

En este procedimiento de prueba, ratas que tienen sus tórax quirúrgicamente abiertos, pero no tienen alguna oclusión inducida (animales falsamente operados) tienen una concentración de TNFa estable a través de la duración del procedimiento, con una concentración máxima de 242+90 pg/ L. Estos datos muestran que la oclusión vascular produce niveles bastamente incrementados de TNFa, el cual se maximiza en la conclusión del periodo isquémico. Los resultados también muestran que el etanercept reduce significantemente las puntas de TNFa masivas en la concentración en respuesta a la oclusión vascular a 0 minutos. Efecto del Tratamiento Antagonista de TNFa en Mortalidad en Ratas Ocluidas. El porcentaje de supervivencia después de la isquemia/reperfusión también se evaluó en este g|fig m^ ^íyL ^g*g|!= ^^¿^^jjE de prueba. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla abajo.

Porcentaje de supervivencia de tórax abiertos de ratas que se someten a isquemia/reperfusión miocardial en la presencia o ausencia de etanercept (3 mg/kg iv) .

GRUPOS Vehículos Etanercept -30 min 100 100 0 min 100 100 30 min 86 100 60 mm 66 100 90 min 50 89 120 min 33 89 150 min 17 89* Los datos se expresan como porcentaje de supervivencia. * indica p<0.05 contra el grupo de tratamiento con vehículo en el punto de tiempo indicado. Línea Base = -30 min, Final de la Isquemia = 0 min, y Reperfusión = 30, 60, 90 ... mm. En este procedimiento de prueba farmacológica estándar, el etanercept (3 mg/kg i.v.) administrado inmediatamente antes de la oclusión, reduce significantemente íocardial. Durante las últimas etapas de reperfusión (t= 0 minutos) una diferencia comienza a emerger con respecto a la mortalidad total. Por ejemplo, 4 de 9 ratas murieron a t=90 minutos en el grupo tratado con vehículo, comparado con 1 de 9 en el grupo tratado con etanercept, aunque la diferencia falló al lograr significancia estadística (p=0.08). La diferencia entre el etanercept y grupos de control de vehículo lograron diferencia estadística a 120 y 150 minutos de reperfusión. De las siete muertes observadas en el grupo tratado con vehículo, seis fueron debido a la insuficiencia aguda de bombeo y bradicardia progresiva, y un animal murió de arritmias ventriculares tempranamente después de la reperfusión. Las dos muertes en el grupo tratado con etanercept fueron ambas debidas a la bradicardia e insuficiencia de bombeo. El tamaño del infarto, expresado como un porcentaje del ventrículo izquierdo, fue 24+3% para Etanercept y 26+2% para el grupo de control de vehículo, mostrando que la diferencia de supervivencia no fue el resultado del tamaño desigual del infarto. Estos resultados demuestran que el tratamiento con un antagonista de TNFa que reduce la mortalidad que resulta de la isquemia/reperfusión miocardial, presumiblemente previniendo la cascada que genera la esfingosina a partir de la esfingomielina la cual sigue al enlace del TNFa al TNFR1 en respuesta a la lesión isquémica/reperfusión. Basados en los resultados obtenidos en los procedimientos de pruebas farmacológicas estándares descritos anteriormente, los antagonistas del TNFa son útiles en la reducción de la mortalidad después del infarto miocardial. Basados en los resultados obtenidos, los antagonistas del TNFa son también empleados en el tratamiento o inhibición de la lesión celular o muerte celular después de un evento isquémico. Más particularmente, esta invención proporciona un método de tratamiento o inhibición de la lesión celular o muerte celular que resulta del infarto miocardial, isquemia miocardial, isquemia retinal, oclusión retinal central, oclusión arterial periférica (es decir, un embolismo) , ataques isquémicos temporales (es decir, ataques isquémicos ceberales), choque isquémico, obstrucción arterial isquémica, lesión por reperfusión que resulta de congelamiento, trombosis arterial y oclusión, y traumatismo por aplastamiento. Esta invención también es empleada en el tratamiento o inhibición de la lesión por reperfusión. El tratamiento con un antagonista del TNFa también será empleado previo a o durante procedimientos los cuales involucran eventos isquémicos seguidos por reperfusión, tal como cirugía de transplante, cuando el donador del órgano se somete a un periodo de isquemia, y después es sometido a reperfusión por el suministro de sangre a los recipientes; angioplastía o colocación de pinzas quirúrgicas de sujeción coronaria; terapia trombolítica; reemplazo de válvula cardiaca; y cirugía bypass o de derivación. Los antagonistas del TNFa pueden ser formulados puros o pueden ser combinados con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables para la administración de conformidad con el método estándar para la formulación de agentes farmacéuticos. Las rutas de administración incluyen oral, parenteral (que incluye, por ejemplo, intravenosa, inyección intramuscular, inyección subcutánea) , intranasal, intraperitoneal, rectal, vaginal y transdérmica. Las rutas de administración varían con la naturaleza del antagonista de TNFa y razón de administración. Por ejemplo, en donde el antagonista TNFa rápidamente se degrada en el intestino, la administración se hace preferiblemente de manera parenteral. Es preferible proporcionar etanercept intravenosamente para el tratamiento o inhibición de la lesión celular o muerte celular después de un evento isquémico, debido a la ^^^^^^TltlÉrfiirlíftf naturaleza inestable acida del etanercept y la necesidad para el comienzo rápido de acción. Cuando el antagonista TNFa es proporcionado oralmente, puede proporcionarse en tales formas como tabletas, cápsulas, polvos dispersables, granulos o suspensiones que contienen por ejemplo, desde aproximadamente 0.05 hasta 5% del agente de suspensión, jarabes que contienen por ejemplo, desde aproximadamente 10 hasta 50% de azúcar, y elíxires que contienen por ejemplo, desde aproximadamente 20 hasta 50% de etanol y similares, o parenteralmente en la forma de solución estéril inyectable o suspensión que contiene desde aproximadamente 0.05 hasta 5% de agente de suspensión en un medio isotónico. Tales preparaciones farmacéuticas pueden contener por ejemplo, desde aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 90% del ingrediente activo en combinación con en portador, más usualmente entre aproximadamente 5% y 60% en peso. La formulación para administración de tableta o cápsula puede incluir portadores sólidos que incluyen almidón, lactosa, fosfato dicálcico, celulosa microcristalma, sucrosa y caolina, mientras los portadores líquidos incluyen agua estéril, polietilenglicoles, tensioactivos no iónicos y aceites comestibles tales como - aceite de maíz, cacaMuate y de sésamo, en tanto sean apropiados a la naturalezaí-del ingrediente activo y la forma particular de administración deseada. Los adyuvantes cotidianamente empleados en la preparación de composiciones farmacéuticas pueden ser ventajosamente incluidos, tales como agentes saborizantes, agentes colorantes, agentes de preservación y antioxidantes, por ejemplo, vitamina E, ácido ascórbico, BHT y BHA. Cuando el antagonista de TNFa es administrado parenteralmente o intraperitonealmente, soluciones o suspensiones de estos compuestos activos como una base libre o sal farmacológicamente aceptable pueden ser preparadas en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo tal como hidroxi-propilcelulosa. Las dispersiones pueden también ser preparadas en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un preservativo para prevenir el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida a la Á&^^^8^&á ^^^U^^ L. que fácilmente exista fácil habilidad con las jeringas. Deber ser estable bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento y debe ser preservada contra la acción de contaminación de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un medio solvente o de dispersión que contiene por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido) , mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. El etanercept, por ejemplo es comercialmente disponible como un polvo liofilizado, libre de preservativo, blanco, para administración parenteral después de la reconstitución con agua. Se anticipa que la dosificación del antagonista del TNFa variará de conformidad con la naturaleza del antagonista TNFa, la razón para la administración y terapia individual que recibe el paciente. Para terapia crónica, se recomienda de manera general, que el tratamiento comience con la dosis efectiva más baja, con los ajustes de dosificación haciéndose a través del monitoreo del especialista.. Para el tratamiento con etanercept, las dosificaciones intravenosas proyectadas podrán ser entre 0.05 - 25 mg/kg de etanercept. Se contempla que el antagonista del TNFa puede ser administrada en una dosis o varias dosis en respuesta a un evento isquémico particular, o puede ser administrada crónicamente para inhibir el daño o muerte celular en repuesta a los futuros eventos isquémicos. Por ejemplo, se anticipa que un antagonista del TNFa puede ser administrado crónicamente a un paciente que sufre de eventos isquémicos temporales, los cuales a menudo ocurren después de periodos prolongados de tiempo. Alternativamente, se contempla también que el antagonista de TNFa puede ser administrado profilácticamente en situaciones en donde se anticipa que un evento isquémico ocurrirá (por ejemplo, previo a un procedimiento de transplante o procedimiento de angioplastía.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método de tratamiento o inhibición de la lesión celular o inhibición de la muerte celular después de un evento isquémico en un mamífero en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende proporcionar una cantidad efectiva de un antagonista del TNFa al mamífero.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la lesión o muerte celular resulta de infarto miocardial, isquemia miocardial, isquemia retinal, oclusión retinal central, oclusión arterial periférica, ataques isquémicos temporales, choque isquémico, obstrucción arterial isquémica, congelamiento, trombosis arterial y oclusión, o traumatismo por aplastamiento.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista del TNFa es una proteína de fusión al receptor/inmunoglobulina TNF.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el antagonista del TNFa comprende un fragmento de TNFR y una porción o la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el antagonista del TNFa es etanercept.

6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el antagonista del TNFa es p55TNFR:Fc.

7. Un método de tratamiento o inhibición de la lesión por reperfusión en un mamífero en necesidad del mismo, caracterizado porque comprenden proporcionar una cantidad efectiva de un antagonista del TNFa al mamífero.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la lesión resulta de cirugía de transplante, angioplastía, colocación de pinzas de sujeción coronarias, terapia trombolítica, reemplazo de la válvula cardiaca o cirugía por bypass o derivación.

9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el antagonista del TNFa es una proteína de fusión al receptor/inmunoglobulina TNF.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el antagonista del TNFa comprende un fragmento de TNFR y una porción de la región constante completa de una cadena pesada de inmunoglobulina humana.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el antagonista del TNFa es etanercept.

12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el antagonista es p55TNFR:Fc.

13. Un método para reducir la mortalidad después de un infarto miocardial en un mamífero en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende proporcionar una cantidad efectiva de un antagonista del TNFa al mamífero.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el antagonista del TNFa es una proteína de fusión al receptor/inmunoglobulma TNF.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el antagonista del TNFa comprende un fragmento de TNFR y una porción o la región constante completa de una cadena pesada de inmunoglobulina humana.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el antagonista del TNFa es etanercept.

17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el antagonista del TNFa es

18. El uso de un antagonista del TNFa en la manufactura de un medicamento para prevenir, tratar o inhibir la lesión celular o muerte celular debida a un evento 5 isquémico.

19. El uso de un antagonista del TNFa en la manufactura de un medicamento para prevenir, tratar o inhibir la lesión por reperfusión.

20. El uso de un antagonista del TNFa en la 10 manufactura de un medicamento para reducir la mortalidad después de un infarto miocardial.-

21. Un uso como se reivindica en la reivindicación 18, en donde la lesión o muerte celular resulta de infarto miocardial, isquemia miocardial, isquemia retinal, oclusión 15 retmal central, oclusión arterial periférica, ataques isquémicos temporales, choque isquémico, obstrucción arterial isquémica, congelamiento, trombosis arterial y oclusión, o traumatismo por aplastamiento.

22. Un uso como se reivindica en cualquiera de las 20 reivindicaciones 18 a 21, en donde el antagonista del TNFa es una proteína de fusión al receptor/inmunoglobulina del TNF.

23. Un uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 en donde el antagonista del TNFoíA comprende un fragmento de TNFR y una porción o la región constante completa de una cadena pesada de inmunoglobulma humana .

24. Un uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en donde el antagonista del TNFa es etanercept.