TW201803593A - 高純度及優良產量之正確折疊之恩博（etanercept） - Google Patents

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Abstract

本發明揭示分離特定蛋白質之正確摺疊構型與不正確摺疊構型的混合模式層析方法。該方法高度有效地分離正確摺疊之恩博(etanercept)與不正確摺疊之恩博及聚集物，以具有商業吸引力之產量能夠提供具有極高純度之正確摺疊之恩博對不正確摺疊之恩博之恩博製劑。本發明進一步係關於包括使用本發明方法所獲得正確摺疊蛋白質之蛋白質製劑及調配物，以及使用自該混合模式方法獲得之高純度製劑治療的方法。

Description

高純度及優良產量之正確折疊之恩博（ETANERCEPT）
本發明概言之係關於純化重組表現蛋白之層析分離方法及自該等方法獲得之產物。更特定而言，其係關於混合模式層析在純化重組蛋白表現產物(包含(例如)可包含不期望量之不正確摺疊及/或聚集蛋白以及適當摺疊之蛋白質之融合蛋白)中之用途。本發明之混合模式層析方法尤其可用於分離正確摺疊之恩博(etanercept)與不正確摺疊之恩博(如本文中所定義)。本發明亦係關於恩博製劑及醫藥調配物，其中以高產量及高純度使用所揭示方法產生其中所供應之恩博。本發明進一步係關於採用特徵在於顯著較低含量之錯誤摺疊/聚集蛋白之高度純化恩博治療TNF病狀之方法。
恩博(Enbrel® ，由Immunex公司製造)係二聚融合多肽，其由連接至人類免疫球蛋白G之Fc受體[片段，可結晶]區(「IgG1」)之人類75千道爾頓(kilodalton) (p75)腫瘤壞死因子受體(「TNFR」)之細胞外配體結合部分組成。恩博由934個胺基酸組成且具有大約150千道爾頓之表觀分子量(Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company公司)。恩博之Fc組份含有人類IgG1之恆定重鏈2 (CH2)結構域、恆定重鏈3 (CH3)結構域及鉸鏈區，但不含恆定重鏈1 (CH1)結構域。Fc結構域可含有一個或所有上述結構域。 患有一些類型之發炎性疾病(例如類風濕性關節炎、斑塊狀牛皮癬、牛皮癬性關節炎、幼年型特發性關節炎及強直性脊柱炎)者具有過度產生腫瘤壞死因子(「TNF」)之免疫系統。已發現，投與恩博有效用於治療一些發炎性疾病，此乃因其可藉由結合至TNF (作為誘餌受體)來減小個體中TNF之活性形式之含量。 恩博可以已知方式藉由重組DNA技術在中國卵巢倉鼠(Chinese hamster ovary，「CHO」)哺乳動物細胞表現系統中產生。令人遺憾的是，藉由CHO細胞產生之產物含有大量不正確摺疊或錯誤摺疊及/或聚集恩博。對於醫藥應用而言，期望提供相對不含不正確摺疊及聚集蛋白之恩博，此乃因不正確摺疊/聚集蛋白並不具有與正確摺疊之蛋白質相同之治療效應，且可實際上對患者有害。 錯誤摺疊及聚集通常發生於產生重組蛋白期間，且由此必須經由能夠分離正確摺疊之蛋白質與錯誤摺疊或聚集蛋白之下游過程來解決。錯誤摺疊減小或消除了蛋白質之治療效應。聚集通常理解為涉及兩種或更多種恩博同源二聚體發生非共價締合而形成極高分子量物質，其導致治療效應之類似損失，且發生於蛋白質(包含錯誤摺疊之蛋白質)積累及凝聚在一起時。如上所述，該等錯誤摺疊之蛋白質及蛋白質聚集物不僅在治療上無效，且亦可對患者有害。因此，為獲得提供最高可能醫藥接受程度之恩博，重要的是能夠純化含有恩博之蛋白質表現產物，從而將適當摺疊之恩博與錯誤摺疊及/或聚集恩博分離。 產生錯誤摺疊及聚集蛋白並非恩博之專有問題。許多治療蛋白可具有錯誤摺疊問題。舉例而言，含有二硫化物之蛋白質在自大腸桿菌(Escherichia coli )包涵體再摺疊重組蛋白期間難以避免發生錯誤摺疊，但可藉由反相層析以高解析度有效分離。然而，在反相層析中使用低pH及有機溶劑可使蛋白質變性且可導致經純化蛋白在層析期間發生聚集。 即使在產生醫藥蛋白期間認為錯誤摺疊可忽略時(例如在哺乳動物分泌表現之情形下)，聚集及一些錯誤摺疊仍可發生(例如參見Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W.及Carpenter, J. F.,Physical Stability of Proteins in Aqueous Solution: Mechanism and Driving Forces in Nonnative Protein Aggregation , Pharm. Res., 20, 1325-1336 (2003)；Kiese, S., Pappenberger, A., Friess, W.及Mahler, H. C.,Shaken, Not Stirred: Mechanical Stress Testing of an IgG1 Antibody , J. Pharm. Sci., 97, 4347-4366 (2008))。研究者已成功地在非變性條件下使用水性層析採用以下方法分離出錯誤摺疊之非原始蛋白：離子交換(「IEC」) (例如參見Gagnon, P. J.,Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography in the Presence of Polyethylene Glycol , Immunol. Methods, 336, 222-228 (2008)；Gagnon, P.,Purification Tools for Monoclonal Antibodies , Validated Biosystems, Tucson, AZ, 57-87 (1996)；Shukla, A. A.及Yigzaw, Y.,Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry , Shukla, A., Etzel, M.及Gadam, S.編輯，179-227, CRC Press, Boca Raton (2007)；Staby, A., Jacobsen, J. H., Hansen, R. G., Bruus, U. K., Jensen, I. H.,Comparison of Chromatographic Ion-exchange Resins. V. Strong and Weak Cation-Exchange Resins , J.Chromatogr. A, 1118, 168-179 (2006)；Shukla, A. A., Hubbard, B., Tressel, T., Guhan, S., Low, D. J.,Downstream Processing of Monoclonal Antibodies-Application of Platform Approaches ,Chromatogr. B, 848, 28-39 (2007)；Shihara, T., Kadoya, T. J.,Accelerated Purification Process Development of Monoclonal Antibodies for Shortening Time to Clinic: Design and Case Study of Chromatography Processes , Chromatogr. A, 1176, 149-156 (2007)；Fahrner, R. L., Knudsen, H. L., Basey, C. D., Galan, W., Feuerhelm, D., Vanderlaan, M., Blank, G. S.,Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies: Development, Operation, and Validation of Chromatography Processes , Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 18, 301-27 (2001)；及Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A.及Vedantham, G.,Ion Exchange Chromatography of Proteins and Clearance of Aggregates , Curr. Pharm. Biotech., 10, 421-426 (2009))、疏水性相互作用(「HIC」) (例如參見Chen, J., Tetrault, J., Ley, A.,Comparison of Standard and New Generation Hydrophobic Interaction Chromatography Resins in the Monoclonal Antibody Purification Process , J. Chromatogr. A., 1177, 272-81 (2008)；Gagnon, P.及Grund, E.,Large Scale Process Development for Hydrophobic Interaction Chromatography ， 第 4 部分 ： Controlling Selectivity , BioPharm, 9, 54-64 (1996)；及Lu, Y., Williamson, B.及Gillespie, R.,Recent Advancement in Application of Hydrophobic Interaction Chromatography for Aggregate Removal in Industrial Purification Process , Curr. Pharm. Biotech., 10, 427-33 (2009))及羥基磷灰石(「HA」)層析(例如參見Aoyama, K., Chiba, J.,Separation of Molecular Forms of Mouse IgG and IgM Monoclonal Antibodies in High Performance Liquid Chromatography on Spherical Hydroxyapatite Beads , J. Immunol. Methods, 162, 201-210 (1993)；Luellau, E., Marison, W., von Stockar, U.,Ceramic Hydroxapatite: A New Tool for Separation and Analysis of IgA Monocolonal Antibodies, in Animal Cell Technology, Carondo, M.編輯，Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 265-269 (1997)；Luellau, E., von Stockar, U., Vogt, S., Freitag, R.,Development of a Downstream Process for the Isolation and Separation of Monoclonal Immunoglobulin A Monomer, Dimers, and Polymers from Cell Culture Supernatant , J. Chomatogr. A., 796, 165-175 (1998)；Yamakawa, Y., Chiba, J.,High Performance Liquid Chromatography of Mouse Monoclonal Antibodies on Spherical Hydroxyapatite Beads , J. Liquid. Chromatogr., 11, 665-681 (1998)；Coppola, G., Underwood, J., Cartwright, G., Hearn, M. T.,High-performance Liquid Chromatography of Amino Acids, Peptides and Proteins: XCIII. Comparison of Methods for the Purification of Mouse Monoclonal Immunoglobulin M Autoantibodies, J. Chromatogr. A., 476, 269-290 (1989)；Josics, D., Loster, K., Kuhl, R., Noll, F., Reusch, J.,Purification of Monoclonal Antibodies by Hydroxylapatite HPLC and Size Exclusion HPLC , Biol. Chem. Hoppe-Seylars, 372, 149-156 (1991)；Gagnon,P.及Beam, K.,Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography , Curr. Pharm. Biotech. (2008))。 已證實，先前教示內容(例如彼等在上文提及者)不可應用於分離正確摺疊之恩博與不正確摺疊之恩博，其中其不能定性及/或定量提供合適試樣。因此，業內需要用於CHO細胞產生之恩博之有效及高效分離技術，其能夠提供極高純度(亦即其中不正確摺疊之恩博不存在或以極低含量存在)及具有商業吸引力之產量之恩博製劑。 本發明採用所謂的「混合模式」層析。在利用至少兩種不同力來結合蛋白質並分離期望蛋白質產物與不期望材料(其可存在於含有期望蛋白質以及不期望雜質之相對不純表現產物中)時，純化重組表現蛋白之層析方法通常可稱為「混合模式」。該等力可包含(例如)靜電力及疏水性力。 混合模式層析以類似於存在固定相及流動相之較傳統層析技術之方式進行運作。固定相通常係不溶性樹脂或凝膠(通常稱為層析樹脂)，其提供分離之基礎。樹脂含於管柱中以容許液體通過並與樹脂接觸。可藉由存在偶聯至樹脂之所選化學基團或部分來使得層析樹脂能夠分離期望材料與不期望材料。該等偶聯基團(通常稱為配體)賦予樹脂所需親和性質(亦即源自存在於配體中之離子交換部分之靜電吸引性質，及源自存在於配體中之疏水性部分之疏水性吸引性質)，由此使得在使含有不純試樣之溶液流經與樹脂接觸之層析管柱時樹脂能夠結合至不純試樣中之一些蛋白質材料而並不結合其他材料。 將層析管柱中含有具有該等親和基團之樹脂之固定相堆積於層析管柱內側，該層析管柱通常係剛性圓柱形器皿，流體可在其一端引入，與樹脂接觸，且然後在相對端離開管柱。可藉由以下方式將含有擬純化蛋白之溶液引入(且由此流經)管柱中：將蛋白質產物置入適當溶液中且使溶液(稱為流動相)行進穿過管柱。在將擬純化蛋白質產物(產物分析物)呈現至流動相中之管柱時，其在管柱與流動相之間達到平衡狀態，從而意味著蛋白質溶液中之一些材料將附接、結合或附至管柱樹脂上之親和基團或由其捕獲，而產物中之剩餘材料部分並不附接至管柱，而是流經且離開管柱，其中可收集該部分用於分析，進一步處理，或可將其棄除。 在蛋白質分析物以上述方式結合至管柱後，然後使用洗滌步驟(通常稱為洗脫步驟)自管柱洗脫或釋放所結合分析物。端視存在於樹脂上以使分析物結合至管柱之親和配體類型(例如基於電荷之部分或疏水性部分或其組合等)，用於自管柱洗脫或釋放分析物之溶液必須對分析物及/或配體具有可克服分析物與樹脂之親和力或吸引力之親和力或吸引力(例如電荷性質、疏水性性質、pH性質、鹽濃度等)，由此使得分析物自樹脂(上文所提及之固定相)釋放且進入洗脫介質(流動相)中。在釋放或洗脫至流動相中後，分析物然後可流經且離開層析管柱以用於最後收集、分析等或轉移用於進一步純化方法或過濾步驟。可理解，不論吸引性質抑或親和性質皆使得分析物結合至層析樹脂(例如電荷性質或疏水性性質)，隨後用於洗脫或釋放分析物之流動相溶液必須具有一組競爭性質，從而分析物然後「優先」進入洗脫介質中而非仍捕獲於管柱樹脂上。 與其他單一模式層析技術相比，所謂的混合模式層析之獨特之處在於，各種結合及洗脫因子可相互獨立且可彼此相對抗。舉例而言，在分析物之帶電特性較管柱樹脂吸引力對於洗脫介質具有較強吸引力(偏好)時，增加傳統單一模式離子交換層析中流動相之離子強度可驅動結合樹脂之分析物之洗脫或釋放。然而，在層析樹脂使用靜電吸引以及疏水性吸引結合分析物之混合模式層析方法中，增加流動(洗脫)相之離子強度可驅動試樣材料自管柱之釋放(基於材料之電荷性質)，而同時驅動或加強分析物中之疏水性材料之結合，此乃因該等疏水性蛋白質材料在帶電基洗脫介質存在下則往往較洗脫介質之帶電環境對於結合至管柱之疏水性配體具有較強吸引力或偏好。因此，儘管增加鹽濃度可實際上驅動自固定相置換帶電蛋白質材料之趨勢(在流動相中之帶電離子與蛋白質競爭固定相上之結合位點時)，但分析物產物混合物中可展現較高程度疏水性特徵之彼等部分可能會更加傾向於保持結合至混合模式層析管柱之疏水性部分上。人們認為幾乎不可預測在任一給定蛋白質分離情況中利用該等現象之能力。 混合模式樹脂之兩種實例係CaptoTM MMC及CaptoTM Adhere (可自GE Healthcare獲得)。CaptoTM MMC利用附接至固體載體基質且可與分析物藉由陽離子交換(與其羧酸基團)、氫鍵結及疏水性相互作用來相互作用之配體。CaptoTM MMC配體圖解說明於下文中：
Figure TW201803593AD00001
CaptoTM Adhere類似於CaptoTM MMC，其中其亦採用附接至固體載體基質之配體。配體N-苄基-N-甲基乙醇胺亦與分析物藉由陽離子交換、氫鍵結及疏水性相互作用來相互作用。CaptoTM Adhere配體圖解說明於下文中：
Figure TW201803593AD00002
在兩種配體中，疏水性相互作用預計較弱。因此，若該等配體僅具有疏水性部分(無電荷)，則其最可能需要鹽析(蛋白質沈澱)條件以用於蛋白質結合。然而，具有靜電相互作用可使該弱疏水性相互作用足以提供額外結合力。
本發明係基於以下發現：可採用混合模式層析(例如使用CaptoTM MMC及CaptoTM Adhere作為混合模式層析樹脂)純化包括正確摺疊及不正確摺疊之蛋白質之混合物(包含(例如)包括正確摺疊及不正確摺疊之恩博之蛋白質混合物)之分析物，藉此可以高效方式及優良產量將正確摺疊之蛋白質與不正確或錯誤摺疊之蛋白質高效分離，從而獲得極高度富含正確摺疊之期望蛋白質之蛋白質製劑。另外，本發明涵蓋以以下方式實踐本文所闡述混合模式層析分離之能力：自層析分離獲得可(若期望)不含或基本上不含不正確摺疊之產物之洗脫產物，但可理解，出於平衡產量及純度之目的，可發現，可接受地包含極低含量之不正確摺疊之產物(例如小於5 wt%且較佳地小於3 wt%)以將產量最大化至期望程度。 因此，在第一實施例中，本發明係分離正確摺疊之蛋白質與不正確摺疊之蛋白質之混合模式層析方法，其包括以下步驟：(a)使包括給定蛋白質之正確摺疊及不正確摺疊之構型之第一蛋白質混合物結合至具有離子交換部分及疏水性部分二者的混合模式層析樹脂；(b)自混合模式樹脂洗脫正確摺疊之蛋白質以獲得較第一蛋白質混合物包括較高比例正確摺疊之蛋白質之第二蛋白質混合物。術語「較高比例」意指步驟(b)洗脫物中正確摺疊之蛋白質對不正確摺疊之蛋白質之比率至少大於1:1，但最佳地大於約8:2，且較佳地大於約9:1。第二蛋白質混合物最佳地以構成第二蛋白質混合物之至少約95 wt%之量含有正確摺疊之蛋白質。 在第二實施例中，該方法係關於純化蛋白質混合物以分離該混合物中存在之正確摺疊之恩博與不正確摺疊之恩博的混合模式層析方法，該方法包括以下步驟：(a)使具有疏水性部分及離子交換部分之混合模式層析樹脂與含有包括正確摺疊之恩博及不正確摺疊之恩博之蛋白質混合物的溶液接觸，從而正確及不正確摺疊之恩博二者皆附至、結合至或捕獲於混合模式層析樹脂上；及(b)使混合模式樹脂與能夠自混合模式層析樹脂洗脫恩博蛋白之溶液接觸以獲得洗脫物，在該洗脫物中正確摺疊之恩博對不正確摺疊之恩博之量的比率較大，且較佳地遠大於在步驟(a)中引入樹脂中之蛋白質混合物。 在第三實施例中，本發明係關於根據上述方法實施例獲得之含有恩博之蛋白質混合物或包括該混合物之醫藥上可接受之調配物，且其中該蛋白質混合物以構成蛋白質混合物之大於約90 wt.%之量包括正確摺疊之恩博；且以構成蛋白質混合物之小於約5 wt%之量包括不正確摺疊之恩博；且其中蛋白質混合物中正確摺疊及不正確摺疊之恩博之組合量構成含有恩博之蛋白質混合物的至少約95 wt.%且較佳地至少約98 wt.%。可使用疏水性相互作用層析(單一模式)來測定正確摺疊及不正確摺疊之恩博之量。可使用尺寸排除層析(「SEC」)來測定正確摺疊及不正確摺疊之恩博之組合量。如本文中所使用，術語「基於恩博之蛋白質混合物」或「含有恩博之蛋白質混合物」或「恩博製劑」或「基於恩博之材料」及諸如此類應理解為係同義詞且意欲表示以下蛋白質混合物：其中主要組份包括正確摺疊之恩博且次要組份可包括修剪恩博、不正確摺疊之恩博、聚集恩博(該等聚集物包括正確及/或不正確摺疊之恩博)或恩博片段。本發明提供產生用作醫藥調配物中之活性成份之基於恩博之蛋白質混合物(或恩博製劑)的能力，其中期望較迄今所達到之程度在較大程度上最大化正確摺疊之恩博之量，而最小化不正確摺疊(包含聚集)之恩博之量。 在第四實施例中，本發明係關於一種醫藥上可接受之調配物，其包括高純恩博且適於投與需要治療TNF介導病狀之個體，該調配物含有包括大量正確摺疊之恩博及少量不正確摺疊之恩博之蛋白質混合物，其中：(i)不正確摺疊之恩博構成蛋白質混合物之小於約10 wt.%、較佳地小於約8 wt.%且最佳地小於約5 wt.%；(ii)正確摺疊之恩博構成蛋白質混合物之大於90 wt.%且較佳地大於約92 wt%及最佳地大於約95 wt%；且(iii)正確摺疊之恩博及不正確摺疊之恩博(但不包含其聚集物)之總量構成蛋白質混合物之至少95 wt%且較佳地至少98重量%；其中調配物進一步包括致使調配物適於投與個體之醫藥上可接受之惰性成份、賦形劑或載劑。 在第五實施例中，本發明係產生含有恩博之蛋白質混合物之方法，該混合物就其中所存在正確摺疊之恩博量對不正確摺疊之恩博量而言具有高純度，該方法包括以下步驟：(1)在哺乳動物表現系統中表現恩博以獲得收穫細胞培養流體，其含有包括正確摺疊及不正確摺疊之恩博二者之含有恩博之蛋白質混合物；(2)對在步驟1中獲得之收穫細胞培養流體實施純化製程，藉此獲得含有恩博之蛋白質混合物，其具有減少量之或實質上不含在步驟(1)中產生之收穫細胞培養流體中存在之不期望雜質(亦即非基於恩博之蛋白質)；(3)使在步驟(2)中獲得之含有恩博之蛋白質混合物與具有離子交換部分及疏水性相互作用部分二者之混合模式層析樹脂接觸一或多次，以將混合物中所含的蛋白質附於樹脂上；及(4)使來自步驟3之上面結合有蛋白質之混合模式樹脂與能夠自混合模式樹脂洗脫正確摺疊之恩博的溶液接觸以獲得洗脫物，該洗脫物包括含有恩博之蛋白質混合物，該混合物中正確摺疊之恩博對不正確摺疊之恩博之比例高於在步驟3中引入樹脂中之含有恩博之混合物；且其中(i)存在於自步驟2純化所獲得含有恩博之蛋白質混合物中蛋白質之量為存在於步驟1中所獲得收穫細胞培養流體中基於恩博之蛋白質混合物量的至少約80 wt%且最佳地至少約85 wt%；(ii)存在於步驟4中所洗脫蛋白質混合物中之正確及不正確摺疊之恩博蛋白之組合量為存在於自步驟2所獲得蛋白質混合物中之其量的至少約60 wt.%；(iii)存在於步驟4洗脫物中之正確摺疊之恩博量為存在於步驟1中所獲得收穫細胞培養流體中之含有恩博之蛋白質混合物量的至少約30 wt.%且較佳地至少約34 wt.%；且(iv)該正確摺疊之恩博構成步驟4中所獲得洗脫物之至少約90 wt%且較佳地至少約95 wt.%。 在第六實施例中，本發明係關於治療患有TNF介導疾病之個體之方法，其包括以下步驟：向該個體投與含有包括正確摺疊之恩博及不正確摺疊之恩博之蛋白質混合物的醫藥調配物，該混合物係藉由任一上述方法獲得，且其中蛋白質混合物中不正確摺疊之恩博之量小於該混合物之約10 wt.%且較佳地小於約5 wt%。 在第七實施例中，本發明係關於治療患有TNF介導疾病之個體之方法，其包括以下步驟：向該個體投與含有包括正確摺疊之恩博及不正確摺疊之恩博之蛋白質混合物的醫藥調配物，其中蛋白質混合物中不正確摺疊之恩博之量小於該混合物之約10 wt%且較佳地小於約5 wt%。 在第八實施例中，本發明係關於分離正確摺疊之恩博與不正確摺疊之恩博之方法，其中使用層析方式來達成該分離，且其中層析方式僅由混合模式層析組成，其中使包括正確摺疊及不正確摺疊之恩博之混合物與具有離子交換及疏水性部分之混合模式層析樹脂接觸，且然後自其洗脫，從而獲得包括至少約85 wt%且較佳地至少約90 wt%且最佳地至少約95 wt%之正確摺疊之恩博之洗脫物。就此實施例而言，在本文中陳述「層析方式僅由混合層析組成」時，應理解，該片語並不排除在僅用於分析目的時視情況使用各種層析方式(例如HIC、SEC等)。本實施例較為有利，其中除本文所闡述之混合模式方法外中其無需使用拆分正確及不正確摺疊之蛋白質之分離方法。 在另一態樣中，可以下列方式實踐應用至恩博之上述方法兩次或更多次以獲得高純恩博製劑：藉由實施如闡述於(例如)上文實施例1及2中之步驟(a)及(b)來實施第一混合模式分離(1號分離)；隨後藉由再次實施步驟(a)及(b)來實施第二混合模式分離(2號分離)；其中然後將在1號分離之步驟(b)中獲得之洗脫物用作用於2號分離步驟(a)之分析物(亦即含有蛋白質混合物之溶液)。用於1號分離及2號分離中之混合模式樹脂可相同或不同。在此態樣之一尤佳實踐中，使用Capto™ MMC混合模式樹脂實施1號分離且使用Capto™ ADHERE混合模式樹脂實施2號分離。 視情況，源自本發明方法或提供於上述製備、調配或治療實施例中之恩博製劑可(若期望)不含或基本上不含不正確摺疊之恩博，但可理解，本文中能夠提供具有顯著較低含量不正確摺疊之恩博(較佳地小於存在於藥物調配物中之基於恩博之蛋白質混合物之總量的約10 wt.%且最佳地小於約5 wt%)之恩博製劑代表其顯著優於當前可用於商業規模且含有基於恩博之混合物的醫藥調配物(其中基於HIC分析，該等混合物中不正確摺疊之恩博之量可大於該等調配物中所發現基於恩博之蛋白質的約10%)。 用於本發明之較佳混合模式樹脂係Capto™ MMC及Capto™ ADHERE；然而，應理解，預計經離子交換部分及疏水性部分二者功能化之任一混合模式樹脂皆可用於本發明。 不受限於任一特定理論，視為可能的是(若根本不可預測)，可能在採用電荷特性及疏水性特性之混合模式層析中利用該兩種親和力類型之間之相互依賴性及相反作用，從而研發高效分離適當摺疊之蛋白質物質與不正確摺疊及/或聚集之物質。令人吃驚的是，本發明之混合模式方法無需組合有或補充有任一其他分離策略來以優良產量及高純度拆分正確及不正確摺疊之蛋白質。舉例而言，無需採用額外HIC步驟來進一步達成正確及不正確摺疊之蛋白質之該分離。 如對於恩博所應用，本發明之混合模式層析方法涉及發生下列常見順序之現象：首先，在將含有恩博之不純試樣引入混合模式樹脂(亦即包括正確摺疊之恩博、不正確摺疊之恩博及其他雜質之試樣，例如自恩博之CHO表現所獲得者)中後，本發明方法使恩博(正確及不正確摺疊之恩博二者)結合至混合模式樹脂。其次，在隨後洗脫或洗滌步驟(例如使用較佳地以增加濃度之梯度施加之鹽梯度)期間，本發明使得自基於恩博之混合物之樹脂進行釋放(亦即洗脫)，其中所含之恩博主要係正確摺疊者，而實質上使不正確摺疊之恩博保持結合或捕獲於混合模式樹脂上；藉此可在自樹脂洗脫之材料中獲得極高比例之適當摺疊之恩博(與存在於最初引入且結合至樹脂之含有恩博之蛋白質試樣中之其較低比例相比)。就本發明之混合模式層析之物理操作而言，混合模式樹脂可含於(亦即堆積)剛性柱狀容納構件或器皿中，該剛性柱狀容納構件或器皿可含有樹脂，且具有入口及出口構件，該等入口及出口構件容許流體溶液在管柱之一端進入，發生流動而與樹脂接觸，且然後在器皿之相對端離開以收集用於進一步分析或處理或棄除。 可以已知方式藉由在哺乳動物細胞培養物(例如CHO細胞)中表現恩博蛋白來獲得上述方法之步驟(a)中所使用含有正確摺疊及不正確摺疊之恩博之蛋白質混合物的溶液。在本發明之混合模式層析純化之前，可對自哺乳動物表現收穫之蛋白質(收穫細胞培養流體)實施初始純化步驟(例如蛋白質A親和純化)以去除雜質。儘管可期望該步驟以去除非基於恩博之雜質，但此純化通常不會顯著分離(亦即拆分)正確摺疊之恩博與不正確摺疊之恩博。因此，然後對蛋白質A池實施本發明之混合模式方法以達成該分離。 本發明方法提供正確摺疊之恩博之商業有用之回收率(產量)。舉例而言，若本發明方法之步驟(a)中所使用正確及不正確摺疊之恩博之基於恩博之蛋白質溶液較佳地以蛋白質A層析輸出物(藉由純化蛋白質A管柱之恩博之哺乳動物表現產物獲得)形式提供，則在蛋白質A純化步驟中回收之材料量較佳地為存在於引入蛋白質A管柱中之收穫細胞培養物中之基於恩博之表現產物的至少約80 wt.%且較佳地至少約85 wt% (其中可藉由Fc Elisa來測定存在於收穫細胞培養物中之基於恩博之蛋白質之量，且可藉由A280 nm下UV吸光度來測定蛋白質A洗脫池中所獲得基於恩博之蛋白質之量)。隨後，在使用上述蛋白質A純化材料實踐本發明之混合模式層析時，本發明步驟(b)之洗脫中所獲得基於恩博之蛋白質材料量較佳地為在本發明步驟(a)中引入混合模式樹脂中之基於恩博之材料量的至少約60 wt.%且較佳地至少約70 wt%。 因此，本文步驟(b)之混合模式洗脫物中之高純恩博混合物(其高度富含正確摺疊之恩博，亦即含有不大於10 wt%及較佳地不大於約5 wt%之錯誤摺疊之材料(基於洗脫物重量))之總產量可為以下值中的任一值：在純化(例如蛋白質A純化)之前最初存在於收穫細胞培養流體中之基於恩博之混合物的約30 wt%至約50 wt%。 亦可藉由其他層析方式來純化收穫細胞培養流體，例如使用具有離子交換及疏水性相互作用部分二者之層析樹脂之混合模式層析。 在實踐本發明方法時，可以已知方式實施額外過濾步驟(例如病毒過濾及切向流過濾)以進一步處理在上述混合模式層析方法之步驟(b)中產生之洗脫物。 本發明提供大大改良之分離方法，其用於分離給定蛋白質之正確摺疊之構型與不正確摺疊之構型(包含聚集物)，且特定而言，用於拆分適當摺疊之恩博與錯誤摺疊(及聚集)之恩博(自包括基於恩博之物質之高度異質混合物之哺乳動物收穫細胞培養物獲得)。
本發明係基於本文中之以下發現：可使用利用離子交換及疏水性吸引原理之混合模式樹脂(例如CaptoTM MMC及CaptoTM Adhere)進行結合且然後優先(亦即選擇性)洗脫給定蛋白質分析物之正確摺疊之構型(較不正確摺疊之構型)。上述混合模式樹脂中之二者皆包括具有提供用於吸引及結合蛋白質分析物之兩種不同模式(亦即離子交換吸引及疏水性相互作用)之部分(亦即化學基團)的配體。定義 在本發明上下文中及在使用每一術語之具體上下文中，本說明書中所用術語通常具有業內普通含義。下文或說明書中其他地方論述用於闡述本發明之某些術語，其為關注本發明說明之從業人員提供額外指導。提供某些術語之同義詞。列舉一或多個同義詞並不排除其他同義詞之使用。本說明書中任一處之實例(包含本文所論述任一術語之實例)的使用僅具有闡釋性，且決不限制本發明或所例示任一術語之範圍及含義。本發明並不限於在本說明書中給出之各種實施例。 除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明相關技術者通常所理解相同之含義。倘若出現衝突，則以本文件(包含定義)為準。 「在……周圍(Around)」、「約(about)」或「大約(approximately)」通常應意指在給定值或範圍之20%內、10%內、5%內、4%內、3%內、2%內或1%內。給定數值量係近似值，此意味著若非明確陳述，則可推斷術語「在……周圍(around)」、「約(about)」或「大約(approximately)」。 本文所用之術語「恩博」意指含於商業Enbrel® 調配物中之活性成份，亦即由連接至人類免疫球蛋白G之Fc部分[片段，可結晶] (「IgG1」)之人類75千道爾頓(p75)腫瘤壞死因子受體(「TNFR」)之細胞外配體結合部分組成之融合多肽的同源二聚體。恩博係同源二聚體，其中如上文所闡述75千道爾頓TNFR:Fc分子之兩條鏈由二硫鍵聯在Fc部分之鉸鏈區連結。恩博由934個胺基酸組成且具有大約150千道爾頓之表觀分子量，且其Fc組份含有人類IgG1之恆定重鏈2 (CH2)結構域、恆定重鏈3 (CH3)結構域及鉸鏈區，但不含恆定重鏈1 (CH1)結構域。出於本申請案之目的，術語「恩博」亦涵蓋在胺基酸結構中具有並不顯著影響如上文所闡述多肽之功能之微小改質(包含胺基酸之缺失、添加及/或替代)之恩博。術語恩博亦應理解為包含欲為或視為恩博之所謂的生物類似或生物較佳變體之蛋白質。 本文所用之術語「正確摺疊之恩博」意欲表示以下形式：恩博同源二聚體(如上文所定義)中具有抑制TNF之生物活性之摺疊構型；及與Enbrel® 中之活性成份之構型及生物活性相同或實質上相同之構型。 本文所用之術語「不正確摺疊之恩博」意欲涵蓋：(i)與恩博(如上文所定義)具有相同或基本上相同胺基酸序列但與正確摺疊之恩博具有不同構型之同源二聚蛋白，其中該不同構型致使蛋白質缺乏或實質上缺乏作為TNF抑制劑之生物活性；及/或(ii)聚集物，其中兩種或更多種正確及/或不正確摺疊之恩博同源二聚體發生締合(亦即聚集或凝聚)以形成分子量高於正確摺疊之恩博之物質；及/或(iii) (i)及(ii)之混合物；及/或(iv)聚集(亦即)凝聚蛋白質組合物，其與正確摺疊之恩博包括相同或基本上相同序列或其部分，但與正確摺疊之恩博相比在HIC管柱上展現降低之洗脫位置(因較大疏水性)。 術語「治療」係指對於哺乳動物疾病之任何投與或施用藥物，且包含抑制疾病、阻止疾病發生、減輕疾病(例如藉由引起消退，或恢復或修復損失、失去或缺陷功能)或刺激無效過程。該術語包含獲得期望藥理學及/或生理學效應，且涵蓋哺乳動物中病理學病狀或病症之任何治療。效應可為預防，完全或部分地預防病症或其症狀，及/或治療，部分或完全治癒病症及/或歸因於病症之不良影響。其包含(1)預防在易患病症但尚無症狀之個體中發生或復發病症，(2)抑制病症，例如阻止病症發生，(3)停止或終止病症或至少其有關症狀，因而宿主不再患有病症或其症狀，例如藉由恢復或修復損失、失去或缺陷功能而引起病症或其症狀之消退，或刺激無效過程，或(4)減輕、緩解或改善病症或與其有關之症狀，其中改善在廣泛意義上用於係指至少減小參數(例如發炎、疼痛及/或腫瘤大小)之等級。 術語「醫藥上可接受之載劑」係指任何習用類型之無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、囊封材料、調配輔助劑或賦形劑。醫藥上可接受之載劑在所用劑量及濃度對接受者無毒且與調配物之其他成份相容。 術語「組合物」或「調配物」係指通常含有載劑(例如醫藥上可接受之載劑)或賦形劑(為業內習知且為治療、診斷或預防目的適於投與個體)之混合物。其可包含細胞培養物，其中多肽或多核苷酸存在於細胞或培養基中。舉例而言，經口投與之組合物可形成溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物、漱口水或粉劑。 本發明適於分離特定蛋白質之正確摺疊之構型與不正確摺疊之構型。可根據本發明方法處理之蛋白質之實例包含需要再摺疊之任何含二硫化物的蛋白質，例如G-CSF、IGF、胰島素、生長激素等以及經改造抗體(例如單鏈可變域抗體片段)。 適於根據本發明之混合模式層析方法純化之恩博可藉由表現恩博之活宿主細胞產生，該等活宿主細胞係(例如)雜交瘤(在抗體之情形下)或經基因改造以產生多肽之宿主細胞(在融合多肽或抗體之情形下)。基因改造細胞以產生多肽之方法在業內已眾所周知。例如參見Ausubel等人編輯(1990)，Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)。該等方法包含將編碼多肽且容許表現多肽之核酸引入活宿主細胞中。該等宿主細胞可為細菌細胞、真菌細胞或較佳地生長於培養物中之動物細胞。細菌宿主細胞包含但不限於大腸桿菌細胞。適宜大腸桿菌菌株之實例包含：HB101、DH5.α、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539及任一不能裂解外來DNA之大腸桿菌菌株。可使用之真菌宿主細胞包含但不限於釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、甲醇酵母(Pichia pastoris)及曲黴菌(Aspergillus )細胞。可使用之動物細胞系之一些實例係CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3及W138。可使用彼等熟習此項技術者熟知之方法(例如藉由轉變、病毒感染及/或選擇)來確立新動物細胞系。視情況，可藉由宿主細胞將恩博分泌至培養基中。 在正確摺疊之恩博與錯誤摺疊之恩博之混合模式層析分離之前，可藉由任一標準方法來純化經表現恩博。在以細胞內方式產生恩博時，藉由(例如)離心或超濾去除微粒碎屑。在將恩博分泌至培養基中時，可首先使用標準多肽濃縮過濾器來濃縮來自該等表現系統之上清液。亦可添加蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解且可包含抗生素以防止微生物之生長。 可使用(例如)以下技術來純化恩博：羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析及已知或尚待發現純化技術(包含但不限於蛋白質A層析、離子交換管柱上分級分離、乙醇沈澱、反相HPLC、二氧化矽上層析、肝素SEPHAROSET®上層析、陰離子或陽離子交換樹脂層析(例如聚天門冬胺酸管柱)、層析聚焦法、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱)之任一組合。 在極一般意義上，如對於恩博所應用(但不限於此)，本發明提供蛋白質分離方法，其包括以下步驟：(a)在能夠使正確及不正確摺疊之恩博結合至樹脂之條件下，將含有基於恩博之蛋白質混合物(具有正確摺疊及不正確摺疊之恩博)之溶液引入經離子交換部分以及疏水性相互作用部分功能化之混合模式層析樹脂中；且然後(b)使用能夠自樹脂洗脫正確摺疊之恩博之洗脫介質洗滌樹脂，從而所得洗脫物中正確摺疊之恩博之比例高於在步驟(a)中引入之蛋白質溶液。 視情況，該方法可進一步包含以下初級步驟：在哺乳動物細胞培養物(例如CHO細胞培養物)中表現恩博，且然後使用(例如)蛋白質A層析純化表現產物，藉此蛋白質A產物輸出物變為用於本發明之步驟(a)中之蛋白質溶液。應理解，本發明方法可以以下方式來實踐：哺乳動物表現及蛋白質A步驟(產生用於本發明之步驟(a)中之起始溶液)可藉由第一實體在給定製造位點實施，而本發明之混合模式分離方法可藉由相同或不同實體在相同或不同製造位點實施。用於步驟 (a)— 結合至 Capto™ MMC 混合模式樹脂之條件。 在本發明之步驟(a)中，應在約4至約8之pH下且較佳地在約4至約6之pH下，將包括正確摺疊及不正確摺疊之恩博之蛋白質溶液引入Capto™ MMC混合模式樹脂中以用於結合至其上。另一選擇為，在使用Capto™ ADHERE混合模式樹脂時，應在約6至約8.5之pH下且較佳地在約7至約8之pH下，將步驟(a)中包括正確摺疊及不正確摺疊之恩博之蛋白質溶液引入Capto™ ADHERE混合模式樹脂中以用於結合至其上。用於步驟 (b)— 自混合模式樹脂洗脫之條件 。在步驟(b)中，洗脫介質包括預定濃度之鹽，且以較不正確摺疊之恩博有效優先洗脫正確摺疊之恩博蛋白之預定方式施加至管柱上。儘管概言之洗脫物應含有正確摺疊之恩博對不正確摺疊之恩博之較高比率，但較佳地選擇鹽溶液及將其施加至樹脂上之方式，從而在步驟(b)洗脫物中正確摺疊之恩博之量大大超過不正確摺疊之恩博之量。早期洗脫流份可基本上含有100%之正確摺疊之蛋白質。可藉由改變(增加)鹽溶液之莫耳濃度(例如經由梯度)來達成鹽溶液洗脫步驟。可逐步達成梯度，但較佳地係連續及線性梯度。在一較佳實施例中，鹽溶液含有氯化鈉(「NaCl」)。NaCl線性梯度可為約0至約1 M。 在一替代實施例中，鹽溶液可含有硫酸鈉(「Na2 SO4 」)。亦可以逐步或線性梯度、較佳地以線性方式及最佳地以約0至約1莫耳濃度之濃度梯度來施加Na2 SO4 溶液。 可藉由在CHO細胞中進行培養來獲得恩博。 在一較佳實施例中，鹽溶液包括NaCl。 遵循下列程序來進行以下各項：表現，純化表現產物，及分析自本發明之混合模式層析方法獲得之含有恩博之洗脫物：恩博之表現。 在經編碼在C末端處融合至人類Fc之人類TNFR細胞外結構域之基因轉染之重組CHO細胞的條件化培養基(「CM」)下表現恩博。業內用於恩博之哺乳動物表現之實例可參見下列美國專利(以引用方式併入本文中)：RE 36755、美國專利第5,605,690號、EP 464,533、EP 417,563、美國專利第8,063,182號及國專利第7,294,481號。蛋白質 A 層析 。使用蛋白質A管柱(使用1 ml HiTrap rProtein A管柱(可自GE Healthcare獲得)且使用10 mM磷酸鹽、0.1 M NaCl (pH 7.0溶液)進行平衡)來處理上文獲得之CM。在使用1 M精胺酸鹽酸鹽(「精胺酸」)、0.1 M檸檬酸鹽(pH 6.0溶液)洗滌管柱之後，使用pH 4.2、3.7及3.0且在含有1 M精胺酸及0.1 M檸檬酸鹽下逐步洗脫結合蛋白。另一選擇為，可在無精胺酸下於下降pH下使用0.1 M檸檬酸鹽來處理管柱。在不存在精胺酸下，在pH 3.85下洗脫大部分恩博以提供包括在低於此pH下洗脫之污染物以及不正確摺疊之恩博、恩博片段、恩博聚集物等之洗脫物。然後使蛋白質A洗脫物經受HiTrap管柱中之CaptoTM MMC或CaptoTM Adhere (可自GE Healthcare獲得)，如下文在實例中所闡述。蛋白質 A 洗脫物之 分析。 上文所獲得蛋白質A洗脫物之分析闡述於圖2A及2B中。圖2A展示使用含有1 M精胺酸之低pH緩衝液之來自蛋白質-A之洗脫圖。在pH 6.0下觀察到較大UV吸收峰(峰標記為6.0)且不含對應於商業恩博之帶(圖2B，泳道4) (如藉由原態PAGE (泳道1)所檢驗)：應注意，並無恩博流經蛋白質-A管柱(比較泳道2及3)。儘管在pH 6.0下未觀察到蛋白質帶(泳道4)，但所觀察之較大UV吸收指示顏料之洗脫。在達到基線吸光度之後(圖2A)，然後使用0.1 M精胺酸、0.1 M檸檬酸鹽(pH 4.2)洗脫管柱，從而得到尖銳洗脫峰(圖2A，標記為4.2)。此峰之原態PAGE分析展示強烈恩博帶以及模糊低流動性帶(泳道5)。洗脫蛋白質之HIC分析展示2個峰，第一峰對應於商業恩博之主峰且第二峰對應於亦存在於商業恩博中之次要物質。儘管第二峰之性質尚不明了，但其似乎係恩博之錯誤摺疊之物質，此乃因結合至蛋白質-A且由此應含有Fc結構域。在pH 3.7下且然後在pH 3.0下(皆在含有1 M精胺酸下)洗脫剩餘結合蛋白。該等低pH溶劑使得可洗脫較小峰，如圖2A (3.7及3.0)中所展示。pH 3.7峰含有少量恩博(泳道6)，而pH 3.0峰主要含有對應於錯誤摺疊之物質以及亦可聚集物質之低流動性物質(泳道7)。在不存在精胺酸下觀察到類似洗脫圖案。需要較低pH (例如pH 3.85)來洗脫恩博且進一步降低pH會洗脫低流動性物質。該等低流動性物質實際上結合至蛋白質-A意味著其亦係Fc融合蛋白。因該等物質在低於恩博之pH下洗脫，故其更緊密地結合至蛋白質-A。該等分析證實，重組CHO細胞中之恩博表現得到原始(正確摺疊)恩博(對應於正確摺疊之物質)及低流動性物質(對應於不正確地錯誤摺疊之物質)，如藉由分析型HIC所分析。因錯誤摺疊之物質在HIC後期洗脫出，故疏水性應大於原始恩博。端視CHO純系及發酵條件，正確摺疊之物質之量由蛋白質A洗脫物之40 wt%至60 wt%變化。在下文實例中，評估混合模式層析分離摺疊物質與錯誤摺疊之物質之能力。分析方法。 可使用業內熟知之各種技術分析來自蛋白質A、CaptoTM MMC及CaptoTM Adhere組合物之洗脫流份，例如尺寸排除層析(SEC)、變性SEC (dSEC)、疏水性相互作用層析(HIC)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及原態PAGE。舉例而言，尺寸排除層析技術闡述於Hawe等人，Pharm. Res. 2011, 28: 2302及/或van Marrschalkerweerd等人，Eur. J. Pharm. Biopharm. 2011, 78: 213中。SDS-PAGE 。 舉例而言，可藉由十二烷基硫酸鈉或原始聚丙烯醯胺凝膠電泳(分別係SDS-PAGE或原態PAGE)分析來自蛋白質A、CaptoTM MMC及CaptoTM Adhere之洗脫流份。SDS-PAGE及原態PAGE二者皆係使用6% 叁-甘胺酸凝膠(可自Life Technology獲得)來實施。可在非還原條件下進行SDS-PAGE，從而可觀察到二硫化物連接之聚集物。尺寸排除層析。 可使用熟知技術尺寸排除層析(SEC)、高效液相層析(「HPLC」)方法(其中按尺寸分離分析物)分析使用本發明之混合模式層析方法獲得之洗脫物流份(參見Rogner, M. (2000). Size Exclusion Chromatography.Protein Liquid Chromatography. M. Kastner. Amsterdam, Elsevier.61: 89-145.)。舉例而言且並不加以限制，可製備含有50 mM單水合磷酸二氫鈉及150 mM精胺酸之流動相緩衝液。使用1 M HCl將pH調節至6.5。可使用以線性方式附接至Tosoh TSK-Gel G4000 SWxl 7.8 mm × 30 cm (目錄編號：8542)之Tosoh TSK-Gel SWxl 6 mm × 4 cm保護管柱(目錄編號：8543)實施分離。為實施分離，使管柱達到室溫(23℃)且使用流動相以0.5 mL/min之流速平衡。使用自動採樣器將5微升包括恩博之50 mg/mL溶液注入管柱中。可經約30分鐘以約0.5 mL/分鐘之流速達成分離。在此期間在280 nm之波長下監測管柱洗脫劑。可使用Chromeleon軟體(Dionex)實施積分。在積分之前，自所有層析圖減去不含恩博之緩衝液之SEC層析圖。所有積分皆可實施介於12分鐘與26分鐘之間之滯留時間。使用若干參數來定義峰。將檢測峰之最小面積設定於0.05 mAu * min。將峰檢測之二維靈敏度設定於0.01 mAu及75秒。使用人工積分工具人工添加峰肩。在兩個步驟中人工調節所有檢測峰。首先，將峰基線(峰之底部邊界)調節至水平。其次，將峰基線之垂直位置調節至層析圖基線之垂直位置。將層析圖基線值定義為不存在分析物下之信號。將不存在分析物下之信號定義為12分鐘滯留時間下之吸光度(以mAu表示)。疏水性相互作用層析 (HIC) 。 可在丁基瓊脂糖® 上使用1.8 M至0 M之硫酸銨梯度實施疏水性相互作用層析(HIC)分析。亦可以美國專利7,294,481 (參見第19欄，第49-55行)中所闡述之方式實施HIC層析。亦參照美國專利第7,157,557號；Chen J, Tetrault J, Ley A. (2008) J Chromatogr A. 1177, 272-81；Gagnon P.及Grund E.(1996) BioPharm, 9, 54-64；及Lu, Y., Williamson, B.及Gillespie, R. Recent advancement in application of hydrophobic interaction chromatography for aggregate removal in industrial purification process. Curr. Pharm. Biotech. 對於根據本發明之混合模式層析方法產生之恩博製劑之HIC分析而言，應注意，美國專利7,294,481 (以引用方式併入本文中)中之圖4含有恩博製劑之存在三個峰之HIC層析圖，最大峰(在‘481專利中記為「峰2」)揭示為代表適當摺疊之恩博融合蛋白；而較小峰(在‘481專利中記為「峰3」)由專利權人推測含有「雜亂」(亦即在本論述中視為與不正確摺疊同義)恩博以及聚集恩博(參見美國專利7,294,481第22欄第13-66行及其圖5)。本發明之顯著優點在於能夠以具有商業吸引力之產量提供格外高純度之含恩博製劑，其中HIC層析圖之「峰3」(如‘481專利之圖4及圖5中所提及，且在本文中視為包括不正確摺疊之恩博)可實質上減少或基本上消除。 本發明進一步係關於恩博之醫藥調配物，其中使用本發明方法獲得用於該等調配物中之高純度恩博。本發明調配物亦可包含緩衝液、張度改質劑、賦形劑、醫藥上可接受之載劑及醫藥組合物之其他常用惰性成份。為簡明起見，該等成份更全面地論述於本申請案之下文中。 緩衝液將pH維持於期望範圍內。適宜緩衝液包含組胺酸、磷酸鉀、檸檬酸鈉或檸檬酸鉀、馬來酸、乙酸銨、叁-(羥甲基)-胺基甲烷(tris)、各種形式之乙酸鹽及二乙醇胺。調配物中之緩衝液濃度較佳地介於約1 mM至約1M之間，且更佳地介於約10 mM至約200 mM之間。緩衝液在業內已眾所周知且藉由已知方法製造及可自商業供應商獲得。 適宜緩衝液之實例係磷酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸鹽、叁-(羥甲基)-胺基甲烷(tris)、碳酸氫鹽。 在一較佳實施例中，緩衝液係磷酸鈉。 在一較佳實施例中，醫藥組合物之pH為生理學值或接近生理學值。因此，較佳地，所提供組合物之pH介於約5.8與約8.4之間；且甚至更佳地介於約6.2與約7.4之間。熟習此項技術者應理解，可視需要調節pH以最大化特定調配物中之恩博之穩定性及溶解性。因此，pH在生理學範圍外但仍可為患者耐受之恩博調配物亦在本發明範圍內。 張度改質劑係有助於溶液滲透壓之分子。較佳地調節醫藥組合物之滲透壓以最大化活性成份之穩定性及/或最小化在投與後對患者之不適。通常較佳地，醫藥組合物與血清等滲，亦即具有相同或類似滲透壓，此係藉由添加張度改質劑來達成。 在一較佳實施例中，所提供調配物之滲透壓為約180 mOsM至約420 mOsM。然而，應理解，視具體條件所需，滲透壓可較高或較低。 適於改變滲透壓之張度改質劑之實例包含但不限於胺基酸(不含精胺酸) (例如半胱胺酸、組胺酸及甘胺酸)、鹽(例如氯化鈉、氯化鉀及檸檬酸鈉)及/或糖/多元醇(例如蔗糖、葡萄糖及甘露醇)。 較佳張度改質劑係甘胺酸、丙胺酸、氯化鈉、氯化鉀及硫酸鈉。 在一較佳實施例中，調配物中之張度改質劑濃度較佳地介於約1 mM至約1 M之間，更佳地介於約10 mM至約200 mM之間。張度改質劑在業內已眾所周知且藉由已知方法製造及可自商業供應商獲得。 亦可向醫藥組合物中添加賦形劑(亦稱為化學添加劑、共溶質或共溶劑)，其穩定呈溶液形式(亦呈乾燥或冷凍形式)之多肽。賦形劑在業內已眾所周知且藉由已知方法製造及可自商業供應商獲得。 適宜賦形劑之實例包含但不限於糖/多元醇，例如：蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、麥芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖；聚合物，例如：血清白蛋白(牛血清白蛋白(BSA)、人類SA或重組HA)、右旋糖酐、聚(乙烯醇)PVA、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙烯亞胺、明膠、聚乙烯基吡咯啶酮(PVP)、羥乙基纖維素(HEC)；非水性溶劑，例如：PEG及甘油及二甲基甲醯胺(DMF)；胺基酸，例如：麩胺酸、L-絲胺酸、麩胺酸鈉、丙胺酸、甘胺酸、離胺酸鹽酸鹽、肌胺酸及γ-胺基丁酸；表面活性劑，例如：Tween®-80 (聚山梨醇酯80)、Tween®-20 (聚山梨醇酯20)、SDS、聚山梨醇酯、泊洛沙姆(poloxamer)；及混雜賦形劑，例如：磷酸鉀、乙酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、三甲胺N-氧化物、甜菜鹼、金屬離子(例如鋅離子、鈣離子及鎂離子)、CHAPS、單月桂酸酯、2-O-β-甘露甘油酸酯或上述賦形劑之任一組合。 較佳賦形劑係蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、麥芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖、牛血清白蛋白(BSA)、人類血清白蛋白(HSA)、重組白蛋白、右旋糖酐、PVA、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙烯亞胺、明膠、聚乙烯基吡咯啶酮(PVP)、羥乙基纖維素(HEC)、PEG、乙二醇、甘油、丙胺酸、甘胺酸、離胺酸鹽酸鹽、肌胺酸、SDS、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、三甲胺N-氧化物、甜菜鹼、鋅離子、鈣離子、鎂離子、CHAPS、蔗糖單月桂酸酯及2-O-β-甘露甘油酸酯。 本發明調配物中之一或多種賦形劑之濃度較佳地介於約0.001重量%至5重量%之間，更佳地介於約0.1重量%至2重量%之間。 若期望，則根據本發明製得之恩博製劑可用於當前供應商業Enbrel之相同調配物中，該調配物包括約25 mg/ml至約75 mg/ml之恩博製劑，且進一步包括蔗糖、氯化鈉、L-精胺酸鹽酸鹽及磷酸鈉。 另一選擇為，根據本發明獲得之恩博製劑可供應於不含精胺酸之醫藥調配物中；例如如以下案件中所闡述之任一無精胺酸調配物，Manning等人 ，臨時申請案USSN 61/548,518及61/669480 (分別於2011年10月18日及2012年7月9日提出申請，其全部內容以引用方式併入本文中)。 在另一實施例中，本發明提供治療哺乳動物之方法，其包括向哺乳動物投與治療有效量之本發明之醫藥組合物，其中該哺乳動物患有可有益地使用恩博治療之疾病或病症。 在一較佳實施例中，恩博源自與使用組合物治療者相同之哺乳動物物種。 在一較佳實施例中，哺乳動物係人類。 可使用所提供組合物治療之疾病或病症包含但不限於類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎、韋格納氏病(Wegener's disease) (肉芽腫病)、克羅恩氏病(或發炎性腸病)、慢性阻塞性肺病(COPD)、C型肝炎、子宮內膜異位症、哮喘、惡病質、牛皮癬及特應性皮炎。可使用本發明組合物治療之其他疾病或病症包含彼等闡述於WO 00/62790、WO 01/62272、美國專利申請案2001/0021380及美國專利7,648,702 B2 (該等案件之相關部分以引用方式併入本文中)中者。 可藉由以下方式將所提供醫藥組合物投與需要治療之個體：全身性注射，例如靜脈內注射；或注射或施加至相關位點，例如直接注射或直接施加至位點(在位點暴露於手術中時)；或局部施加。 在一實施例中，本發明提供治療及/或預防類風濕性關節炎之方法，其包括向有需要之哺乳動物投與治療有效量之一種所提供恩博組合物。 所提供組合物中之恩博之治療有效量取決於所治療病狀、病狀嚴重程度、先前療法及患者臨床史及對治療劑之反應。可根據主治醫師之判斷來調節適當劑量，從而可一次性或在投與系列內將該劑量投與患者。 在一實施例中，每一成人劑量之有效恩博量為約1-500 mg/m2 或約1-200 mg/m2 或約1-40 mg/m2 或約5-25 mg/m2 。 另一選擇為，可投與固定劑量，其量可介於2-500 mg/劑量、2-100 mg/劑量或約10-80 mg/劑量之間。 若擬每週投與該劑量一次以上，則實例性劑量範圍與前述劑量範圍相同或較低且較佳地以25-100 mg/劑量之每劑量範圍每週投與兩次或更多次。 在另一實施例中，藉由注射投與之可接受劑量含有80-100 mg/劑量，或另一選擇為含有80 mg/劑量。 該劑量可每週、每兩週或間隔數週(例如2至8週)投與。 在一實施例中，藉由單一皮下(SC)注射投與25 mg/ml至75 mg/ml恩博。 在一些情況下，藉由在至少三週時段內每週一至三次投與至多約100 mg劑量之醫藥組合物來改良患者病狀。可能較長時段治療以誘導期望改良程度。對於可治癒慢性病狀而言，方案可無限期持續。對於兒科患者(4-17歲)而言，適宜方案可涉及每週一或多次投與0.4 mg/kg至5 mg/kg恩博之劑量。 在另一實施例中，本發明之醫藥調配物可製成主體調配物，且由此將醫藥組合物之組份調節至高於投與所需者且在投與之前適當稀釋。 醫藥組合物可以單獨治療劑投與或與視需要與其他療法組合投與。因此，在一實施例中，將所提供之治療及/或預防方法與投與治療有效量之另一活性劑組合使用。另一活性劑可在投與本發明之醫藥組合物之前、期間或之後投與。另一活性劑可作為所提供組合物之一部分來投與，或另一選擇為作為單獨調配物來投與。 可以各種方式來投與所提供醫藥組合物，包含非經腸、經口、經頰、經鼻、經腸、腹膜腔內、真皮內、經皮、皮下、靜脈內、動脈內、心內、心室內、顱內、氣管內、鞘內投與、肌內注射、玻璃體內注射及局部施加。 本發明之醫藥組合物尤其可用於非經腸投與，亦即皮下、經肌內、經靜脈內、腹膜腔內、腦脊髓內、關節內、滑膜內及/或鞘內。非經腸投與可藉由濃注或連續輸注進行。用於注射之醫藥調配物可以單位劑型呈現，例如存於安瓿(ampoule)或存於多劑量容器中，同時添加有防腐劑。此外，已研發諸多最新藥物遞送方式且本發明之醫藥組合物適於使用該等新方法投與，例如Inject-ease®、Genject®、注射筆(例如GenPen®)及無針式裝置(例如MediJector®及BioJector®)。本發明之醫藥組合物亦可適用於待發現投與方法。亦參見Langer, 1990, Science, 249:1527-1533。 亦可將所提供醫藥組合物調配為儲積製劑。該等長效調配物可藉由植入(例如經皮下或經肌內)或藉由肌內注射來投與。因此，舉例而言，可使用適宜聚合或疏水性材料(例如作為存於可接受油中之乳液)或離子交換樹脂或作為微溶衍生物(例如作為微溶鹽)來對調配物進行改質。 若期望，則醫藥組合物可呈現於小瓶、包裝或分配器裝置中，其可含有一或多個含有活性成份之單位劑型。在一實施例中，分配器裝置可包括注射器，該注射器具有單一劑量之準備注射之液體調配物。注射器可藉由投與說明書來達成。 在另一實施例中，本發明係關於套組或容器，其含有本發明之水性醫藥組合物。水性醫藥組合物中之多肽濃度可在寬範圍內變化，但通常在約0.05微克/毫升(μg/ml)至約20,000微克/毫升(μg/ml)水性調配物之範圍內。套組亦可藉由使用說明書來達成。 本發明更具體闡述於下列實例中，該等實例意欲僅具有闡釋性，此乃因彼等熟習此項技術者明瞭其中之許多修改及改變。附錄A提供本發明之其他代表性實施例。實例 1 使用 NaCl 洗脫之 CaptoTM MMC 混合模式純化 在此實例中，對如上文所闡述獲得之蛋白質A洗脫物實施CaptoTM MMC層析。使用5 mM檸檬酸鹽之pH 4.5溶液平衡CaptoTM MMC管柱。使用5 mM檸檬酸鹽適當洗脫蛋白質A洗脫物(例如，端視蛋白質A步驟之洗脫緩衝液，洗脫3至6倍)使得完全結合至管柱。如SDS-PAGE分析中所展示，載樣(pH 4.2，蛋白質A洗脫物)具有高度異質性且並無蛋白質流經CaptoTM MMC管柱。然後使用存於10 mM磷酸鹽中之0.15 M NaCl pH 7.5溶液洗脫結合蛋白，此使得pH (自4.5至7.5)及NaCl濃度(自0至0.15 M)發生同時變化。自洗脫物分析觀察到含有正確摺疊之恩博之尖銳洗脫峰。然而，回收率約為40-50%。在剛剛闡述之洗脫步驟後，使含有剩餘結合蛋白材料之樹脂與存於10 mM磷酸鹽中之0.3 M NaCl及1 M精胺酸pH 7.5溶液接觸，此得到主要含有錯誤摺疊之物質以及二硫化物連接聚集物之洗脫液。此實例顯示，CaptoTM MMC可有效分離錯誤摺疊之物質與正確摺疊之物質。錯誤摺疊之物質實際上在較高鹽濃度(0.3 M對0.1 M)下洗脫意味著其對管柱具有較強靜電相互作用。此外，1 M精胺酸進一步增加錯誤摺疊亦及聚集蛋白之洗脫，從而指示該等蛋白質不僅經由靜電相互作用且亦經由疏水性相互作用結合至CaptoTM MMC且精胺酸增強了靜電及疏水性相互作用二者之破壞。此實例中所獲得洗脫物流份之分析表示於圖3A及3B中。實例 2 使用 NaCl 之 CaptoTM MMC 混合模式純化 樹脂平衡至 pH 7.5 在前述實例中，首先使包括正確摺疊及不正確摺疊之恩博之蛋白質溶液與Capto™ MMC樹脂在pH 4.5下接觸。在此實例中，在首先使用10 mM磷酸鹽pH 7.5溶液平衡CaptoTM MMC管柱且然後依次使用NaCl以及精胺酸洗脫時，觀察到類似於在實例1中所觀察之洗脫。具體而言，在此pH平衡期間，並無恩博洗脫出。此結果出人意料，此乃因恩博在pH 7.5下帶負電；恩博之pI因重糖基化而介於4.9至5.4之間。因此，在pH 4.5下或低於pH 4.5下，恩博帶正電且由此應結合至帶負電之CaptoTM MMC配體，但疏水性相互作用可有助於結合。在pH 7.5下，帶負電之恩博應自帶負電之CaptoTM MMC解離，但發現此情形並未發生。此可藉由以下原因來予以闡釋：恩博與CaptoTM MMC之間之疏水性相互作用壓倒了帶負電管柱與恩博之間之靜電排斥。另一選擇為，CaptoTM MMC可藉由結合至蛋白質部分之局部正電荷(蛋白質部分之pI約為8.1)來保持結合蛋白。實例 3 使用 NaCl 梯度進行洗脫之 CaptoTM MMC 混合模式純化 在此實例中，使用NaCl濃度梯度達成成功洗脫。具體而言，在使用10 mM磷酸鹽pH 7.5溶液洗滌管柱之後，使用自0至0.5 M之線性鹽梯度洗脫結合蛋白。載樣(pH 4.2蛋白質A洗脫物)如先前情形中一般具有極大異質性(含有正確摺疊及不正確摺疊之恩博二者)，且使用具有增加之離子強度之NaCl梯度洗脫結合蛋白。在180 min之後，終止梯度且然後使鹽濃度達到0.5 M，此會略微增強蛋白質洗脫。如藉由隨後分析所測定，低鹽流份含有較多正確摺疊之恩博且較高鹽流份富含低流動性(錯誤摺疊及聚集)物質。最後，使用1 M精胺酸、10 mM磷酸鹽之pH 7.5溶液洗脫剩餘蛋白。此流份不含恩博，而完全係低流動性(錯誤摺疊/聚集)物質。對不同蛋白質A洗脫物使用CaptoTM MMC之NaCl梯度洗脫且與初步樹脂平衡組合結會得到就正確摺疊之恩博而言更純之洗脫物。在洗脫介質中之低NaCl濃度下，洗脫試樣富含正確摺疊之恩博。隨著向樹脂施加上述鹽梯度，錯誤摺疊之物質在洗脫物中逐漸增加。在完成鹽梯度之後，使樹脂與1 M精胺酸溶液接觸，且發現自其得到之洗脫物流份含有錯誤摺疊之物質(其不僅包含錯誤摺疊之物質且亦包含聚集物質)，如在隨後SDS-PAGE分析中所明瞭。在SDS-PAGE上，一些低流動性物質可視為不正確摺疊(但非聚集)恩博，從而指示一部分錯誤摺疊之物質作為錯誤摺疊之恩博同源二聚體在原態PAGE上以慢於正確摺疊之恩博同源二聚體的流動性進行遷移。此實例中所獲得洗脫物流份之分析提供於圖4A、4B及4C中。實例 4 使用 Na2 SO4 梯度進行洗脫之 CaptoTM MMC 混合模式純化 在此實例中，使用Na2 SO4 梯度代替NaCl作為鹽梯度自混合模式樹脂洗脫正確摺疊之恩博。儘管通常排他性地使用NaCl來洗脫IEC中之蛋白質，通常已知不同鹽具有不同程度之鹽析(沈澱蛋白質)效應。NaCl係鹽溶鹽(例如MgCl2 )與鹽析鹽(例如Na2 SO4 )之間之中間體。NaCl可有效弱化恩博與CaptoTM MMC之間之靜電相互作用，但對於弱化疏水性相互作用可無作用。在本文中認為，Na2 SO4 應亦有效弱化靜電相互作用，但應增強疏水性相互作用，此乃因其稱為強鹽析鹽。因此，若低流動性物質如上文所指示藉由疏水性相互作用與管柱結合，則其洗脫可由Na2 SO4 阻抑。此情形係藉由以下方式來測試：在使用10 mM磷酸鹽pH 7.5溶液pH平衡Capto™ MMC樹脂管柱之後，使用0至0.4 M之Na2 SO4 梯度洗脫含有正確摺疊及不正確摺疊之恩博之蛋白質溶液。在完成蛋白質之Na2 SO4 梯度洗脫之後，使用1 M精胺酸pH 7.5溶液洗滌管柱。圖5A展示洗脫層析圖，而圖5B展示洗脫流份之SDS-PAGE及原態PAGE。在低Na2 SO4 流份中觀察到正確摺疊之恩博之相對尖銳帶(圖5B之泳道6及7)且該等流份之純度大於負載(泳道1)。較高Na2 SO4 濃度使得在原態PAGE上洗脫低流動性物質(圖5B之泳道8及9)。在pH 7.5下之最終1 M精胺酸洗脫使得洗脫低流動性(錯誤摺疊/聚集)物質。在此流份中似乎存在一些恩博(圖5B之泳道10)，從而指示Na2 SO4 亦可阻抑原始恩博之洗脫。可總結出，Na2 SO4 等效(若非更強)分離正確摺疊之物質與錯誤摺疊之物質，但其可導致原始恩博發生滯留(泳道10)。實例 5 使用 NaCl 及 pH 梯度進行洗脫之 CaptoTM MMC 混合模式純化 在前述實例中，在pH平衡步驟期間(亦即pH自4.5 (5 mM檸檬酸鹽)變化至7.5 (10 mM磷酸鹽))，並未觀察到蛋白質洗脫出。然而，在蛋白質載量增加至超過10 mg/1 ml管柱時，情形有所不同。在較高載量下在pH變化期間蛋白質之洗脫有所增加，但此觀察之原因尚不明了。此洗脫試樣之純度大於載樣，但遠小於低鹽流份。舉例而言，在載樣(蛋白質A洗脫物)含有僅51%之正確摺疊之恩博物質時，在pH平衡期間發生之洗脫僅為65%純，此高於負載但遠低於低鹽流份，而上述實例中之鹽洗脫能夠在開始鹽梯度時得到96%純度，如藉由分析型HIC所測定(圖6)。如圖6中所繪製，隨著鹽濃度增加，洗脫流份之純度自96%逐漸降低至20%，此與CaptoTM MMC之原態PAGE結果一致(圖3B、4B、5B)。1 M精胺酸流份之純度(就正確摺疊之恩博而言)較低(僅11%)，此亦與原態PAGE分析一致(參見圖4B泳道9及圖5B泳道10)。鑒於前述觀察，結合本文所展示發現可推測，可有益地組合pH梯度與鹽梯度以抵抗在管柱pH平衡期間較大蛋白質載量中任一正確摺疊之物質之潛在損失。因此，在此實例5之下文中，在實施本發明方法之上文所定義步驟(b)時，組合pH梯度與鹽梯度。在此實例中，藉由組合pH變化與鹽梯度來抵抗少量適當摺疊之恩博可在混合模式樹脂管柱之初始pH平衡期間不期望地洗脫之可能性。具體而言，藉由pH及NaCl濃度二者之同時梯度來洗脫結合蛋白，亦即自5 mM檸檬酸鹽pH 4.5溶液至10 mM磷酸鹽pH 7.5溶液(含有NaCl)來形成管柱。此使得pH及鹽濃度二者發生同時變化，其皆引起結合蛋白之洗脫。此類似於在pH平衡之後觀察到之鹽洗脫圖，其中在後期流份中(亦即在較高pH及鹽濃度下)及在最終1 M精胺酸pH 7.5洗滌液中洗脫出低流動性物質。舉例而言，蛋白質A洗脫物(24 mg)在pH 4.5下結合至管柱且由自5 mM檸檬酸鹽(pH 4.5)至10 mM磷酸鹽(pH 7.5)且含有0.5 M NaCl之梯度洗脫出。據推測，pH平衡下之此較大負載使得可在pH移位期間洗脫結合蛋白。在pH及鹽梯度期間之洗脫圖實際上在開始梯度時展示小峰且在梯度中間展示主峰(期望之正確摺疊之恩博)。所觀察小峰可對應於若最初不使用pH/鹽梯度實施pH平衡所觀察之洗脫。在完成NaCl/pH梯度洗脫之後，然後使用1 M精胺酸溶液對管柱實施進一步洗脫，此得到對應於低流動性物質之最終尖銳峰。早期洗脫之低鹽及低pH流份富含恩博，而高鹽及高pH流份展示洗脫出低流動性物質；pH自4.5逐漸增加至7.5，例如在中間鹽濃度時pH為4.1-5.1且在梯度結束時pH為6.6。使用1 M精胺酸pH 7.5溶液之最終洗滌在原態PAGE上展示模糊帶且在SDS-PAGE上展示多個帶，此與在使用10 mM磷酸鹽pH 7.5洗滌進行初始管柱平衡(引起pH移位)之後得到之洗脫基本上一致。池中之適當摺疊之恩博之回收率約為70%。在使用相同pH/鹽梯度(至10 mM磷酸鹽pH 7.5溶液，但止於含有0.25 M NaCl之較低鹽)實施洗脫時，獲得類似結果。使用較低鹽濃度之此梯度使得不完全洗脫恩博且產率約為50%。如先前實例中，使用1 M精胺酸洗滌觀察到大峰，此對應於低流動性(錯誤摺疊/聚集)恩博物質。此實例中所獲得洗脫物之分析表示於圖7A及7B中。實例 6 使用 Na2 SO4 /pH 梯度進行洗脫之 CaptoTM MMC 混合模式純化 類似於上文實例5中所使用之程序，亦使用0.5 M Na2 SO4 溶液作為最終溶劑實施pH/鹽梯度洗脫，認為可改良正確摺疊之物質與錯誤摺疊之物質之拆分。池中之恩博之回收率約為50%，且低回收率據信係由增強之疏水性相互作用(藉由0.5 M Na2 SO4 )所致，從而使得不僅滯留錯誤摺疊之物質(主要洗脫於1 M精胺酸洗滌中)，且亦滯留恩博(其亦出現於1 M精胺酸洗滌中)。因此，使用Na2 SO4 可增強錯誤摺疊之物質與正確摺疊之物質之分離(亦即拆分)，但亦減小恩博之回收率。對於此實例中之洗脫物之分析，可參照圖8A及8B。實例 7 CaptoTM Adhere ； 使用 NaCl 在 pH 7.5 及 pH 4.5 下洗脫 在此實例中，使用CaptoTM Adhere作為混合模式樹脂對蛋白質A洗脫物(包括正確及不正確摺疊之恩博物質二者)實施混合模式層析。在pH 7.5下實施包括正確摺疊及不正確摺疊之恩博物質之蛋白質溶液之結合，在該pH下恩博帶負電且由此應結合至帶正電之CaptoTM Adhere配體。在針對10 mM磷酸鹽pH 7.5溶液透析pH 4.2蛋白質A洗脫物時，蛋白質完全結合，但發現單獨鹽洗脫(在pH 7.5下)無效，從而表明CaptoTM Adhere具有極大疏水性。因此認為，因恩博之pI為4.9-5.4，故在可能pH 4.5之較低洗脫pH下，恩博物質帶正電且由此在pH 4.5下由帶正電之CaptoTM Adhere樹脂所排斥。藉由在pH 4.5下自CaptoTM Adhere洗脫恩博物質來探究此可能性。pH 4.2蛋白質A洗脫物(已透析至pH 7.5)結合至經10 mM磷酸鹽pH 7.5溶液平衡之CaptoTM Adhere。在裝載蛋白質後，使用存於相同緩衝液中之0及0.2 M NaCl洗滌管柱，且在該等洗滌中並未洗脫出蛋白質。實例 8 CaptoTM Adhere ； 使用 / 不使用精胺酸在 pH 4.5 下進行洗脫 鑒於實例7之結果，然後使用5 mM檸檬酸鹽pH 4.5溶液有及無精胺酸來洗脫結合蛋白。在此實例中使用精胺酸代替NaCl以探究較疏水性物質(精胺酸)可能影響洗脫之方式(鑒於CaptoTM Adhere配體之疏水性質)。發現使用5 mM檸檬酸鹽pH 4.5洗滌溶液(不含精胺酸)洗脫低流動性(錯誤摺疊/聚集)物質以及正確摺疊之恩博。由於此流份所測量之pH為3.0，故此流份中低流動性物質之洗脫可能因pH突然變化。當使用0.1 M及0.2 M精胺酸於5 mM檸檬酸鹽pH 4.5溶液中重複此步驟時，僅觀察到極少量之正確摺疊之恩博。正確摺疊之恩博之完全洗脫需要0.5 M精胺酸，然而，洗脫物包含不期望量之低流動性物質。因此，發現即使在pH 4.5，精胺酸在低濃度無效，且在較高精胺酸濃度，造成正確摺疊及錯誤摺疊物質之間之拆分差。此實例中所獲得洗脫物之分析參見圖9。實例 9 CaptoTM Adhere ； 使用兩種精胺酸梯度及 7.5 至 4.5 之 pH 梯度洗脫 進一步推測，組合之pH/精胺酸梯度可較佳地拆分適當摺疊及錯誤摺疊之物質。如針對Capto™ MMC之先前實例，可藉由同時施加pH梯度，然後可與精胺酸濃度梯度偶合，來防止使用5 mM檸檬酸鹽進行pH平衡期間pH自7.5降至4.5(例如梯度自10 mM磷酸鹽pH 7.5至5 mM檸檬酸鹽pH 4.5含精胺酸)。使用此pH梯度探究兩種精胺酸梯度。在精胺酸梯度至0.25 M精胺酸之情形下(圖10A及10B)，發現最終0.5 M精胺酸洗滌造成低流動性物質及恩博二者洗脫，指示使用梯度至僅0.25 M精胺酸之精胺酸濃度不足以完全洗脫正確摺疊之恩博。因此，探究0-0.5 M之精胺酸梯度(與上述7.5至4.5之pH梯度偶合)(圖11A及11B)。隨後原態PAGE分析顯示，以精胺酸梯度高於先前0.25 M精胺酸梯度之最終1 M精胺酸洗滌之相對峰高度較小。並未觀察到第二峰，表明拆分可能減低。pH梯度使得洗脫流份之pH自7.5逐漸降低至6.0、5.7、5.2及最終4.5。對於0.5 M精胺酸及pH梯度，主洗脫峰中之兩種流份富含正確摺疊之恩博且蛋白質回收率約為65%。梯度之後部分顯示一個含有恩博之模糊帶。因此，儘管0.5 M精胺酸梯度以及pH梯度增強結合恩博之洗脫，但在精胺酸/pH梯度之後部分中，正確摺疊之恩博與錯誤摺疊之物質共洗脫出。最終1 M精胺酸洗滌僅顯示一個模糊帶。實例 10 CaptoTM Adhere ； 使用精胺酸梯度及 7.5 至 4.5 之 pH 梯度進行洗脫 亦在pH 7.5下使用CaptoTM MMC池實施精胺酸梯度洗脫。使用自10 mM磷酸鹽(pH 7.5)至0.6 M精胺酸、10 mM磷酸鹽(pH 7.5)之梯度洗脫結合蛋白。SDS-PAGE及原態PAGE圖展示在中間流份(0.2-0.4 M精胺酸)中洗脫出正確摺疊之恩博(圖13)。在後期流份及最終1 M精胺酸pH 7.0洗滌中觀察到如在兩種凝膠中看到之低流動性物質。與之相比，在pH 7.5下於梯度洗脫中使用0.5 M NaCl代替0.6 M精胺酸時，恩博之洗脫大大減小。圖14展示在pH 7.5下於至0.5 M NaCl之鹽梯度期間之洗脫圖。在梯度期間觀察到兩個峰，其主要含有恩博，但產量較低。在最終1 M精胺酸洗滌中洗脫出大量恩博，從而指示與pH 7.5結合之0.5 M NaCl鹽濃度不能最佳地用於分離正確摺疊之恩博與錯誤摺疊/聚集材料。如上所述，1 M精胺酸高度有效地洗脫正確摺疊之恩博，但存在低流動性物質。應注意，改變鹽洗脫梯度以施加約0至約1M NaCl之梯度且在pH 8下實施洗脫使得在該梯度之早期洗脫產物中優良地拆分正確摺疊之恩博與低流動性(錯誤摺疊/聚集)物質，如實例12中所展示。恩博結合至Capto™ Adhere之疏水性貢獻在pH 8.0下似乎有所減小，從而使得使用單獨之NaCl即有效洗脫正確摺疊之恩博。實例 11 CaptoTM Adhere ； 使用精胺酸 /NaCl 梯度在 pH 7.5 下進行洗脫 在此實例中，在pH 7.5下探究組合之NaCl/精胺酸梯度。探究兩種該梯度：探究洗脫介質之第一梯度係最終NaCl及精胺酸濃度分別為0.4及0.2者。然後探究第二梯度，其中最終NaCl及精胺酸濃度分別為0.25 M NaCl及0.5 M精胺酸。在兩種情況下，在10 mM磷酸鹽pH 7.5溶液中施加梯度。第一梯度仍過弱以致不能減小疏水性相互作用且由此洗脫恩博。第二梯度較為有效，如由最終1 M精胺酸洗滌中之較小峰所指示。特定而言，如使用SDS-PAGE所證實，在至多0.25 M NaCl、0.5 M精胺酸之整個第二測試梯度中洗脫出恩博且並無高分子量(低流動性/錯誤摺疊/聚集)物質。此高分子量物質然後在最終1 M精胺酸洗滌中洗脫出。在原態PAGE上，大部分正確摺疊之原始恩博展示在中間流份中洗脫出。使用1 M精胺酸洗滌觀察到模糊帶。因此顯而易見，精胺酸及NaCl之組合可洗脫恩博且分離低流動性及高分子量物質(對應於錯誤摺疊之物質)。CaptoTM MMC池之CaptoTM Adhere流份(60-80%純)之HIC分析展示，在梯度期間之洗脫流份(除尾流份外)通常得到大於95%之純度。此實例中所獲得洗脫物之分析表示於圖15A及15B中。實例 12 - CaptoTM Adhere 及 CaptoTM MMC 在此實例中，藉由類似於上述蛋白質A方法之方法獲得包括正確摺疊及錯誤摺疊之恩博之蛋白質A洗脫物。隨後將洗脫物施加至CaptoTM MMC管柱上，且然後將產物池施加至CaptoTM ADHERE管柱上以定量及定性地提供優異恩博產物。步驟 1. 細胞擴展。 以業內已知之方式，使用表現恩博融合蛋白之CHO細胞純系實施所需細胞擴展以生成足夠數量用於接種生產生物反應器之細胞。此表現過程之產物(收穫細胞培養流體)得到正確摺疊之恩博以及不正確摺疊及/或聚集恩博以及額外雜質之混合物。對包括該蛋白質混合物之收穫細胞培養流體實施洗滌劑病毒鈍化。步驟 2 .親和層析。使用習用蛋白質A親和管柱以熟知方式對在上述步驟1中獲得之收穫細胞培養物實施親和層析。產物回收率大約為85%。所獲得產物係複雜蛋白質混合物，其包括正確摺疊之恩博、不正確摺疊之恩博及/或正確及/或不正確摺疊之恩博之聚集物或蛋白質片段。將自此蛋白質A親和管柱純化步驟獲得之產物調節至pH 3.5且然後實施病毒鈍化步驟。在病毒鈍化後，將產物調節至pH 5.5且然後以已知方式使用商業獲得之膠囊式過濾器進一步淨化。步驟 3A . 混合模式陽離子交換層析。使用31.8 L (45 cm直徑× 20 cm床高)堆積床GE Healthcare Capto™ MMC層析管柱純化在上述步驟2中獲得之產物。在使用之前，使用2 CV 25 mM乙酸鹽(pH 5.5)平衡管柱且使用2 CV 0.1 N NaOH、1 M NaCl消毒，並使用2 CV 25 mM乙酸鹽、0.7 M NaCl (pH 5.5)中和。然後使用8-10 CV 25 mM乙酸鹽(pH 5.5)平衡管柱直至流出物為pH 5.5及3.5 mS/cm為止。使用WFI將來自上述步驟2之蛋白質A池稀釋至≤ 6 mS/cm且施加至至多每循環15 g/L介質之管柱載量。以200 cm/h之線性速度操作管柱以得到6分鐘滯留時間。在裝載之後，使用2 CV 25 mM乙酸鹽(pH 5.5)洗滌管柱。然後使用8.5 CV 25 mM乙酸鹽(pH 5.5)至25 mM乙酸鹽、0.7 M NaCl (pH 5.5)之15%至85%梯度洗脫產物。產物收集始於0.15 OD (A280, 1.0 cm路徑長度)且收集止於最大峰之50%。洗脫物體積大約為5 CV。使用2 CV 10 mM Tris、1 M NaCl (pH 8.0)自管柱剝除殘餘產物及污染物並棄除。使用Millipore Opticap XL10, 0.22 μm Durapore膠囊式過濾器(0.69 m2 )過濾自混合模式管柱獲得之產物。自此步驟獲得之產物展現步驟2中所獲得蛋白質A材料之約70%之回收率。步驟 3B. 混合模式陽離子交換層析。使用27.0 L (45 cm直徑×17 cm床高)堆積床GE Healthcare Capto™ Adhere層析管柱進一步純化在上述步驟3A中獲得之產物。在使用之前，使用2 CV 25 mM Tris (pH 8.0)平衡管柱且使用2 CV 0.1 N NaOH、1M NaCl消毒，並使用2 CV 25 mM Tris (pH 8.0)中和及平衡。在裝載產物之前，使用3 CV 10 mM Tris (pH 8.0)平衡管柱。使用約0.045 kg 1 M Tris (pH 8.3)/kg池將來自上述步驟3A之Capto™ MMC池調節至pH 8.1。使用WFI以1:3.8將來自上述步驟3A之產物在線稀釋以將電導率調節至12.0 mS/cm且調節至pH 8.0。然後施加所得材料直至最多15 g/L介質之管柱載量。以170 cm/h之線性速度操作管柱以得到6分鐘滯留時間。在裝載之後，使用2 CV 25 mM Tris (pH 8.0)洗滌管柱。然後使用10 CV 25 mM Tris (pH 8.0)至10 mM Tris、1 M NaCl (pH 8.0)之(20%至90%)梯度洗脫產物。產物收集始於0.15 OD (A280, 1.0 cm路徑長度)且收集止於最大峰之25%。洗脫物體積為4-6 CV。使用市售膠囊式過濾器過濾洗脫產物且然後以已知方式實施病毒過濾及切向流過濾步驟。來自步驟3B (包含最終病毒及切向流過濾步驟)之總產物回收率大約為68%。在過濾步驟之前量測之產物回收率約為75%。根據來自此步驟之洗脫流份所獲得HIC數據之示意性代表圖表示於圖12中。分析 ： 發現在此實例中獲得之最終過濾產物具有大於約90 wt%之正確摺疊之恩博，如藉由HIC所測定；小於5 wt%之不正確摺疊之恩博物質，如藉由HIC所測定；小於約3 wt%之修剪材料(如藉由HIC分析所測定，視為已截短其TNFR部分之恩博片段)；及大於95 wt%之組合量之正確及不正確摺疊之恩博，如藉由尺寸排除層所測定析。 --------------------- 蛋白質結合實際上發生於存在鹽析條件下表明，考慮到疏水性蛋白質結合至HIC通常需要強鹽析，疏水性相互作用可能並不涉及恩博與CaptoTM MMC及CaptoTM Adhere之結。然而，在存在蛋白質與該等混合模式樹脂之間之靜電相互作用下，可促進疏水性相互作用。因此，不期望受限於任一特定理論，即使在不存在鹽析條件下，恩博與混合模式樹脂之結合可經由靜電及疏水性相互作用模式二者來調介。分析型HIC明確指示，錯誤摺疊之物質(其在較低硫酸銨濃度下洗脫出)之疏水性大於正確摺疊之物質。假設正確摺疊及錯誤摺疊之物質具有相同靜電性質且等效結合至CaptoTM MMC或CaptoTM Adhere配體之帶電基團，錯誤摺疊之物質之較強疏水性貢獻可能導致其更緊密結合至混合模式樹脂，由此錯誤摺疊之物質需要較強洗脫條件，如在前述實例中所觀察。對於CaptoTM MMC而言，此可在較高鹽濃度下達成，此可能不足以顯著增強疏水性相互作用，但可足以破壞CaptoTM MMC與正確及不正確摺疊之物質二者之間之額外靜電相互作用。與之相反，CaptoTM Adhere之疏水性似乎大於CaptoTM MMC，從而需要精胺酸或另一選擇為較高鹽濃度(使用較高pH)來洗脫正確摺疊之物質。需要較高精胺酸濃度或較苛刻條件來洗脫錯誤摺疊之物質。 儘管本發明互換使用術語「錯誤摺疊」或「不正確摺疊」或「不適當摺疊」，但亦應理解，該等術語意欲亦涵蓋聚集物質，其中亦發現混合模式樹脂有效去除相同洗脫流份中發現含有錯誤摺疊之物質之聚集物質。實際上，恩博形成二硫化物連接之寡聚物，如在SDS-PAGE中所看到。該等寡聚物主要洗脫於1 M精胺酸洗滌中，從而指示其與樹脂具有較強疏水性相互作用。因此，對於恩博而言，似乎CaptoTM MMC及CaptoTM Adhere二者皆可同時去除錯誤摺疊及聚集物質。高度期望去除錯誤摺疊之材料及聚集物(不論共價抑或非共價)以提供較安全生物藥物，此乃因聚集物材料(不論正確摺疊抑或不正確摺疊)具有潛在免疫原性。 對於前述實例中之精胺酸效應而言，顯而易見，精胺酸(精胺酸鹽酸鹽)不僅用作鹽，且亦弱化疏水性相互作用。精胺酸在業內已知用於阻抑蛋白質聚集及表面吸附。此外，精胺酸與芳族基團相互作用且由此干擾蛋白質之間或蛋白質與表面之間之芳族-芳族或芳族-陽離子相互作用。CaptoTM MMC及CaptoTM Adhere二者皆擁有可有助於蛋白質結合之芳族基團。尚不能預測此一結合模式可由精胺酸但非NaCl有效破壞。精胺酸亦弱化脂肪酸之間之相互作用，從而表明其可破壞並非經由芳族基團調介之疏水性相互作用。精胺酸之疏水性性質(儘管尚未在機械上明確理解)由此可在調變蛋白質-蛋白質相互作用及表面吸附及由此自混合模式樹脂之蛋白質洗脫中發揮重要作用。然而，如上述實例12中所展示，無需使用精胺酸來實踐本發明以提供極高純度之恩博製劑。此或許係由於Capto™ MMC及Capto™ Adhere樹脂與蛋白質之結合具有弱疏水性貢獻。然而，使用精胺酸與NaCl之組合可改良混合模式層析關於蛋白質之回收率及拆分。附錄 A 其他代表性實施例 ( 揭示於優先權申請案 USSN 61/699,552 中 ) A.一種分離正確摺疊之蛋白質與不正確摺疊之蛋白質之混合模式層析方法，其包括以下步驟： (a)使包括給定蛋白質之正確摺疊及不正確摺疊之構型二者之第一蛋白質混合物與具有離子交換部分及疏水性部分二者的混合模式層析樹脂結合； (b)自混合模式樹脂洗脫正確摺疊之蛋白質以獲得第二蛋白質混合物，該第二蛋白質混合物包括之正確摺疊之蛋白質之比例高於第一蛋白質混合物。 B.如實施例A之方法，其中混合模式層析樹脂係CaptoTM MMC混合模式層析樹脂。 C.如實施例A之方法，其中混合模式層析樹脂係CaptoTM Adhere混合模式層析樹脂。 D.如實施例A至C中任一項之方法，其中正確及不正確摺疊之蛋白質構型包括正確摺疊及不正確摺疊之恩博。 E.如實施例D之方法，其中不正確摺疊之恩博構成步驟(b)中所獲得洗脫物之小於約10 wt.%且較佳地小於約5 wt.%；正確摺疊之恩博構成步驟(b)中所獲得洗脫物之大於約90 wt%且較佳地大於約95 wt%；且正確摺疊及不正確摺疊之恩博之組合量構成步驟(b)中所獲得洗脫物之至少約95 wt.%且較佳地至少約98 wt.%。 F.如實施例A至E中任一項之方法，其中混合模式樹脂係CaptoTM MMC且該方法之步驟(a)及(b)係在介於約4.5至約7.5之間之pH下實施；且藉由使混合模式樹脂與鹽溶液接觸來實施洗脫步驟(b)。 G.如實施例A至E中任一項之方法，其中混合模式樹脂係CaptoTM Adhere且步驟(a)及(b)係在約4.5至約8.5之pH下實施；且藉由使混合模式樹脂與鹽溶液接觸來實施洗脫步驟(b)，該溶液視情況進一步包括精胺酸。 H.如實施例F或G之方法，其中在步驟(b)中經由鹽濃度逐漸增加之梯度來施加鹽溶液。 I.如實施例H之方法，其中步驟(b)之鹽濃度梯度使得鹽濃度自約0增加至約1M。 J.如實施例F至I中任一項之方法，其中鹽係選自氯化鈉及硫酸鈉。 K.如實施例A至J中任一項之方法，其中在步驟(b)期間，逐漸改變在步驟(b)中接觸樹脂之溶液之pH。 L.如實施例K之方法，其中逐漸增加pH。 M.如實施例K之方法，其中逐漸降低pH。 N.如實施例A至M中任一項之方法，其中步驟(b)洗脫物中所獲得正確摺疊之蛋白質之量為存在於步驟(a)樹脂中所引入蛋白質混合物中之蛋白質之量的至少約60 wt%。 O.如實施例N之方法，其中正確摺疊之蛋白質之量為存在於步驟(a)樹脂中所引入蛋白質混合物中之蛋白質之量的至少約70 wt.%。 P.如實施例A至O中任一項之方法，其中除下列步驟外，並不實施或無需實施任一層析分離或純化步驟來分離正確摺疊之恩博與不正確摺疊之恩博，即可獲得包括至少90 wt%正確摺疊之恩博及較佳地小於約5 wt.%不正確摺疊之恩博之蛋白質混合物： (1)一或多個純化步驟，較佳地包括蛋白質A層析純化步驟，其中採用該(等)步驟來純化含有基於恩博之蛋白質之收穫細胞培養流體，且其中該純化步驟不使正確摺疊之恩博與不正確摺疊之恩博發生任何顯著分離。 (2)實施例1中所列舉之混合模式層析步驟(a)及(b)；及 (3) SEC、HIC或其他分析型層析步驟，其實施僅用於分析目的。 Q.如實施例A至P中任一項之方法，其中藉由A 280下UV吸光度測定存在於步驟(b)洗脫物中之蛋白質之量；藉由疏水性相互作用層析測定步驟B洗脫物中正確摺疊之恩博之量；且藉由尺寸排除層析測定存在於步驟(b)洗脫物中之正確及不正確摺疊之恩博之組合量。 R.一種混合模式層析方法，其用於純化蛋白質混合物以分離存在於該混合物中之正確摺疊之恩博與不正確摺疊之恩博，該方法包括以下步驟： (a)使具有疏水性部分及離子交換部分之混合模式層析樹脂與含有包括正確摺疊之恩博及不正確摺疊之恩博之蛋白質混合物的溶液接觸，從而正確及不正確摺疊之恩博二者皆附至、結合至或捕獲於混合模式層析樹脂上；及 (b)使混合模式樹脂與能夠自混合模式層析樹脂洗脫恩博蛋白之溶液接觸以獲得洗脫物，在該洗脫物中正確摺疊之恩博對不正確摺疊之恩博之量的比率大於在步驟(a)中引入樹脂中之蛋白質混合物。 S.如實施例R之方法，其中混合模式層析樹脂係CaptoTM MMC混合模式層析樹脂。 T.如實施例R之方法，其中混合模式層析樹脂係CaptoTM Adhere混合模式層析樹脂。 U.如實施例A至T之方法，其中 (A)不正確摺疊之恩博構成步驟(b)中所獲得洗脫物之小於約5 wt.%；正確摺疊之恩博構成步驟(b)中所獲得洗脫物之大於約90 wt%；及正確摺疊及不正確摺疊之恩博之組合量構成步驟(b)中所獲得洗脫物之至少約95 wt.%；或 (B)在步驟(b)中獲得之洗脫物或其部分包括正確摺疊之恩博且不含或基本上不含不正確摺疊之恩博。 V.如實施例A至U中任一項之方法，其中混合模式樹脂係CaptoTM MMC且該方法之步驟(a)及(b)係在介於約4.5至約7.5之間之pH下實施；且藉由使混合模式樹脂與鹽溶液接觸來實施洗脫步驟(b)。 W.如實施例R至V中任一項之方法，其中混合模式樹脂係CaptoTM Adhere且步驟(a)及(b)係在約4.5至約8.5之pH下實施；且藉由使混合模式樹脂與鹽溶液接觸來實施洗脫步驟(b)，該溶液視情況進一步包括精胺酸。 X.如實施例V或W之方法，其中在步驟(b)中經由鹽濃度逐漸增加之梯度來施加鹽溶液。 Y.如實施例X之方法，其中步驟(b)之鹽濃度梯度使得鹽濃度自約0增加至約1 M。 Z.如實施例V至Y中任一項之方法，其中鹽係選自氯化鈉及硫酸鈉。 AA. 如實施例R至Z中任一項之方法，其中在步驟(b)期間，逐漸增加或逐漸降低在步驟(b)中接觸樹脂之溶液之pH。 BB. 如實施例R至AA中任一項之方法，其中步驟(b)洗脫物中所獲得正確摺疊之蛋白質之量為存在於步驟(a)樹脂中所引入蛋白質混合物中之蛋白質之量的至少約60 wt%且較佳地至少約70 wt.%。 CC. 如實施例A至BB中任一項之方法，其中以下列方式實踐該方法兩次或更多次： 藉由實施步驟(a)及(b)來實施第一混合模式分離(1號分離)；隨後 藉由再次實施步驟(a)及(b)來實施第二混合模式分離(2號分離)； 其中將1號分離之步驟(b)中獲得之洗脫物用作在2號分離之步驟(a)中含有蛋白質混合物之溶液。 DD. 如實施例CC之方法，其中在1號分離中使用之混合模式樹脂與在2號分離中使用之混合模式樹脂相同或不同。 EE. 如實施例DD之方法，其中以選自下列組合之方式來實施1號分離及2號分離： 1號分離使用Capto™ MMC作為混合模式層析樹脂且 2號分離使用Capto™ ADHERE作為混合模式層析樹脂； --------- 1號分離使用Capto™ ADHERE作為混合模式層析樹脂且 2號分離使用Capto™ MMC作為混合模式層析樹脂； -------- 1號分離使用Capto™ MMC作為混合模式層析樹脂且 2號分離使用Capto™ MMC作為混合模式層析樹脂；或 -------- 1號分離使用Capto™ ADHERE作為混合模式層析樹脂 2號分離使用Capto™ ADHERE作為混合模式層析樹脂。 FF. 如實施例EE之方法，其中以下列方式實施1號分離及2號分離：1號分離使用Capto™ MMC作為混合模式層析樹脂；且2號分離使用Capto™ ADHERE作為混合模式層析樹脂。 GG. 一種含有恩博之蛋白質混合物或包括該混合物之醫藥上可接受之調配物，其係藉由如實施例A至FF中任一項之方法獲得，且其中該蛋白質混合物以構成蛋白質混合物之大於約90 wt.%之量包括正確摺疊之恩博；且以構成蛋白質混合物之小於約5 wt%之量包括不正確摺疊之恩博；且其中蛋白質混合物中正確摺疊及不正確摺疊之恩博之組合量構成含有恩博之蛋白質混合物的至少約95 wt.%且較佳地至少約98 wt.%。 HH. 一種醫藥上可接受之調配物，其含有高純恩博且適於投與需要治療TNFα介導病狀之個體，該調配物含有包括大量正確摺疊之恩博及少量不正確摺疊之恩博之蛋白質混合物，其中： (i)不正確摺疊之恩博構成蛋白質混合物之小於約10 wt.%、較佳地小於約8 wt.%且最佳地小於約5 wt.%； (ii)正確摺疊之恩博構成蛋白質混合物之大於90 wt.%且較佳地大於約92 wt%且較佳地大於約95 wt%；且 (iii)正確摺疊之恩博及不正確摺疊之恩博(但不包含其聚集物)之總量構成蛋白質混合物之至少95 wt%且較佳地至少98重量%； 其中該調配物進一步包括致使調配物適於投與個體之醫藥上可接受之惰性成份、賦形劑或載劑。 II. 如實施例HH之調配物，其中恩博製劑構成調配物之約25 mg/ml至約75 mg/ml，且調配物進一步包括蔗糖、氯化鈉、L-精胺酸鹽酸鹽及磷酸鈉。 JJ. 一種產生含有恩博之蛋白質混合物之方法，該混合物就其中所存在正確摺疊之恩博量對不正確摺疊之恩博量而言具有高純度，該方法包括以下步驟： (1)在哺乳動物表現系統中表現恩博以獲得收穫細胞培養流體，其含有包括正確摺疊及不正確摺疊之恩博二者之含有恩博之蛋白質混合物； (2)對在步驟1中獲得之收穫細胞培養流體實施純化製程，藉此獲得含有恩博之蛋白質混合物，其具有減少量之或實質上不含在步驟(1)中產生之收穫細胞培養流體中存在之不期望雜質； (3)使在步驟(2)中獲得之含有恩博之蛋白質混合物與具有離子交換部分及疏水性相互作用部分二者之混合模式層析樹脂接觸一或多次，以將混合物中所含的蛋白質附於樹脂上；及 (4)使來自步驟3之上面結合有蛋白質之樹脂與溶液接觸以自混合模式樹脂洗脫正確摺疊之恩博，從而獲得洗脫物，該洗脫物包括含有恩博之蛋白質混合物，該混合物中正確摺疊之恩博對不正確摺疊之恩博之比例高於在步驟3中引入樹脂中之含有恩博之混合物； 其中： (i)存在於自步驟2純化所獲得含有恩博之蛋白質混合物中蛋白質之量為存在於步驟1中所獲得收穫細胞培養流體中基於恩博之蛋白質混合物量的至少約80 wt%； (ii)存在於步驟4中所洗脫蛋白質混合物中之正確及不正確摺疊之恩博蛋白之組合量為存在於自步驟2所獲得蛋白質混合物中之其量的至少約60 wt.%； (iii)存在於步驟4洗脫物中之正確摺疊之恩博量為存在於步驟1中所獲得收穫細胞培養流體中之含有恩博之蛋白質混合物量的至少約30 wt.%且較佳地至少約35 wt.%；且 (iv)該正確摺疊之恩博構成步驟4中所獲得洗脫物之至少約90 wt%且較佳地至少約95 wt.%。 KK. 如實施例JJ之方法，其中混合模式樹脂係選自由Capto™ MMC及Capto™ ADHERE組成之群。 LL.如實施例JJ或KK之方法，其包括下列額外步驟： 步驟(5)：使在步驟4洗脫物中獲得之蛋白質混合物與具有離子交換部分及疏水性相互作用部分二者之混合模式層析樹脂接觸以將混合物中所含之蛋白質附於樹脂上，且然後； 步驟(6)使樹脂與溶液接觸以自其洗脫正確摺疊之恩博，從而獲得洗脫物，該洗脫物包括正確摺疊之恩博對不正確摺疊之恩博之比例較高的蛋白質混合物； 其中在該等額外步驟5及6中使用之混合模式樹脂與在步驟3及4中使用之混合模式樹脂相同或不同。 MM.如實施例LL之方法，其中在步驟(3)及(4)中使用之混合模式樹脂係Capto™ MMC且在步驟(5)及(6)中使用之樹脂係Capto™ ADHERE。 NN. 如實施例JJ至MM中任一項之方法，其中藉由使混合模式樹脂與鹽溶液接觸以自混合模式樹脂洗脫正確摺疊之恩博來實施步驟4 (及/或在實施例LL之情形下步驟6)，且視情況(i)其中在步驟(4)或(6)中於溶液與樹脂之該接觸期間逐漸增加鹽溶液之濃度；且視情況(ii)在步驟(4)及/或(6)中於溶液與樹脂之該接觸期間逐漸增加或降低洗脫溶液之pH。 OO. 如實施例JJ至NN中任一項之方法，其中對在該方法之一或多個步驟中獲得之產物實施過濾，例如病毒過濾及/或切向流過濾。 PP.如實施例JJ至OO中任一項之方法，其中使用蛋白質A層析管柱實施步驟2。 QQ. 如實施例JJ至OO中任一項之方法，其中使用具有疏水性及離子交換部分之混合模式樹脂實施步驟2。 RR. 如實施例A至PP中任一項之方法，其中獲得包括至少90 wt%正確摺疊之恩博及較佳地小於約5 wt.%不正確摺疊之恩博之蛋白質混合物，且除一或多個下列步驟外並不實施任一層析分離或純化步驟來分離正確摺疊之恩博與不正確摺疊之恩博： (1)視情況一或多個純化步驟，較佳地包括蛋白質A層析純化步驟，採用一或多個該步驟來純化含有基於恩博之蛋白質之收穫細胞培養流體，其中該純化步驟並不分離正確摺疊之恩博與不正確摺疊之恩博； (2)實施該等在實施例A中列舉之混合模式層析步驟(3)及(4) (或根據實施例LL之步驟3、4、5及6)一或多次；及 (3)視情況一或多個SEC、HIC或其他層析步驟，其實施僅用於分析目的。 SS. 如實施例A至RR中任一項之方法，其除了在僅出於分析目的實施時，不包含使用單一模式疏水性相互作用層析作為分離正確摺疊之恩博與不正確摺疊之恩博之方式。 TT. 一種治療患有TNF介導疾病之個體之方法，其包括以下步驟：向該個體投與含有包括正確摺疊之恩博及不正確摺疊之恩博之蛋白質混合物的醫藥調配物，該混合物係藉由如實施例A至SS中任一項之方法獲得，其中蛋白質混合物中不正確摺疊之恩博之量小於該混合物之約5 wt%。 UU. 如實施例TT之方法，其中蛋白質混合物中不正確摺疊之恩博之量小於該混合物之約3 wt%，且混合物中正確摺疊之恩博之量大於該混合物之約95 wt%。 VV. 一種治療患有TNF介導疾病之個體之方法，其包括以下步驟：向該個體投與含有包括正確摺疊之恩博及不正確摺疊之恩博之蛋白質混合物的醫藥調配物，其中蛋白質混合物中不正確摺疊之恩博之量小於該混合物之約5 wt%。 WW. 如實施例TT至VV之方法，其中蛋白質混合物中不正確摺疊之恩博之量小於該混合物之約3 wt%，且混合物中正確摺疊之恩博之量大於混合物之約95 wt%。 XX. 如實施例TT至VV中任一項之方法，其中正確摺疊及不正確摺疊之恩博(不包含其聚集物)之組合量為該混合物之至少約95 wt%。 YY. 如實施例XX之方法，其中正確摺疊及不正確摺疊之恩博(不包含其聚集物)之組合量為該混合物之至少約98 wt%。 ZZ. 如實施例A至YY中任一項之方法或組合物，其中除非另有所述，否則術語「不正確摺疊之恩博」應理解為包含含有正確摺疊及/或不正確摺疊之恩博之聚集物。 AAA. 如實施例JJ至QQ之方法，其中藉由Fc elisa測定在步驟1之收穫細胞培養物中所含基於恩博之蛋白質之量。 BBB. 如實施例JJ至QQ中任一項之方法，其中藉由A280下UV吸光度測定存在於自在步驟4 (或在實施例LL之情形下步驟4及6)中之混合模式樹脂所獲得洗脫物中之基於恩博之蛋白質的量。 CCC. 如實施例BBB之方法，其中藉由A280下UV吸光度或藉由Fc elisa測定存在於自步驟2之純化製程所獲得產物中之基於恩博之蛋白質的量。 DDD. 一種分離正確摺疊之恩博與不正確摺疊之恩博之方法，其中使用層析方式來達成該分離，且其中層析方式僅或基本上由混合模式層析組成，其中使包括正確摺疊及不正確摺疊之恩博之混合物與具有離子交換及疏水性部分之混合模式層析樹脂接觸，且然後自其洗脫，從而獲得包括至少約85 wt%且較佳地至少約90 wt%且最佳地至少約95 wt%之正確摺疊之恩博之洗脫物。 EEE. 如實施例DDD之方法，其中混合模式樹脂係選自Capto™ MMC及Capto™ ADHERE；使用鹽溶液來實施洗脫，該鹽溶液視情況使用鹽濃度遞增之梯度來施加；鹽溶液之pH在約4至約8.5之範圍內，其係視情況以逐漸增加或降低pH之梯度來施加；且其中經一定時間段自樹脂獲得洗脫物，且在該時段早期收集之洗脫物不含或基本上不含不正確摺疊之恩博。
圖 1 展示Capto™-MMC及Capto™-Adhere混合模式樹脂之化學結構。圖 2A (來自蛋白質A之洗脫圖)展示來自包括正確摺疊及錯誤摺疊之恩博蛋白二者之CHO收穫培養物之蛋白質-A的洗脫圖，其係藉由在指示pH下使用含有1 M精胺酸之0.1 M檸檬酸鹽進行洗脫。實曲線係UV吸光度；虛曲線係電導率(下列各圖中相同)。圖 2B (來自蛋白質A之洗脫圖)展示自蛋白質-A洗脫之試樣之原態PAGE結果，其中泳道1係標準物(商業Enbrel)；泳道2係負載；泳道3係FT (流經物)；泳道4：pH 6.0；泳道5：pH 4.2；泳道6：pH 3.7；泳道7：pH 3.0。圖 3A (來自Capto™ MMC之蛋白質A池之洗脫圖)展示藉由存於10 mM磷酸鹽(pH 7.5)中之NaCl或精胺酸洗脫之Capto™ MMC層析圖。圖 3B (來自Capto™ MMC之蛋白質A池之洗脫圖)洗脫試樣之SDS-PAGE及原態PAGE，其中泳道0：標準物；泳道1：負載；泳道2：FT；泳道3：0.15 M NaCl；泳道4：0.3 M NaCl；泳道5：1 M精胺酸。圖 4A (來自Capto™ MMC之蛋白質A池之洗脫圖)展示藉由0-0.5 M NaCl梯度(在pH 7.5下)洗脫之層析。在梯度洗脫之前，使用10 mM磷酸鹽(pH 7.5)平衡管柱。圖 4B (來自Capto™ MMC之蛋白質A池之洗脫圖)展示洗脫試樣之原態PAGE，其中：泳道0：標準物；泳道1：負載；泳道2至泳道8：洗脫流份；泳道9：1 M精胺酸。圖 4C (來自Capto™ MMC之蛋白質A池之洗脫圖)展示不同蛋白質A池之洗脫試樣之SDS-PATE及原態PAGE，其中：泳道0：標準物；泳道1：負載，泳道2：FT；泳道3至泳道8：洗脫流份；泳道9：1 M精胺酸。圖 5A (來自Capto™-MMC之蛋白質-A池之洗脫圖)藉由0-0.4 M Na2 SO4 梯度(在pH 7.5下)洗脫之層析圖。在梯度洗脫之前，使用10 mM磷酸鹽(pH 7.5)平衡管柱。圖 5B . (來自Capto™-MMC之蛋白質-A池之洗脫圖)洗脫試樣之SDS-PAGE及原態PAGE，其中：泳道1：負載；泳道2：FT；泳道3：洗滌緩衝液；泳道4至泳道9：洗脫流份；泳道10：1 M精胺酸。圖 6 展示Capto™-MMC洗脫流份之HIC分析。圖 7A (來自Capto™-MMC之蛋白質-A池之洗脫圖)展示藉由pH及鹽梯度洗脫之層析圖。圖 7B (來自Capto™-MMC之蛋白質-A池之洗脫圖)展示洗脫試樣之SDS-PAGE及原態PAGE，其中泳道0：標準物；泳道1：負載；泳道2及3：FT；泳道4至泳道8：洗脫流份；泳道9：1 M精胺酸。圖 8A (來自Capto™-MMC之蛋白質-A池之洗脫圖)展示藉由pH及Na2 SO4 梯度洗脫之層析圖。圖 8B (來自Capto™-MMC之蛋白質-A池之洗脫圖)展示洗脫試樣之SDS-PAGE及原態PAGE，其中泳道0：標準物；泳道1：負載；泳道2：FT；泳道3至泳道5：洗脫流份；泳道6：1 M精胺酸。圖 9 展示來自Capto™-Adhere之蛋白質-A池之原態PAGE，其中泳道0：標準物；泳道1：負載；泳道2：5 mM檸檬酸鹽(pH 4,5)；泳道3及4：0.1 M精胺酸(pH 4.5)；泳道5：0.5 M精胺酸。將所觀察之低分子量物質加邊框。圖 10A (來自Capto™-Adhere之蛋白質-A池之洗脫圖)展示藉由pH及精胺酸梯度洗脫之層析圖。圖 10B (來自Capto™-Adhere之蛋白質-A池之洗脫圖)展示洗脫試樣之SDS-PAGE及原態PAGE，其中：泳道0：標準物；泳道1：負載；泳道2至泳道4：FT；泳道5至泳道7：洗脫流份；泳道8：0.5 M精胺酸。圖 11A (來自Capto™-Adhere之蛋白質-A池之洗脫圖)展示藉由pH及精胺酸梯度洗脫之層析圖。圖 11B (來自Capto™-Adhere之蛋白質-A池之洗脫圖)展示洗脫試樣之原態PAGE，其中：泳道0：標準物；泳道1：負載；泳道2：FT；泳道3至泳道5：洗脫流份；泳道6：1 M精胺酸。圖 12 係在實例12之步驟3B中所獲得Capto™-Adhere混合模式樹脂洗脫流份之HIC (疏水性相互作用層析)分析之示意性代表圖，其中負載試樣係在實例12之步驟3A中獲得之材料。縱軸指示正確摺疊之恩博之百分比，且橫軸代表隨時間施加之鹽梯度。在梯度早期獲得之洗脫流份含有100%之正確摺疊之恩博。圖 13 (來自Capto™-Adhere之Capto™-MMC池之洗脫圖)展示洗脫試樣之SDS及原態PAGE。使用精胺酸梯度在pH 7.5下進行洗脫，其中：泳道0：標準物；泳道1：負載；泳道2及3：FT；泳道4至泳道7：洗脫流份；泳道8：1 M精胺酸。圖 14 係來自Capto™-Adhere之Capto™-MMC池之洗脫層析圖。藉由NaCl梯度在pH 7.5下進行洗脫。圖 15A (來自Capto™-Adhere之Capto™-MMC池之洗脫圖)展示藉由鹽/精胺酸梯度在pH 7.5下洗脫之層析圖。圖 15B (來自Capto™-Adhere之Capto™-MMC池之洗脫圖)洗脫試樣之SDS-PAGE及原態PAGE，其中：泳道0：標準物；泳道1：負載；泳道2：FT；泳道3至泳道6：洗脫流份；泳道7：1 M精胺酸。圖 16 係對應於在實例12中產生之恩博材料之HIC層析圖，其中展現基本上沒有第二較小峰(錯誤摺疊之材料)之曲線對應於根據本發明產生之材料(實例12)；且其中看到圖中對應於市售恩博之另一曲線(出於對比目的提供)展現代表錯誤摺疊及/或聚集材料之第二次要峰。

Claims (30)

  1. 一種含有恩博(etanercept)之蛋白質混合物，其包含構成該蛋白質混合物之大於約90 wt.%之量之正確摺疊之恩博，其中該蛋白質混合物相較於商業獲得之恩博具較低免疫原性。
  2. 一種醫藥上可接受之調配物，其包含如請求項1之含有恩博之蛋白質混合物。
  3. 如請求項2之醫藥上可接受之調配物，其中該正確摺疊之恩博構成該蛋白質混合物之約25至約75 mg/ml。
  4. 如請求項2之醫藥上可接受之調配物，其進一步包含緩衝液。
  5. 如請求項2之醫藥上可接受之調配物，其進一步包含張度改質劑。
  6. 如請求項2之醫藥上可接受之調配物，其進一步包含糖、多元醇或糖及多元醇兩者。
  7. 如請求項2之醫藥上可接受之調配物，其進一步包含胺基酸。
  8. 如請求項2之醫藥上可接受之調配物，其進一步包含表面活性劑。
  9. 如請求項2之醫藥上可接受之調配物，其中該調配物不含有精胺酸。
  10. 如請求項2之醫藥上可接受之調配物，其中該調配物具有約5.8至約8.4之pH。
  11. 如請求項2之醫藥上可接受之調配物，其中該調配物具有約180至約420 mOsM之滲透壓。
  12. 如請求項3之醫藥上可接受之調配物，其進一步包含緩衝液、張度改質劑及表面活性劑，其中該調配物具有約5.8至8.4之pH。
  13. 如請求項12之醫藥上可接受之調配物，其中該調配物不含有精胺酸。
  14. 一種如請求項2之醫藥上可接受之調配物的用途，其係用於製備治療患有TNF介導疾病之患者的藥物。
  15. 如請求項14之用途，其中該TNF介導疾病為類風濕性關節炎、斑塊狀牛皮癬、牛皮癬性關節炎、幼年型特發性關節炎或強直性脊柱炎。
  16. 一種含有恩博(etanercept)之蛋白質混合物，相較於商業獲得之恩博，其包含較少之錯誤摺疊及/或聚集恩博，其中該蛋白質混合物相較於該商業獲得之恩博具較低免疫原性。
  17. 一種醫藥上可接受之調配物，其包含如請求項16之含有恩博之蛋白質混合物。
  18. 如請求項17之醫藥上可接受之調配物，其中該正確摺疊之恩博構成該蛋白質混合物之約25至約75 mg/ml。
  19. 如請求項17之醫藥上可接受之調配物，其進一步包含緩衝液。
  20. 如請求項17之醫藥上可接受之調配物，其進一步包含張度改質劑。
  21. 如請求項17之醫藥上可接受之調配物，其進一步包含糖、多元醇或糖及多元醇兩者。
  22. 如請求項17之醫藥上可接受之調配物，其進一步包含胺基酸。
  23. 如請求項17之醫藥上可接受之調配物，其進一步包含表面活性劑。
  24. 如請求項17之醫藥上可接受之調配物，其中該調配物不含有精胺酸。
  25. 如請求項17之醫藥上可接受之調配物，其中該調配物具有約5.8至約8.4之pH。
  26. 如請求項17之醫藥上可接受之調配物，其中該調配物具有約180至約420 mOsM之滲透壓。
  27. 如請求項18之醫藥上可接受之調配物，其進一步包含緩衝液、張度改質劑及表面活性劑，其中該調配物具有約5.8至8.4之pH。
  28. 如請求項27之醫藥上可接受之調配物，其中該調配物不含有精胺酸。
  29. 一種如請求項17之醫藥上可接受之調配物的用途，其係用於製備治療患有TNF介導疾病之患者的藥物。
  30. 如請求項29之用途，其中該TNF介導疾病為類風濕性關節炎、斑塊狀牛皮癬、牛皮癬性關節炎、幼年型特發性關節炎或強直性脊柱炎。
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