MX2015003090A - Etanercept plegado correctamente con alta pureza y un rendimiento excelente. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método cromatográfico de modo mixto para separar correctamente de conformaciones correctamente plegadas de las incorrectamente plegadas de una determinada proteína; el método es altamente efectivo para separar etanercept correctamente plegado de etanercept incorrectamente plegado y agregados con rendimientos comercialmente atractivos capaces de producir preparaciones etanercept con muy alta pureza en términos de etanercept correctamente plegado contra etanercept incorrectamente plegado; la invención además se refiere a preparaciones de proteínas y formulaciones que comprende las proteínas correctamente plegadas obtenidas mediante los métodos actuales y los métodos de tratamiento con las preparaciones de alta pureza obtenidas por el método de modo mixto.

Description

ETANERCEPT PLEGADO CORRECTAMENTE CON ALTA PUREZA Y UN RENDIMIENTO EXCELENTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a los métodos de separación cromatográfica para la purificación de proteínas expresadas por vía recombinante y productos obtenidos de tales métodos. Más concretamente, se refiere al uso de cromatografía en modo mixto para purificar un producto de expresión de la proteína recombinante, incluyendo, por ejemplo, proteínas de fusión que pueden incluir cantidades indeseadas de proteínas incorrectamente plegadas y/o agregadas junto con proteínas correctamente plegadas. El método de cromatografía de modo mezclado de la invención es especialmente útil para separar correctamente etanercept plegado de etanercept incorrectamente plegado (como se define en el presente documento). La invención también se refiere a preparaciones de etanercept y formulaciones farmacéuticas en donde el etanercept suministrado en esta se ha producido con alto rendimiento y alta pureza utilizando el método descrito. La invención además se refiere a los métodos de tratamiento para condiciones de TNF empleando etanercept altamente purificado caracterizado por niveles notablemente bajos de proteína mal plegada/agregada.

ANTECEDENTESDELAINVENCIÓN Etanercept (Enbrel®, fabricado por Immunex Corporation) es un polipéptido de fusión dimérica consistente de la porción de unión a ligando extracelular del receptor de factor de necrosis tumoral humano 75 kilodalton (p75) ("TNFR") unido a la región de receptor Fe [fragmento, cristalizable] de la inmunoglobulina G humana ("IgGl"). Etanercept consiste en 934 aminoácidos y tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 150 kilodaltons (Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company, Inc.)· El componente Fe del etanercept contiene el dominio pesado constantes 2 (CFI2), el dominio constante pesado 3 (CH3) y la región bisagra, pero no el dominio constante pesado 1 (CH1) de IgGl humana. Un dominio de Fe puede contener uno o todos los dominios descritos anteriormente.

Las personas que sufren de ciertos tipos de enfermedades inflamatorias como artritis reumatoide, psoriasis, artritis psoriásica, artritis idiopática juvenil y espondilitis anquilosante, tienen un sistema inmune que produce el factor de necrosis tumoral ("TNF"). La administración de etanercept se ha encontrado que es eficaz para el tratamiento de algunas enfermedades inflamatorias porque puede reducir los niveles de la forma activa de TNF en un sujeto al unirse a TNF como un receptor de señuelo.

Etanercept puede producirse de una manera conocida por teenología del ADN recombinante en un sistema de expresión de células de mamífero de ovario de hámster chino ("CHO"). Desafortunadamente, el producto que es producido por las células CHO contiene una gran cantidad de etanercept de forma incorrecta o mal plegado y/o agregado. Para uso farmacéutico, es conveniente proporcionar etanercept que es relativamente libre de proteínas incorrectamente plegadas y agregados debido a que la proteína incorrectamente plegada/agregada no tendrá el mismo efecto terapéutico que la proteína correctamente plegada y en realidad puede ser perjudicial para el paciente.

El mal plegado y la agregación ocurren con frecuencia durante la producción de proteínas recombinantes y por lo tanto, deben abordarse a través de procedimientos aguas abajo capaces de separar las proteínas correctamente plegadas de la proteína que está mal plegada o agregada. El mal plegado reduce o elimina el efecto terapéutico de la proteína. La agregación, generalmente se entiende que implica la asociación no covalente de dos o más homodímeros de etanercept para formar especies de muy alto peso molecular, resulta en una pérdida similar de efecto terapéutico y ocurre cuando las proteínas, incluyendo proteínas mal plegadas, se acumulan y se agrupan. Como se indicó anteriormente, estas proteínas mal plegadas y agregados de proteína no sólo son ineficaces terapéuticamente, sino que también pueden ser perjudiciales para el paciente. Por consiguiente, la capacidad de purificar un producto de expresión de proteínas que contiene etanercept de modo que etanercept correctamente plegado esté separado de etanercept mal plegado y/o agregado es importante para la obtención de etanercept que proporciona el mayor grado posible de aceptabilidad farmacéutica.

La producción de proteínas mal plegadas y agregadas no es un problema específico de etanercept. Hay muchas proteínas terapéuticas para las cuales el mal plegado puede ser un problema. Por ejemplo, el mal plegado de proteínas que contienen disulfuro durante el re-pliegue de proteínas recombinantes de cuerpos de inclusión de Escherichia coli es difícil de evitar, pero se puede separar con eficacia por cromatografía de fase reversa con alta resolución. El uso de pH bajo y solvente orgánico en cromatografía de fase reversa, sin embargo, puede desnaturalizar las proteínas y puede provocar la agregación de la proteína purificada durante la cromatografía.

Incluso cuando el mal plegado se cree que es insignificante durante la producción de proteínas farmacéuticas, por ejemplo, en el caso de expresión secretora de mamífero, agregación y algunos mal plegados todavía pueden ocurrir (véase por ejemplo, Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W. and Carpenter, J. F., Physical StabiHty of Proteins in Aqueous Solution: Mechanism and Driving Forces i n Nonnative Protein Aggregation, Pharm. Res., 20, 1325-1336 (2003); Kiese, S., Pappenberger, A., Friess, W., and Mahler, H. C, Shaken, Not Stirred: Mechanical Stress Testing of an IgGl Antibody, J. Pharm. Sci., 97, 4347-4366 (2008)). Los investigadores han separado con éxito proteínas no-nativas, mal plegadas en condiciones no desnaturalizantes utilizando cromatografía empleando acuosa de intercambio iónico ("IEC") (véase, por ejemplo Gagnon, P. J., Antibody Aggregate Removai by Hydroxyapatite Chromatography in the Presence of Po/yethy/ene G/ycol, Immunol. Methods, 336, 222-228 (2008); Gagnon, P., Purification Tools for Monodona I Antibodies, Validated Biosystems, Tucson, AZ, 57-87 (1996); Shukla, A. A., and Yigzaw, Y., Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceuticat Industry, Shukla, A., Etzel, M., and Gadam, S., eds., 179-227, CRC Press, Boca Ratón (2007); Staby, A., Jacobsen, J. H., Hansen, R. G., Bruus, U. K., Jensen, I. H., Comparison of Chromatographic Ion-exchange Resins. V. Strong and Weak Cation-Exchange Resins, J.Chromatogr. A, 1118, 168-179 (2006); Shukla, A. A., Hubbard, B., Tressel, T., Guhan, S., Low, D. J., Downstream Processing of Monodonai Antibodies-AppHcation of P/atform Approaches, Chromatogr. B, 848, 28-39 (2007); Shihara, T., Kadoya, T. 3., Acce/erated Purifícation Process Deveíopment of Monodonai Antibodies for Shortening Time to C/inic: Design and Case Study of Chromatography Processes, Chromatogr. A, 1176, 149-156 (2007); Fahrner, R. L., Knudsen, H. L., Bascy, C. D., Galan, W., Feuerhelm, D., Vanderlaan, M., Blank, G. S., Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies: Deveíopment, Operation, and Va/idation of Chromatography Processes, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 18, 301-27 (2001); and Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A. and Vedantham, G., Ion Exchange Chromatography of Proteins and Ciearance of Aggregates, Curr. Pharm. Biotech., 10, 421-426 (2009)), hydrophobic interaction ("HIC") (see e.g., Chen, J., Tetrault, 3., Ley, A., Comparison of Standard and New Generation Hydrophobic Interaction Chromatography Resins in the Monodonai Antibody Purifícation Process, J. Chromatogr. A., 1177, 272-81 (2008); Gagnon, P., and Grund, E., Large Scale Process Deveíopment for Hydrophobic Interadion Chromatography, Parí 4: Controlling Selectivity, BioPharm, 9, 54-64 (1996); and Lu, Y., Williamson, B., and Gillespie, R., Recent Advancement in Application of Hydrophobic Interadion Chromatography for Aggregate Removai ¡n Industrial Purification Process, Curr. Pharm. Biotech., 10, 427-33 (2009)) and hydroxyapatide ("FIA") chromatography (see e.g., Aoyama, K., Chiba, 1, Separation of Molecular Forms of Mouse IgG and IgM Monodonai Antibodies in High Performance Liquid Chromatography on Spherical Hydroxyapatite Beads, J. Immunol. Methods, 162, 201-210 (1993); Luellau, E., Marison, W., von Stockar, U., Ceramic Hydroxapatite: A New Tool for Separation and Analysis of IgA Monocolonal Antibodies, in Animal Cell Technology, Carondo, M., ed., Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 265-269 (1997); Luellau, E., von Stockar, U., Vogt, S., Freitag, R., Deveíopment of a Downstream Process for the Isolation and Separation of Monodonai Immunoglobulin A Monomer, Dimers, and Po/ymers from Cell Culture Supernatant, J. Chomatogr. A., 796, 165-175 (1998); Yamakawa, Y., Chiba, 3., High Performance Liquid Chromatography of Mouse Monodonai Antibodies on Spherical Hydroxyapatite Beads, J. ?quid. Chromatogr., 11, 665-681 (1998); Coppola, G., Underwood, J., Cartwright, G., Hearn, M. T., High-performance Liquid Chromatography of Amino Acids, Peptides and Proteins: XCIII. Comparison of Methods for the Purif ¡catión of Mouse Monodonai Immunogiobuiin M Autoantibodies, J. Chromatogr. A., 476, 269-290 (1989); Josics, D., Loster, K., Kuhl, R., Noli, F., Reusch, J., Purification of Monodonai Antibodies by Hydroxyiapatite HPLC and Size Exclusión HPLC, Biol. Chem. Hoppe-Scylars, 372, 149-156 (1991); Gagnon, P., and Beam, K., Antibody Aggregate Removai by Hydroxyapatite Chromatography, Curr. Pharm. Biotech. (2008)).

Enseñanzas anteriores como los que se hace referencia arriba no han demostrado ser útiles para su aplicación a la separación de etanercept correctamente plegado de etanercept incorrectamente plegado en que no logran proporcionar muestras adecuadas cualitativa y/o cuantitativamente. En consecuencia, hay una necesidad en la téenica de una técnica de separación eficaz y eficiente para el uso con etanercept que produce células CHO capaz de proporcionar preparaciones etanercept de muy alta pureza (es decir, en donde etanercept incorrectamente plegado está ausente o presente en la actualidad en niveles muy bajos) y con rendimientos productivos comercialmente atractivos.

La presente invención emplea la llamada cromatografía de "modo mixto". Un método de cromatografía para purificar las proteínas expresadas por vía recombinante generalmente puede denominarse "modo mixto" cuando utiliza al menos dos diferentes fuerzas para unir las proteínas y separar un producto de proteína deseada de materiales indeseados que pueden estar presentes en un producto de expresión relativamente impuro que contiene la proteína deseada junto con las impurezas indeseadas. Estas fuerzas pueden incluir, por ejemplo, las fuerzas electrostáticas y fuerzas hidrofóbicas.

La cromatografía de modo mixto funciona de manera similar a las técnicas más tradicionales de cromatografía en que hay una fase estacionaria y una fase móvil. Normalmente la fase estacionaria es una resina insoluble o gel, normalmente conocida como la resina de cromatografía, que proporciona la base para la separación. La resina está contenida en una columna que permite a los líquidos a pasar a través y contactar la resina. La capacidad de la resina de cromatografía para separar el material deseado de material no deseado se hace posible por la presencia de grupos químicos seleccionados, o radicales, que se conjugan a la resina. Estos grupos conjugados, típicamente llamados ligandos, dan a la resina las propiedades de afinidad necesarias (es decir, propiedades de atracción electrostática resultante de radicales de intercambio iónico presentes en los ligandos y propiedades de atracción hidrofóbica resultantes de radicales hidrofóbicos presentes en los ligandos) de tal modo permitiendo que la resina se una en algunos de los materiales de proteína en una muestra impura, pero otros no, cuando una solución que contiene la muestra impura se deja fluir a través de la columna de cromatografía en contacto con la resina.

La fase estacionaria de la columna de cromatografía que contiene la resina con estos grupos de afinidad se empaca dentro de la columna de cromatografía que suele ser un recipiente cilindrico rígido en donde el fluido puede ser introducido en un extremo, contacto con la resina y luego la salida de la columna en un extremo opuesto. Una solución que contiene la proteína a ser purificada puede ser introducida en (y así permite que fluya) la columna colocando el producto de proteína en una solución adecuada y permitiendo que la solución, llamada la fase móvil, viaje a través de la columna. Cuando el producto de la proteína a ser purificada (llamado el analito) se presenta a la columna en la fase móvil, alcanza un estado de equilibrio entre la columna y la fase móvil, lo que significa que parte del material en la solución de proteína se fije, una o llegue a fijarse en o capture por los grupos de afinidad de la resina de la columna, mientras que el resto del material en el producto no se una a la columna, pero en cambio fluya a través y fuera de la columna donde se puede recoger para el análisis, procesamiento posterior, o puede ser desechado.

Una vez que un analito de proteína se ha unido a la columna de la manera antes descrita, un paso de lavado— típicamente llamado un paso de elución-se utiliza entonces para eluir, o liberar, el analito unido de la columna. Dependiendo del tipo de ligandos de afinidad (por ejemplo, radicales basados en la carga o radicales hidrofóbicos, o una combinación de éstos, etc.,) que están presentes en la resina para unir el analito a la columna, la solución utilizada para eluir o liberar el analito de la columna debe tener una afinidad o una atracción hacia el analito y/o el ligando (propiedades de carga ejemplares, propiedades hidrofóbicas, propiedades de pH, concentración de sal, etc.) que puede superar la afinidad del analito, o atracción, a la resina, causando de esta manera que el analito sea liberado de la resina (la fase estacionaria que se hace referencia anteriormente) y en el medio de elución (la fase móvil). Una vez liberado o eluido en la fase móvil, el analito entonces puede fluir a través y fuera de la columna de cromatografía para la eventual colección, análisis, etc, o la transferencia a otros métodos de purificación o pasos de filtración. Puede entenderse que cualquiera que sean las propiedades de atracción o afinidad, causan que un analito se una a la resina de cromatografía (por ejemplo, propiedades de carga o propiedades hidrofóbicas), la solución de fase móvil que posteriormente se utiliza para eluir o liberar el analito debe tener un conjunto de competencia de propiedades tales que el analito entonces "prefiere" estar en el medio de elución más que permanecer capturado en la resina de la columna.

En comparación con otras téenicas de cromatografía de modo sencillo, la llamada cromatografía de modo mixto es única en que los diversos factores de unión y elución pueden ser interdependientes y pueden oponerse a otro. Por ejemplo, aumentando la fuerza iónica de la fase móvil en cromatografía de intercambio iónico tradicional en modo sencillo puede conducir la elución o liberación de analito unido a la resina cuando las características cargadas de un analito tienen una atracción más fuerte (preferencia) para el medio de elución contra las fuerzas de atracción de la resina de la columna. Sin embargo, en un método de cromatografía de modo mixto donde la resina de cromatografía usa la atracción electrostática así como la atracción hidrofóbica para unir un analito, aumentando la fuerza iónica de la fase móvil (elución) puede conducir la liberación de material de muestra de la columna basada en propiedades de la carga de ese material, mientras que al mismo tiempo conducen o refuerzan la unión de materiales hidrofóbicos en el analito debido a que tales materiales de proteína hidrofóbica-en presencia de medio de elución basado en la carga-entonces tenderán a tener una más fuerte atracción o preferencia a unirse a los ligandos hidrofóbicos de la columna contra el medio ambiente cargado del medio de elución. En consecuencia, mientras que un aumento en la concentración de sal puede manejar efectivamente una tendencia a desplazar los materiales de proteína cargados de la fase estacionaria cuando los iones cargados en la fase móvil compiten con la proteína para sitios de unión en la fase estacionaria — esas porciones de una mezcla de producto de analito que pueden exhibir un carácter hidrofóbico de grado superior pueden tener una mayor tendencia a permanecer unido a los radicales hidrofóbicos de la columna de cromatografía de modo mixto. La capacidad de aprovechar estos fenómenos en cualquier contexto de separación determinada de la proteína puede considerarse difícilmente predecible.

Dos ejemplos de resinas de modo mixto son Capto™ MMC yCapto™ Adhere (disponible de GE Healthcare). Capto™ MMC utiliza un ligando unido a una matriz de soporte sólido que puede interactuar con el analito por intercambio catiónico (con su grupo carboxílico), unión de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. El ligando de Capto™ MMC se ilustra a continuación: Capto™ Adhere es similar a Capto™ MMC que también emplea un ligando que se une a una matriz de soporte sólido. El ligando, N-bencil-N-metil etanol amina, también interactúa con el analito por intercambio de anión, unión de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. El ligando de Capto™ Adhere se ilustra a continuación: En ambos ligandos, la interacción hidrofóbica se espera que sea débil. Por lo tanto, si estos ligandos tienen sólo radicales hidrofóbicos (sin cargas), más probablemente pueden requerir de condiciones de remoción de sal (precipitación de la proteína) para la unión de proteínas. Sin embargo, teniendo interacción electrostática puede hacer de tal interacción hidrofóbica débil suficiente para proporcionar fuerza adicional de unión.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento que LA cromatografía de modo mixto, por ejemplo, usando Capto™ MMC y Capto™ Adhere como la resina de cromatografía de modo mixto, se puede emplear para purificar un analito que comprende una mezcla de proteína correctamente plegada e incorrectamente plegada, incluyendo, por ejemplo, una mezcla de proteína que comprende etanercept correctamente plegado e incorrectamente plegado, por el que las proteínas correctamente plegadas puede ser eficientemente separada de la proteína incorrecta o mal plegada de una manera altamente eficiente, y de los rendimientos de producción excelente, para obtener una preparación de proteína que está altamente enriquecida en la proteína deseada, correctamente plegada. Por otra parte, la invención abarca la posibilidad de practicar la separación cromatográfica de modo mixto descrita aquí de tal manera que se obtenga un producto de elución de la separación cromatográfica que puede, si se desea, estar libre o esencialmente libre del producto incorrectamente plegado, aunque puede entenderse para propósitos de rendimiento de equilibrio y pureza, uno puede encontrar esto aceptable para incluir los niveles muy bajos del producto incorrectamente plegado (por ejemplo, menos del 5% en peso y preferiblemente menos del 3% en peso) con el fin de maximizar los rendimientos a un punto deseado.

Por consiguiente, en una primera modalidad la presente invención es un método de cromatografía de modo mixto para separar una proteína correctamente plegada de una proteína mal plegada, que comprende los pasos de: (a) unir una primera mezcla de proteína que comprende las conformaciones correctamente plegadas e incorrectamente plegadas de una proteína dada a una resina de cromatografía de modo mixto que tiene los radicales de intercambio de iones y radicales hidrofóbicos; (b) eluir la proteína correctamente plegada de la resina de modo mixto para obtener una segunda mezcla de proteína que comprende una mayor proporción de proteína correctamente plegada que la primera mezcla de proteína. El término "mayor proporción" significa que la proporción de proteínas correctamente a incorrectamente plegadas en el eluato del paso (b) es por lo menos mayor que 1:1, pero más preferiblemente mayor que cerca de 8:2 y preferiblemente mayor de cerca de 9:1. La segunda mezcla de proteína más preferiblemente contiene proteínas correctamente plegadas en una cantidad que constituye al menos de cerca de 95% en peso de la segunda mezcla de proteína.

En una segunda modalidad, el método se dirige a un método de cromatografía de modo mixto para purificar una mezcla de proteína para separar el etanercept correctamente plegado de etanercept incorrectamente plegado presente en dicha mezcla, el método que comprende los pasos de: (a) contactar una resina de cromatografía de modo mixto teniendo radicales hidrofóbicos y radicales de intercambio iónico con una solución que contiene una mezcla de proteínas que comprende etanercept correctamente plegado y etanercept incorrectamente plegado, tal que el etanercept incorrectamente y correctamente plegado llega a fijarse, unirse o capturarse en la resina de cromatografía de modo mixto; y (b) contactar la resina de modo mixto con una solución capaz de eluir las proteínas de etanercept de la resina de cromatografía de modo mixto para obtener un eluato en donde la proporción de la cantidad de etanercept correctamente plegado a etanercept incorrectamente plegado es mayor, y preferiblemente mucho mayor que la de la mezcla de proteína introducida a la resina en el paso (a).

Una tercera modalidad la presente invención se refiere a una mezcla de proteínas que contiene etanercept, o una formulación farmacéuticamente aceptable que comprende dicha mezcla, obtenida de acuerdo con las modalidades del método descrito anteriormente y en donde dicha mezcla de proteína comprende etanercept correctamente plegado en una cantidad constituyendo más de cerca de 90% en peso de la mezcla de proteína; y que comprende etanercept incorrectamente plegado en una cantidad que constituye menos de cerca de 5% en peso de la mezcla de proteína; y en donde la mezcla de proteínas tiene una cantidad combinada de etanercept correctamente plegado e incorrectamente plegado que constituyen al menos cerca de 95 y preferiblemente al menos cerca del 98% en peso de la mezcla de proteína que contiene etanercept. Cantidades de etanercept correctamente plegad e incorrectamente plegado pueden ser determinados mediante cromatografía de interacción hidrófoba (modo sencillo), La cantidad combinada de etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente puede ser determinada mediante cromatografía de exclusión de tamaño ("SEC"). Como se utiliza en este documento, los términos "mezcla de proteína a base de etanercept" o "mezcla de proteína que contiene etanercept" o "preparación de etanercept" o "material a base de etanercept" y similares, deben ser leídos como sinónimos y sirven para denotar una mezcla de proteínas en donde el componente principal comprende etanercept correctamente plegado y los componentes menores pueden abarcar el etanercept sujetado, etanercept Incorrectamente plegado, etanercept agregado (tales agregados estando compuestos de etanercept correctamente y/o incorrectamente plegado), o fragmentos de etanercept. La presente invención proporciona la capacidad de producir una mezcla de proteína a base de etanercept (o preparación de etanercept) para su uso como el ingrediente activo en formulaciones farmacéuticas en donde se desea maximizar la cantidad de etanercept correctamente plegado, mientras se minimiza la cantidad de etanercept incorrectamente plegadao (incluyendo agregado), en mayor medida que el hasta ahora ha logrado.

En una cuarta modalidad, la invención se refiere a una formulación farmacéuticamente aceptable que comprende etanercept altamente puro conveniente para la administración a un sujeto que requiere tratamiento para una condición mediada por TNF, dicha formulación que contiene una mezcla de proteínas que comprende una importante cantidad de etanercept correctamente plegado y una cantidad menor de etanercept incorrectamente plegado, en donde (i) el etanercept incorrectamente plegado constituye menos de cerca del 10% en peso, preferiblemente menos de cerca de 8% en peso y más preferiblemente menos de cerca de 5% en peso de la mezcla de proteína; (ii) el etanercept correctamente plegado constituye más del 90% en peso y preferiblemente más de aproximadamente 92% en peso y más preferentemente más de aproximadamente 95% en peso de la mezcla de proteína; y (iii) la cantidad total de etanercept correctamente plegado y etanercept incorrectamente plegado (pero sin incluir sus agregados) constituye por lo menos 95% en peso y preferiblemente al menos el 98% en peso de la mezcla de proteína; en donde la formulación además comprende ingredientes inactivos farmacéuticamente aceptables, excipientes o portadores que hacen de la formulación conveniente para la administración al sujeto.

En una quinta modalidad la invención es un método para producir una mezcla de proteína que contiene etanercept con una pureza elevada con respecto a la cantidad de etanercept correctamente plegado versus incorrectamente plegado presente en esta, dicho método que comprende los pasos de: (1) expresar etanercept en un sistema de expresión mamífera para obtener un fluido de cultivo celular recolectado que contiene una mezcla de proteína que contiene etanercept que comprende el etanercept correctamente plegado e incorrectamente plegado; (2) someter el fluido de cultivo celular colectado obtenido en paso 1 a un procedimiento de purificación por el que una mezcla de proteína que contiene etanercept se obtiene con una cantidad reducida de, o sustancialmente libre de impurezas ¡ndeseadas (es decir, las proteínas no basadas en etanercept) presentes en el fluido de cultivo celular colectado producido en el paso (1); (3) contactar la mezcla de proteínas que contiene etanercept obtenida en el paso (2) una o más veces con una resina cromatográfica en modo mixto teniendo los radicales de intercambio iónico y los radicales de interacción hidrófoba con el fin de fijar las proteínas contenidas en la mezcla a la resina; y (4) contactar la resina de modo mixto con proteína unida a ésta del paso 3 con una solución capaz de eluir correctamente etanercept plegado de la resina en modo mixto para obtener un eluato que comprende una etanercept que comprende una mezcla de proteína que contiene etanercept teniendo una mayor proporción de etanercept correctamente plegado contra etanercept plegado incorrectamente que la mezcla que contiene etanercept introducida a la resina en el paso 3; y en donde (i) la cantidad de proteína presente en la mezcla de proteína que contiene etanercept obtenida de la purificación del paso 2 es por lo menos 80% en peso y más preferentemente al menos cerca del 85% en peso de la cantidad de la mezcla de proteína a base de etanercept presente en el fluido de cultivo celular colectado obtenido en el paso 1; (¡i) la cantidad combinada de proteína de etanercept incorrectamente y correctamente plegado presente en la mezcla de proteína eluida en el paso 4 es por lo menos de cerca de 60% en peso de la cantidad de la misma presente en la mezcla de proteína obtenida del paso 2; (iii) la cantidad de etanercept correctamente plegado presente en el eluato del paso 4 es por lo menos de cerca de 30% en peso y preferiblemente por lo menos de cerca de 34% en peso de la cantidad de la mezcla de proteína que contiene etanercept presente en el fluido de cultivo celular colectado obtenido en el paso 1; y (iv) dicho etanercept correctamente plegado constituye al menos cerca del 90% en peso y preferiblemente al menos cerca de 95% en peso del eluido obtenido en el paso 4.

En una sexta modalidad, la invención se refiere a un método para tratar un sujeto que sufre de una enfermedad mediada por TNF, que comprende los pasos de administrar a tal individuo una formulación farmacéutica que contiene una mezcla de proteínas que comprende etanercept correctamente plegado y etanercept incorrectamente plegado, dicha mezcla siendo obtenida por cualquiera de los métodos descritos anteriormente, y en donde la cantidad de etanercept plegado incorrectamente en la mezcla de proteína es de menos de cerca de 10% en peso y preferiblemente menos de cerca de 5% en peso de dicha mezcla.

En una séptima modalidad la invención se refiere a un método para tratar a un sujeto que sufre de una enfermedad mediada por TNF, que comprende los pasos de administrar a tales individuales una formulación farmacéutica que contiene una mezcla de proteínas que comprende etanercept correctamente plegado y etanercept incorrectamente plegado en donde la cantidad de etanercept plegado incorrectamente en la mezcla de proteína es inferior a cerca de 10% en peso y preferiblemente menos de cerca de 5% en peso de dicha mezcla.

En una octava modalidad la invención se refiere a un método para separar etanercept correctamente plegado de etanercept incorrectamente plegado, en donde se utilizan medios cromatográficos para lograr dicha separación, y en donde los medios cromatográficos consisten exclusivamente de cromatografía en modo mixto en donde una mezcla compuesta por etanercept correctamente plegado y plegada incorrectamente se pone en contacto con una resina cromatográfica de modo mixto con intercambio iónico y radicales hidrofóbicos y entonces se eluye a partir de este, para obtener un eluido que comprende al menos cerca de 85 y preferiblemente al menos cerca de 90 y más preferentemente al menos cerca de 95% en peso de etanercept correctamente plegado. Con respecto a esta modalidad, cuando se establece aquí que "medios decromatográficos consisten exclusivamente de cromatografía mixta," debe entenderse que tal fraseología no excluye el uso opcional de diversos medios de cromatografía (por ejemplo, HIC, SEC, etc.) cuando se usa exclusivamente con fines analíticos. Esta modalidad es ventajosa ya que no requiere uso de metodologías de separación para resolver correctamente las proteínas mal plegadas aparte de la metodología de modo mixto descrita aquí.

En otro aspecto, los métodos descritos antes aplicados a etanercept pueden ser practicados dos o más veces para obtener una preparación altamente pura de etanercept de la siguiente manera: realizar una primera separación de modo mixto (separación #1) al llevar a cabo los pasos (a) y (b) como se describe antes, por ejemplo, en las modalidades 1 y 2 anteriores; seguido por la realización de una segunda separación de modo mixto (separación #2) al llevar a cabo los pasos (a) y (b) nuevamente; donde el eluido obtenido en el paso (b) de la separación #1 se utiliza entonces como el analito (es decir, la solución que contiene una mezcla de proteína) para el paso (a) de la separación #2. Las resinas de modo mixto utilizadas en la separación #1 y la separación #2 pueden ser las mismas o diferentes. En una práctica particularmente preferida de este aspecto, la separación #1 se realiza con la resina de modo mixto MMC CAPTO y la separación #2 se realiza con la resina de modo mixto CAPTO ADHERE.

Opcionalmente, las preparaciones de etanercept resultantes del método de la invención, o proporcionadas en la preparación, modalidades de formulación o tratamiento descritas anteriormente pueden, si así se desea, ser libre o esencialmente libre de etanercept incorrectamente plegado, aunque puede entenderse que la capacidad en este documento para proporcionar preparaciones de etanercept con niveles muy bajos de etanercept plegado incorrectamente, preferiblemente menos de cerca de 10% en peso y más preferentemente menos de cerca de 5% en peso de la cantidad total de una mezcla de proteína a base de etanercept presente en una formulación farmacológica, representa un avance significativo sobre formulaciones farmacéuticas actualmente disponibles para la venta comercial que contienen mezclas a base de etanercept en donde la cantidad de etanercept incorrectamente plegado en dichas mezclas, basado en el análisis HIC, puede ser mayor que cerca de 10% de las proteínas basadas en etanercept encontradas en tales formulaciones.

Las resinas de modo mixto preferidas para su uso en la invención son CAPTO MMC y CAPTO ADHERE; sin embargo, debe entenderse que cualquier resina de modo mixto funcionalizada con los radicales de intercambio iónico y radicales hidrofóbicos se contemplan para su uso en la presente invención.

Sin estar limitado a cualquier teoría particular, se considera posible, sino en todo predecible, que uno podría ser capaz de explotar la interdependencia y acción opuesta entre las características de carga y características hidrofóbicas en una cromatografía de modo mixto empleando estos dos tipos de afinidad, con el fin de desarrollar una altamente eficiente separación de especies de proteínas correctamente plegadas de especies que son inccorrectamente plegadas y/o agregadas. Sorprendentemente, el método de modo mixto de la invención no necesita ser combinado con o complementado con cualquier otra estrategia de separación para resolver la proteína plegada correctamente de la proteína incorrectamente plegada con excelente rendimiento y alta pureza. Por ejemplo, no es necesario emplear un paso adicional de HIC a fin de lograr dicha separación de la proteína plegada correctamente de la proteína mal plegada.

Según como se aplica a etanercept, el método de cromatografía de modo mixto según la presente invención consiste en la aparición de la siguiente secuencia general de fenómenos: En primer lugar, durante la introducción de una muestra que contiene etanercept impura a la resina de modo mixto (es decir, una muestra que comprende correctamente plegado, incorrectamente plegado y otras impurezas) como las obtenidas, por ejemplo, de expresión de CHO de etanercept, el método de la invención permite que etanercept (incorrectamente y correctamente plegado) se una con la resina de modo mixto. En segundo lugar, durante una posterior elución o paso de lavado (por ejemplo, utilizando un gradiente de sal aplicado preferentemente en un gradiente de concentración creciente), la presente invención permite la liberación (es decir, elución) de la resina de una mezcla a base de etanercept en donde el etanercept contenido en ésta predominante se pliega correctamente, mientras permite substancialmente que etanercept sea incorrectamente plegado para permanecer enlazado o capturado en la resina de modo mixto; por lo que se puede obtener en el material eluido de la resina en una proporción muy elevada del etanercept correctamente plegado (en comparación con una menor proporción del mismo presente en la muestra de proteína que contiene etanercept inicialmente introducida y unida a la resina). En cuanto a funcionamiento físico de la cromatografía de modo mixto de la invención presente, la resina de modo mixto puede contenerse (es decir, empacar) en un medio de contención rígido columnar o recipiente que puede contener la resina, y que tiene medios de entrada y salida para permitir que las soluciones fluidas entren en un extremo de la columna, el flujo en contacto con la resina, y luego salgan en un extremo opuesto del recipiente para ser recogido para su posterior análisis o procesamiento, o a ser desechada.

La solución que contiene una mezcla de proteína de etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente utilizado en el paso (a) de los métodos descritos anteriormente puede obtenerse de una manera conocida de la expresión de la proteína del etanercept en el cultivo de células de mamífero, por ejemplo las células CHO. Antes de la purificación cromatográfica de modo mixto en la presente invención, la proteína recolectada de la expresión mamífera (un fluido de cultivo celular recolectado) puede ser sometida a un paso de purificación inicial, como la purificación de afinidad de proteína A, para eliminar las impurezas. Mientras que tal paso puede ser deseable para la eliminación de impurezas no basadas en etanercept, esta purificación generalmente no resultará en una apreciable separación (es decir, resolución) del etanercept correctamente plegado del etanercept incorrectamente plegado. Por consiguiente el grupo de proteína A se somete entonces a la metodología de modo mixto de la invención presente para llevar a cabo dicha separación.

El método de la invención presente ofrece recuperaciones comercialmente útiles (rendimientos) de etanercept correctamente plegado. Por ejemplo, en casos en los que la solución de proteína basada en etanercept de etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente utilizado en el paso (a) del presente método preferentemente se suministra en forma de una salida de cromatografía proteína obtenida purificando un producto de expresión mamífera de etanercept en una columna de proteína A, la cantidad de material recuperado en el paso de purificación de la proteína A, es preferentemente al menos cerca del 80% en peso y preferiblemente al menos cerca del 85% en peso de los productos de expresión basados en etanercept presentes en el cultivo celular recolectado introducido a la columna de la proteína A (donde la cantidad de proteínas basadas en etanercept presentes en el cultivo celular recolectado puede determinarse mediante Fe Elisa y la cantidad de proteínas basadas etanercept obtenidas en el grupo de elución de la proteína A puede determinarse por la absorbancia UV en A280 nm). Posteriormente, cuando la cromatografía de modo mixto de la presente invención se practica utilizando el material purificado de proteína A antes mencionado, la cantidad de material de proteína basado en etanercept obtenido en la elución del paso (b) del presente es preferiblemente por lo menos alrededor de 60% en peso y preferiblemente al menos cerca del 70% en peso de la cantidad de material a base de etanercept introducida a la resina de modo mixto en el paso (a) de la invención.

En consecuencia el rendimiento total de una mezcla altamente pura de etanercept en el eluado de modo mixto del paso (b) del presente que es altamente enriquecido en etanercept correctamente plegado (es decir, que contiene no más del 10% en peso y preferiblemente no más de cerca del 5% en peso de material plegado de forma incorrecta por peso del eluido) puede ser cualquiera de cerca de 30 a cerca de 50% en peso de la mezcla a base de etanercept originalmente presente en un fluido de cultivo celular recolectado antes de la purificación (por ejemplo, purificación de la proteína A) del mismo.

La purificación del fluido de cultivo celular recolectado también puede lograrse por otros medios cromatográficos, como cromatografía de modo mixto usando resinas de cromatografía con intercambio de Iones y radicales de interacción hidrofóbica.

En la práctica del método de la invención presente, los pasos de filtración adicional (por ejemplo, filtración viral y filtración de flujo tangencial) pueden realizarse de una manera conocida para procesar además eluados producidos en el paso (b) del método de cromatografía de modo mixto antes descrita.

La presente invención proporciona un método de separación muy mejorado para la separación de conformaciones correctamente plegadas de conformaciones incorrectamente plegadas (incluyendo agregados) de una determinada proteína y, en particular, la resolución de etanercept correctamente plegado de etanercept mal plegado (y agregado) obtenido de una cosecha de cultivo de células de mamífero que comprende una mezcla altamente heterogénea de especies basadas en etanercept.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1A (perfil de elución de la proteína A) muestra un perfil de elución de Proteína-A de cultivo recolectado de CHO que comprende la proteína etanercept correctamente plegada y mal plegada mediante la elución por citrato 0.1 M a pH indicado que contienen arginina 1 M. La curva sólida es absorbancia de UV; la curva punteada, es conductividad (lo mismo en las siguientes figuras).

La figura IB (elución perfilada de la proteína A) muestra los resultados de nativo-PAGE para muestras eluidas de proteína-A donde carril-1 es estándar (Enbrel comercial); carril-2 es la carga; carril-3 es FT (flujo pasante); carril-4, pH 6.0; carril-5, pH 4.2; carrll-6, pH 3.7; carril-7, pH 3.0.

La figura 2A (Perfil de elución del grupo de proteína A de Capto MMC) muestra un cromatograma CAPTO MMC de elución por NaCI o arginina en 10 mM fosfato, pH 7.5.

La figura 2B (perfil de elución del grupo de proteína A partir de Capto MMC) SDS-PAGE y Nativo-PAGE de muestras eluidas) donde el carril-0, estándar; carril-1, carga; carril-2, FT; carril 3, NaCI 0.15 M; carril-4, 0.3 M de IMaCI; carril-5, 1 M arginina.

La figura 3A (perfil de elución del grupo de proteína A partir de Capto MMC) muestra una cromatografía de elución por 0-0.5 M de NaCI gradiente a pH 7.5. La columna se equilibró con fosfato 10 mM, pH 7.5 antes del gradiente de elución.

La figura 3B (perfil de elución del grupo de proteína A partir de Capto MMC) muestra nativo-PAGE de muestras eluidas en donde. Carril-0, estándar; carril-1, carga; carr¡l-2 a carril-8, fracciones eluidas; carril-9, 1 M arginina.

La figura 3C (perfil de elución del grupo de proteína A partir de Capto MMC) muestra SDS-PATE y nativo-PAGE de la muestra eluida para el grupo de proteína A diferente en donde: Carril-0, estándar; carril-1, carga, carril-2, FT; carril-3 a carril-8, fracciones eluidas; carril-9, 1 M arginina.

La figura 4A (perfil de elución del grupo de proteína-A del Capto-MMC) cromatograma de elución por 0-0.4 M Na2S04 gradiente a pH 7.5. La columna se equilibró con fosfato 10 mM, pH 7.5 antes del gradiente de elución.

La figura 4B (perfil de elución del grupo de proteína-A de Capto-MMC) SDS-PAGE y nativo-SDS de muestras eluidas en donde; carril-1, carga; carril-2, FT; carril-3, lavado de regulador de pH; carril-4 a carril-9, fracciones eluidas; carril-10, 1 M arginina.

La figura 5 muestra un análisis HIC de fracciones eluidas Capto-MMC.

La figura 6A (perfil de elución del grupo de proteína-A de Capto-MMC) muestra un cromatograma de elución por pH y gradiente de sal.

La figura 6B (perfil de elución del grupo de proteína-A de Capto-MMC) muestra SDS-PAGE y nativo-PAGE de muestras eluidas donde el carril-0, estándar; carril-1, carga; carril-2 y 3, FT; carril-4 al carril-8, fracciones eluidas; carril-9, 1 M arginina.

La figura 7A (perfil de elución del grupo de proteína-A de Capto-MMC) muestra un cromatograma de elución por pH y gradiente de Na2S04.

La figura 7B (perfil de elución del grupo de proteína-A de Capto-MMC) muestra SDS-PAGE y nativo-SDS de muestras eluidas donde el carril-0, estándar; carril-1, carga; carril-2, FT; carril-3 a carril-5, fracciones eluidas, carril-6, 1 M arginina.

La figura 8 muestra nativo-PAGE del grupo de proteína-A de Capto-Adhere en donde el carril-0, estándar; carril-1, carga; carril-2, 5 mM citrato (pH 4.5); carril 3 y 4, arginina 0.1 M (pH 4.5); carril-5, 0.5 M arginina. Las especies de bajo peso molecular se observan en el cuadro.

La figura 9A (perfil de elución del grupo de proteína-A de Capto-Adhere) muestra un cromatograma de elución por pH y gradiente de arginina.

La figura 9B (perfil de elución del grupo de proteína-A de Capto-Adhere) muestra SDS-PAGE y nativo-PAGE de muestras eluidas en donde: Carril-0, estándar; carril-1, carga; carril-2 al carril-4 FT; carril-5 al carril-7, fracciones eluidas; carril-8, 0.5 M arginina.

La figura 10A (perfil de elución del grupo de proteína-A de Capto-Adhere) muestra un cromatograma de elución por pH y gradiente de arginina.

La figura 10B (perfil de elución del grupo de proteína-A de Capto-Adhere) muestra nativo-PAGE de muestras eluidas en donde el carril-0, estándar; carril-1, carga; carril-2, FT; carril-3 al carril 5, fracciones eluidas; carril-6, 1 M arginina.

La figura 11 es una representación esquemática de análisis de (cromatografía de interacción hidrófoba) HIC de fracciones de elución de resina de modo mixto obtenidas en el paso 3B del ejemplo 12 en donde la muestra de carga es el material obtenido en el paso 3A del ejemplo 12. El porcentaje de etanercept correctamente plegado está indicado en el eje vertical, y aplicación del gradiente de sal con el tiempo se representa en el eje horizontal. Una fracción de elución obtenida temprano en el gradiente contiene 100% de etanercept correctamente plegado.

La figura 12 (perfil de elución del grupo Capto-MMC de Capto-Adhere) muestra SDS y Native-PAGE de muestras eluidas. La elución se realizó con gradiente de arginina a pH 7.5 donde: Carril-0, estándar; carril-1, carga; carril-2 y 3, FT; carril-4 al carril-7, fracciones eluidas; carril-8, 1 M arginina.

La figura 13 es un cromatograma de elución del grupo Capto-MMC de Capto-Adhere. La elución fue hecha por el gradiente de NaCI a pH 7.5.

La figura 14A (perfil de elución del grupo Capto-MMC de Capto-Adhere) muestra un cromatograma de elución por gradiente de sal/arginina a pH 7.5.

La figura 14B (perfil de elución del grupo Capto-MMC de Capto-Adhere) SDS-PAGE y nativo-PAGE de muestras eluidas en donde: Carril-0, estándar; carril-1, carga; carril-2, FT; carril-3 a carril-6, fracciones eluidas; carril-7, 1 M arginina La figura 15 es un cromatograma HIC correspondiente al material etanercept producido en el ejemplo 12, en donde el gráfico no exhibiendo esencialmente un segundo pico menor (material mal plegado) corresponde al material producido según la presente invención (ejemplo 12); y en donde se ve la curva adicional en la figura correspondiente a etanercept comercialmente disponible, para fines comparativos, se ve que exhiben un segundo pico menor representando material mal plegada y/o agregado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se basa en el descubrimiento en el presente documento que las resinas de modo mixto mediante el intercambio iónico y principios de atracción hidrofóbico, por ejemplo Capto™ MMC y Capto™Adhere, pueden ser utilizadas para unir y luego preferencialmente (es decir, selectivamente) eluir conformaciones correctamente plegadas versus conformaciones incorrectamente plegadas de un determinado analito de proteína. Dos de las resinas de modo mixto antes mencionados comprenden ligandos con radicales (es decir, grupos químicos) que ofrecen dos modos diferentes para atraer y unir el analito de proteína, es decir atracción del intercambio iónico e interacción hidrofóbica.

Definiciones Los términos usados en esta especificación generalmente tienen sus significados ordinarios en la téenica, dentro del contexto de la invención, y en el contexto específico en donde se usa cada término. Ciertos términos que se usan para describir la invención se discuten a continuación, o en otra parte en la especificación, para proveer una guía adicional al practicante con respecto a la descripción de la invención. Se proveen sinónimos de ciertos términos. El uso de uno o más sinónimos no excluye el uso de otros sinónimos. El uso de ejemplos en cualquier parte en esta especificación incluyendo ejemplos de cualesquiera términos discutidos en la presente es ilustrativo únicamente, y de ninguna manera limita el alcance y significado de la invención o de cualquier término ejemplificado. La invención no se limita a las diversas modalidades dadas en esta especificación.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por un experto en la técnica al cual compete esta invención. En caso de conflicto, el presente documento, incluyendo definiciones serán de control.

"Alrededor de", "cerca de" o "aproximadamente" generalmente significarán dentro de 20 por ciento, dentro de 10 por ciento, dentro de 5, 4, 3, 2 ó 1 por ciento de un valor o intervalo dado. Las cantidades numéricas dadas son aproximadas, lo que significa que el término "alrededor de", "aproximadamente" o "cerca de" puede ser inferido si no se establece expresamente.

El término "etanercept" como se utiliza en este documento significa el ingrediente activo contenido en la formulación comercial de Enbrel®, es decir un homodímero del polipéptido de fusión que consiste en la porción de unión del ligando extracelular del factor de necrosis tumoral humano 75 kilodalton (p75) ("TNFR") unido a la porción Fe [fragmento, cristalizable] de la inmunoglobulina humana G ("IgGl"). Etanercept es un homodímero en que dos cadenas de la molécula de TNFR: Fe 75 kilodalton como se describe antes están conectadas por un enlace disulfuro en una región de bisagra de la porción Fe. Etanercept consiste en 934 aminoácidos y tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 150 kilodaltons, y el componente Fe del mismo contiene el dominio constante pesado 2 (CH2), el dominio constante pesado 3 (CH3) y región bisagra, pero no el dominio constante pesado 1 (CH1) de IgGl humana. A los efectos de la presente solicitud, el término "etanercept" también puede abarcar etanercept con pequeñas modificaciones en la estructura del aminoácido (incluyendo adiciones, eliminaciones y/o sustituciones de aminoácidos) que no afectan significativamente la función del polipéptido como se describió anteriormente. El término etanercept también debe entenderse que incluye proteínas destinadas o consideradas que son variantes bio-similares o bio-mejores de etanercept.

El término "etanercept correctamente plegado" como se utiliza en el presente documento pretende denotar una conformación plegada del homodfmero de etanercept (según lo definido anteriormente) con actividad biológica para la inhibición de TNF y conformación que son iguales o sustancialmente iguales a la conformación y actividad biológica del ingrediente activo en Enbrel®.

El término "etanercept plegado incorrectamente" como se utiliza en el presente documento pretende abarcar: (i) una proteína homodimérica teniendo el mismo o esencialmente la misma secuencia de aminoácidos que etanercept (según lo definido anteriormente), pero con una conformación diferente a la del etanercept correctamente plegado, en donde dicha conformación diferente hace que la proteína carezca o sustancialmente carezca de actividad biológica como un inhibidor de TNF; y/o (ii) un agregado en el cual dos o más homodímeros de etanercept correctamente plegado o incorrectamente plegado se han llegado a asociar (es decir, agregado o acuminado) de tal manera en cuanto a formar especies que tienen mayor peso molecular que etanercept correctamente plegado; y/o (¡ii) una mezcla de (i) y (ii); y/o (iv) agregado, es decir, composiciones de proteína agrupada que comprende la misma o esencialmente la misma secuencia o partes de la misma, como etanercept correctamente plegado pero que exhiben posición de elución disminuida (debido a una mayor hidrofobicidad) en una columna HIC en comparación con el etanercept correctamente plegado.

El término "tratamiento" se refiere a cualquier administración o aplicación de remedios para una enfermedad en un mamífero e incluye inhibir la enfermedad, detener su desarrollo, aliviar la enfermedad, (por ejemplo, al causar regresión, o restaurar o reparar una pérdida, carencia o función defectuosa) o estimular un procedimiento ineficiente. El término incluye obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado y cubrir cualquier tratamiento de una condición o trastorno patológico en un mamífero. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completamente o parcialmente un trastorno o síntoma del mismo y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para un trastorno y/o efecto adverso atribuible al trastorno. Incluye (1) evitar el trastorno ocurra o vuelva a ocurrir en un sujeto que puede estar predispuesto al trastorno pero aún no es sintomático, (2) inhibir el trastorno, tal como detener su desarrollo, (3) detener o terminar el trastorno o por lo menos sus síntomas asociados, de modo que el hospedero ya no padezca el trastorno o sus síntomas, tales como causar regresión del trastorno o sus síntomas, por ejemplo, al restaurar o reparar una pérdida, carencia o función defectuosa, o estimular un procedimiento infeccioso, o (4) atenuar, aliviar o mitigar el trastorno, o síntomas asociados con el mismo, en donde la mitigación se usa en un sentido amplio para referirse a por lo menos una reducción en la magnitud de un parámetro, tal como inflamación, dolor y/o tamaño del tumor.

El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un llenador sólido, semisólido o líquido no tóxico, diluyente, material encapsulante, auxiliar de formulación, o excipiente de cualquier tipo convencional. Un vehículo farmacéuticamente aceptable es no tóxico para receptores en las dosis y concentraciones utilizadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación.

El término "composición" o "formulación" se refiere a una mezcla que usualmente contiene un portador, tal como un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable que es convencional en la téenica y que es adecuado para administrarse a un sujeto para propósitos terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos. Puede incluir un cultivo de células en el cual el polipéptido o polinucleótido está presente en las células o en el medio de cultivo. Por ejemplo, las composiciones para administración oral puede formar soluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, enjuagues orales o polvos.

La presente invención es conveniente para separar las conformaciones correctamente plegadas de las incorrectamente plegadas de una determinada proteína. Ejemplos de proteínas que pueden ser procesadas conforme a los métodos de la invención incluyen cualquier proteína que contiene disulfuro que requieren el re-plegado como G-CSF, IGF, insulina, hormona del crecimiento, etc, así como los anticuerpos diseñados, por ejemplo, fragmentos de anticuerpo de dominio variable de cadena sencilla.

Etanercept adecuado para la purificación según el método cromatográfico de modo mixto de la invención presente puede ser producido por células hospederas vivientes que expresan etanercept, como hibridomas en el caso de los anticuerpos, o células hospederas que se han diseñado genéticamente para producir el polipéptido en el caso de polipéptidos de fusión o anticuerpos. Los métodos para diseñar genéticamente a células para que produzcan polipéptidos son bien conocidos en la técnica. Vea, por ejemplo, Ausubel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wilcy, New York). Tales métodos incluyen introducir ácidos nucleicos que codifican y permiten la expresión del polipéptido dentro de las células hospederas vivas. Estas células hospederas pueden ser células bacterianas, células de hongos, o preferiblemente células animales cultivadas en un cultivo. Las células hospederas bacterianas incluyen, pero no se limitan a células Escherichia coli. Ejemplos de cepas adecuadas de E. coli incluyen: HB101, DH5.alfa, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, y cualquier cepa de E. coli que falle en disociar ADN extraño. Las células hospederas fúngicas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a células de Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Aspergillus. Unos cuantos ejemplos de líneas celulares animales que pueden ser utilizados son CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, y W138. Pueden establecerse nuevas líneas celulares animales usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, por transformación, infección viral, y/o selección). Opcionalmente, el etanercept puede ser secretado por las células hospederas dentro del medio.

Previo a la separación cromatográfica de modo mixto de etanercept correctamente plegado del mal plegado, purificación del etanercept expresado puede ser realizado por cualquier método estándar. Cuando el etanercept es producido intracelularmente, los desechos de las partículas son eliminados, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cuando el etanercept es secretado dentro del medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión pueden ser primero concentrados usando filtros estándar de concentración de polipéptidos. También pueden agregarse inhibidores de proteasa para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de microorganismos.

El etanercept puede ser purificado usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxipatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, y cualquier combinación conocida o aún por descubrir de téenicas de purificación, incluyendo pero no limitadas a cromatografía de proteína A, fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSET®, cromatografía de resina de intercambio de anión o de catión (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfocado, SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio.

En términos muy generales, como se aplica a etanercept (pero no limitado a esto), la invención proporciona un método de separación de proteínas que comprende ios pasos de (a) introducir una solución que contiene una mezcla de proteínas a base de etanercept teniendo etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente a una resina de cromatografía de modo mixto funcionalizada con radicales de intercambio iónico así como radicales de interacción hidrofóbica bajo condiciones capaces de permitir que el etanercept incorrectamente y correctamente plegado se una a la resina; y luego (b) lavar la resina con medios de elución capaces de eluir correctamente el etanercept plegado de la resina tal que el eluato resultante tiene una mayor proporción del etanercept correctamente plegado que la solución de proteína introducida en el paso (a).

Opcionalmente, el método puede incluir además los pasos preliminares de expresar etanercept en un cultivo de células de mamífero como un cultivo de células CHO y luego purificar el producto de expresión utilizando por ejemplo la cromatografía de la proteína A con lo cual la salida del producto de la proteína A se convierte en la solución de proteína utilizada en el paso (a) de la presente invención. Debe entenderse que el método de la invención puede ser practicado de manera que la expresión de mamífero y los pasos de proteína A, dando lugar a una solución inicial para su uso en el paso (a) de la invención presente, puede ser realizada por una primera entidad en un sitio determinado de fabricación, mientras que el método de separación de modo mixto de la presente invención puede realizarse por la misma o una entidad diferente en el mismo o en un sitio diferente de fabricación.

Condiciones para el paso (a)— unión a la resina de modo mixto CAPTO MMC En el paso (a) de la invención, la solución de proteína que comprende etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente debe introducirse a la resina de modo mixto MMC CAPTO para la unión a éste en un pH de aproximadamente 4 a cerca de 8 y preferiblemente a un pH de aproximadamente 4 a cerca de 6. Alternativamente, cuando la resina de modo mixto CAPTO se usa la solución de proteína en el paso (a) que comprende etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente debe introducirse a la resina de modo mixto CAPTO ADHERE para la unión a éste a un pH de aproximadamente 6 a cerca de 8.5 y preferiblemente a un pH de alrededor de 7 a cerca de 8.

Condiciones del paso elución de la resina de modo mixto En el paso (b) el medio de elución comprende una sal en una concentración determinada y aplicada a la columna de manera predeterminada eficaz para la elución preferencial de proteína etanercept correctamente plegada contra etanercept incorrectamente plegado. Mientras que, hablando en términos generales, el eluato debe contener una proporción más alta de etanercept plegado correctamente a plegado incorrectamente , la solución de sal y la forma de aplicación del mismo a la resina, preferiblemente se selecciona tal que la cantidad de etanercept plegado correctamente supera con creces la cantidad de etanercept plegado incorrectamente en el eluato del paso (b). Fracciones eluidas tempranas pueden contener proteína correctamente plegada esencialmente al 100%. El paso de elución de solución salina puede lograrse cambiando (aumentando) la concentración molar de la solución de sal, tales como a través de un gradiente. El gradiente puede ser logrado paso a paso, pero es preferible ser continuo y lineal. En una modalidad preferida, la solución de sal contiene cloruro de sodio ("NaCI"). El gradiente lineal de NaCI puede ser de cerca de 0 a cerca de 1 M.

En una modalidad alternativa, la solución de sal puede contener sulfato de sodio ("Na2S04"). La solución de l\la2S04 puede también aplicarse en pasos o con un gradiente lineal, preferiblemente linealmente y más preferentemente de un gradiente de concentración de cerca de 0 a cerca de 1 molar.

El etanercept puede obtenerse por cultivo en células CHO.

En una modalidad preferida, la solución de sal comprende NaCI.

Los siguientes procedimientos se siguieron para la expresión, purificación de productos de expresión y análisis de eluatos que contienen etanercept obtenidos por el método de cromatografía de modo mixto de la presente invención: Expresión de Etanercept Etanercept se expresa en un medio condicionado ("CM") de células CHO recombinantes transfectadas con un gen que codifica el dominio extracelular de TNFR humano fusionado a Fe humano en el C-terminal. Ejemplos en la téenica de expresión mamífera de etanercept pueden encontrarse en las siguientes patentes de Estados Unidos, incorporadas aquí por referencia: RE 36755; patente de E.U.A. 5,605,690; EP 464,533; EP 417,563; patente de E.U.A. No. 8,063,182; y patente de E.U.A. No. 7,294,481.

Cromatografía de proteína A El CM obtenida antes es procesada utilizando una columna de proteína A con una columna HiTrap rProteína A de 1 mi (disponible en GE Healthcare) y equilibrado con un fosfato 10 mM, 0.1 M NaCI, solución pH 7.0. Después de lavar la columna con 1 M-clorhidrato de arginina ("arginina"), citrato 0.1 M, solución pH 6.0, las proteínas unidas se eluyen paso a paso con arginina 1 M y citrato 0.1 M que contiene pH 4.2, 3.7 y 3.0. Alternativamente, la columna puede procesarse sin arginina en pH descendiente con citrato 0.1 M. En ausencia de la arginina, una mayoría de etanercept eluyó a un pH de 3.85 para proporcionar un eluato que comprende los contaminantes así como etanercept incorrectamente plegado, fragmentos del etanercept, agregados de etanercept, etc., eluyendo abajo de este pH. El eluato de la proteína A entonces se somete a Capto™ MMC o Capto™ Adhere en una columna HiTrap (disponible en GE Healthcare) como se describe abajo en los ejemplos.

Análisis de eluato de proteína A Análisis del eluato de la proteína A obtenido anteriormente se establecen en las figuras 1A y IB. La figura 1A muestra el perfil de elución de proteína-A con regulador de pH bajo que contiene arginina 1 M. Un gran pico de absorbancia de UV fue observado en pH 6.0 (pico marcado como 6.0) y no contenía ninguna banda (figura IB, carril-4) correspondiente con el Etanercept comercial examinado por nativo-PAGE (carril-1): note que no fluye Etanercept a través de la columna de la proteína-A (comparar carril-2 y 3). Aunque no se observan bandas de proteínas en pH 6.0 (carril-4), la absorbancia de UV grande observada indica la elución de pigmentos. Después de alcanzar la absorbancia de línea base (figura 1A), la columna entonces se eluyó con 0.1 M arginina, 0.1 M citrato, pH 4.2, resultando en un pico de elución agudo (figura 1A, marcado 4.2). Análisis nativo-PAGE de este pico mostró una intensa banda de Etanercept, junto con el manchado de las bandas de baja movilidad (carril-5). El análisis HIC de la proteína eluida mostró 2 picos, el primer pico correspondiente al pico principal del Etanercept comercial y segundo pico correspondiente a las especies menores también están presentes en el Etanercept comercial. Aunque no está clara la naturaleza del segundo pico, parece ser una especie mal plegada de Etanercept, como si se uniera a la proteína A y por lo tanto debe contener el dominio Fe. Las restantes proteínas unidas fueron eluidas con pH 3.7 y luego 3.0, ambas contendiendo arginina 1 M. Estos solventes de bajo pH resultaron en la elución de picos pequeños como se muestra en la figura 1A (3.7 y 3.0). El pico de pH 3.7 contiene una pequeña cantidad de etanercept (carril-6), mientras que el pico de pH 3.0 contiene principalmente especies de baja movilidad, correspondiente a las especies mal plegadas, así como especies que también se pueden agregar (carril-7). Un patrón similar de elución se observó en la ausencia de la arginina. Un pH más bajo, por ejemplo, pH 3.85, fue requerido para eluir etanercept y además disminuir en el pH resultó en la elución de las especies de escasa movilidad. El hecho de que estas especies de escasa movilidad se unieran a la proteína-A significa que también eran las proteínas de fusión Fe. Desde que estas especies eluidas a pH más bajo que el Etanercept, se unieron a la Protein-A más firmemente. Estos estudios confirman que la expresión de etanercept en células CHO recombinantes conduce a etanercept nativo (correctamente plegado), correspondiente a las especies correctamente plegadas y especies de baja movilidad, correspondiente a la especie mal plegada, como se analiza por HIC analítica. Ya que las especies mal plegadas eluidas posteriormente en HIC, deberían ser más hidrofóbicas que etanercept nativo. Dependiendo de los clones CHO y condiciones de fermentación, la cantidad de especies correctamente plegadas variadas de 40 a 60 en peso del eluato de proteína A. En los ejemplos posteriores la capacidad de la cromatografía de modo mixto para separar especies plegadas de especies mal plegadas se evalúa.

Métodos analíticos Las fracciones eluidas de la proteína A, las composiciones Capto™ MMC y Capto™Adhere pueden ser analizadas usando una variedad de téenicas conocidas en la técnica como la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC), SEC desnaturalizada (dSEC), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y nativo-PAGE. Por ejemplo, las técnicas de Cromatografía de exclusión de tamaño son descritas en Hawe et al, Pharm. Res. 2011, 28: 2302 y/o van Marrschalkerweerd et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 2011, 78: 213.

SDS-PAGE Por ejemplo, pueden analizarse las fracciones eluidas de proteína A, Capto™ MMC y Capto™Adhere por dodecilsulfato de sodio o electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (SDS-PAGE o nativo-PAGE, respectivamente). Tanto SDS-PAGE y nativo-PAGE se llevaron a cabo usando gel de Tris-glicina 6% (disponible de Life Technology). SDS-PAGE puede hacerse bajo condiciones no reductoras para que los agregados enlazados a disulfuro puedan observarse.

Cromatografía por exclusión de tamaño Las fracciones eluidas obtenidas mediante los métodos de cromatografía de modo mixto de la invención presente pueden analizarse utilizando la técnica bien conocida de cromatografía exclusión tamaño (SEC), un método de cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC") en donde los analitos están separados por tamaño (ver Rogner, M. (2000). Cromatografía de exclusión de tamaño. Cromatografía líquida de proteínas. M. Kastner. Amsterdam, Elsevier. 61: 89-145.). Por ejemplo, y no en forma de restricción, se puede preparar un regulador de pH de fase móvil para contener fosfato de sodio monobásico monohidratado 50 mM y arginina 150 mM. El pH se ajustó a 6.5 usando 1 M HCI. Las separaciones se realizaron usando una columna de guardia Tosoh TSK-Gel SWxl 6 mm x 4 cm (no cat. 8543) unida linealmente a una Tosoh TSK-Gel G4000 SWxl 7.8 mm x 30 cm (no. cat. 8542). Para realizar una separación, las columnas se llevaron a temperatura ambiente (23°C) y se equilibraron con una fase móvil a un caudal de flujo de 0.5 ml/min. 5 microlitros de 50 mg/ml de solución que comprende etanercept se inyecta en la columna usando un muestreador automático. La separación puede realizarse en cerca de 30 minutos a una velocidad de flujo de cerca de 0.5 ml/minuto. El eluyente de la columna se vigiló a una longitud de onda de 280 nm durante este tiempo. La integración puede realizarse utilizando el software de Chromeleon (Dionex). Antes de la integración, el cromatograma SEC para un regulador de pH que no contiene etanercept se sustrajo de todos los cromatogramas. Toda la integración se puede realizar entre los tiempos de retención de 12 minutos y 26 minutos. Muchos parámetros se usaron para definir un pico. El área mínima para un pico detectado se ajustó a 0.05 mAu * min. La sensibilidad bidimensional para la detección del pico se estableció a 0.01 mAu y 75 segundos. Las bases del pico se agregaron manualmente usando una herramienta de integración manual. Todos los picos detectados se ajustaron manualmente en dos pasos. Primero, las líneas de base pico (la frontera del fondo del pico) se ajustaron a la horizontal. Segundo, las posiciones verticales de las líneas de base del pico se ajustaron a esa de la línea de base del cromatograma. El valor de la línea de base del cromatograma se definió como la señal en ausencia del analito. La señal en ausencia de analito se definió como la absorbancia en mAu en 12 minutos de tiempo de retención.

Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIQ El análisis de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) puede llevarse a cabo en butilo-Sepharose® utilizando un gradiente de sulfato de amonio de 1.8 a 0 M. La cromatografía de HIC también puede realizarse en la forma descrita en la patente de E.U.A. 7, 294,481 (ver la columna 19, líneas 49-55). También se hizo referencia a la Patente de E.U.A. No 7,157,557; Chen J, Tetrault J, Lcy A. (2008) J Chromatogr A. 1177, 272-81; Gagnon P. and Grund E.(1996) BioPharm, 9, 54-64; and Lu, Y., Williamson, B., y Gillespie, R. El avance reciente en la aplicación de cromatografía de interacción hidrofóbica para la remoción del agregado en el procedimiento de purificación industrial. Curr. Pharm. Biotech.

Con respecto al análisis de HIC de preparaciones de etanercept producidas según el método de cromatografía de modo mixto de la invención presente, se observa que la figura 4 en la patente de E.U.A. 7,294,481, incorporada aquí por referencia, contiene un cromatograma de HIC de una preparación de etanercept en donde hay tres picos, el más grande de los cuales (identificado como "pico 2" en la patente’481) se describe como la representación de la proteína de fusión etanercept correctamente plegada; mientras que un pico menor (identificado como "pico 3" en la patente 481) es postulado por el titular de la patente para contener etanercept "revuelto" (es decir, se cree en la discusión actual que es sinónimo con plegado incorrectamente) así como etanercept agregado (véase la patente de Estados Unidos, 7,294,481 columna 22, líneas 13-66 y figura 5 de la misma). Una ventaja significativa de la invención presente es la capacidad de proporcionar un etanercept extraordinariamente de alta pureza que contiene la preparación, en rendimientos comercialmente atractivos, en donde el "pico 3" del cromatograma HIC, como se indica en figura 4 y figura 5 de la patente '481 y se cree en el presente documento que comprende etanercept incorrectamente plegado, puede reducirse sustancialmente o esencialmente eliminado.

La invención además se refiere a formulaciones farmacéuticas de etanercept en donde un etanercept de alta pureza para uso en tales formulaciones se obtiene mediante el uso de métodos de la invención presente. Las formulaciones de la invención pueden incluir también amortiguadores, modificadores de tonicidad, excipientes, portadores farmacéuticamente aceptables y otros ingredientes inactivos comúnmente utilizados en las composiciones farmacéuticas. Estos se discuten más completamente posteriormente en la solicitud.

Los amortiguadores mantienen el pH en un intervalo deseado. Los amortiguadores adecuados incluyen histidina, fosfato de potasio, citrato de sodio o de potasio, ácido maléico, acetato de amonio, tris-(hidroximetil)-aminometano (tris), varias formas de acetato y dietanolamina. La concentración del amortiguador en la formulación está preferiblemente entre aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1M, y más preferiblemente aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM. Los amortiguadores son bien conocidos en la téenica y se fabrican por métodos conocidos y están disponibles de proveedores comerciales.

Ejemplos de amortiguadores adecuados son fosfato, histidina, citrato, maleato, tartrato, succinato, acetato, tris-(hidroximetil)-aminometano (tris), bicarbonato.

En una modalidad preferida, el amortiguador es fosfato de sodio.

En una modalidad preferida, el pH de la composición farmacéutica está en o cerca de los niveles fisiológicos. Así, preferiblemente el pH de las composiciones proporcionadas está entre aproximadamente 5.8 y aproximadamente 8.4; e incluso más preferiblemente, entre aproximadamente 6.2 y aproximadamente 7.4. Una persona con conocimientos ordinarios en la técnica comprenderá que el pH puede ser ajustado según sea necesario para maximizar la estabilidad y la solubilidad del etanercept en una formulación particular. Así, las formulaciones de etanercept a un pH fuera de estos intervalos fisiológicos, pero tolerables para un paciente, también están dentro del alcance de la invención.

Un modificador de tonicidad es una molécula que contribuye a la osmolalidad de una solución. La osmolalidad de una composición farmacéutica preferiblemente se ajusta para maximizar la estabilidad de los ingredientes activos y/o para minimizar la incomodidad para el paciente con la administración. Por lo general, es preferible que una composición farmacéutica sea isotónica con suero, es decir, que tenga la misma o similar osmolalidad, la cual se logra mediante la adición de un modificador de tonicidad.

En una modalidad preferida, la osmolalidad de las formulaciones proporcionadas es de aproximadamente 180 a aproximadamente 420 mOsM. Sin embargo, se entenderá que la osmolalidad puede ser ya sea mayor o menor según lo requieran las condiciones específicas.

Ejemplos de modificadores de tonicidad adecuados para modificar la osmolalidad incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (no incluyendo arginina) (por ejemplo, cisterna, histidina y glicina), sales (por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio y citrato de sodio) y/o sacáridos/polioles (por ejemplo, sacarosa, glucosa y manitol).

Modificadores de tonicidad preferidos son glicina, alanina, cloruro de sodio, cloruro de potasio, y sulfato de sodio.

En una modalidad preferida, la concentración del modificador de tonicidad en la formulación está preferiblemente entre aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1 M, más preferiblemente aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM. Los modificadores de tonicidad son bien conocidos en la téenica y se fabrican por métodos conocidos y están disponibles de proveedores comerciales.

Los excipientes, también llamados aditivos químicos, co-solutos, o co-solventes, que estabilizan el polipéptido mientras están en solución (también en formas secas o congeladas) también pueden ser agregados a una composición farmacéutica. Los excipientes son bien conocidos en la técnica y se fabrican por métodos conocidos y están disponibles de proveedores comerciales.

Ejemplos de excipientes adecuados incluyen pero no se limitan a azúcares/polioles tales como: sacarosa, lactosa, glicerol, xilitol, sorbitol, manitol, maltosa, inositol, trehalosa, glucosa; polímeros tales como: albúmina de suero (albúmina de suero bovino (BSA), SA humano o HA recombinante), dextrano, poli(alcohol vinílico) PVA, hidroxipropil metilcelulosa (HPMC), polietilenimina, gelatina, polivinilpirrolidona (PVP), hidroxietilcelulosa (HEC); solventes no acuosos tales como: PEG, y glicerol y dimetilformamida (DMF); aminoácidos tales como: prolina, L-serina, ácido glutámico sódico, alanina, glicina, clorhidrato de lisina, sarcosina y ácido gama-aminobutírico; agentes tensoactivos tales como: Tween®-80 (polisorbato 80), Tween®-20 (polisorbato 20), SDS, polisorbato, poloxámeros; y excipientes misceláneos tales como: fosfato de potasio, acetato de sodio, sulfato de amonio, sulfato de magnesio, sulfato de sodio, trimetilamina N-óxido, betaina, iones metálicos (por ejemplo, cinc, calcio, y magnesio), CHAPS, monolaurato, 2-O-beta-manoglicerato o cualquier combinación de los anteriores.

Los excipientes preferidos son sacarosa, lactosa, glicerol, xilitol, sorbitol, manitol, maltosa, inositol, trehalosa, glucosa, albúmina de suero bovino (BSA), albúmina de suero humano (HSA), albúmina recombinante, dextrano, PVA, hidroxipropol metilcelulosa (HPMC), polietilenimina, gelatina, polivinilpirrolidona (PVP), hidroxietilcelulosa (HEC), PEG, etilen glicol, glicerol, alanina, glicina, clorhidrato de lisina, sarcosina, SDS, polisorbato 20, polisorbato 80, poloxámero 188, trimetilamina N-óxido, betaina, iones de zinc, iones de calcio, iones de magnesio, CHAPS, sacarosa monolaurato, y 2-O-beta-manoglicerato.

La concentración de uno o más excipientes en una formulación de la invención es/son preferiblemente entre aproximadamente 0.001 a 5 por ciento en peso, más preferiblemente aproximadamente 0.1 a 2 por ciento en peso.

Si se desea, una preparación de etanercept preparada según la invención presente puede usarse en la misma formulación en donde Enbrel comercial se suministra actualmente, dicha formulación que comprende, alrededor de 25 a cerca de 75 mg/ml de la formulación y que comprende además sacarosa, cloruro de sodio, clorhidrato de L-arginina y fosfato de sodio.

Alternativamente, las preparaciones de etanercept obtenidas de acuerdo con la presente invención se pueden suministrar en una formulación farmacéutica que no contiene arginina; por ejemplo ninguna de las formulaciones no-arginina como describe en Manning et al solicitudes provisionales USSN 61/548.518 y 61/669480 presentadas el 18 de octubre de 2011 y 09 de julio de 2012, respectivamente, ambas de las cuales por el presente se incorporan por referencia en su totalidad.

En otra modalidad, la invención proporciona un método de tratamiento de un mamífero que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de las composiciones farmacéuticas de la invención a un mamífero, en donde el mamífero tiene una enfermedad o trastorno que puede tratarse benéficamente con etanercept.

En una modalidad preferida, el etanercept es derivado de la misma especie de mamífero que el que será tratado con la composición.

En una modalidad preferida, el mamífero es un humano.

Las enfermedades o trastornos que pueden ser tratados con las composiciones proporcionadas incluyen pero no se limitan a artritis reumatoide, artritis psoriática, espondilitis anquilosante, enfermedad de Wegener (granulomatosis), enfermedad de Crohn (o enfermedad inflamatoria del intestino), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), hepatitis C, endometriosis, asma, caquexia, psoriais, y dermatitis atópica. Otras enfermedades o trastornos que pueden ser tratados con las composiciones de la presente invención incluyen esas descritas en WO 00/62790, WO 01/62272, Solicitud de Patente de EE.UU 2001/0021380, Pat. de EEUU 7,648,702 B2, las partes relevantes de las cuales se incorporan en la presente como referencia.

Las composiciones farmacéuticas proporcionadas pueden ser administradas a un sujeto que necesita tratamiento por inyección sistemática, tal como por inyección intravenosa, o por inyección o aplicación en el sitio relevante, tal como por inyección directa, o aplicación directa al sitio cuando el sitio es expuesto en cirugía; o por aplicación tópica.

En una modalidad, la invención proporciona un método de tratamiento y/o prevención de artritis reumatoide que comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de una de las composiciones de etanercept proporcionadas.

La cantidad terapéuticamente efectiva de etanercept en las composiciones proporcionadas dependerá de la condición a ser tratada, la gravedad de la condición, antes de la terapia, y de la historia clínica del paciente y la respuesta al agente terapéutico. La dosis apropiada puede ser ajustada de acuerdo con el criterio del médico responsable de manera que puede ser administrada al paciente una vez o durante una serie de administraciones.

En una modalidad, la cantidad efectiva de etanercept por dosis de adulto es de aproximadamente 1-500 mg/m2, o de aproximadamente 1-200 mg/m2, o de aproximadamente 1-40 mg/m2 o aproximadamente 5-25 mg/m2.

Alternativamente, una dosis plana puede ser administrada, cuya cantidad puede variar de 2-500 mg/dosis, 2-100 mg/dosis o de aproximadamente 10-80 mg/dosis.

Si la dosis será administrada más de una vez por semana, un intervalo de dosis ejemplar es el mismo que los intervalos de dosis descritos anteriormente o menores, y preferiblemente administrados dos o más veces por semana a un intervalo por dosis de 25-100 mg/dosis.

En otra modalidad, una dosis aceptable para la administración por inyección contiene 80-100 mg/dosis, o bien, contiene 80 mg por dosis.

La dosis puede ser administrada semanalmente, quincenalmente, o separada por varias semanas (por ejemplo, 2 a 8).

En una modalidad, el etanercept se administra a 25 a 75 mg/ml por una sola inyección subcutánea (SC).

En algunos casos, una mejora en el estado de un paciente se obtiene mediante la administración de una dosis de hasta 100 mg de la composición farmacéutica entre una y tres veces por semana durante un período de por lo menos tres semanas. Puede ser necesario el tratamiento por periodos más largos para inducir el grado de mejora deseado. Para condiciones crónicas incurables el régimen puede continuar indefinidamente. Para pacientes pediátricos (edades de 4-7) un régimen adecuado puede involucrar administrar una dosis de 0.4 mg/kg a 5 mg/kg de etanercept, una o más veces por semana.

En otra modalidad, las formulaciones farmacéuticas de la Invención pueden ser preparadas en una formulación a granel, y como tal, los componentes de la composición farmacéutica se ajustan para hacer mayores de lo que se requerirían para la administración y se diluyen adecuadamente antes de la administración.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas como un solo agente terapéutico o en combinación con terapias adicionales según sea necesario. Por lo tanto, en una modalidad, los métodos de tratamiento y/o prevención proporcionados se usan en combinación con la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de otro agente activo. El otro agente activo puede ser administrado antes, durante o después de administrar las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Otro agente activo puede ser administrado ya sea como parte de las composiciones proporcionadas, o alternativamente, como una formulación separada.

La administración de las composiciones farmacéuticas proporcionadas puede lograrse de varias maneras, incluyendo parenteral, oral, bucal, nasal, rectal, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intra-arterial, intracardiaca, intraventricular, intracraneal, intratraqueal, administración intratecal, inyección intramuscular, inyección intravítrea y aplicación tópica.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención son particularmente útiles para la administración parenteral, es decir, por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intracerebrospinal, intra-articular, intrasinovial, y/o intratecal. La administración parenteral puede ser por inyección de bolo o por infusión continua. Las composiciones farmacéuticas para inyección pueden presentarse en una forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en recipientes de dosis múltiples, con un conservador agregado. Además, se han desarrollado varios enfoques de suministro de fármacos recientes y las composiciones farmacéuticas de la presente invención son convenientes para la administración usando esos nuevos métodos, por ejemplo Inject-ease®, Genject®, plumas inyectoras tales como GenPen®, y dispositivos sin agujas tales como MediJector® y BioJector®. La composición farmacéutica presente también puede adaptarse para métodos de administración aún por descubrir. Vea también Langer, 1990, Science, 249:1527-1533.

Las composiciones farmacéuticas proporcionadas también pueden ser formuladas como una preparación de depósito. Dichas formulaciones de larga activación se pueden administrar mediante implantación (por ejemplo de manera subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Así, por ejemplo, las formulaciones pueden ser modificadas con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.

Las composiciones pueden, si se desea, ser presentadas en un paquete o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contiene el ingrediente activo. En una modalidad el dispositivo surtidor puede comprender una jeringa que tiene una sola dosis de la formulación líquida lista para inyección. La jeringa puede ser acompañada por instrucciones de administración.

En otra modalidad, la presente invención se dirige a un kit o contenedor, que contiene una composición farmacéutica acuosa de la invención. La concentración del polipéptido en la composición farmacéutica acuosa puede variar sobre un amplio intervalo, pero normalmente está dentro del intervalo de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 20,000 microgramos por millilitro (pg/mi) de formulación acuosa. El kit también puede ser acompañado por instrucciones de uso.

La presente invención se describe en forma más particular en los siguientes ejemplos que se pretende que sean únicamente ilustrativos, ya que muchas modificaciones y variaciones en los mismos serán evidentes para los expertos en la téenica. El apéndice A proporciona modalidades representativas adicionales de la presente invención.

EJEMPLO 1 Purificación de modo mezclado de Capto™ MMC oue usa elución de NaCI En este ejemplo, un eluato de proteína A obtenido como se describió anteriormente se somete a cromatografía de Capto™ MMC. La columna de Capto™ MMC es equilibrada con un citrato 5 mM, solución a pH 4.5. Una dilución apropiada del eluato de proteína A (por ejemplo, 3 a 6 veces la dilución dependiendo del regulador de pH de elución del paso de la proteína A) con citrato 5 mM resulta en unión completa a la columna. Como se muestra en los análisis de SDS-PAGE, la muestra de carga (pH 4.2, eluato de proteína A) es altamente heterogénea y ninguna proteína fluye a través de la columna Capto™ MMC. Las proteínas unidas entonces se eluyeron con NaCI 0.15M en fosfato 10 mM, solución de pH 7.5 que conduce a un cambio simultáneo en el pH (de 4.5 a 7.5) y la concentración de NaCI (de 0 a 0.15 M). Un pico agudo de elución que contiene etanercept correctamente doblado se observa del análisis al eluato. Sin embargo, la recuperación es de aproximadamente 40-50%. Después del paso de elución como se ha descrito, la resina que contienen el material de proteína unida restante se pone en contacto con NaCI 0.3M y la arginina 1M en fosfato 10 mM, soluciones a pH 7.5 que resulta en eluciones que contienen principalmente especies mal plegadas, así como agregados enlazados con disulfuro. Este ejemplo demuestra que Capto™ MMC es efectiva en la separación de las especies mal plegadas de las especies dobladas correctamente. El hecho de que el eluato de especies mal plegadas en una mayor concentración de sal (0.3 M vs 0.1 M) significa que tienen una fuerte interacción electrostática con la columna. Además, arginina 1M además incrementa la elución de las proteínas mal plegadas y también agregadas, que indican que estas proteínas están unidas a la Capto™ MMC no sólo a través de la interacción electrostática, sino también interacción hidrofóbica y que la arginina mejora la interrupción de las interacciones electrostáticas e hidrofóbicas. Los análisis de las fracciones de eluato obtenidas en este ejemplo se representan en las figuras 2A y 2B.

EJEMPLO 2 Purificación de modo mezclado MCC Capto™ que usa resina de NaCI equilibrada a PH 7.5 En el ejemplo anterior, la solución de proteína que comprende etanercept plegado correctamente y plegado incorrectamente es contactada inicialmente con la resina MMC CAPTO a pH 4.5. En este ejemplo, una elución similar a la observada en el ejemplo 1 se observa cuando la columna Capto™ MMC es primero equilibrada con un fosfato 10 mM, solución pH 7.5 y luego se eluyó con NaCI seguido por arginina. Específicamente, nada de etanercept se eluyó durante este equilibrio de pH. Este resultado es inesperado debido a que etanercept está cargado negativamente a pH 7.5; el ml de etanercept varía de 4.9 a 5.4 debido a la glicosilación pesada. Así, en o debajo de pH 4.5, etanercept está cargado positivamente y por lo tanto debe unirse a los ligandos Capto™ MMC cargados negativamente, aunque la interacción hidrofóbica puede contribuir a la unión. A pH 7.5, el etanercept cargado negativamente debe disociarse de Capto™ MMC cargado negativamente, pero se encuentra que esto no ocurre. Esto puede explicarse por la interacción hidrófoba entre etanercept y Capto™ MMC que abruma la repulsión electrostática entre la columna cargada negativamente y etanercept. Alternativamente, Capto™ MMC puede mantener la proteína unida por la unión a las cargas positivas locales del radical de molécula (pl de radical de proteína es ~8.1).

EJEMPLO 3 Purificación de modo mezclado Capto™ MMC usando ei gradiente de NaCI para elución En este ejemplo, la elución exitosa se logra utilizando un gradiente de concentración de NaCI. Específicamente, después de lavar la columna con el fosfato 10 mM, solución pH 7.5, las proteínas unidas se eluyeron con gradiente de sal lineal de 0 a 0.5 M. La muestra de carga (eluato de proteína A pH 4.2) es extremadamente heterogénea (contiene ambos etanercept plegado correctamente y plegado incorrectamente) como en el caso anterior, y las proteínas unidas se eluyeron con el aumento de fuerza iónica del gradiente de NaCI. Después de 180 minutos, el gradiente se termina y la concentración de sal es entonces traída a 0.5 M, que causa una elución de proteína ligeramente mejorada. Según lo determinado por los análisis posteriores, fracciones bajas en sal contienen más del etanercept plegado correctamente y fracciones altas en sal se enriquecieron con especies de baja movilidad (mal plegadas y agregadas). Finalmente, las proteínas restantes se eluyeron con una arginina 1M, fosfato 10 mM, solución pH 7.5. Esta fracción no contiene etanercept, pero enteramente especies de baja movilidad (mal plegado/agregado). El uso de la elución de gradiente de NaCI de Capto™MMC en eluatos de proteína A diferentes, combinado con un equilibrio preliminar de los resultados de resina en un eluato más puro en términos de etanercept plegado correctamente. Con bajas concentraciones de NaCI en los medios de elución, las muestras eluidas se enriquecen con el etanercept plegado. Las especies mal plegadas gradualmente incrementan en el eluato como el gradiente sal descrito anteriormente se aplica a la resina. Después de que el gradiente de sal se completa, la resina se pone en contacto con la solución de arginina 1M, y la fracción de eluato resultante de estos se encuentra que contiene especies mal plegadas (que incluyen no sólo especies mal plegadas sino también agregadas) como es evidente en el análisis subsecuente de SDS-PAGE. Algunas de las especies de baja movilidad se cree que son etanercept plegado incorrectamente (pero no agregado) en SDS-PAGE, que indica que una porción del especies mal plegadas emigran como el homodímero de etanercept más plegado con menor movilidad en nativo-PAGE que el homodímero de etanercept correctamente plegado. El análisis de fracciones de eluato obtenidas en este ejemplo se proporciona en las figuras 3A, 3B y 3C.

EJEMPLO 4 Purificación de modo mixto Capto™ MMC usando el gradiente de para elución En este ejemplo un gradiente de Na2SO4 en lugar de NaCI se utiliza como el gradiente de sal para la elución de etanercept plegado correctamente de la resina de modo mezclado. Mientras que NaCI es en general utilizado exclusivamente para eluir las proteínas en IEC, es generalmente conocido que diferentes sales tienen diversos grados de efectos en remoción de sales (la precipitación de proteína). NaCI es un intermedio entre las sales en inserción de sales, tal como MgCI2 y sales en remoción de sales, tal como Na2S04. NaCI puede ser efectivo en debilitar la interacción electrostática entre etanercept y Capto™ MMC, pero puede ser neutral en el debilitamiento de la interacción hidrofóbica. Se pensó aquí que Na2S04 también deben ser efectivo en debilitar la interacción electrostática, pero debe mejorar la interacción hidrófoba porque es conocida como una sal en remoción de sales fuerte. Por lo tanto, si las especies de baja movilidad están unidas por la columna por interacción hidrofóbica como se indicó anteriormente, su elución puede ser suprimida por Na2S04. Esto es probado por la elución de la solución de proteína que contiene etanercept plegado correctamente y plegado incorrectamente con un gradiente de Na2S04 de 0 a 0.4 M, después de equilibrar el pH de la columna de resina MMC CAPTO con un fosfato 10 mM, solución pH 7.5. Después de que la elución de gradiente de l\la2S04 se completa, la columna se lava con una arginina 1M, solución de pH 7.5. La figura 4A muestra el cromatograma de elución, mientras que la figura 4B muestra el SDS-PAGE y nativo-PAGE de las fracciones eluidas. Se observa una banda relativamente aguda del etanercept plegado correctamente en fracciones bajas de l\la2S04 (carriles 6 y 7 figura 4B) y la pureza de estas fracciones es mayor que la carga (carril 1). Las altas concentraciones de Na2S04 resulta en la elución de especies de baja movilidad en nativo-PAGE (carriles 8 y 9 figura 4B). Una elución de arginina 1M final a pH 7.5 resulta en elución de las especies de baja movilidad (mal plegado/agregado). Esto parece que es un poco de etanercept en esta fracción (carril 10 figura 4B), que indica que Na2S04 también puede suprimir la elución del etanercept nativo. Se puede concluir que Na2S04 es igualmente, si no más, efectivo en la separación de las especies plegadas de las especies mal plegadas, aunque puede causar retención de etanercept nativo (carril 10).

EJEMPLO 5 Purificación de modo mixto Capto™ MMC que usa la elución con NaCI v gradiente de PH En los ejemplos anteriores no se observan proteínas para eluir durante el paso de equilibrio de pH, es decir, el cambio de pH de 4.5 (cltrato 5 mM) a 7.5 (fosfato 10 mM). Cuando la cantidad de carga de proteína se incrementa sobre de 10 g por 1 mi de columna, sin embargo, esto ya no es el caso. Un incremento de la elución de las proteínas durante el cambio de pH ocurre en la carga mayor, aunque la razón de esta observación no está clara. La pureza de esta muestra eluida es mayor que las muestras de carga, pero es mucho menor que las fracciones bajas en sal. Por ejemplo, cuando la muestra de carga (eluato de proteína A) contiene solamente 51% de especies de etanercept plegada correctamente, la elución que ocurre durante el equilibrio de pH es sólo el 65% puro, superior a la carga pero muy por debajo de las fracciones bajas en sal, mientras que, las eluciones de sal en los ejemplos anteriores son capaces de proporcionar 96% de pureza al principio del gradiente de sal, según lo determinado por HIC analítico (figura 5). Como se gráfica en la figura 5, la pureza de las fracciones eluidas disminuye gradualmente de 96% a 20% con el aumento de las concentraciones de sal, consistente con el resultado de natlvo-PAGE de Capto™ MMC (figuras 2B, 3B, 4B). La pureza de la fracción de arginina 1M (en términos de etanercept plegado correctamente) es baja (sólo 11%), también consistente con el análisis nativo-PAGE (véase la figura 3B, carril 9 y figura 4B, carril 10). En vista de las observaciones anteriores, se postula en relación con los descubrimientos incorporados aquí que puede ser beneficioso combinar un gradiente de pH con un gradiente de sal para contrarrestar la pérdida potencial de cualquiera de las especies plegadas correctamente durante el equilibrado de pH de columna para una carga de proteína más grande. En consecuencia, en este ejemplo 5 posterior, un gradiente de pH se combina con un gradiente de sal al realizar el paso (b) definido anteriormente del método presente. En este ejemplo la posibilidad de que pequeñas cantidades de etanercept plegado correctamente puedan ser eluidas indeseablemente durante el equilibrio de pH inicial de la columna de resina de modo mezclado es contrarrestada por la combinación de un cambio de pH con un gradiente de sal. Específicamente, la proteína unida se eluye por un simultáneo gradiente de pH y concentración de NaCI, es decir, la columna se desarrolla de citrato 5 mM, solución pH 4.5 a fosfato 10 mM, solución pH 7.5, que contiene NaCI. Esto resulta en cambios simultáneos de pH y concentración de sal, ambos causando la elución de las proteínas unidas. Esto es similar al perfil de elución de sal después de que el equilibrio del pH se observó en que las especies de baja movilidad eluidas en fracciones más adelante (es decir, en pH mayor y concentración de sal) y en la arginina final 1M, lavado a pH 7.5. Por ejemplo, el eluato de proteína A (24 mg) está unido a la columna a pH 4.5 y se eluye por un gradiente de citrato 5 mM, pH 4.5 a fosfato lOmM pH 7.5 que contiene NaCI 0.5M.

Se postula que esta gran carga con equilibrio de pH podría conducir a la elución de las proteínas unidas durante el cambio de pH. El perfil de elución durante el pH y el gradiente de sal muestran de hecho un pico pequeño al principio del gradiente y un pico principal (el etanercept plegado correctamente deseado) en el intermedio del gradiente. El pequeño pico observado puede corresponder a la elución que hubiera sido observada si el equilibrio de pH se realizó inicialmente sin un gradiente de pH/sal. Una vez que la elución de gradiente de NaCI/pH se completa, la columna entonces se somete a elución adicional con solución de arginina 1M que resulta en un pico agudo final correspondiente a especies de baja movilidad. La elución temprana de fracciones bajas en sal y pH bajo se enriquecen con etanercept, mientras que las fracciones altas en sal y pH alto muestran elución de especies de baja movilidad; el pH gradualmente incrementa de 4.5 a 7.5, por ejemplo, pH 4.1-5.1 en las concentraciones de sal intermedias y pH 6.6 en el final del gradiente. El lavado final con la arginina 1M, solución pH 7.5, muestra una banda de untado nativo-PAGE y bandas múltiples en SDS-PAGE, esencialmente idéntica a la elución que resulta después de equilibrar la columna inicial que causa el cambio de pH con fosfato 10 mM; lavado a pH 7.5. La recuperación de etanercept plegado apropiadamente en el grupo es ~70%. Un resultado similar se obtiene cuando la elución se lleva a cabo con el mismo gradiente de pH/sal al fosfato 10 mM, solución a pH 7.5 pero terminando en una sal inferior que contiene NaCI 0.25M. Este gradiente que usa una menor concentración de sal resulta en elución incompleta de etanercept con un rendimiento de ~50%. Como en los ejemplos anteriores, se observó un pico grande con lavado de arginina 1M, correspondiente a las especies de etanercept de baja movilidad (mal plegado/agregado). El análisis de los eluatos obtenidos en este ejemplo se representa en las figuras 6A y 6B.

EJEMPLO 6 Purificación de modo mezclado Capto™ MMC que usa gradiente de NaoSO /pH para elución Similar a los procedimientos utilizados en el ejemplo 5 anterior, una elución de gradiente de pH/sal también se lleva a cabo utilizando una solución de Na2SO4 0.5 M como el solvente final, que se piensa que mejora la resolución de las especie plegadas de las especies mal plegadas. La recuperación del etanercept en grupo es ~50%, y la baja recuperación se cree que es debido a la interacción hidrofóbica mejorada por Na2S040.5M, conduce a la retención de no sólo las especies mal plegadas generalmente eluidas en lavado de arginina 1M, pero también el etanercept, que también apareció en lavado de arginina 1M. Por lo tanto, el uso de Na2S04 puede mejorar la separación (es decir, resolución) de las especies mal plegadas de las plegadas correctamente, pero también reduce la recuperación del etanercept. Para el análisis de los eluatos en este ejemplo, la referencia puede tener a las figuras 7 A y 7B.

EJEMPLO 7 Capto™ Adhere: elución con NaCI en DH 7.5 v PH 4.5 En este ejemplo, un eluato de proteína A que comprende especies de etanercept plegadas correctamente e incorrectamente se somete a cromatografía de modo mezclado usando Capto™ Adhere como la resina de modo mezclado. La unión de la solución de proteína que comprende especies de etanercept plegadas correctamente y plegadas incorrectamente se realizó en pH 7.5, en el cual etanercept está cargado negativamente y por lo tanto debe unirse a los ligandos de Capto™ Adhere cargados positivamente. Cuando el eluato de proteína A a pH 4.2 se dializó contra el fosfato 10 mM, solución pH 7.5, la unión de proteínas es completa, pero la elución por la sal sola (a pH 7,5) resulta que es ineficaz, sugiriendo que Capto™ Adhere es considerablemente hidrofóbico. Por lo tanto se considera que, debido a la ml de etanercept es 4.9-5.4, que a un pH de elución inferior de tal vez pH 4.5 las especies de etanercept podrían ser cargadas positivamente y por lo tanto repelidas desde la resina Capto™ Adhere cargadas positivamente a pH 4.5. Esta posibilidad es investigada por llevar a cabo la elución de especies de etanercept de Capto™ Adhere a pH 4.5. El eluato de proteína A a pH 4.2 (que se ha dializado a pH 7.5) está unido a Capto™ Adhere equilibrado con un fosfato 10 mM, solución pH 7.5. Después de la carga de proteína, la columna se lavó con 0 y NaCI 0.2M en el mismo regulador de pH, sin elución de proteína en estos lavados.

EJEMPLO 8 Capto™ Adhere: elución con/sin arainina a PH 4.5 En vista de los resultados del ejemplo 7, la proteína unida entonces se eluyó con un citrato 5 mM, solución pH 4.5 con y sin arginina. La arginlna, en lugar de NaCI, se utiliza en este ejemplo para Investigar la manera en la que especies más hidrofóbicas (arginina) pueda impactar la elución en vista de la naturaleza hldrofóbica de ligandos Capto™ Adhere. Se encuentra que las especies de baja movilidad (mal plegadas/agregadas) junto con etanercept correctamente plegado se eluyen con un citrato 5 mM, solución de lavado a pH 4.5 (no contiene arginina). La elución de las especies de baja movilidad en esta fracción puede deberse a un cambio repentino en el pH, como el pH medido de esta fracción es 3.0. Cuando este paso se repite con arginlna 0.1 y 0.2M en un citrato 5 mM, solución pH 4.5, solamente las cantidades marginales de etanercept plegado correctamente. La elución completa del etanercept plegado correctamente requiere arginina 0.5 M, sin embargo el eluato Incluye una cantidad no deseada de especies de baja movilidad. Por lo tanto, se encuentra que incluso a pH 4.5, la arginina es Ineficaz en bajas concentraciones, y en mayores concentraciones de arginlna, resulta en pobre resolución entre las especies plegadas y mal plegadas. Véase la figura 8 para el análisis de los eluatos obtenidos en este ejemplo.

EJEMPLO 9 Capto™ Adhere: Elución con dos gradientes de arainina v gradiente de PH de 7.5 a 4.5 Luego se postula que un gradiente de pH/arglnlna combinado podría resultar en mejor resolución entre especies plegadas correctamente y mal plegadas. Como en los ejemplos anteriores para CAPTO MMC, una caída de pH durante el equilibrio de pH de 7.5 a 4.5 utilizando citrato 5 mM puede prevenirse mediante la aplicación de un gradiente simultáneo de pH que luego puede ser acoplado con un gradiente de concentración de arginlna (por ejemplo un gradiente de fosfato 10 mM, pH 7.5 a citrato 5 mM, pH 4.5 que contiene arginina). Dos gradientes de arginina se investigaron con este gradiente de pH. En el caso de un gradiente de arginlna a la arginina 0.25 M, (Figura 9A y 9B) se encuentra que un lavado de arginina 0.5 M final resultó en elución de ambas especies de baja movilidad y etanercept, que Indica que el uso de un gradiente a una concentración de arginina de sólo arginlna 0.25M podría ser Insuficiente para completar la elución del etanercept plegada correctamente. En consecuencia, un gradiente de arginlna de 0-0.5M (acoplada con el gradiente de pH anterior de 7.5 a 4.5) se investigó (figuras 10A y 10B). Es evidente del análisis natlvo-PAGE posterior que la altura pico relativa es más pequeña para la arginina 1M final se lava con el gradiente de arginlna mayor que el gradiente de arginlna 0.25M anterior. No se observó un segundo pico que sugiere que la resolución puede haber sido comprometida. El gradiente de pH es tal que el pH de las fracciones eluidas disminuyen gradualmente de 7.5 a 6.0, 5.7, 5.2 y finalmente 4.5. Con respecto a la arginina 0.5 M y el gradiente de pH, dos fracciones en el pico de elución principal se enriquecen con el etanercept correctamente plegado con una recuperación de proteína en ~65%. La parte posterior del gradiente demostró una banda de adherencia que contiene etanercept. Por lo tanto, aunque el gradiente de arginina 0.5M junto con la elución incrementada de gradiente de pH de etanercept unido, el etanercept plegado correctamente co-eluido con las especies mal plegadas en la parte posterior del gradiente de arginina/pH. El lavado de arginina 1M final mostró solamente una banda de adherencia.

EJEMPLO 10 Capto™ Adhere: elución con gradiente de arginina v gradiente de PH de 7.5 a 4.5 Las eluciones de gradiente de arginina también se realizan en pH 7.5 que usa grupos de Capto™ MMC. Las proteínas unidas se eluyen con un gradiente de fosfato 10 mM, pH 7.5 a arginina 0.6M, fosfato 10 mM, pH 7.5. Los perfiles de SDS-PAGE y nativo-PAGE muestran elución de etanercept plegado correctamente en las fracciones medias (arginina 0.2-0.4M) (Figura 12). Las especies de baja movilidad como se observa en ambos geles se observan en la fracción posterior y un lavado de arginina 1M de pH 7.0. En comparación, cuando la arginina 0.6M se sustituye con NaCI 0.5M en la elución de gradiente a pH 7.5, la elución de etanercept se reduce grandemente. La figura 13 muestra el perfil de elución en pH 7.5 durante el gradiente de sal para NaCI 0.5M. Dos picos se observaron durante el gradiente, que contiene etanercept en su mayoría, pero con un bajo rendimiento. Una gran cantidad de etanercept se eluyó en el lavado de arginina 1M final que indica que la concentración de sal de NaCI 0.5M acoplado con pH 7.5 no es óptima para la separación del etanercept plegado correctamente del material mal plegado/agregado. Como se señaló anteriormente, arginina 1M es altamente efectiva en la elución de etanercept correctamente plegada, aunque con presencia de especies de baja movilidad. Cabe señalar que la modificación del gradiente de elución de sal para aplicar un gradiente de NaCal de aproximadamente 0 a aproximadamente 1M y conducir la elución a pH 8 resulta en excelente resolución de etanercept plegado correctamente vs especies de muy baja movilidad (mal plegadas/agregadas) en productos de elución tempranos de dicho gradiente como se muestra en el ejemplo 12. Parece que la contribución hidrofóbica de etanercept que unen a Capto Adhere se reduce a pH 8.0, que resulta la elución efectiva del etanercept plegado correctamente con NaCI solo.

EJEMPLO 11 Capto™ Adhere: elución con gradientes de arainina/Nad en DH 7.5 En este ejemplo un gradiente de NaCI/arginina combinado se investiga a pH 7.5. Se investigaron dos de dichos gradientes: El primer gradiente que es investigado por el medio de elución es uno en el cual concentraciones de NaCI final y arginina son 0.4 y 0.2, respectivamente. Un segundo gradiente entonces se investiga en donde las concentraciones de NaCI y arginina finales son NaCI 0.25M y arginina 0.5M, respectivamente. En ambos casos los gradientes se aplican en un fosfato 10 mM, solución pH 7.5. El primer gradiente todavía era demasiado débil para reducir las interacciones hidrofóbicas y por lo tanto eluir etanercept. El segundo gradiente es más efectivo, como se indica por un pico más pequeño en el lavado de arginina 1M final. En particular, como se confirmó con SDS-PAGE, la elución de etanercept se produce a través del segundo gradiente probado hasta NaCI 0.25M, arginina 0.5M sin especies de alto peso molecular (baja movilidad/mal plegado/agregado). Estas especies de alto peso molecular se eluyen luego en el lavado de arginina 1M final. En nativo-PAGE, una mayoría de etanercept plegado correctamente nativo se muestra para eluir en la fracción media. Se observó una banda de adherencia con el lavado de arginina 1M. Por lo tanto es evidente que una combinación de arginina y NaCI puede conducir a la elución de etanercept y separación de especies de alto peso molecular y baja movilidad, correspondientes a las especies mal plegadas. Los análisis HIC de las fracciones Capto™ Adhere para los grupos de Capto™ MMC (60-80% puro) muestra que las fracciones eluidas durante el gradiente (excepto para las fracciones de cola) normalmente proporcionan una pureza superior al 95%. Los análisis de los eluatos obtenidos en este ejemplo se representan en las figuras 14A y 14B.

EJEMPLO 12 Capto™ Adhere v Capto™ MMC En este ejemplo, un eluato de proteína A que comprende etanercept plegado correctamente y mal plegado se obtiene por un método similar al método de proteína A descrito anteriormente. El eluato se aplicó posteriormente a una columna Capto™ MMCe, y el grupo de producto entonces se aplicó a una columna Capto™ ADHERE para proporcionar un producto de etanercept superior, tanto cuantitativamente como cualitativamente.

PASO 1. Expansión celular En una manera conocida en la téenica, la expansión celular necesaria para generar un número suficiente de células para inoculación de un bioreactor de producción se realiza usando un clon de células de CHO que expresan la proteína de fusión del etanercept. El producto de este procedimiento de expresión (un fluido de cultivo celular cosechado) resulta en una mezcla de etanercept correctamente plegado, así como un etanercept incorrectamente plegado y/o agregado, junto con impurezas adicionales. El cultivo celular cosechado que comprende tal mezcla de proteínas es sometido a inactivación viral con detergente.

PASO 2. Cromatografía de afinidad. La cromatografía de afinidad se realiza en el cultivo celular cosechado obtenido en el Paso 1 anterior usando una columna convencional de afinidad de Proteína A en una manera bien conocida. La recuperación del producto es aproximadamente 85%. El producto obtenido es una mezcla compleja de proteínas que comprende etanercept correctamente plegado, etanercept incorrectamente plegado, y/o agregados de etanercept correctamente y/o incorrectamente plegado, o fragmentos de proteína. El producto obtenido de este paso de purificación en la columna de afinidad de la Proteína A se ajusta a pH 3.5 y luego se somete a un paso de inactivación viral. Después de la inactivación viral, el producto se ajusta a pH 5.5 y luego se clarifica además en una manera conocida usando un filtro de cápsula obtenido comercialmente.

PASO 3A. Cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto. Una columna de cromatografía de lecho empacado de 31.8 L (45 cm de diámetro X 20 cm de altura de lecho) GE Healthcare Capto MMC se usa para purificar el producto obtenido en el Paso 2 anterior. Antes del uso, la columna se equilibra con 2 CV de acetato 25 mM pH 5.5 y se sanitizó con 2 CV de NaOH 0.1 N, NaCI 1 M y se neutralizó con 2 CV de acetato 25 mM, NaCI 0.7 M, pH 5.5. La columna luego se equilibra con 8-10 CV de acetato 25 mM pH 5.5 hasta que el efluente está a pH 5.5 y 3.5 mS/cm. El combinado de Proteína A del Paso 2 anterior se diluye a < 6 mS/cm con WFI y se aplicó a una carga de columna de hasta 15 g/L de media para cada ciclo. La columna se opera a una velocidad lineal de 200 cm/h para dar un tiempo de residencia de 6 minutos. Después de la carga, la columna se lava con 2 CV de acetato 25 mM a pH 5.5. El producto luego se eluye con un 8.5 CV, 15% a 85% de gradiente de acetato 25 mM a pH 5.5 acetato 25 mM, NaCI 0.7 M, pH 5.5. La recolección de producto comienza a 0.15 OD (A280, 1.0 cm de longitud de trayectoria) y la recolección termina a 50% del valor máximo. El volumen eluido es aproximadamente 5 CV. El producto residual y los contaminantes se eliminan de la columna con 2 CV de Tris 10 mM, NaCI 1 MI, pH 8.0 y se desecharon. El producto obtenido de la columna de modo mixto se filtra usando un filtro de cápsula Millipore Opticap XL10, 0.22 mm Durapore, (0.69 m2). El producto obtenido de este paso representa una recuperación de aproximadamente 70% del material de la Proteína A obtenido en el paso 2 PASO 3B. Cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto. Una columna de cromatografía de lecho empacado de 27.0 L (45 cm de diámetro X 17 cm de altura de lecho) GE Healthcare Capto Adhere se usa para purificar más el producto obtenido en el Paso 3A anterior. Antes del uso, la columna se equilibra con 2 CV de Tris 25 mM, pH 8.0 y se sanitizó con 2 CV de NaOH 0.1 N, NaCI 1M y se neutralizó y equilibró con 2 CV de Tris 25 mM, pH 8.0. Antes de la carga del producto, la columna se equilibra con 3 CV de Tris 10 mM, pH 8.0. La combinación de Capto MMC del Paso 3A anterior se ajusta a pH 8.1 con ~0.045 kg de Tris 1 M, pH 8.3 por kg de combinado. El producto del Paso 3A anterior se diluyó en línea 1:3.8 con WFI para ajustar la conductividad a 12.0 mS/cm y pH 8.0. El material resultante luego se aplica a una carga de columna de hasta 15 g/L de media. La columna se opera a una velocidad lineal de 170 cm/h para dar un tiempo de residencia de 6 minutos. Después de la carga, la columna se lava con 2 CV de Tris 25 mM, pH 8.0. El producto es entonces eluido con un gradiente de 10 CV (20% a 90%) de Tris 25 mM, pH 8.0 a Tris 10 mM, NaCI 1 M, pH 8.0. La recolección de producto comenzó a 0.15 OD (A280, 1.0 cm de longitud de trayectoria) y la recolección terminó a 25% del valor máximo. El volumen eluido es 4-6 CV. El producto eluido se filtra usando un filtro de cápsula disponible en el comercio y luego se somete en una manera conocida a los pasos de filtración viral y de filtración de flujo tangencial. El producto total recuperado del Paso3B (incluyendo los pasos de filtración viral y filtración de flujo tangencial) fue aproximadamente 68%. La recuperación del producto medido antes de los pasos de filtración fue aproximadamente 75%. Una representación esquemática de datos de HIC obtenida en las fracciones de elución de este paso se representa en la figura 11.

Análisis: Se encuentra que el producto final filtrado obtenido en este ejemplo tiene mayor que aproximadamente 90 % p de etanercept correctamente plegado según se determinó por HIC; menor que 5 %p de especies de etanercept incorrectamente plegadas según se determinó por HIC; menor que aproximadamente 3 %p de material sujetado por análisis HIC (se cree que son fragmentos de etanercept en los que la porción de TNFR de los mismos ha sido truncada) y una cantidad combinada de etanercept correctamente e incorrectamente plegado mayor que 95 %p según se determinó cromatografía de exclusión de tamaño.

El hecho de que la unión de proteína ocurrió en presencia de condiciones de remoción de sales sugiere una posibilidad de que la interacción hidrofóbica no está implicada en unión de etanercept Capto™ MMC y Capto™ Adhere, considerando que la unión de proteína hidrofóbica a HIC requiere normalmente la remoción de sales fuerte. Sin embargo, la interacción hidrofóbica puede facilitarse en presencia de interacción electrostática entre la proteína y estas resinas de modo mezclado. Por lo tanto, sin desear ser unido a cualquier teoría particular, la unión de etanercept a la resina de modo mezclado puede estar mediada a través de los modos de interacción electrostática e hidrofóbica incluso en la ausencia de condiciones de remoción de sales. La HIC analítica indica claramente que las especies mal plegadas, que eluyen en menor concentración de sulfato de amonio, es más hidrofóbica que las especies plegadas. Al suponer que las especies plegadas y mal plegadas tienen una propiedad electrostática idéntica y se unen igualmente bien para el grupo cargado de ligandos Capto™ MMC o Capto™ Adhere, es posible que la contribución hidrofóbica más fuerte de las especies mal plegadas cause que se unan fuertemente a las resinas de modo mezclado, por lo tanto, lo que requiere las condiciones de elución más fuertes para las especies mal plegadas como se observa en los ejemplos anteriores. Para Capto™ MMC, esto se logra a concentración de sal más alta, que puede no ser suficiente para mejorar significativamente la interacción hidrofóbica, pero puede ser suficiente para romper la interacción electrostática adicional entre Capto™ MMC y las especies plegadas correctamente e incorrectamente. De lo contrario, Capto™ Adhere parece ser más hidrofóbico que Capto™ MMC, que requiere arginina, o alternativamente la concentración de sal más alta con pH más alto, para eluir las especie plegadas correctamente. La concentración de arginina más alta o condiciones de endurecimiento se requieren para eluir las especies mal plegadas.

Mientras que la presente invención utiliza los términos "mal plegado" o "plegado incorrectamente" o "plegado inapropiadamente" de manera intercambiable, también se debe entender que estos términos se pretende que incluyan también especies agregadas, en que las resinas de modo mezclado también se encuentra que con efectivas en la eliminación de especies agregadas en las mismas fracciones de elución se encuentra que contienen las especies mal plegadas. De hecho, etanercept forma oligómeros enlazados con disulfuro como se observa en SDS-PAGE. Dichos oligómeros se eluyen mayormente en lavado de arginina 1M, que indica su interacción hidrofóbica más fuerte con las resinas. En consecuencia, para etanercept, parece que ambos Capto™ MMC y Capto™ Adhere pueden resultar en la eliminación simultánea de las especies mal plegadas y agregadas. La remoción del material mal plegado y agregados, ya sea covalentes o no covalentes, es altamente deseada para proporcionar biofármacos más seguros debido a la inmunogenicidad potencial de material agregado (ya sea plegado correctamente o incorrectamente).

Con respecto a los efectos de la arginina en los ejemplos anteriores, es evidente que la arginina (clorhidrato de arginina) no solo sirve como una sal sino también debilita la interacción hidrófoba. La arginina es conocida en la téenica para suprimir la agregación de proteína y la adsorción superficial. Además, la arginina interactúa con grupos aromáticos y de tal modo interfiere con interacción aromático-aromático o aromático-catión entre proteínas o entre las proteínas y la superficie. Tanto Capto™ MMC y Capto™ Adhere poseen un grupo aromático que puede contribuir a la unión de proteína. Podría no haberse predicho que dicho modo de unión podría ser interrumpido efectivamente por arginina, pero no por NaCI. La arginina también debilita la interacción entre los ácidos grasos, lo que sugiere que puede interrumpir la interacción hidrofóbica, no mediada a través de grupos aromáticos. La naturaleza hidrofóbica de la arginina, aunque no claramente entendida mecanísticamente, así puede desempeñar un papel importante en la modulación de interacción proteína-proteína y adsorción de superficie y por lo tanto la elución de proteína de la resina de modo mezclado. Sin embargo, como se muestra en el ejemplo, 12 anterior, no es necesario usar arginina para poner en práctica la presente invención para proporcionar una preparación de etanercept de pureza extremadamente alta. Esto es quizás debido a la débil contribución hidrofóbica de las resinas Capto MMC y Capto Adhere a la unión de proteínas. Sin embargo, el uso de arginina en combinación con NaCI puede mejorar la recuperación y la resolución de la cromatografía de modo mezclado para las proteínas.

ESTRUCTURA QUÍMICA Resina de modo mixto Capto-MMC v Capto-Adhere Capto Adhere Apendice A Modalidades adicionales representativas (Descritas en la solicitud de prioridad USSN 61/699.5521 A. Un método de cromatografía de modo mixto para separar una proteína correctamente plegada de una proteína mal plegada, que comprende los pasos de: (a) unir una primera mezcla de proteína que comprende las conformaciones correctamente plegadas e incorrectamente plegadas de una proteína dada a una resina de cromatografía de modo mixto que tienen los radicales de intercambio iónico y radicales hidrofóbicas; (b) eluir la proteína correctamente plegada de la resina de modo mixto para obtener una segunda mezcla de proteína que comprende una mayor proporción de proteína correctamente plegada que la primera mezcla de proteína.

B. El método de la modalidad A en donde la resina de cromatografía de modo mixto es un resina de cromatografía de modo mixto Capto™ MMC.

C. El método de la modalidad A en donde la resina de cromatografía de modo mixto es una resina de cromatografía de modo mixto Capto™Adhere.

D. El método de cualquiera de las modalidades A-C en donde las conformaciones de proteínas incorrectamente y correctamente plegadas comprenden etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente.

E. El método de la modalidad D donde el etanercept incorrectamente plegado constituye menos de cerca de 10% en peso y preferiblemente menos de cerca de 5% en peso del eluido obtenido en el paso (b); el etanercept correctamente plegado constituye más de cerca de 90% en peso y preferiblemente más de aproximadamente 95% en peso del eluato obtenido en el paso (b); y una cantidad combinada de etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente constituye menos de cerca de 95 por ciento en peso y preferiblemente al menos aproximadamente 98% en peso del eluido obtenido en el paso (b).

F. El método de cualquiera de las modalidades A a E en donde la resina de modo mixto es Capto™ MMC y los pasos (a) y (b) del método se llevan a cabo a un pH de entre cerca de 4.5 a aproximadamente 7.5; y el paso de elución (b) se lleva a cabo por el contacto con la resina de modo mixto con una solución salina.

G. El método de cualquiera de las modalidades de A a E en donde la resina de modo mixto es Capto™ Adhere y los pasos (a) y (b) se llevan a cabo a un pH de aproximadamente 4.5 a cerca de 8.5; y el paso de elución (b) se lleva a cabo por el contacto de la resina de modo mixto con una solución salina, dicha solución opcionalmente además comprende arginina.

H. El método de las modalidades F o G en donde se aplica la solución de sal en el paso (b) a través de un gradiente por el que se aumenta gradualmente la concentración de sal.

I. El método de la modalidad H donde el gradiente de la concentración de sal del paso (b) provoca un aumento en la concentración de sal de cerca de 0 a cerca de 1M.

J. El método de cualquiera de las modalidades F a I donde se selecciona la sal de cloruro de sodio y sulfato de sodio.

K. El método de cualquiera de las modalidades A a J en donde, durante el paso (b), el pH de la solución en contacto con la resina en el paso (b) ha cambiado gradualmente.

L. El método de la modalidad K en donde el pH se incrementa gradualmente.

M. El método de la modalidad K en donde el pH se reduce gradualmente.

N. El método de cualquiera de las modalidades A a M en donde la cantidad de proteína correctamente plegada obtenida en el eluato del paso (b) es por lo menos alrededor del 60% en peso de la cantidad de proteína presente en la mezcla de proteína introducida a la resina en el paso (a).

O. El método de la modalidad N en donde la cantidad de proteína correctamente plegada es por lo menos de cerca de 70% en peso de la cantidad de proteína presente en la mezcla de proteína introducida a la resina en el paso (a).

P. El método de cualquiera de las modalidades A-0 en donde una mezcla de proteínas que comprende al menos 90% en peso de etanercept correctamente plegado y preferiblemente menos de cerca de 5% en peso de etanercept plegado incorrectamente se obtiene sin realizar, o sin necesidad de realizar ninguna separación cromatográfica o pasos de purificación para separar etanercept correctamente plegado del incorrectamente plegado, excepto los siguientes: 1) uno o más pasos de purificación, preferentemente que comprende un paso de purificación cromatográfica de proteína A, donde dichos pasos se emplean para purificar un fluido de cultivo celular recolectado que contiene proteínas basadas en etanercept, y donde tal paso de purificación no hace apreciable separación de etanercept correctamente plegado del incorrectamente plegado. (2) los pasos cromatográficos de modo mixto (a) y (b) recitados en la modalidad 1; y (3) SEC, HIC u otros pasos cromatográficos analíticos realizados exclusivamente con fines de análisis.

Q. El método de cualquiera de las modalidades A a P en donde se determina la cantidad de proteína presente en el eluato del paso (b) por absorbancia UV a 280; la cantidad del etanercept correctamente plegado en el eluato del paso B se determina mediante cromatografía de interacción hidrófoba; y la cantidad combinada de etanercept incorrectamente y correctamente plegado presente en el eluato del paso (b) se determina mediante cromatografía de exclusión de tamaño.

R. Un método de cromatografía de modo mixto para purificar una mezcla de proteína para separar etanercept correctamente plegado de etanercept incorrectamente plegado presente en dicha mezcla, el método que comprende los pasos de: (a) contactar una resina de cromatografía de modo mixto con radicales hidrofóbicos y radicales de intercambio iónico con una solución que contiene una mezcla de proteínas que comprende etanercept correctamente plegado y etanercept incorrectamente plegado, tal que el etanercept incorrectamente y correctamente plegado se llega a fijar, unir o capturar a la resina de cromatografía de modo mixto; y (b) contactar la resina de modo mixto con una solución capaz de eluir las proteínas de etanercept de la resina de cromatografía de modo mixto para obtener un eluato en donde la proporción de la cantidad de etanercept correctamente plegado a etanercept incorrectamente plegado es mayor que la de la mezcla de proteína introducida a la resina en el paso (a).

S. El método de la modalidad R en donde la resina de cromatografía de modo mixto es una resina de cromatografía de modo mixto Capto™ MMC.

T. El método de la modalidad R en donde la resina de la cromatografía de modo mixto es una resina de cromatografía de modo mixto Capto™Adhere.

U. El método de las modalidades A-T donde (A) etanercept incorrectamente plegado constituye menos de cerca de 5 por ciento en peso del eluato obtenido en el paso (b); etanercept correctamente plegado constituye más de cerca del 90% en peso del eluato obtenido en el paso (b); y una cantidad combinada de etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente constituye al menos cerca de 95 por ciento en peso del eluato obtenido en el paso (b); o (B) el eluato, o porción del mismo, obtenido en el paso (b) comprende etanercept correctamente plegado y está libre o esencialmente libre de etanercept incorrectamente plegado.

V. El método de cualquiera de modalidades A a U en donde la resina de modo mixto es Capto™ MMC y pasos (a) y (b) del método se llevan a cabo a un pH de entre cerca de 4.5 a aproximadamente 7.5; y el paso de elución (b) se lleva a cabo en contacto con la resina de modo mixto con una solución salina.

W. El método de cualquiera de las modalidades R a V en donde la resina de modo mixto es Capto™Adhere y los pasos (a) y (b) se llevan a cabo a un pH de aproximadamente 4.5 a cerca de 8.5; y el paso de elución (b) se lleva a cabo por el contacto de la resina de modo mixto con una solución salina, dicha solución opcionalmente comprendiendo además arginina.

X. El método de las modalidades V o W, en donde se aplica la solución de sal en el paso (b) a través de un gradiente por el que se aumenta gradualmente la concentración de sal.

Y. El método de la modalidad X en donde el gradiente de concentración de sal del paso (b) provoca un aumento en la concentración de sal de cerca de 0 a cerca de 1M.

Z. El método de cualquiera de las modalidades V a Y en donde se selecciona la sal de cloruro de sodio y sulfato de sodio.

AA. El método de cualquiera de las modalidades R a Z en donde, durante el paso (b), el pH de la solución en contacto con la resina en el paso (b) es gradualmente aumentada o disminuida gradualmente.

BB. El método de cualquiera de las modalidades R a AA en donde la cantidad de proteína correctamente plegada obtenida en el eluato del paso (b) es por lo menos de alrededor de 60% en peso y preferentemente al menos de cerca de 70% en peso de la cantidad de proteína presente en la mezcla de proteína Introducida a la resina en el paso (a).

CC. El método de cualquiera de las modalidades A a BB, en donde el método es practicado dos o más veces de la siguiente manera: realizar una primera separación de modo mixto (separación #1) mediante la realización de los pasos (a) y (b); seguido por realizar una segunda separación de modo mixto (separación #2): mediante la realización de los pasos (a) y (b) nuevamente; en donde el eluato obtenido en el paso (b) de la separación #1 se utiliza como la solución que contiene una mezcla de proteína en el paso (a) de separación #2.

DD. El método de la modalidad CC en donde la resina de modo mixto utilizada en la separación #1 es igual, o diferente de, la resina de modo mixto utilizada en la separación #2.

EE. El método de la modalidad DD donde la separación #1 y la separación #2 se realizan de una manera seleccionada de las siguientes combinaciones: La separación # 1 usa CAPTO MMC como la resina de cromatografía de modo mixto y la separación # 2 usa CAPTO ADHERE como la resina de cromatografía de modo mixto; La separación # 1 usa CAPTO ADHERE como la resina de cromatografía de modo mixto y la separación # 2 usa CAPTO MMC como la resina de cromatografía de modo mixto; La separación # 1 usa CAPTO MMC como la resina de cromatografía de modo mixto y la separación # 2 usa CAPTO MMC como la resina de cromatografía de modo mixto; o La separación # 1 usa CAPTO ADHERE como la resina de cromatografía de modo mixto la separación # 2 usa CAPTO ADHERE como la resina de cromatografía de modo mixto.

FF. El método de la modalidad EE donde la separación #1 y la separación #2 se realizan de la siguiente manera: La separación # 1 usa CAPTO MMC como la resina de cromatografía de modo mixto; y la separación # 2 usa CAPTO ADHERE como la resina de cromatografía de modo mixto.

GG. Una mezcla de proteínas que contiene etanercept, o una formulación farmacéuticamente aceptable que comprende dicha mezcla, obtenida por el método de cualquiera de las modalidades A a FF y en donde dicha mezcla de proteína comprende etanercept correctamente plegado en una cantidad constituyendo más de cerca de 90% en peso de la mezcla de proteína; y que comprende etanercept incorrectamente plegado en una cantidad que constituye menos de cerca de 5% en peso de la mezcla de proteína; y en donde la mezcla de proteínas tiene una cantidad combinada de etanercept correctamente plegado e incorrectamente plegado que constituyen al menos cerca de 95 y preferiblemente al menos cerca del 98% en peso de la mezcla de proteína que contiene etanercept.

HH. Una formulación farmacéuticamente aceptable que comprende etanercept altamente puro conveniente para la administración a un sujeto que requiere tratamiento para una condición mediada por TNF, dicha formulación que contiene una mezcla de proteínas que comprende una importante cantidad de etanercept correctamente plegado y una cantidad menor de etanercept incorrectamente plegado, en donde: (i) el etanercept incorrectamente plegado constituye menos de cerca de 10% en peso preferiblemente menos de cerca de 8% en peso y más preferiblemente menos de cerca de 5% en peso de la mezcla de proteína; (ii) el etanercept correctamente plegado constituye más de 90% en peso y preferiblemente más de aproximadamente 92% en peso y preferiblemente más de aproximadamente 95% en peso de la mezcla de proteína; y (iii) la cantidad total de etanercept correctamente plegado y etanercept incorrectamente plegada (pero no incluye los mismos agregados) constituye por lo menos 95 y preferiblemente al menos el 98% en peso de la mezcla de proteína; en donde la formulación además comprende ingredientes inactivos farmacéuticamente aceptables, excipientes o portadores que hacen de la formulación conveniente para la administración al sujeto.

II. La formulación de la modalidad HH en donde la preparación de etanercept constituye cerca de 25 a cerca de 75 mg/ml de la formulación y la formulación además comprende sacarosa, cloruro de sodio, clorhidrato de L-arginina y fosfato de sodio.

JJ. Un método para producir una mezcla de proteína que contiene etanercept con una pureza elevada con respecto a la cantidad de etanercept correctamente plegado versus incorrectamente plegado presente en esta, dicho método que comprende los pasos de: (1) expresar etanercept en un sistema de expresión mamífera para obtener un fluido de cultivo celular recolectado que contiene una mezcla de proteína que contiene etanercept que comprende etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente; (2) someter el fluido de cultivo celular recolectado obtenido en el paso 1 a un procedimiento de purificación por el que una mezcla de protefna que contiene etanercept se obtiene con una cantidad reducida de, o sustancialmente libre de, impurezas indeseadas presentes en el fluido de cultivo celular recolectado producido en el paso (1); (3) poner en contacto la mezcla de proteína que contiene etanercept obtenida en el paso (2) una o más veces con una resina cromatográfica de modo mixto teniendo radicales de intercambio iónico y radicales de interacción hidrófoba con el fin de fijar las proteínas contenidas en la mezcla a la resina; y (4) poner en contacto la resina con proteína unida a la misma del paso 3 con una solución para eluir etanercept correctamente plegado de la resina de modo mixto para obtener un eluato que comprende una mezcla de proteína que contiene etanercept con una mayor proporción del etanercept correctamente plegado contra etanercept plegado incorrectamente que la mezcla que contiene etanercept introducida a la resina en el paso 3; en donde: (i) la cantidad de proteína presente en la mezcla de proteína que contiene etanercept obtenida de la purificación del paso 2 es por lo menos 80% en peso de la cantidad de la mezcla de proteína a base de etanercept presente en el fluido de cultivo celular de recolección obtenido en el paso 1. (ii) la cantidad combinada de proteína de etanercept incorrectamente y correctamente plegado presente en la mezcla de proteína eluida en el paso 4 es por lo menos cercade 60% en peso de la cantidad de la misma presente en la mezcla de proteína obtenida en el paso 2; (¡ii) la cantidad del etanercept correctamente plegado presente en el eluato del paso 4 es por lo menos cerca de 30% en peso y preferiblemente por lo menos cerca de 35% en peso de la cantidad de la mezcla de proteína que contiene etanercept presente en el fluido de cultivo celular recolectado obtenido en el paso 1; y (iv) dicho etanercept correctamente plegado que constituye al menos cerca de 90% en peso y preferiblemente al menos cerca de 95% en peso de eluato obtenido en el paso 4.

KK. El método de la modalidad JJ en donde la resina de modo mixto es seleccionada del grupo formado por CAPTO MMC y CAPTO ADHERE.

LL: El método de las modalidades JJ o KK que comprende los siguientes pasos adicionales: Paso (5): poner en contacto la mezcla de proteína obtenida en el eluato del paso 4 con una resina cromatográfica de modo mixto teniendo radicales de intercambio iónico y radicales de interacción hidrófoba con el fin de fijar las proteínas contenidas en la mezcla a la resina; y luego paso (6) poner en contacto la resina con una solución para eluir correctamente etanercept plegado de ahí para obtener un eluato que comprende una mezcla de proteínas con una mayor proporción de etanercept plegado correctamente frente al incorrectamente plegado; en donde la resina de modo mixto usada en dichos pasos adicionales 5 y 6 es igual a o diferente de la resina de modo mixto utilizada en los pasos 3 y 4.

MM. El método de la modalidad LL en donde la resina de modo mixto utilizada en el paso (3) y (4) es CAPTO MMC y la resina utilizada en los pasos (5) y (6) es CAPTO ADHERE.

NN. El método de cualquiera de las modalidades JJ a MM en donde el paso 4 (y/o paso 6 en el caso de la modalidad LL) se lleva a cabo por el contacto con la resina de modo mixto con una solución salina para eluir etanercept correctamente plegado de la resina de modo mixto y, opcionalmente, (i) en donde la concentración de la solución de sal se aumenta gradualmente en los pasos (4) o (6) durante dicho contacto de la solución con la resina; y opcionalmente (ii) el pH de la solución de elución se aumenta gradualmente o disminuye en los pasos (4) y/o (6) durante dicho contacto de la solución con la resina. 00. El método de cualquiera de las modalidades JJ a NN, en donde el producto obtenido en uno o más de los pasos del método son sometidos a filtración, tales como filtración viral y/o filtración de flujo tangencial.

PP. El método de cualquiera de las modalidades JJ a 00, en donde el paso 2 se lleva a cabo empleando una columna de cromatografía de proteína A.

QQ. El método de cualquiera de las modalidades JJ a 00 en donde se lleva a cabo el paso 2 usando una resina de modo mixto teniendo radicales hidrofóbicos y radicales de intercambio iónico.

RR. P. El método de cualquiera de las modalidades A-PP en donde una mezcla de proteínas que comprende al menos 90% en peso de etanercept correctamente plegado y preferiblemente menos de cerca de 5% en peso de etanercept plegado incorrectamente se obtiene sin realizar una separación cromatográfica o pasos de purificación para separar etanercept correctamente plegado del incorrectamente plegado, diferente de uno o más de los siguientes pasos: (1) opcionalmente, uno o más pasos de purificación, preferentemente que comprende un paso de purificación cromatográfica de proteína A, dichos pasos siendo empleados para purificar un fluido de cultivo celular recolectado que contiene proteínas basadas en etanercept, y donde tal paso de purificación no separa el etanercept correctamente plegado del incorrectamente plegado; (2) dicha una o más apariciones de los pasos cromatográficos de modo mixto (3) y (4) recitados en la modalidad A (o pasos 3, 4, 5 y 6 según la modalidad LL); y (3) opcionalmente, uno o más SEC, HIC u otros pasos de cromatografía realizados exclusivamente con fines de análisis.

SS. El método de cualquiera de las modalidades A a RR que excluye el uso de cromatografía de interacción hidrófoba de modo sencillo como un medio de separar etanercept correctamente doblado de etanercept incorrectamente plegado, excepto cuando se realiza exclusivamente con fines de análisis.

TT. Un método para tratar un sujeto que sufre de una enfermedad mediada por TNF, que comprende los pasos de administrar a dicho individuo una formulación farmacéutica individual que contiene una mezcla de proteínas que comprende etanercept correctamente plegado y etanercept incorrectamente plegado, dicha mezcla siendo obtenida por el método de cualquiera de las modalidades A a SS, y en donde la cantidad de etanercept plegado incorrectamente en la mezcla de proteína es de menos de cerca de 5% en peso de dicha mezcla.

UU. El método de la modalidad TT, en donde la cantidad de etanercept plegado incorrectamente en la mezcla de proteína es inferior a cerca de 3% en peso de dicha mezcla y cantidad de etanercept correctamente plegado en la mezcla es mayor que aproximadamente 95% en peso de dicha mezcla.

VV. Un método para tratar a un sujeto que sufre de una enfermedad mediada por TNF, que comprende los pasos de administrar a tales individuales una formulación farmacéutica que contiene una mezcla de proteínas que comprende etanercept correctamente plegado y etanercept incorrectamente plegado en donde la cantidad de etanercept plegado incorrectamente en la mezcla de proteína es inferior a cerca de 5% en peso de dicha mezcla.

WW. El método de las modalidades TT-VV, en donde la cantidad de etanercept plegado incorrectamente en la mezcla de proteína es inferior a cerca de 3% en peso de dicha mezcla y la cantidad de etanercept correctamente plegado en la mezcla es mayor que aproximadamente 95% en peso de la mezcla.

XX. El método de cualquiera de las modalidades TT-VV en donde la cantidad combinada de etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente (excluyendo los agregados del mismo) es al menos cerca de 95% en peso de dicha mezcla.

YY. El método de la modalidad XX en donde la cantidad combinada de etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente (excluyendo los agregados del mismo) es al menos cerca de 98% en peso de dicha mezcla.

ZZ. Los métodos o las composiciones de cualquiera de las modalidades A a YY en donde el término "etanercept incorrectamente plegado" se entiende, a menos que se indique lo contrario, que incluye agregados que comprenden etanercept correctamente plegado o incorrectamente plegado.

AAA. El método de las modalidades JJ a QQ en donde la cantidad de la proteína basada en etanercept en el cultivo celular recolectado del paso 1 se determina por Fe elisa.

BBB. El método de cualquiera de las modalidades JJ-QQ en donde la cantidad de proteínas basadas en etanercept presentes en los eluatos obtenidos de la resina de modo mixto en el paso 4 (o como en el caso de la modalidad LL, pasos 4 y 6) está determinado por la absorbancia UV a A280.

CCC. El método de la modalidad BBB en donde la cantidad de proteína a base de etanercept presente en el producto obtenido del procedimiento de purificación del paso 2 se determina por absorbancia de UV a A280 o por Fe elisa.

DDD. Un método para separar etanercept correctamente plegado de etanercept incorrectamente plegado, en donde se utilizan medios cromatográficos para lograr dicha separación, y en donde los medios cromatográficos consisten solamente o exclusivamente de cromatografía en modo mixto en donde una mezcla compuesta por etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente se pone en contacto con una resina cromatográfica de modo mixto con intercambio iónico y radicales hidrofóbicos y entonces se eluye a partir de este, para obtener un eluato que comprende al menos cerca de 85 y preferiblemente al menos cerca de 90 y más preferentemente al menos cerca de 95% en peso de etanercept correctamente plegado.

EEE. El método de la modalidad DDD en donde se selecciona la resina de modo mixto de CAPTO MMC y CAPTO ADHERE; se lleva a cabo la elución con una solución salina, opcionalmente aplicada mediante un gradiente de aumento de la concentración de sal; el pH de la solución de sal está en el intervalo de aproximadamente 4 a cerca de 8.5, opcionalmente aplicado en un gradiente en el cual el pH es gradualmente aumentado o disminuido; y en el cual el eluido se obtiene de la resina durante un período de tiempo y eluido recolectado temprano en dicho período está libre o esencialmente libre de etanercept incorrectamente plegada.

Claims (31)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un método de cromatografía de modo mixto para separar una proteína correctamente plegada de una proteína mal plegada, que comprende los pasos de: (a) unir una primera mezcla de proteína que comprende las conformaciones correctamente plegadas e incorrectamente plegadas de una proteína dada a una resina de cromatografía de modo mixto que tienen los radicales de Intercambio iónico y radicales hidrofóblcas; (b) eluir la proteína correctamente plegada de la resina de modo mixto para obtener una segunda mezcla de proteína que comprende una mayor proporción de proteína correctamente plegada que la primera mezcla de proteína.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la resina de cromatografía de modo mixto es una resina de cromatografía de modo mixto Capto™ MMC.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la resina de cromatografía de modo mixto es una resina de cromatografía de modo mixto Capto™Adhere.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las conformaciones de proteínas Incorrectamente y correctamente plegadas comprenden etanercept correctamente plegado y plegado Incorrectamente.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el etanercept incorrectamente plegado constituye menos de cerca de 10% en peso y preferiblemente menos de cerca de 5% en peso del eluido obtenido en el paso (b); el etanercept correctamente plegado constituye más de cerca de 90% en peso y preferiblemente más de aproximadamente 95% en peso del eluato obtenido en el paso (b); y una cantidad combinada de etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente constituye menos de cerca de 95 por ciento en peso y preferiblemente al menos aproximadamente 98% en peso del eluido obtenido en el paso (b).

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la resina de modo mixto es Capto™ MMC y pasos (a) y (b) del método se llevan a cabo a un pH de entre cerca de 4.5 a aproximadamente 7.5; y el paso de elución (b) se lleva a cabo en contacto con la resina de modo mixto con una solución salina.

7. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la resina de modo mixto es Capto™Adhere y los pasos (a) y (b) se llevan a cabo a un pH de aproximadamente 4.5 a cerca de 8.5; y el paso de elución (b) se lleva a cabo por el contacto de la resina de modo mixto con una solución salina, dicha solución opcionalmente comprendiendo además arginina.

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque se aplica la solución de sal en el paso (b) a través de un gradiente por el que se aumenta gradualmente la concentración de sal.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el gradiente de concentración de sal del paso (b) provoca un aumento en la concentración de sal de cerca de 0 a cerca de 1M.

10. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la sal se selecciona de cloruro de sodio y sulfato de sodio.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque durante el paso (b), el pH de la solución en contacto con la resina en el paso (b) ha cambiado gradualmente.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la cantidad de proteína correctamente plegada obtenida en el eluato del paso (b) es por lo menos alrededor del 60% en peso de la cantidad de proteína presente en la mezcla de proteína introducida a la resina en el paso (a).

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la cantidad de proteína correctamente plegada es por lo menos de cerca de 70% en peso de la cantidad de proteína presente en la mezcla de proteína introducida a la resina en el paso (a).

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque una mezcla de proteínas que comprende al menos 90% en peso de etanercept correctamente plegado y preferiblemente menos de cerca de 5% en peso de etanercept plegado incorrectamente se obtiene sin realizar, o sin necesidad de realizar ninguna separación cromatográfica o pasos de purificación para separar etanercept correctamente plegado del incorrectamente plegado, excepto los siguientes: (1) uno o más pasos de purificación, preferentemente que comprende un paso de purificación cromatográfica de proteína A, donde dicho(s) paso(s) se emplea(n) para purificar un fluido de cultivo celular recolectado que contiene proteínas basadas en etanercept, y donde tal paso de purificación no hace apreciable la separación de etanercept correctamente plegado del incorrectamente plegado; (2) los pasos cromatográficos de modo mixto (a) y (b) recitados en la reivindicación 1; y (3) SEC, HIC u otros pasos cromatográficos analíticos realizados exclusivamente con fines de análisis.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque se determina la cantidad de proteína presente en el eluato del paso (b) por absorbancia UV a 280; la cantidad del etanercept correctamente plegado en el eluato del paso (b) se determina mediante cromatografía de interacción hidrófoba; y la cantidad combinada de etanercept incorrectamente y correctamente plegado presente en el eluato del paso (b) se determina mediante cromatografía de exclusión de tamaño.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el método es practicado dos o más veces de la siguiente manera: realizar una primera separación de modo mixto (separación #1) mediante la realización de los pasos (a) y (b); seguido por realizar una segunda separación de modo mixto (separación #2): mediante la realización de los pasos (a) y (b) nuevamente; en donde el eluato obtenido en el paso (b) de la separación #1 se utiliza como la solución que contiene una mezcla de proteína en el paso (a) de separación #2.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la resina de modo mixto utilizada en la separación #1 es igual, o diferente de, la resina de modo mixto utilizada en la separación #2.

18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la separación #1 y la separación #2 se realizan de una manera seleccionada de las siguientes combinaciones: la separación # 1 usa CAPTO MMC como la resina de cromatografía de modo mixto y la separación # 2 usa CAPTO ADHERE como la resina de cromatografía de modo mixto; la separación # 1 usa CAPTO ADHERE como la resina de cromatografía de modo mixto y la separación # 2 usa CAPTO MMC como la resina de cromatografía de modo mixto; la separación # 1 usa CAPTO MMC como la resina de cromatografía de modo mixto y la separación # 2 usa CAPTO MMC como la resina de cromatografía de modo mixto; o la separación # 1 usa CAPTO ADHERE como la resina de cromatografía de modo mixto la separación # 2 usa CAPTO ADHERE como la resina de cromatografía de modo mixto.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la separación #1 y la separación #2 se realizan de la siguiente manera: la separación # 1 usa CAPTO MMC como la resina de cromatografía de modo mixto; y la separación # 2 usa CAPTO ADHERE como la resina de cromatografía de modo mixto.

20. Una mezcla de proteínas que contiene etanercept, o una formulación farmacéuticamente aceptable que comprende dicha mezcla, obtenida por el método de la reivindicación 1 y en donde dicha mezcla de proteína comprende etanercept correctamente plegado en una cantidad constituyendo más de cerca de 90% en peso de la mezcla de proteína; y que comprende etanercept incorrectamente plegado en una cantidad que constituye al menos cerca de 5% en peso de la mezcla de proteína; y en donde la mezcla de proteínas tiene una cantidad combinada de etanercept correctamente plegado e incorrectamente plegado que constituyen al menos cerca de 95 y preferiblemente al menos cerca del 98% en peso de la mezcla de proteína que contiene etanercept.

21. Una formulación farmacéuticamente aceptable que comprende etanercept altamente puro conveniente para la administración a un sujeto que requiere tratamiento para una condición mediada por TNF, dicha formulación que contiene una mezcla de proteínas que comprende una importante cantidad de etanercept correctamente plegado y una cantidad menor de etanercept incorrectamente plegado, en donde: (i) el etanercept incorrectamente plegado constituye menos de cerca de 10% en peso preferiblemente menos de cerca de 8% en peso y más preferiblemente menos de cerca de 5% en peso de la mezcla de proteína; (ii) el etanercept correctamente plegado constituye más de 90% en peso y preferiblemente más de aproximadamente 92% en peso y preferiblemente más de aproximadamente 95% en peso de la mezcla de proteína; y (iii) la cantidad total de etanercept correctamente plegado y etanercept incorrectamente plegada (pero no incluye los mismos agregados) constituye por lo menos 95 y preferiblemente al menos el 98% en peso de la mezcla de proteína; en donde la formulación además comprende ingredientes inactivos farmacéuticamente aceptables, excipientes o portadores que hacen de la formulación conveniente para la administración al sujeto.

22. La formulación de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada además porque la preparación constituye cerca de 25 a cerca de 75 mg/ml de la formulación y la formulación además comprende sacarosa, cloruro de sodio, clorhidrato de L-arginina y fosfato de sodio.

23. Un método para producir una mezcla de proteína que contiene etanercept con una pureza elevada con respecto a la cantidad de etanercept correctamente plegado versus incorrectamente plegado presente en esta, dicho método que comprende los pasos de: (1) expresar etanercept en un sistema de expresión mamífera para obtener un fluido de cultivo celular recolectado que contiene una mezcla de proteína que contiene etanercept que comprende etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente; (2) someter el fluido de cultivo celular recolectado obtenido en el paso 1 a un procedimiento de purificación por el que una mezcla de proteína que contiene etanercept se obtiene con una cantidad reducida de, o sustancialmente libre de, impurezas indeseadas presentes en el fluido de cultivo celular recolectado producido en el paso (1); (3) poner en contacto la mezcla de proteína que contiene etanercept obtenida en el paso (2) una o más veces con una resina cromatográfica de modo mixto teniendo radicales de intercambio iónico y radicales de interacción hidrófoba con el fin de fijar las proteínas contenidas en la mezcla a la resina; y (4) poner en contacto la resina con proteína unida a la misma del paso 3 con una solución para eluir etanercept correctamente plegado de la resina de modo mixto para obtener un eluato que comprende una mezcla de proteína que contiene etanercept con una mayor proporción del etanercept correctamente plegado contra etanercept plegado incorrectamente que la mezcla que contiene etanercept introducida a la resina en el paso 3; en donde: (i) la cantidad de proteína presente en la mezcla de proteína que contiene etanercept obtenida de la purificación del paso 2 es por lo menos 80% en peso de la cantidad de la mezcla de proteína a base de etanercept presente en el fluido de cultivo celular de recolección obtenido en el paso 1; (ii) la cantidad combinada de proteína de etanercept incorrectamente y correctamente plegado presente en la mezcla de proteína eluida en el paso 4 es por lo menos cercade 60% en peso de la cantidad de la misma presente en la mezcla de proteína obtenida en el paso 2; (iii) la cantidad del etanercept correctamente plegado presente en el eluato del paso 4 es por lo menos cerca de 30% en peso y preferiblemente por lo menos cerca de 35% en peso de la cantidad de la mezcla de proteína que contiene etanercept presente en el fluido de cultivo celular recolectado obtenido en el paso 1; y (iv) dicho etanercept correctamente plegado que constituye al menos cerca de 90% en peso y preferiblemente al menos cerca de 95% en peso de eluato obtenido en el paso 4.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la resina de modo mixto se selecciona del grupo que consta de CAPTO MMC y CAPTO ADHERE.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque comprende los siguientes pasos adicionales: paso (5): poner en contacto la mezcla de proteína obtenida en el eluato del paso 4 con una resina cromatográfica de modo mixto teniendo radicales de intercambio iónico y radicales de interacción hidrófoba con el fin de fijar las proteínas contenidas en la mezcla a la resina; y luego paso (6) poner en contacto la resina con una solución para eluir correctamente etanercept plegado de ahí para obtener un eluato que comprende una mezcla de proteínas con una mayor proporción de etanercept plegado correctamente frente al incorrectamente plegado; en donde la resina de modo mixto usada en dichos pasos adicionales 5 y 6 es igual a o diferente de la resina de modo mixto utilizada en los pasos 3 y 4.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la resina de modo mixto utilizada en el paso (3) y (4) es CAPTO MMC y la resina utilizada en los pasos (5) y (6) es CAPTO ADHERE.

27. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque excluye el uso de cromatografía de interacción hidrófoba de modo sencillo como un medio de separar etanercept correctamente doblado de etanercept incorrectamente plegado, excepto cuando se realiza exclusivamente con fines de análisis.

28. Un método para tratar a un sujeto que sufre de una enfermedad mediada por TNF, que comprende los pasos de administrar a tales individuales una formulación farmacéutica que contiene una mezcla de proteínas que comprende etanercept correctamente plegado y etanercept incorrectamente plegado en donde la cantidad de etanercept plegado incorrectamente en la mezcla de proteína es inferior a cerca de 5% en peso de dicha mezcla.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la cantidad de etanercept plegado incorrectamente en la mezcla de proteína es inferior a cerca de 3% en peso de dicha mezcla y la cantidad de etanercept correctamente plegado en la mezcla es mayor que aproximadamente 95% en peso de la mezcla.

30. Un método para separar etanercept correctamente plegado de etanercept incorrectamente plegado, en donde se utilizan medios cromatográficos para lograr dicha separación, y en donde los medios cromatográficos consisten solamente o exclusivamente de cromatografía en modo mixto en donde una mezcla compuesta por etanercept correctamente plegado y plegado incorrectamente se pone en contacto con una resina cromatográfica de modo mixto con intercambio iónico y radicales hidrofóbicos y entonces se eluye a partir de este, para obtener un eluato que comprende al menos cerca de 85 y preferiblemente al menos cerca de 90 y más preferentemente al menos cerca de 95% en peso de etanercept correctamente plegado.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque se selecciona la resina de modo mixto de CAPTO MMC y CAPTO ADHERE; se lleva a cabo la elución con una solución salina, opcionalmente aplicada mediante un gradiente de aumento de la concentración de sal; el pH de la solución de sal está en el intervalo de aproximadamente 4 a cerca de 8.5, opcionalmente aplicado en un gradiente en el cual el pH es gradualmente aumentado o disminuido; y en el cual el eluido se obtiene de la resina durante un período de tiempo y eluido recolectado temprano en dicho período está libre o esencialmente libre de etanercept incorrectamente plegada.