KR100232688B1 - 종양 괴사 인자 길항제를 함유하는 tnf-의존성 염증 치료용 제약 조성물 - Google Patents

종양 괴사 인자 길항제를 함유하는 tnf-의존성 염증 치료용 제약 조성물 Download PDF

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크레이그 에이. 스미쓰
신디 에이. 제이콥스
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스코트 쥐. 홀퀴스트
이뮤넥스 코포레이션
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Abstract

본 발명은 가용성 TNFR 등의 TNF 길항질을 포유 동물에게 투여하는 것으로 이루어진 TNF-의존성 염증의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
종양 괴사 인자 길항제를 함유하는 TNF-의존성 염증 치료용 제약 조성물
[관련 출원과의 상호 참조]
본 발명은 1990년 5월 10일자로 출원되어 현재 계류중인 미합중국 특허 출원 제523,635호의 일부 계속 출원이고, 이 출원은 1989년 10월 13일자로 출원되어 현재 포기된 미합중국 특허 출원 제421,417호의 일부 계속 출원이며, 이 출원은 1989년 9월 11일자로 출원되어 현재 포기된 미합중국 특허 출원 제405,370호의 일부 계속 출원이고, 이 출원은 1989년 9월 5일자로 출원되어 현재 포기된 미합중국 특허 출원 제403,241호의 일부 계속 출원이다.
[발명의 배경]
본 발명은 일반적으로 사이토킨(cytokine) 수용체에 관한 것이며, 더 구체적으로 말하자면 종양 괴사 인자 길항제를 사용하여 TNF-의존성 염증을 억제하는 방법에 관한 것이다.
종양 괴사 인자-α (TNFα, 카케크틴(cachectin)으로도 알려져 있음) 및 종양 괴사 인자-β (TNFβ, 림포톡신(lymphotoxin)으로도 알려져 있음)는 다수의 세포 유형에 대해 광범위한 각종 효과를 유발할 수 있는, 포유 동물의 내분비 상동 단백질이다. 이들 2가지 사이토킨의 구조적 및 기능적 특징이 매우 유사하기 때문에, “TNF”로 통칭된다. TNFα (Pennica 등, Nature 312:724, 1984) 및 TNFβ (Gray 등, Nature 312:721, 1984)를 코딩하는 상보적 cDNA 클론을 단리시켜, TNF의 더 상세한 구조 및 생물학적 특성을 알았다.
TNF 단백질은 TNF-감응성 세포의 플라즈마 막 상에 발현된 특정 TNF 수용체 (TNFR) 단백질에 결합함으로써 세포에 대해 생물학적 효과를 개시한다. TNFR의 2가지 독특한 형태는 분자량이 약 75 킬로달톤인 타입 I TNFR (TNFRI), 및 분자량이 약 55 킬로달톤인 타입 II TNFR (TNFRII)로 존재한다고 알려져 있다. TNFRI 및 TNFRII는 각각 TNFα 및 TNFβ 모두에 결합한다. TNFRI 및 TNFRII는 모두 분자적으로 클론화되어 (Smith 등, Science 248:1019, 1990; Loetscher 등, Cell 61:351, 1990 및 Schall 등, Cell 61:361, 1990), 가용성 TNFR 단백질의 재조합 발현 및 정제를 가능케 하였다.
인간의 뇨로부터 가용성 TNF 결합 단백질도 확인되었다 [Peetre 등의 Eur. J. Haematol. 41:414, 1988; Seckinger 등의 J. Exp. Med. 167:1511, 1988; Seckinger 등의 J. Biol. Chem. 264:11966, 1989; Seckinger 등의 영국 특허 출원 공개 제2,218,101호; Engelmann 등의 J. Biol. Chem. 264:11974, 1989 참조].
가용성 TNFR 및 TNF 결합 단백질 등과 같은 TNF 길항제는 TNF에 결합되어 TNF가 세포막에 결합되어 있는 TNF 수용체에 결합되는 것을 방지한다. 따라서, 이러한 단백질은 TNF에 의해 유발되는 생물학적 활성을 억제하는 데 유용하다.
TNF 매개된 염증에 있어서의 TNF의 역할, 및 가용성 TNFR 및 TNF 결합 단백질 등의 TNF-의존성 염증을 억제하는 데 있어서의 생체내 생물학적 효과는 완전히 밝혀져 있지 않으며, TNF 길항제의 잠재적인 치료 용도도 아직 확인된바 없다.
[발명의 요약]
본 발명은 TNF 길항제를 사용하는 TNF-의존성 염증의 억제 방법을 제공한다. 더 구체적으로 말하면, 본 발명은 TNF 길항제, 예를 들면 가용성 인체 TNFR을 인체체 투여하는 단계를 포함하는 관절염 환자의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 이러한 목적 및 다른 목적은 하기 상세한 설명으로부터 보다 명백해질 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 재조합 인체 TNFR/Fc 융합 단백질의 이량체 구조를 나타낸다. rhu TNFR/Fc를 코딩하는 플라스미드의 1차 번역 산물은 인체 IgG1로부터 유도된 Fc의 단일 사슬에 결합된 가용성 TNFR의 단일 분자이다. 번역 후 및 분비전에, 이 융합 단백질은 Fc 영역에 있는 3개의 시스테인 잔기를 통해 이량체화 되어 이량체 rhu TNFR/Fc를 형성한다. 박스는 TNFR의 구조 도메인을 나타낸다.
제2도는 플라스미드 pCAVDHFR rhu TNFR/Fc의 구조를 나타낸다. 약어는 다음과 같다: ADH2, 효모 알콜 데히드로게나제 유전자 및 조절 영역; CMV, 사이토메갈로바이러스 초기 인핸서; TPL, 아데노바이러스-2 트리파타이트 리더; VA, 아데노바이러스-2 바이러스-관련 RNA 유전자 I 및 II; DHFR, 햄스터 디히드로플레이트 리덕타제 유전자.
제3도 및 제4도는 재조합 인체 TNFR/Fc, 단량체 TNFR, 재조합 쥐 IL-1R 및 rmuIL-1R과 조합한 TNFR 단량체를 관절 내로 투여할 때 쥐에 있어서의 항원-유도된 관절염에 대한 효과를 나타낸다. 데이터는 TNFR/Fc, TNFR 단량체, rmu IL-1R 및 IL-1R과 조합된 TNFR이 항원-유도 관절염과 관련된 염증을 억제함을 나타낸다.
제5도는 재조합 인체 TNFR/Fc 및 PBS (비히클 대조용)를 복강내 투여할 때 B10,RIII 생쥐에 있어서 콜라겐 유도 관절염 (CIA)의 발현에 대한 효과를 나타낸다. TNFR/Fc는 CIA의 발병을 현저히 지연시킨다.
제6도는 재조합 인체 TNFR/Fc 및 PBS (비히클 대조용)를 복강내 투여할 때 DBA/1 생쥐에 있어서 콜라겐 유도 관절염 (CIA)의 발현에 대한 효과를 나타낸다. TNFR/Fc는 CIA의 발병을 현저히 지연시킨다.
제7도는 TNFR/Fc를 생쥐에게 투여함으로써 관절염 지수 및 관절염의 징후를 나타내는 관절의 수를 감소시킴을 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
[정의]
본 명세서에 사용된 “TNF 수용체” 및 “TNFR”이라는 용어는 천연 포유 동물 TNF 수용체 또는 TNF 결합 단백질 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 가져서, TNF 분자와 결합할 수 있고, TNF가 세포막 결합된 TNFR에 결합하는 것을 억제할 수 있는 단백질을 의미한다. TNFR의 2가지 독특한 유형은 타입 I TNFR (TNFI) 및 타입 II (TNFRII)로 존재한다고 알려져 있다. 성숙한 전체 길이의 인체 TNFI은 분자량이 약 75 내지 80 킬로달톤 (kDa)인 글리코프로테인이다. 성숙한 전체 길이의 인체 TNFRII는 분자량이 약 55 내지 60 킬로달톤 (kDa)인 글리코프로테인이다. 본 발명의 바람직한 TNFR은 TNFRI 및 TNFRII의 가용성 형태 및 가용성 TNF 결합 단백질이다. 가용성 TNFR 분자로는 20개 이상의 아미노산을 갖는 천연 단백질의 동족체 또는 소단위체를 들 수 있으며, 이들은 TNFRI, TNFRII 또는 TNF 결합 단백질과 공통적인 생물학적 활성을 나타낸다. 가용성 TNFR 구조는 트랜스멤브레인 영역이 없지만 (세포에서 분비되고), TNF와 결합하는 능력을 보유한다. 여러 가지 생물학적 등가 단백질 및 아미노산 동족체는 천연 TNFR, 예를 들면 huTNFRI△235, huTNFRI△185 및 huTNFRI△163의 세포외 영역의 전부 또는 일부에 상응하는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 1-163, 아미노산 서열 1-185 또는 아미노산 서열 1-235와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 가지며, 이들이 TNF 리간드에 결합한다는 점에서 생물학적 활성이 있다. 등가의 가용성 TNFR로는 이들 서열이 1회 이상의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형되고, TNF에 결합하는 능력을 갖거나 또는 세포 표면 결합 TNF 수용체 단백질, 예를 들면 huTNFRI△x(여기서, x는 SEQ ID NO:1의 아미노산 163-235 서열 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택됨)를 통해 TNF 신호 형질 도입 활성을 억제하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 동족체성 결실에 의해 muTNFR로 제조될 수 있다. TNF 신호 형질 도입 활성의 억제는 세포를 재조합 TNFR DNA로 형질 감염시켜 재조합 수용체를 발현시킴으로써 측정할 수 있다. 이어서, 이들 세포를 TNF와 접촉시키고, 생성되는 대사 효과를 조사하였다. 그 효과가 리간드의 작용에 기여 가능하면, 재조합 수용체는 신호 형질 도입 활성을 갖는다. 폴리펩티드가 신호 형질 도입 활성을 갖는지 여부를 측정하기 위한 방법의 예는 문헌[Idzerda 등의 J. Exp. Med. 171:861 (1990): Curtis 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3045 (1989): Prywes 등의 EMBO J.5:2179 (1986) 및 Chou 등의 J. Biol Chem. 262:1842 (1987)]에 기재되어 있다. 별법으로, 내생성 TNF 수용체를 발현시키고, TNF에 대해 검출가능한 정도로 생물학적으로 감응하는 초기 배양 세포 또는 세포주도 이용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 TNFR 동족체에 대한 명명법은 hu (인체에 대해) 또는 mu (쥐에 대해)가 선행하고, △ (결실을 나타냄) 및 C-말단 아미노산의 수가 후속하는 단백질의 통상적인 명명법 (예, TNFR)에 따른 것이다. 예를 들면, huTNFR△235는 C-말단 아미노산으로서 Asp235(즉, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 1-235를 갖는 폴리펩티드)를 갖는 인체 TNFR을 의미한다. 임의의 인체 또는 쥐 종을 지정하지 않으면 TNFR은 일반적으로 포유 동물의 TNFR을 의미한다. 마찬가지로, 결실 돌연변이체에 대해 임의의 특정 종을 지정하지 않으면, TNFR이라는 용어는 TNFR 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 및 동족체를 포함한 TNFR의 모든 형태를 의미한다.
본 명세서에서 TNFR 단백질 또는 단배질 조성물의 순도를 한정하기 위해 사용된 “단리된” 또는 “정제된”이라는 용어는 단백질 또는 단백질 조성물에 다른 천연 단백질 또는 내생성 기원이 실질적으로 없고, 제조시에 잔류하는 단백질 오염물을 약 1 중량% 미만으로 함유하는 것을 의미한다. 그러나, 이러한 조성물은 안정화제, 담체, 부형제 또는 치료 보조제로서 첨가되는 다른 단백질을 함유할 수 있다. TNFR은 은 염색에 의해 폴리아크릴아미드 겔 중에서 단일 단백질 밴드로서 검출되는 경우에 단리된다.
본 명세서에 사용된 “재조합”이라는 용어는 단백질이 재조합 (예, 미생물 또는 포유 동물) 발현계로부터 유도된 것을 의미한다. “미생물”이라는 용어는 세균 또는 진균 (예, 효모) 발현계에서 제조된 재조합 단백질을 의미한다. 산물로서, “재조합 미생물”이라는 용어는 실질적으로 천연 내생성 물질이 없는 미생물 발현계에서 제조된 단백질을 의미한다. 대부분의 세균 배양물, 예를 들면 이. 콜라이 중에서 발현된 단백질은 글리칸이 없다. 효모 중에서 발현된 단백질은 포유 동물 세포에서 발현된 것과는 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수도 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐 TNF 수용체의 특징으로서 사용된 “생물학적으로 활성인”이라는 용어는 특정 분자가 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시태양과 마찬가지로 검출가능한 양의 TNF와 결합하고, TNF 자극을, 예를 들면 혼성 수용체 작제물의 성분으로서 세포에 전달하거나, 또는 천연 (즉, 비재조합) 공급원으로부터의 TNFR에 대항하여 야기되는 안티-TNFR 항체와 교차 반응하기에 충분한 아미노산 서열을 공유함을 의미한다. 바람직하기로는, 본 발명의 범위에 속하는, 생물학적으로 활성인 TNF 수용체는 표준 결합 분석 (이하 참조) 결과 이 수용체 1 nmole 당 TNF 0.1 nmole 이상과 결합할 수 있고, 가장 바람직하게는 수용체 1 nmole 당 TNF 0.5 nmole 이상과 결합할 수 있다.
[가용성 TNF 길항제 및 동족체]
본 발명은 단리 및 정제된 TNF 길항제 폴리펩티드를 이용한다. 본 발명에 사용되는 단리 및 정제된 TNF 길항제 폴리펩티드는 실질적으로 천연 또는 내생성 기원의 다른 오염 물질이 없으며, 생산 공정 중에 잔류하는 단백질 오염물을 약 1 중량% 미만으로 함유한다. 본 발명에 사용되는 TNF 길항제 폴리펩티드는 임의로는 결합된 천연형 글리코실기가 없는 것이다.
본 발명의 바람직한 일면에 있어서, TNF 길항제는 가용성 인체 TNFRI 및 TNFRII로 이루어진 군으로부터 선택된다. 인체 TNFRI cDNA 클론 1을 함유하는 pCAV/NOT-TNFR 벡터를 가용성 인체 TNFRI을 발현시키고 정제시키는 데 사용하였다. pCAV/NOT-TNFR은 pCAV/NOR-TNFR이라는 명칭으로 미합중국 20852 매릴래드주 록크빌 파크론 드라이브 12301 소재 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션에 기타되었다 (수탁 번호 제68088호).
대부분의 포유 동물 유전자와 마찬가지로, 포유 동물 TNF 수용체도 멀티-엑손 유전자에 의해 코딩되는 것으로 추정된다. 전사 후 상이한 mRNA 스플라이싱이 일어날 수 있고, 본 명세서에 청구된 cDNA와 동일하거나 또는 유사한 영역을 많이 공유하는 다른 mRNA 구조물이 사용될 수도 있다.
다른 포유 동물의 TNFR cDNA는 종간 혼성화에 의해 특정 포유 동물의 cDNA 라이브러리를 선별하기 위한 프로브로서 적절한 인체 TNFR DNA 서열을 사용하여 단리시킬 수 있다. 본 발명에 사용된 포유 동물의 TNFR의 예로는 영장류, 인간, 쥐, 개, 고양이, 소, 양, 말 및 돼지 TNFR을 들 수 있다. 포유 동물의 TNFR은, 종간 혼성화에 의해 포유 동물의 cDNA 라이브러리로부터 TNFR cDNA를 단리시키기 위한 혼성화 프로브로서 인체 TNFR DNA 서열로부터 유도된 단일 스트랜드 cDNA를 사용하여 얻을 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 TNFR의 유도체는 생물학적 활성을 보유하는 1차 단백질의 여러 가지 구조적 형태를 포함할 수도 있다. 이온화 가능한 아미노기 및 카르복실기의 존재로 인해, TNFR 단백질은 산성 염 또는 염기성 염의 형태로 존재하거나, 또는 중성 형태로 존재할 수 있다. 개개의 아미노산 잔기는 산화 또는 환원에 의해 변형될 수도 있다.
1차 아미노산 구조는 다른 화학 잔기, 예를 들면 글로코실기, 지질, 포스페이트, 아세틸기 등과 공유 결합 또는 응집성 결합체를 형성하거나, 또는 아미노산 서열 돌연변이를 생성함으로써 변형될 수 있다. 공유 결합 유도체는 특정 관능기를 TNFR 아미노산 측쇄 또는 N- 또는 C-말단에 결합시킴으로써 제조할 수 있다. TNFR의 다른 유도체로는 N-말단 또는 C-말단 융합물과 같이 재조합 배양물 중에서 합성에 의해 얻어지는, 다른 단백질 또는 폴리펩티드와 TNFR 또는 그의 단편과의 공유 결합성 또는 응집성 결합체를 들 수 있다. 예를 들면, 결합된 펩티드는 단백질의 N-말단 영역에서 번역과 동시에 또는 번역후 그의 합성 부위로부터 세포막 또는 세포벽 내부 또는 외부의 기능 부위로 단백질을 전달하는 신호 (또는 리더) 폴리펩티드 서열 (예, 효모 α-인자 리더)일 수 있다. TNFR 단백질 융합물은 TNFR의 정제 또는 확인을 추진시키기 위해 첨가되는 펩티드 (예, poly-His)로 이루어질 수 있다. TNF 수용체의 아미노산 서열은 펩티드 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)에 결합될 수도 있다 (Hopp 등의 Bio/Technology 6:1204,1988 참조). 후자의 서열은 항원성이 크고, 특정 모노클로날 항체에 의해 가역적으로 결합되는 에피토프를 제공함으로써, 발현된 재조합 단백질의 신속한 분석 및 용이한 정제를 가능케 한다. 또한, 이러한 서열은 Asp-Lys 쌍 직후의 잔기에서 소 점막의 엔테로키나제에 의해 특이적으로 분해될 수도 있다. 이러한 펩티드로 캡핑(capping)된 융합 단백질은 이. 콜라이 중에서의 세포내 분해에 대해 내성일 수도 있다.
결합된 천연형 글리코실화 존재 또는 부재하의 TNFR이 사용될 수도 있다. 효모 또는 포유 동물 발현계, 예를 들면 COS-7 세포에서 발현되는 TNFR은 발현계에 따라 분자량 및 글리코실화 패턴에 있어서 천연 분자와 유사하거나 약간 상이할 수 있다. 이. 콜라이 등의 세균 중에서 TNFR DNA의 발현은 글리코실화되지 않은 분자를 제공한다. 비활성화 N-글리코실화 부위를 갖는 포유 동물 TNFR 기능성 돌연변이 동족체는 올리고뉴클레오티드 합성 및 연결 반응, 또는 부위-특이적 돌연 변이 유발 기술에 의해 제조할 수 있다. 이들 동족체 단백질은 효모 발현계를 사용하여 균질한 환원 탄수화물 형태로 양호한 수율로 제조할 수 있다. 진핵 생물 단백질의 N-글리코실화 부위는 아미노산 트리플렛 Asn-A1-Z (여기서, A1은 Pro를 제외한 임의의 아미노산이고, Z는 Ser 또는 Thr임)를 특징으로 한다. 이 서열에서, Asn은 탄수화물의 공유 결합을 위한 측쇄 아미노기를 제공한다. 이와 같은 부위는 Asn 또는 잔기 Z 대신에 다른 아미노산으로 치환시키거나, Asn 또는 Z를 결실시키거나, 또는 A1과 Z 사이에 비-Z 아미노산을 삽입하거나, 또는 Asn과 A1사이에 Asn 이외의 다른 아미노산을 삽입함으로써 제거할 수 있다.
TNFR 유도체는 TNFR 또는 그의 소단위체의 돌연변이화에 의해 얻을 수도 있다. 본 명세서에 언급된 TNFR 돌연변이체는 TNFR와 상동인 폴리펩티드이지만, 결실, 삽입 또는 치환에 의해 천연 TNFR과는 상이한 서열을 갖는다.
TNFR 단백질의 생물학적 등가 동족체는 예를 들면 생물학적 활성에 불필요한 잔기 또는 서열을 다양하게 치환시키거나 또는 말단 내부 잔기 또는 서열을 결실시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, 시스테인 잔기 (예, Cys178)를 결실시키거나 또는 다른 아미노산으로 치환시킴으로써 재생시 불필요하거나 또는 부정확한 분자내 디설파이드 브리지의 형성을 방지할 수 있다. 돌연 변이 유발을 위한 시도로는 KEX2 프로테아제 활성이 존재하는 효모계에서의 발현을 증진시키기 위해 인접하는 이염기성 아미노산 잔기의 변형을 들 수 있다. 일반적으로, 치환은 보존적으로 이루어지며, 즉, 가장 바람직한 치환 아미노산은 치환될 잔기의 특성과 유사한 물리화학적 특성을 갖는 것이다. 마찬가지로, 결실 또는 삽입 기술을 적용할 경우, 생물학적 활성에 대한 결실 또는 삽입의 잠재적 효과를 고려해야 한다. 가용성 TNFR을 구성하기 위하여 C-말단 절단부는 더 적은 수의 아미노산 서열을 함유할 것이지만, 상술한 바와 같이 실질적으로 유사한 폴리펩티드 서열은 일반적으로 동일한 수의 아미노산 서열로 이루어진다. TNFR의 생물학적 활성을 보존하기 위하여, 결실 및 치환이 상동성 또는 보존적으로 치환된 서열을 제공하는 것이 바람직하며, 이는 주어진 잔기가 생물학적으로 유사한 잔기에 의해 치환됨을 의미한다. 보존치환의 예로는 1개의 지방족 잔기가 다른 지방존 잔기로, 예를 들어 Ile, Val, Leu 또는 Ala 등 사이에서 상호 치환되거나, 또는 1개의 극성 잔기가 다른 극성 잔기로, 예를 들어 Lys와 Arg; Glu와 Asp; 또는 Gln과 Asn 사이 등에서 치환된 것을 들 수 있다. 다른 보존적 치환, 예를 들면 유사한 소수성을 갖는 전체 영역의 치환은 잘 알려져 있다. 또한, 인간, 쥐 및 다른 포유 동물 TNFR 사이의 특정 아미노산의 차이는 TNFR의 주요 생물학적 특성을 변경시키지 않고 추가의 보존 치환이 이루어질 수 있음을 제안한다.
TNFR의 소단위체는 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시킴으로써 작제할 수 있다. 특히 바람직한 서열로는 TNFR의 트랜스멤브레인 영역 및 세포내 도메인이 결실되거나 또는 친수성 잔기로 치환되어 수용체의 세포 배양 배지 증으로의 분비를 촉진시키는 것을 들 수 있다. 생성된 단백질은 TNF에 결합하는 능력을 보유하는 가용성 TNFR 분자로서 언급된다. 특히 바람직한 가용성 TNFR 구조는 TNFRI△235 (SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 1-235)이며, 이는 트랜스멤브레인 영역에 바로 인접한 Asp235로 종결되는, TNFRI의 전체 세포외 영역을 포함한다. 부가적인 아미노산은 TNF 결합 활성을 보유하면서 트랜스멤브레인 영역으로부터 결실될 수 있다. 예를 들면 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 1-183으로 이루어진 huTNFRI△183 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 1-163으로 이루어진 TNFRI△163은 TNF 리드간에 결합하는 능력을 보유한다. 그러나, TNFRI△142는 TNF 리드간에 결합하는 능력을 보유하고 있지 않다. 이는 Cys157및 Cys163중 하나 또는 이들 모두가 TNFRI의 적절한 폴딩을 위한 분자내 디설파이드 브리지를 형성하는데 필요함을 시사한다. Cys178은 가용성 TNFRI가 TNF에 결합하는 능력에 대해 임의의 명백한 부작용 없이 결실되므로, TNFRI의 적절한 폴딩에 필수적인 것으로는 보이지 않는다. 따라서, C 말단에서 Cys163까지의 임의의 결실은 가용성 TNFRI에 있어서 생물학적 활성을 초래할 것으로 기대된다. 본 발명은 Cys163이후의 임의의 아미노산으로 종결되는 TNFR의 세포외 영역의 전부 또는 일부에 상응하는 이러한 가용성 TNFR 구조를 사용할 것을 고려한다. TNFRI△157에서와 같은 다른 C-말단의 결실은 편의상 TNFR cDNA를 적절한 제한 효소로 절단하고, 필요할 경우 합성 올리고뉴클레오티드 링커를 사용하여 특정 서열을 재작제하는 것으로 이루어질 수 있다. N-말단이 결실된 가용성 TNFR이 본 발명에 사용될 수도 있다. 예를 들면, TNFRI의 N-말단은 TNFRI가 TNF 길항제로서 효과적으로 작용하는 능력에 크게 영향을 미치지 않는 Ley1, Pro2또는 Ala3으로 시작할 수 있다. 이어서, 생성된 가용성 TNFR 구조를 삽입하여 적절한 발현 벡터 중에서 발현시키고, TNF에 결합하는 능력에 대해 평가한다.
동족 TNFR을 발현시키기 위해 작제된 뉴클레오티드 서열에 있어서의 돌연변이는 코딩 서열의 판독 프레임 상을 보존해야 함은 물론, 혼성화되어 수용체 mRNA의 번역에 부작용을 미치는 루프 또는 헤어핀 등의 2차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보 영역을 생성하지 않는 것이 바람직하다. 돌연변이 부위는 미리 결정될 수 있지만, 돌연변이 자체의 특성이 미리 결정될 필요는 없다. 예를 들면, 주어진 부위에서 돌연변이체의 최적의 특성을 선택하기 위해, 표적 코돈에서 무작위 돌연변이 유발이 이루어질 수 있으며 발현된 TNFR 돌연변이체는 목적하는 활성에 대해 선별될 수 있다.
TNFR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 모든 돌연변이가 최종 산물 중에 발현되는 것은 아니며, 예를 들면 발현을 증진시키고, 주로 전사된 mRNA 중의 2차 구조 루프 (본 명세서에 선행 기술 문헌으로 포함된 유럽 특허 공개 제75,444호 참조)를 피하거나, 또는 코돈, 예를 들면 이. 콜라이 발현을 위한 공지된 이. 콜라이 선호 코돈이 선택된 숙주에 의해 보다 용이하게 번역되게 하기 위해 뉴클레오티드 치환이 이루어질 수 있다.
돌연변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 특정 위치에 돌연변이를 도입하고, 제한 부위에 의해 플랭킹시켜 천연 서열의 단편에 연결시킬 수 있다. 연결 후, 생성되는 재구성된 서열은 목적하는 아미노산을 삽입, 치환 또는 결실한 동족체를 코딩한다.
별법으로, 올리고뉴클레오티드-지시 부위-특이적 돌연변이 유발 방법을 사용하여 요구되는 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 갖는 변경된 유전자를 제공할 수 있다. 상기 변경을 위한 방법의 예는 문헌[Walder 등의 Gene 42:133, 1986; Bauer 등의 Gene 37:73, 1985; Craik 등의 BioTechiniques, 1985년 1월, 12-19; Smith 등의 Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981 및 적합한 기술을 기재하고 있는 미합중국 특허 제4,518,584호 및 동 제4,737,462호]에 기재되어 있으며, 본 명세서에 선행 기술 문헌으로 포함한다.
TNFR의 1가 형태 및 다가 형태 모두가 본 발명에 사용될 수도 있다. 다가 형태는 TNF 리간드에 대해 복수의 TNFR 결합 부위를 갖는다. 예를 들면, 2가 가용성 TNFR은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 1-235의 2개의 직렬식 반복 단위로 이루어지며, 링커 영역에 의해 분리된다. 별개의 다가 형태는 예를 들면 TNFR을 피콜, 폴리에틸렌 글리콜 또는 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 임상학적으로 허용되는 담체 분자, 중합체에 통상적인 커플링 기술을 사용하여 화학 결합시킴으로써 구성할 수 있다. 별법으로, TNFR은 비오틴에 화학 결합될 수 있고, 이어서, 비오틴-TNFR 결합체가 아비딘에 결합되어 4가 아비딘/비오틴/TNFR 분자를 생성한다. TNFR은 또한 디니트로페놀 (DNP) 또는 트리니트로페놀 (TNP)에 공유 결합될 수도 있고, 생성되는 결합체는 안티-DNP 또는 안티-TNP-IgM을 사용하여 침전시켜 결합 부위에 대해 10가를 갖는 십량체 결합체를 형성한다.
이뮤노글로불린 분자 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나 또는 이들 모두의 가변 도메인이 TNFR 서열로 치환되었으며 비변형된 일정 영역 도메인을 갖는 재조합 카메라 항체 분자를 제조할 수도 있다. 예를 들면, 카메라 TNFR/IgG1은 2개의 키메라 유전자, 즉 TNFR/인체 κ 경쇄 키메라 (TNFR/Cκ) 및 TNFR/인체 γ1중쇄 키메라 (TNFR/C γ-1)로부터 제조할 수 있다. 2개의 키메라 유전자의 전사 및 번역 후, 유전사 산물은 2가를 나타내는 TNFR을 갖는 단일 키메라 항체 분자로 조립된다. TNFR의 이러한 다가 형태는 TNF 리간드에 대한 결합능을 증진시킬 수 있다. TNFR/Fc 융합 단백질의 한가지 특정 예는 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4에 개시되어 있다. 이러한 키메라 항체 분자의 구조에 관한 더 상세한 설명은 국제 특허 출원 공개 제WO89/09622호 및 유럽 특허 제315062호에 개시되어 있다.
[재조합 TNFR의 발현]
재조합 발현 벡터는 TNFR을 코딩하는 DNA를 증폭 또는 발현시켜 정제된 TNFR을 얻는데 사용하는 것이 바람직하다. 재조합 발현 벡터는 포유 동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래하는 적절한 전사 또는 번역 조절요소에 작동 가능하게 결합된 포유 동물 TNFR 또는 생물학적 등가 동족체를 코딩하는 합성 또는 cDNA-유도 DNA 단편을 갖는 복제 가능한 DNA 구조이다. 전사 단위는 일반적으로, 이하 상세히 기재될 (1) 유전자 발현에 있어서 조절 역할, 예를 들면 전사 프로모터 또는 인핸서 역할을 하는 유전자 요소(들), (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 어셈블리로 이루어져 있다. 이러한 조절 요소는 전사를 조절하기 위한 오퍼레이터 서열, 적절한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 숙주에 있어서의 복제능은 일반적으로 복제원에 의해 주어지며, 형질 전환체의 인식을 촉진시키기 위한 선택 유전자가 추가로 혼입될 수 있다. DNA 영역을 이들이 상호 기능적으로 연결되어 있을 때 작동 가능하게 연결된다. 예를 들면, 신호 펩티드 (분비 리더)를 위한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현되는 경우에 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동 가능하게 연결되고, 프로모터는 서열의 전사를 조절하는 경우에 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되거나 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 허용하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 결합된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된다는 것은 연속적인 것을 의미하며, 분비 리더의 경우에, 연속적이고 또한 번역 프레임 내인 것을 의미한다. 효모 발현계에 사용하기 위한 구조요소는 숙주 세포에 의해 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 별법으로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열의 부재하에 발현되는 경우, N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 임의로 발현된 재조합 단백질로부터 차후에 분리되어 최종 산물을 제공할 수 있다.
미생물 중에 발현되어야 하는 포유 동물의 TNF 수용체를 코딩하는 DNA 서열은 DNA의 mRNA로의 전사를 조기에 종결시킬 수 있는 인트론을 함유하지 않는 것이 바람직하지만, 전사의 조기 종결은 예를 들면 유리한 C-말단 절단부를 갖는 돌연변이체를 유발할 수 있는 경우, 예를 들면 트랜스멤브레인 영역이 결실되어 세포 막에 결합되지 않은 가용성 수용체를 생성하는 것이 바람직할 것이다. 코드 축퇴로 인한, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 있어서의 변형을 고려할 수 있다. 다른 실시태양은 약간 엄격한 조건 (50℃, 2 x SSC)하에 제공된 cDNA의 서열에 혼성화될 수 있는 서열 및 혼성화되거나 생물학적으로 활성인 TNF 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 것에 대해 축퇴된 다른 서열을 포함한다.
재조합 TNFR DNA는 적절한 숙주 미생물, 예를 들면 이. 콜라이 등의 세균 또는 맥주 호모균(S. cerevisiae) 등의 효모의 실질적으로 균질한 단일 배양물로 이루어진 재조합 발현계에서 발현 또는 증폭되며, 형질 전환 또는 형질 감염에 의해 염색체 DNA에 안정하게 통합된 재조합 전사 단위를 갖거나, 상존성 플라스미드의 성분으로서 재조합 전사 단위를 보유할 수 있다. 일반적으로, 시스템을 구성하는 세포는 단일 모세포의 형질 전환 세포의 자손이다. 본 명세서에 정의된 바의 재조합 발현계는 발현될 DNA 서열 또는 합성 유전자에 결합된 조절 요소가 유도됨에 따라 이종 단백질을 발현시킬 것이다.
형질 전환된 숙주 세포는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제된 TNFR 벡터로 형질 전환 또는 형질 감염된 세포이다. 형질 전환된 숙주 세포는 통상적으로 TNFR을 발현시키지만, TNFR DNA를 클로닝 또는 증폭시키기 위하여 형질 전환된 숙주 세포는 TNFR을 발현시킬 필요가 없다. 발현된 TNFR은 선택된 TNFR DNA에 따라, 세포막 내에 침착되거나 또는 배양 상등액으로 분비될 것이다. 포유 동물의 TNFR을 발현시키는 데 적절한 숙주 세포로는 적절한 프로모터 조절하의 원핵 생물, 효모 또는 고등 진핵 생물 세포를 들 수 있다. 원핵 생물 세포로는 그램 음성 또는 그램 양성 유기체, 예를 들면, 이. 콜라이 바실러스를 들 수 있다. 고등 진핵 세포로는 후술하는 바와 같은 포유 동물 기원의 확립된 세포주를 들 수 있다. 세포 미함유 번역계도 본 발명의 DNA 구조로 부터 유도된 RNA를 사용하여 포유 동물의 TNFR을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 세균, 진균, 효모 및 포유 동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 포우웰 (Pouwels) 등의 문헌 [Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985]에 기재되어 있으며, 본 명세서에 선행 기술 문헌으로 포함한다.
원핵 세포 발현 숙주는 광범위한 원핵 세포 및 디설파이드 처리를 요하지 않는 TNFR을 발현시키는 데 사용할 수 있다. 원핵 세포 발현 벡터는 일반적으로 1종 이상의 표현형 선택 마커, 예를 들면 항체 내성을 비교하거나 독립 영양 요건을 공급하는 단백질을 코딩하는 유전자, 및 숙주 내에서 증폭되는 것을 보증하는 숙주에 의해 인식되는 복제원으로 이루어진다. 다른 물질을 선택물질로서 사용할 수도 있지만, 형질 전환을 위한 적절한 원핵 세포 숙주로는 이. 콜라이, 고초균 (Bacillus subtilis), 쥐 티푸스군 (Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스속, 스트렙토마이세스속 및 포도상구균속에 속하는 여러 가지 종을 들 수 있다.
세균용으로 유용한 발현 벡터는 선택성 마커 및 공지된 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 유전 성분으로 이루어진 시판 플라스미드로부터 유도되는 세균성 복제원으로 이루어질 수 있다. 이러한 시판 벡터의 예로는 pKK223-3 (스웨덴 웁살라 소재 Pharmacia Fine Chemicals) 및 pGEM1 (미합중국 위스콘신주 매디슨 Promega Biotec)을 들 수 있다. 이들 pBR322 “골격” 부위를 적절한 프로모터 및 발현하고자 하는 구조 서열과 조합한다. 이. 콜라이는 전형적으로 pBR322의 유도체를 사용하여 형질 전환시키며, 플라스미드는 이. 콜라이 종 (Bolivar 등 Gene 2:95, 1977)으로부터 유도된다. pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 함유함으로써 형질 전환된 세포를 확인하기 위한 단순한 수단을 제공하다.
재조합 미생물 발현 벡터에 통상적으로 사용되는 프로모터의 예로는 β-락타마제 (페니실리나제) 및 락토스 프로모터계 (Chang 등의 Nature 275:615, 1978; 및 Goeddel 등의 Nature 281:544, 1979), 트립토판 (trp) 프로모터계 (Goeddel 등의 Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; 및 EPA 36,776) 및 tac 프로모터 (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 제412페이지, 1982)를 들 수 있다. 특히 유용한 세균 발현계는 파지 λPL프로모터 및 cI857 열감수성 리프레서를 사용하다. λPL프로모터의 유도체를 혼입시킨, 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션으로부터 입수 가능한 플라스미드 벡터로는 플라스미드 pHUB2 [이. 콜라이 균주 JMB9 (ATCC 37092)에 존재] 및 pPLc28 [이. 콜라이 RR1 (ATCC 53082)에 존재]을 들 수 있다.
재조합 TNFR 단백질은 또한 효모 숙주, 바람직하게는 맥주 효모균 (S. cerevisiae) 등의 효모균속 (Saccharomyces species)에서 발현될 수도 있다. 피치아 (Pichia) 또는 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 등의 다른 효모도 사용할 수 있다. 효모 벡터는 일반적으로 2μ 효모 플라스미드로부터의 복제원 또는 독자적 복제 서열 (ARS), 프로모터, TNFR을 코딩하는 DNA, 폴리아데닐화 및 전사 종료를 위한 서열 및 선택 유전자를 포함할 것이다. 바람직하기로는, 효모 벡터는 복제원 및 효모와 이. 콜라이 모두의 형질 전환을 허용하는 선택 마커, 예를 들면 이. 콜라이 및 맥주 효모균의 암피실린 내성 유전자 TRP1 또는 URA3 유전자를 포함하며, 트립토판 중에서의 성장능이 결여된 효모의 돌연 변이 균주를 위한 선택 마커, 및 고도로 발현된 효모 유전자로부터 유도되어 구조 서열 하류의 전사를 유도하는 프로모터로 이루어진다. 효모 숙주 세로 게놈에서 TRP1 또는 URA3 병변의 존재는 이어서 트립토판 또는 우라실 부재하에 성장함으로써 형질 전환을 검출하는데 효과적인 환경을 제공한다.
효모 벡터 중의 적절한 프로모터 서열은 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제 (Hitzeman 등의 J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) 또는 기타 글리콜성 효소 (Hess 등의 J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968: 및 Holland 등의 Biochem. 17:4900, 1978), 예를 들면 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제를 위한 프로모터를 포함한다. 효모 발현에 사용하기 위한 적절한 벡터 및 프로모터는 히쯔만 (R. Hitzeman) 등의 유럽 특허 공개 제73,657호에 더 상세히 기재되어 있다.
바람직한 효모 벡터는 이. 콜라이에서의 선택 및 복제를 위한 pUC18로부터 얻어지는 DNA 서열 (Ampr유전자 및 복제원) 및 글루코스-억제성 ADH2 프로모터 및 α-인자 분비 리더를 포함하는 DNA 서열을 사용하여 조립할 수 있다. ADH2 프로모터는 루셀 (Russell) 등의 문헌 [J. Biol. Chem. 248:2674, 1982] 및 베이어(Beier) 등의 문헌 [Nature 300:742, 1982]에 기재되어 있다. 이종 단백질의 분비를 유도하는 효모 α-인자 리더는 프로모터와 발현하고자 하는 구조 유전자 사이에 삽입할 수 있다 [Kurjan 등의 Cell 30:933, 1982; 및 Bitter 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984 참조]. 리더 서열은 그의 3' 말단 근처에 1 이상의 유용한 제한 부위를 함유하도록 변형되어 리더 서열과 이물질 유전자의 융합을 촉진시킬 수 있다.
적절한 효모 형질 전환 프로토콜은 당업자들에게 알려져 있으며, 그러한 기술의 예는 힌넨 (Hinnen) 등의 문헌 [Procl. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978]에 기재되어 있으며, 0.67% 효모 질소염기, 0.5% 카스아미노산, 2% 글루코스, 10㎍/ml 아데닌 및 20㎍/ml 우라실을 함유하는 선택 배지 중에서 Trp+ 형질전환체를 선택하거나, 또는 0.67% YNB와 Sherman 등의 문헌 [Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 뉴욕 1986]에 기재된 바의 아미노산 및 염기를 함유하는 배지 중에서 URA+ 형질전환체를 선택한다.
ADH2 프로모터로 이루어진 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 균주는 1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 및 1% 또는 4% 글루코스로 이루어지고 80㎍/ml 아데닌 및 80㎍/ml 우라실을 보충시킨 부유 배지에서 성장시켜 발현시킬 수 있다. ADH2 프로머터의 억제 해제는 배지의 글루코스가 고갈될 때 발생한다. 조 효모 상등액을 여과시켜 수집하고 4℃에서 유지시킨 후 추가로 정제시킨다.
각종 포유 동물 또는 곤충 세포 배양계는 또한 재조합 단백질을 발현시키는 데 유리하게 사용될 수 있다. 포유 동물 세포에서의 재조합 단백질의 발현이 특히 바람직하며, 그 이유는 이러한 단백질이 일반적으로 정확하게 폴딩되고, 적절히 변형되고 완전히 기능화되기 때문이다. 적절한 포유 동물 숙주 세포주의 예로는 문헌 [Gluzman의 Cell 23:175, 1981]에 기재된 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주, 및 적절한 벡터를 발현시킬 수 있는 기타 세포주, 예를 들면 L 세포, C127, 3T3, 중국산 햄스터의 난소 (CHO) 세포주, HeLa 및 BHK 세포주를 들 수 있다. 포유 동물 발현 벡터는 복제원, 적절한 프로모터 및 발현될 유전자에 결합된 인핸서와 같은 미전사 성분, 및 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위와 같은 기타 5' 또는 3' 플랭킹 비전사 서열 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 및 전사 말단 서열로 이루어질 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질을 생산하기 위한 배큘로바이러스계는 문헌[Luckow 및 Summers의 Bio/Technology 6:47 (1988)]에 기재되어 있다.
척추 동물 세포를 형질 전환시키는 데 사용되는 발현 벡터에 있어서의 전사 및 번역 조절 서열은 바이러스 제공원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 통상적으로 사용되는 프로모터 및 인핸서는 폴리오마 (Polyoma), 아데노바이러스 (Adenovirus) 2, 시미안 바이러스 (Simian Virus) 40 (SV40) 및 인체 사이토메갈로바이러스로부터 유도된다. SV40 바이러스 게놈, 예를 들면 SV40 기원, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이드 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열을 이종 DNA 서열을 발현시키는 데 요구되는 다른 유전자 요소를 제공하기 위해 사용할 수 있다. 초기 및 후기 프로모터는 모두 SV40 바이러스 복제원을 함유하기도 하는 단편으로서 바이러스로부터 용이하게 얻을 수 있기 때문에 특히 유용하다 [Fiers 등의 Nature 273:113, 1978 참조]. 바이러스 복제원에 위치하는 Bg/ℓ 부위쪽으로 Hind 3 부위로부터 신장하는 약 250 bp의 서열이 포함된다면, 좀 더 작거나 또는 좀 더 큰 SV40 단편을 사용할 수도 있다. 또한, 조절 서열이 선택된 숙주 세포와 양립한다면, 포유 동물 게놈의 TNFR 프로모터, 조절 및(또는) 신호 서열을 사용할 수 있다. 재조합 포유 동물의 TNFR 수용체를 생산하기 위해 포유 동물의 고등 발현 벡터를 사용하는 것에 대한 더 상세한 설명은 하기 실시예 2 및 7에 제공된다. 작제될 수 있는 벡터의 예는 문헌 [Okayama 및 Berg의 Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983]에 기재되어 있다.
C127 쥐의 유방 상피 세포 중 포유 동물 수용체 cDNA의 안정한 고등 수준의 발현을 위한 유용한 계는 실질적으로 문헌 [Cosman 등의 Mol. Immunol. 23:395, 1986]에 기재된 바와 같이 작제될 수 있다.
TNFR cDNA로 이루어진 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 DNA에 안정하게 통합된다. 상승된 수준의 발현 산물은 증폭된 수의 벡터 DNA를 갖는 세포주를 선택함으로써 성취된다. 예를 들면 숙주 세포를 공지된 약물에 의해 억제되는 효소를 코딩하는 DNA 서열로 이루어진 벡터를 사용하여 형질 전환시킴으로써 증폭된 수의 벡터 DNA를 갖는 세포주가 선택된다. 또한, 이 벡터는 목적하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이루어질 수도 있다. 별법으로, 숙주 세포는 목적하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어진 제2 벡터로 동시 형질 전환될 수 있다. 이어서, 형질 전환 또는 동시 형질 전환된 숙주 세포를 증가된 농도의 공지된 약물 중에서 배양시킴으로써 약물 내성 세포를 선택한다. 이러한 약물 내성 세포는 과다 생산된 효소가 약물에 의해 억제되어, 결과적으로 효소를 코딩하는 유전자가 종종 증폭됨으로써 증가된 농도의 독성 약물 중에서 생존한다. 약물 내성이 억제가능한 효소를 코딩하는 벡터 DNA의 복사 횟수가 증가됨으로써 유발되는 경우, 숙주 세포 DNA에서 목적하는 단백질 (TNFR)을 코딩하는 벡터 DNA의 동시 증폭이 수반된다.
이러한 동시 증폭을 위한 바람직한 계는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자를 사용하며, 약물 메토트렉세이트 (MTX)에 의해 억제될 수 있다. 동시 증폭을 달성하기 위해, DHFR을 코딩하는 활성 유전자가 결여된 숙주 세포는 DHFR 및 목적하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어진 벡터를 사용하여 형질 전환시키거나, 또는 DHFR을 코딩하는 DNA 서열로 이루어진 벡터 및 목적하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어진 벡터를 사용하여 동시 형질 전환시킨다. 형질 전환 또는 동시 형질 전환된 숙주 세포를 증가된 농도의 MTX를 함유하는 배지 중에서 배양하고, 생존하는 세포주를 선택한다.
특히 바람직한 동시 증폭계는 글루타민 합성 효소 (GS) 유전자를 사용하며, ATP에서 ADP로의 가수분해 및 반응을 개시하기 위해 포스페이트를 사용하는 글루타민 및 암모니아의 합성에 감응한다. GS는 각종 억제제, 예를 들면 메티오닌 술폭시민 (MSX)에 의해 억제된다. 따라서, TNFR은 GS 및 목적하는 단백질의 DNA 서열로 이루어진 벡터로 형질 전환시키거나, 또는 GS를 코딩하는 DNA 서열로 이루어진 벡터 및 목적하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어진 벡터로 동시 형질 전환된 세포를 동시 증폭시키고, 증가된 농도의 MSX를 함유하는 배지 중에서 숙주 세포를 배양시키고, 생존하는 세포를 선택함으로써 고농도로 발현될 수 있다. GS 동시 증폭계, 적절한 재조하 발현 벡터 및 세포주는 다음과 같은 국제 특허 출원 공개 제WO87/04462호, 동 제WO89/01036호, 동 제WO89/10404호 및 동 제WO86/05807호에 기재되어 있다.
재조합 단백질은 포유 동물 숙주 세포, 예를 들면 중국산 햄스터의 난소 (CHO) 세포, 또는 별법으로 쥐의 골수종 세포주, 예를 들면 SP2/0-Ag14 또는 NSO 또는 래트의 골수종 세포주, 예를 들면 YB2/3.0-Ag20 중에서 DHFR 또는 GS를 동시에 증폭시킴으로써 발현시키는 것이 바람직하며, 이는 국제 특허 출원 공개 제WO89/10404호 및 동 제WO89/05807호에 기재되어 있다.
TNFR DNA를 발현시키기 위한 바람직한 진핵 세포 벡터를 하기 실시예 1에 기재한다. pCAV/NOT와 관련한 이러한 벡터는 포유 동물의 고등 발현 벡터 pDC201로부터 유발되었으며, SV40, 아데노바이러스-2 및 인체 사이토메갈로바이러스로부터 얻은 조절 서열을 함유한다.
[재조합 TNFR의 정제]
정제된 포유 동물의 TNF 수용체 또는 동족체는 적절한 숙주/벡터계를 배양시켜 본 발명의 DNA의 재조합 번역 산물을 발현시킨 후, 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제시켜 제조한다.
예를 들면, 재조합 단백질을 배양 배지로 분비하는 계로부터의 상등액을 먼저 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들면 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킬 수 있다. 농축 단계 후, 농축액을 적절한 정제 매트릭스에 도포할 수 있다. 예를 들면, 적절한 친화성 매트릭스는 TNF 또는 렉틴 또는 적절한 지지체에 결합된 항체 분자로 이루어질 수 있다. 이와 달리, 음이온 교환 수지는 예를 들면 매트릭스 또는 펜던트 디에틸아미노에틸 (DEAE)기를 갖는 기질을 사용할 수 있다. 이 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스 또는 단백질 정제에 흔히 이용되는 기타 다른 종류일 수 있다. 별법으로, 양이온 교환단계를 사용할 수 있다. 적절한 양이온 교환체는 술로프로필 또는 카르복시메틸기로 이루어진 각종 불용성 매트릭스를 포함한다. 술포프로필기가 바람직하다.
마지막으로, TNFR 조성물을 더 정제하기 위해, 소수성 RP-HPLC 매질 (예, 펜던트 메틸 또는 기타 지방족기를 갖는 실리카겔)을 사용하는 1회 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 단계를 사용할 수 있다. 상기 정제 단계의 일부 또는 전부를 다양하게 조합하여 균질한 재조합 단백질을 제공하는데 사용될 수 있다.
세균 배양물에서 생산된 재조합 단백질은 통상적으로 세포 펠릿으로부터의 초기 추출, 이어서 1회 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리시킨다. 마지막으로, 최종 정제 단계를 위해 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용할 수 있다. 재조합 포유 동물의 TNFR의 발현에 사용된 미생물 세포는 냉동 해동 사이클, 초음파 처리, 기계적 파열 또는 세포 용해제의 이용을 포함한 임의의 통상적인 방법에 의해 파열될 수 있다.
분비된 단백질로서 포유 동물의 TNFR을 발현시키는 효모의 발효는 정제를 매우 단순화시킨다. 대규모 발효로 얻어지는 분비된 재조합 단백질을 문헌 [Urdal 등의 J. Chromatog. 296:171, 1984]에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 정제시킬 수 있다. 이 문헌에는 정제 HPLC 컬럼 상에서 재조합 인체 GM-CSF를 정제시키기 위한 2가지 순차적 영상 HPLC 단계가 기재되어 있다.
재조합 배양물 중에서 합성된 인체 TNFR은 단백질을 포함한 비인체 세포 성분이 배양물로부터 인체 TNFR을 회수하기 위해 행해지는 정제 단계에서 의존하는 특정의 양으로 존재함을 특징으로 한다. 이들 성분은 통상적으로 효모, 원핵 생물 또는 비인체 고등 진핵 생물 기원일 수 있으며, 바람직하게는 무해성 오염 물질 중에 약 1 중량% 미만의 양으로 존재한다. 또한, 재조합 세포 배양물은 그의 종의 기원, 예를 들면, 세포, 세포 분비액 또는 체액 중에서 천연적으로 발견되는 그대로의 TNFR과 정상적으로 결합되는 TNFR이 없는 단백질의 생산을 가능케 한다.
[재조합 가용성 TNFR의 치료적 투여]
본 발명은 유효량의 TNF 길항제, 예를 들면 TNFR 및 적절한 희석제 및 담체를 투여하는 것으로 이루어진, 인체에서의 TNF-의존성 염증 억제 방법을 제공한다.
치료용으로 정제된 가용성 TNFR 단백질을 관절염을 치료하기 위해 환자, 바람직하게는 인간에게 투여한다. 따라서, 예를 들면 가용성 TNFR 단백질 조성물은 관절내, 복막내 또는 피하 경로로 거환 주입, 연속 주입, 삽입물로부터의 지속적인 방출, 또는 기타 적절한 기술에 의해 투여될 수 있다. 통상적으로, 가용성 TNFR 치료제는 정제된 단백질과 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제로 이루어지는 조성물 형태로 투여될 것이다. 이러한 담체는 사용된 투여량 및 농도에서 환자에게 무독성일 것이다. 보편적으로, 이러한 조성물의 제조에는 TNFR을 완충제, 아스코르브산과 같은 산화방지제, 저분자량 (약 10개 미만의 잔기를 가짐) 폴리펩티드, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 예를 들면 글루코스, 수크로스 또는 덱스크린, EDTA 등의 킬레이트제, 글루타티온 및 기타 안정화제 및 부형제와 혼합하는 것이 수반된다. 중성 완충 염수 또는 동종 혈청 알부민과 혼합한 염수는 적당한 희석제의 예이다. 바람직하게는, 산물을 희석제로서 적절한 부형제 용액, 예컨대 수크로스를 사용하여 동결 건조물로서 제조한다. 적절한 투여량은 수회의 시도를 거쳐 결정될 수 있다. 적절한 공업 표준에 따르면, 벤질 알코올과 같은 방부제를 첨가할 수도 있다. 물론, 투여량 및 그 횟수는 치료되는 징후의 성질 및 심도, 목적하는 감응도, 환자의 상태 등과 같은 인자에 따라 좌우될 것이다.
TNF 길항제 단백질은 포유 동물, 바람직하게는 인간에게 관절염과 같은 TNF 의존성 염증성 질환을 치료할 목적으로 투여된다. 예컨대, TNFRI 단백질은 TNF 의존성 관절염 반응을 억제시킨다. TNF 생성에 중요한 작용을 하는 IL-1 및 IL-2로 인하여, TNF 관련 임상 징후들의 치료에는 TNFR을 IL-1R 및(또는) IL-2R과 함께 사용한 병행 투여 요법이 바람직할 수 있다. 인체 치료에는 가용성 인체 TNFR이 바람직하다. 본 발명에서는 관절염과 같은 TNF 의존성 염증성 질환을 치료하기 위하여 타입 I IL-1R 또는 타입 II IL-1R 중 어느 하나를 사용하거나, 또는 이들을 병용할 수 있다. 다른 유형의 TNF 결합 단백질이 유사한 방법으로 사용될 수도 있다.
관절염의 치료를 위해, TNFR은 1주 당 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg양으로 전신 투여된다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, TNFR은 1주 당 약 0.5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 양으로 투여된다. 관절내 국소 투여를 위한 투여량은 1회 주사시 약 0.01 mg/kg 내지 약 1.0 mg/kg이 바람직하다.
하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위하여 제공되며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
[실시예]
[실시예 1]
[가용성 인체 TNFRI의 발현 및 정제]
인체 TNF 수용체의 80 kD 형에 대한 cDNA의 클로닝에 대해서는 문헌[스미드(Smigh) 등의 Science 248:1019, 1990]에 상술되어 있다. TNFR cDNA 클론 1을 함유하는 발현 벡터 pCAB/NOT-TNFR(ATCC 68088)을 사용하여 다음과 같이 가용성 인체 TNFRI을 제조 및 발현시켰다.
가용성 인체 TNFRI△235(SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 -22-235를 갖는 1차 번역 산물)를 코딩하는 cDNA는 pCAV/NOT-TNFR의 840 bp 단편을 제한 효소 Not1 및 Pvu2로 절단하여 작제하였다. Not1은 pCAV/NOT-TNFR을 복수개의 클로닝 부위로 절단하고, Pvu2는 TNFR 코딩 영역내에서 트랜스멤브레인 영역 5'의 20개의 뉴클레오티드를 절단한다. TNFR 서열의 3' 말단을 제작제하기 위하여, 2개의 올리고뉴클레오티드를 합성 및 어니일링(annealing)하여 SEQ ID NO:1의 아미노산 229-235에 상응하는 아미노산을 코딩하는 다음의 올리고뉴클레오티드 링커를 생성하였다.
이 올리고뉴클레오티드 링커는 말단 Pvu2 및 Bg12 제한 부위를 가지며, TNFR의 20개의 뉴클레오티드에 이어 종결 코돈(밑줄 그은 부분) 및 BamH1 제한 부위(Not1/BamH1 소화에 의하여 전체 가용성 TNFR을 단리시키는데 편리하게 사용됨)를 재생시킨다. 이어서, 이 올리고뉴클레오티드는 Bg12/Not1에 의해 절단된 pCAV/NOT 내로 840 bp Not1/Puv2 TNFR 삽입물과 함께 연결되어 psolhuTNFR△235/CAVNOT를 생성하고, 이것은 상기한 바와 같이 COS-7 세포속으로 형질감염되었다. 숙주 세포는 TNF를 결합시킬 수 있는 아미노산 서열 1-235를 갖는 성숙된 가용성 인체 TNFRI 단백질을 발현시켰다.
[실시예 2]
[가용성 인체 TNFR/Fc 융합 단백질의 작제 및 발현]
재조합 가용성 인체 TNFR:Fc 발현 벡터의 작제를 나타내는 개략도가 제1도에 도시되어 있다. rhu TNFR:Fc 융합 유전자는 다음의 단편들을 시판되고 있는 클로닝 벡터(Stratagene사 제품) 블루스크립트(Bluescript) 내부로 연결시켜 생성하였다.
1) 절단된 TNFR을 코딩하는 cDNA를 함유하는 pCAV/NOT-TNFR(ACTT 68088)의 867 bp Asp 718-Pvu2 단편.
2) 인체 IgGl의 Fc 부분이 232개의 아미노산을 코딩하는 플라스미드 pIXY498의 700 bp Styl-Spel 단편. 플라스미드 pIXY498은 인체 IgGl의 Fc 단편을 함유하는 효모 발현 벡터이다(제2도 참조).
3) 절단된 TNFR을 인체 IgGl Fc 단편과 융합시키기 위한 올리고뉴클레오티드 링커. 이 링커는 절단된 TNFR 수용체의 3' 말단 및 인체 IgGl의 5' 말단을 코딩하고, CCCCAGCTGAAGGGAGCACTGGCGACGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTC (SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 833-883) 서열을 갖는 한 프라이머와, 인체 IgGl의 뉴클레오티드 257-237을 코딩하는 안티센스 CGGTACGTGCTGTTGTTACTGC (SEQ ID NO:5)의 서열을 갖는 다른 프라이머 2개를 사용하여 PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 증폭법으로 생성시켰다. 이 반응을 위한 주형은 pIXY498이었다. 이 반응 산물을 Pvu2와 Styl로 소화시키고, 115 bp 단편을 단리시켰다.
이어서, 이 작제물을 Not1로 소화시키고, rhu TNFR:Fc 융합 DNA 서열을 함유하는 생성된 1.4 킬로베이스 단편을 플라스미드 CAV/NOT/DHFR의 Not1 부위내로 연결시켰다. 플라스미드 pCAV/NOT/DHFR은 pCAV/NOT의 Hpal 부위 내로 햄스터(hamster) 디히드로플레이트 리덕타제 DNA 서열(DHFR)을 삽입함으로써 플라스미드 pCAV/NOT로부터 유도하였다(제2도). 이 작제물을 플라스미드 pCAVDHF RhuTNFRcF라 명명하였다. 전체 코딩 영역 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하고, 이를 제2도에 도시하였다.
숙주 균주를 제조하기 위하여, 미합중국 콜롬비아 대학의 로렌 체이신(Hawren Chasin) 박사로부터 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)의 발현이 결핍된 DXB-11 CHO 세포를 얻었다. 이들 세포를 함유하는 100개의 바이알 뱅크를 만들고, 이들 중 대표적인 바이알을 다음 과정에 따른 조사를 위해 미합중국 미생물협회에 보냈다.
이 목적을 위해 설치한 별도 실험실에서 모든 형질감염 및 증폭 단계를 수행하였다. 미코플라스마가 없는 세포주만이 이 단계가 용이하게 가능하였다.
형질감염은 pCAVDHFRhuTNFRc 플라스미드 DNA를 지브코 비알엘(Gibco BRL) 사의 리포펙틴(LipofectinTM) 시약과 혼합함으로써 수행하였다. 약 10g 이상의 DNA를 CHO DXB-11 세포를 함유하는 10cm 크기의 페트리 접시에 첨가시켰다. 최초 형질감염 후에, 세포를 글리신, 하이포크산틴 및 티미딘이 결핍된 선택적 배지에서 계대배양(subculture)시킴으로써 DHFR의 발현을 위해 선택하였다. 이어서, 얻어진 콜로니를 24웰 플레이트로 옮기고, rhu TNFR:Fc 발현에 대해 분석하였다. 최고 발현 배양물은 농도를 증가시킨 메토트렉세이트(MTX)에 노출시켜 증폭시켰다. 25 nM MTX에서 성장할 수 있는 세포들은 96웰 플레이트 속에서의 희석을 제한시킴으로써 클로닝시켰다. 최고로 발현된 클론들을 현탁 배양물로 옮기고, 상기 조건하에서 클론 4-4FC102A5-3을 그의 고수준의 rhu TNFR:Fc 발현을 토대로 하여 최종적으로 선택하였다.
[실시예 3]
[CHO 세포 중의 가용성 TNF 수용체 단량체의 발현]
국제 특허 출원 공개 제WO87/04462호 및 동 제WO89/01036호에 기재된 바와 실질적으로 동일하게, 글루타민-합성효소(GS) 유전자 증폭제를 사용하여 중국산 햄스터의 난소(CHO) 세포에서 가용성 TNF 수용체를 발현시켰다. 간단히, CHO 세포를 TNFR 및 GS 모두를 위한 유전자 함유 발현 벡터로 형질 감염시켰다. CHO 세포를 형질감염된 DNA의 친화도를 기준으로 GS 유전자 발현에 대해 선택하여 저농도의 메티오닌 술폭시민(MSX)에 대한 내성을 부여하였다. 이러한 세포에서 GS 서열 증폭 결과는 농도를 상승시킨 MSX를 사용하여 선택된다. 이러한 방법으로, 인접 TNFR 서열 역시 증폭되며, TNFR 발현을 증강시킬 수 있다.
GS 발현계에 사용된 벡터는 psoℓTNFR/P6/PSVLGS로서, 다음과 같이 작제하였다. 먼저, 벡터 pSVLGS.1 [국제 특허 출원 공개 제WO87/04462호 및 동 제WO89/01036호에 기재되어 있고, 영국 버크셔 소재, 셀테크, 리미티드(Celltech, Ltd.)사로부터 입수함]을 BamH1 제한 효소로 절단하고, 송아지 장알칼리 포스파타제(CIAP)로 탈인산화시켜 벡터가 그 자체에 재연결되지 않게 하였다. 이어서, BamH1로 절단한 pSVLGS.1 단편을 pEE5hCMV (국제 특허 출원 공개 제WO89/01036호에 기재되어 있고, 역시 셀테크사로부터 입수함)의 2.4 Kb BamH1 내지 Bg12 단편에 연결시키고, 이를 Bg12, BamH1 및 Fsp1로 절단하여 2개의 단편이 유사 크기를 갖지 않도록 하여 p6/PSVLGS.1로 명명된 11.2kb 벡터를 얻었다. 이 pSVLGS.1은 SV40 후기 프로모터의 통제하에 있는 글루타민 합성효소 선택 마커 유전자를 함유하고 있다. pEE6hCMV의 BamH1 내지 Ba12 단편은 인체 사이토메갈로바이러스(hCMV) 주요 즉시 초기 프로모터, 폴리링커 및 SV40 초기 폴리아데닐화 신호를 함유하고 있다. 가용성 TNFR에 대한 코딩 서열은 발현 벡터 psolTNFR/CAVNOT (실시예 3의 위 방법에 따라 제조)로부터 얻은 Not1 내지 BamH1 단편을 절단하고, 클레노우(Klenow)를 사용하요 평활 말단으로 만들고, 이를 SmaI로 절단한 탈인산화 p6/PSVLGS.1과 연결시킴으로써 p6/PSVLGS.1에 첨가하고, 이로써 solTNFR 코딩 서열을 hCMV 프로모터의 통제하에 있게 하였다. 이에 따라, SV50/GS 및 hCMB/solTNFR 전사 단위가 반대 방향으로 전사된 단일 플라스미드 벡터가 생성되었다. 이 벡터를 psolTNFR/P6/PSVLGS로 명명하였다.
이 psolTNFR/P6/PSVLGS를 사용하여 다음과 같이 CHO-Kl 세포(미합중국 메릴랜드주 록크빌 소재 ATCC로부터 기탁 번호 CCL61로 입수가능함)을 형질 감염시켰다. CHO-Kl 세포 단층을 글루타민을 함유하지 않고 10% 투석 소 태아 혈청(Gibco:220-630 0AJ), 1 mM 소듐 피루베이트(시그마사 제품), MEM 비필수 아미노산(Gibco:320-1140AG), 500μM 아스파라긴 및 글루타메이트(시그마세 제품), 및 뉴클레오시드(30μM 아데노신, 구아노신, 시티딘 및 우리딘과 10μM 티미딘) (시그마사 제품)을 보충한 최소 필수 배지(MEM) 10X(Gibco:330-1581AJ)에서 완전히 밀집되지 않은 상태로 성장시켰다.
10cm 크기 페트리 접시 당 약 1 x 106세포를 문헌[Graham & van der Eb. Virology 52:456(1983)]에 기재된 바와 실질적으로 동일한 방법으로 표준 인산 칼륨 침전법에 의해 psolTNFR/P6/PSVLGS 10㎍으로 형질감염시켰다. 이 세포를 문헌[Frost & Williams. Virology 91:39(1978)]에 기재된 바와 실질적으로 동일한 방법으로 형질감염시킨지 약 4시간 후에 글리세롤 쇼크(혈청 무함유 배양 배지 중의 15% 글리세롤, 약 1.5분간)를 가하고, 이어서 혈청 무함유 배지로 세척하였다. 하루 경과후에, 형질감염된 세포를 25μM의 최종 농도로서 MSX를 함유하는 신선한 선택 배지에 주입하였다. MSX에 대해 내성을 갖는 생존 세포들의 콜로니를 3-4주 이내에 육안으로 관찰하였다. 생존 세포들의 콜로니를 24웰 플레이트로 이동시키고 선택 배지에서 밀집 상태로 성장시켰다. 이어서, 표준 결합 분석법을 사용하여 밀집 웰로부터 얻은 컨디셔닝된 배지를 가용성 TNFR 활성에 대해 분석하였다. 이 분석의 결과, 콜로니가 생물학적으로 활성인 가용성 TNFR을 발현시킨다는 사실이 드러났다.
GS 유전자 증폭에 대한 선택을 하기 위하여, 몇 개의 MSX 내성 세포주를 psolTNFR/P6/PSVLGS로 형질감염시키고, 각종 농도의 MSX 중에서 성장시켰다. 각 세포주에 대해, 약 1 x 106세포를 점진적으로 증가되는 농도, 즉 100μM, 250μM, 500μM 및 1mM의 MSX 중에 플레이팅시키고, 10-14일간 인큐베이션시켰다. 12일 경과후에, 고농도의 MSX에 대해 내성을 갖는 콜로니가 나타났다. 생존 세포들의 콜로니는 TNFR 활성에 대해 분석하였다. 이와 같이 높은 내성을 갖는 각 세포주들은 다수의 독립적 증폭 결과로부터 생기는 세포들을 함유한다. 이러한 세로주로부터 한가지 이상의 가장 큰 내성을 갖는 세포주를 단리시켰다. 이어서, 큰 생산율을 갖는 증폭된 세포들을 한계 희석 클로닝방법으로 클로닝시켰다. 형질감염체들의 대량 세포 배양물은 활성을 갖는 가용성 TNFR을 분비한다.
[실시예 4]
[래트의 항원 유도 관절염에 대한 가용성 TNFR의 효과]
완전 프로인트 보조제(Freund's adjuvant) 중 메틸화된 소 혈청 알부민(mBSA)으로 미리 면역화시킨 루이스 래트는 무릎 관절이 mBSA로 공격받을 때 항원 유도 관절염(AIA)으로 진행된다. rhu TNFR:Fc, TNFR 단량체, 쥐의 재조합 가용성 IL-1 수용체(rm IL-1R) 또는 TNFR 단량체와 rm IL-1R의 조합체는 래트의 항원 유도 관절염의 작용을 억제시키는데 효과적인 것으로 나타났다.
루이스 래트를 완전 프로인트 보조제 중 mBSA 0.5mg으로 후방 측부에 면역화시켰다. 21일 경과후에(제0일), 이 동물의 양 무릎 관절에 피로겐 무함유 염수 중의 mBSA 50㎍을 주사하였다. 당일 또는 후속 2일 (제0, 1 및 2일)에 6마리의 쥐로 이루어진 군의 양 무릎 관절에 다음 표 1에 나타낸 바와 같이 관절내로 주사하였다.
[표 1]
각 처치에 따른 제0-6일에 매일 무릎 관절의 폭을 측정하였다. TNFR 단량체는 실시예 2에 따른 CHO 세포에서 생성되었다. 이 실험에 사용된 rhu TNFR:Fc BHK(햄스터 신장) 세포에서 생성되었다. 이 물질은 CHO 세포에서 유도된 TNFR과 유사한 것이다.
제3도 및 제4도는 mBSA 공격시와 후속 이틀간의 공격시에 BHK로 유도한 rhu TNFR:Fc로 처리한 결과 희석액으로 처리한 대조군 래트와 비교하여 무릎 관절 팽창이 감소됨을 입증한다. 관절 팽창 및 염증의 감소는 BHK로 유도한 rhu TNFR:Fc 5 또는 10㎍, TNFR 단량체 5㎍, 또는 rmuIL-1R 1㎍으로 처리한 쥐에서 관찰되었다. 관절 팽창의 감소는 rmuIL-1R과 TNFR 단량체 처리를 병행했을 때 훨씬 더 두드러지게 나타났다.
제6일째에 팽창 정도를 확인하기 위하여 수집한 관절의 조직병리학적 조사를 수행하였다. 이로부터 무릎 관절을 평가하고 이들의 상태를 다음과 같이 점수를 매김으로써 조직병리학적 점수를 얻었다: 제1 등급, 최소, 영향 받은 면적 10% 이하; 제2 등급, 중간, 영향 받은 면적 10-50%; 제3 등급, 두드러짐, 영향 받은 면의 50% 이상 100% 미만; 제4 등급, 최대, 전체 면적이 심하게 영향 받음. 5가지의 무릎 관절 구조, 즉 관절낭, 관절틈, 활막, 관절 연골 및 성대하골을 포함한 각종 병변/변형체를 평가하였다. 이러한 각 구조적 변형체에 대해 1 내지 4의 점수를 매기고, 이 점수들을 더하여 평균치를 계산하였다. 조직병리학적 결과는 각 처리군에서 평균 점수로 나타내었다.
다음 표 2는 조직병리학 결과를 나타내는 것으로서, 역시 rhu TNFR:Fc, TNFR 단량체 및 rmu IL-1R이 항원 유도 관절염의 심도를 낮추는데 효과적이고, 그 IL-1R과 TNFR 단량체의 병용이 이들 수용체 중 어느 하나를 단독으로 사용하는 것보다 더 효과적이라는 것을 나타낸다.
[표 2]
요약하면, mBSA 공격시와 후속 이틀간의 공격시에 rhu TNFR:Fc, TNFR 단량체 또는 rmu IL-1R로 처리한 결과 희석액으로 처리한 대조군 쥐와 비교하여 무릎 관절 팽창이 감소되었다는 것이다. rmu IL-1R과 TNFR 단량체 모두를 병용한 결과 이들 수용체 분자중 어느 하나를 단독으로 사용하는 것보다 훨씬 더 팽창이 감소되었다. 이러한 조직병리학적 결과는 또한 rhu TNFR/Fc, TNFR 단량체 및 rmu IL-1R이 항원 유도 관절염의 심도를 낮추는 데 효과적이고, rmu IL-1R과 TNFR 단량체의 병용이 이들 수용체 중 어느 하나를 단독으로 사용하는 것보다 더 효과적이라는 것을 나타낸다.
[실시예 5]
[B10.RIII 생쥐의 콜라겐 유도 관절염에 대한 가용성 TNRF의 효과]
완전 프로인트 보조제 중의 돼지 타입 II 콜라겐(CII)으로 미리 면역화시킨 B10.RIII 생쥐에 콜라겐 유도 관절염(CIA)를 일관되게 발병시킨다. rhu TNFR:Fc를 투여한 경우 생쥐의 CIA 징후를 억제시키는데 효과적인 것으로 나타났다.
B10.RIII 생쥐를 완전 프로인트 보조제 중의 100㎍ 돼지 타입 II 콜라겐(CII)으로 유도된 관절염 징후에 대해 피부내로 면역화시켰다. 면역화시킨지 약 14-17일 경과후에, 생쥐에서 임상적 관절염의 징후들이 나타나기 시작하여 28일에는 생쥐의 90-100%가 심한 관절염을 드러냈다. CIA에 대한 가용성 TNFR/Fc의 효과를 측정하기 위하여 생쥐에 TNFR/Fc 또는 PBS를 복강내로 주사하였다. 이 생쥐들을 면역화시킨지 12주 경과후에 관절염의 징후에 대해 평가 분석하였다.
첫 번째 실험에서, TNFR/Fc는 CIA가 진전된 전 기간에 걸쳐 투여하였다. 12마리의 생쥐에 제0일 내지 35일 동안 1주에 3일씩 TNFR/Fc 10㎍을 주사하였다. 12마리의 대조군 생쥐에는 PBS를 주사하였다. 제5도는 TNFR/Fc가 대조군과 비교하여 관절염의 발생을 현저하게 감소시킴을 나타낸다. TNFR/Fc 처리를 중단했을 때는 생쥐의 관절염이 진전되었다.
두 번째 실험에서는, TNFR/Fc를 다음 표 3에 나타낸 바와 같이 CIA의 발병 단계 동안만 면역화시킨 날과 비교하여 제-1일 내지 17일에 투여하였다.
[표 3]
위 데이터는 TNFR/Fc가 관절염의 발병을 지연시키기는 하나, 타입 II 콜라겐으로 면역화시키기 하루 전과 면역화시킨지 3일 후에 TNFR/Fc 30㎍을 투여한 생쥐에게서는 CIA가 변화되지 않음을 나타낸다. 제-1일 내지 17일간 격일마다 TNFR/Fc 10㎍을 투여한 생쥐는 PBS를 주사한 대조군과 비교하여 CIA 발병율 및 그 심도에 있어서 약간 감소를 보였다.
세 번째 실험에서는 TNFR/Fc을 다음 표 4에 나타낸 바와 같이 CIA의 진전 단계 동안 만 면역화시킨 후 제14-28일 동안 격일마다 투여하였다.
[표 4]
위 데이터는 제14-28일 동안 격일마다 TNFR/Fc 10㎍의 투여한 생쥐의 경우 대조군과 비교하여 CIA 발병에 잇어서 약간의 지연을 보인다는 것을 나타낸다. 그러나, 관절염의 발병율 및 심도에 있어서는 변화가 없는 것으로 보인다.
요약하면, 상기 실험들은 TNFR/Fc가 CIA 진전의 전 기간 동안 투여될 때 CIA의 발병을 지연시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다.
[실시예 6]
[DBA/1 생쥐의 콜라겐 유도 관절염에 대한 가용성 TNFR의 효과]
완전 프로인트 보조제 중의 돼지 타입 II 콜라겐(CII)로 미리 면역화시킨 DBA/1 생쥐에서 CIA에 대한 가용성 TNFR/Fc의 효과를 또한 시험하였다. rhu TNFR:Fc를 투여한 결과 CIA의 징후를 억제시키는데 효과적인 것으로 나타났다.
이 실험에서는, DBA/1 생쥐에 CII 100㎍으로 면역화시킨 후에 제21일 내지 제28일에 무균 염수 중의 재조합 가용성 인체 TNFR/Fc 50㎍을 복강내 주사하였다. 대조군 생쥐에는 무균 염수(비히클) 주사액을 투여하였다. 이 처리 기간은 CIA의 임상적 신호가 진전되기 전이었으나, 타입 II 콜라겐에 감응하는 DTH 반응의 진전 및 IgG 항 CII 생성 기간 동안이었다.
두 생쥐 군을 70일간 CIA의 진전에 대해, 그리고 면역화시킨후 44-45일간 CIA의 발병에 대해 평가하였다. 제6도 및 제7도는 TNFR/Fc가 대조군과 비교하여 CIA의 발병율을 현저하게 저하시키며(28% : 86% ; p〈0.03), 관절염 지표(관절염 심도의 주관적 척도) 및 관련 관절수를 모두 저하시키는 것으로 나타났다. CII에 감응하는 항체는 TNFR/Fc로 처리한 직후(제28일) 현저하게 낮아졌으나, 항체의 수준은 실험의 종결시(제70일)에 동등하였다.
상기 결과들은 TNFR/Fc가 생쥐의 CIA의 발병율을 저하시키는데 효과적이며, 따라서 관절염 치료에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
[서열 목록]
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 : 제이콥스, 신디 에이.
(ii) 발명의 명칭 : 종양 괴사 인자 길항제를 사용한 TNF-의존성 염증의 치료방법
(iii) 서열 수 : 5
(iv) 주소 :
(A) 수취인 : 이뮤넥스 코포레이션(IMMUNEX CORPORATION)
(B) 거리명 : 유니버시티 스트리트 51
(C) 도시명 : 시애틀
(D) 주 : 워싱톤
(E) 국적 : 미합중국
(F) ZIP : 98101
(v) 컴퓨터 판독형 :
(A) 미디어 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) 현 출원 데이터 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(viii) 변리사/대리인 정보 :
(A) 성명 : 와이트, 크리스토퍼 엘.
(B) 등록 번호 : 31,680
(C) 참고/처리 번호 : 2503
(ix) 통신 정보 :
(A) 전화번호 : (206)587-0430
(B) 팩스 번호 : (206)587-0606
(2) SEQ ID NO:1에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1641 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일 스트랜드
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자 유형 : cDNA
(iii) 하이포세티칼 : 없음
(iv) 안티센스 : 없음
(vi) 원래 기원 :
(A) 생물 : 인간
(G) 세포형 : 피브로블라스트
(H) 세포주 : WI-26 VA4
(vii) 직접 기원 :
(A) 라이브러리 : WI-26 VA4
(B) 클론 : 클론 1
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 :CDS
(B) 존재 위치 : 88..1473
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : 매트 펩티드
(B) 존재 위치 : 154..1470
(xi) 특징 :
(A) 명칭/키 : 시그 펩티드
(B) 존재 위치 : 88..153
(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO:1:
(2) SEQ ID NO:2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 461 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:2
(2) SEQ ID NO:3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1557 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드: 단일 스트랜드
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 하이포세티칼: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vii) 직접 기원:
(B) 클론: TNFR/Fc 융합 단백질
(ix) 특징:
(A) 명칭/키 :CDS
(B) 존재 위치 : 1..1557
(ix) 특징:
(A) 명칭/키 : 매트 펩티드
(B) 존재 위치 : 1..1554
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:3
(2) SEQ ID NO:4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 518 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:4
(2) SEQ ID NO:5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드: 단일 스트랜드
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA (게놈)
(iii) 하이포세티칼: 없음
(iv) 안티 센스: 있음
(vii) 직접 기원:
(B) 클론: 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:5
CGGTACGTGC TGTTGTTACT GC

Claims (8)

  1. 치료 유효량의 TNF 길항제와 불활성 담체로 이루어진, 포유 동물의 TNF-매개 관절염 치료를 위한 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 포유 동물이 인간인 것인 제약 조성물.
  3. 제2항에 있어서, TNF 길항제가 가용성 인체 TNFR인 것인 제약 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 가용성 인체 TNFR이 가용성 인체 타입 I TNFR 및 가용성 인체 타입 II TNFR로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 가용성 인체 TNFR이 인체 이뮤노글로불린 분자의 Fc 영역에 융합된 것인 제약 조성물.
  6. 제1항에 있어서, TNFR이 IL-1R과 병용 투여되는 것인 제약 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 가용성 인체 TNFR이 1주 당 약 0.1mg/kg 내지 약 100mg/kg의 양으로 포유 동물에 투여되는 것인 제약 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 가용성 인체 TNFR의 양이 1주 당 약 0.5mg/kg 내지 약 50mg/kg으로 투여되는 것인 제약 조성물.
KR1019940701636A 1992-09-15 1993-09-14 종양 괴사 인자 길항제를 함유하는 tnf-의존성 염증 치료용 제약 조성물 KR100232688B1 (ko)

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