FI108645B - Kasvainkuoliotekijä-alfa- ja kasvainkuoliotekijä-beta- reseptoreita - Google Patents

Description

108645

Kasvainkuoliotekijä-α- ja kasvainkuoliotekijä-B-resepto-reita Tämä patenttihakemus on jakamalla erotettu patent-5 tihakemuksesta FI 920946.

Keksinnön tausta

Esillä oleva keksintö koskee yleisesti sytokiini-reseptoreita ja spesifisemmin kasvainkuoliotekijäresepto-reita.

10 Kasvainkuoliotekijä-a (TNF-α, tunnetaan myös ka- kektiinina) ja kasvainkuoliotekijä-β (TNF-β, tunnetaan myös lymfotoksiinina) ovat homologisia nisäkkään endogee-nisiä erittyviä proteiineja, jotka kykenevät indusoimaan laajan valikoiman vaikutuksia suuressa lukumäärässä solu-15 tyyppejä. Suurien samankaltaisuuksien johdosta näiden kahden sytokiinin rakenteellisissa ja funktionaalisissa ominaisuuksissa niitä kutsutaan yhteisnimellä "TNF". Komplementaarisia cDNA-klooneja, jotka koodittavat TNF-a:aa (Pennica et ai., Nature 312 (1984) 724) ja TNF-B:aa (Gray 20 et ai., Nature 312 (1984) 721), on eristetty, mikä mahdollistaa TNF:n rakenteellisten ja biologisten ominaisuuksien lisäkarakterisoinnin.

TNF-proteiinit käynnistävät biologisen vaikutuk-‘ sensa soluihin sitoutumalla spesifisiin TNF-reseptori- • ·’ 25 (TNF-R-) proteiineihin, jotka ilmentyvät TNF:lie respon- siivisen solun plasmamembraanilla. TNF-a:n ja TNF-B:n • · · osoitettiin ensin sitoutuvan yhteiseen reseptoriin ihmisen | » t kohdunkaulasyöpäsolulinjassa ME-180 (Aggarwal et ai., :***: Nature 318 (1985) 665) . Arviot TNF-R:n koosta, joita mää- • · · 30 ritettiin affiniteettileimaustutkimuksilla, vaihtelivat 54:stä 175 kDa:iin (Creasey et ai., Proc.Natl. Acad. Sei.

USA M (1987) 3293, Stauber et al^, J.Biol.Chem. 263 » ‘1’ (1988) 19098; Hohmann et ai., J.Biol.Chem. 264 (1989) · ’ ** 14927) . Vaikka näiden kahden TNF-R:n, joiden molekyylipai- *”'· 35 no on erilainen, keskinäinen suhde on epäselvä, Hohmann et 1 t 108645 2 ai. (J.Biol.Chem. 264 (1989) 14927) raportoivat, että ai nakin kahta erilaista solupintareseptoria TNFrlle esiintyy erilaisilla solutyypeillä. Näiden reseptorien näennäinen molekyylipaino on noin 80 kDa:ta ja vastaavasti noin 55 -5 60 kDa:ta. Missään edeltävistä julkaisuista ei kuitenkaan ole raportoitu solupinta-TNF-reseptorien puhdistamista homogeenisiksi .

Solupintareseptorien TNFrlle lisäksi on niinikään ihmisen virtsasta identifioitu liukoisia proteiineja, jot-10 ka kykenevät sitoutumaan TNFrään (Peetre et ai., Eur. -J.Haematol. 41 (1988) 414; Seckinger et ai., J.Exp.Med.

167 (1988) 1511; Seckinger et ai., J.Biol.Chem. 264 (1989) 11966; GB-patenttihakemus 2 218 101 A Seckingerille et ai.; Engelmann et ai., J.Biol.Chem. 264 (1989) 11974) .

15 Liukoisen virtsaperäisen TNFrää sitovan proteiinin, joka julkistetaan patenttijulkaisussa GB 2 218 101 A, osittainen N-pään aminohapposekvenssi on Asp-Ser-Val-Cys-Pro-, joka vastaa osittaista sekvenssiä, jonka julkistivat myöhemmin Engelmann et ai. (1989). Edeltävien liukoisten 20 virtsaperäisten sitoutumisproteiinien keskinäistä suhdetta selvitettiin edelleen tämän patenttijulkaisun etuoikeus-hakemuksen jättämisen jälkeen, kun Engelmann et ai. rapor-#V. toivat identifioineensa ja puhdistaneensa toisen erillisen :·/. liukoisen virtsaperäisen TNFrään sitoutuvan proteiinin, ·.·. 25 jonka N-pään aminohapposekvenssi on Val-Ala-Phe-Thr-Pro- 1.!^ (J.Biol.Chem. 265 (1990) 1531) . GB-patenttijulkaisussa 2 218 101 A ja Engelmannin et ai. julkaisussa julkaistujen • · kahden virtsaperäisen proteiinin osoitettiin olevan im- • · '···’ muunikemiallisesti sukua kahdelle ilmeisesti erilliselle 30 solupintaproteiinille sitoutumisproteiinien vastaisen vas- ’F*: taseerumin kyvystä inhiboida TNFrn sitoutumista tiettyihin : soluihin.

‘ . Sittemmin kaksi erillistä ryhmää raportoivat ihmi- . sen 55 kDarn TNF-Rrn molekyylitason kloonauksesta ja il- 35 mentämisestä (Loetscher et ai., Cell. 61 (1990) 351; • » · • · » 108645 3

Schall et ai. , Cell 61 (1990) 361). Kummankin ryhmän TNF-R:llä on N-pääaminohapposekvenssi, joka vastaa julkaisuissa GB 2 218 101 A, Engelmann et ai. (1989) ja Engelmann et ai. (1990) julkistetun virtsaperäisen sitoutumisproteiinin 5 osittaista aminohapposekvenssiä.

TNF-R:n moninaisten muotojen ja liukoisten virtsa-peräisten TNFrään sitoutuvien proteiinien välisen suhteen selvittämiseksi tai TNF-R:ien rakenteellisten ja biologisten ominaisuuksien sekä sen roolin tutkimiseksi, joka TNF-10 R:illä on erilaisten solupopulaatioiden vasteissa TNFrlle tai muulle sytokiinistimulaatiolle, tai TNF-R:ien tehokkaaksi käyttämiseksi, diagnoosissa tai määrityksissä tarvitaan puhdistettuja TNF-R-koostumuksia. Kuitenkin tällaisia koostumuksia voidaan saada käytännöllisinä saantoina 15 vain kloonaamalla ja ilmentämällä reseptoreita koodittavia geenejä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen. Yrityksiä TNF-R-molekyylin puhdistamiseksi käytettäväksi biokemiallisessa analyysissä tai TNF-R:ää koodittavien nisäkäsgeenien kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi on kuitenkin haitannut 20 reseptoriproteiinin tai mRNA:n sopivan lähteen puuttuminen. Ennen esillä olevaa keksintöä minkään solulinjan ei tiedetty ilmentävän korkeita TNF-R-tasoja konstitutiivi-sesti ja jatkuvasti, mikä sulki pois reseptorin puhdista- • · ;·.·. misen sekventoitavaksi tai geenikirjastojen rakentamisen ... 25 cDNA:n kloonausta silmällä pitäen.

!.! Yhteenveto keksinnöstä • » \\\ Esillä oleva keksintö koskee puhdistettua, biolo- ’···’ gisesti aktiivista nisäkkään kasvainkuoliotekijäreseptori (TNF-R)-proteiinia, etenkin ihmisen TNF-R:iä. Keksinnön 30 mukainen TNF-R-proteiini käsittää aminohapposekvenssin, joka valitaan kuvion 2 aminohapoista 1-x, jolloin x vali-·’*: taan aminohapoista 163 - 235. Erityisesti keksintö koskee 1 . liukoisia TNF-reseptori-proteiineja.

. Kuvataan myös koostumuksia käytettäviksi TNF-R- 35 diagnostiikassa, -määrityksissä, tai TNF-R:n vastaisten ·. : : vasta-aineiden tuotannossa, jotka koostumukset käsittävät 4 1 08645 tehokkaita määriä liukoisia natiiveja reseptoriproteiineja tai yhdistelmä-DNA-reseptoriproteiineja, jotka on valmistettu kantahakemuksessa kuvatuilla menetelmillä.

Koska TNF:n kykenee spesifisesti sitomaan TNF-5 reseptoreita (TNF-R:iä), puhdistetut TNF-R-koostumukset ovat käyttökelpoisia TNF:n diagnostisissa määrityksissä sekä tuotettaessa TNF-reseptorin vastaisia vasta-aineita käytettäviksi diagnostiikassa ja terapiassa.

Esillä olevan keksinnön muut kohteet ilmenevät 10 oheisista patenttivaatimuksista.

Suppea kuvaus piirroksista

Kuvio 1 on kaaviollinen esitys erilaisten humaa-ni-ja hiiri-TNF-R:iä koodittavien cDNA-sekvenssien koo-dittavasta alueesta. Johtosekvenssi on vivoviivoitettu ja 15 transmembraanialue on umpinainen.

Kuviot 2-3 esittävät humaani-TNF-R-klooni-1:n osittaista cDNA-sekvenssiä ja siitä pääteltyä aminohappo-sekvenssiä. Nukleotidit on numeroitu alkaen 5'-ei-luetusta alueesta. Aminohapot on numeroitu signaalipeptidisekvens-20 sin alusta. Oletettua signaalipeptidisekvenssiä edustavat aminohapot -2 - -1. Kypsän TNF-R-proteiinin N-pääleusiini on alleviivattu asemassa 1. Ennustettu transmembraanialue .'.· : aminohapot 236 - 265 on samoin alleviivattu. Erilaisten liukoisten TNF-R:ien C-päät on merkitty nuolella (pysty-25 nuoli).

• * · ,···. Kuviot 4-6 esittävät cDNA-sekvenssiä ja siitä • · pääteltyä aminohapposekvenssiä hiiri-TNF-R-klooni-11: lie.

"t Oletettua signaalipeptidisekvenssiä esittävät aminohapot '··’ -22 - -1. Kypsän TNF-R-proteiinin N-päävaliini on allevii- 30 vattu asemassa 1. Ennustettu transmembraanialue aminohapot : ’ 234 - 265 on samoin alleviivattu.

Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä .,..: Määritelmiä * * (-ti; Tässä käytettynä ilmaisuilla "TNF-reseptori" ja 35 i t I » t 108645 5 "TNF-R" tarkoitetaan proteiineja, joilla on aminohappo-sekvenssejä, jotka ovat oleellisesti samankaltaisia kuin natiivin nisäkäs-TNF-reseptorin aminohapposekvenssit, ja jotka ovat biologisesti aktiivisia alla määritellyn mukai-5 sesti sikäli, että ne kykenevät sitoutumaan TNF-molekyy-leihin tai transdusoimaan biologisen signaalin, jonka on käynnistänyt TNF-molekyylin sitoutuminen soluun, tai ris-tireagoimaan anti-TNF-R-vasta-aineiden kanssa, jotka on tuotettu vastaan TNF-R:ää luonnollisista (eli ei-yhdis-10 telmä-DNA-) lähteistä. Kypsä täysimittainen ihmisen TNF-R on glykoproteiini, jonka molekyylipaino on noin 80 kilo-daltonia (kDa). Kautta koko selityksen ilmaisulla "kypsä" tarkoitetaan proteiinia, joka on ilmennetty muodossa, josta puuttuu johtosekvenssi, joka voi esiintyä natiivin gee-15 nin täysimittaisissa kopioissa. Kokeet, joissa käytettiin COS-soluja, jotka oli transfektoitu täysimittaista ihmisen TNF-R:ää koodittavalla cDNA:lla, osoittivat, että TNF-R sitoi 125I-TNF-a:aa näennäisen Ka:n ollessa noin 5 x 109 M" 1 1 o c , ja että TNF-R sitoi I-TNF^:aa näennäisen Ka:n olles- 20 sa noin 2 x 109 M-1. Ilmaisujen "TNF-reseptori" tai "TNF-R" piiriin kuuluvat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta na- tiivien proteiinien analogit tai alayksiköt, joissa on ai- nakin 20 aminohappoa, ja jotka osoittavat ainakin jotain TNF-R:n kanssa yhteistä biologista aktiivisuutta, esimer- ·.·. 25 kiksi liukoiset TNF-R-rakenteet, joista puuttuu transmem- ,···. braanialue (ja jotka erittyvät solusta) , mutta joilla on > » !*.*._ tallella kyky sitoa TNF:ää. Erilaisia bioekvivalentteja proteiini- ja aminohappoanalogeja kuvataan yksityiskohtai-*··’ sesti alla.

30 Tässä käytetty TNF-R-analogien nimeämistapa seuraa “*”* tapaa, jonka mukaan proteiini (esim. TNF-R) nimetään si- ' ten, että sitä edeltää joko hu (ihmis-) tai mu (hiiri-) , ____: ja seuraa delta (osoittamaan deleetion) sekä C-pääamino- * · hapon luku. Esimerkiksi hu-TNF-R-delta-235:11a tarkoite-

* O -3 C

. 35 taan ihmisen TNF-R:ää, jossa on Asp C-pään aminohappona 108645 6 (eli polypeptidi, jonka aminohapposekvenssi on 1 - 235 kuviossa 2) . Merkinnän ihmis- tai hiirilajista puuttuessa TNF-R viittaa geneerisesti nisäkäs-TNF-R:ään. Vastaavasti minkään spesifisen merkinnän puuttuessa deleetiomutanteis-5 ta ilmaisulla TNF-R tarkoitetaan kaikkia TNF-R:n muotoja, mukaan lukien mutantit ja analogit, joilla on TNF-R:n biologista aktiivisuutta.

Esillä olevan keksinnön yhteydessä käytettyinä "liukoisella TNF-R:llä" tai "sTNF-R:llä" tarkoitetaan pro-10 teiineja, tai oleellisesti samanarvoisia analogeja, joiden aminohapposekvenssi vastaa kokonaisuudessaan tai osittain natiivin TNF-R:n solunulkoista aluetta, esimerkiksi hu-TNF-R-delta-235, hu-TNF-R-delta-185 ja hu-TNF-R-delta-163, tai aminohapposekvenssejä, jotka ovat oleellisesti saman-15 laisia kuviossa 2 esitettyihin, aminohapot 1 - 163, aminohapot 1 - 185, tai aminohapot 1 - 235 käsittäviin nähden, ja jotka ovat biologisesti aktiivisia sikäli, että ne sitoutuvat TNF-ligandiin. Samanarvoisiin liukoisiin TNF-R:iin kuuluu polypeptidejä, jotka poikkeavat näistä sek-20 vensseistä yhdellä tai useammalla substituutiolla, delee-tiolla tai additiolla, ja joilla on tallella kyky sitoutua TNF:ään tai inhiboida TNF-signaalitransduktioaktiivisuus : solupintaan sitoutuneiden TNF-reseptoriproteiinien väli- tyksellä, esimerkiksi hu-TNF-R-delta-x, jossa x valitaan y. 25 ryhmästä, jonka muodostavat mitkä tahansa aminohapoista • · 163 - 235 kuviossa 2. Analogisia deleetioita voidaan tehdä » * TNF-R: ään. TNF-signaalitransduktioaktiivisuuden inhibitio !* voidaan määrittää transfektoimalla soluja yhdistelmä-DNA- TNF-R-DNA-sekvensseillä yhdistelmä-DNA-reseptori-ilmennyk-30 sen saamiseksi. Sitten solut saatetaan kosketuksiin TNF:n ' ' kanssa ja saatuja metabolisia vaikutuksia tutkitaan. Jos saadaan vaikutus, jonka voidaan katsoa johtuvan ligandin toiminnasta, yhdistelmä-DNA-reseptorilla on signaalitrans-. ; duktioaktiivisuutta. Esimerkkimenettelyitä sen määrittämi- . 35 seksi, onko polypeptidillä signaalitransduktioaktiivisuut- 7 1 O 8 6 4 5 ta, julkistavat Idzerda et ai., J.Exp.Med. 171 (1990) 861;

Curtis et ai., Proc.Natl.Acad.Sei. USA 86 (1989) 3045;

Prywes et ai. , EMBO J. 5 (1986) 2179; ja Chou et ai., J. Biol.Chem. 262 (1987) 1842. Vaihtoehtoisesti voitaisiin 5 myös käyttää primaarisoluja tai solulinjoja, jotka ilmentävät endogeenisen TNF-reseptorin ja joilla on todettava biologinen vaste TNF:lle.

Ilmaisulla "eristetty" tai "puhdistettu" käytettynä tämän selityksen yhteydessä TNF-R-proteiinin tai 10 proteiinikoostumusten puhtauden määrittelemiseksi tarkoitetaan, että proteiini tai proteiinikoostumus ei oleellisesti sisällä muita alkuperältään luonnollisia tai endo-geenisiä proteiineja ja sisältää alle noin 1 paino-%:n tuotantomenetelmistä jääneitä proteiiniepäpuhtauksia. Täl-15 laiset koostumukset voivat kuitenkin sisältää muita prote iineja, jotka on lisätty stabiloimisaineiksi, kantajiksi tai täyteaineiksi. TNF-R on eristetty, jos se voidaan todeta yksittäisenä proteiininauhana polyakryyliamidigee-lissä hopeavärjäyksellä.

20 Ilmaisulla "oleellisesti samanlainen" käytettynä joko aminohappo- tai nukleiinihapposekvenssien määrittelemiseksi tarkoitetaan, että nimenomainen kohdesekvenssi, esimerkiksi mutanttisekvenssi, poikkeaa viitesekvenssistä • yhdellä tai useammalla substituutiolla, deleetiolla tai ·.·. 25 additiolla, jolloin summavaikutus tästä on TNF-R-proteii- ,··, nin biologisen aktiivisuuden säilyttäminen, joka voidaan * i !!! määrittää esimerkiksi jollain alla esimerkissä 1 esite- tyistä TNF-R-sitoutumismäärityksistä. Vaihtoehtoisesti • » ’···' nukleiinihappoalayksiköt ja -analogit ovat "oleellisesti 30 samanlaisia" kuin spesifiset tässä julkistetut DNA-sek- » *’ ’ venssit, jos: (a) DNA-sekvenssi on saatu natiivin nisäkäs- ‘ti/ TNF-R-geenin koodialueelta; (b) DNA-sekvenssi kykenee hyb- ridisoitumaan DNA-sekvensseihin (a):sta kohtuullisen anka-rissa olosuhteissa (50 °C, 2x SSC) , ja ne koodittavat bio- ! · . 35 logisesti aktiivisia TNF-R-molekyylejä; tai DNA-sekvens- » » * · 108645 8 : sit, jotka ovat degeneroituneet tuloksena geneettisestä koodista (a):ssa tai (b):ssä määriteltyihin DNA-sekvens-seihin nähden ja jotka koodittavat biologisesti aktiivisia TNF-R-molekyylejä.

5 Ilmaisulla "yhdistelmä-DNA" tarkoitetaan tässä käytettynä, että proteiini on saatu yhdistelmä-DNA- (esim. mikrobi- tai nisäkäs-) ilmennyssysteemeistä. "Mikrobiaali-sella" tarkoitetaan yhdistelmä-DNA-proteiineja, jotka on valmistettu bakteeri- tai sieni- (esim. hiiva-) ilmennys-10 systeemeissä. Tuotteena "yhdistelmä-DNA-mikrobiaalinen" määrittelee proteiinin, joka on tuotettu mikrobi-ilmennys-systeemissä, ja joka oleellisesti ei sisällä natiiveja en-dogeenisiä aineita. Useimmissa bakteeriviljelmissä, esim.

E. colissa, ilmennetty proteiini ei sisällä glykaania.

15 Hiivassa ilmennetyn proteiinin glykosylaatiokuvio mahdollisesti poikkeaa nisäkässoluissa ilmennetystä.

"Biologisesti aktiivisella" käytettynä kautta selityksen TNF-reseptorien ominaisuutena tarkoitetaan, että nimenomaisella molekyylillä on riittävän samanlainen ami-20 nohapposekvenssi tässä julkistettuihin esillä olevan keksinnön mukaisiin suoritusmuotoihin nähden, jotta se kykenee sitomaan todettavia määriä TNF:ää, välittämään TNF-: stimulaatiota soluun, esimerkiksi hybridireseptoriraken- I’·*: teen osana, tai ristireagoimaan anti-TNF-R-vasta-aineiden V. 25 kanssa, jotka on tuotettu vastaan TNF-R:ää luonnollisista (eli ei-yhdistelmä-DNA-) lähteistä. Edullisesti esillä h) olevan keksinnön piiriin kuuluvat biologisesti aktiiviset TNF-reseptorit kykenevät sitomaan enemmän kuin 0,1 nano-’ * moolin (nmol) TNFrää kohden nanomoolia reseptoria, ja edu- 30 llisesti enemmän kuin 0,5 nanomoolia TNFrää kohden nano- ' moolia reseptoria sitoutumisen vakiomäärityksissä (katso alla) .

"Eristetyllä DNA-sekvenssillä" tarkoitetaan DNA-polymeeriä erillisen fragmentin muodossa tai suuremman 35 DNA-rakenteen osana, joka on saatu DNArsta, joka on eris- > * i t 9 1 O 8 6 45 ! tetty ainakin kerran oleellisesti puhtaassa muodossa, eli vapaana kontaminoivista endogeenisistä materiaaleista ja määränä tai pitoisuutena, joka mahdollistaa sekvenssin ja sen osanukleotidisekvenssien tunnistuksen, käsittelyn ja 5 talteenoton tavanomaisilla biokemiallisilla menetelmillä, esimerkiksi kloonausvektoria käyttäen. Tällaiset sekvenssit ovat edullisesti avoimen lukualueen muodossa, jota eivät katkaise sisäiset ei-luetut sekvenssit, tai intronit, joita tyypillisesti esiintyy eukaryoottisissa geeneissä.

' 10 Genomi-DNA:ta, joka sisältää oleelliset sekvenssit, voi taisiin samoin käyttää koodisekvenssien lähteenä. Sekvenssejä ei-luettua DNA:ta voi esiintyä 5'- tai 3'- suuntaan avoimesta lukualueesta, silloin kun ne eivät häiritse koo-dialueiden käsittelyä tai ilmennystä.

15 "Nukleotidisekvenssillä" tarkoitetaan deoksiribo- nukleotidien heteropolymeeriä. DNA-sekvenssejä, jotka koodattavat tämän keksinnön käyttöön antamia proteiineja, voidaan koota cDNA-fragmenteista ja lyhyistä oligonukleo-tidiliittäjistä, tai sarjasta oligonukleotideja, synteet-20 tisen geenin saamiseksi, joka kyetään ilmentämään yhdis-telmä-DNA-kopiointiyksikössä.

TNF-R:ää koodittavien cDNA-sekvenssien eristäminen : TNF-R:n koodisekvenssi saadaan eristämällä komple- ·'·*: mentaarinen DNA- (cDNA-) sekvenssi, joka koodittaa TNF- y. 25 R:ää, yhdistelmä-cDNA- tai genomi-DNA-kirjastosta. cDNA- I · ,·>·. kirjasto rakennetaan edullisesti hankkimalla polyadeny- -4 loitua mRNActa erityisestä solulinjasta, joka ilmentää ni- säkäs-TNF-R:n, esimerkiksi ihmisen sidekudosmuodostusso-lulinjasta WI-26 VA4 (ATCC CCL 95.1) ja käyttämällä 30 mRNArta templaattina kaksisäikeisen cDNA:n syntetisoimi-• ’ seksi. Kaksisäikeinen cDNA pakataan sitten yhdistelmä-DNA- vektoriin, joka viedään tarkoituksenmukaiseen Ey coli -kantaan, jossa sitä lisäännytetään. Voidaan käyttää myös hiiri- tai muita nisäkässolulinjoja, jotka ilmentävät 35 TNF-R:n. cDNA-kirjaston sisältämät TNF-R-sekvenssit voi- 108645 ίο daan tunnistaa helposti seulomalla kirjasto tarkoituksenmukaisella nukleiinihappokoettimella, joka kykenee hybri-disoitumaan TNF-R-cDNA:han. Vaihtoehtoisesti TNF-R-pro-teiineja koodittavia DNA-sekvenssejä voidaan koota liga-5 toimalla synteettisiä oligonukleotidialayksiköitä, jotka vastaavat kokonaisuudessaan tai osittain sekvenssiä kuvioissa 2-3 tai kuvioissa 4-6, täydellisen koodisek-venssin saamiseksi.

Esillä olevan keksinnön yhteydessä kuvatut humaa-10 ni-TNF-reseptori-cDNA:t eristettiin suoran ilmennyskloo- nausmenetelmällä. cDNA-kirjasto rakennettiin eristämällä ensin ihmisen sidekudosmuodostussolulinjan WI-26 VA4 solu-liman mRNA:ta. Polyadenyloitu RNA eristettiin ja sitä käytettiin kaksisäikeisen cDNA:n valmistamiseksi. Puhdistetut 15 cDNA-fragmentit ligatoitiin sitten pCAV/NOT-vektori- DNA:han, joka käyttää säätelysekvenssejä, jotka on saatu pDC201:stä (pMLSV-johdannainen, jota ovat aiemmin kuvanneet Cosman et ai., Nature 312 (1984) 768), SV40:stä ja sytomegalovirus-DNA:sta, joita kuvataan yksityiskohtai-20 sesti alla esimerkissä 2. pCAV/NOT on talletettu talle tuslaitokseen the American Type Culture Collection talle-tusnumerolla ATCC 68014. WI26-VA4-cDNA-fragmentteja sisäl-tävät pCAV/NOT-vektorit transformoitiin E. coli -kantaan * · :V: DH5-a. Transformantit maljaamalla saatiin noin 800 pesä- • * ·.·. 25 kettä maljaa kohden. Saadut pesäkkeet otettiin talteen ja • · ,···. kustakin poolista valmistettiin plasmidi-DNA, joka trans- « i fektoitiin COS-7-soluihin oleellisesti kuten ovat kuvan- • · ;;; neet Cosman et ai. (Nature 312 (1984) 7 68) ja Luthman et I · ’··' ai. (Nucl. Acids Res. 11 (1983) 1295). Biologisesti ak- 30 tiivisia solupinta-TNF-reseptoreita ilmentävät transfor-*”· mäntit tunnistettiin seulomalla niiden kyvyn suhteen sitoa *it/ 125I-TNF:ää. Tässä seulomislähestymistavassa transfektoitu- ja COS-7-soluja inkuboitiin kasvualustassa, joka sisälsi . 125I-TNF:ää, solut pestiin sitoutumatta jääneen leimatun 35 TNF:n poistamiseksi ja soluyksikerrokset saatettiin koske- « » t 11 108645 tuksiin röntgenfilmin kanssa TNF-sitoutumispitoisuuksien toteamiseksi kuten ovat julkistaneet Sims et ai., Science 241 (1988) 585. Tällä tavalla todetut transfektantit näkyvät tummina kohtina vasten suhteellisen vaaleaa taustaa.

5 Käyttämällä tätä lähestymistapaa noin 240 000 cDNA:ta seulottiin noin 800 cDNA:n pooleina, kunnes yhden transfektanttipoolin määritys osoitti positiivisia kohtia TNF-sitoutumiselle. Jäädytettyä bakteerivarastokantaa tästä positiivisesta poolista kasvettiin viljelmänä ja mal-10 jättiin yksittäisten pesäkkeitten saamiseksi, joita seulottiin kunnes tunnistettiin yksittäinen klooni (klooni-11), joka kykeni ohjaamaan pintaproteiinin synteesiä, jolla oli todettavaa TNF-sitoutumisaktiivisuutta. Edeltävällä menetelmällä eristetyn cDNA-klooni-11:n sekvenssi esite-15 tään kuvioissa 4-6.

Lisää cDNA-klooneja voidaan eristää muiden nisäkäslajien cDNA-kirjastoista ristilajihybridisaatiolla. Hybridisaatiossa käytettäväksi TNF-R:ää koodittava DNA voidaan leimata kovalenttisesti todettavalla aineella ku-20 ten fluoresoivalla ryhmällä, radioaktiivisella atomilla tai kemiluminoivalla ryhmällä menetelmillä, jotka ovat alan ammattilaisille tuttuja. Tällaisia koettimia voitai-siin myös käyttää nimenomaisten tilojen jji vitro -diag-noosissa.

• ♦ ·,·. 25 Kuten useimpia nisäkäsgeenejä nisäkäs-TNF-resepto- • » * • reita koodattavat oletettavasti monieksonigeenit. Vaih-toehtoisten mRNA-rakenteiden, joiden voidaan katsoa synty- * · vän kopioinnin jälkeisistä erilaisista mRNA-silmukoitumis-’ ·*’ tapahtumista ja joilla on tässä kuvattujen cDNA- 30 sekvenssien kanssa yhteisenä laajoja identtisyys- tai sa- '·"· manlaisuusalueita, katsotaan kuuluvan esillä olevan kek- ‘ ^ sinnön piiriin.

Muita nisäkäs-TNF-R-cDNA-sekvenssejä eristetään . käyttämällä tarkoituksenmukaista humaani-TNF-R-DNA-sek- 35 venssiä koettimena nimenomaisen nisäkäs-cDNA-kirjaston 108645 12 seulomiseksi ristilajihybridisaatiolla.

Proteiineja ja analogeja

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön eristettyjä yhdistelmä-DNA-nisäkäs-TNF-R-polypeptidejä. Tämän keksin-5 nön mukaiset eristetyt TNF-R-polypeptidit eivät oleellisesti sisällä muita alkuperältään luonnollisia tai endo-geenisiä kontaminoivia materiaaleja ja ne sisältävät vähemmän kuin noin 1 paino-%:n tuotantomenetelmistä jääneitä proteiiniepäpuhtauksia. Natiivit humaani-TNF-R-molekyylit 10 otetaan talteen solulysaateista glykoproteiineina, joiden näennäinen molekyylipaino SDS-PAGE:n mukaan on noin 80 kilodaltonia (kDa). Tämän keksinnön mukaisista TNF-R-polypeptideistä mahdollisesti puuttuu liittyvä natiivin kuvion mukainen glykosylaatio.

15 Esillä olevan keksinnön mukaiseen nisäkäs-TNF- R:ään kuuluu esimerkiksi kädellis-, ihmis-, hiiri-, koira-, kissa-, nauta-, lammas-, hevos- ja sika-TNF-R. Nisä-käs-TNF-R:t voidaan saada ristilajihybridisaatiolla käyttäen yksisäikeistä cDNA:ta, joka on saatu humaani-TNF-R-20 DNA-sekvenssistä, hybridisaatiokoettimena TNF-R-cDNA- sekvenssien eristämiseksi nisäkäs-cDNA-kirjastoista.

Keksinnön piiriin kuuluviin TNF-R-johdannaisiin kuuluu myös primaarisen proteiinin erilaisia rakenteelli- t * I'·'. siä muotoja, joilla on tallella biologinen aktiivisuus.

*.·. 25 Esimerkiksi ionisoituvien amino- ja karboksyyliryhmien * · läsnäolon johdosta TNF-R-proteiini voi olla happamien tai ’’* emäksisten suolojen muodossa, tai se voi olla neutraalissa muodossa. Yksittäisiä aminohappotähteitä voidaan niinikään modifioida hapettamalla tai pelkistämällä.

30 Primaarista aminohapporakennetta voidaan modifioi- • ‘ da muodostamalla kovalenttisia tai aggregatiivisia konju- ‘t,,: gaatteja muiden kemiallisten ryhmien, kuten glykosyyli- ryhmien, lipidien, fosfaatti-, asetyyliryhmien ja vastaa-vien kanssa, tai luomalla aminohapposekvenssimutantteja.

35 Kovalenttisia johdannaisia valmistetaan liittämällä ni- 108645 13 menomaisia funktionaalisia ryhmiä TNF-R-aminohapposivu-ketjuihin tai N- tai C-päähän. Muita TNF-R-johdannaisia ovat TNF-R:n tai sen fragmenttien kovalenttiset tai aggre-gatiiviset konjugaatit muiden proteiinien tai polypeptidi-5 en kanssa, (jotka muodostetaan) esimerkiksi syntetisoimalla yhdistelmä-DNA-viljelmässä N-pää- tai C-pääfuusioina. Esimerkiksi konjugoitu peptidi voi olla signaali- (tai johto-) polypeptidisekvenssi proteiinin N-pääalueella, joka luennan aikana tai luennan jälkeen ohjaa proteiinin 10 siirtymistä sen synteesipaikasta sen toimintapaikkaan so-lumembraanin tai -seinän sisä- tai ulkopuolella (esim. hiiva-a-tekijäjohtosekvenssi). TNF-R-proteiinifuusiot voivat käsittää peptidejä, jotka on lisätty helpottamaan TNF-R:n puhdistusta tai tunnistusta (esim. poly-His). TNF-15 reseptorin aminohapposekvenssi voidaan myös liittää peptidiin Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et ai., Bio/Technoloqy 6 (1988) 1204). Viimemainittu sekvenssi on erittäin antigeeninen ja käsittää epitoopin, jota sitoo reversiibelisti spesifinen monoklonaalinen vasta-20 aine, mikä mahdollistaa ilmennetyn yhdistelmä-DNA-proteiinin nopean määrityksen ja helpon puhdistuksen. Tätä sekvenssiä pilkkoo niinikään spesifisesti naudan limakal-von enterokinaasi tähteen kohdalta, joka seuraa välittö-mästi Äsp-Lys-paria. Tällä peptidillä salvatut fuusiopro-\\ 25 teiinit voivat niinikään vastustaa solunsisäistä hajoamis- ' ’·, ta L colissa.

K'. TNF-R-johdannaisia voidaan myös käyttää reagens- ;;; seinä reseptoripohjaisissa immuunimäärityksissä tai sitou- ’···’ tumisagentteina TNF:n tai muiden sitoutumisligandien affi- 30 niteettipuhdistusmenettelyissä. TNF-R-johdannaisia voidaan myös saada käyttämällä ristikytkemisaineita, kuten M-maleimidobentsoyylisukkiini-imidiesteriä ja N-hydroksisuk-kiini-imidiä, kysteiini- ja lysiinitähteiden kohdalla.

» I

ti. TNF-R-proteiinit voidaan samoin sitoa kovalenttisesti re- » , 35 aktiivisten sivuryhmien välityksellä erilaisiin ei- l· i · • » » < I t t 108645 14 liukoisiin substraatteihin, kuten syaanibromidiaktivoidut, bisoksiraaniaktivoidut, karbonyylidi-imidatsoliaktivoidut tai tosyyliaktivoidut agaroosirakenteet, tai adsorboimalla polyolefiinipintoihin (käyttäen tai käyttämättä glutaa-5 rialdehydiristikytkemistä). Kun TNF-R on sitten sidottu substraattiin, sitä voidaan käyttää anti-TNF-R-vasta- aineiden tai TNF:n selektiiviseksi sitomiseksi (määritys-tai puhdistustarkoituksissa).

Esillä olevaan keksintöön kuuluu myös TNF-R, joka ' 10 käsittää liittyvän natiivin kuvion mukaisen glykosylaation tai ei käsitä sitä. Hiiva- tai -nisäkäsilmennyssysteemeis-sä, esim. COS-7-soluissa, ilmennetyllä TNF-R:llä voi olla samanlaiset tai lievästi erilaiset molekyylipaino ja gly-kosylaatiokuvio kuin natiiveilla molekyyleillä ilmennys- 15 systeemistä riippuen. Ilmentämällä TNF-R-DNA:t bakteereis sa kuten Eh_ colissa saadaan ei-glykosyloituja molekyylejä. Nisäkäs-TNF-R:n funktionaalisia mutanttianalogeja, joissa on inaktivoituja N-glykosylaatiokeskuksia, voidaan tuottaa oligonukleotidisynteesillä ja ligatoimalla tai käyttäen 20 paikkaohjatun mutatoinnin tekniikoita. Näitä analogipro-teiineja voidaan tuottaa homogeenisessa, pelkistetty hiilihydraatti -muodossa saannon ollessa hyvä hiivailmennys-.!· : systeemejä käyttäen. Eukaryoottisten proteiinien N- j'·'. glykosylaatiokeskuksille on karakteristista aminohappo- ·.*. 25 tripletti Asn-Ai-Z, jossa Ai on mikä tahansa aminohappo • · · t···, paitsi Pro, ja Z on Ser tai Thr. Tässä sekvenssissä aspa- « · ragiinista saadaan sivuketjuaminoryhmä hiilihydraatin ko- » * • * \\\ valenttiseksi kiinnittämiseksi. Tällainen keskus voidaan eliminoida substituoimalla toinen aminohappo Asn:n tai 30 tähteen Z tilalle, deletoimalla Asn tai Z tai insertoi- ’·"· maila ei-Z-aminohappo Ai:n ja Z:n väliin, tai muu amino- happo kuin Asn Asn:n ja Ai:n väliin.

TNF-R-johdannaisia voidaan saada samoin mutatoi-. maila TNF-R:ää tai sen alayksiköitä. TNF-R-mutantti tässä , 35 tarkoitetussa mielessä on TNF-R:ään nähden homologinen po- > i » t * i t I * 108645 15 lypeptidi, joka aminohapposekvenssiltään kuitenkin poikkeaa natiivista TNF-R:stä deleetion, insertion tai substituution vuoksi.

TNF-R-proteiinien bioekvivalenttisia analogeja 5 voidaan rakentaa esimerkiksi tekemällä erilaisia tähteiden tai sekvenssien substituutioita tai deletoimalla päässä sijaitsevia tai sisäisiä tähteitä tai sekvenssejä, jotka eivät ole biologiselle aktiivisuudelle välttämättömiä. Esimerkiksi kysteiinitähteet voidaan deletoida (esim.

10 Cys178) tai korvata muilla aminohapoilla tarpeettomien tai virhellisten molekyylinsisäisten disulfidisiltojen muodostuksen estämiseksi renaturoinnissa. Muihin lähestymistapoihin mutatoinnin suorittamiseksi kuuluu viereisten kak-siemäksisten aminohappotähteiden modifiointi ilmennyksen 15 tehostamiseksi hiivasysteemeissä, joissa esiintyy KEX2-proteaasiaktiivisuutta. Yleisesti substituutiot tulisi tehdä konservatiivisesti; eli edullisimpia korvaavia aminohappoja ovat ne, jotka fysikokemiallisilta ominaisuuksiltaan muistuttavat korvattavan tähteen vastaavia. Samoin 20 käytettäessä deleetio- tai insertiostrategiaa deleetion tai insertion mahdollinen vaikutus biologiseen aktiivisuuteen tulisi ottaa huomioon. Oleellisesti samanlaiset poly-peptidisekvenssit edellä määritellyn mukaisesti käsittävät

* I

I’.*. yleensä saman lukumäärän aminohapposekvenssejä, vaikka « · *.·, 25 C-päätypistelmät liukoisten TNF-R:ien rakentamista silmäl- ..•t lä pitäen sisältävät harvempia aminohapposekvenssejä.

ΙΓ. TNF-R:ien biologisen aktiivisuuden säilyttämiseksi delee- tioiden ja substituutioiden tuloksena saadaan edullisesti homologisia tai konservatiivisesti substituoituja sekvens-30 sejä, mikä tarkoittaa, että tietty tähde on korvattu bio-logisesti samanlaisella tähteellä. Esimerkkejä konserva-’ii(! tiivisista substituutioista ovat yhden alifaattisen täh- teen sijoittaminen toisen tilalle, kuten Ile, Vai, Leu tai s

Ala toistensa tilalle, tai substituutiot, joissa yksi po-35 laarinen tähde sijoitetaan toisen tilalle, kuten keskenään >

S i i I

! 108645 16

Lys ja Arg; Glu ja Asp; tai Gin ja Asn. Muitakin tällaisia konservatiivisia substituutioita, esimerkiksi hydrofobi-suusominaisuuksiltaan samanlaisten kokonaisten alueiden substituutiot, tunnetaan hyvin. Lisäksi nimenomaiset ami-5 nohappoerot ihmisen, hiiren ja muun nisäkkään TNF-R:ien välillä viittaa toisiin konservatiivisiin substituutioihin, joita voidaan tehdä muuttamatta TNF-R:n oleellisia biologisia ominaisuuksia.

TNF-R-alayksiköitä voidaan rakentaa deletoimalla 10 päässä sijaitsevia tai sisäisiä tähteitä tai sekvenssejä. Erityisen edullisia sekvenssejä ovat ne, joissa TNF-R:n transmembraanialue ja solunsisäinen alue on deletoitu tai substituoitu hydrofiilisillä tähteillä reseptorin erityksen solukasvualustaan helpottamiseksi. Saatua proteiinia 15 kutsutaan liukoiseksi TNF-R-molekyyliksi, jolla on tallella kykynsä sitoa TNF:ää. Erityisen edullinen liukoinen TNF-R-rakenne on TNF-R-delta-235 (aminohappojen 1 - 235 sekvenssi kuviossa 2), joka käsittää TNF-R:n solunulkoisen alueen kokonaisuudessaan päättyen Asp235:een välittömästi 20 transmembraanialueen vieressä. Lisää aminohappoja voidaan deletoida transmembraanialueelta säilyttäen TNF:ää sitova aktiivisuus. Esimerkiksi hu-TNF-R-delta-183:11a, joka kä-sittää aminohappojen 1 - 183 sekvenssin kuviossa 2, ja TNF-R-delta-163:11a, joka käsittää aminohappojen 1 - 163 t · · • 25 sekvenssin kuviossa 2, on tallella kyky sitoa TNF-ligandi, '·*.* mikä määritetään käyttäen alla esimerkissä 1 kuvattuja si- • · * ·...* toutumismäärityksiä. TNF-R-delta-142:11a ei kuitenkaan ole tallella kykyä sitoa TNF-ligandia. Tämä viittaa siihen, : että jompikumpi tai kumpikin tähde Cys157 ja Cys163 on vält- 30 tämätön molekyylinsisäisen disulfidisillan muodostamiseksi TNF-R: n laskostamiseksi oikein. Cys , joka deletoitiin .···, ilman mitään ilmeistä kielteistä vaikutusta liukoisen TNF- ’·' R:n kykyyn sitoa TNF:ää, ei vaikuta välttämättömältä TNF- * ' R:n laskostamiseksi oikein. Täten minkä tahansa deleetion, 35 joka on C-pään puolella Cys163:een nähden, voitaisiin olet- • · · 108645 17 taa johtavan biologisesti aktiiviseen liukoiseen TNF-R:ään. Esillä oleva keksintö koskee tällaisia liukoisia TNF-R-rakenteita, jotka vastaavat kokonaisuudessaan tai osittain TNF-R:n solunulkoista aluetta päättyen mihin 5 tahansa aminohappoon Cys163:n jälkeen. Muita C- päädeleetioita, kuten TNF-R-delta-157, voidaan tehdä kätevästi leikkaamalla TNF-R-cDNA:ta tarkoituksenmukaisilla restriktioentsyymeillä ja tarvittaessa rakentamalla uudestaan spesifisiä sekvenssejä käyttäen synteettisiä oligo-10 nukleotidiliittäjia. Saadut liukoiset TNF-R-rakenteet in- sertoidaan sitten ja ilmennetään tarkoituksenmukaisissa ilmennysvektoreissa ja määritetään niiden kyky sitoa TNF:ää, kuten kuvataan esimerkissä 1. Biologisesti aktiiviset liukoiset TNF-R:t, jotka saadaan tällaisista raken-15 teista, katsotaan myös esillä olevan keksinnön piiriin kuuluviksi.

Mutaatioiden nukleotidisekvensseissä, jotka on rakennettu analogi-TNF-R:n ilmentämiseksi, on luonnollisesti säilytettävä koodisekvenssien lukualuevaihe ja edullisesti 20 ne eivät muodosta komplementaarisia alueita, jotka voisivat hybridisoitua tuottaen sekundaarisia mRNA-rakenteita, kuten silmukoita tai hiussilmiä, joilla olisi kielteinen . . vaikutus reseptori-mRNA:n luentaan. Vaikka mutaatiokohta ; voidaan määrittää ennalta, ei ole tarpeen, että mutaation • ·’ 25 luonne sinänsä määritetään ennalta. Esimerkiksi optimiomi- a ·.*.* naisuuksien valitsemiseksi mutanteille tietyssä kohdassa • aa voidaan suorittaa kohdekodonin satunnaismutatointi ja seu- a a a loa ilmennetyt TNF-R-mutantit halutun aktiivisuuden suh-teen.

30 Kaikki mutaatiot TNF-R:ää koodittavassa nukleoti- disekvenssissä eivät ilmenny lopputuotteessa, esimerkiksi ,···, nukleotidisubstituutioita voidaan tehdä ilmennyksen tehos- "* tamiseksi, ensisijaisesti sekundaaristen rakennesilmukoi- ’**’ den välttämiseksi kopioidussa mRNArssa (katso EP-A- *”” 35 75 444A, joka sisällytetään tähän viitteeksi), tai kodo- i a a 18 108645 nien saamiseksi, jotka valittu isäntä helpommin lukee, esim. hyvin tunnetut Eh_ coli ensisijaisuuskodonit ilmennykseen Jh, colissa.

Mutaatioita voidaan tehdä nimenomaisiin kohtiin 5 syntetisoimalla oligonukleotideja, jotka sisältävät mu- tanttisekvenssin, jota sivuavat restriktiokeskukset, jotka mahdollistavat fragmenttien ligatoinnin natiiviin sekvenssiin. Ligatoinnin jälkeen saatu uudelleenrakennettu sekvenssi koodittaa analogia, jossa on haluttu aminohappoin-* 10 sertio, -substituutio tai -deleetio.

Vaihtoehtoisesti oligonukleotidiohjattuja paikka-spesifisiä mutatointimenettelyjä voidaan käyttää muutetun geenin saamiseksi, jossa tiettyjä kodoneja on muutettu tarvittavan substituution, deleetion tai insertion mukai-15 sesti. Esimerkkimenetelmiä edellä esitettyjen muutosten tekemiseksi julkistavat Walder et ai. (Gene 42 (1986) 133); Bauer et ai. (Gene 37 (1985) 73); Craik (BioTechn- iques 1985:tammikuu 12 - 19); Smith et ai. ("Genetic Eng- ineering: Principles and Methods", Plenum Press, 1981); ja 20 US-patenttijulkaisuissa 4 518 584 ja 4 737 462 jul kistetaan sopivia tekniikoita, ja nämä sisällytetään tähän viitteiksi.

, . TNF-R:n sekä yksivalenssiset muodot että moniva- *' lenssiset muodot ovat käyttökelpoisia tämän keksinnön mu- : ·’ 25 kaisissa koostumuksissa ja menetelmissä. Monivalenssisissa • · muodoissa on useita TNF-R-sitoutumiskohtia TNF-ligandille.

•.>t: Esimerkiksi kaksivalenssinen liukoinen TNF-R voi : koostua kahdesta peräkkäisestä toistosta aminohappoja 1 - 235 kuviossa 2, joita erottaa liittosekvenssialue. Vaih-30 toehtoisia monivalenssisia muotoja voidaan niinikään ra-kentaa esimerkiksi kemiallisesti liittämällä TNF-R mihin • · #...i tahansa kliinisesti hyväksyttävään kantomolekyyliin, poly- meeriin, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Ficoll, polyetyleeniglykoli tai dekstraani, käyttäen tavanomaisia ’F" 35 kytkemistekniikoita. Vaihtoehtoisesti TNF-R voidaan ke- I > » i 19 108645 miallisesti kytkeä biotiiniin, minkä jälkeen biotiini-TNF-R-konjugaatin annetaan sitoutua avidiiniin, jolloin saadaan nelivalenssisia avidiini/biotiini/TNF-R-molekyylejä.

TNF-R voidaan myös liittää kovalenttisesti dinitrofenoliin 5 (DNP) tai trinitrofenoliin (TNP) ja saatu konjugaatti sa-ostaa anti-DNP:llä tai anti-TNP-IgM:llä dekameeristen kon-jugaattien muodostamiseksi, joiden valenssi TNF-R-si-toutumiskeskusten suhteen on 10.

Voidaan samoin muostaa kimeerinen yhdistelmä-DNA-10 vasta-ainemolekyyli, jossa on TNF-R-sekvensseillä substi-tuoitu vaihtuvia alueita immunoglobuliinimolekyylin joko raskaassa tai kevyessä ketjussa tai molemmissa ja jossa on ei-modifioituja pysyvä alue -alueita. Esimerkiksi kimeerinen TNF-R/IgGi voidaan tuottaa kahdesta kimeerisestä 15 geenistä: TNF-R/humaani-kappa-kevyt ketju-kimeeristä (TNF-R/ C kappa) ja TNF-R/humaani-gammai-raskas ket ju-kimeeristä (TNF-R/Cgamma-i) · Kahden kimeerisen geenin kopioinnin ja luennan jälkeen geenituotteet kokoontuvat yhdeksi kimeeri-seksi vasta-ainemolekyyliksi, jossa TNF-R esiintyy kaksi-20 valenssisesti. Tällaisilla monivalenssisilla TNF-R-muo-doilla voi olla tehostunut sitoutumisaffiniteetti TNF-li-gandille. Lisää yksityiskohtia koskien tällaisten ki-. . meeristen vasta-ainemolekyylien rakentamista julkistetaan ;t ; patenttijulkaisuissa WO 89/09622 ja EP-315 062.

·’ 25 Yhdistelmä-DNA-TNF-R: n ilmennys • · TNF-R:ää koodittavan DNA:n vahvistamiseksi tai il- • « ♦ mentämiseksi voidaan käyttää yhdistelmä-DNA-ilmennys-vektoreita. Yhdistelmä-DNA-ilmennysvektorit ovat replikoi-tuvia DNA-rakenteita, joissa on synteettisiä tai cDNA-30 peräisiä DNA-fragmentteja, jotka koodittavat nisäkäs-TNF-R:ää tai bioekvivalenttisia analogeja ja jotka on opera- » » t···, tiivisesti kytketty sopiviin kopiointia tai luentaa sääte- leviin yksiköihin, jotka ovat peräisin nisäkäs-, mikrobi-, ’*"· virus- tai hyönteisgeeneistä. Kopiointiyksikkö käsittää 35 yleensä yhdistelmän, jossa on (1) yksi tai useampi geneet- » · · » I t » 108645 20 tinen yksikkö, jolla on säätelevä osa geeni-ilmennyksessä, esimerkiksi kopiointipromoottorit tai -tehostimet, (2) rakenne- tai koodisekvenssi, joka kopioidaan mRNArksi ja luetaan proteiiniksi, ja (3) tarkoituksenmukaisia kopioin-5 nin ja luennan käynnistäviä ja päättäviä sekvenssejä, ku ten kuvataan yksityiskohtaisesti alla. Tällaiset säätöyk-siköt voivat käsittää operaattorisekvenssin kopioinnin kontrolloimiseksi, joka sekvenssi koodittaa sopivia mRNA-ribosomisitoutumiskeskuksia. Kyky replikoitua isännässä, 10 tavallisesti replikaatioalkukohdan mukanaan tuomana, ja valikointigeeni transformanttien tunnistuksen helpottamiseksi voi niinikään sisältyä mukaan. DNA-alueet ovat operatiivisesti kytketyt, kun ne funktionaalisesti liittyvät toisiinsa. Esimerkiksi signaalipeptidin DNA (eritysjoh-15 tosekvenssi) on operatiivisesti kytketty polypeptidin DNAihan, jos se ilmentyy prekursorina, joka osallistuu polypeptidin eritykseen; promoottori on operatiivisesti kytketty koodisekvenssiin, jos se kontrolloi sekvenssin kopiointia; tai ribosomisitoutumiskeskus on operatiivisesti 20 kytketty koodisekvenssiin, jos se on sijoitettu siten, et tä luenta on mahdollista. Yleensä operatiivisesti kytketty merkitsee jatkuvaa, ja eritysjohtosekvenssien kohdalla . . jatkuvaa ja lukualueella olevaa. Hiivailmennyssysteemeissä '' ‘ käytettäviksi tarkoitettuihin rakenneyksiköihin kuuluu • · · • ·' 25 edullisesti johtosekvenssi, jonka ansiosta isäntäsolu voi • · V." erittää ulkopuolelleen luetun proteiinin. Vaihtoehtoisesti • · · ilmennettäessä yhdistelmä-DNA-proteiini ilman johto- tai kuljetussekvenssiä se voi käsittää N-päämetioniinitähteen.

Tämä tähde voidaan mahdollisesti sittemmin lohkaista il- • * · 30 mennetystä yhdistelmä-DNA-proteiinista lopputuotteen saa-miseksi.

• · ... DNA-sekvenssit, jotka koodittavat nisäkäs-TNF-re- septoreita, jotka on määrä ilmentää mikro-organismissa, eivät edullisesti sisällä introneja, jotka saattaisivat 35 ennenaikaisesti päättää DNA:n kopioinnin mRNA:ksi; kuiten-

I · I » I

108645 21 kin kopioinnin ennenaikainen päättyminen voi olla toivottavaa esimerkiksi silloin, kun se johtaisi mutantteihin, joissa on edullisia C-päätypistyksiä, esimerkiksi trans-membraanialueen deleetio liukoisen reseptorin saamiseksi, 5 joka ei ole sitoutunut solumembraaniin. Koodin degeneraat-tiluonteen johdosta saattaa ilmetä huomattavaa vaihtelua nukleotidisekvensseissä, jotka koodittavat samaa aminohapposekvenssiä. Muita suoritusmuotoja ovat sekvenssit, jotka kykenevät hybridisoitumaan annetun cDNA:n sekvensseihin ‘ 10 kohtuullisen ankarissa olosuhteissa (50 °C, 2x SSC), ja muita sekvenssejä, jotka hybridisoituvat biologisesti aktiivisia TNF-reseptoripolypeptidejä koodittaviin tai ovat degeneroituneita mainittuihin nähden.

Yhdistelmä-DNA-TNF-R-DNA ilmennetään tai vahviste-15 taan yhdistelmä-DNA-ilmennyssysteemissä, joka käsittää oleellisesti homogeenisen sopivan isäntämikro-organismin puhdasviljelmän, esimerkiksi bakteerista kuten |h_ colista tai hiivasta kuten S^_ cerevisiaestä, jotka ovat stabiilista integroineet (transformoinnin tai transfektoinnin 20 tuloksena) yhdistelmä-DNA-kopiointiyksikön kromosomi-DNA:han tai jotka käsittävät yhdistelmä-DNA-kopiointiyk-sikön läsnä olevan plasmidin rakenneosana. Yleensä sys-. . teemin muodostavat solut ovat yhden kantatransformantin ;* ; jälkeläisiä. Tässä määritellyt yhdistelmä-DNA-ilmennyssys- • · · • ·* 25 teemit ilmentävät heterologisen proteiinin, kun ilmennet- • · tävään DNA-sekvenssiin tai synteettiseen geeniin kytketyt säätöyksiköt indusoidaan.

: *. Transformoidut isäntäsolut ovat soluja, jotka on ·/“: transformoitu tai transfektoitu TNF-R-vektoreilla, jotka 30 on rakennettu käyttäen yhdistelmä-DNA-tekniikoita. Trans-formoidut isäntäsolut ilmentävät tavallisesti TNF-R:n, • » S··' mutta isäntäsolujen, jotka on transformoitu TNF-R-DNA:n kloonaus- tai monistustarkoituksessa, ei tarvitse ilmentää '·' · TNF-R:ää. Ilmennetty TNF-R varastoituu solumembraaniin tai 35 tulee eritetyksi viljelmäsupernatanttiin riippuen väli- * > » I » · i i i • · 22

1 ö 8 6 4 S

I tusta TNF-R-DNA:sta. Sopivia isäntäsoluja nisäkäs-TNF-R:n ilmentämiseksi ovat prokaryootit, hiiva- tai korkeammat eukaryoottiset solut tarkoituksenmukaisten promoottorien kontrollissa. Prokaryootteihin lukeutuu gram-negatiivisia 5 tai gram-positiivisia organismeja, esimerkiksi EL_ coli tai basillit. Korkeampia eukaryoottisia soluja ovat nisä-käsalkuperää olevat vakiintuneet solulinjat kuten alla kuvataan. Soluja sisältämättömiä luentasysteemejä voitaisiin niinikään käyttää nisäkäs-TNF-R:n tuottamiseksi käyttäen 10 RNA-sekvenssejä, jotka on saatu edellä kuvatuista DNA-rakenteista. Tarkoituksenmukaisia kloonaus- ja ilmennys-vektoreita käytettäviksi bakteeri-, sieni-, hiiva- ja ni-säkässoluisäntien kanssa kuvaavat Pouwels et ai. ("Cloning Vectors: A Laboratory Manual", Elsevier, New York, 1985), 15 jonka oleellinen julkistus sisällytetään tähän viitteeksi.

Prokaryoottisia ilmennysisäntiä voidaan käyttää TNF-R:n ilmentämiseksi, joka ei tarvitse laajamittaista proteolyysi- ja disulfidiprosessointia. Prokaryoottiset ilmennysvektorit käsittävät yleensä yhden tai useamman fe- 20 notyyppivalikointimerkin, esimerkiksi geenin, joka koo- dittaa proteiineja, jotka tuovat antibioottiresistenssin, tai täyttävät autotrofiavaatimuksen, sekä isännän tunnis- . . tämän replikaatioalkukohdan vahvistuksen isännässä varmis- • · • · · ; tamiseksi. Sopivia prokaryoottisia isäntiä transformoin- • · t : ·' 25 tiin ovat E. coli, Bacillus subtilis. Salmonella tvphimu- • * ·.*.* rium ja eri lajit suvuista Pseudomonas, Streptomyces ja • < · **,,,· Staphylococcus, vaikka valinnan mukaan voidaan käyttää • · · : *. muitakin.

• t I

Bakteerikäyttöön käyttökelpoiset ilmennysvektorit 30 voivat käsittää valikointimerkin ja bakteeriperäisen rep-likaatioalkukohdan, joka on saatu kaupallisesti saatavina .··, olevista plasmideista ja joka käsittää geeniyksiköitä hy- T vin tunnetusta kloonausvektorista pBR322 (ATCC 37017).

• · Tällaisia kaupallisia vektoreita ovat esimerkiksi pKK223-3 'F*: 35 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi) ja pGEMl (Pro- » * »

» I

108645 23 mega Biotec, Madison, WI, USA). Nämä pBR322-"runko"-osat yhdistetään tarkoituksenmukaiseen promoottoriin ja ilmennettävään rakennesekvenssiin. JL_ coli transformoidaan tyypillisesti käyttäen pBR322-johdannaisia, joka plasmidi 5 saadaan EL_ coli -lajista (Bolivar et ai ♦, Gene 2 (1977) 95). pBR322 sisältää geenit ampisilliini- ja tetrasyklii-niresistenssille ja antaa siten yksinkertaisen keinon transformoitujen solujen tunnistamiseksi.

Yhdistelmä-DNA-mikrobi-ilmennysvektoreissa tavan-10 omaisesti käytettyjä promoottoreita ovat β-laktamaasi-(penisillinaasi-) ja laktoosipromoottorisysteemi (Chang et ai., Nature 275 (1978) 615; ja Goeddel et ai., Nature 281 (1979) 544), tryptofaani- (trp-) promoottorisysteemi (Goeddel et ai,, Nucl.Acids Res. 8^ (1980) 4057; ja EP-A-15 36 776) sekä tac-promoottori (Maniatis, "Molecular Clon ing: A Laboraroty Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 412). Erityisen käyttökelpoisessa bakteeri-ilmen-nyssysteemissä käytetään lambdafagi-PL-promoottoria ja lä-mpölabiilia cl857ts-repressoria. Talletuslaitoksesta the 20 American Type Culture Collection saatavana olevia plasmidi vektoreita, jotka sisältävät lambda-PL-promoottorijohdannaisia, ovat plasmidi pHUB2, joka on läsnä EL_ coli . . -kannassa JMB9 (ATCC 37092) , ja pPLc28, joka on läsnä f EL coli RRl: ssä (ATCC 53082) .

♦ » · : ·’ 25 Yhdistelmä-DNA-TNF-R-proteiineja voidaan niinikään « · ·.*.* ilmentää hiivaisännissä, edullisesti Saccharomyces-lajis- i i · :,t,: ta, kuten S_^ cerevisiaessä. Voidaan käyttää muidenkin su- : _*· kujen hiivoja, kuten Pichia tai Kluyveromyces. Hiivavek- torit sisältävät yleensä replikaatioalkukohdan 2p-hiiva-30 plasmidista tai autonomisesti replikoituvan sekvenssin (ARS), promoottorin, TNF-R:ää koodittavan DNA:n, sekvens-sit polyadenylaatiolle sekä kopioinnin lopettamiseksi, ja valikointigeenin. Edullisesti hiivavektoreissa on repli-· kaatioalkukohta ja valikointimerkki, jotka mahdollistavat 35 transformoinnin sekä hiivaan että EL_ coliin, esim. ampi- i t % t * l t ft I )

I t I

a t*

I I

24 108645 silliiniresistenssigeenin Eh_ colista ja cerevisiaestä TRP1- tai URA3-geenin, josta saadaan valikointimerkki hiivan mutanttikannalle, jolta puuttuu kyky kasvaa tryptofäänillä, sekä promoottorin, joka on peräisin voimakkaasti 5 ilmentyvästä hiivageenistä, alavirran rakennesekvenssin kopioinnin indusoimiseksi. TRP1- tai URA3-puutoksen esiintymisestä hiivaisäntäsolugenomissa saadaan sitten tehokas ympäristö transformoinnin toteamiseksi kasvusta tryptofaa-nin tai urasiilin puuttuessa.

10 Sopivia promoottorisekvenssejä hiivavektoreihin ovat promoottorit metallotioneiinille, 3-fosfoglyseraat-tikinaasille (Hitzeman et ai., J.Biol.Chem. 255 (1980) 2073) tai muille glykolyyttisille entsyymeille (Hess et ai. , J. Adv. Enzyme Reg. Ί_ (1968) 149; ja Holland et ai., 15 Biochem. 17 (1978) 4900), kuten enolaasi, glyseraldehydi- 3-fosfaattidehydrogenaasi, heksokinaasi, pyruvaattidekar-boksylaasi, fosfofruktokinaasi, glukoosi-6-fosfaatti-iso-meraasi, 3-fosfoglyseraattimutaasi, pyruvaattikinaasi, trioosifosfaatti-isomeraasi, fosfoglukoosi-isomeraasi ja 20 glukokinaasi. Sopivia vektoreita ja promoottoreita käytettäviksi hiiva-ilmennyksessä kuvataan edelleen julkaisussa R. Hitzeman et ai. EP-A-73 657.

, . Edullisia hiivavektoreita voidaan koota käyttäen j’ i* DNA-sekvenssejä pUC18:sta valikointiin ja replikaatioon : ·* 25 Eh_ colissa (Ampr-geeni ja replikaatioalkukohta) ja hiiva- DNA-sekvenssejä, joihin kuuluu glukoosirepressoituva ADH2-promoottori ja α-tekijäeritysjohtosekvenssi. ADH2-promoot-; ; toria ovat kuvanneet Russell et ai. (J. Bio!.Chem. 258 (1982) 2674) ja Beier et ai. (Nature 300 1982 724) . Hiiva-30 α-tekijäjohtosekvenssi, joka ohjaa heterologisten pro-teiinien eritystä, voidaan insertoida promoottorin ja il-.mennettävän rakennegeenin väliin. Katso esim. Kurjan et ‘I* ai., Cell 30 (1982) 933; ja Bitter et ai., Proc.Natl. -

Acad.Sci. USA 81 (1984) 5330) . Johtosekvenssiä voidaan mo-*:*': 35 difioida sisältämään lähellä 3’-päätään yhden tai useamman I * » 108645 25 käyttökelpoisen restriktiokeskuksen johtosekvenssin fuusion vierasgeeneihin helpottamiseksi.

Sopivia hiivatransformointiprotokollia on alan ammattilaisten tiedossa; esimerkkitekniikkaa kuvaavat Hinnen 5 et ai. , Proc.Natl.Aca.Sei. USA 75 (1978) 1929, jonka mu kaan Trp+-transformantit valitaan selektiivisessä kasvualustassa, joka sisältää 0,67 % hiivatyppiemästä, 0,5 % kasaminohappoja, 2 % glukoosia, 10 pg/ml adeniinia ja 20 pg/ml urasiilia, tai URA+-transformantit kasvualustas-10 sa, joka sisältää 0,67 % YNB:tä, käyttäen aminohappoja ja emäksiä kuten ovat kuvanneet Sherman et ai., "Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986.

Isäntäkantoja, jotka on transformoitu ADH2-15 promoottorin käsittävillä vektoreilla, voidaan kasvattaa ilmennettäviksi rikkaassa kasvualustassa, joka sisältää 1 %:n hiivauutetta, 2 % peptonia, ja 1 %:n tai 4 % glukoosia ja jota on täydennetty 80 pg:lla/ml adeniinia ja 80 pg:lla/ml urasiilia. ADH2-promoottorin derepressio tapah-20 tuu kasvualustaglukoosin loppuessa. Epäpuhtaat hiivasu- pernatantit otetaan talteen suodattamalla ja niitä pidetään 4 °C:ssa ennen jatkopuhdistusta.

, , Erilaisia nisäkäs- tai hyönteissoluviljelysystee- I ·’ mejä käytetään niinikään edullisesti yhdistelmä-DNA-pro- • · · • ·' 25 teiinin ilmentämiseksi. Yhdistelmä-DNA-proteiinien ilmen- • » *.*’.· täminen nisäkässoluissa on erityisen edullista, koska täl- • laiset proteiinit ovat yleensä oikein laskostuneita, tar-koituksenmukaisesti modifioituja ja täysin funktionaali-siä. Esimerkkejä sopivista nisäkäsisäntäsolulinjoista ovat » * · 30 apinan munuaissolujen COS-7-solulinjat, joita kuvaa Gluz-,,,,: man (Cell 23 (1981) 175) , sekä muut solulinjat, jotka ky- ... kenevät ilmentämään tarkoituksenmukaisen vektorin, mukaan i lukien esimerkiksi L-solut, C127-, 3T3-, kiinalaisen hams-terin munasarja- (CHO-) , HeLa- ja BHK-solulinjät. Nisäkäs-35 ilmennysvektorit voivat käsittää ei-kopioituja yksiköitä I » » I i ) i i I < t I * • I · I » 108645 26 kuten replikaatioalkukohta, sopiva promoottori ja tehostin kytkettyinä ilmennettävään geeniin, ja muita sivuavia ei-kopioituja 5'- tai 3'-sekvenssejä, ja ei-luettuja 5'- tai 3'-sekvenssejä, kuten välttämättömät ribosomisitoutumis-5 keskukset, polyadenylaatiokeskus, silmukan luovuttaja- ja vastaanottajakeskukset, ja kopioinninpäätössekvenssit. Katsauksen bakulovirussysteemeistä heterologisten proteiinien tuottamiseksi hyönteissoluissa esittävät Luckow ja Summers, Bio/Technology 6 (1988) 47.

' ! 10 Kopioinnin ja luennan kontrollisekvenssit ilmen- nysvektoreissa, joita on määrä käyttää selkärankaissolujen transformoimiseksi, voidaan saada viruslähteistä. Esimerkiksi tavanomaisesti käytettyjä promoottoreita ja tehostumia saadaan polyoomasta, adenovirus-2:sta, apinavirus-15 40:stä (SV40) ja ihmisen sytomegaloviruksesta. SV40-virus-genomista saatuja DNA-sekvenssejä, esimerkiksi SV40-alku-kohtaa, varhais- ja myöhäispromoottoria, tehostinta, sil-mukoimis- ja polyadenylaatiokeskuksia voidaan käyttää muiden geneettisten yksiköiden saamiseksi, joita tarvitaan 20 heterologisen DNA-sekvenssin ilmentämiseksi. Varhais- ja myöhäispromoottorit ovat erityisen käyttökelpoisia, koska molemmat saadaan helposti viruksesta fragmenttina, joka sisältää myös SV40-virusreplikaatioalkukohdan (Fiers et ·.·. ai. , Nature 273 (1978) 113). Pienempiä tai suurempia SV40- *.. *. 25 fragmentteja voidaan niinikään käyttää edellyttäen, että • · ) mukaan sisältyy noin 250 ep:n sekvenssi, joka ulottuu • ·

Hind3-keskuksesta Bqll-keskukseen, joka sijaitsee viruksen '··' replikaatioalkukohdassa. Edelleen nisäkkään genomi-TNF-R- ·...’ promoottori-, kontrolli- ja/tai signaalisekvenssejä voi- I I · • >t,· 30 daan käyttää edellyttäen, että tällaiset kontrollisekvens sit sopivat yhteen valitun isäntäsolun kanssa. Lisää yksi- ;·*· tyiskohtia koskien nisäkäskorkeailmennysvektorin käyttöä .’··. yhdistelmä-DNA-nisäkäs-TNF-reseptorin tuottamiseksi esi- • t tetään esimerkeissä 2 ja 7 alla. Esimerkkivektoreita voi- 35 daan rakentaa kuten ovat kuvanneet Okayama ja Berg 11*1· • ♦ • » · • · · • · 108645 27 .

(Mol.Cell.Biol. 3 (1983) 280).

Käyttökelpoinen systeemi nisäkäsreseptori-cDNA-sekvenssien stabiiliksi ilmentämiseksi korkeina tasoina C127-hiiririntarauhasepiteelisoluissa voidaan rakentaa 5 oleellisesti kuten ovat kuvanneet Cosman et ai. (Mol. Immunol. 23 (1986) 935).

Edullisesti TNF-R-cDNA-sekvenssejä käsittävät yh-distelmä-DNA-ilmennysvektorit on stabiilisti integroitu isäntäsolun DNA:hän. Kohonneita määriä ilmennystuotetta 10 saadaan valikoimalla solulinjoja, joissa on monistettua vektori-DNA:ta. Solulinjat, joissa on monistettua vektori-DNA:ta, valitaan esimerkiksi transformoimalla isäntäsolu vektorilla, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa entsyymiä, jonka inhiboi tunnettu lääke. Vektori voi niin-15 ikään käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa halutun proteiinin. Vaihtoehtoisesti isäntäsolu voidaan yh-teistransformoida toisella vektorilla, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa halutun proteiinin. Transformoituja tai yhteistransformoituja isäntäsoluja viljellään 20 sitten tunnetun lääkkeen kasvavissa pitoisuuksissa, jol loin valikoidaan lääkkeelle resistenttien solujen suhteen. Tällaiset lääkeresistentit solut jäävät henkiin myrkyllisen lääkkeen pitoisuuksien kasvaessa tuottamalla run-*.·. säästi entsyymiä, jonka lääke inhiboi, usein seurauksena 25 entsyymiä koodittavan geenin vahvistumisesta. Silloin kun ! lääkeresistenssin on aiheuttanut kasvu inhiboitavaa ent- syymiä koodittavan vektori-DNA:n kopioluvussa, on samalla ’ ”* tapahtunut haluttua proteiinia (TNF-R:ää) koodittavan vek- tori-DNA:n yhteisvahvistuminen isäntäsolun DNA:ssa.

I s t 30 Edullisessa systeemissä tällaiseksi yhteisvahvis- tamiseksi käytetään dihydrofolaattireduktaasi- (DHFR-) ·;···. geeniä, joka voidaan inhiboida lääkkeellä metotreksaatti (MTX) . Yhteisvahvistukseen pääsemiseksi isäntäsolu, josta • # puuttuu aktiivinen DHFR:ää koodittava geeni, joko trans- 35 formoidaan vektorilla, joka käsittää DHFR:ää ja haluttua » » » » » » » 108645 28 proteiinia koodittavan DNA-sekvenssin, tai se yhteistrans-formoidaan vektorilla, joka käsittää DHFR:ää koodittavan DNA-sekvenssin, ja vektorilla, joka käsittää haluttua proteiinia koodittavam DNA-sekvenssin. Transformoituja tai 5 yhteistransformoituja isäntäsoluja viljellään kasvualustassa, joka sisältää kasvavia MTX-tasoja ja eloonjäävät solulinjat valitaan.

Erityisen edullisessa yhteismonistussysteemissä käytetään glutamiinisyntetaasi-(GS-)geeniä, joka on vas-' 10 tuussa glutamaatin ja ammoniakin synteesistä käyttäen ATP:n hydrolyysiä ADP:ksi ja fosfaatiksi reaktion ylläpitämiseksi. GS:ää inhiboivat monet erilaiset inhibiittorit, esimerkiksi metioniinisulfoksimiini (MSX). Täten TNF-R voidaan ilmentää korkeina pitoisuuksina yhteisvahvistamal-15 la soluja, jotka on transformoitu vektorilla, joka käsittää DNA-sekvenssin GS:lle ja halutulle proteiinille, tai yhteistransformoitu vektorilla, joka käsittää GS:ää koodittavan DNA-sekvenssin, ja vektorilla, joka käsittää haluttua proteiinia koodittavan DNA-sekvenssin, minkä jäl-20 keen isäntäsoluja viljellään kasvualustassa, joka sisältää kasvavia MSX-tasoja, ja valikoidaan eloonjääneiden solujen suhteen. GS-yhteismonistussysteemiä, tarkoituksenmukaisia yhdistelmä-DNA-ilmennysvektoreita ja solulinjoja kuvataan ·.·. seuraavissa PCT-patenttihakemusjulkaisuissa: WO 87/04 462, 25 W0 89/01 036, WO 89/10 404 ja WO 86/05 807.

\ ! Yhdistelmä-DNA-proteiinit ilmennetään edullisesti ; ; yhteisvahvistamalla DHFR tai GS nisäkäsisäntäsolussa, ku- '··** ten kiinalaisen hamsterin munasarja- (CHO-) soluissa, tai ...’ vaihtoehtoisesti hiiren myeloomasolulinjassa, kuten * * · 30 SP2/0Agl4 tai NSO tai rotan myeloomasolulinjassa, kuten YB2/3.0-Ag20, jotka julkistetaan PCT-patenttihakemusjul-·;··; kaisuissa WO 89/10 404 ja WO 86/05 807.

Edullinen eukaryoottinen vektori TNF-R-DNA:n il- • , mentämiseksi julkistetaan alla esimerkissä 2. Tämä vekto- 35 ri, jota kutsutaan pCAV/NOT:ksi, saatiin nisäkäskorkeail- • · • I ·

• I I

I · 108645 29 ' mennysvektorista pDC201 ja se sisältää säätösekvenssejä SV40:stä, adenovirus-2:sta ja ihmisen sytomegalovirukses-ta.

Yhdistelmä-DNA-TNF-R:n puhdistaminen 5 Puhdistettuja nisäkäs-TNF-reseptoreita tai analo geja valmistetaan viljelemällä sopivia isäntä/vektorisys-teemejä yhdistelmä-DNA-luentatuotteiden ilmentämiseksi edellä kuvatuista DNA-sekvensseistä ja puhdistamalla ne sitten viljelykasvualustasta tai solu-uutteista.

10 Esimerkiksi supernatantteja systeemeistä, jotka erittävät yhdistelmä-DNA-proteiinin kasvualustaan, voidaan ensin konsentroida käyttäen kaupallisesti saatavana olevaa proteiinikonsentrointisuodatinta, esimerkiksi Amiconin tai Milliporen ultrasuodatusyksikköä. Konsentrointivaiheen 15 jälkeen konsentraatti voidaan panostaa sopivaan puhdistus-matriisiin. Esimerkiksi sopiva affiniteettimatriisi voi käsittää TNF- tai lektiini- tai vasta-ainemolekyylin sidottuna sopivaan tukeen. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää anioninvaihtohartsia, esimerkiksi matriisia tai substraat-20 tia, jossa on riippuvia dietyyliaminoetyyli- (DEAE-) ryhmiä. Matriisit voivat olla akryyliamidia, agaroosia, deks-traania, selluloosaa tai muita tyyppejä, joita tavanomaisesti käytetään proteiinien puhdistuksessa. Vaihtoehtoi-V. sesti voidaan käyttää kationinvaihtovaihetta. Sopivia ka- 25 tioninvaihtajia ovat erilaiset ei-liukoiset matriisit, • · * jotka käsittävät sulfopropyyli- tai karboksimetyyliryhmiä. Sulfopropyyliryhmät ovat edullisia.

• · *···1 Lopuksi TNF-R-koostumuksen puhdistamiseksi edel- < 1 · ·...1 leen voidaan käyttää yhtä tai useampaa käänteisfaasikor- • · · 30 keapainenestekromatografia- (RP-HPLC-) vaihetta käyttäen hydrofobista RP-HPLC-alustaa, esim. silikageeliä, jossa on ·;··· riippuvia metyyliryhmiä tai muita alifaattisia ryhmiä.

.··. Joitakin tai kaikkia edeltäviä puhdistusvaiheita erilai- • t sinä yhdistelminä voidaan samoin käyttää homogeenisen yh- 35 distelmä-DNA-proteiinin saamiseksi.

(MM

· · • » » ψ 1 108645 30

Bakteeriviljelmässä tuotettu yhdistelmä-DNA-pro-teiini eristetään tavallisesti ensin uuttamalla solupel-lettejä, minkä jälkeen suoritetaan yksi tai useampi kon-sentrointi-, ulossuolaus-, vesi-ioninvaihto- tai kokoeks-5 kluusiokromatografiavaihe. Lopuksi korkeapainenestekroma- tografiaa (HPLC) voidaan käyttää viimeisissä puhdistus-vaiheissa. Yhdistelmä-DNA-nisäkäs-TNF-R:n ilmentämiseksi käytetyt mikrobisolut voidaan rikkoa millä tahansa kätevällä menetelmällä, mukaan lukien jäädytys/sulatuskierrä-10 tys, ultraäänikäsittely, mekaaninen rikkominen tai solujen lyysin aikaansaavien aineiden käyttö.

Nisäkäs-TNF-R:n eritettynä proteiinina ilmentävän hiivan fermentointi yksinkertaistaa suuresti puhdistusta. Fermentaatiosta suuressa mittakaavassa saatua eritettyä 15 yhdistelmä-DNA-proteiinia voidaan puhdistaa menetelmillä, jotka ovat analogisia menetelmiin nähden, joita ovat julkistaneet Urdal et ai. (J.Chromatoq. 296 (1984) 171). Tässä julkaisussa kuvataan kahta peräkkäistä käänteisfaasi-HPLC-vaihetta yhdistelmä-DNA-ihmis-GM-CSF:n puhdistamisek-20 si preparatiivisessa HPLC-kolonnissa.

Yhdistelmä-DNA-viljelmässä syntetisoidulle humaa-ni-TNF-R:lle on karakteristista ei-ihmissolurakenneosien, mukaan lukien proteiinien, läsnäolo määrinä ja tyyppinä, ·.·. jotka riippuvat humaani-TNF-R:n talteenottamiseksi viljel- 25 mästä käytetyistä puhdistusmenetelmistä. Nämä rakenneosat ! ovat tavallisesti alkuperältään hiivaprokaryooteista tai *;// korkeammista ei-humaanieukaryooteista, ja niitä on edul- *··' lisesti läsnä harmittomina kontaminoivina määrinä suuruus- ,,,* luokiltaan alle noin 1 paino-%. Edelleen yhdistelmä-DNA- 30 soluviljelmällä on mahdollista tuottaa TNF-R:ää, joka ei sisällä proteiineja, joita voi normaalisti liittyä TNF-·;·· R:ään sellaisena kuin se esiintyy luonnossa alkuperälajis- saan, esim. soluissa, solu-ulosvirtausnesteissä tai ruu-’ , miin nesteissä.

35 Seuraavat esimerkit esitetään havainnollistavassa 10864b 31 eikä rajaavassa tarkoituksessa.

Esimerkkejä Esimerkki 1 Sitoutumismäärityksiä 5 A. TNF-a:n ja TNF-B:n radioleimaus. Yhdistelmä- DNA-humaani-TNF-a ilmennettiin fuusioproteiinin muodossa, joka sisältää hydrofiilisen oktapeptidin N-päässä, hiivassa erittyvänä proteiinina ja se puhdistettiin affini-teettikromatografisesti (Hopp et ai., Bio/Technoloqy 6 10 (1988) 1204) . Puhdistettu yhdistelmä-DNA-humaani-TNF-β hankittiin valmistajalta R&D Systems (Minneapolis, MN) . Molemmat proteiinit radioleimattiin käyttäen kaupallisesti saatavana olevaa kiinteäfaasiainetta, Iodo-Gen (Pierce). Tässä menettelyssä 5 pg Iodo-Gen-tuotetta maljättiin 10 x 15 75 mm:n lasiputken pohjalle ja inkuboitiin 20 minuutin ajan 4 °C:ssa 75 piillä 0,1 M natriumfosfaattiliuosta, pH 7,4, ja 20 pl:lla (2 mCi) Na125I:tä. Tämä liuos siirrettiin sitten toiseen lasiputkeen, joka sisälsi 5 pg TNF-a:aa (tai TNF-5:aa) 45 piissä PBS:ää, 20 minuutiksi 20 4 °C:ssa. Reaktioseos fraktioitiin geelisuodattamalla 2 ml:n petitilavuuden Sephadex G-25 -tuotetta (Sigma) läpi, jota oli tasapainotettu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 -kasvualustassa, joka sisälsi 2,5 % (w/v) nautaseerumialbumiinia (BSA), 0,2 % (w/v) natriumatsidia b 25 ja pitoisuuden 20 mM Hepes, pH 7,4 (sitoutumiskas- ; vualusta) . Lopullinen 125I-TNF-pooli laimennettiin sitoutu- miskasvualustaan työvarastoliuokseksi, jonka pitoisuus oli 1 x 10"7 M, ja jota varastoitiin aina kuukauden ajan 4 °C:ssa ilman todettavaa reseptorisitoutumisaktiivisuuden 30 menetystä. Spesifinen aktiivisuus on tavanomaisesti 1 x 106 tuiketta/min/mmol TNF:ää.

• ;··; B. Sitoutuminen ehyisiin soluihin. Sitoutumismää- ritykset ehyillä soluilla suoritettiin kahdella menetel-• . mällä. Ensimmäisessä menetelmässä soluja kasvatettiin en- 35 sin joko lietteenä (esim. U937) tai kiinnittämällä kudos- 108645 32 viljelymaljoihin (esim. WI26-VA4-, COS-solut, jotka ilmentävät yhdistelmä-DNA-TNF-reseptorin). Kiinnittyneet solut poistettiin sitten käsittelemällä 5 mM EDTA-liuoksella 10 minuutin ajan 37 °C:ssa. Sitoutumismääritykset suoritet-5 tiin sitten ftalaattiöljyerotusmenetelmällä (Dower et ai., J.Immunol. 132 (1984) 751) oleellisesti kuten ovat kuvanneet Park et al^_ (J.Biol.Chem. 261 (19 8 6 ) 4 1 77). 125I-TNF:n ei-spesifinen sitoutuminen mitattiin 200-kertaisen tai suuremman mooliylimäärän ei-leimattua TNF:ää läsnä olles-: 10 sa. Natriumatsidia (0,2 %) sisällytettiin sitoutumis- määritykseen I-TNF:n siirtymisen solujen sisään estämiseksi. Toisessa menetelmässä testattiin COS-solujen, jotka oli transfektoitu TNF-R:n sisältävällä plasmidilla ja jotka ilmensivät pinnallaan TNF-reseptoreita, kykyä sitoa 15 125I-TNF:ää maljasitoutumismäärityksellä, jota ovat kuvan- neet Sims et ai. (Science 241 (1988) 585).

C. Sitoutumismääritykset kiinteässä faasissa. Keino TNF-R:n toteamiseksi saatiin TNF-R:n kyvystä adsorboitua stabiilisti nitroselluloosaan ihmissolujen detergent-20 tiuutteista siten, että TNF-sitoutumisaktiivisuus kuitenkin säilyy. Solu-uutteet valmistettiin sekoittamalla so-lupelletti 2x tilavuuteen PBSrää, joka sisälsi 1 %:n Triton X-100 -valmistetta ja sekoituksen proteaasi-·.*. inhibiittoreita (2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi, 10 25 μΜ pepstatiini, 10 μΜ leupeptiini, 2 mM o-fenantroliini ja 1 2 mM EGTA), kiivaasti vortex-sekoittamalla. Seosta inku- boitiin jäissä 30 minuutin ajan, minkä jälkeen sitä sent-*·*·’ rifugoitiin 12 000 x g:ssä 15 minuutin ajan 8 °C:ssa tumi- I « i :...· en ja muun jätteen poistamiseksi. Kahden mikrolitran erät » » · :,,,· 30 solu-uutteita sijoitettiin kuiville BA85/21- nitroselluloosamembraaneille (Schleicher & Schuell, Keene, ·;··; NH) ja annettiin kuivaa. Membraaneja inkuboitiin kudosvil- jelymaljoissa 30 minuutin ajan Tris- (0,05 M) puskuroidus- * , sa suolaliuoksessa (0,15 M), pH 7,5, joka sisälsi 3 % 35 (w/v) BSA:ta, ei-spesifisten sitoutumiskeskusten salpaa- 4 I » I » • · • I * • t » » · · » »

I » I

• » » t · 108645 33 naiseksi. Membraani peitettiin sitten seoksella, jossa oli 5 x 10"11 M 125I TNF:ää PBSrssä, jossa oli 3 % BSA:ta, ja inkuboitiin 2 tunnin ajan 4 °C:ssa ravistellen. Tämän ajan kuluttua membraanit pestiin 3 kertaa PBS:llä, kuivattiin 5 ja sijoitettiin Kodak X-Omat AR -filmille 18 tunniksi -70 °C: seen.

Esimerkki 2

Humaani-TNF-R-cDNA:n eristäminen ilmentämällä aktiivinen proteiini suoraan COS-7-soluissa 10 Erilaisia ihmissolulinjoja seulottiin TNF-R-ilmen- nyksen suhteen niiden kyvyn nojalla sitoa I-leimattua TNFrää. Ihmisen sidekudosmuodostussolulinjan WI-26 VA4 todettiin ilmentävän kohtuullisen lukumäärän reseptoreita solua kohden. Tasapainositoutumistutkimukset osoittivat, 15 että solulinja osoitti kaksifaasista I-TNF:n sitomista käsittäen noin 4 000 korkea-affiniteettikeskusta (Ka = 1 x 1010 M-1) ja 15 000 matala-af f initeettikeskusta (Ka = 1 x 108 M”1) solua kohden.

Koon mukaan jaottelematon cDNA-kirjasto rakennet-20 tiin suorittamalla käänteiskopiointi polyadenyloidulle mRNA:lle, joka oli eristetty kokonais-RNA:sta, joka oli uutettu ihmisen sidekudosmuodostus-WI-26 VA4 -soluista, joita oli kasvatettu Phytolacca americana (engl. pokeweed) ·.·. -mitogeenin läsnä ollessa, käyttäen vakiotekniikoita (Gub- t · ♦ 25 ler et ai., Gene 25 (1983) 263; Ausubel et ai., toim., 1 "Current Protocols in Molecular Biology", osa 1, 1987).

• t ·

Solut otettiin talteen aikaansaamalla soluissa lyysi gua-'·*·* nidiinihydrokloridiliuoksessa ja kokonais-RNA eristettiin kuten aiemmin on kuvattu (March et ai., Nature 315 (1985) 30 641) .

Poly A+ -RNA eristettiin oligo-dT-selluloosakroma-*; : tografisesti ja kaksisäikeinen cDNA valmistettiin mene- telmällä, joka oli samanlainen kuin Gublerin ja Hoffmanin , (Gene 25 (1983) 263) . Lyhyesti, poly A+ -RNA muutettiin ’ 35 RNA-cDNA-hybridiksi käyttäen käänteiskopioijaentsyymiä ja , t I · t · I » I * * 34 108645 oligo-dT:tä alukkeena. RNA-cDNA-hybridi muutettiin sitten kaksisäikeiseksi cDNArksi käyttäen RN-aasi-H:ta yhdessä DNA-polymeraasi-I:n kanssa. Saadun kaksisäikeisen cDNA:n päistä tehtiin tasaiset käyttäen T4-DNA-polymeraasia.

5 cDNA:han, jonka päät olivat tasaiset, lisätään EcoRI-liittosekvenssejä (joissa on sisäisiä Not1-keskuksia), jotka oli fosforyloitu vain toisesta päästä (Invitrogen). Liittosekvensseillä varustettua cDNA:ta käsiteltiin T4-po-lynukleotidikinaasilla liittosekvenssin 5'-ylijäämäalueen 10 fosforyloimiseksi ja ligatoitumatta jääneet liittosekvens-sit poistettiin ajamalla cDNA Sepharose CL4B -kolonnissa. Liittosekvensseillä varustettu cDNA ligatoitiin ekvimolaa-riseen pitoisuuteen bakteriofagi lambda-gtlO:n EcoRI;llä leikattuja ja defosforyloituja varsia (Huynh et ai., "DNA 15 Cloning: A Practical Approach"; Glover, toim., IRL Press, ] ss. 49 - 78). Ligatoitu DNA pakattiin fagipartikkeleihin käyttäen kaupallisesti saatavana olevaa pakkausta yhdis-telmä-DNA-tuotekirjaston saamiseksi (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA). Yhdistelmä-DNA-tuotteita 20 vahvistettiin edelleen maljaamalla fagi JL_ coli -kanta c600(hfl”) bakteerimatolle.

Fagi-DNA puhdistettiin saadusta lambda-gtlO-cDNA-kirjastosta ja cDNA-insertit leikattiin pilkkomalla res-*.·, triktioentsyymillä Notl. Suoritettiin pilkkomistuotteiden !. ! 25 elektroforeesi agaroosigeelissä, minkä jälkeen eristettiin ( 2 000 ep:tä suuremmat cDNA-fragmentit.

Saadut cDNA-f ragmentit ligatoitiin eukaryoottiseen '<··* ilmennysvektoriin pCAV/NOT, joka oli suunniteltu ilmentä- ·...* mään sen monikloonauskeskukseen insertoidut cDNA-sekvens- >,"· 30 sit nisäkässoluihin transfektoituna. pCAV/NOT koottiin pDC201:stä (pMLSV-johdannainen, jota ovat aiemmin kuvan-·;·· neet Cosman et ai., Nature 312 (1984) 768), SV40:stä ja sytomegalovirus-DNA: sta ja käsittää järjestyksessä ko- • , pioinnin suunnassa replikaatioalkukohdasta lukien: (1) 35 SV40-sekvenssit koordinaatit 5171-270 mukaan lukien rep- »

• I

I » * 1086^5 35 likaatioalkukohta, tehostinsekvenssit ja varhais- ja myö-häispromoottorit; (2) sytomegalovirussekvenssit mukaan lu kien promoottori- ja tehostinalueet (nukleotidit 671 - +63 sekvenssistä, jonka ovat julkistaneet Boechart et ai.

5 (Cell 41 (1985) 521); (3) adenovirus-2-sekvenssit, jotka sisältävät ensimmäisen eksonin ja osan intronista kolmiosaisen johtosekvenssin ensimmäisen ja toisen eksonin välissä, toisen eksonin ja osan kolmiosaisen johtosekvenssin kolmannesta eksonista sekä monikloonauskeksuksen 10 (MCS), joka sisältää keskukset Xhol:lie, Kpnl:lie,

Smal:lie, Notl:lie ja Bgll:lie; (4) SV40-sekvenssit koordinaatit 4127-4100 ja 2770-2533, joihin sisältyy polyade-nylaatio- ja päätössignaalit varhaiskopioinnille; (5) pBR322:sta peräisin olevia sekvenssejä ja virusliitteiset 15 sekvenssit VAI ja VAII pDC201:stä, jolloin adenovirussek-i venssit 10532-11156 sisältävät VAI- ja VAII-geenit, joita seuraavat pBR322-sekvenssit 4363-2486:sta ja 1094-375:stä, jotka sisältävät ampisilliiniresistenssigeenin ja repli-kaatioalkukohdan.

20 Saadulla WI-26 VA4 -cDNA-kirjastolla pCAV/NOT:ssä transformoitiin L coli -kanta DH5-a, minkä jälkeen yh-distelmä-DNA-tuotteet maljaamalla saatiin noin 800 pesäkettä maljaa kohden, jolloin maljoja käytettiin riittä- • t1t västi, jotta saatiin kaikkiaan noin 50 000 pesäkettä seu- »· » ! !. 25 lontaa kohden. Pesäkkeet raaputettiin kustakin maljasta, ; yhdistettiin pooleiksi ja kustakin poolista valmistettiin • · *·’·' plasmidi-DNA. Pooli-DNA: 11a transfektoitiin sitten ei vie- • · lä yhteenkasvanut kerros apinan COS-7-soluja käyttäen DEAE-dekstraania, ja sitten klorokiinikäsittelyä kuten ί,,,ί 30 ovat kuvanneet Luthman et ai. (Nucl.Acids Res. 11 (1983) 1295) ja McCutchan et ai. (J.Natl.Cancer Inst. 41 (1986) • ;..j 351) . Soluja kasvatettiin sitten viljelmässä 3 päivän ajan .·1·. insertoitujen sekvenssien tilapäisen ilmennyksen saami- • t seksi. Kolmen päivän kuluttua soluviljelmäsupernatantit 35 heitettiin pois ja kustakin maljasta määritettiin so- 1 1 • I » » » 108645 36 ' luyksikerroksien TNF-sitoutuminen seuraavasti. Kolme ml sitoutumiskasvualustaa, joka sisälsi pitoisuuden 1,2 x 10’11 M 125I-leimattua FlagR-TNF:ää, lisättiin kuhunkin maljaan ja maljoja inkuboitiin 4 °C:ssa 120 minuutin ajan.

5 Sitten tämä kasvualusta heitettiin pois ja kukin malja pestiin kerran kylmällä sitoutumiskasvualustalla (joka ei sisältänyt leimattua TNF:ää) ja kahdesti kylmällä PBS:llä. Sitten kunkin maljan reunat rikottiin, jolloin saatiin tasainen levy, joka saatettiin kosketuksiin rönt-10 gensädefilmin kanssa 72 tunniksi -70 °C:ssa monistussuo-dinta käyttäen. TNF-sitoutumisaktiivisuus näkyi valotetuilla filmeillä tummana kohtana suhteellisen tasaista taustaa vasten.

Kun noin 240 000 yhdistelmä-DNA-tuotetta kirjas-15 tosta oli seulottu tällä tavalla, yhden transfektanttipoo-lin havaittiin tarjoavan TNF-sitoutumiskohtia, jotka näkyivät selvästi taustan valotusta vasten.

Jäädytettyä varastokantaa positiivisen poolin bakteereista käyttäen valmistettiin sitten noin 150 pesäkettä 20 käsittäviä maljoja. Näistä maljoista valmistettiin kopiot nitroselluloosasuodattimille, minkä jälkeen maljat raaputettiin ja valmistettiin plasmidi-DNA, joka transfektoi-tiin kuten edellä kuvattiin positiivisen maljan tunnista-V. miseksi. Bakteereja yksittäisistä pesäkkeistä tämän maljan I » · !. 1 25 nitroselluloosakopiosta kasvatettiin 0,2 ml:n viljelminä, *. ! joita käytettiin plasmidi-DNA:n saamiseksi, joka transfek- » · ';// toitiin COS-7-soluihin kuten edellä kuvattiin. Tällä ta- *···* valla eristettiin yksi klooni, klooni-1, joka kykeni indu- soimaan humaani-TNF-R:n ilmennyksen COS-soluilla. Ilmen- t » ·

30 nysvektori pCAV/NOT, joka sisältää TNF-R-DNA-klooni-1: n, on talletettu talletuslaitokseen the American Type Culture ·;··· Collction, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA

(hakunumero 68088) nimellä pCAV/NOT-TNF-R.

* * ♦ 35 > i » I I * I » > » t I I I · * • · » 108645 37

Esimerkki 3

Liukoista hu-TNF-R-delta-235:tä koodittavien cDNA-sekvenssien rakentaminen

Liukoista hu-TNF-R-delta-235: tä koodittava cDNA 5 (jonka sekvenssi on aminohapot 1 - 235 kuviossa 2) raken nettiin leikkaamalla 840 ep:n fragmentti pCAV/NOT-TNF-R:stä restriktioentsyymeillä Notl ja Pvu2. Notl leikkaa pCAV/NOT-TNF-R:n monikloonauskeskuksesta ja Pvu2 leikkaa TNF-R-koodialueelta 20 nukleotidia 5' transmembraa- 10 nialueesta. TNF-R-sekvenssien 3'-pään uudelleenrakentami seksi syntetisoitiin kaksi oligonukleotidia, jotka juotettiin seuraavan oligonukleotidiliittosekvenssin saamiseksi : 15 Pvu 2 BamHl Bgl2 CTGÄAGGGAGCACTGGCGACTAAGGATCCA GACTTCCCTCGTGACCGCTGATTCCTAGGTCTAG AlaGluGlySerThrGlyAspLoppu 20 Tässä oligonukleotidiliittosekvenssissä on päässä sijaitsevat Pvu2- ja Bgl2-restriktiokeskukset, se luo uudelleen 20 nukleotidia TNF-R:ää, joita seuraa päätöskodoni (alleviivattu) ja BamHI-restriktiokeskus (kätevyyden vuok-·,·. si eristettäessä liukoinen TNF-R kokonaisuudessaan I I · 25 Notl/BamHI-pilkkomisella. Tämä oligonukleotidi liqatoitiin ·, \ sitten 840 ep:n Notl/Pvu2-TNF-R-insertin kanssa Bgl2/~ ''’l* Notl: llä leikattuun pCAV/NOT:hen, jolloin saatiin psolhu- '...* TNF-R-delta-235/CAVNOT, joka transfektoitiin COS-7-solui- hin kuten edellä kuvattiin. Tämä ilmennysvektori indusoi » * * !ii(! 30 liukoisen humaani-TNF-R:n ilmennyksen, joka kykeni sito maan TNFrää.

* t I « i # I » I I t t · t

Iitti » l I * * | | · » * • · » » » I I $ » 108645 38

Esimerkki 4

Liukoista hu-TNF-R-delta-185:tä koodittavien cDNA-sekvenssien rakentaminen

Liukoista hu-TNF-R-delta-185:tä koodittava cDNA 5 (jonka sekvenssi on aminohapot 1 - 185 kuviossa 2) rakennettiin leikkaamalla 640 ep:n fragmentti pCAV/NOT-TNF-R:stä restriktioentsyymeillä Notl ja Bgl2. Notl leikkaa pCAV/NOT-TNF-R:n monikloonauskeskuksesta ja Bgl2 leikkaa TNF-R-koodialueelta nukleotidin 637 kohdalta, joka on 237 10 nukleotidia 5' transmembraanialueesta. Syntetisoitiin seu-raavat oligonukleotidiliittosekvenssit:

Bgl2 5'-GATCTGTAACGTGGTGGCCATCCCTGGGÄATGCAAGCATGGÄTGC-3'

15 ACATTGCACCACCGGTAGGGACCCTTACGTTCG

IleCysAsnValValAlalleProGlyAsnAlaSerMetAspAla

Notl 5'- AGTCTGCACGTCCACGTCCCCCACCCGGTGAGC -3'

2 0 TACCTACGTCAGACGTGCAGGTGCAGGGGGTGGGCCACTCGCCGG

ValCysThrSerThrSerProThrArgLoppu ·* Edeltävät oligonukleotidiliittosekvenssit rakenta- I ’.· vat uudelleen reseptorimolekyylin 3'-pään nukleotidiin ••S 25 708, jota seuraa päätöskodoni (alleviivattu). Nämä oligo- nukleotidit ligatoitiin sitten 640 ep:n Notl-TNF-R-inser-tin kanssa Notl:llä leikattuun pCAV/NOT:hen, jolloin saa- • · · .·*. tiin ilmennysvektori psol-TNF-R-delta-185/CAVNOT, joka • · · transfektoitiin C0S-7-soluihin kuten edellä kuvattiin. Tä- . 30 mä ilmennysvektori indusoi liukoisen humaani-TNF-R:n il- ... mennyksen, joka kykeni sitomaan TNF:ää.

• * ·;·’ Esimerkki 5

Liukoista hu-TNF-R-delta-163:ea koodittavien cDNA-sekvenssien rakentaminen

35 Liukoista hu-TNF-R-delta-163: ea koodittava cDNA

; \ (jonka sekvenssi on aminohapot 1 - 163 kuviossa 2) raken- 108645 39 nettiin leikkaamalla 640 ep:n fragmentti pCAV/NOT-TNF-R:stä restriktioentsyymeillä Notl ja Bgl2 kuten kuvattiin esimerkissä 4. Syntetisoitiin seuraava oligonukleotidi-liittosekvenssi: 5

Bgl2 Notl 5’GATCTGTTGAGC -3'

ACAACTCGCCGG

IleCysLoppu 10 Tämä edeltävä oligonukleotidiliittosekvenssi rakentavaa uudelleen reseptorimolekyylin 3'-pään nukleotidiin 642 (aminohappo 163), jota seuraa päätöskodoni (alleviivattu) . Tämä oligonukleotidi ligatoitiin sitten 640 15 ep:n Not1-TNF-R-insertin kanssa Notl:llä leikattuun pCAV/-NOT-:hen, jolloin saatiin ilmennysvektori psol-TNF-R-del-ta-163/CAVNOT, joka transfektoitiin COS-7-soluihin kuten edellä kuvattiin. Tämä ilmennysvektori indusoi liukoisen humaani-TNF-R:n ilmennyksen, joka kykeni sitomaan TNF:ää 20 esimerkissä 1 kuvatussa sitoutumismäärityksessä.

Esimerkki 6

Liukoista hu-TNF-R-delta-142:ta koodittavien cDNA-sekvenssien rakentaminen

• Liukoista hu-TNF-R-delta-142: ta koodittava cDNA

.Y: 25 (jonka sekvenssi on aminohapot 1 - 142 kuviossa 2) raken- nettiin leikkaamalla 550 ep:n fragmentti pCAV/NOT-TNF-R:sta restriktioentsyymeillä Notl ja AlwNl. AlwNl leikkaa ,*··, TNF-R-koodialueelta nukleotidin 549 kohdalta. Syntetisoi tiin seuraava oligonukleotidiliittosekvenssi: 40 108645

Bgl2 Not1

5'-CTGAAACATCAGACGTGGTGTGCAAGCCCTGTTAAA-3' CTTGACTTTGTAGTCTGCACCACACGTTCGGGACAATTTCTAGA

Loppu 5 Tämä edeltävä oligonukleotidiliittosekvenssi rakentavaa uudelleen reseptorimolekyylin 3'-pään nukleotidiin 579 (aminohappo 142), jota seuraa päätöskodoni (alleviivattu) . Tämä oligonukleotidi ligatoitiin sitten 10 550 ep:n Notl/AlwNl-TNF-R-insertin kanssa Notl/Bgl2:11a leikattuun pCAV/NOT:hen, jolloin saatiin ilmennysvektori psol-TNF-R-delta-142/CAVNOT, joka transfektoitiin COS-7-soluihin kuten edellä kuvattiin. Tämä ilmennysvektori ei indusoinut liukoisen humaani-TNF-R:n ilmennystä, joka ky-15 kenisi sitomaan TNF:ää. Arvellaan, että tämä nimenomainen rakenne ei kyennyt ilmentämään biologisesti aktiivista TNF-R:ää, koska yksi tai useampi molekyylinsisäiselle sitoutumiselle (TNF-R-molekyylin oikeanlaisen tertiaarira-kenteen muodostamiseksi) välttämätön oleellinen kysteii-20 nitähde (esim. Cys157 tai Cys163) oli eliminoitu.

Esimerkki 7

Liukoisten TNF-reseptorien ilmennys CHO-soluissa • · :**.· Liukoinen TNF-reseptori ilmennettiin kiinalaisen ; V hamsterin munasarja-(CHO-)soluissa käyttäen glutamiinisyn- 25 tetaasi- (GS-) geenimonistussysteemiä, oleellisesti kuten kuvataan PCT-patenttihakemusjulkaisuissa nrot WO 87/04 462 ja WO 89/01 036. Lyhyesti, CHO-solut transfektoidaan il- .··*. mennysvektorilla, joka sisältää geenit sekä TNF-R:lle että « · GS:lle. CHO-solut valikoidaan GS-geeni-ilmennyksen suhteen . 30 transfektoidun DNA:n kyvyn nojalla tuottaa resistenssi al haisille metioniinisulfoksimiini- (MSX-) tasoille. GS- » * ···* sekvenssimonistustapahtumat tällaisissa soluissa valikoi- ·:·; daan käyttäen korkeampia MSX-pitoisuuksia. Tällä tavalla .;·· jatkuvat TNF-R-sekvenssit vahvistuvat myös ja päästään te- 35 hostuneeseen TNF-R-ilmennykseen.

• · 108645 41 GS-ilmennyssysteemissä käytetty vektori oli psol-TNF-R/P6/PSVLGS, joka rakennettiin seuraavasti. Ensin vektori pSVLGS.l (jota kuvataan PCT-patenttihakemusjulkaisuissa nrot WO 87/04462 ja WO 89/01036 ja jota on saa-5 tavana valmistajalta Celltech, Ltd., Berkshire, UK) leikattiin BamHI-restriktioentsyymillä ja defosforyloitiin vasikansuolen alkalisella fosfataasilla (CIAP) vektorin sisäisen uudelleenligatoitumisen estämiseksi. BamHI:llä leikattu pSVLGS.1-fragmentti ligatoitiin sitten 2,4 ke:n 10 BamHI-Bgl2-fragmenttiin pEE6hCMV:stä (jota kuvataan PCT- patenttihakemus julkaisussa nro WO 89/01036, ja jota niinikään on saatavana valmistajalta Celltech), jota leikattiin Bgl2:11a, BamHI:llä ja Fspl:llä kahden saman kokoisen fragmentin muodostumisen välttämiseksi, jolloin saatiin 15 11,2 ke:n vektori, joka nimettiin p6/PSVLGS.1:ksi.

pSVLGS.l sisältää glutamiinisyntetaasivalikointimerkki-geenin SV40-myöhäispromoottorin kontrollissa. BamHI-Bql2-fragmentti pEE6hCMV:stä sisältää ihmisen sytomegaloviruk-sen pääasiallisen välittömän varhaispromoottorin (hCMV), 20 polyliittäjän ja SV40-varhaispolyadenylaatiosignaalin.

Liukoisen TNF-R:n koodisekvenssit lisättiin p6/-PSVLGS.l:een leikkaamalla Notl-BamHI-fragmentti ilmennys- :·'.· vektorista psol-TNF-R/CAVNOT (joka valmistettiin edeltävän · # ; esimerkin 3 mukaan) tasaamalla päät Klenow-entsyymilla ja 25 ligatoimalla Smal:llä leikattuun defosforyloituun p6/PS- VLGS.l:een, jolloin sol-TNF-R-koodisekvenssit sijoitettiin » » * .*·. hCMV-promoottorin kontrolliin. Tästä saatiin yksittäinen ,*··. plasmidivektori, jossa SV40/GS- ja hCMB/sol-TNF-R-kopioin- tiyksiköt kopioidaan vastakkaisiin suuntiin. Tämä vektori 30 nimettiin psol-TNF-R/P6/PSVLGS:ksi.

psol-TNF-R/P6/PSVLGS:llä transfektoitiin CHO-K1->··* soluja (saatavana ATCC-talletuslaitoksesta, Rockville, MD, ·:··· jossa hakunumero on CCL 61) seuraavasti. CHO-Kl-soluyksi- kerros kasvatettiin lähes yhteenkasvavaksi minimivaatimus-,·. 35 kasvualustassa (MEM), 10X (Gibco: 330-1581AJ), joka ei si- 108645 42 sältänyt glutamiinia ja jota oli täydennetty 10 %:lla dia-lysoitua nautasikiöseerumia (Gibco: 220-6300AJ), pitoi suudella 1 mM natriumpyruvaatti (Sigma), MEM-ei-välttämät-tömillä aminohapoilla (Gibco: 320-1140AG), pitoisuudella 5 500 μΜ asparagiini ja glutamaatti (Sigma) ja nukleosideil- la (30 μΜ adenosiini, guanosiini, sytidiini ja uridiini ja 10 μΜ tymidiini) (Sigma).

Noin 1 x 106 solua 10 cm:n petrimaljassa transfek-toitiin 10 pg:lla psol-TNF-R/P6/PSVLGS:ää käyttäen kal-10 siumfosfaattivakiosaostusta oleellisesti kuten ovat kuvanneet Graham ja van der Eb, Virology 52 (1983) 456. Soluihin kohdistettiin glyserolishokki (15 % glyserolia seerumia ei sisältävässä kasvualustassa noin 1,5 minuutin ajan) noin 4 tunnin kuluttua transfektoinnista oleelli-15 sesti kuten ovat kuvanneet Frost ja Williams, Virology 91 , (1978) 39, minkä jälkeen ne pestiin seerumia ei sisältä vällä kasvualustalla. Päivää myöhemmin transfektoiduille soluille annettiin tuoretta selektiivistä kasvualustaa, joka sisälsi MSXtää loppupitoisuuden 25 μΜ. 3-4 viikon 20 kuluttua voitiin nähdä MSX-resistenttien eloonjääneiden solujen muodostamia pesäkkeitä. Eloonjääneet pesäkkeet siirrettiin 24-kuoppaisille levyille, ja niiden annettiin ' .* kasvaa yhteen selektiivisessä kasvualustassa. Käsitellystä ; kasvualustasta yhteenkasvaneita soluja käsittävistä kuo- . 25 pistä määritettiin sitten liukoisen TNF-R:n aktiivisuus käyttäen edellä esimerkissä 1 kuvattua sitoutumismääritys-tä. Määritykset osoittivat, että pesäkkeet ilmensivät bio-logisesti aktiivista liukoista TNF-R:ää.

< » GS-geenivahvistuksen suhteen valikoimiseksi useita , 30 MSX-resistenttejä solulinjoja transfektoidaan psol-TNF- R/P6/PSVLGS:llä ja kasvatetaan eri MSX-pitoisuuksissa.

···* Kustakin solulinjasta noin 1 x 106 solua maljoitetaan vä- ;··: hittäin kasvaviin pitoisuuksiin 100 μΜ, 250 μΜ, 500 μΜ ja 1 mM MSX ja inkuboidaan 10 - 14 päivän ajan. 12 päivän ku-35 luttua korkeammille MSX-tasoille resistenttejä pesäkkeitä 108645 43 tulee näkyviin. Eloonjääneistä pesäkkeistä määritetään TNF-R-aktiivisuus käyttäen edellä esimerkissä 1 kuvattua sitoutumismääritystä. Kukin näistä hyvin resistentistä so-lulinjasta sisältää soluja, jotka syntyvät monista riippu-5 mattomista monistustapahtumista. Näistä solulinjoista eristetään yksi tai useampi kaikkein resistenteimmistä so-lulinjoista. Vahvistettuja soluja, joiden tuotantotehot ovat korkeita, kloonataan sitten rajaavan laimentamisen kloonauksella. Transfektanttien massasoluviljelmät erittä-10 vät aktiivista liukoista TNF-R:ää.

Esimerkki 8

Liukoisen humaani-TNF-R:n ilmentäminen hiivassa

Liukoinen humaani-TNF-R ilmennettiin hiivassa käyttäen ilmennysvektoria pIXY432, joka saatiin hiivail-15 mennysvektorista pIXY120 ja plasmidista pYEP352. pIXY120 on identtinen pYaHuGMrään (ATCC 53157) nähden lukuunottamatta, että se ei sisällä cDNA-inserttiä ja sisältää po-lyliittäjä/monikloonauskeskuksen, jossa on Ncol-restrik-tiokeskus.

20 DNA-fragmentti, joka koodittaa TNF-reseptoria ja sopii kloonattavaksi hiivailmennysvektoriin pIXY120, muodostettiin ensin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) vahvis-·.1 .1 tamalla solunulkoista osaa täysimittaisesta reseptorista pCAV/NOT-TNF-R: stä (ATCC 68088). Tässä PCR-monistuksessa . 25 käytettiin seuraavia alukkeita: • » · » · • 1 • · ♦ » M • · > · I i i 141·· • · * I · » » t · · » » · 108645 44 5'-pääaluke: 5'-TTCCGGTACCTTTGGATAAAAGAGACTACAAGGAC Asp718->ProLeuAspLysArgAspTyrLysAsp 5 GACGATGACAAGTTGCCCGCCCAGGTGGCATTTACA-3'

AspAspAspLys<--------TNF-R---------> 3'-pääaluke (ei-tietosekvenssi): 10 5'-CCCGGGATCCTTAGTCGCCAGTGCTCCCTTCAGCTGGG-3'

BamHl>Loppu<-----------TNF-R------>

Monistuksessa käytetty 5'-pääoligonukleotidialuke sisälsi 5'-päässään Asp718-restriktiokeskuksen, ja sen 15 jälkeen nukleotidit, jotka koodittavat hiivan a-tekijäjoh-tosekvenssin 3'-päätä (Pro-Leu-Asp-Lys-Arg), sekä nukleotidit, jotka koodittavat 8 aminohappoa FlagR-peptidistä (AspTyrLysAspAspAspAspLys) fuusioituna sekvenssiin, joka koodittaa kypsän reseptorin 5'-päätä. FlagR-peptidi (Hopp 20 et ai., Bio/Technoloqy 6 (1988) 1204) on hyvin antigeeninen sekvenssi, joka sitoo reversiibelisti monoklonaalisen vasta-aineen Ml (ATCC HB 9259). Oligonukleotidi, jota käy-tettiin PCR-peräisen fragmentin 3'-pään muodostamiseksi, • on ei-tietosäie DNA-koodisekvensseistä, jotka päättävät 25 reseptorin avoimen lukualueen kypsän koodialueen nukleoti- din 704 jälkeen (Asp-tähteen jälkeen, joka edeltää trans-membraanialuetta) tuomalla TAA-lopetuskodonin (alleviivat-.··, tu) . Lopetuskodonia seuraa sitten BamHI-restriktiokeskus.

TNF-R:ää koodittavat DNA-sekvenssit vahvistetaan sitten . 30 PCR:llä, oleellisesti kuten ovat kuvanneet Innis et ai., toim., "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applica- ·;·* tions", Academic Press, 1990.

·:**: Liukoista humaani-TNF-R:ää koodittava PCR:llä saa- ·;···, tu DNA-fragment ti alakloonattiin hiivailmennysvektoriin 35 pIXY120 pilkkomalla PCR:llä saatu DNA-fragmentti BamHI- ja 108645 45

Asp718-restriktioentsyvmeillä, pilkkomalla pIXYl20 Bam-HI:llä ja Asp718:11a ja ligatoimalla PCR-fragmentti leikattuun vektoriin in vitro T4-DNA-ligaasia käyttäen. Saatu rakenne (pIXY424) fuusioi FlagR-liukoisen TNF-reseptorin 5 avoimen lukualueen lukualueella täydelliseen a-teki- jäjohtosekvenssiin ja sijoitti ilmennyksen hiivassa säädellyn hiiva-alkoholidehydrogenaasi-(ADH2-)promoottorin säätelyyn. pIXY424:ään sisältyvän liukoisen TNF-reseptorin nukleotidisekvenssin identtisyys cDNA-klooni-1:n sisältä-10 miin nähden varmistettiin DNA-sekventoinnilla käyttäen di- deoksinukleotidiketjupäämenetelmää. pIXY424 transformoitiin sitten JL_ coli -kantaan RR1.

Liukoinen humaani-TNF-reseptori ilmennettiin myös ja eritettiin hiivassa toisessa vektorissa. Tämä toinen 15 vektori muodostettiin ottamalla pIXY424-plasmidi talteen E. colista ja pilkkomalla EcoRI- ja BamHI-restriktioent-syymeillä fragmentin eristämiseksi, joka käsittää ADH2-promoottoria koodittavam alueen, a-tekijäjohtosekvenssin, FlagR-liukoisen TNF-reseptorin ja lopetuskodonin. Tämä 20 fragmentti ligatoitiin in vitro EcoRI:llä ja BamHI:llä leikattuun plasmidiin pYEP352 (Hill et ai., Yeast 2 (19869 163), jolloin saatiin ilmennysplasmidi pIXY432, joka transformoitiin Eh_ coli -kantaan RR1.

• Liukoisen humaani-TNF-reseptorin erityksen hiivas- . : : 25 ta määrittämiseksi pIXY424 puhdistettiin ja vietiin dip- loidiseen S_;_ cerevisiae -hiivakantaan (XV2181) elektropo-raatiolla ja valikoimalla plasmidin käsittämän hiiva- * * · ,*·, TRPl+-geenin siirtymisen suhteen kasvualustalla, josta puuttui tryptofaani. pIXY432:n ohjaaman reseptorierityksen . 30 määrittämiseksi plasmidi vietiin hiivakantaan PB149-6b elektroporaatiolla, minkä jälkeen valikoitiin plasmidin ···* käsittämän URA3+-geenin suhteen kasvattamalla kasvualus- :··: talla, josta puuttui urasiili. Yön yli kasvaneita viljel- ·;·· miä kasvatettiin 30 °C:ssa tarkoituksenmukaisessa selek- 35 tiivisessä kasvualustassa. PB149-6b/pIXY434-transformantit 108645 46 1 laimennettiin YEP-1 % glukoosi-kasvualustaan ja kasvatet tiin lämpötilassa 30 °C 38 - 40 tunnin ajan. Supernatantit valmistettiin poistamalla solut sentrifugoimalla ja suodattamalla supernatantit 0,45 μ:η suodattimien läpi.

5 Eritetyn reseptorin taso supernatanteissa määri tettiin immuuni-piste blot -määrityksellä. Lyhyesti, 1 μΐ supernatantteja ja supernatanttien laimennoksia tiputettiin nitroselluloosasuodattimille ja annettiin kuivaa. Ei-spesifinen proteiinisitoutuminen salvattiin 3-%:isella 10 BSA-liuoksella, minkä jälkeen suodattimia inkuboitiin lai mennetulla Ml-anti-FlagR-vasta-aineella ja ylimääräinen vasta-aine poistettiin pesemällä, minkä jälkeen edelleen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitujen anti-hiiri-IgG-vas-ta-aineiden laimennoksia inkuboitiin suodattimien kanssa.

15 Ylimääräiset sekundaarivasta-aineet poistettiin, minkä jälkeen peroksidaasisubstraatit lisättiin ja värinkehityk-sen annettiin kestää noin 10 minuuttia ennen kuin sub-straattiliuos poistettiin.

Supernatanteista tavattu anti-FlagR-reaktiivinen 20 materiaali osoitti, että merkittäviä reseptoritasoja erit tyi kummassakin ilmennyssysteemissä. Vertailut osoittivat, että pIXY432-systeemi eritti noin 8-16 kertaa enemmän V liukoista humaani-TNF-reseptoria kuin pIXY424-systeemi.

Supernatanteista määritettiin liukoisen TNF-R:n aktiivi-, : 25 suus kuten kuvattiin esimerkissä 1 niiden kyvyn nojalla sitoa 125I-TNF-a:aa ja salava TNF-a-sitoutumista. pIXY432-

• I I

supernatanttien todettiin sisältävän merkittäviä tasoja • * · .···. aktiivista liukoista TNF-R:ää.

Esimerkki 9 . 30 Hiiri-TNF-R-cDNA-sekvenssien eristäminen fin· I ·

Hiiri-TNF-R-cDNA-sekvenssejä eristettiin cDNA-kir-;*’ jastosta, joka oli valmistettu hiiren 7B9-solulinjasta, ·;··: joka on antigeeniriippuvainen avustaja-T-solulinja, joka .;··· saadaan C57BL/6-hiiristä, ristilajihydridisaatiolla humaa- 35 ni-TNF-R-koettimeen. cDNA-kir jasto rakennettiin lambda- * i • * · 108645 47 ZAP:iin (Stratagene, San Diego), oleellisesti kuten kuvattiin edellä esimerkissä 2, eristäen polyadenyloitu RNA 7B9-soluista.

Kaksisäikeinen humaani-TNF-R-cDNA-koetin valmis-5 tettiin leikkaamalla noin 3,5 ke:n NotI-fragmentti humaa-ni-TNF-R-klooni-1:stä ja 32P-leimaamalla cDNA käyttäen sa-tunnaisalukkeita (Boehringer-Mannheim).

Hiiri-cDNA-kirjasto vahvistettiin kerran ja kaikkiaan 900 000 plakkia seulottiin, oleellisesti kuten ku-10 vattiin esimerkissä 2, humaani-TNF-R-cDNA-koettimellä.

Noin 21 positiivista plakkia puhdistettiin ja sinikopio-plasmidit, jotka sisälsivät EcoRI-liitteisiä inserttejä, leikattiin (Stratagene, San Diego). Osan hiiri-TNF-R-klooni-ll:tä nukleiinihapposekventointi osoitti, että hii-15 ri-TNF-R:n koodisekvenssi oli noin 88-%:isesti homologinen vastaavaan humaani-TNF-R-nukleotidisekvenssiin nähden. Hiiri-TNF-R-cDNA-klooni-11:n osanukleotidisekvenssi esitetään kuvioissa 4-5.

Esimerkki 10 20 TNF-R-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus

Valmisteita puhdistetusta yhdistelmä-DNA-TNF- * » R:stä, esimerkiksi humaani-TNF-R:stä, tai transfektoituja ; V COS-soluja, jotka ilmentävät korkeita TNF-R-tasoja, käy- • # .#!t! 25 tetään TNF-R-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden muodostamiseksi tavanomaisia tekniikoita käyttäen, esimer-kiksi US-patenttijulkaisussa 4 411 993 kuvattuja. Täl-laiset vasta-aineet ovat todennäköisesti käyttökelpoisia osina TNF:n tai liukoisen TNF-reseptorin diagnoosi- tai , 30 tutkimusmäärityksiä.

Hiirten immunoimiseksi TNF-R-immunogeeni emulgoi-daan täydelliseen Freundin tehosteeseen ja ' määrä 10 -100 pg ruiskutetaan ihonalaisesti Balb/c-hiiriin. 10 - 12 ·;· päivän kuluttua immunoiduille eläimille annetaan tehostee- ,35 na lisää immunogeenia emulgoituna epätäydelliseen Freundin I < 108645 48 tehosteeseen, minkä jälkeen annetaan ajoittainen tehoste 1-2 viikon immunointiohjelman mukaisesti. Silloin tällöin otetaan seeruminäytteitä laskemalla verta silmäkuopan takaa tai leikkaamalla hännänpäätä analyysiä varten blot-5 pistemäärityksellä (vasta-aine-sandwich) tai ELISA:11a (entsyymiliitteinen immuunisorbenttimääritys). Muutkin määritysmenettelyt ovat sopivia. Kun tarkoituksenmukainen vasta-ainetiitteri on todettu, positiivisille eläimille annetaan laskimonsisäinenä ruiskeena antigeeniä suolaliu-10 oksessa. 3-4 päivän kuluttua eläimet uhrataan, pernasolut otetaan talteen ja fuusioidaan hiiren myeloo-masolulinjaan NS1. Tällä menettelyllä muodostettuja hyb-ridoomasolulinjoja maljataan useille mikrotiitterilevyille selektiiviseen HAT-kasvualustaan (hypoksantiini, aminopte-15 riini ja tymidiini) ei-fuusioitujen solujen, mye-loomahybridien ja pernasoluhybridien lisääntymisen estämiseksi .

Näin muodostetut hybridoomakloonit voidaan seuloa ELISA:11a reaktiivisuuden suhteen TNF:lle, esimerkiksi 20 käyttäen muunnoksia tekniikoista, joita ovat julkistaneet Engvall et ai., Immunochem. 8 (1971) 871; ja joita julkistetaan US-patenttijulkaisussa 4 703 004. Positiivisia klooneja ruiskutetaan sitten syngeenisten Balb/c-hiirten ‘ 1f! vatsaonteloon vatsaontelonesteen tuottamiseksi, joka si- ,Y: 25 sältää korkeita pitoisuuksia (> 1 mg/ml) anti-TNF-R-mono- klonaalista vasta-ainetta. Saatu monoklonaalinen vasta-aine voidaan sitten puhdistaa ammoniumsulfaatilla saosta- ,···, maila ja suorittamalla sitten geeliekskluusiokromatografia 1 · ja/tai affiniteettikromatografia nojautuen vasta-aineen . 30 sitoutumiseen proteiini-A:hän Staphylococcus aureuksesta.

UM i « I < 1 t · * » 1 1 » ·

Claims (7)

108645

1. Puhdistettu biologisesti aktiivinen nisäkkään TNF-reseptori (TNF-R) -proteiini, joka käsittää aminohap- 5 posekvenssin, joka valitaan kuvion 2 aminohapoista 1 - x, jolloin x valitaan aminohapoista 163 - 235.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen TNF-R-proteiini, tunnettu siitä, että se on liukoinen ihmisen TNF-R- proteiini, joka käsittää kuvion 2 aminohapposekvenssin 1 -10 235.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen TNF-R-proteiini, tunnettu siitä, että aminohappotähde 46 on korvattu aminohapolla Ile tai Thr ja aminohappotähde 118 on kor vattu aminohapolla Vai tai Ile.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen TNF-R-proteiini, tunnettu siitä, että se on liukoinen ihmisen TNF-R- proteiini, joka käsittää kuvion 2 aminohapposekvenssin 1 -185.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen TNF-R-proteiini, 20 tunnettu siitä, että se on liukoinen ihmisen TNF-R- proteiini, joka käsittää kuvion 2 aminohapposekvenssin 1 -163. t

6. Vasta-aine, joka sitoutuu spesifisesti jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen biologisesti aktiivi- ,V; 25 sen nisäkkään TNF-R-proteiinin kanssa.

7. Menetelmä TNF- tai TNF-R-molekyylien tai niiden > * ¥ vuorovaikutuksen toteamiseksi, tunnettu siitä, että ···, käytetään koostumusta, joka sisältää jonkin patentti- vaatimuksen 1-5 mukaista TNF-R-proteiinia. • i » » f » t I I I » • ' * * • | I » t » I I » tili» i > » t I > « * I I » » 108645